RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 08/02/2024. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL FORMULAÇÃO DE Aureobasidium pullulans PARA CONTROLE DE DOENÇAS DE PÓS-COLHEITA EM FRUTOS CÍTRICOS Vanessa Santos Moura Engenheira Agrônoma 2022 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL FORMULAÇÃO DE Aureobasidium pullulans PARA CONTROLE DE DOENÇAS DE PÓS-COLHEITA EM FRUTOS CÍTRICOS Vanessa Santos Moura Orientadora: Prof. Dra. Katia Cristina Kupper Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agropecuária. 2022 M929f Moura, Vanessa Santos Formulação de Aureobasidium pullulans para controle de doenças de pós-colheita em frutos cítricos / Vanessa Santos Moura. -- Jaboticabal, 2022 85 f. : tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal Orientadora: Katia Cristina Kupper 1. Controle biológico. 2. levedura killer. 3. Geotrichum citri-aurantii. 4. Penicillium digitatum. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. DADOS CURRICULARES DO AUTOR VANESSA SANTOS MOURA – Nascida em 16 de janeiro de 1991 em Manaus, AM. Iniciou sua graduação em Agronomia em março de 2010 na Universidade Federal do Amazonas - UFAM, na cidade de Manaus, AM, concluindo seu bacharelado em maio de 2015. Durante a graduação, foi bolsista no programa de educação tutorial - PET Agronomia, durante quase toda sua formação acadêmica, sob orientação do Prof. Dr. Ari de Freitas Hidalgo, foi bolsista de iniciação cientifica do CNPq-PIBIC, no Instituto de Pesquisa do Amazonas – INPA, sob a orientação do Prof. Dr. Hugo Iriarte Martel e bolsista de iniciação cientifica do FAPEAM-PIBIC, na Universidade Federal do Amazonas atuando na área de Fitopatologia e Controle Biológico, sob a orientação da Profa. Dra. Solange de Mello Véras. Em agosto de 2015 ingressou no curso de Pós- graduação em Microbiologia Agropecuária na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – (FCAV- UNESP), na cidade de Jaboticabal, SP, sob a orientação da Profa. Dra. Katia Cristina Kupper, como bolsista CNPq, realizando seu projeto de pesquisa na área de Fitopatologia e Controle Biológico, no Centro Avançado de Pesquisa de Citros “Sylvio Moreira”/IAC, na cidade de Cordeirópolis, SP. Em agosto de 2017 ingressou no curso de doutorado em Microbiologia Agropecuária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – (FCAV-UNESP), na cidade de Jaboticabal, SP, como bolsista Capes, desenvolvendo seu projeto de doutorado no Centro Avançado de Pesquisa de Citros “Sylvio Moreira”/IAC, sob a orientação da profa. Dra. Katia C. Kupper. Epígrafe segura as pontas que você dá conta, mulher você não cogitou ir tão longe e mesmo assim conseguiu é arrebatador traçar o próprio roteiro Ryane Leão Dedicatória A minha mãe Maria do Rosário Santos Moura, que me ensinou tanto e tornou possível a realização deste sonho, e de tantos outros, em minha vida. Obrigada mãe, eu te amo mais do que as palavras podem expressar. AGRADECIMENTOS Antes de tudo, quero agradecer a Deus, por ter abençoado e iluminado meu caminho, todos os dias da minha vida, sua presença me dar forças para seguir sempre em frente. Meu agradecimento amoroso, à minha mãe Maria do Rosário Santos Moura e aos meus irmãos Silvia Santos Moura e Wagner Santos Moura por nunca soltarem a minha mão, por serem minha fortaleza, meu amparo e minha alegria. Muito obrigada pelo amor incondicional, vocês são meu orgulho e minha inspiração. Ao meu pai Mario Silvio dos Santos Moura pelo carinho, apoio, incentivo e por acreditar em mim. Vocês vibram comigo, choram comigo e me levantam. Do fundo do meu coração e da minha alma, obrigada. Ao programa de Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP/Jaboticabal, pela oportunidade de participar e desenvolver meu doutorado e a todos os funcionários, principalmente ao pessoal da seção de Pós-graduação, que sempre foram muito gentis e atenciosos. A minha Orientadora Katia Cristina Kupper sou grata por seu encorajamento, pela paciência e por revisar incansavelmente este manuscrito. Eu sei que este fim é na verdade apenas um início, mas não consigo imaginar nada disso sem você. Gostaria de agradecer, em especial, a professora Solange de Mello Véras, você acreditou e apostou em mim, eu não teria ido tão longe sem seu encorajamento. Com carinho todo especial aos meus sobrinhos Elvio Neto e Heitor, meus anjos que alegram meu coração. Amarei vocês para sempre, mesmo quando não puder mais. Ao Matheus da Silva Ferreira obrigada por segurar minha mão em todos os percalços dessa aventura. Seu apoio e amor me ajudam todos os dias. Aos amigos que conquistei ao longo desta jornada Luriany, Andreia, Aline, Flávia, Bianca, Deborah, Fernanda, Natalia, Alisson e Lucas por toda ajuda concedida para o desenvolvimento deste trabalho, pela amizade, apoio e afeto que nunca me deixaram faltar, vocês tornaram tudo mais gratificante e feliz. Guardarei eternamente em meu coração, amo cada um de vocês. Que possamos chegar ainda mais alto. Às minhas amigas Nátalia Sarmanho e Laiana Lobo, a vida nos leva por caminhos inesperados, e sou grata que tenhamos caminhado juntas por este trecho. À Larissa Holanda sou grata por seu encorajamento e por me ajudar a compreender meu cérebro, sua amizade é um presente. Gostaria de agradecer, também, a Fernanda Barbosa, sua amizade foi uma surpresa feliz e sinto que ganhei mais que uma amiga, ganhei uma irmã. Ao Centro Avançado de Pesquisa de Citros “Sylvio Moreira” – IAC por disponibilizar o laboratório e toda a estrutura necessária para a realização deste trabalho. A todos os funcionários do Centro de Citricultura, em especial à Maria, Rose, Lordes, Isabel, Nadji, Vivian, Gomes, Nidelce e Valéria, pelo carinho, simpatia e gentileza. Ao Núcleo de Inovação Tecnológica – IAC por toda ajuda e apoio necessário ao depósito de pedido de patente, em especial a Janice e a Lilian vocês foram anjos em minha vida. À Citrícola Lucato pela doação dos frutos para os meus experimentos. À FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo financiamento da pesquisa (Proc. nº 2019 / 07296-9). O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. i SUMÁRIO RESUMO........................................................................................................... iii ABSTRACT ........................................................................................................ v LISTA DE TABELAS ....................................................................................... vii LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... x 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 3 2.1 Importância da Citricultura ....................................................................... 3 2.2 Doenças na pós colheita de Citros ........................................................... 5 2.3 Controle .................................................................................................... 8 2.4 Controle Biológico .................................................................................... 9 2.5 Desenvolvimentos de bioprodutos ......................................................... 11 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 14 3.1. Microrganismos ..................................................................................... 14 3.2. Composição do meio de cultura para cultivo da levedura ...................... 14 3.3. Determinação da viabilidade e biomassa seca de células de Aureobasidium pullullans ............................................................................. 15 3.4. Produção de biofilme por Aureobasidium pullulans ............................... 16 3.5. Efeito da molaridade do tampão fosfato de sódio e pH em células de Aureobasidium pullulans .............................................................................. 17 3.6. Formulações e vida de prateleira .......................................................... 18 3.7. Manutenção da atividade killer de Aureobasidium pullulans-ACBL-77 nas formulações .................................................................................................. 18 3.8. Detecção e quantificação de sideróforos de Aureobasidium pullulans ACBL-77 na formulação ............................................................................... 19 3.9. Efeito das formulações à base de Aureobasidium pullulans na inibição do crescimento micelial de Geotrichum citri-aurantii e de Penicillium digitatum 20 3.10. Efeito da formulação, à base de Aureobasidium pullulans, na germinação do fitopatógeno ............................................................................................. 20 3.11. Controle da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos utilizando a formulação à base de Aureobasidium pullulans ........................................ 21 3.12. Efeito da aplicação do produto formulado à base de Aureobasidium pullulans nos parâmetros de qualidade dos frutos cítricos ........................... 22 3.12.1 Rendimento de suco ....................................................................... 23 3.12.2 Teor de sólidos solúveis totais (SS) ............................................... 23 3.12.3 Acidez total titulável (ATT) .............................................................. 24 ii 3.12.4 Ratio .............................................................................................. 24 3.13. Análise estatística ............................................................................... 25 4. RESULTADOS ............................................................................................. 25 4.1. Determinação da viabilidade e biomassa seca de células de Aureobasidium pullulans ............................................................................... 25 4.2. Produção de biofilme por Aureobasidium pullulans ............................... 27 4.3. Efeito da molaridade do tampão fosfato de potássio e do pH na produção de células de Aureobasidium pullulans ........................................................ 28 4.4. Formulações e vida de prateleira ........................................................... 29 4.5. Manutenção da atividade killer de Aureobasidium pullulans-ACBL-77 nas formulações................................................................................................... 32 4.6. Detecção e quantificação de sideróforos de Aureobasidium pullulans ACBL-77 na formulação ................................................................................ 34 4.7. Efeito das formulações à base de Aureobasidium pullulans na inibição do crescimento micelial de Geotrichum citri-aurantii e de Penicillium digitatum 34 4.8. Efeito da formulação à base de Aureobasidium pullulans sobre a germinação dos fitopatógenos ...................................................................... 39 4.9. Formulação à base de Aureobasidium pullulans no controle da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos .................................................... 41 4.9.1. Podridão Azeda ................................................................................... 41 4.9.1.1 Lima ácida Tahiti ............................................................................ 41 4.9.1.2 Laranja Pêra .................................................................................. 48 4.9.1.3 Tangerina Murcott .......................................................................... 51 4.9.2. Bolor Verde ......................................................................................... 52 4.9.2.1 Lima ácida Tahiti ............................................................................ 52 4.9.2.2 Laranja Pêra .................................................................................. 57 4.9.2.3 Tangerina Murcott .......................................................................... 62 4.10. Efeito da aplicação do produto à base de Aureobasidium pullulans nos parâmetros de qualidade dos frutos cítricos ................................................. 65 5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 71 6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 76 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 77 iii FORMULAÇÃO DE Aureobasidium pullulans PARA CONTROLE DE DOENÇAS DE PÓS-COLHEITA EM FRUTOS CÍTRICOS RESUMO O Brasil é um dos maiores produtores de citros, tanto para o consumo in natura como na forma industrializada de sucos concentrados. No entanto, o setor citrícola sofre com as doenças que ocorrem na fase de pós-colheita, as quais são iniciadas no campo e se desenvolvem durante o beneficiamento dos frutos em packing houses. A podridão azeda (Geotrichum citri-aurantii) e o bolor verde (Penicillium digitatum) se destacam, em termos de importância econômica, dentre as doenças que ocorrem na pós-colheita de citros, as quais são responsáveis pela diminuição da qualidade e quantidade de frutos. A utilização de microrganismos antagônicos no desenvolvimento de formulações e o aumento do número de pesquisas na área podem contribuir para a utilização de uma alternativa ao uso de fungicidas sintéticos. O processo de formulação deve atingir, principalmente, quatro objetivos básicos: i) estabilizar o antagonista durante a produção, distribuição e armazenamento do bioproduto; ii) facilitar o manuseio e aplicação pelo agricultor; iii) proteger o agente de fatores ambientais nocivos e, finalmente, iv) manter a atividade do organismo no local de uso. Trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia e Controle Biológico do Centro Avançado de Pesquisa e Desenvolvimento de Citricultura Sylvio Moreira/IAC mostraram o potencial da levedura Aureobasidium pullulans–ACBL- 77 no controle destas doenças. Diante deste contexto, este trabalho visou investigar uma formulação à base da levedura A. pullulans buscando desenvolver uma tecnologia de manejo de controle na fase de pós-colheita, a fim de encontrar uma alternativa para o controle dessas doenças. Para tal foram avaliados: (i) a viabilidade e a biomassa de A. pullulans-ACBL-77 em diferentes meios de cultivo; (ii) a produção de biofilme por A. pullulans nos diferentes meios de cultura; (iii) o efeito da molaridade do tampão fosfato de potássio e pH em células da levedura; (iv) o melhor agente de preservação da levedura no processo de formulação e a vida-de-prateleira do produto; (v) a atividade killer de A. pullulans ACBL-77 após formulação; (vi) a detecção e quantificação de sideróforos produzidos por A. pullulans-ACBL-77 na formulação; (vii) o efeito das formulações à base de A. pullulans na inibição do crescimento micelial de G. citri- iv aurantii e de P. digitatum; (viii) o efeito da formulação à base de A. pullulans na germinação de G. citri-aurantii e de P. digitatum; (ix) a eficiência da formulação à base de A. pullulans no controle in vivo da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos e, finalmente, (x) verificar o efeito da aplicação do produto formulado quanto aos parâmetros de qualidade dos frutos cítricos. Os resultados deste estudo mostraram que o produto formulado à base de A. pullulans ACBL- 77 proporcionou a viabilidade da levedura por seis meses de armazenamento a 4°C, manteve as suas atividades de antagonismo (killer e produção de sideróforos) e inibiu a germinação dos conídios dos fitopatógenos. Além disso, o bioproduto independente da concentração testada, controlou, preventiva e curativamente, a podridão azeda em frutos de lima ácida Tahiti e de laranja Pêra. No entanto, para o bolor verde o produto formulado controlou de forma preventiva a doença em os frutos de laranja Pêra e, a sua eficiência de controle foi maior quando os frutos foram armazenados em câmara fria (10°C). O produto formulado não afetou os parâmetros de qualidade dos frutos cítricos. Com base nesses resultados, a formulação à base da levedura tem grandes possibilidades de ser comercializada para o biocontrole na pós-colheita de citros. Palavras-chave: Controle biológico, levedura killer, Geotrichum citri-aurantii, Penicillium digitatum, v FORMULATION OF Aureobasidium pullulans FOR POSTHARVEST DISEASE CONTROL IN CITRUS FRUITS ABSTRACT Brazil is one of the largest citrus producers, both for fresh consumption and in the industrialized form of concentrated juices. However, the citrus industry suffers from diseases that occur in the post-harvest phase, which start in the field and develop during fruit processing in packing houses. The Sour rot (Geotrichum citri-aurantii) and the green mold (Penicillium digitatum) stand out, in terms of economic importance, among the diseases that occur in the postharvest of citrus, they are responsible for the decrease in the quality and quantity of fruits. The use of antagonistic microorganisms in the development of formulations and the increase in the number of researches in this area can contribute to the use of an alternative to synthetic fungicides. The formulation process must achieve, mainly, four basic objectives: i) stabilize the antagonist during production, distribution and storage of the bioproduct; ii) facilitate handling and application by the farmer; iii) protect the agent from harmful environmental factors and, finally, iv) maintain the activity of the organism at the place of use. Works developed at the Laboratory of Phytopathology and Biological Control of the Advanced Center for Research and Development of Citriculture Sylvio Moreira/IAC showed the potential of the yeast Aureobasidium pullulans–ACBL-77 to control these diseases. The present study aimed to develop a formulation based on the yeast A. pullulans ACBL-77 as an alternative control. To this end, the following were evaluated: (i) the viability and biomass of A. pullulans-ACBL-77 in different culture media; (ii) biofilm production by A. pullulans in different culture media; (iii) the effect of potassium phosphate buffer molarity and pH on yeast cells; (iv) the best yeast preservation agent in the formulation process and product shelf life; (v) the killer activity of A. pullulans ACBL-77 after formulation; (vi) detection and quantification of siderophores produced by A. pullulans-ACBL-77 in the formulation; (vii) the effect of formulations based on A. pullulans in inhibiting the mycelial growth of G. citri- aurantii and P. digitatum; (viii) the effect of the formulation based on A. pullulans on the germination of G. citri-aurantii and P. digitatum; (ix) the efficiency of the formulation based on A. pullulans in vivo control of sour rot and green mold in citrus fruits and, finally, (x) verify the effect of the application of the formulated vi product on the quality parameters of citrus fruits. The results of this study showed that the product formulated based on A. pullulans ACBL-77 provided yeast viability for six months of storage at 4°C, maintained its antagonism activities (killer and siderophore production), and affected the conidial germination of the phytopathogens. Furthermore, the bioproduct, regardless of the concentration tested, controlled, preventively and curatively, the sour rot in Tahiti lime and Pêra orange fruits. However, for green mold, the formulated product preventively controlled the disease in Pêra orange fruits, and its control efficiency was greater when the fruits were stored in a cold chamber (10 oC). The formulated product did not affect the quality parameters of the citrus fruits. Based on these results, the yeast-based formulation has great possibilities of being commercialized for the biocontrol of citrus post-harvest. Keywords: Biological control, killer yeast, Geotrichum citri-aurantii, Penicillium digitatum. 1 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o maior produtor mundial de laranja doce, seguido da China, União Europeia e Estados Unidos (Feitoza e Gasparotto, 2020). Considerando a importância econômica da citricultura para o país, este setor apresenta inúmeros problemas fitossanitários que limitam sua produção, dentre tais problemas, destacam-se as doenças de pós-colheita, como por exemplo a podridão azeda (Geotrichum citri-aurantii Ferraris) e o bolor verde (Penicillium digitatum Sacc) (Kupper et al., 2016). A penetração do patógeno nos frutos se dá por ferimentos ocasionados durante o manuseio, transporte e armazenamento e, a sua colonização no sítio de infecção se dá pela liberação de enzimas que irão atuar na decomposição de substâncias mais complexas do fruto, tornando-as assimiláveis para o fungo, acarretando na podridão do mesmo (Spadaro e Droby, 2016; Bazioli et al., 2019). O fungicida Imazalil (IMZ) é o mais efetivo no controle do bolor verde, no entanto, o uso indiscriminado e excessivo pode deixar resíduo do produto nos frutos, além de contribuir para a proliferação de linhagens resistentes do patógeno ao princípio ativo (Ismail e Zhang, 2004), além de seu uso não ser eficaz para o controle de G. citri-aurantii, fungo este que não apresenta um produto registrado para uso no Brasil (Liu et al., 2009). Diante deste contexto, busca-se métodos alternativos que potencializam, sozinhos ou, em combinação, o controle de doenças na pós-colheita de citros (Droby et al., 2009; Moura et al., 2019). A utilização de microrganismos no controle de patógenos de plantas tem sido considerada a mais natural e, eventualmente, a mais aceita na substituição, parcial ou total, ao uso do tratamento químico (Moretto et al., 2014). Dentre os agentes de biocontrole, as leveduras são potencialmente mais efetivas, pois são fenotipicamente mais adaptadas a esses nichos, além de serem hábeis na colonização e na competição por espaço e nutrientes (Filonow, 1998; Liu et al., 2013), apresentado resultados promissores no controle de doenças de pós- colheita (Spadaro e Droby, 2016). Dentre as espécies de levedura, Aureobasidium pullulans De Bary (Arnaud), particularmente, o isolado ACBL-77, alvo de estudo deste trabalho, 2 mostrou ser efetivo no controle da podridão azeda (G. citri-aurantii) de citros (Ferraz et al., 2016; Klein e Kupper, 2018). Segundo relatos de literatura, A. pullulans vem utilizando vários mecanismos de ação contra fitopatógenos, como a competição por espaço e nutrientes (Bencheqroun et al., 2007); produção de compostos antifúngicos voláteis, termoestáveis e livres de células (Adikaram et al., 2002; Di Francesco et al., 2015); produção de enzimas hidrolíticas (Zhang et al., 2010; Ferraz et al., 2016; Moura et al., 2021); produção de proteases (Zhang et al., 2012); produção de toxina killer (Ferraz et al., 2016; Moura et al., 2021); produção de aureobasidina (AbA), que age como antibiótico (Liu et al., 2007); produção de sideróforos (Ma et al., 2012), além de atuar como agente indutor do mecanismo de defesa da planta (Ippolito et al., 2000). O conhecimento dos mecanismos de ação do antagonista é fundamental durante o desenvolvimento de um bioproduto, permitindo a possibilidade de aumento de viabilidade, potencial de controle, registro para uso comercial e elaboração de protocolos adequados de aplicação do produto (Chanchaichaovivat et al., 2008; Di Francesco et al., 2016). O processo para o desenvolvimento de uma formulação é complexo e devem ser observados aspectos como, o tipo e as características do propágulo utilizado como ingrediente ativo; as condições de fermentação; as características químicas e físicas dos inertes; a compatibilidade dos componentes da formulação ao microrganismo; a estabilidade do ingrediente ativo no armazenamento; o efeito no desempenho ou, atividade do formulado; entre outros. Tais conhecimentos são indispensáveis para o sucesso da formulação no campo (Morandi e Bettiol, 2009). Muitos produtos à base de leveduras já são comercializados, como Shemer®, produto a base de Metschnikowia fructicola, registrado em Israel e, comercialmente usado para doenças pós-colheita de batata-doce, uva, morango, pimenta e cenoura (Kurtzman e Droby, 2001; Droby et al., 2009). Na Bélgica foi registrado o bioproduto Nexy® (Candida oleophila) desenvolvido pela empresa Bionext, tem sido utilizado comercialmente para controle de doenças de pós- colheita em maçã, banana e citros (Zhang et al., 2020). Duas cepas de A. pullulans foram formuladas no mesmo bioproduto, Boni-Protect® registrado na Alemanha para controle de patógenos de pós-colheita, sendo eficiente, 3 principalmente, para Monilia fructigena, P. expansum e B. cinerea, em maçã (Wagner et al., 2013). Dada a importância da cultura para o país e a necessidade de controle mais eficiente e ambientalmente aceito, este trabalho visou investigar uma formulação à base da levedura A. pullulans buscando desenvolver uma tecnologia de manejo de controle na fase de pós-colheita, a fim de encontrar uma alternativa para o controle da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos. Para tal foram avaliados: (i) a viabilidade e a biomassa de A. pullulans-ACBL-77 em diferentes meios de cultivo; (ii) a produção de biofilme por A. pullulans nos diferentes meios de cultura; (iii) o efeito da molaridade do tampão fosfato de potássio e pH em células da levedura; (iv) o melhor agente de preservação da levedura no processo de formulação e a vida-de-prateleira do produto; (v) a atividade killer de A. pullulans ACBL-77 após formulação; (vi) a detecção e quantificação de sideróforos produzidos por A. pullulans-ACBL-77 na formulação; (vii) o efeito das formulações à base de A. pullulans na inibição do crescimento micelial de Geotrichum citri-aurantii e de Penicillium digitatum; (viii) o efeito da formulação à base de A. pullulans na germinação de G. citri-aurantii e de P. digitatum; (ix) a eficiência da formulação à base de A. pullulans no controle in vivo da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos e, finalmente, (x) verificar o efeito da aplicação do produto formulado quanto aos parâmetros de qualidade dos frutos cítricos. 76 6. CONCLUSÕES a) O meio líquido à base de YEPD favoreceu as produções de células, de biomassa e de biofilme de A. pullulans- ACBL-77; b) A formulação à base de Glicerol (20%) + Goma Xantana (5g/L) + células da levedura (1x108células/ml) proporcionou um período mais longo de sobrevivência da levedura e foi capaz de manter as suas atividades de antagonismo avaliadas (killer e produção de sideróforos): c) A temperatura de 4°C proporcionou maior vida-de-prateleira do formulado; d) O formulado à base de A. pullulans- ACBL-77 afetou o tamanho da colônia de G. citri-aurantii, e, a germinação de conídios de G. citri-aurantii e de P. digitatum; e) Células da levedura ACBL-77 e o produto formulado, independente da concentração testada controlaram, preventiva e curativamente, a podridão azeda em frutos de lima ácida Tahiti e de laranja Pêra; f) Aplicações preventivas de células de levedura ACBL-77 foram mais eficientes no controle do bolor verde, em frutos de lima ácida Tahiti, do que o produto formulado à base do microrganismo; g) Para frutos de laranja Pêra, as células da levedura e o produto formulado controlaram de forma preventiva o bolor verde e, a eficiência de controle foi maior quando os frutos foram armazenados em câmara fria; h) Em frutos de tangor Murcott, aplicações preventivas de células de levedura ACBL-77 foram mais eficientes no controle da podridão azeda e do bolor verde; i) O produto formulado, independente das concentrações avaliadas, não afetaram os parâmetros de qualidade dos frutos de lima ácida Tahiti, laranja Pêra e tangor Murcott. 77 7. 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