RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 21/02/2023. INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Análise do conteúdo gênico e expressão diferencial de variantes do cromossomo B em Psalidodon (Teleostei, Characiformes) Mateus Rossetto Vidal Botucatu, SP 2022 INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências de Botucatu Análise do conteúdo gênico e expressão diferencial de variantes de cromossomo B em Psalidodon (Teleostei, Characiformes) Aluno: Mateus Rossetto Vidal Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti Coorientador: Dr. Duílio M. Z. A. Silva Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia). Botucatu, SP 2022 Palavras-chave: Astyanax; Citogenética; Expressão gênica; Genômica; Psalidodon. Vidal, Mateus Rossetto. Análise do conteúdo gênico e expressão diferencial de variantes do cromossomo B em Psalidodon (Teleostei, Characiformes) / Mateus Rossetto Vidal. - Botucatu, 2022 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Fausto Foresti Coorientador: Duílio Mazzoni Zerbinato de Andrade Silva Capes: 20400004 1. Astyanax (Peixe). 2. Expressão gênica. 3. Genômica. 4. Citogenética. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. Dedicatória À minha mãe Ana Cristina, com carinho dedico. Agradecimentos Agradeço primeiramente ao Professor Fausto Foresti por ter aceito me orientar e por ter sempre me inspirado e motivado a ir além. Ao meu Co-Orientador Duílio Mazzoni Zerbinato de Andrade Silva, obrigado por cobrar sempre o melhor de mim e me guiar para obter sempre o melhor resultado. Ao Professor Cláudio Oliveira, por todo o apoio fornecido para esta pesquisa. Ao meu colega Lucas Fortino Lasmar pela colaboração neste trabalho e por toda parceria e amizade. Aos colegas do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, por terem me acolhido tão bem. Ao Professor Fábio Porto Foresti e a todos os colegas do Laboratório de Genética de Peixes da UNESP Bauru, pela amizade e apoio no desenvolvimento deste projeto. Aos membros do Laboratório de Biologia Molecular e Reprodutiva da UNESP de Botucatu, em especial ao Professor Rafael Henrique Nóbrega e à colega Maira da Silva Rodrigues pelo suporte. Aos membros do Laboratório de Biologia do Músculo Estriado Esquelético da UNESP Botucatu, em especial à Professora Maeli Dal Pai e à colega Bruna Tereza T. Zanella pelo suporte. Aos meus familiares que me deram todo apoio e suporte durante toda minha graduação e pós-graduação, em especial à minha namorada Ariane por me apoiar em todos os momentos da minha formação. Ao Instituto de Biociências de Botucatu. Ao programa de Pós-graduação em Zoologia. Aos funcionários do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional e da seção técnica de Pós-Graduação que, pelo seu trabalho, permitiram que este estudo fosse realizado. À FAPESP, CAPES e ao CNPq, pelo financiamento deste projeto. Esta pesquisa foi financiada com recursos da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Processos: 2019/15140-9; 2020/01775-0 Somos feitos de poeira das estrelas. Somos uma maneira de o cosmos conhecer a si mesmo. Carl Sagan Resumo Cromossomos B são elementos supranumerários do genoma de eucariotos, com diversos aspectos ainda incógnitos. Apesar de sua composição pobre em genes codificadores de proteínas, a descrição de transcritos provenientes destes elementos vem alterando a visão de que são estruturas inertes no genoma. Dentre os peixes do gênero Psalidodon, uma grande diversidade desses elementos pode ser observada, com a ocorrência de micro a macro cromossomos B com diferentes morfologias. Estudos anteriores demonstram a ocorrência de pelo menos 21 genes nos cromossomos B de Psalidodon paranae e Psalidodon scabripinnis, sendo que ambas as espécies possuem maior presença de cromossomos B em fêmeas, o que sugere sua atuação nas vias de diferenciação do sexo. Desta forma, o presente estudo visou investigar o conteúdo gênico da variante BfMa de Psalidodon fasciatus para testar a hipótese de origem comum com outras variantes no gênero, bem como investigar se a presença de cromossomos B leva à expressão diferencial de genes da via de diferenciação do sexo em P. paranae. Para isso, foram coletados e analisados indivíduos de P. paranae e P. fasciatus e as análises de qPCR permitiram identificar oito genes codificadores de proteína na variante BfMa de P. fasciatus (amhr2, ccpg1, cia30, g2e3, msh4, nobox, nusap1, sbno2), sendo que seis destes já foram descritos na variante BfMb da mesma espécie. Dessa forma, é altamente provável que ambas as variantes possuam uma origem comum e se diversificaram ao ponto de perder ou adquirir genes exclusivos. Ainda, devido ao compartilhamento de cinco genes entre os cromossomos B de Psalidodon já analisados, pode-se concluir que a variante BfMa também compartilha de uma origem comum com as demais variantes do gênero ocorrida há cerca de 4 milhões de anos e que sua origem não se deu por hibridação interespecífica recente. As análises de RT-qPCR em gônadas de P. paranae mostraram a expressão diferencial de três genes em fêmeas (cyp19a1a, esr1 e nobox) e de dois em machos (dmrt1 e nobox). A subexpressão dos genes cyp19a1a e esr1 em fêmeas poderia ser reflexo de um processo de desregulação causado pelo cromossomo B, ou uma resposta do genoma A para neutralizar o genoma B, ou ainda um possível efeito funcional destes cromossomos, que levaria a uma distorção do período reprodutivo. A superexpressão do gene nobox poderia refletir a existência de um mecanismo de acúmulo destes cromossomos, determinando uma maior eficiência no processo de oogênese e um maior sucesso reprodutivo para fêmeas +B. Em machos, a superexpressão do gene dmrt1 poderia causar uma alteração do ciclo reprodutivo dos indivíduos, como já foi verificado ocorrer em P. scabripinnis por outros autores. Abstract B chromosomes are supernumerary elements found in the genome of eukaryotes and have several aspects still unknown. Despite its poor composition in protein-coding genes, the description of transcripts from these elements has changed the view that they are inert structures in the genome. Among the fish of the genus Psalidodon, a great diversity of these elements can be observed, with the occurrence of micro to macro B chromosomes, with different morphologies. Previous studies have demonstrated the occurrence of at least 21 genes in the B chromosomes of Psalidodon paranae and Psalidodon scabripinnis, with both species having a greater presence of B chromosomes in females, which suggests their role in sex differentiation pathways. Thus, the present study aimed to investigate the gene content of the BfMa variant of Psalidodon fasciatus to test the hypothesis of a common origin with other variants in the genus, as well as to investigate whether the presence of B chromosomes leads to the different expression of genes in the differentiation pathway of the sex in P. paranae. For this, individuals of P. paranae and P. fasciatus were collected and analyzed and the qPCR analysis allowed the identification of eight protein-coding genes in the BfMa variant of P. fasciatus (amhr2, ccpg1, cia30, g2e3, msh4, nobox, nusap1, and sbno2), being that six of these have already been described in the BfMb variant of the same species. Thus, it is highly likely that both variants have a common origin and have diversified to the point of losing or acquiring unique genes. Still, due to the sharing of five genes between the B chromosomes of Psalidodon already analyzed, it can be supposed that the BfMa variant also shares a common origin with the other variants of the genus, in a process that occurred about 4 million years ago and that its origin was not due to recent interspecific hybridization. RT- qPCR analyzes in P. paranae gonads showed differential expression of three genes in females (cyp19a1a, esr1 and nobox), and two in males (dmrt1 and nobox). The under expression of the cyp19a1a and esr1 genes in females could reflect a dysregulation process caused by the B chromosome, or a response of the A genome to neutralize the B genome, or even a possible functional effect of these chromosomes, which would lead to a distortion of the reproductive period. The overexpression of the nobox gene could reflect the existence of a mechanism of accumulation involving these chromosomes, determining greater efficiency in the oogenesis process and greater reproductive success for +B females. In males, overexpression of the dmrt1 gene could cause an alteration in the reproductive cycle, as has already been observed before in P. scabripinnis. Sumário Capítulo 1 - Análise de conteúdo gênico da variante BfMa de Psalidodon fasciatus ................................................... 10 1.1 Introdução ............................................................................................................................................................... 11 1.1.2 Cromossomos B no gênero Psalidodon ............................................................................................................... 13 1.2 Objetivos .................................................................................................................................................................. 14 1.3 Material e métodos ................................................................................................................................................ 15 1.3.1 Material ....................................................................................................................................................................... 15 1.3.2 Métodos........................................................................................................................................................................ 16 1.3.2.1 Estimulação de mitoses ......................................................................................................................................... 16 1.3.2.2 Obtenção dos cromossomos metafásicos mitóticos ........................................................................................... 16 1.3.2.3 Coloração convencional com Giemsa .................................................................................................................. 16 1.3.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) ....................................................................................... 16 1.3.2.5 Hibridação in situ fluorescente (FISH) ................................................................................................................... 16 1.3.2.6 Estudos cariotípicos ................................................................................................................................................ 17 1.3.2.7 Extração de DNA genômico ................................................................................................................................... 17 1.3.2.8 Análise de conteúdo gênico das variantes do cromossomo B por qPCR......................................................... 17 1.3.2.9 Análises estatísticas ................................................................................................................................................ 18 1.4 Resultados ............................................................................................................................................................... 18 1.4.1 Variabilidade cariotípica e presença de cromossomos B em P. fasciatus do Rio Alambari ........................... 18 1.4.2 Genes presentes na variante BfMa de P. fasciatus ............................................................................................ 19 1.5 Discussão ........................................................................................................................................................................ 21 1.6 Conclusões ..................................................................................................................................................................... 22 1.7 Referências ..................................................................................................................................................................... 23 Capítulo 2 - Efeitos do cromossomo B na expressão de genes de diferenciação sexual em Psalidodon paranae ... 29 2.1 Introdução........................................................................................................................................................................ 30 2.2 Material e métodos ........................................................................................................................................................ 32 2.2.1 Coleta e análises cariotípicas ...................................................................................................................................... 32 2.2.2 Extração de RNA total e conversão para cDNA ........................................................................................................ 32 2.2.3 Desenho de Primers para análise de expressão gênica por RT-qPCR ................................................................... 33 2.2.4 Análise de expressão gênica – RT-qPCR .................................................................................................................... 33 2.2.5 Análise estatística ......................................................................................................................................................... 33 2.3 Resultados ........................................................................................................................................................................ 33 2.3.1 Teste de eficiência dos primers desenhados ............................................................................................................ 34 2.3.2 Padronização de genes de referência para análise de expressão gênica por RT-qPCR ...................................... 34 2.3.3 Expressão de genes associados à diferenciação sexual em P. paranae ................................................................ 35 2.4 Discussão ........................................................................................................................................................................ 37 2.5 Conclusões ....................................................................................................................................................................... 40 2.6 Referências ...................................................................................................................................................................... 41 Considerações Gerais ............................................................................................................................................................ 46 Material suplementar ........................................................................................................................................................... 48 Capítulo 1_______________________________________________________________10 Capítulo 1 - Análise de conteúdo gênico da variante BfMa de Psalidodon fasciatus Capítulo 1_______________________________________________________________11 1.1 Introdução Cromossomos B são elementos supranumerários do genoma de eucariotos descobertos há cerca de 115 anos (Wilson, 1907). Desde então, diversos estudos vêm tentando elucidar o seu papel biológico (Jones, 2017; Valente et al., 2017; Vujošević et al., 2018) e, no entanto, diversos aspectos estruturais e funcionais destes elementos genômicos ainda permanecem incógnitos. Esses elementos estão presentes em apenas uma porção dos indivíduos de uma determinada população e podem até mesmo apresentar variação intraindividual (Foresti et al., 1989). Devido a essas características, são considerados não essenciais para a sobrevivência dos portadores (Camacho, 2005) e os efeitos fenotípicos causados por eles são pouco perceptíveis (Burt e Trivers, 2006). Entretanto, alguns efeitos fenotípicos causados pela presença dos cromossomos B foram relatados em algumas espécies, tais como resistência à ferrugem da folha em Avena sativa (Dherawattana & Satanaga, 1973), coloração do aquênio em Haplopappus gracilis (Jackson & Newmark, 1960) e resistência a antibióticos em Nectria haematococca (Coleman et al., 2009). A origem dos cromossomos B em muitos casos ocorre a partir dos cromossomos componentes do complemento padrão da própria espécie e, deste modo, podem carregar informação genética redundante já presente nestes cromossomos (Martis et al., 2012). No entanto, os cromossomos B também podem ser adquiridos de espécies próximas através do processo de hibridação (Camacho, 2005; Tosta et al., 2015). Apesar de sua origem a partir dos cromossomos do complemento padrão, os cromossomos B não se recombinam com os cromossomos do complemento A durante o processo de meiose, seguindo desta forma seu próprio caminho evolutivo (Camacho, 2005). Em geral, os cromossomos B são majoritariamente compostos por heterocromatina e ricos em sequências de DNA repetitivo como DNA satélite, DNA ribossomal e elementos transponíveis (Camacho, 2005). Devido a estas características, alguns autores primeiramente os consideraram como elementos inertes do genoma (Rhoades & McClintock, 1935), enquanto outros os classificavam como elementos parasitas (Östergren, 1945). Com o surgimento das primeiras evidências moleculares de atividade gênica e presença de genes codificadores de proteínas (GCPs) nos cromossomos B (Leach et al., 2005; Graphodatsky et al., 2005), ficou evidente que não se tratam de elementos geneticamente inertes, mas que podem atuar ativamente e desempenhar um papel biológico. Capítulo 1_______________________________________________________________12 Neste contexto, a utilização de metodologias genéticas moleculares e o avanço das tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) permitiram que diversos novos genes fossem identificados nos cromossomos B (Ruban et al., 2017; Ahmad et al., 2019), possibilitando que a pesquisa sobre os cromossomos B dessem um expressivo salto nos últimos 10 anos com relação à caracterização do conteúdo gênico destes cromossomos, tendo sido constatado que vários genes desses componentes genômicos são ativamente transcritos em diversas espécies (Trifonov et al., 2013; Navarro-Domínguez et al., 2017; Ahmad et al., 2020; Blavet et al., 2021; Silva et al., 2021). Com isso, alguns efeitos complexos destes cromossomos estão sendo desvendados, como por exemplo a eliminação dos cromossomos B apenas nas raízes de Aegilops speltoides durante a fase embrionária (Ruban et al., 2020), a presença de um gene adquirido por hibridação interespecífica chamado de haploidizador em Nasonia vitripennis, que causa uma conversão sexual de fêmeas em machos ao expulsar todo o genoma vindo do espermatozoide (Dalla Benetta et al., 2020) e a presença de um gene determinante de sexo feminino epistaticamente dominante ao Y em peixes ciclídeos (Clark & Kocher, 2019). De acordo com Ruiz-Ruano et al. (2019), o conteúdo gênico dos cromossomos B parece ser um fator importante para garantir sua perpetuação. A ocorrência e manutenção da frequência destes cromossomos pode ser explicada por dois modelos, ou pela ocorrência simultânea de ambos (Pokorná & Reifová, 2021). No primeiro modelo, os cromossomos B levam a alterações fenotípicas benéficas e, desta forma, conferem vantagem adaptativa para os indivíduos portadores (Dherawattana & Satanaga, 1973; Coleman et al., 2009). Já o segundo modelo assume que estes cromossomos se fixam na população devido à capacidade de burlar a taxa de transmissão mendeliana, se acumulando na prole através de um mecanismo chamado de drive (Camacho, 2005). Em muitos casos, esta acumulação ocorre durante o processo meiótico nas fêmeas, em que o cromossomo B preferencialmente segrega para o oócito, ao invés de se fixar no corpúsculo polar (Kayano, 1957; Hewitt, 1976; Zurita et al., 1998). De acordo com Akera et al. (2017), o processo meiótico no oócito feminino providencia uma grande oportunidade para elementos genômicos egoístas se acumularem, devido à assimetria do fuso meiótico. Ao se ligarem preferencialmente ao lado do ovócito no fuso, as taxas de transmissão podem ultrapassar as taxas mendelianas esperadas. É interessante destacar que diversos genes relacionados com o ciclo celular já foram encontrados em cromossomos B (Valente et al., 2014; Makunin et al., 2018; Park et al., Capítulo 1_______________________________________________________________13 2019; Silva et al., 2021), sendo possível especular que estes cromossomos consigam manipular a maquinaria celular em benefício próprio (Ruiz-Ruano et al., 2019). 1.1.2 Cromossomos B no gênero Psalidodon Estima-se que a região Neotropical possua cerca de 27% do total de espécies de peixes, o que a torna a região biogeográfica mais rica do mundo com relação à fauna deste táxon (Reis et al., 2016). Dentre os peixes, os componentes da ordem Characiformes ganham grande destaque por serem um dos grupos mais representativos (Fricke et al., 2021). Inserido nesta ordem, o gênero Psalidodon (Characiformes, Characidae) recentemente redescrito por Terán et al. (2020), possui ampla distribuição na América do Sul (Ornelas-Garcia et al., 2008). No entanto, este gênero possui uma sistemática complexa (Rossini et al., 2016). O gênero Psalidodon é caracterizado pela ocorrência de espécies crípticas (Pansonato-Alves et al., 2013; Gavazzoni et al., 2018) e complexos de espécies, tais como os complexos P. scabripinnis (Moreira-Filho & Bertollo, 1991) e P. fasciatus (Artoni et al., 2006), sendo que uma variabilidade cariotípica significativa é encontrada entre os componentes destes complexos de espécies que apresentam, além de números diploides distintos, também diferentes variantes de cromossomos B (Maistro et al., 1992; Mizoguchi & Martins-Santos, 1997). Com relação à variabilidade cariotípica no gênero Psalidodon, são encontrados números diploides desde 2n=36 em P. schubarti (Daniel-Silva & Toledo, 2001) até 2n=50 em diversas outras espécies (Oliveira et al., 2009), além de algumas espécies e populações apresentarem elementos supranumerários ou cromossomos B em seu genoma. De acordo com Oliveira et al. (2009), a morfologia e tamanho dos cromossomos B em Psalidodon é variada, podendo ser encontrados desde macro a micro cromossomos. No entanto, de acordo com Moreira-Filho et al. (2004), a variante metacêntrica com tamanho similar ao do primeiro par de cromossomos do complemento A é a mais recorrente. Devido a isso, foi proposta pelos autores a hipótese de que este cromossomo corresponderia à variante ancestral comum em Psalidodon. Essa hipótese foi posteriormente confirmada por Silva et al. (2016, 2021) com base no compartilhamento de sequências de DNA repetitivo e de genes codificadores de proteínas (GCPs), com base em análises realizadas nos cromossomos B de P. paranae, P. scabripinnis, P. fasciatus e P. bockmanni. Um efeito funcional interessante dos cromossomos B foi relatado em P. scabripinnis, com alterações observadas no período reprodutivo de seus portadores (Castro Capítulo 2_______________________________________________________________41 2.6 Referências ANDERSEN, C.L.; JENSEN, J.L.; ØRNTOFT, T.F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer research, v. 64, n. 15, p. 5245-5250, 2004. BRITT, K.L.; KERR, J.; O'DONNELL, L.; JONES, M.E.E.; DRUMMOND, A.E.; DAVIS, S.R. et al. Estrogen regulates development of the somatic cell phenotype in the eutherian ovary. The FASEB journal, v. 16, n. 11, p. 1389-1397, 2002. BUSTIN, S.A.; BENES, V.; GARSON, J.A.; HELLEMANS, J.; HUGGETT, J.; KUBISTA, M. et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 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Dentre os genes compartilhados entre todas as variantes, pelo menos três estão relacionados a funções do ciclo celular, e desta forma é possível especular que tenham sido genes importantes para o sucesso evolutivo destes cromossomos. O compartilhamento de seis genes da variante BfMa dentre os 11 genes encontrados em BfMb de P. fasciatus indica que estes cromossomos são capazes de perder ou adquirir genes exclusivos e seguir caminhos evolutivos distintos dentro de uma mesma espécie. Ainda, apesar da ocorrência de hibridação interespecífica entre P. fasciatus e P. paranae, o acúmulo de diferenças estruturais entre as variantes BfMa e BpM, bem como o acúmulo de diferenças no conteúdo gênico, permitem descartar a hipótese de surgimento da variante BfMa por hibridação específica recente. Em seguida, a análise de expressão diferencial de genes associados com a via de diferenciação do sexo em P. paranae ajuda elucidar os possíveis efeitos funcionais destes cromossomos. As análises indicam que os genes envolvidos com a produção e ação de hormônios estrógenos encontram-se subexpressos em fêmeas +B. Essa subexpressão poderia levar a menor produção e ação destes hormônios e poderia ser um reflexo da distorção dos feedbacks regulatórios causados pelos cromossomos B, bem como um mecanismo de supressão da ação destes cromossomos por parte do genoma A. Neste sentido, a superexpressão do gene dmrt1 em machos +B poderia ser um indício desta supressão, indicando uma corrida armamentista entre os genomas A e B. Ainda, a subexpressão de genes da via estrogênica também poderia ser entendida como um efeito funcional dos cromossomos B, levando a uma menor produção de estrógeno e alterando o ciclo reprodutivo da espécie. A superexpressão do gene nobox em fêmeas +B poderia levar a uma maior produção de ovócitos e conferir um importante efeito adaptativo para os cromossomos B, indicando assim um mecanismo de acúmulo destes cromossomos. Capítulo 2_______________________________________________________________47 Por fim, consideramos que os resultados e as hipóteses aqui apresentados fornecem novas perspectivas para o estudo de cromossomos B em peixes. Ainda, posteriores análises de NGS podem elucidar de forma mais ampla as relações evolutivas entre diferentes variantes de cromossomo B em Psalidodon. Também, análises dos efeitos dos cromossomos B na expressão de gônadas de juvenis em período de determinação sexual podem elucidar de forma completa o mecanismo de atuação destes cromossomos durante o ciclo de vida.