RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta disssertação será disponibilizado somente a partir de 01/08/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS JABOTICABAL ASSOCIAÇÃO ENTRE Azospirillum brasilense E MILHO NA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE SALINO: UMA ABORDAGEM ANTIOXIDANTE Mirela Vantini Checchio Bióloga 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS JABOTICABAL ASSOCIAÇÃO ENTRE Azospirillum brasilense E MILHO NA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE SALINO: UMA ABORDAGEM ANTIOXIDANTE Mirela Vantini Checchio Orientadora: Profª. Drª. Priscila Lupino Gratão Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Produção Vegetal). 2019 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Mirela Vantini Checchio, nasceu em 16 de Outubro de 1991 na cidade de Jaboticabal, São Paulo. Ingressou no ano de 2012 na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/UNESP, obtendo os títulos de Bacharel em Ciências Biológicas (2015) e Licenciatura em Ciências Biológicas (2017). Em agosto de 2017 iniciou o Mestrado no Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal) na mesma universidade (FCAV/UNESP), dedicando-se ao estudo do metabolismo antioxidante de resposta a estresses abióticos em plantas cultivadas desde 2014 sob a orientação da docente Priscila Lupino Gratão. “Pouco conhecimento faz com que as pessoas se sintam orgulhosas. Muito conhecimento, que se sintam humildes. É assim que as espigas sem grãos erguem desdenhosamente a cabeça para o céu, enquanto que as cheias as baixam para a terra, sua mãe.” Leonardo da Vinci Dedicatória Aos meus Pais, fonte de ensinamentos dos valores mais genuínos, Por todo amor e apoio irrestrito. AGRADECIMENTOS Primeiramente à Deus, por me conceder a vida com infinita bondade e amor, guiar meus passos e me permitir vivenciar momentos inesquecíveis. À minha orientadora Priscila, por toda dedicação, conhecimentos e conversas compartilhados ao longo desses cinco anos. Mas, acima de tudo, pela pessoa amiga e inspiradora que é. À minha querida irmã Michele, pela nossa união e afeto inigualáveis. E pelo meu afilhado Murilo, que sorri com os olhos e me renova de amor e esperança a cada dia. À minha família, por todo amor e torcida ao longo do caminho. Em especial as minhas tias (Regina e Ednéia) e Mônica pelas orações e cuidado. Soninha, pelo abraço e carinho que conforta em qualquer momento que poderia “beirar ao caos”. Aos companheiros que fazem parte da rotina no Laboratório de Fisiologia Vegetal, sempre dispostos a ouvir e ajudar: Kevein, Leticia, Emilaine, Reginaldo, Clebson, Rafael, Carol, Ricardo, Jeferson, Noelle, Milena e Kolima. E a todos que por lá passaram. Em especial, Rita de Cássia, por me auxiliar não só na condução do experimento, mas sim por dividir conhecimentos e me ensinar indiretamente sobre determinação. Gilmar, pelo companheirismo diário no laboratório, dose de autenticidade emanada e conselhos únicos. E principalmente, pelas inúmeras vezes que você me enxergou melhor do que eu sou. Mayara, pela amizade e sintonia em vários âmbitos da vida. Roberta, Fran e Marina Gavassi, pelos desabafos e palavras de conforto nos momentos de aflição e por serem a prova viva de que a amizade nunca foi uma questão de presença física. Fernanda e Talita, por apoiarmos umas às outras ao longo desses anos e pelos momentos que são infindáveis na memória. Aos meus amigos do “Glorinha” (eterna Bio 012) que guardo no coração. E a todos os outros que aqui não mencionei por nome, mas que marcaram minha vida em alguma etapa, deixando um pouquinho de si e contribuindo de alguma forma. Aos colegas e professores da Pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos, conversas e parcerias ao longo do percurso. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. A todos que contribuíram de forma direta ou indireta para a execução deste trabalho, Muito Obrigada! i SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 3 2.1 A Cultura do Milho: aspectos morfológicos, socioeconômico e fisiológicos .................. 3 2.2 Efeito da salinidade nas plantas .............................................................................. 5 2.3 Mecanismos de defesa perante o estresse salino .................................................... 7 2.4 Impactos da salinidade e adubação nitrogenada nos sistemas de produção agrícolas ............................................................................................................................ 8 2.5 Uso de bactérias diazotróficas: Azospirillum brasilense ......................................... 10 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 12 3.1 Condução do experimento.......................................................................................... 12 3.2. Análise de massa seca (MS) ..................................................................................... 13 3.3. Teor de clorofila e carotenóides................................................................................. 13 3.4. Determinação do conteúdo de Na+ ............................................................................ 14 3.5. Determinação do acúmulo de N ................................................................................ 14 3.6. Análise bioquímica .................................................................................................... 15 3.6.1. Peroxidação lipídica (MDA) ................................................................................. 15 3.6.2. Extração de proteínas e determinação enzimática .............................................. 15 3.6.3. Superóxido Dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) ........................................................ 15 3.6.4. Glutationa Redutase (GR, EC 1.8.1.7) ................................................................ 16 3.6.5. Glutationa Peroxidase (GSH-PX, EC 1.11.1.9) ................................................... 16 3.6.6. Guaiacol Peroxidase (GPOX, EC, 1.11.1.7) ........................................................ 16 3.7. Análise estatística .................................................................................................. 17 4. RESULTADOS ............................................................................................................. 17 4.1. Clorofila total e Carotenóides ................................................................................. 17 4.2. Peroxidação Lipídica – malondialdeído (MDA)....................................................... 18 4.3. Enzimas Antioxidantes........................................................................................... 20 4.3.1. Superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) ......................................................... 20 4.3.2. Glutationa redutase (GR, EC 1.8.1.7) ................................................................. 22 4.3.3. Glutationa peroxidase (GSH-PX, EC 1.11.1.9) .................................................... 24 4.3.4. Guaiacol Peroxidase (GPOX, EC 1.11.1.7) ......................................................... 25 ii 4.4. Determinação de Na+ ............................................................................................. 27 4.5. Quantificação do acúmulo de N ............................................................................. 28 4.6. MS dos tecidos vegetais ........................................................................................ 30 5. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 32 6. CONCLUSÃO............................................................................................................... 38 7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 39 iii ASSOCIAÇÃO ENTRE Azospirillum brasilense E MILHO NA TOLERÂNCIA AO ESTRESSE SALINO: UMA ABORDAGEM ANTIOXIDANTE RESUMO - Devido às intensas mudanças climáticas globais e atividades antropogênicas, a salinidade tornou-se uma das principais problemáticas limitantes à produção agrícola. Para lidar com essa problemática, o estudo de genótipos e cultivares que sejam tolerantes ao sal, bem como alternativas através de inoculantes torna-se cada vez mais necessário. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a resposta antioxidante através da inoculação de Azospirillum brasilense em milho, e correlacionar a atividade destas enzimas ao aumento na capacidade da planta em tolerar o estresse ocasionado pela salinidade. Os tratamentos foram formados pela combinação de cloreto de sódio (0 e 100 mM de NaCl) via água de irrigação e ausência e presença do inóculo de A. brasilense, sendo o experimento conduzido inteiramente casualizado, com quatro repetições. Os resultados demonstraram diferentes respostas de acordo com as análises de peroxidação lipídica (MDA), quantificação de nitrogênio (N) e sódio (Na+), massa seca (MS) e atividades enzimáticas, como superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2), guaiacol peroxidase (GPOX, EC 1.11.1.7) e glutationa peroxidase (GSH-PX, EC. 1.11.1.9). Os resultados mostraram que 100 mM de NaCl ocasionou peroxidação lipídica, com consequente aumento do teor de MDA. Entretanto, com a presença da bactéria nesta condição, o teor de MDA foi reduzido, houve aumento do acúmulo de N e as enzimas apresentaram diferenças significativas entre si, com aumentos significativos para GSH-PX e GPOX. Nossos dados sugerem que a presença de A. brasilense no milho sob estresse salino pode conferir tolerância a planta e que esta tolerância está relacionada ao sistema de defesa antioxidante, principalmente de GSH-PX e GPOX. Palavras-chave: Bacterias diazotróficas, Estresse abiótico, Indução de tolerância salina, Zea mays L. iv ASSOCIATION BETWEEN Azospirillum brasilense AND MAIZE ON TOLERANCE TO SALINE STRESS: AN ANTIOXIDANT APPROACH ABSTRACT - Due to intense global climate change and anthropogenic activities, salinity has become one of the main problems limiting agricultural production. To deal with this problem, the study of genotypes and cultivars that are salt tolerant and alternatives through inoculants becomes increasingly necessary. The main of this work was to characterize an antioxidant response through the inoculation of Azospirillum brasilense in maize and to correlate the activity of the enzymes with the salt-stress tolerance. The experiment was carried out in a completely randomized design with four replications. The treatments were performed by combination of sodium chloride (0 and 100 mM NaCl) through irrigation water and absence and presence of A. brasilense inoculation. Overall results showed different responses according to lipid peroxidation (MDA), nitrogen (N) and Na+ contents, dry mass (DM) and enzymatic activities, such as superoxide dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), glutathione reductase (GR, EC 1.6.4.2), guaiacol peroxidase (GPOX, EC 1.11.1.7) and glutathione peroxidase (GSH-PX, EC 1.11.1.9). The results showed were that 100 mM NaCl caused lipid peroxidation with consequent increases in MDA content. However, MDA content was reduced and antioxidant enzymes demonstrated significant differences in the presence of the bacteria. Our data suggest that A. brasilense may confer plant tolerance in maize to salt stress and acquired tolerance can be related to the antioxidant system, mainly GSH-PX and GPOX. Keywords: Abiotic stress, Diazotrophic bacterias, Salt tolerance induction, Zea mays L. v LISTA DE FIGURAS Figura 1. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre o teor de Clorofila Total (A) e Carotenóides (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições ( n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). .................. 18 Figura 2. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre o conteúdo de MDA nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições ( n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). ............................. 20 Figura 3. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre a atividade da enzima SOD nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições ( n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). .................. 22 Figura 4. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre a atividade da enzima GR nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). ................... 23 Figura 5. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre a atividade da enzima GSH-PX nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). .............. 25 Figura 6. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre a atividade da enzima GPOX nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). ................... 26 Figura 7. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre o acúmulo de Na+ nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). .............................. 28 vi Figura 8. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre o acúmulo de N nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). ................................................ 29 Figura 9. Efeito da inoculação de A. brasilense e estresse salino sobre a MS nas raízes (A) e folhas (B). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Os valores representam médias de quatro repetições (n= 4); barras verticais indicam o erro padrão (±EP). ...................................................... 31 1 1. INTRODUÇÃO Devido as intensas mudanças climáticas globais e atividades antropogênicas, incluindo práticas de irrigação, a qualidade das terras agrícolas vem sendo afetadas, especialmente pelo aumento da deposição de sal no solo. Desse modo, a salinidade tornou-se um dos principais estresses abióticos que acomete a produtividade e o desenvolvimento de inúmeras culturas mundialmente (Liang et al., 2018). Sob salinidade, o principal efeito decorrente nas plantas é o estresse osmótico, ocasionado por um desbalanço de íons sódio (Na+) e cloro (Cl-), afetando instantaneamente a captação de água e outros nutrientes e consequentemente o crescimento vegetal (Liang et al., 2018). Posteriormente, quando os níveis de sal atingem um limiar além do qual a planta pode tolerar, ocorre a toxicidade iônica, causando desequilíbrios iônicos através de um intenso influxo de Na+ (Wu et al., 2017). Ambas as etapas são reconhecidas como estresses primários e que podem suceder a outras tensões secundárias, à exemplo tem-se o estresse oxidativo que é ocasionado pela superprodução de espécies reativas de oxigênio (ERO) (Gratão et al., 2015; Liang et al., 2018), transcorrendo em danos na membrana citoplasmática e uma série de disfunções em processos metabólicos essenciais (Wang et al., 2017). Para atenuar as ERO, as enzimas antioxidantes desempenham uma importante resposta nos mecanismos de defesa das plantas perante a salinidade. Algumas enzimas que compõem essa linha de defesa são bem reconhecidas, sendo a superóxido dismutase (SOD, EC, 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.15.1.1), glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2), guaiacol peroxidase (GPOX, EC, 1.11.1.7), glutationa peroxidase (GSH-PX, EC 1.11.1.9), entre outras (Gratão et al., 2015; Alves et al., 2018). Além disso, mecanismos não enzimáticos também são bem elucidados, envolvendo o ascorbato (AsA), glutationa (GSH), prolina, flavonóides, alcalóides e carotenóides (Foyer e Noctor, 2013; Gratão et al., 2015). 2 Uma vez sob estresse salino, a sinalização em cascata é desencadeada e o sistema antioxidante de defesa é constantemente estimulado para lidar com o dano oxidativo. Essa capacidade antioxidante tem sido demonstrada em vários trabalhos, a fim de se obter uma comparação da tolerância à salinidade entre diferentes cultivares (Ashraf et al., 2015; Khalid et al., 2017; Radhakrishnan e Baek, 2017). O milho (Zea mays L.) é intensamente afetado por fatores abióticos e considerado moderadamente sensível ao estresse salino (Ayers e Westcot, 1999), refletindo negativamente em seu crescimento e desenvolvimento. Além disso, por ser uma das culturas economicamente mais importantes do mundo, exige uma alta demanda de nitrogênio (N) para manter sua produtividade (Caires e Milla., 2016). Com isso, fertilizantes fosfatados são constantemente utilizados, não contribuindo para uma abordagem ecológica sustentável (Hungria et al., 2011), além do alto custo para o produtor. Alguns estudos foram desenvolvidos visando estratégias de manejo para suprir a demanda de N pelas plantas, onde obtiveram resultados positivos com a prática de inoculação de bactérias diazotróficas, dentre elas a Azospirillum brasilense (Hungria, 2011; Portugal et al., 2016), bem reconhecidas por sua capacidade de fixação biológica de N e por promover o crescimento em algumas culturas (Fukami et al., 2016). Resultados satisfatórios foram encontrados como uma melhor arquitetura das raízes e rendimento de grãos (Portugal et al., 2016; Pii et al., 2019), produção de hormônios vegetais (Pereira et al., 2015) e, recentemente estudos voltados para a indução de genes associados à defesa de plantas na tolerância ao estresse (Fukami et al., 2017). Como uma nova proposta dentro do estudo envolvendo o efeito da associação de bactérias diazotróficas associadas ao milho, a potencialização do sistema antioxidante de resposta poderia estar associada a esta interação, tornando estas plantas mais tolerantes a situações ambientais adversas, como a salinidade. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a resposta antioxidante através da inoculação de Azospirillum brasilense em milho e correlacionar a atividade destas enzimas ao aumento na capacidade da planta em tolerar o estresse ocasionado pela salinidade. 38 6. CONCLUSÃO A presença de Azospirillum brasilense no milho sob estresse salino pode conferir tolerância as plantas sob salinidade, uma vez que proporcionou a redução dos danos oxidativos (peroxidação lipídica) e aumentou as respostas antioxidantes de GSH-PX e GPOX, além de maior incremento de massa seca sob condição estressora no sistema radicular e uma maior fixação de nitrogênio. 39 7. 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