DEMÉTRIO DE ABREU SOUSA Ocorrência de poluentes orgânicos persistentes em ovos de Caiman yacare (jacaré-do-Pantanal) Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, no âmbito do Programa DINTER - CAPES com o Instituto Federal do Mato Grosso, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientadora: Profa. Dra. Mary Rosa R. de Marchi Co-orientadora: Profa. Dra. Adriana P. de Oliveira Araraquara 2014 FICHA CATALOGRÁFICA Sousa, Demétrio de Abreu S725o Ocorrência de poluentes orgânicos persistentes em ovos de Caiman yacare (jacaré-do-Pantanal) / Demétrio de Abreu Sousa. – Araraquara: [s.n], 2014 113 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi Coorientador: Adriana Paiva de Oliveira 1. Química analítica. 2. Quimiometria. 3. Jacaré. 4. Estudos de validação. 5. Extração por solventes. 6. Cromatografia a gás. I. Título. Elaboração: Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação DADOS CURRICULARES Dados pessoais Nome Demétrio de Abreu Sousa Endereço profissional Instituto Federal de Mato Grosso, Campus Cáceres Av. dos Ramires, S/N Distrito Industrial - Cáceres 78200-000, MT - Brasil Telefone: 65 32212600 Endereço eletrônico E-mail: demetrio.sousa@cas.ifmt.edu.br e-mail alternativo : demetrioabreu@yahoo.com.br ____________________________________________________________________________ Formação acadêmica/titulação 2010 Doutorado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Ocorrência de poluentes orgânicos persistentes em ovos de Caiman yacare (jacaré-do-Pantanal) Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi 2005 - 2008 Mestrado em Química. Universidade Federal de Goiás, UFG, Goiânia, Brasil Título: Grupo de estudo de professores de química: uma investigação-ação, Ano de obtenção: 2008 Orientador: Wilson Botter Junior 2009- Graduação interrompido(a) em Licenciatura em Química - Modalidade EAD. Instituto Federal de Mato Grosso, IFMT, Cuiabá, Brasil Ano de interrupção: 2010 1999 - 2004 Graduação em Farmácia - Habilitação Análises Clínicas. Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Cuiabá, Brasil Título: Infecção Hospitalar em Neonatos Orientador: Fabiana Nuevo Roquette Giachetto ____________________________________________________________________________ Formação complementar 2009 - MBA em Gestão e Perícia Ambiental. Universidade de Cuiabá, UNIC, Cuiabá, Brasil 1994 - 1997 Técnico Em Química. Escola Técnica Federal do Mato Grosso, ETFMT, Cuiabá, Brasil ____________________________________________________________________________ Atuação profissional 1. Instituto Federal de Mato Grosso - IFMT __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2010 - Atual Vínculo: Servidor público , Enquadramento funcional: Docente , Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva 2. Centro Universitário de Várzea Grande - UNIVAG __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2009 - 2010 Vínculo: Celetista , Enquadramento funcional: Professor , Carga horária: 24, Regime: Parcial 3. Universidade de Cuiabá - UNIC __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2009 - 2010 Vínculo: Celetista , Enquadramento funcional: Professor , Carga horária: 9, Regime: Parcial 4. Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2008 - 2009 Vínculo: Contrato , Enquadramento funcional: Professor Substituto , Carga horária: 16, Regime: Parcial 2004 - 2005 Vínculo: Professor Substituto , Enquadramento funcional: Professor Substituto , Carga horária: 40, Regime: Integral 5. Universidade do Estado de Mato Grosso - UNEMAT __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2008 - 2008 Vínculo: Contrato, Enquadramento funcional: Professor, Carga horária: 12, Regime: Parcial 6. Universidade Estadual Vale do Acaraú - UVA-CE __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2007 - 2007 Vínculo: Contrato , Enquadramento funcional: Professor, Regime: Parcial 7. Cooperativa de Ensino do Médio Araguaia - COOPEMA __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2004 - 2005 Vínculo: Celetista , Enquadramento funcional: Professor titular , Carga horária: 10, Regime: Parcial 8. Instituto Madre Marta Cerutti - IMMC __________________________________________________________________ Vínculo institucional 2005 - 2005 Vínculo: Celetista , Enquadramento funcional: professor titular , Carga horária: 8, Regime: Parcial ____________________________________________________________________________ Projetos 2011 - 2012 ANÁLISE BIOQUÍMICA DO CUMBARU (DIPTERYX ALATA VOG) PRODUZIDO EM POCONÉ (MT). Descrição: O projeto visa realizar análises bioquímicas e bromatológicas no cumbaru que é colhido na região de Poconé. As análises serão realizadas na amêndoa in natura e torrada, no fruto e em alimentos produzidos a partir destes produtos. Visamos avaliar as qualidades nutricionais dos produtos e a viabilidade de uso para produção de biodiesel. Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (1); Integrantes: Demétrio de Abreu Sousa (Responsável); Mayara Chagas de Ávila. Financiador(es): Instituto Federal de Mato Grosso-IFMT 2010 - 2011 ESTUDO DAS POTENCIALIDADES DE USO DO BAGAÇO DE CANA PARA A CONSTRUÇÃO DE UM FILTRO PARA ÓLEO RESIDUAL Descrição: Óleos vegetais residuais devem passar por processos de limpeza antes de serem utilizados na fabricação de biodiesel. O projeto propõe a utilização de bagaço de cana como meio filtrante e adsorvente de possíveis contaminantes que estejam presentes no óleo residual. Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (1); Integrantes: Demétrio de Abreu Sousa (Responsável); Juliana Avelar de Carvalho Financiador(es): Instituto Federal de Mato Grosso-IFMT 2010 - 2011 Caracterização físico-química e microbiológica de mananciais hídricos da região de Cáceres (MT) Descrição: Este projeto visa realizar a caracterização da qualidade da água de mananciais os quais serão analisadas as características físico-químicas e microbiológicas de águas superficiais na região de Cáceres. Os resultados das análises serão utilizados para caracterização da qualidade da água, sendo, então, possível de indicar pontos de contaminação química e/ou microbiológica. Em caso de contaminação, os resultados serão apresentados ao Poder Público para que o mesmo possa tomar medidas mitigadoras. Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (5); Integrantes: Demétrio de Abreu Sousa (Responsável); Thalita Neves Marostega; Juçara Tinasi de Oliveira Financiador(es): Instituto Federal de Mato Grosso-IFMT 2010 - 2011 Utilização de óleo de fritura para a produção de biodiesel e sabões funcionais Descrição: O presente projeto tem a pretensão de reaproveitar o óleo de descarte do IFMT – Campus Cáceres para a produção de sabões funcionais e biocombustível, em nível de bancada, visando esta prática como um recurso pedagógico para o curso de Tecnologia em Biocombustíveis. Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (5); Integrantes: Demétrio de Abreu Sousa (Responsável); Mayara Chagas de Ávila. Produção ____________________________________________________________________________ Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. SOUSA, DEMÉTRIO A., GONÇALVES, RENATO M., HELENO, FERNANDA F., DE QUEIROZ, MARIA ELIANA L.R., DE MARCHI, MARY ROSA R. Chemometric optimization of solid-liquid extraction with low-temperature partition (SLE-LTP) for determination of persistent organic pollutants in Caiman yacare eggs. Microchemical Journal (Print). , v.114, p.266 - 272, 2014. Trabalhos publicados em anais de eventos (completo) 1. CARVALHO, J. A., SOUSA, Demétrio de Abreu. Study the potential use of sugarcane bagasse for adsorption of metals in residual oil In: Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, 2012, Rio de Janeiro. Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, 2012. 2. MAROSTEGA, T. N., SOUSA, Demétrio de Abreu. O perfil do estudante de tecnologia em biocombustíveis (IFMT/Cáceres) e as relações com o currículo In: V Congresso Internacional de Bioenergia, 2010, Curitiba. Anais do V Congresso Internacional de Bioenergia. , 2010. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. SOUSA, DEMÉTRIO A. ; DE MARCHI, MARY ROSA R. . PERSISTENT ORGANIC COMPOUNDS IN CAIMAN YACARE EGGS: VALIDATION OF A METHOD BASED ON SOLID LIQUID EXTRACTION WITH LOW-TEMPERATURE PARTITION (SLE-LTP). In: 38th International Symposium on Capillary Chromatography (ISCC), 2014, Riva del Garda (Italia). GCxGCLifetimeAchievementAwardLecture, 2014. 2. MAROSTEGA, T. N., SOUSA, Demétrio de Abreu, ARAUJO, :. L. M., RANZANI, R. E. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DE MANANCIAIS HÍDRICOS DA REGIÃO DE CÁCERES (MT) In: Congresso de Iniciação Científica, 2013, Cáceres. Anais. , 2013. v.8. Orientações e Supervisões Monografias de conclusão de curso de aperfeiçoamento/especialização 1. Danillo Ferreira Souza. AINES no meio ambiente: uma revisão sobre a ocorrência e principais fontes de contaminação.. 2012. Monografia (Especialização em Farmacologia e Dispensação Farma) - Instituto Brasil de Pós-Graduação, Capacitação e Assessoria 2. Salviano Dias Vieira. LEVANTAMENTO DA FREQUÊNCIA DE EXAMES RADIOLÓGICOS REALIZADOS NO MUNICÍPIO DE CUIABÁ (MT).. 2010. Monografia (Auditoria em Serviços de Saúde) - Universidade de Cuiabá Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. Rogério João Nunes Batista. Levantamento do Perfil de 50 hipertensos do município de Barra do Graças - MT, Assistidos pelo Programa Saúde da Família-Unidade Centro.. 2004. Curso (Farmácia - Habilitação Análises Clínicas) - Universidade Federal de Mato Grosso Iniciação científica 1. Mayara Chagas de Ávila. ANÁLISE BROMATOLÓGICA DO CUMBARU (DIPTERYX ALATA VOG) PRODUZIDO EM POCONÉ – MT. 2012. Iniciação científica (Tecnólogo em Biocombustíveis) - Instituto Federal de Mato Grosso 2. Thalita Neves Marostega. Caracterização físico-química e microbiológica de mananciais hídricos da região de Cáceres (MT). 2011. Iniciação científica (Biocombustíveis) - Instituto Federal de Mato Grosso 3. Juliana Avelar de Carvalho. Uso de bagaço de cana para adsorção de fósforo em óleo residual. 2011. Iniciação científica (Biocombustíveis) - Instituto Federal de Mato Grosso 4. Mayara Chagas de Ávila. Utilização de óleo de fritura para a produção de biodiesel e sabões funcionais. 2011. Iniciação científica (Biocombustíveis) - Instituto Federal de Mato Grosso Bancas Participação em banca de trabalhos de conclusão Curso de aperfeiçoamento/especialização 1. SOUSA, Demétrio de Abreu, MONTECCHI, I. A. D. Participação em banca de Célia Ribeiro Fancio. EDUCAÇÃO AMBIENTAL COMO EXERCÍCIO DE CIDADANIA NO PROEJA FIC, 2012. (Especialização PROEJA) Instituto Federal de Mato Grosso Graduação 1. FLUMINGAN, D. L., SOUSA, Demétrio de Abreu, RIZZATTO, M. Participação em banca de Ana Larissa de Moraes. Caracterização da identidade e controle de qualidade de óleo vegetal, matéria-prima para produção de biodiesel, 2013. (Biocombustíveis) Instituto Federal de São Paulo 2. SOUSA, Demétrio de Abreu, TOLEDO, Olegário Rosa de, DAVID, Flávia Lucia. Participação em banca de CAROLINA CARNICEL. ANÁLISE COMPARATIVA NA REDUÇÃO DO RISCO CARDIOVASCULAR PELOS INIBIDORES ECA EM DIABÉTICOS HIPERTENSOS, 2004 (Farmácia - Habilitação Análises Clínicas) Universidade Federal de Mato Grosso 3. SOUSA, Demétrio de Abreu, SCHERER, Edson Fredulin, ROBLES, Renata. Participação em banca de FERNANDO VENTURINI. AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E RESISTÊNCIA BACTERIANA EM INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO EM PONTAL DO ARAGUAIA, 2004 (Farmácia - Habilitação Análises Clínicas) Universidade Federal de Mato Grosso 4. SOUSA, Demétrio de Abreu, SCHERER, Edson Fredulin, ROBLES, Renata. Participação em banca de ALAN RODRIGO PETRENKO. INCIDÊNCIA DE MALÁRIA NA REGIÃO DO MUNICÍPIO DE JURUENA-MT, 2004 (Farmácia - Habilitação Análises Clínicas) Universidade Federal de Mato Grosso 5. SOUSA, Demétrio de Abreu, ROBLES, Renata, LEITE, Tatiane Morbeck. Participação em banca de ROGÉRIO JOÃO NUNES BATISTA. LEVANTAMENTO DO PERFIL DE 50 HIPERTENSOS DO MUNICÍPIO DE BARRA DO GARÇAS - MT, ASSISTIDOS PELO PROGRAMA SAÚDE DA FAMÍLIA - UNIDADE CENTRO, 2004 (Farmácia - Habilitação Análises Clínicas) Universidade Federal de Mato Grosso AGRADECIMENTOS Durante minha formação de pesquisador, tem algo ainda mais valioso que aprendi além dos conhecimentos teóricos e práticos transmitidos pela academia. Aprendi que ciência é feita por pessoasss (no sentido mais pluralista possível). Do meu trabalho de doutorado tenho a consciência de que nada fiz sozinho, pois se consegui chegar longe é porque estive apoiado em ombros de amigos, de familiares e de outros pesquisadores, que são maiores que os gigantes de Newton. Agradecer a estas pessoas é o mínimo que posso fazer para reconhecer o seu valor e sua contribuição para a construção desta tese. Então eu agradeço: Aos meus pais, Itália e Salviano, por terem sempre colocado a educação e o amor em primeiro lugar; Ao meu companheiro Danillo pelo amor, pela a amizade, pela ajuda no laboratório e com os cromatogramas, pelo apoio desde o mestrado e ter suportado, pacientemente, tantas vezes o meu único assunto – “o doutorado”; À minha irmã Monique pelo amor, apoio e por ter conseguido minha permanência em Araraquara; À orientadora Mary por ter aceitado me orientar mesmo sem me conhecer e, assim, ter acreditado em meu potencial em uma simples conversa pelo telefone. Também a agradeço pela parceria no forró; À amiga Carol pelas contribuições e ensinamentos científicos, pela parceria no forró e aventuras radicais; Aos colegas do GRESCO (Claudia P., Elissandro, Lucy, Patrícia e Paulo) pelas contribuições científicas, ajudas e risadas no laboratório. Aos amigos Renato (Zé) e Marcos (Pipoca), nossos ‘estatistiqueiros’, pelas explicações e ensinamentos estatísticos. Às amigas Débora (Brabu) e Stephane (Absoluta) que me acolheram quando precisei e pelas longas discussões científicas durante as madrugadas; Aos amigos Pedro e Nathalie (Nathalinda) pela diversão, companheirismo e treinamento no ECD; Ao amigo Bruno pela acolhida e aos amigos Dayana (Day) e Danilo pela gentileza de cederem a casa para morar; Ao amigo Prof. Dr. Vitor Aleixo e aos pantaneiros pela ajuda nas coletas de ovo de jacaré. Prova de que o conhecimento técnico necessita estar aliado ao conhecimento tácito. À equipe do LAQUA da Universidade Federal de Viçosa, em especial Profa. Dra. Maria Eliana Queiroz e Dra. Fernanda Heleno, por terem carinhosamente e pacientemente me ensinado a técnica de extração que utilizei neste trabalho. Ao Eduardo (Pousada Piuval) por ter permitido a coleta dos ovos em sua fazenda. Às colegas Daryne Lu e Denise pela paciência em liofilizar as amostras. Aos colegas e profissionais do IQ e do IFMT que ajudaram direta ou indiretamente em minhas dúvidas e solicitações. Com todos vocês eu divido esta Tese. RESUMO Mostramos aqui a ocorrência de poluentes orgânicos persistentes em ovos de jacaré- do-Pantanal (Caiman yacare), coletados em dois municípios do estado de Mato Grosso (Brasil), em 2012 e 2013. p,p’-DDE foi o composto encontrado em maior concentração (51,3 – 78,1 ng g-1 de ovo liofilizado) em ambas as regiões estudadas. Para a extração de pesticidas organoclorados - OCPs - (p,p’-DDD, p,p’-DDE, o,p’- DDT, o,p’-DDD, o,p’-DDE, β-endosulfan e endosulfan sulfato) e bifenilas policloradas - PCBs - (congêneres 28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180), o conteúdo total de ovos de C. yacare, exceto a casca, foi homogeneizado, liofilizado e submetido a um método de extração sólido-líquido com partição em baixa temperatura (ESL-PBT) que previamente foi otimizado e validado. Foi utilizado um cromatógrafo a gás (CG) com detector por captura de elétrons (ECD) para a detecção destes analitos. PCB 209 a 10 ng mL-1 e tetrabromobenzeno (TBB) a 10 ng mL-1 foram utilizados como padrão interno e como padrão de recuperação (surrogate), respectivamente. O método de extração foi otimizado através de um estudo quimiométrico que incluiu um planejamento fatorial 24 com triplicata do ponto central, para determinação das melhores condições de análise dos compostos de interesse. Volume de solvente extrator (8 – 12 mL), tempo de agitação em vortex (1 – 5 min), tempo de centrifugação a 2.500 rpm (5 – 15 min) e tempo de congelamento (4 – 12 h) foram as variáveis consideradas e testadas em dois níveis, mais a triplicata do ponto central. A recuperação normalizada foi utilizada como resposta para avaliação dos fatores que influenciam o método de extração. As respostas normalizadas foram submetidas ao teste t de Student para determinação dos fatores significativos e as interações entre os fatores foram avaliadas a partir da superfície de resposta. O método otimizado inclui 12 mL de solvente extrator (acetonitrila: acetato de etila - 6,5:1,5 v/v), 5 min de tempo de agitação em vortex, 15 min de centrifugação a 2.500 rpm e 12 h de congelamento. Para a validação do método, a área cromatográfica de cada analito em relação a área cromatográfica do padrão interno versus concentração foram utilizados para construção de três curvas analíticas: (1) em solvente, (2) na matriz e (3) extraída. Todos os pontos de cada curva foram submetidos ao teste de Huber para exclusão de valores anômalos e a linearidade das curvas foi avaliada pelo coeficiente de determinação (r2) e homocedasticidade. A detectabilidade da resposta cromatográfica instrumental foi avaliada pela curva em solvente (3,0 – 71,7 ng mL-1 em isoctano). A curva na matriz (2,3 – 53,8 ng g-1 de ovo liofilizado) foi utilizada para avaliação de efeito matriz, por comparação da variância residual entre a curva em solvente e a curva na matriz. Os resultados mostraram que os componentes da matriz podem afetar a quantificação dos compostos estudados. A curva extraída (2,3 – 53,8 ng g-1 de ovo liofilizado) foi utilizada para a determinação dos parâmetros analíticos (exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, repetitividade e precisão intermediária) do método baseado em ESL-PBT. Os limites de detecção e de quantificação foram determinados através dos parâmetros da curva extraída. O limite de detecção do método (LOD) variou entre 5,3 ng g-1 (o,p’-DDE) e 14,4 ng g-1 (PCB 52), enquanto que o limite de quantificação (LOQ) variou entre 10,0 ng g-1 (o,p’-DDE) e 35,8 ng g-1 (PCB 52). O método apresentou recuperação relativa entre 60% (o,p’-DDE) e 120% (o,p’-DDT), desvio padrão relativo (RSD) menor que 25% para todos os analitos. O uso de ovos de aves como bioindicador de background para contaminação de poluentes orgânicos persistentes é recomendado pela Convenção de Estocolmo. Porém, este estudo, inédito no bioma Pantanal, indicou que o uso do ovo de C. yacare, réptil que possui o sexo determinado pela temperatura do ninho, é promissor como bioindicador de contaminação de background para OCPs e PCBs considerando que foi detectada a presenta destes compostos a partir de uma técnica otimizada e validada aplicada nas amostras coletadas no Pantanal mato-grossense. Palavras-chave: Caiman yacare, poluentes orgânicos persistentes, extração sólido- líquido com partição em baixa temperatura, cromatografia gasosa. ABSTRACT This work shows the occurrence of persistent organic pollutants in the eggs of Caiman yacare, collected in two regions from Pantanal mato-grossense (Brazil), in 2012 and 2013. p,p'-DDE was the analyte found in higher concentration (51.3 - 78.1 ng g-1 of lyophilized egg) in both regions studied. For the extraction of organochlorine pesticides (p,p'-DDD, p,p'-DDE, o,p'-DDT, o,p'-DDD, o,p'-DDE, β-endosulphan and endosulphan sulfate) and polychlorinated biphenyls - PCBs - (congeners 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180) C. yacare eggs, except shell, were homogenized, lyophilized and was applied a method solid-liquid extraction with low temperature partition (SLE-LTP) optimized and validated. A gas chromatograph (GC) with electron capture detector (ECD) was used. PCB 209 10 ng mL-1 was used as internal standard and tetrabromobenzene (TBB) 10 ng mL-1 was used as surrogate. The optimization was based on a chemometric study included a 24 factorial design with three replications of the central point to determine the best conditions for the analysis of compounds of interest. Volume extracting solvent (8-12 mL), vortexing time (1-5 min), centrifugation time at 2,500 rpm (5-15 min) and time freezing (4-12 h) were the variables considered and tested at two levels, plus the triplicate central point. The normalized recovery was used as a response to evaluation of factors that influence the extraction method. The normalized responses were submitted to the Student’s t-test to determine the significant factors and interactions between factors were evaluated from the response surface. The optimized method includes: extractor solvent 12 mL (acetonitrile: ethyl acetate - 6,5:1,5 v/v), 5 min of vortexing time, 15 min centrifugation at 2,500 rpm and 12 hour freezing. To validate the method, The chromatographic area of each analyte relative to the internal standard chromatographic area vs. concentration were used to construct three analytical curves: (1) analytical curve based on standard solution, (2) analytical curve based on matrix (3) analytical curve based on extract. All points of each curve were submitted to Huber’s test for exclusion of outliers and the linearity was evaluated by the coefficient of determination (r2) and homoscedasticity. The instrumental detectability was evaluated by analytical curve based on standard solutions (3.0 – 71.7 ng mL-1 isooctane). The analytical curve based on matrix (2.3 – 53.8 ng g-1 lyophilized egg) was used to evaluate the matrix effect by comparing the residual variance between the analytical curve based on standard solution and the based on matrix. The results showed that the matrix components may affect the quantification of the analytes. The analytical curve based on extract (2.3 – 53.8 ng g-1 lyophilized egg) was used to determine the analytical parameters (accuracy, limit of detection, limit of quantitation, repeatability and intermediate precision) of SLE-LTP method. The limit of detection (LOD) ranged 5.3 ng g-1 (o,p'-DDE) and 14.4 ng g-1 (PCB 52), whereas the limit of quantitation (LOQ) ranged from 10.0 ng g-1 (o,p'-DDE) and 35.8 ng g-1 (PCB 52). The method showed a relative recovery from 60% (o,p'-DDE) and 120% (o,p'-DDT), the relative standard deviation (RSD) of less than 25% for all analytes. The Stockholm Convention recommends the use of bird’s eggs as bioindicator for contamination background of persistent organic pollutants. However, this study, unique in the Pantanal biome, indicated that the use of the egg of C. yacare, reptile which has sex determined by nest temperature, is promising as a bioindicator of OCPs and PCBs; it was detected present a these compounds in samples collected in Pantanal. Keywords: Caiman yacare, persistent organic pollutants, solid-liquid extraction with low temperature partitioning, gas chromatography LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Sub-regiões do Pantanal em território brasileiro com destaque para as regiões que estão inseridas neste trabalho ________________________ 21 Figura 2 – Exemplo de vegetação em mosaico no Pantanal durante o período chuvoso _____________________________________________________ 23 Figura 3 – Área plana de campo inundado dominada por gramíneas, no início do período de seca, localizada em Poconé – Rodovia Transpantaneira ____ 24 Figura 4 – Exemplo de reação de deslocamento mono e bimolecular para o p,p’-DDT _____________________________________________________ 30 Figura 5 – Exemplo de reação de eliminação mono e bimolecular para o p,p’- DDT ________________________________________________________ 30 Figura 6 – Proposta de mecanismo de reação da degradação do p,p’-DDT em p,p’-DDE em água no ambiente ___________________________________ 31 Figura 7 – Jacaré-do-Pantanal (Caiman crocodilos yacare) _____________ 37 Figura 8 – Interação de interferentes endócrinos e receptores nucleares em crocodilianos _________________________________________________ 40 Figura 9 – Localização aproximada dos munícipios de Poconé (1) e Barão de Melgaço (2) no Estado de Mato Grosso _____________________________ 45 Figura 10 – Região de coleta na Fazenda Piuval (Poconé, MT): localização dos ninhos amostrados em janeiro/2012 e 2013 _________________________ 45 Figura 11 – Região de coleta em Barão de Melgaço, margens do Rio Cuiabá, ponto de coleta de 10/02/2012 ____________________________________ 46 Figura 12 – Procedimento de coleta dos ovos de jacaré-do-Pantanal, em Mato Grosso ______________________________________________________ 47 Figura 13 – Demonstração gráfica para a determinação de LOD (A) e LOQ (B) a partir da curva analítica ________________________________________ 51 Figura 14 – Fluxograma geral da técnica de ESL-PBT _________________ 52 Figura 15 – Cromatograma (GC/ECD) para uma solução em isoctano contendo todos os analitos a 10 ng mL-1 ____________________________________ 60 Figura 16 – Demonstração gráfica do teste de Huber para o o,p’-DDD antes da construção da curva em solvente entre 3,0 e 71,7 ng mL-1 de isoctano ____ 61 Figura 17 – Curva em solvente para o o,p’-DDD entre 7,0 e 71,7 ng mL-1 de isoctano _____________________________________________________ 63 Figura 18 – Distribuição dos resíduos para o o,p’-DDD entre 7,0 e 71,7 ng mL-1 de isoctano ___________________________________________________ 63 Figura 19 – Probabilidade normal vs efeitos _________________________ 67 Figura 20 – Gráfico de Pareto para o sistema ESL-PBT ________________ 68 Figura 21 – Superfície de resposta para o planejamento proposto ________ 71 Figura 22 – Cromatograma CG/ECD: ponto na matriz (A1) em isoctano a 11,25 ng g-1 de ovo liofilizado para todos os analitos e testemunha (A2) em isoctano. B1 e B2 são uma ampliação para melhor visualização no intervalo de tempo de retenção entre 21 e 36 min_______________________________________ 73 Figura 23 – Demonstração gráfica do teste de Huber para o o,p’-DDD antes da construção da curva na matriz (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) ____________________________________________________ 74 Figura 24 – Curva na matriz do o,p’-DDD (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) _____________________________________________ 74 Figura 25 – Distribuição dos resíduos da curva na matriz para o,p’-DDD (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) _________________ 75 Figura 26 – Demonstração gráfica do teste de Huber para o o,p’-DDD antes da construção da curva extraída (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) ____________________________________________________ 77 Figura 27 – Curva extraída do o,p’-DDD (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) _____________________________________________ 78 Figura 28 – Distribuição dos resíduos da curva extraída para o,p’-DDD (intervalo entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de amostra liofilizada) _________________ 78 Figura 29 – Comparação entre as três curvas analíticas (em solvente, na matriz e extraída) para o o,p’-DDD. ________________________________ 81 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Lista dos POPs de acordo com a Convenção de Estocolmo ____ 27 Tabela 2 – Sumário de artigos encontrados na literatura incluindo a determinação de POPs em ovos de diversas espécies silvestres. _________ 33 Tabela 3 – Sumário da aplicação de extração líquido-líquido ou sólido-líquido com partição em baixa temperatura ________________________________ 36 Tabela 4 – Características gerais do jacaré-do-Pantanal _______________ 38 Tabela 5 – Sumário de estudos realizados com jacaré-americano e diversos interferentes endócrinos _________________________________________ 41 Tabela 6 – Localização geográfica dos ninhos encontrado em Poconé e Barão de Melgaço e número de ovos coletados em 2012 e 2013 ______________ 44 Tabela 7 – Condições cromatográficas para separação dos analitos ______ 49 Tabela 8 – Fatores, níveis e matriz do planejamento fatorial 24 usado na otimização do método ESL-PBT __________________________________ 54 Tabela 9 – Parâmetros analíticos e estatísticos da curva em solvente para cada um dos padrões analíticos (n ≥ 25)a ________________________________ 62 Tabela 10 – Normalização da porcentagem de recuperação obtidas para os analitos na otimização da técnica ESL-PBT e CG/ECD _________________ 65 Tabela 11 – Resultados dos efeitos ________________________________ 66 Tabela 12 – Matriz do planejamento fatorial completo 23 após a remoção da coluna “FT” dos fatores descritos na Tabela 10. ______________________ 67 Tabela 13 – Parâmetros analíticos e estatísticos para curva na matriz (n ≥ 25a) _____________________________________________________ 76 Tabela 14 – Parâmetros estatísticos e efeito matriz: comparação entre a curva em solvente (CS) e a curva na matriz (CM) para cada analito (n≥ 25)a _____ 76 Tabela 15 – Parâmetros analíticos e estatísticos para a curva extraída (n ≥ 25)a _________________________________________________________ 79 Tabela 16 – Parâmetros estatísticos e comparação entre a curva na matriz (CM) e a curva extraída (CE) para cada analito (n ≥ 25)a _______________ 80 Tabela 17 – Limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método ESL-PBT proposto para todos os analitos, obtidosa partir da curva extraída nas faixas lineares entre 2,3 e 53,8 ng g-1 (n ≥ 25)a _______________________ 82 Tabela 18 – Recuperação, desvio padrão relativo, LOD e LOQ reportados em diferentes estudos que usaram ovos de animais silvestres ou de galinha ___ 83 Tabela 19 – Recuperação relativa média e desvio padrão relativo para todos os analitos em mix ovos de C. yacare extraídos em três níveis de fortificação no mesmo dia (n = 10)a ____________________________________________ 84 Tabela 20 – Recuperação média e desvio padrão relativo para todos os analitos em mix de ovos de C. yacare fortificados com 45,0 ng g-1 e extraídos em três dias diferentes (n = 10)a. __________________________________ 84 Tabela 21 – Concentrações (ng g-1 de ovo liofilizado) encontradas nos ovos de jacaré-do-Pantanal analisadas (n = 9)a _____________________________ 85 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BAP – Bacia hidrográfica do Alto rio Paraguai BDE – Bromodifeniléter CBP – Proteína de ligação do citosol CT – Tempo de centrifugação DDD – Diclorodifenildicloroetano DDE – Diclorodifenildicloroeteno DDT – Diclorodifeniltricloroetano DHT – Dihidroxitestosterona ECD – Detector de captura de elétrons ES – Solvente extrator ESL – Extração sólido-líquido PBT – Partição em baixa temperatura FLD – Detector de fluorescência FT – Tempo de congelamento GC – Cromatografia gasosa Gn – Gonotropinas HCB – Hexaclorobenzeno HCH – Hexaclorociclohexano INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia LC – Cromatografia líquida LOD – Limite de detecção LOQ – Limite de quantificação. MS – Espectrômetro de massa OCP – Pesticidas organoclorados PBDEs – Polibromados difeniléteres PCB – Bifenilas policloradas PCDD – Dibenzo-p-dioxinas policloradas PCDEs – Policlorados difeniléteres PCDF – Dibenzofuranos policlorados PFD – Detector fotométrico de chama PFOS – Ácidos perflúoroctano sulfônico PFOSF – Perfluoroctano sulfonilflúor POP – Poluente orgânico persistente RSD – Desvio padrão relativo SBP – Proteína de ligação de hormônios sexuais SISBIO – Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade UNEP – United Nations for the Environment Protection UPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência UV – Detector de ultravioleta VT – Tempo de agitação em vortex SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................. 17 2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................... 20 2.1 O Pantanal .............................................................................................. 20 2.2 POPs – Poluentes Orgânicos Persistentes ................................................. 25 2.3 Jacaré-do-Pantanal .................................................................................. 37 3 OBJETIVOS ..................................................................................... 43 4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................. 44 4.1 Coleta dos ovos e determinação do teor de gordura ................................. 44 4.2 Reagentes ............................................................................................... 48 4.3 Condições cromatográficas ...................................................................... 48 4.4 Avaliação da resposta cromatográfica ...................................................... 49 4.5 Otimização do método de Extração Sólido-Líquido com Partição em Baixa Temperatura (ESL-PBT) por planejamento fatorial completo 24 com triplicata do ponto central e metodologia de superfície de resposta.......... 51 4.6 Validação do método ............................................................................... 57 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 60 5.1 Teor de gordura total em ovos de C. yacare .............................................. 60 5.2 Avaliação da resposta cromatográfica instrumental a partir da curva em solvente .................................................................................................. 60 5.3 Otimização da ESL-PBT por planejamento fatorial .................................... 64 5.4 Recuperações e recuperação normalizada ................................................ 64 5.5 Resultados dos efeitos e superfície de resposta ........................................ 66 5.5.1 Efeitos principais ............................................................................................. 68 5.5.2 Efeitos de interações de 2a-ordem ................................................................. 69 5.5.3 Efeitos de interações de 3a-ordem ................................................................. 69 5.5.4 Efeito de interação de 4a-ordem ..................................................................... 70 5.5.5 Superfície de resposta..................................................................................... 70 5.6 Validação do método ............................................................................... 72 5.6.1 Avaliação do efeito matriz .............................................................................. 72 5.6.2 Curva extraída e validação do método ESL-PBT ............................................. 77 5.7 Aplicação do método ............................................................................... 85 6 CONCLUSÕES.................................................................................. 87 REFERÊNCIAS.................................................................................. 88 ANEXOS ....................................................................................... 103 17 1 INTRODUÇÃO Poluentes orgânicos persistentes (POPs), tais como pesticidas organoclorados (OCPs) e bifenilas policloradas (PCBs), são amplamente distribuídos no ambiente. Neste trabalho mostramos a ocorrência de OCPs e PCBs em ovos de jacaré-do-Pantanal (Caiman yacare), coletados no Pantanal mato-grossense, e apontamos o seu uso como um possível bioindicador de contaminação de background. Matrizes ambientais e biológicas em geral são matrizes complexas e o método de extração dos compostos de interesse deve ser efetivo na eliminação de macromoléculas como lipídios, pois são incompatíveis com análises cromatográficas com detector por captura de elétrons (ECD) e podem produzir efeito matriz. O desafio adicional é a remoção dos compostos interferentes recuperando os analitos não-polares (POPs). Ovos de crocodilianos são ricos em lipídios pois essa energia concentrada é necessária para o desenvolvimento embrionário, durante a incubação, e para a estrutura da membrana celular1. O uso de qualquer organismo como bioindicador de contaminação ambiental requer o emprego de critérios ecológicos apurados, além de cuidadosa avaliação da confiabilidade analítica do método de análise a ser empregado. Neste trabalho, um método de extração sólido-líquido com partição em baixa temperatura (ESL-PBT) foi proposto para determinar OCPs e PCBs no conteúdo total de ovos de Caiman yacare, exceto a casca, que foi previamente homogeneizado e liofilizado. ESL-PBT é um método simples, de baixo custo, que permite realizar a extração e o clean-up em uma única etapa. O método foi otimizado por planejamento fatorial e a metodologia de superfície de resposta empregada auxiliou a determinar as variáveis que influenciam na eficiência do método de extração e clean-up. A otimização univariada avalia os efeitos de resposta para cada fator/variável separadamente e cada nível do fator analisado possui um tratamento de dados diferente, onde o tratamento é um indicativo de resposta e efeito em cada 18 experimento2. Este método tem a desvantagem de despender um longo período de tempo para avaliar o efeito de cada variável e não é capaz de prever as interações que podem ocorrer entre as variáveis a serem analisadas. Sendo assim, o planejamento fatorial e a metodologia de superfície de resposta têm a vantagem de avaliar diversos fatores separadamente e suas interações, indicando as condições mais importantes para a alcançar a resposta desejada. Portanto, o uso do planejamento fatorial e da metodologia de superfície de resposta tendem a fornecer uma ideia consideravelmente melhor do efeito global das condições experimentais3; 4; 5. A quimiometria mostrou ser proeminente neste estudo ambiental, pois é uma ferramenta sem limitações para otimização de experimentos. Sem esta ferramenta não teria sido possível, em um número reduzido de experimentos, estabelecer quais variáveis são significativas e como estas podem interagir entre si. A etapa de otimização foi publicada no periódico Microchemical Journal (Anexo A). Além do uso de planejamento fatorial, foi proposto um protocolo analítico e estatístico a partir da comparação das variâncias residuais de três curvas analíticas: (1) curva em solvente; (2) curva na matriz e (3) curva extraída. A curva em solvente é uma curva analítica construída a partir das respostas cromatográficas de soluções padrão de OCPs e PCBs em doze concentrações entre 3,0 e 71,7 ng mL-1 em isoctano para cada analito. A curva na matriz foi construída a partir de extratos obtidos a partir de ovo liofilizado que foi submetido ao método ESL-PBT otimizado e fortificados com soluções padrão de OCPs e PCBs após o processo de extração, em doze concentrações entre 2,3 e 53,8 ng g-1 de ovo liofilizado. O método de sobreposição na matriz consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações na matriz e construção da curva analítica relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos padrões6, nesta tese esta curva analítica foi denominada curva extraída e foi obtida nas mesmas condições que a curva na matriz, porém com fortificações no ovo liofilizado duas horas antes do processo de extração pelo método ESL-PBT. 19 A partir da avaliação estatística foi possível determinar que, neste estudo, a matriz e o processo de extração influenciam significativamente na precisão dos resultados e na resposta cromatográfica. A curva em solvente tem por objetivo fazer a avaliação da resposta do sistema cromatográfico, sendo possível determinar a detectabilidade instrumental, representada pelos limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) instrumentais. O LOD é a menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, pela técnica instrumental, enquanto que o LOQ é a menor concentração que pode ser quantificada dentro dos limites de precisão e exatidão do método6; 7. Enquanto que a curva na matriz é um recurso útil para avaliação de efeito matriz, o qual foi identificado para todos os analitos neste trabalho. Quando a extração influencia na sensibilidade do método, determinada pelo coeficiente angular da curva, a curva extraída deve ser utilizada para calcular os parâmetros analíticos do método (linearidade, repetitividade, precisão intermediária, LOD e LOQ), pois a determinação pela curva extraída é mais robusta se comparado com métodos mais utilizados, tais como relação sinal-ruído do branco para a determinação do limite de detecção. Este trabalho é o primeiro registro de contaminação de POPs em material de origem animal no Pantanal brasileiro baseando-se em uma busca no sistema Scopus, sem restrição de data de publicação, com os descritores: Pantanal and Brazil; Pantanal and pesticide or POPs or PCB or organochlorinated compounds. 20 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 O Pantanal A planície pantaneira abrange área brasileira, paraguaia e boliviana, sendo delimitada a oeste pela Cordilheira dos Andes e a leste pelo Planalto Central. Esta planície sedimentar ainda está ativa e sendo formada desde o período Quaternário da Era Cenozóico8. No Brasil, está situado nos Estados de Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, com área de aproximadamente 150.000 km2, inserido na bacia hidrográfica do Alto rio Paraguai ( AP ), ue por sua vez está inserida na bacia do Prata9. A parte brasileira do Pantanal representa 38,21% (aproximadamente 57.300 km2) da área total e compreende 16 municípios. Mato Grosso possui 35,36% da área brasileira, com participação de sete municípios. Assim, o Pantanal inicia, ao Norte, no município de Cáceres (MT) e finaliza, ao Sul, no município de Porto Murtinho (MS)10. A Figura 1 apresenta uma ilustração das sub-regiões do Pantanal, nos estados de Mato Grosso e Mato Grosso do Sul. 21 Figura 1 – Sub-regiões do Pantanal em território brasileiro com destaque para as regiões que estão inseridas neste trabalho Fonte: Silva; Abdon (1998)10. As principais atividades econômicas no Pantanal mato-grossense são a pecuária extensiva, a pesca, o turismo e a mineração11. A pecuária12, as alterações no regime de inundações e as queimadas13 são as atividades que mais contribuem para o desmatamento na planície pantaneira. 22 Estima-se que a biodiversidade do Pantanal é composta por, aproximadamente, 470 espécies de aves, 270 espécies de peixes, 120 espécies de mamíferos, 180 espécies de répteis e 40 espécies de anfíbios e cerca de 1860 espécies formam a flora pantaneira14; 15. O pulso de inundação contínuo é o principal fator para a manutenção desta biodiversidade e seus processos ecológicos16. Nas últimas duas décadas o Pantanal se tornou uma grande área de refugio para espécies que estão criticamente ameaçadas de extinção no restante do Brasil, como por exemplo, tuiuiú (Jabiru mycteria), arara azul (Anodorhynchus hyacinthinus), mutum de penacho (Crax fasciolata)17, veado pantaneiro (Blastocerus dichotomus) e veado campeiro (Ozotocerus bezoarticus)18. Este trabalho, incluiu duas sub-regiões localizadas no estado de Mato Grosso, inseridas no denominado Pantanal-Norte: Poconé e Barão de Melgaço, em destaque na Figura 1. A sub-região de Poconé agrega áreas dos municípios de Cáceres, Poconé, Nossa Senhora do Livramento, Barão de Melgaço e Santo Antônio do Leverger, enquanto que a sub-região de Barão de Melgaço conta com áreas dos municípios de Itiquira, Barão de Melgaço e Santo Antônio do Leverger. Estas duas sub-regiões contribuem com 10,21% e 7,8%, respectivamente, da área total do Pantanal brasileiro. Barão de Melgaço, apesar de contribuir com menor área, contém 99,2% de sua área territorial dentro do Pantanal, Poconé possui 80,3%10. A coleta dos ovos de jacaré-do- Pantanal (Caiman yacare) dependia de apoio de cooperativas locais de criação de jacaré, de fazendeiros e pantaneiros da região, estas foram as regiões onde este apoio foi obtido. Os principais rios destas sub-regiões são o rio Paraguai e o rio Cuiabá10. A drenagem do Pantanal Norte se dá principalmente pelo rio Paraguai, sendo o rio Cuiabá um dos seus principais afluentes. A inundação desta região ocorre pela ação da chuva, mas, principalmente, pela baixa declividade, formando um mosaico de habitats (Figura 2), resultado da combinação de diferentes tipos de solo e do regime de inundação19. 23 Figura 2 – Exemplo de vegetação em mosaico no Pantanal durante o período chuvoso Fonte: Oliveira (2014)20 Este mosaico é formado por diversos tipos de vegetação, sendo a mais representativa o cerrado (36%), cerradão (22%), cerrado sensu stricto (14%) e campo inundado (7%). Na região de estudo deste trabalho, prevalece o cerradão e o campo inundado (16,8% em Poconé, Figura 3) e cerrado (35,8% em Barão de Melgaço)15, influenciando na distribuição dos ninhos de jacaré. Pois, em geral, os crocodilianos desovam, preferencialmente, em mata ciliar (bosque) e em campos inundados (savanas)21. Sendo assim, as coletas em Poconé foram realizadas em campo inundado (localmente denominado de campão) e em Barão de Melgaço em cerrado, próximo a mata ciliar. 24 Figura 3 – Área plana de campo inundado dominada por gramíneas, no início do período de seca, localizada em Poconé – Rodovia Transpantaneira Fonte: autor Estudos pluviométricos e de variação de cheias e vazantes no Rio Paraguai, medidas desde 1900, demonstram diferentes cotas médias anuais para o Rio Paraguai22. Assim, a distribuição das chuvas durante o período destes estudos variou alternadamente e influenciou diretamente na dinâmica do principal rio da planície pantaneira. A inundação do Pantanal promove a ligação de diferentes áreas (rio e planície, rio e lagoa, lagoa e planície) e esta conexão determina a transferência de matéria, nutrientes e animais entre os compartimentos ligados. A transferência de matéria é influenciada também pela profundidade da água na planície, pela dinâmica espaço/temporal e pela extensão do alagamento, alterando a oferta de alimentos e estocagem de água no Pantanal23. O sistema de alagamento do Pantanal depende de dois fatores preponderantes, chuva e inundação oriunda de rios. O primeiro fator se torna relevante quando o nível fluviométrico dos rios atingem valores que não permitam o escoamento das águas. Com o início das chuvas, o solo encharca 25 e o nível dos rios sobe alagando o pantanal, enquanto que no período de seca a diminuição da precipitação pluviométrica e a diminuição do nível dos rios reduzem a profundidade de água na planície, ocasionando o escoamento e a evapotranspiração, formando poças de água isoladas23. O processo de inundação e escoamento não é uniforme em toda a região do Pantanal, podendo ocorrer regiões que serão inundadas primeiramente e serão as últimas a serem escoadas, ocasionando inundações de baixa amplitude, porém de longa duração. Estas regiões contribuem para um maior contato dos animais com o ambiente aquático por um maior período de tempo. Devido a este processo, o Pantanal, mesmo em locais com pouca atividade antrópica, pode receber uma variedade de compostos orgânicos, inclusive os chamados poluentes orgânicos persistentes - POPs24; 25; 26 através dos rios que passam por diferentes cidades, que não pertencem a este bioma. 2.2 POPs – Poluentes Orgânicos Persistentes Em 2001, o Programa das Nações Unidas para o Meio Ambiente (UNEP) selecionou um grupo de 12 compostos químicos (ou classes de compostos) para o mais importante monitoramento global de poluentes. Estes compostos foram denominados de poluentes orgânicos persistentes (POPs)27 e possuem uma combinação particular de propriedades físicas e químicas, tais como coeficiente de partição octanol-água e solubilidade, de tal modo que, uma vez liberados para o ambiente, eles28; 29:  Permanecem inalterados durante longos períodos de tempo (vários anos);  Tornam-se amplamente distribuídos por todo ambiente como resultado de processos naturais, envolvendo o solo, a água e o ar;  Acumulam-se em tecidos adiposos dos organismos vivos, incluindo seres humanos;  São encontrados em concentrações mais elevadas em níveis mais elevados na cadeia alimentar e 26  São tóxicos/interferentes endócrinos para seres humanos e animais silvestres. Em 2005, o Brasil tornou-se signatário da convenção de Estocolmo, através do Decreto no 5472, de 20 de junho de 2005, comprometendo-se a proibir e/ou adotar as medidas jurídicas e administrativas que fossem necessárias para eliminar a produção, a utilização, a importação e a exportação de poluentes orgânicos persistentes, bem como estimular e/ou efetuar atividades de pesquisa, desenvolvimento, monitoramento dos poluentes orgânicos persistentes30. Em 2009, nove compostos foram adicionados à lista original. No mesmo ano, o Relatório Regional da América Latina e Caribe sobre monitoramento dos POPs31 destacou que nestas regiões os dados sobre a presença de POPs no ambiente são insuficientes. Também destacou que alguns dos dados existentes, por falta de controle de qualidade, não poderiam ser considerados no cenário global. A geração de dados para a ocorrência de POPs e sua dispersão com alta confiabilidade analítica continua a ser uma questão crítica para a América Latina. Em 2011, houve mais uma inclusão na lista, totalizando 22 compostos ou classe de compostos, descritos na Tabela 1. 27 Tabela 1 – Lista dos POPs de acordo com a Convenção de Estocolmo Item Composto ou classe* Uso Isômeros, homólogos ou metabólicos 1 Aldrin Pesticida Aldrin e isodrin 2 Dieldrin Pesticida 3 Endrin Pesticida 4 Clordano Pesticida e isômeros 5 Heptacloro Pesticida 6 HCB Pesticida e industrial 7 Mirex Pesticida 8 Toxafeno Pesticida Centenas de isômeros 9 DDT Pesticida p,p’-DDT, o,p’-DDT, p,p’-DDE, o,p’-DDE p,p’-DDD, o,p’-DDD 10 PCB Industrial e subproduto 209 congêneres 11 PCDD Subproduto 75 congêneres 12 PCDF Subproduto 135 congêneres 13 Chlordecane (Kepone) Pesticida 14 Lindano Pesticida 15 -HCH Pesticida e subproduto 16 HCH Pesticida e subprodutos 17 Hexabromobifenila Industrial 42 congêneres 18 Tetra e penta-BDE Industrial 19 Hexa e hepta-BDE Industrial 20 PFOS e seus sais PFOSF Industrial Isômeros de cadeia lateral 21 Pentaclorobenzeno Pesticida, industrial e subproduto 22 Endosulfan Pesticida e isômeros sulfato de endosulfan *abreviações de acordo com a lista de abreviaturas Fonte: Convenção de Estocolmo (2014)27 Pesticidas organoclorados (OCPs) e bifenilas policloradas (PCBs) são compostos não polares, classificados como POPs de acordo com a Convenção de Estocolmo, sendo amplamente distribuídos e objetos de crescente atenção científica32. Para estudos de monitoramento global de POPs, a UNEP (Programa das Nações Unidas para o Meio Ambiente) os caracterizou em “essenciais” ou “recomendados”. p,p’-DDD, p,p’-DDE e p,p’-DDT foram classificados como “essenciais”, sendo o DDE considerado o metabólito mais importante. Os isômeros o,p’-DDD, o,p’-DDE e o,p’-DDT foram classificados como “recomendados”. Para estudo de PCBs, o mínimo deve ser de sete congêneres (28/31, 52, 101/90, 118, 138, 153 e 180) que foram considerados “essenciais” 28 para monitoramento de rotina em amostras de peixes ou produtos alimentícios ao redor do mundo33. endosulfan, -endosulfan e endosulfan sulfato não foram classificados pela UNEP, porém no Brasil sua comercialização foi permitida até 31 de julho de 201334. Neste trabalho, optou-se por estudar pesticidas organoclorados (isômeros do DDT e seus metabólicos,  e  endosulfan e endosulfan sulfato) e sete congêneres de PCBs (28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180). OCPs foram largamente utilizados durante a II Guerra Mundial para o controle da malária e dengue e até a década de 1970 foram utilizados para controle de insetos transmissores destas doenças35. No Brasil, além do controle da malária e dengue, o DDT foi utilizado para o controle de leishmaniose visceral e comumente usado na agricultura como pesticida, devido ao seu baixo custo e alta eficiência36. No estado de Mato Grosso, após a proibição do uso de DDT, o excesso deste pesticida foi estocado de maneira irregular em área aberta da Fundação Nacional de Saúde, na cidade de Várzea Grande (região metropolitana de Cuiabá), resultando na contaminação do solo desta região37. O endosulfan tornou-se um importante agroquímico e agente de controle de pragas, resultando na sua utilização global (por exemplo: União Europeia, América do Norte, Brasil, México e Canadá) no controle uma grande variedade de pragas de insetos38. Estima-se que o uso de endosulfan no Brasil foi de 23.000 toneladas entre 1958 e 200239. PCBs foram amplamente utilizados em uma grande variedade de atividades e aplicações industriais e comerciais, incluindo óleo de transformadores, óleos hidráulicos, fluidos de transferência de calor e aditivos plásticos, devido à sua alta estabilidade química, não são inflamáveis, apresentam ponto de ebulição elevado e propriedades de isolante elétrico40; 41. Os congêneres 28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180,dentre outros, eram os congêneres mais abundantes do Aroclor®, o mix de PCBs mais comum e conhecido que foi produzido entre 1930 e 197042. No Brasil, não existe registro de produção de PCBs, todos os produtos utilizados foram importados dos Estados Unidos ou Alemanha. Em 1981, a produção, importação e uso foram 29 proibidos no Brasil, porém equipamentos que continham óleo isolante com PCBs já instalados continuaram em operação, tornando-se potencial fonte de contaminação, até serem totalmente substituídos por produtos livres de PCBs43. OCPs e PCBs têm sido reportados em estudos ecológicos e de saúde humana como interferentes endócrinos, supressores do sistema imune, cancerígenos e neurotóxicos44; 45; 46. Possivelmente, OCPs e PCBs podem atuar no sistema endócrino porque alguns receptores endócrinos, em especial os estrogênicos, são receptores nucleares e particularmente pouco específicos, sendo suscetíveis à ativação por uma variedade de xenoestrógenos47. O p,p’-DDE, por exemplo, é considerado um antagonista de receptores androgênicos, inibindo a ligação de andrógenos, tais como DHT([3H]-5 - dihidroxitestosterona), aos receptores androgênicos de ratos machos influenciando em seu desenvolvimento48. Metabólitos hidroxilados de PCBs podem inibir a ação de sulfotransferases necessárias para o metabolismo de estradiol, aumentando assim a biodisponibilidade do 17--estradiol49. OCPs e PCBs possuem baixa hidrossolubilidade (solubilidade entre 1,2 e 5,5 µg/L a 25 oC) e alta lipossolubilidade (logKow entre 4,62 e 9,64)36. Quando estes compostos estão no ambiente e não foram absorvidos por plantas, micro- organismos ou animais, geralmente, estão presentes em água, que, geralmente, possui um pH7±2 e baixa concentração de reagentes nucleófilos e eletrófilos. Nestas condições, as reações de deslocamento bimolecular e eliminação bimolecular não são observadas50. Reações de ionização são favorecidas em água devido a sua capacidade de solvatação de íons e alta constante dielétrica que estabilizam íons intermediários. Portanto, reações de deslocamento monomolecular ou eliminação monomolecular são mais frequentes em condições ambientais50. Considerando estas reações, propomos as equações para o DDT em reações de deslocamento (Figura 4) e eliminação (Figura 5). De fato, Bailey50 indica degradação de DDT a DDE e a maior persistência do DDE. 30 Figura 4 – Exemplo de reação de deslocamento mono e bimolecular para o p,p’-DDT Fonte: proposta do autor Figura 5 – Exemplo de reação de eliminação mono e bimolecular para o p,p’-DDT Fonte: proposta do autor A reação de eliminação de cloro do DDT em solução aquosa e pH neutro produz o DDE, com proposta de mecanismo demonstrado na Figura 6, que é mais estável por possuir orbital sp2 no carbono alifático terciário, consequentemente mais resistente à degradação. As reações de deslocamento ou eliminação monomolecular em orbital sp2 (mais eletronegativos que os sp3) não são observadas por não poder estabilizar uma carga positiva e não poder formar um carbocátion intermediário necessário50. p,p’-diclorodifenil-hidroxidiclotoetano p,p’-DDT p,p’-DDT p,p’-DDE 31 Figura 6 – Proposta de mecanismo de reação da degradação do p,p’-DDT em p,p’- DDE em água no ambiente Fonte: proposta do autor Devido a alta lipossolubilidade e por estar presente na forma molecular, estes compostos apresentam capacidade de bioacumulação no tecido adiposo de organismos ou em tecidos com alto teor de lipídios de vegetais, favorecendo a biomagnificação na cadeia trófica51. Considerando-se a distribuição ubíqua dos POPs, estes compostos tem sido encontrados em água de rio51; 52 e sedimentos52; 53; 54 na região do Pantanal. Possavatz e colaboradores55 detectaram -endosulfan e endosulfan sulfato em concentrações entre 5,7 e 79,3 g kg-1 em sedimento de fundo no rio Cuiabá. Maraschim56 detectou p,p’-DDT em concentrações de 0,10 e 0,24 g L-1 e dieldrin (abaixo do limite de quantificação) em rios desta região, dentre eles o rio Cuiabá. Cunha57 detectou p,p’-DDT (em 54% das amostras), p,p’- DDE (em 35% das amostras) e β-endosulfan (em 22,7% das amostras) em 32 sedimentos dos mesmos rios estudados por Maraschim. Vieira e colaboradores26 destacam diversos trabalhos que foram realizados no Pantanal Sul, os quais relatam a ocorrência de pesticidas organoclorados em rios formadores do Pantanal. Os principais resultados apresentados pelos autores são níveis de ciclodienos (grupo químico do dieldrin, endosulfan, endrin e heptacloro) que variaram entre 0,21 e 4,5 mg kg-1 (base seca) para sedimentos do Rio Taquari. Laabs e colaboradores24 detectaram 19 pesticidas (principalmente organoclorados) e 3 metabólitos (p,p’-DDE, endosulfan sulfato, dietilatrazina) em amostras de água e sedimento no rio Cuiabá, no rio Mutum, na lagoa Sia Mariana e em água de chuva na região de Barão de Melgaço. O monitoramento ambiental (quali e/ou quantitativo) destes compostos pode ser realizado utilizando a determinação da dose corpórea dos mesmos em organismos, denominados bioindicadores58. A escolha do bioindicador deve ser coerente com os objetivos da pesquisa, preencher a lacuna entre as ações necessárias e sustentabilidade, gerar resultados de fácil interpretação e depende das informações específicas do ambiente de estudo e das características ecológicas das espécies que estão presentes no local59; 60. A escolha de uma espécie como bioindicador deve levar em conta sua ocorrência (endêmica ou migratória), alimentação, hábitos, nível da cadeia alimentar, facilidade de coleta e influência das estações climáticas58; 60. O uso de ovos de aves silvestres como bioindicador de background de POPs é recomendado pela UNEP33. Ovos de outros animais silvestres como bioindicadores de POPs também tem sido reportado na literatura, na Tabela 2 estão sumarizados alguns dos estudos encontrados. O estudo com ovos também tem sido correlacionados com a possibilidade de transferência materna de POPs em aves61; 62, tartarugas63; 64 e crocodilianos65, com possibilidade de bioacumulação e diminuição da taxa de eclosão dos ovos em fêmeas de jacaré expostas à interferentes endócrinos65. Além disso, répteis têm sido usados como bioindicadores de contaminantes ambientais66. 33 Tabela 2 – Sumário de artigos encontrados na literatura incluindo a determinação de POPs em ovos de diversas espécies silvestres. Ref. Animal / local Analitos* Extração/clean up Análise* 63 Tartaruga-gigante (Dermochelys oriacea) / Estados Unidos PCBs, OCPs e PCBDEs Fluido pressurizado/alumina CG/ECD e CG/MS 67 Tartaruga marinha (Caretta caretta) / Estados Unidos PCBs Soxhlet/ florisil CG/ECD e CG/MS 68 Tartaruga marinha (Caretta caretta) / Estados Unidos PCBs e OCPs Fluido pressurizado/florisil CG/ECD 69 Tartaruga-verde (Chelonia mydas) / Malásia PCBs, OCPs e PBDEs Solvente pressurizado e temperatura elevada/cromatografia em gel e florisil CG/MS/MS 70 Gaivota (Pagophila ebúrnea) / Arquipélago Ártico canadense PCBs, OCPs, PBDEs Sólido-líquido/cromatografia em gel e florisil CG/MS 71 Ave marinha (Stercorarius skua) / Escócia PCBs Micro-extração em fase sólida/florisil CG/ECD 72 Gaivota-de-pata-amarela (Larus michahellis) / Península Ibérica PFOS Sólido-líquido/carvão ativado e ácido acético glacial UPLC-MS/MS 73 Duas espécies de estorninho (Sturnus vulgaris e Sturnus unicolor) / América do Norte, Europa e Austrália OCPs, PBDEs, HCHs e PCBs Soxhlet/sílica acidificada CG/MS 74 Quatro espécies de gaivota e corvo (Corvus cornix) / Karelia (Rússia) DDE, lindano Sólido-líquido/ácido sulfúrico CG/ECD 75 Duas espécies de gaivotas (Larus michahellis e Larus audouinii) / Espanha PCDDs, PBDEs, PCBs, OCPs, PFCs Sólido-líquido ou Soxhlet/filtro de PTFE UPLC-MS/MS, CG/MS 76 Quatro espécies de gaivotas (Laridae) / Canadá PBDEs Sólido-líquido GC/MS 77 14 espécies de pássaros / Espanha PBDEs Líquido pressurizado/SPE com alumina CG/MS 78 Jacaré do papo-amarelo (Caiman latirostris) / Argentina OCPs e PCBS Sólido-líquido/ SPE com alumina e florisil CG/ECD 79 Jacaré do papo amarelo (Caiman latirostris) / Argentina PCBs e OCPs Sólido-líquido/ SPE com alumina e florisil CG/ECD 80 Crocodilo do Nilo (Crocodylus niloticus) / Moçambique OCPs, PCBs, PBDEs Líquido-líquido/ácido sulfúrico CG/MS 81 Crocodilo Morelet (Crocodylus moreletii) / Belize OCPs Cromatografia de permeação em gel CG/ECD 82 Jacaré americano (Alligator mississipiensis PCBs Soxhlet/florisil CG/ECD *Abreviações de acordo com a lista de abreviações 34 Sendo assim, considerando que o jacaré-do-Pantanal (Caiman yacare) é uma espécie abundante na região do Pantanal, topo de cadeia alimentar, com postura anual bem delimitada, o uso de ovos desta espécie para estudo de ocorrência de POPs na região do Pantanal se torna uma possibilidade viável. O ovo de jacaré pode ser considerado como uma matriz complexa, sendo composta principalmente por lipídios e proteínas. Análises por Cromatografia Gasosa (CG) requerem preparação das amostras com o intuito de separar os interferentes, tais como a gordura, e concentrar os analitos de interesse. Amostras ricas em lipídios podem influenciar na escolha dos métodos de clean-up e de extração e, assim, nos resultados analíticos. Comparando o mesmo método com diferentes matrizes, van der Hoff e colaboradores83 demonstraram que para a determinação de pesticidas organoclorados em diferentes amostras gordurosas utilizando um mesmo método de clean-up e extração gera resultados distintos. Por exemplo, segundo os autores, amostras de gordura de porco resultaram em limites de detecção (LOD) entre 10 e 50 µg kg-1 de gordura para níveis de fortificação entre 190 e 510 µg kg-1 de gordura, enquanto que amostras de ração de coelho resultaram em LOD entre 0,1 e 0,6 µg kg-1 para níveis de fortificação entre 1 e 6 µg kg-1 de gordura aplicando os mesmos métodos de clean-up e de extração. Os principais métodos de extração para determinação de OCPs e PCBs em matrizes ambientais são Soxhlet convencional ou automatizado, extração por fluido supercrítico, cromatografia em coluna, ultrassom assistido, por micro-ondas assistido, líquido pressurizado e extração em fase sólida84. Enquanto que o uso de ácido sulfúrico, alumina, sílica, florisil e cromatografia de permeação em gel são os métodos de clean-up mais utilizados84. Porém, em geral, estes métodos apresentam um alto custo de solventes orgânicos e/ou envolve várias etapas de preparação. A extração sólido-líquido com partição em baixa temperatura (ESL- PBT) é um método simples e de baixo-custo, permitindo em uma única etapa a extração e o clean-up. O uso da ESL-PBT tem sido reportado para a extração de piretróides e organofosforados em alimentos frescos ou processados85; 86. No entanto, sua aplicação para a extração de POPs em amostras com alto teor 35 lipídico ainda não havia sido reportado. Outra vantagem no uso de baixa temperatura no processo de extração é ue OCPs, como o p,p’-DDT, podem degradar na extração sólido-líquido com o aumento de temperatura87. A Tabela 3 sumariza as principais aplicações do método de extração sólido-líquido ou líquido-líquido com partição em baixa temperatura. 36 Tabela 3 – Sumário da aplicação de extração líquido-líquido ou sólido-líquido com partição em baixa temperatura Ref. Matriz Analitos Análise* Limites (detecção/ quantificação)* Recuperação (%) 88 Água Piretróides (λ-cialotrina, permetrina, cipermetrina, deltametrina) CG/ECD LOD 1,1 a 3,2 µg L-1 LOQ 2,7 a 9,5 µg L-1 57 a 81 89 Óleo de soja, de amendoim e de gergelim 14 pesticidas organofosforados GC/PFD LOD 2 a 5 µg kg-1 LOQ 7 a 18 µg kg-1 58 a 106 90 Leite Piretróides (cipermetrina, deltametrina) GC/ECD LOQ 0,75 µg L-1 84 a 93 91 Peixe 02 piretróides e 19 pesticidas organoclorados GC/MS LOD 0,5 a 20 μg kg-1 81,3 a 113,7 92 Água Carbamatos (aldicarb, carbofuran e carbaril) LC-UV LOD 5 a 10 µg L-1 LOQ 17 a 33 µg L-1 90 a 96 93 Manteiga Piretróides (cipermetrina, deltametrina) GC/ECD LOD 0,082 e 0,11 μg g-1 LOQ 0,28 e 0,32 μg g-1 90 85 Tomate Organofosforados (clorpirifós, cialotrina) Piretróides (cipermetrina, deltametrina) GC/ECD LOD 0,004 µg g-1 LOQ 0,0125 µg g-1 79 a 97 94 Mel Organofosforados (clorpirifós, cialotrina) Piretróides (cipermetrina, deltametrina) GC/ECD LOD 0,016 µg g-1 LOQ 0,032 µg g-1 85 86 Batata Organofosforados (clorpirifós, cialotrina) Piretróides (cipermetrina, deltametrina) GC/ECD LOQ 18,7 a 26,4 µg kg-1 82,1 a 97,9 95 Urina humana Benzodiazepinos (diazepam, bromazepam, clonazepam, lorazepam) LC/MS LOD 1 a 5 µg L-1 LOQ 3,3 a 17 µg L-1 72,4 a 100,4 96 Músculo bovino Avermectina e milbemicim LC-MS e LC-FLD LOD 0,5 a 1 μg kg-1 LOQ 1 e 2 μg g-1 88,9 a 100,7 *Abreviações de acordo com a lista de abreviações. 37 2.3 Jacaré-do-Pantanal O jacaré-do-Pantanal (Figura 7) é um crocodiliano que pertence à ordem Crocodylia, família Alligatoridae. Esta família contém quatro gêneros Alligator, Caiman, Melanosuchus e Paleosuchus97. A Caiman crocodilos yacare é a espécie que ocorre, principalmente, no Pantanal. Figura 7 – Jacaré-do-Pantanal (Caiman crocodilos yacare) Fonte: autor Este crocodiliano é generalista, ou seja, sua alimentação é variada, dependendo da disponibilidade e facilidade de captura. No Pantanal, a dieta do jacaré depende da dinâmica hídrica, sendo que peixes e insetos são os principais itens consumidos pelo jacaré-do-Pantanal98. Estudos de zoologia do Caiman yacare estão em desenvolvimento, sendo uma espécie com muitos aspectos ainda desconhecidos, como por exemplo, um estudo detalhado do desenvolvimento embrionário desta espécie, sistema de reprodução em cativeiro, comportamento ecológico e determinação de níveis de POPs. Na base Scopus, uma busca realizada em 08 de maio de 2014, por “Caiman crocodilus yacare”, “Caiman yacare” ou “Caiman c. yacare” 38 resultou em 25 trabalhos sendo alguns deles sobre: proteínas séricas99; 100; contagem populacional, conservação e gestão18; 101; 102; diferentes análises da carne do jacaré103; 104; marcadores seletivos de estresse oxidativo105; presença de mercúrio em jacaré capturados em quatro regiões diferentes do Pantanal106; relações de tamanho e idade desta espécie107; presença de parasitas108; 109; processamento da carne110; 111; 112; análises microbiológicas de carne113 e aspectos morfológicos e citoquímicos dos glóbulos sanguíneos114; 115; 116. Em contraponto, a espécie Caiman latirostris (jacaré do papo-amarelo) possui estudos mais amplos sobre o sistema de criação e reprodução117; 118; fertilidade119; termo-regulação, comportamento ecológico-comportamental120 e outros. Esta espécie possui ampla distribuição geográfica, no Brasil, ocorre naturalmente na Bacia do rio São Francisco e do rio Paraná121. As principais diferenças entre as duas espécie são formato do focinho (C. latirostris possui um focinho mais largo), número de escudos nucais (C. latirostris possui três e C. yacare possui quatro), o ciclo reprodutivo do C. Latirostris é variável, com postura entre janeiro e junho, dependendo da região em que vive e não havendo forte influencia da temperatura e do nível da água durante as chuvas quanto o ciclo reprodutivo do C. yacare122. Algumas características da espécie C. yacare estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4 – Características gerais do jacaré-do-Pantanal Característica Descrição Tipo de ninho ‘em monte’ utilizando galhos e folhas secas Média do tamanho do ninho 150 x 40 cm Período de postura Janeiro e Fevereiro Período de incubação 70 dias Ovos por ninho (média) 15 a 40 (25) Comprimento médio do ovo 6,8 cm Largura média do ovo 4,2 cm Peso médio do ovo 75,3 g Temperatura interna do ninho 25 a 32 oC Distinção visual externa entre macho e fêmea Não há Maturidade sexual Machos acima de 90 cm e fêmeas acima de 80 cm (equivalente até dez anos de idade) Fonte: Campos et al (2014)107; Coutinho et al (2005)122; Ferguson (1985)123; Campos (2003)124 39 Devido a ausência de cromossomos sexuais, o sexo dos filhotes de jacaré-do-Pantanal, assim como de todos os crocodilianos, é determinado pela temperatura de incubação no ninho125. A temperatura do ninho depende do local de postura e é afetada pelo nível de insolação, pelas chuvas, pela temperatura do ambiente e pelo calor produzido pela decomposição do material do ninho. Também afeta a probabilidade de sobrevivência dos embriões, acelerando o seu desenvolvimento e diminuindo o tempo em que os ovos estão vulneráveis a inundação e a predação124;126. Para o jacaré-do-Pantanal, temperaturas menores que 30 oC geram 100% de filhotes fêmeas, temperaturas entre 30,5 e 31,5 oC geram aproximadamente 10% machos e temperaturas acima de 31,5 oC geram de 80 a 100% de filhotes machos124. Por demonstrar dependência da temperatura para determinação do sexo, os crocodilianos são mais susceptíveis à ação de interferentes endócrinos em comparação às espécies que não dependem da temperatura por possuir genótipo de determinação sexual127. Esta susceptibilidade pode estar relacionada com a ação de substâncias estrogênicas ou androgênicas durante o desenvolvimento das gônadas destes répteis no período de incubação128, em especial até os 40 dias de incubação quando ainda pode haver reversão sexual nesta espécie124. Conforme citado anteriormente, receptores estrogênicos são do tipo nuclear pouco seletivo. A Figura 8 ilustra a interação entre interferentes endócrinos e os receptores nucleares em crocodilianos129. Note que não há interação entre os interferentes endócrinos com receptores da circulação e do citosol130. 40 Figura 8 – Interação de interferentes endócrinos e receptores nucleares em crocodilianos SBP: Proteína de ligação de hormônios sexuais; CBP: proteína de ligação do citosol; ECDs: interferentes endócrinos; Gn: gonotropinas. Fonte: Guillette (2000)129 Um estudo realizado com jacaré-americano (Alligator mississippiensis)131 demonstrou alterações nas gônadas de filhotes, cujos ovos foram expostos a p,p’-DDE durante a incubação. Neste estudo, ovos de jacaré-americano foram expostos ao p,p’-DDE e estrógenos (como grupo controle positivo) em 41 temperaturas controladas para a geração de machos (acima de 31,5 oC). De acordo com os autores, o p,p’-DDE, em concentrações entre 0,0001 e 100 ng g-1 de ovo, foi capaz de influenciar na diferenciação das gônadas, porém não alterou, significativamente, as funções das gônadas e características sexuais primárias. O mais importante neste estudo foi terem demonstrado a sensibilidade das gônadas deste crocodiliano à baixas concentrações de um interferente endócrino de alta persistência. A Tabela 5 relaciona outros estudos realizados com interferentes endócrinos e A. mississippiensis. Tabela 5 – Sumário de estudos realizados com jacaré-americano e diversos interferentes endócrinos Ref Principais resultados 132; 133 Relaciona ação estrogênica (anti-androgênico) dos compostos p,p’-DDD, p,p’-DDE, o,p’-DDE em machos e antiestrogênica em fêmeas 132 Relaciona a ação de indutor enzimático (P450 aromatase) da atrazina 134; 135 Demonstram possíveis interações do DDT, dieldrin, alachlor com receptores estrogênicos e de progesterona 130 Interação de POPs com proteínas do citosol não foi detectada. 136 Fêmeas jovens na região da Flórida – lago Apopka - (níveis elevados de POPs) apresentaram folículos policísticos nos ovários 132 Diminuição da atividade da enzima aromatase gonadal em fêmeas da região da Flórida 136; 137 Diminuição da concentração de testosterona, na organização dos túbulos seminíferos e no tamanho do pênis em machos jovens na região da Flórida 138 Queda na produção de 17--estradiol em fêmeas jovens e aumento em machos jovens na região da Flórida 139 140 Diminuição na viabilidade dos ninhos com queda na taxa de eclosão de ovos no lago Apopka. Diversos estudos foram realizados com o jacaré-americano do lago Apopka, pois este lago, segundo maior lago da Flórida (EUA) com aproximadamente 12.500 ha, foi muito conhecido pelo esporte de pesca na década de 1970. Porém, o desenvolvimento da agricultura, industrial e urbano ao redor do lago contribuíram para a degradação da qualidade da água e do habitat silvestre. A partir da década de 1980, notaram o declínio da população de jacaré-americano, do esporte de pesca, culminando no final da década de 1990 na ocorrência de mortalidade de 676 aves (principalmente pelicanos)141;142. Estes eventos foram atribuídos a toxicidade de pesticidas e resultou em anos de pesquisas e remediação para garantir o futuro da vida silvestre no local. 42 Diante do exposto, nota-se que poluentes orgânicos persistentes têm sido relatados em ovos de animais silvestres e que podem influenciar na dinâmica da vida silvestre por serem bioacumulativos e atuarem nos receptores estrogênicos, exibindo ação de interferente endócrino, em especial nos crocodilianos. Assim, o C. yacare, espécie pouco estudada atualmente, se torna uma alternativa de bioindicador para monitoramento de contaminação de background de POPs no bioma Pantanal. 43 3 OBJETIVOS Esta tese teve como objetivo geral contribuir para a avaliação de ovos de jacaré como bioindicador da contaminação do Pantanal mato-grossense por poluentes orgânicos persistentes (POPs). Como objetivos específicos destacam-se:  Estabelecer e validar método para determinação de POPs em ovos de jacaré-do-Pantanal (Caiman yacare);  Avaliar a presença de POPs em ovos de jacaré coletados em duas regiões do Pantanal Norte, em duas épocas de coleta. 44 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Coleta dos ovos e determinação do teor de gordura A coleta dos ovos foi autorizada pelo SISBIO (Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade), processo no 27347-2 (Anexo B). Em janeiro e fevereiro de 2012 e 2013, foram coletados ovos de jacaré- do-Pantanal, no Pantanal norte (Figura 9), no município de Poconé (MT), na fazenda Piuval (Figura 10), situada a aproximadamente 12 km desta cidade pela Rodovia Transpantaneira; e em Barão de Melgaço (MT), a margem do Rio Cuiabá, localizado a aproximadamente 25 km da cidade e a 1 km de uma vila de pescadores (Figura 11). No total foram coletados ovos de nove ninhos na região de Poconé e de seis ninhos na região de Barão de Melgaço (Tabela 6). Todos os ovos de cada ninho foram coletados devido a predação por animais silvestres que existe após a coleta124. A média foi de 26 ovos/ninho (variando no intervalo de 18 – 32). Devido a dificuldade de se estabelecer o dia de postura, os ovos foram coletados em diferentes períodos de incubação, sendo que ovos de sete ninhos estavam inválidos devido ao processo natural de inundação. Tabela 6 – Localização geográfica dos ninhos encontrado em Poconé e Barão de Melgaço e número de ovos coletados em 2012 e 2013 Município Data Localização do ninho número de ovos / ninho Poconé 16/01/2012 16°22'23"S 56°37'18"O 26 16°22'22"S 56°37'40"O 18 16°22'46"S 56°37'42"O 28 08/02/2013 16°20'16"S 55°56'36"O 25 16°20'23"S 55°56'27"O 26 16°20'07"S 56°35'55"O 27 16°17'51"S 56°34'43"O 24 16°22'25"S 56°37'00"O 32 16°20'08"S 56°35'52"O 20 Barão de Melgaço 10/02/2012 16°20'38"S 55°57'9"O 32 31 06/02/2013 16º20’52”S 55º56’17’’O 23 16º20’58”S 55º56’30’’O 30 16º21’06”S 55º56’32’’O 25 16º21’05”S 55º56’23’’O 28 45 Figura 9 – Localização aproximada dos munícipios de Poconé (1) e Barão de Melgaço (2) no Estado de Mato Grosso Fonte: autor Figura 10 – Região de coleta na Fazenda Piuval (Poconé, MT): localização dos ninhos amostrados em janeiro/2012 e 2013 Fonte: Google earth 46 Figura 11 – Região de coleta em Barão de Melgaço, margens do Rio Cuiabá, ponto de coleta de 10/02/2012 Fonte: Google earth Para a coleta dos ovos no ninho segue-se um procedimento padrão (esquematizado na Figura 12), visando à segurança dos pesquisadores e evitar agressão à fêmea. Então, ao localizar o ninho, caracterizado por ser um monte de galhos e folhas secas e organizadas, os pesquisadores procuram pela fêmea e se aproximam do ninho com cuidado, porém não é feito silêncio, com intuito de que a fêmea se manifeste, caso não tenha sido localizada anteriormente. Quando ocorre manifestação da fêmea ou a mesma é localizada, com um laço em mastro, a fêmea é imobilizada e logo em seguida à coleta é solta em seu habitat. Durante a coleta, os ovos foram acondicionados em caixa térmica e posteriormente, no laboratório do IFMT-Cáceres, congelados a –18 ºC até realização da análise. Em Cáceres (MT), um ovo de cada ninho foi descongelado, em temperatura ambiente, para determinação do teor total de lipídios. Os ovos foram misturados, homogeneizados e secos a aproximadamente 40 ºC em estufa de ar circulante, durante 24 horas, para posterior determinação do teor de lipídios totais por extração com éter de petróleo e gravimetria, de acordo com o método 960 AOAC143. Acondicionados em caixa térmica, os ovos congelados foram transportado por via área até o Instituto de Química – Unesp Araraquara para a realização da etapa analítica. 47 Figura 12 – Procedimento de coleta dos ovos de jacaré-do-Pantanal, em Mato Grosso Fonte: autor LOCALIZAÇÃO DO NINHO IMOBILIZAÇÃO DA FÊMEA ACONDICIONAMENTO COLETA 48 4.2 Reagentes Padrões analíticos (pureza entre 95 e 97%) dos analitos o,p'-DDE (CAS no. 3424-82-6), p,p'-DDE (CAS no. 72-55-9), o,p'-DDD (CAS no. 53-19-0), p,p'- DDD (CAS no. 72-54-8), o,p'-DDT (CAS no. 789-02-6), p,p'-DDT (CAS nº 50-29- 3), α-endosulfan (CAS no. 959-98-8), β-endosulfan (CAS no. 33213-65-9) e endosulfan sulfato (CAS no.1031-07-8), bem como uma solução padrão de PCBs, a 10 ng µL-1 em ciclohexano, incluindo os congêneres 28 (CAS no. 7012- 37-5), 52 (CAS no. 35693-99-3), 101 (CAS no. 37680-73-2), 118 (CAS nº. 31508-00-6), 138 (CAS nº. 35065-28-2), 153 (CAS nº. 35065-27-1) e 180 (CAS no. 35065-29-3), além da solução do padrão interno PCB 209 (CAS no. 2051- 24-3) a 10 ng µL-1 em ciclohexano, foram adquiridos pela empresa Dr. Ehrenstorfer GBd(Alemanha). O surrogate 1,2,4,5-tetrabromobenzeno – TBB (97,0 %, CAS nº. 636-28-2) foi obtido da Sigma–Aldrich (EUA).Os solventes acetonitrila (J.T. Baker, EUA), acetato de etila e isoctano (Mallinckrodt Chemicals, EUA) grau HPLC e o sulfato de sódio anidro(Synth, Brasil) de grau analítico foram usados como recebidos. Soluções estoque foram preparadas separadamente em isoctano para cada analito em concentração entre 20 e 80 g mL-1. Solução de trabalho contendo todos os analitos foi preparada a 500 ng mL-1 a partir da solução estoque e, a partir desta, foram preparadas todas as demais soluções padrão de trabalho. Todas as soluções foram armazenadas a – 18 °C. 4.3 Condições cromatográficas As condições cromatográficas utilizadas para separação dos analitos foram baseadas nas já empregadas neste grupo de pesquisa em estudos sobra a ocorrência de POPs no ar (dados não publicados), e estão na Tabela 7. 49 Tabela 7 – Condições cromatográficas para separação dos analitos Equipamento Varian 450 GC-ECD Coluna ZB-5ms (Phenomenex, EUA) 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm com pré-coluna de 10 m x 0,25 mm Vazão do gás de arraste (N2) 0,7 mL/min Vazão do gás auxiliar, N2 (make up) 29 mL/min Temperatura do injetor 240 ºC Temperatura do detector 300 ºC Volume de injeção 1 µL (injetor automático) modo de inserção da amostra Splitless/Split com tempo de purga de 0,5 min e razão split de 20:80 Gradiente de aquecimento da coluna 160 ºC/1min 3ºC/min 214 ºC/2min 0,8 ºC/min 220 ºC/1min 10ºC/min 290 ºC/10 min 4.4 Avaliação da resposta cromatográfica Neste trabalho, foram utilizadas curvas analíticas dos analitos dissolvidos em solvente isoctano, denominada curva em solvente, para determinação da linearidade, homocedasticidade e os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) instrumental. A curva em solvente foi construída com soluções em doze concentrações entre 3,0 e 71,1 ng mL-1em isoctano para cada analito, que foram injetadas em triplicata. O PCB 209 a 10 ng mL-1 foi utilizado como padrão interno para correção de erros inerentes ao processo cromatográfico. TBB (tetrabromobenzeno) a 10 ng mL-1 foi utilizado como padrão de recuperação (surrogate) para avaliação de erros inerentes ao processo de extração. O teste de Huber foi usado para exclusão de valores extremos devido a sua robustez estimada144; 145 e ajuste linear. Diferentemente do teste de Grubbs que utiliza a média, que pode ser influenciada por valores extremos, em seus cálculos para exclusão de valores anômalos, o teste de Huber usa a mediana, os resíduos e a mediana absoluta dos resíduos (MAD) para calcular os limites superior e inferior do intervalo linear do conjunto de dados (Eq. 1 e 2). 50 | | (Eq. 1) (Eq. 2) onde, xi é a concentração/área cromatográfica para todas as replicatas, medianaxi é a mediana para todos os valores de xi e IC é o intervalo de confiança entre os limites superior e inferior. Os valores fora do intervalo são considerados outliers e deverão ser excluídos da construção da curva analítica. Após a exclusão dos valores anômalos, a curva analítica pode ser construída. O LOD e o LOQ foram calculados conforme proposto por Ribeiro e colaboradores7. A linearidade foi avaliada pela homocedasticidade e coeficiente de determinação. O LOD e LOQ foram calculados utilizando as equações 3 e 4, respectivamente. ( ⁄ ) [√( ⁄ ) ( ̅) ( ∑ ( ̅) )⁄ ] (Eq. 3) ( ⁄ ) ( ⁄ ) [√( ⁄ ) ( ̅) ( ∑ ( ̅) )⁄ ] (Eq.4) onde, é o desvio padrão residual do sinal analítico ( ), t é o t de Student (para um nível de significância de 5 % e n - 2 graus de liberdade), a0 e a1 são, respectivamente, os coeficientes linear e angular, N é o número total de amostras, foi determinado pela relação da área cromatográfica do analitos/área cromatográfica do padrão interno, ̅ é a media do valor de para todas as amostras, ( ) é o intercepto do limite superior no intervalo de confiança da curva analítica, ̅ é a media dos valores de concentração ( ) para todas as amostras e é o valor de a partir da projeção do valor da concentração ( ) (até o ponto onde intercepta a regressão linear) no limite superior do intervalo de confiança da curva analítica. A figura13 demonstra graficamente como é determinado o LOQ e o LOD. 51 Figura 13 – Demonstração gráfica para a determinação de LOD (A) e LOQ (B) a partir da curva analítica Fonte: RIBEIRO et al (2008)7 Para cada curva foram avaliados os ajuste linear e ajuste quadrático, também foram determinados os coeficientes de determinação (r2) e os resíduos de todos os pontos pela diferença da área medida e da área interpolada, calculando a variância e o desvio padrão para cada nível de concentração. A partir dos desvios, foi calculado a diferença entre suas somas quadráticas, considerando o número total de pontos da curva, estimando, pelo teste-F (95% de confiança, n - 3 graus de liberdade) e a significância entre os dois valores. Se a razão entre a diferençadas somas quadrádicas dos dois ajustes e a variância do ajuste quadrádico for menor ou igual ao F tabelado, o ajuste linear é considerado mais adequado. Caso contrário, o ajuste quadrático será o mais adequado. 4.5 Otimização do método de Extração Sólido-Líquido com Partição em Baixa Temperatura (ESL-PBT) por planejamento fatorial completo 24 com triplicata do ponto central e metodologia de superfície de resposta Basicamente, a ESL-PBT compreende oito etapas, esquematizadas na Figura 14. Destas, quatro diferentes fatores (adição de um solvente extrator, homogeneização, centrifugação e congelamento) foram estabelecidos como A B LOD LOQ 52 variáveis para a otimização da extração de POPs de ovos de jacaré, neste trabalho. Figura 14 – Fluxograma geral da técnica de ESL-PBT Fonte: autor Para determinar as melhores condições para a extração de OCPs e PCB, uma mistura contendo dois ovos de cada ninho de todas as coletas (n = 28) foi preparada. A mistura foi homogeneizada em um triturador (triturador de alimentos em inox de 8 L, Lucre, Brasil) e liofilizada (Liobras L101, Brasil). Amostras de 2,0 g de ovo liofilizado foram fortificadas com OCPs e PCBs, utilizando 90 µL da solução de trabalho de 500 ng mL-1 para todos os analitos, correspondendo a 22,5 ng g-1 de ovo liofilizado. Adicionou-se também 20 µL de TBB a 750 ng mL-1, correspondendo a 10 ng mL-1 de isoctano. As amostras foram centrifugadas e deixada em repouso durante 2 h em temperatura ambiente. Água ultrapura (4,0 mL) e um volume pré-definido de solvente extrator (acetonitrila: acetato de etila - 6,5:1,5 v/v) foram adicionados. As amostras foram, em seguida, homogeneizadas em vortex, centrifugadas a 2500 rpm e congeladas a -18 °C. Após o congelamento, a fase líquida foi filtrada através de lã de vidro, com 2,0 g de sulfato de sódio anidro, previamente condicionado com 500 µL de solvente extrator a -18 °C. A fase sólida congelada foi lavada três vezes com 500 µL de solvente extrator a -18 °C. O solvente da fase líquida foi evaporado com N2 e o resíduo foi recuperado com 53 volume final 1,5 mL em isoctano e analisados por CG-ECD. 95 µL de PCB 209 a 80 ng mL-1 foi adicionado na etapa de recuperação com isoctano, estas amostras foram denominadas de ponto extraído. Para cada ensaio, a área cromatográfica de cada analito foi dividia pela área do padrão interno, com intuito de minimizar os efeitos inerentes ao processo cromatográfico. A área cromatográfica do TBB foi utilizada para avaliação do processo de extração. Se houvesse uma variação maior que 20 % na área cromatográfica do TBB o processo de extração deveria ser repetido. Para o cálculo de recuperação média relativa (parâmetro utilizado como resposta analítica no planejamento fatorial) ponto a ponto para cada experimento, amostras não fortificadas (denominadas amostras testemunha) passaram pelo mesmo processo de ESL-PBT, sendo posteriormente fortificados, na mesma concentração final de 22,5 ng g-1, somente na etapa de recuperação com isoctano, sendo denominados ponto na matriz. Para evitar um número exaustivo de ensaios, o primeiro passo consistiu na otimização do método ESL-PBT com utilização de um planejamento fatorial completo 24 com três repetições no ponto central. O planejamento fatorial é útil quando um grande número de fatores podem ser avaliados simultaneamente, calculando-se os efeitos principais e de interações entre os fatores com um reduzido número de experimentos. Os quatro fatores escolhidos no planejamento foram: (1) volume de solvente extrator, (2) tempo de agitação em vortex, (3) tempo de centrifugação e (4) tempo de congelamento. Um total de 19 experimentos foram realizados para a optimização do processo de extração (Tabela 8). As replicatas do ponto central tem dois objetivos: permitir a mensuração do erro absoluto e ajustar a variância da resposta predita146. Os experimentos foram randomizados para minimizar os erros indeterminados nas respostas reais devido a fatores externos147. A recuperação relativa em cada experimento foi utilizada como resposta analítica para avaliação fatorial. A recuperação para cada analito foi calculada comparando-se as áreas cromatográficas do analito no ponto extraído com a área do ponto na matriz descontando a área obtida para a amostra testemunha. 54 Tabela 8 – Fatores, níveis e matriz do planejamento fatorial 24 usado na otimização do método ESL-PBT Experimentos (Ordem realizada) ESb VTc CTd FTe mL Cód. min Cód. min Cód. h Cód. 1 (16) 12 +1 5 +1 15 +1 12 +1 2 (8) 12 +1 5 +1 15 +1 4 -1 3 (7) 12 +1 5 +1 5 -1 12 +1 4 (3) 12 +1 5 +1 5 -1 4 -1 5 (19) 12 +1 1 -1 15 +1 12 +1 6 (14) 12 +1 1 -1 15 +1 4 -1 7 (17) 12 +1 1 -1 5 -1 12 +1 8 (12) 12 +1 1 -1 5 -1 4 -1 9 (11) 8 -1 5 +1 15 +1 12 +1 10 (6) 8 -1 5 +1 15 +1 4 -1 11 (15) 8 -1 5 +1 5 -1 12 +1 12 (13) 8 -1 5 +1 5 -1 4 -1 13 (18) 8 -1 1 -1 15 +1 12 +1 14 (5) 8 -1 1 -1 15 +1 4 -1 15 (10) 8 -1 1 -1 5 -1 12 +1 16 (4) 8 -1 1 -1 5 -1 4 -1 17Ca (1) 10 0 2 0 10 0 6 0 18Ca (2) 10 0 2 0 10 0 6 0 19Ca (9) 10 0 2 0 10 0 6 0 a ponto central; bSolvente extrator (acetonitrila: acetato de etila - 6,5:1,5 v/v); ctempo de vortex; dtempo de centrifugação; e tempo de congelamento; Cód.: código na matriz (+1) para maior nível, (-1) para menor nível e (0) para o ponto central O planejamento foi avaliado a partir da resposta da recuperação normalizada (Rn) obtida para cada experimento. A resposta normalizada foi calculada com a equação 5148; 149: Rn = Ʃ[Rx/Rx(max)] (Eq. 5) onde, x é o analito (PC 28; PC 52; o,p’-DDE; PC 101; α-endosulfan; p,p’- DDE; o,p’-DDD; β-endosulfan; p,p’-DDD; o,p’-DDT; endosulfan sulfato, PCB 180; PC 118, PC 153 e p,p’-DDT/PCB 138), Rx é a recuperação obtida para o composto x, e Rx(max) é a recuperação máxima obtida para o composto entre os 19 experimentos do planejamento fatorial. Os resultados experimentais foram analisados utilizando Microsoft Excel 2007® e GNU-Octave 2.1.72. A significância dos efeitos foi determinada pela análise de variância e pelo teste t de Student com n - 1 grau de liberdade com uma significância estatística de 0,05. Este valor representa a probabilidade de o efeito de um fator ser unicamente devido à erro aleatório. Assim, se o efeito é 55 maior do que o t-crítico, o efeito do fator correspondente é significativo. Os efeitos e a significância das variáveis na ESL-PBT foram avaliados utilizando gráfico de Pareto150. Para determinar o efeito e a influência dos níveis de cada fator no sistema proposto, estes níveis foram codificados como +1 e -1, para o maior e menor níveis, respectivamente, como exposto na Tabela 8. Matematicamente, o efeito principal pode ser estimado de acordo com a equação 6, calculado como uma média dos efeitos individuais permitindo a avaliação média do efeito de cada fator separadamente das condições dos efeitos dos outros fatores151. Efeito principal = 2(∑y+ - ∑y-)/(ba) (Eq. 6) onde, y representa a média dos efeitos individuais em cada medida, os sinais (+) e (-) representam os níveis de cada fator e ba representa o número total de experimentos. Os efeitos de interações levam em conta os fatores combinados uns com os outros. Neste caso, foram calculados os efeitos de interação de 2a- ordem (dois fatores entre si), de 3ª-ordem (três fatores entre si) e de 4ª-ordem (todos os fatores entre si). Os efeitos de interações de 2ª-ordem e 3a-ordem foram calculados usando as equações 7 e 8, respectivamente. Interações de 2a-ordem = 2[(∑y++ + ∑y-) - (∑y-+ + ∑y+-)]/(ba) (Eq. 7) Interações de 3a-ordem = 2[(y+-- + y-+- + y--+ + y+++) - (y--- + y++- + y+-+ + y-++)/(ba) (Eq. 8) O efeito de interação de 4a-ordem, considerando todos os fatores entre si, pode ser calculado pela metade da diferença entre as interações de 3a- ordem entre três fatores pra dois níveis distintos do fator a ser analisado. Depois de calcular todos os efeitos, um gráfico de ‘probabilidade normal vs efeito’ foi plotado com os valores de probabilidade para uma distribuição normal versus o valor calculado de cada efeito, com o objetivo de visualizar quais os fatores possuem efeitos mais proeminentes. A partir deste gráfico, é possível a exclusão de fator(es) que não produz(em) resposta(s) que possa(m) 56 influenciar nos resultados, ou seja, efeito praticamente zero. Com a remoção de um fator não significativo, o planejamento fatorial pode ser reduzido para a avaliação dos fatores mais importantes, por exemplo, redução de um planejamento 24 para um planejamento 23 se apenas um fator for excluído. Com a redução do tamanho da matriz experimental, aumenta-se o número de replicatas para cada combinação. Neste caso, é possível calcular a variância experimental (eq. 9), o erro experimental (eq. 10), a variância dos efeitos (eq. 11) e o erro dos efeitos (eq. 12). Para calcular os efeitos a partir da matriz experimental reduzida, pode-se utilizar as equações 6, 7 e 8, descritas anteriormente. Então, é possível aplicar o teste t de Student para comparar as variâncias, erros experimentais e os efeitos. Um t-crítico pode ser obtido pela multiplicação do valor tabelado de t (com 95% de confiança e n graus de liberdade) e o erro de efeito. Se o efeito calculado for maior ou igual ao t-crítico, este efeito é considerado significativo e pode ser visualizado em um gráfico de Pareto150. s2 = (v1s1 2 + v2s2 2 + ... +vms2 m)/(v1 + v2 + … + vm) (Eq. 9) s = √ (Eq. 10) ŝ2 = (s2/n).∑a2 (Eq. 11) ŝ = √ (Eq. 12) onde, vi é o número de graus de liberdade (n-1) de cada variância (s2 m) obtido para todos os experimentos para ith experimento. O parâmetro n é o número de replicatas para cada experimento e a é o coeficiente usado para calcular os efeitos. Mais experimentos, tais como o ponto central, podem ser analisados e adicionados ao planejamento fatorial e o resultado pode ser usado para determinar uma superfície de resposta quadrática para os efeitos significativos. O modelo da superfície de resposta foi estabelecido usando a equação 13152. Y = β0 + ΣβiXi +ΣβiiXi 2 +ΣβjXj +ΣβjjXj 2+ ΣβijXiXj (Eq. 13) 57 onde, Y é o valor predito da resposta pelo modelo, β0 é uma constante e βi(βj), βii(βjj) e βij são os coeficientes linear, quadrático e de interação, respectivamente. Neste modelo, Xi e Xj são as variáveis independentes. Determinado as melhores condições para realização da extração, a próxima etapa consiste na validação do método e avaliação de efeito matriz. 4.6 Validação do método Assim como descrito na seção 4.5, para a validação do método o conteúdo de dois ovos (exceto a casca) de cada ninho de todas as coletas (n = 28) foram homogeneizados em triturador de alimentos em inox e a mistura foi liofilizada e congelada a -18 oC até o momento da análise. O efeito matriz foi avaliado utilizando o extrato obtido a partir de 2 g de ovo liofilizado (usando o método ESL-PBT otimizado) com fortificação com solução de trabalho (OCPs e PCBs 500 ng mL-1) após a extração, conforme descrito anteriormente, em doze concentrações entre 2,3 e 53,8 ng g-1. PCB 209 e TBB foram utilizados na concentração de 10 ng mL-1 de isoctano para ambos. A curva analítica neste caso foi denominada de curva na matriz. 2 g de amostras de ovo liofilizado foram fortificadas com solução de trabalho, 2 h antes da ESL-PBT, em temperatura ambiente, em doze concentrações entre 2,3 e 53,8 ng g-1, para então serem submetidas a todo o processo de extração, conforme descrito anteriormente. A curva analítica obtida neste caso foi denominada de curva extraída e foi utilizada para avaliação da performance do método. A faixa de concentração foi selecionada com base nas concentrações relatadas na literatura para estes analitos em ovos de animais silvestres. Para a construção de ambas as curvas foi aplicado o teste de Huber, conforme descrito na seção 4.4. Todas as amostras foram extraídas em duplicatas e, então, os extratos obtidos foram analisados por CG/ECD com quadruplicata de injeção para cada nível de fortificação. A partir dos dados de área cromatográfica dos pontos da curva na matriz e da curva extraída foi 58 possível calcular a recuperação relativa (exatidão do método) e o desvio padrão relativo – RSD (precisão do método) para todos os analitos.