NATALIA LEOCADIO ROSSIGNOLO Revisão do gênero Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) São José do Rio Preto 2020 Câmpus de São José do Rio Preto NATALIA LEOCADIO ROSSIGNOLO Revisão do gênero Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP – Proc. 2016/16320-2 Orientador: Prof. Dr. Orlando Necchi Junior São José do Rio Preto 2020 R834r Rossignolo, Natalia Leocadio Revisão do gênero Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) / Natalia Leocadio Rossignolo. -- São José do Rio Preto, 2020 121 f. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientador: Orlando Necchi Junior 1. Alga vermelha. 2. Freshwater algae. 3. Filogenia. 4. Molecular Biology. 5. Morfologia. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. NATALIA LEOCADIO ROSSIGNOLO Revisão do gênero Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Mircrobiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP – Proc. 2016/16320-2 Comissão Examinadora Prof. Dr. Orlando Necchi Junior UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientador Profa. Dra. Mariana Cabral de Oliveira USP – São Paulo Profa. Dra. Mutue Toyota Fujii Instituto de Botânica – São Paulo Profa. Dra. Valéria Cassano USP – São Paulo Profa. Dra. Inessa Lacativa Bagatini UFSCAR – São Carlos São José do Rio Preto 28 de agosto de 2020. “Aos meus amados pais, marido André Luiz e filho João Antonio, por toda paciência, suporte e amor dedicados a min e que sempre acreditaram que eu seria capaz de atingir meus objetivos e alcançar meus sonhos”. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Orlando Necchi Jr., minha sincera gratidão por seus ensinamentos, pela confiança em mim depositada, pela compreensão, paciência, incentivo e orientação, para que pudéssemos concluir este trabalho. Aos meus pais pelo alicerce, incentivo, paciência, carinho, e, principalmente, por estarem presentes em todos os momentos da minha vida. Ao meu marido e filho por toda compreensão, paciência e amor dedicados a min, e principalmente por estarem sempre ao meu lado me apoiando e incentivando. Aos meus sogros, Bernadete e Aston, por toda ajuda, apoio e incentivo durante esses anos. Ao Ibilce, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista do campus de São José do Rio Preto, São Paulo, pelo espaço fornecido. À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e aos funcionários da Seção de Pós-graduaçao, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista do campus de São José do Rio Preto, São Paulo, pelo incentivo e encaminhamento dos expedientes nas várias etapas do Doutorado. Agradeço à fundação de Amparo e Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de Doutorado (Proc. 2016/16320-2) e auxílio à pesquisa ao orientador (Proc. 2016/07808-1). Aos colegas do Laboratório B.E.T.A. (Biologia, Ecologia e Taxonomia de Algas) pelo excelente convívio durante esse tempo. “Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”. Leonardo da Vinci (Pensador, 2020) RESUMO Gêneros da ordem das algas vermelhas de águas continentais, Batrachospermales, foram recentemente investigados usando evidências moleculares e morfológicas, mas o gênero Sirodotia ainda não havia sido revisado. O presente estudo teve como objetivos: inferir as relações filogenéticas das espécies dentro do gênero Sirodotia e com outros gêneros da ordem Batrachospermales; conhecer os limites de variação intra e interespecífica com base na análise de três marcadores moleculares: gene plastidial que codifica a subunidade grande da RuBisCO (rbcL), região de “barcode” do gene mitocondrial que codifica a subunidade 1 da citocromo c oxidase (COI-5P) e região de “barcode” do gene nuclear que codifica a subunidade grande do ribossomo (rDNA LSU); e avaliar os caracteres morfológicos de valor diagnóstico para a delimitação de espécies do gênero em âmbito mundial à luz dos novos dados moleculares. Foram analisadas 40 amostras de Sirodotia provenientes de várias regiões do mundo, incluindo África, Ásia, Australásia, América do Norte, América do Sul e Europa, além de espécimes-tipo de seis espécies. Análises filogenéticas concatenadas e de um único gene (rbcL, COI-5P e LSU) mostraram o gênero Sirodotia como grupo monofilético com alto suporte, evidenciando clados ou grupos bem definidos, com nítida repartição biogeográfica delimitando as espécies, além de alta divergência interespecífica (2,1-8,1% e 4,4-10,5%) e baixa variação intraespecífica (0- 2,4% e 0-3,8%) para rbcL e COI-5P, respectivamente. As análises das sequências de LSU revelaram valores de divergência interespecíficas menores (0,7-3,3%) do que as sequências de COI-5P indicando menor poder de resolução como “barcode”. Os caracteres morfológicos diagnósticos previamente utilizados para distinguir o gênero (carpogônio assimétrico com protuberância basal e carposporófito difuso com filamentos prostrados produzindo ramos eretos com carposporângios) foram confirmados neste estudo. Algumas espécies apresentaram padrão biogeográfico bem definido: S. delicatuliformis ocorrência no Brasil e Costa Rica, S. amazonica (regiões centro-oeste e norte do Brasil) e S. cryptica (centro-oeste do Brasil), S. assamica (nordeste da Índia), S. aquiloamericana (sul da América do Norte), S. huillensis (sul e sudeste da África) e S. kennedyi (centro-sul da África). Assim, distribuição geográfica pode ser usada como critério adicional para o reconhecimento dessas espécies. Os seguintes caracteres foram considerados diagnósticos para distinguir as espécies do gênero: número de células dos fascículos primários, arranjo dos espermatângios, parte do carpogônio que produz os filamentos gonimoblásticos e dimensões do carposporângio. Com base na combinação de dados moleculares, morfológicos e biogeográficos foram reconhecidas nove espécies, cinco já descritas (S. assamica, S. delicatula, S. huillensis, S. kennedyi e S. suecica) e quatro novas espécies propostas neste trabalho (S. amazonica, S. aquiloamericana, S. cryptica e S. delicatuliformis). Das espécies previamente consideradas taxonomicamente aceitas no gênero, três (S. cirrhosa, S. gardneri e S. huangshanensis) não puderam ser reavaliadas, pois os espécimes tipo não estavam disponíveis para análise e os caracteres utilizados não foram considerados taxonomicamente informativos; e quatro espécies foram sinonimizadas neste trabalho (S. segawae, S. sinica e S. yutakae com S. suecica; e S. ateleia com S. delicatula). Palavras–chave: Batrachospermales, COI-5P, LSU, rbcL, Sirodotia, morfologia, sistemática molecular. ABSTRACT Genera of the freshwater red algal order Batrachospermales were recently investigated using molecular and morphological evidences, but the genus Sirodotia had not yet been revised. The goals of this study were: to infer the phylogenetic relationships of the species within the genus Sirodotia and with other genera of the order Batrachospermales; to ascertain the limits of intra and interspecific variation, based on the analysis of three molecular markers: the plastid gene that encodes the RuBisCO large subunit (rbcL), the barcode region of the mitochondrial gene that encodes cytochrome c oxidase subunit 1 (COI-5P) and the barcode region of the nuclear gene that encodes the large ribosome subunit (rDNA LSU); and to evaluate the morphological characters of diagnostic value for delimitation of species in the genus worldwide in the light of the new molecular data. Forty samples of Sirodotia from different regions of the world were analyzed, including Africa, Asia, Australasia, North America, South America and Europe, in addition to type specimens of six species. Concatenated and single gene analyses showed the genus Sirodotia as a monophyletic group with high support, showing well-defined clades or groups, with clear biogeographic distribution delimiting species, in addition to high interspecific divergence (2.1-7% and 4.4-10.5%) and low intraspecific variation (0-2.4% and 0- 3.8%) for rbcL and COI-5P, respectively. The analysis of the LSU sequences revealed lower interspecific divergence values (0.7-3.3%) than the COI-5P sequences (4.4- 10.5%) indicating lower resolution as a barcode marker. The diagnostic morphological characters previously used to distinguish the genus (asymmetric carpogonium with basal protuberance and diffuse carposporophyte with prostrate filaments producing erect branches with carposporangia) were confirmed in this study. Some species showed a well-defined biogeographic pattern: S. delicatuliformis occurring in Brazil and Costa Rica, S. amazonica (midwestern and northern Brazil), S. cryptica (midwestern Brazil), S. assamica (northeastern India), S. aquiloamericana (southern North America), S. huillensis (southern and southeastern Africa) and S. kennedyi (south- central Africa). Thus, geographic distribution can be used as an additional criterion for the recognition of these species. The following characters were considered diagnostic to distinguish species in the genus: number of cells of the primary fascicles, arrangement of spermatangia, part of the carpogonium that produces the gonimoblastic filaments and dimensions of the carposporangia. On the basis of a combination of molecular, morphological and biogeographic data nine species were recognized, five already described (S. assamica, S. delicatula, S. huillensis, S. kennedyi and S. suecica) and four new species proposed in this work (S. amazonica, S. aquiloamericana, S. cryptica and S delicatuliformis). Among the remaining species taxonomically accepted in the genus, three (S. cirrhosa, S. gardneri and S. huangshanensis) could not be re-evaluated, because the type specimens were not available for analysis and the characters used were not considered taxonomically informative; and four species were synonymyzed in this study (S. segawae, S. sinica and S. yutakae with S. suecica; and S. ateleia with S. delicatula). Keywords: Batrachospermales, COI-5P, LSU, molecular systematics, morphology, rbcL, Sirodotia. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Filogenia das algas vermelhas segundo autores recentes (Muñoz-Gomes et al., 2017) com a proposição de um novo Subfilo, Proteorhodophytina . 16 Figura 2 – Maximum likelihood phylogenetic tree based on rbcL DNA sequences. 35 Figura 3 – Distance tree (neighbor joining) of COI-5P DNA sequences for Sirodotia species and Batrachospermales outgroup taxa. 36 Figura 4 – Sirodotia assamica sp. nov. 39 Figura 5 – Phylogenetic tree (ML) showing the relationship of species within Sirodotia and genera of the Batrachospermales and Thoreales based on rbcL, COI-5P and LSU concatenated sequence data. 63 Figuras 6-10 – Sirodotia amazonica (photomicrographs of the holotype, SJRP 31924). 77 Figuras 11-15 – Sirodotia aquiloamericana (photomicrographs of the holotype, BHO- 0437). 77 Figuras 16-21 – Sirodotia assamica (photomicrographs of SJRP 32583, SJRP 32584). 78 Figuras 22-26 – Sirodotia cryptica (photomicrographs of the holotype, samples SJRP 32575). 78 Figuras 27-31 – Sirodotia delicatula (photomicrographs of BHO A-0984). 79 Figuras 32-38 – Sirodotia delicatuliformis (photomicrographs of holotype, SJRP 31918). 79 Figuras 39-44 – Sirodotia huillensis (photomicrographs of BHO A-1447). 80 Figuras 45-47 – Sirodotia kennedyi (photomicrographs of BHO A-0946). 80 Figuras 48-52 – Sirodotia suecica (photomicrographs of BHO A-0266, SJRP32582, SJRP32583). 80 Fig. S1 – Maximum likelihood phylogenetic tree based on rbcL. 111 Fig. S2 – Distance tree (neighbor-joining) based on COI-5P sequences. 112 Fig. S3 – Graphical representation of the results of Automatic Barcode Gap Discovery (ABGD) for the COI-5P sequences of the Sirodotia genus used in this study. 113 Fig. S4 – Distance tree (neighbor-joining) based on LSU sequences. 114 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Gêneros da ordem Batrachospermales, família Batrachospermaceae. 19 Tabela 2 – Description of collecting sites and GenBank accession numbers for samples of Sirodotia assamica sp. nov. from India analyzed in this study. 33 Tabela 3 – Comparative morphology and distribution of Sirodotia species. 40 Tabela 4 – Relação das espécies Sirodotia anteriormente consideradas taxonomicamente aceitas e as reconhecidas neste estudo. Os nomes em negrito indicam as nove espécies reconhecidas neste estudo. 116 Table S1 – Sequences of rbcL for Sirodotia species from Genbank used in the analysis. 46 Table S2 – Sequences of COI-5P for Sirodotia species obtained from Genbank used in the analyses. 48 Table S3 – Morphological characters of Sirodotia assamica sp. nov. specimens examined in this study. 49 Table S4 – Reproductive characters of Sirodotia assamica sp. nov. specimens examined in this study. 50 Table S5 – Species, collection information, and GenBank accession numbers for specimens of Sirodotia used in this study. 94 Table S6 – Sequences of rbcL, COI-5P and LSU Sirodotia species obtained from Genbank used in the analyzes. 98 Table S7 – Outgroup sequences used in rbcL, COI and LSU concatenated alignment for phylogenetic analyses. 99 Table S8 –Morphological characters of Sirodotia specimens examined in this study or reported in relevant works. 101 Table S9 – Reproductive characters of Sirodotia specimens examined in this study or reported in relevant works. 104 Table S10 – Comparative morphological characters and geographic distribution of some species of Sirodotia. 108 APRESENTAÇÃO DA TESE O presente trabalho consiste em uma revisão mundial do gênero Sirodotia (Rhodophyta, Batrachospermales). Está estruturado em dois capítulos, precedidos por uma introdução geral e seguidos por conclusões gerais. Os dois capítulos são referentes a dois artigos: o primeiro capitulo representa a primeira parte do trabalho (artigo publicado) com a descrição de uma nova espécie de Sirodotia para o continente Asiático (Índia); o segundo capitulo corresponde ao trabalho geral deste projeto, referente a revisão mundial de Sirodotia contendo as análises dos três marcadores utilizados, parte taxonômica com chave de identificação, descrição das espécies reconhecidas, discussão e conclusões referentes aos resultados gerais obtidos. SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL .......................... ...........................................................................15 1.1. O gênero Sirodotia...........................................................................................................20 1.2. Hipóteses e objetivos gerais do estudo ......................................................................... 21 1.2.1. Hipotéses......................................................................................................................21 1.2.2. Objetivos.......................................................................................................................22 1.3. Referências ................................................................................................................... 23 2. CAPITULO 1: Molecular and morphological evidence for a new species in the genus Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) from the State of Assam, India…………………………………………………………………………………………..………28 2.1. Abstract ........................................................................................................................ 29 2.2. Introduction ................................................................................................................... 30 2.3. Material and Methods ................................................................................................... 32 2.4. Results And Discussion ................................................................................................ 34 2.4.1. Molecular analyses…………………………………………………………………………..34 2.4.2. Morphological analyses……………………………………………………………………...37 2.5. Conclusion .................................................................................................................... 41 2.6. References .................................................................................................................... 41 2.7. Supporting Information .................................................................................................. 45 3. CAPITULO 2: Revision of the genus Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) with description of four new species ....................................................................................... 51 3.1. Abstract ........................................................................................................................ 52 3.2. Introduction ................................................................................................................... 53 3.3. Material and Methods ................................................................................................... 56 3.3.1. Morphological analyses……………………………………………………………………...56 3.3.2.Molecular analyses……………………………………….…………………………………..58 3.4. Results .......................................................................................................................... 60 3.4.1. Molecular analyses…………………………………………………………………………..60 3.4.2. Morphological analyses……………………………………………………………………...63 3.4.2.1 Taxonomic Treatment………………………………………………………………………64 3.4.2.2. Species description………………………………………………………………………...66 3.4.2.3. Doubtful species……………………………………………………………………………81 3.5. Discussion .................................................................................................................... 81 3.6. References .................................................................................................................... 85 3.7. Supporting Information .................................................................................................. 92 4. CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................................... 115 REFERÊNCIAS....................................................................................................................119 15 1. INTRODUÇÃO GERAL O filo Rhodophyta representa umas das linhagens mais antigas de algas e é considerado um grupo irmão das algas verdes e das glaucófitas, todos com cloroplastos derivados de endosssimbiose primária (LOPEZ-BAUTISTA, 2010; DE CLERCK et al., 2012). As rodófitas são, em sua maioria, macroscópicas, fotossintetizantes e habitantes de ambientes marinhos (98%), mas muitos táxons ocorrem exclusivamente em hábitats de água doce e nascentes de água quente e ácida. Algumas rodófitas também foram relatadas em florestas tropicais como membros de comunidades subaéreas (YOON et al., 2004; GURGEL & LOPEZ- BAUTISTA, 2007). Em regiões tropicais e subtropicais dos ecossistemas marinhos costeiros, Rhodophyta representa mais de 60% das macroalgas (NORTON et al., 1996). As rodófitas continentais ocorrem geralmente em águas correntes e estão amplamente distribuídas em bacias de drenagem de regiões árticas a tropicais (NECCHI et al., 1999). No Brasil foram registradas 39 espécies de rodófitas continentais (NECCHI, 2017; dados não publicados). As algas vermelhas representam um distinto grupo de organismos que possuem apenas clorofila a, contêm ficobiliproteínas (aloficocianina, ficocianina e ficoeritrina) responsáveis pela coloração geralmente avermelhada destas algas, que ocorrem na forma de ficobilissomos em tilacoides não empilhados. Os membros desse grupo não apresentam flagelos e centríolos em nenhum estágio de vida (GABRIELSON et al., 1990; GRAHAM & WILCOX, 2009). O cloroplasto é envolto por duas membranas e produz amido das florídeas (material de reserva), que é armazenado no citoplasma. Atualmente é amplamente aceito que o cloroplasto das algas vermelhas se originou através da endossimbiose primária de uma cianobactéria, sendo que essa organela compartilha um ancestral comum com as algas verdes e glaucófitas (BHATTACHARYA et al., 2004; RODRIGUEZ-EZPELETA et al., 2005). O sistema de classificação do filo Rhodophyta tem passado por modificações importantes com base em estudos moleculares e ultraestruturais que visam melhor representar as relações filogenéticas (SAUNDERS & HOMMERSAND, 2004; YOON et al. 2006; QIU et al., 2016). Até o fim dos anos noventa, o filo Rhodophyta era dividido em duas classes ou subclasses, Florideophyceae (Florideophycideae) e Bangiophyceae (Bangiophycideae), baseadas nas características morfológicas e histórico de vida (SHEATH, 1984; GABRIELSON et al., 1985; GARBARY & 16 GABRIELSON, 1990). Estudos moleculares têm se baseado amplamente em alguns genes plastidiais e nucleares focados em uma ampla diversidade de linhagens dentro das Florideophyceae. Uma das primeiras consequências dessas análises foi a separação do filo Rhodophyta em dois subfilos, Cyanidiophytina com uma única classe Cyanidiophyceae, e o subfilo Rhodophytina composto por seis classes: Bangiophyceae, Compsopogonophyceae, Florideophyceae, Porphyridiophyceae, Rhodelophyceae e Stylonematophyceae (YOON et al., 2006). As classes Bangiophyceae e Florideophyceae formaram um grupo monofilético, mas as relações entre as classes restantes permaneceram controversas (MULLER et al., 2001; YOON et al., 2006, 2010; YANG et al., 2010; SCOTT et al., 2011). Em estudo recente, Muñoz- Gomes et al. (2017) aplicaram análise filogenômica a um rico conjunto de dados de genomas plastidiais e propuseram um novo subfilo Proteorhodophytina composto por quatro classes: Porphyridiophyceae, Compsopogonophyceae, Rhodellophyceae e Stylonematophyceae. Algas destes grupos apresentaram os maiores genomas plastídiais já sequenciados até o presente. Figura 1. Filogenia das algas vermelhas segundo autores recentes (Muñoz-Gomes et al., 2017) com a proposição de um novo Subfilo, Proteorhodophytina. Fonte: Muñoz-Gomes et al., 2017. No outro subfilo (Eurhodophytina) encontra-se a classe Florideophyceae que forma uma linhagem monofilética contendo aproximadamente 7.000 espécies descritas (GUIRY, 2012) que exibem uma grande variedade de estruturas 17 morfológicas e ultraestruturais e possuem estratégias reprodutivas complexas. Acredita-se que o número de espécies possa chegar a 20.000 devido às recentes descobertas de espécies crípticas (GRAHAM & WILCOX, 2009). Elas representam cerca de 95% dos táxons conhecidos de algas vermelhas e são importantes fontes de alimentos (por exemplo, nori) e produtos industriais (por exemplo, ágar e carragenana) (QIU et al., 2015). O número de ordens reconhecidas varia de 16 (YOON et al., 2006) a 23 (LE GALL & SAUNDERS, 2007) e tende a crescer com a realização de estudos de grupos específicos baseados em dados moleculares. As ordens e famílias de Florideophyceae foram classificadas, em grande parte, com base no tipo de histórico de vida e o modo de reprodução sexuada. Membros desta classe crescem por meio de células apicais e consistem de filamentos ramificados nos quais as células estão ligadas através de “pit-connections” (conexões intercelulares entre células adjacentes), as quais, em nível estrutural, formam os chamados “pit-plugs” (GRAHAM & WILCOX, 2009). As características ultraestruturais dos “pit-plugs”, como número e arranjo das camadas, são importantes para delimitação das ordens. Vários tipos de “pit-plugs” foram identificados por diferirem no número de “cap layers” (zero, um ou dois) e pela presença ou ausência de uma “cap membrane”. Nove ordens (Hildenbrandiales, Corallinales, Acrochaetiales, Palmariales, Batrachospermales, Ahnfeltiales, Bonnemaisoniales, Gracilariales e Rhodogorgonales) foram estabelecidas principalmente pelas características ultraestruturais dos “pit-plugs” (PUESCHEL & COLE, 1992; FRESHWATER et al., 1994; LEE, 2008; ELORANTA et al., 2011). Dentro da classe Florideophyceae, na subclasse Nemaliophycidae, encontram- se as rodófitas exclusivamente de águas continentais que pertencem às ordens Balbaniales, Batrachospermales e Thoreales (LAM et al., 2015). A maior parte da diversidade de espécies de algas vermelhas de água doce encontra-se na ordem Batrachospermales com aproximadamente 200 espécies em 19 gêneros (ENTWISLE et al., 2009; GUIRY & GUIRY, 2020). Batrachospermales é distinta das demais ordens de Nemaliophycidae com base na seguinte combinação de caracteres: (i) talos heterotríqueos, uniaxiais, gelatinosos ou cartilaginosos; (ii) células axiais com filamentos assimiladores laterais de crescimento determinado; (iii) “pit-plug” com duas camadas, com a camada externa expandida e abaulada; (iv) ausência de tetrasporângio e ocorrência de meiose somática dando origem a eixos haplóides; e (v) múltiplos cloroplastos discóides sem pirenoides; (PUESCHEL & COLE, 1982; 18 GARBARY & GABRIELSON, 1990; KUMANO, 2002; ENTWISLE et al., 2009; PAIANO et al., 2018). A ordem Batrachospermales era tradicionalmente composta por três famílias: Batrachospermaceae, Lemaneaceae e Psilosiphonaceae (SAUNDERS & HOMMERSAND, 2004). Batrachospermales foi foco de revisão por Entwisle et al. (2009), o qual representa o esquema taxonômico mais recente e amplo para a ordem. As principais novidades, além do reconhecimento de uma única família (Batrachospermaceae com nove gêneros) foram: reconhecimento provisório do gênero Batrachospermum, visto que tem sido demonstrado como parafilético em todas análises filogenéticas moleculares; proposição do novo gênero Kumanoa, resultado da elevação das antigas seções Contorta e Hybrida do gênero Batrachospermum; e o reconhecimento de oito seções no gênero Batrachospermum – Acarposporophytum (rebaixado do nível subgênero para seção), Aristata, Batrachospermum, Macrospora (separada de Aristata), Setacea, Turfosa e Virescentia. Para a maioria das seções havia grande carência de análises representativas incluindo maior número de espécies e de populações de cada espécie. A elevação de grupos monofiléticos menores (geralmente conhecidos como seções de Batrachospermum) para o nível gênero tem sido uma clara tendência na taxonomia do grupo nos últimos anos. A antiga seção Helminthoidea foi elevada para gênero (Sheathia) baseado em caracteres morfológicos e análises filogenéticas de três marcadores moleculares (SALOMAKI et al., 2014). A seção Setacea foi também elevada a gênero por Rossignolo & Necchi (2016) com base em dados morfológicos e moleculares e o nome posteriormente alterado para Torularia (WYNNE, 2019). As seções relacionadas a seguir foram elevadas a gêneros em estudos recentes com base em evidências morfológicas e moleculares: Virescentia (NECCHI et al., 2018), Acarposporophytum (gênero Acarposporophycos, NECCHI et al., 2019a), Aristata (gênero Visia, NECCHI et al., 2019a), Macrospora (gênero Montagnia, NECCHI et al., 2019b) e Turfosa (gênero Paludicola, VIS et al., 2020). A tabela 1 resume os gêneros de Batrachospermales atualmente reconhecidos, as antigas seções a que pertenciam e a distribuição geográfica mundial. 19 Tabela 1. Gêneros da ordem Batrachospermales, família Batrachospermaceae. Gêneros Seções antigas Distribuição Referências Acarposporophycos Acarposporophytum América do Sul Necchi (1987), Necchi et al. (2019a) Balliopsis - América do Sul, Africa e Ásia Saunders & Necchi (2002) Batrachospermum - Africa, América do Norte, América do Sul, Ásia, Australasia e Europa Roth (1797), Kumano (2002), Guiry &Guiry (2020) Kumanoa Contorta e Hybrida África, América do Norte, América do Sul, Ásia, Australasia e Europa Sirodot (1873), Skuja (1931), Entwisle et al. (2009), Necchi & Vis (2012) Lemanea - América do Norte, Ásia, Europa Bory (1808) Lympha América do Norte Evans et al. (2017) Montagnia Macrospora África, América do Norte, América do Sul e Ásia Kumano (1993), Necchi et al. (2019b) Nocturama Batrachospermum América do Sul, Australásia Entwisle et al. (2016) Nothocladus Batrachospermum Africa, Ásia e Australásia Skuja (1934), Schneider & Wynne (2007), Entwisle et al. (2016) Paludicola Turfosa América do Norte, América do Sul, Ásia e Europa Sirodot (1873), Vis et al. (2020) Paralemanea - América do Norte, América do Sul, Ásia e Europa Vis & Sheath (1992) Petrohua - América do Sul Vis et al. (2007), Schneider & Wynne (2007) Psilosiphon - Australásia Entwisle (1989) Sheathia Helminthoidea África, América do Norte, Ásia, Australasia e Europa Sirodot (1973), Salomaki et al. (2014) Sirodotia - África, América do Norte, América do Sul, Australásia, Ásia e Europa Kylin (1912), Lam et al. (2012) Torularia Setacea Africa, América do Norte, América do Sul, Ásia, Australásia e Europa Rossignolo & Necchi (2016), Wynne (2019) Tuomeya - América do Norte Harvey (1858), Kaczmarczyk et al. (1992), Kumano (2002) Virescentia Virescentia América do Norte, América do Sul, Asia e Europa Sirodot (1873), Necchi et al. (2018) Visia Aristata América do Sul, Ásia e Australásia Skuja (1933), Necchi et al. (2019a) Volatus - América do Norte e Europa Chapuis et al. (2017) Fonte: Produção do autor 20 1.1. O gênero Sirodotia Dentre as rodófitas continentais da ordem Batrachospermales, Sirodotia é um gênero amplamente distribuído no mundo todo (LAM et al., 2012). O gênero foi proposto por Kylin (1912) dentro de Batrachospermaceae com base na espécie tipo S. suecica. Apresenta morfologia similar ao gênero Batrachospermum e aos gêneros mais recentemente segregados como Kumanoa e Virescentia (ENTWISLE et al. 2009, LAM et al. 2012). O gênero Sirodotia se diferencia dos demais gêneros da família por apresentar carpogônio com base assimétrica (com uma protuberância) e carposporófito difuso que se estende ao longo do eixo principal, consistindo de filamentos gonimoblásticos indeterminados e prostrados, que produzem pequenos filamentos eretos determinados, sobre os quais se desenvolvem os carposporângios (NECCHI et al., 1993; KUMANO, 2002; NECCHI et al., 2007; LAM et al., 2012). As espécies do gênero têm sido reconhecidas com base em alguns caracteres morfológicos, como morfologia vegetativa do gametófito, presença de espermatângios em ramos especializados, posição do ramo carpogonial, origem dos filamentos gonimoblásticos em relação ao carpogônio e tamanho do carpogônio e carposporângio (NECCHI et al., 1993; KUMANO, 2002; NECCHI et al., 2007). Atualmente existem 13 espécies taxonomicamente aceitas em Sirodotia (KUMANO, 2002; OTT, 2009; GUIRY & GUIRY, 2020): S. assamica, S. cirrhosa, S. delicatula, S. gardneri, S. huangshanensis, S. huillensis, S. iyengarii, S. kennedyi, S. polygama, S. segawae, S. sinica, S. suecica e S. yutakae. Porém, poucas espécies foram analisadas com base em dados moleculares e morfológicos. O gênero Sirodotia tem sido reconhecido como um grupo distinto e monofilético em vários estudos, tanto com base em dados morfológicos (NECCHI et al., 1993; KUMANO, 2002; NECCHI et al., 2007), quanto moleculares (VIS & SHEATH, 1999; LAM et al., 2012; PAIANO & NECCHI, 2013; JOHNSTON et al., 2014). Estudos moleculares sobre o gênero Sirodotia têm contribuído para melhor compreensão sobre a taxonomia infra-genérica (VIS & SHEATH, 1999; NECCHI et al., 2007; PAIANO & NECCHI, 2013; JOHNSTON et al., 2014). Esses estudos mostraram que a diversidade genética é grande entre as espécies, levando à sinonimização de algumas espécies (S. tenuissima sinônimo de S. suecica) e à distinção genética e morfológica de outras (S. huillensis e S. delicatula). Além disso, esses estudos têm apontado a ocorrência de espécies crípticas com alto nível de divergência genética, porém sem a correspondente distinção morfológica, em alguns casos, apenas 21 geográfica. Em um estudo recente sobre o gênero Sirodotia (LAM et al., 2012) com a inclusão de um número expressivo de sequências de algumas regiões do globo foi encontrada provável espécie nova de amostra da África do Sul (referida como S. aff. huillensis). Paiano et al. (2013) por meio de estudos filogeográficos com S. delicatula, indicaram a existência de espécies crípticas no Brasil. Ademais, estudos moleculares realizados por Johnston et al. (2014) revelaram que os espécimes de S. delicatula da Malásia e do Brasil não são semelhantes geneticamente, sugerindo que o espécime da Malásia representa S. delicatula, enquanto que a espécie brasileira deve tratar-se de espécie distinta. Os dados filogenéticos moleculares já apresentados para o gênero Sirodotia, assim como para outros gêneros e seções da ordem Batrachospermales, têm revelado numerosos casos de espécies crípticas (LAM et al., 2012; PAIANO & NECCHI, 2013; AGOSTINHO et. al., 2014; ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016; NECCHI et al., 2019a, 2019b; VIS et al., 2019). Assim como nos gêneros e seções de Batrachospermum, as relações filogenéticas, limites de variação e diversidade genética entre espécies precisam de um estudo mais detalhado baseado em dados morfológicos e moleculares. A utilização de ferramentas moleculares para auxílio na taxonomia e biogeografia de algas tem contribuído no aprimoramento do esquema de identificação de táxons não somente nas descontinuidades na variação morfológica para distinguir espécies, mas com a utilização de dados genéticos e/ou geográficos (SAUNDERS, 2005). Dentre os gêneros de Batrachospermales que têm numerosas espécies, Sirodotia é um dos poucos que ainda não foi completamente revisado. Considerando este conjunto de informações e que poucas espécies têm sido reconhecidas mundialmente com base em dados moleculares e morfológicos o presente estudo foi proposto. 1.2. HIPÓTESES E OBJETIVOS GERAIS DO ESTUDO 1.2.1. Hipóteses Com base nas informações atualmente disponíveis (morfológicas e moleculares) sobre representantes do gênero Sirodotia em âmbito mundial, as seguintes hipóteses gerais foram testadas: 1. O gênero Sirodotia será confirmado como grupo monofilético dentro da ordem Batrachospermales. Se a hipótese for corroborada, o gênero será reconhecido como 22 distinto dentro da ordem e confirmará conclusões de outros estudos filogenéticos (VIS et al., 1998; VIS & SHEATH, 1999; NECCHI et al., 2007; ENTWISLE et al., 2009; PAIANO & NECCHI 2013); 2. Espécies atualmente reconhecidas com base em caracteres morfológicos serão corroboradas pelos dados moleculares. E espécies novas, particularmente espécies crípticas, deverão ser encontradas e reconhecidas como espécies distintas dentro do gênero; 3. Os caracteres morfológicos atualmente usados para distinguir as espécies do gênero - presença de espermatângios em ramos especializados, posição do carpogônio que produz os filamentos gonimoblásticos e dimensões do carpogônio e carposporângio (NECCHI et al., 1993; KUMANO, 2002; NECCHI et al., 2007) – deverão ser corroborados pelos dados moleculares; 4. A biogeografia das espécies deverá ser um caráter adicional importante para a determinação de novas espécies, visto que os dados disponíveis indicam que algumas espécies apresentam nítida repartição geográfica. 1.2.2. Objetivos Para testar estas hipóteses desenvolvemos o presente trabalho com os seguintes objetivos: 1. Inferir as relações filogenéticas das espécies dentro do gênero Sirodotia e com as de outras de outros gêneros da ordem Batrachospermales, com base na análise das sequências do gene plastidial que codifica a subunidade grande da RuBisCO (rbcL), da região de “barcode” do gene mitocondrial que codifica a subunidade 1 da citocromo c oxidase (COI-5P) e da região de “barcode” do gene nuclear que codifica a subunidade grande do ribossomo (LSU); 2. Fornecer subsídios para melhor definição dos limites de variação interespecífica com base na análise das sequências desses três marcadores; 3. Avaliar quais caracteres morfológicos têm valor diagnóstico, inclusive à luz dos novos dados moleculares, para a delimitação de espécies do gênero Sirodotia e circunscrever as espécies reconhecidas no gênero em âmbito mundial. 23 1.3. REFERÊNCIAS AGOSTINHO, D. C; NECCHI, O. Jr. Systematics of the section Virescentia of the genus Batrachospermum (Batrachospermales, Rhodophyta) in Brazil. 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Phylogenetic relationships of the new species were inferred on the basis of DNA sequence data for the plastid rbcL gene and the barcode region of the mitochondrial COI- 5P gene. Taxonomic affinities of the new species were determined by morphological analyses and a distinctive character was found for this species: spermatangia arranged in clusters. Although this character is also observed in S. huillensis, both species are genetically highly divergent (4.5–5.0% for rbcL and 9.6–10.1% for COI-5P). DNA sequences from Indian specimens formed a well-supported clade, sister to S. delicatula from Malaysia. DNA sequence divergence between S. assamica and S. delicatula varied from 2.5–2.7% for rbcL and COI-5P. Intraspecific divergence between the two sequences from India were low (0.4–0.5%). A full description and photographs of the new species are provided, as well as a comparison with morphologically similar and phylogenetically allied species reported from India and other Asian regions. Keywords: Batrachospermales, COI-5P, freshwater Rhodophyta, India, molecular systematics, rbcL 2.2. Introduction The genus Sirodotia is a member of the freshwater red algal order Batrachospermales (Entwisle et al. 2009) and was proposed by Kylin (1912) based on the type species S. suecica. Sirodotia currently includes species with similar vegetative morphology to the genus Batrachospermum and other recently segregate genera such as Kumanoa, Virescentia and Torularia (Entwisle et al. 2009; Lam et. al., 2012). Sirodotia is distinguished by two important reproductive characters: an asymmetrical carpogonium base (with a protuberance), and a diffuse carposporophyte extending along the main axis consisting of indeterminate, prostrate gonimoblast filaments with short erect branches producing carposporangia (Necchi et al., 1993, 2007; Kumano, 2002; Lam et al., 2012). Within Sirodotia, species are differentiated based on the morphology of the gametophyte, presence of spermatangia on specialized branches, the origin of the carpogonial branch, which side of the carpogonium (protuberant or 30 non-protuberant) produces the gonimoblast filaments, and the size of the carpogonium and carposporangia (Necchi et al., 1993; Kumano, 2002; Necchi et al., 2007). Kumano (2002) recognized eight species worldwide, but there are eleven species currently taxonomically accepted (Guiry & Guiry, 2020). Only three geographically widespread species have been reported: S. suecica Kylin, S. huillensis Welwitsch ex West & G.S.West and S. delicatula Skuja (Kumano, 2002; Necchi et al. 2007; Lam et al., 2012). Sirodotia species occur on all continents except Antarctica and have been reported from various locations in North America, South America, Australasia, and Europe, with sparse reports in China, India, Southeast Asia, and Africa (Israelson, 1942; Balakrishnan & Chaugule, 1980; Kumano, 1982; Necchi et al., 1993; Entwisle & Foard, 1999; Sheath & Sherwood, 2002; Carmona et al., 2006; Eloranta & Kwandrans, 2007; Necchi et al., 2007; Eloranta et al., 2011; Lam et al., 2012). The use of DNA sequence data for genes such as the plastid RuBisSCO large sub-unit (rbcL) and the mitochondrial cytochrome c oxidase sub-unit (COI-5P) in conjunction with morphological data, has provided better species circumscriptions, insights into taxonomically informative characters and phylogeographic relationships for members of the Batrachospermales and Rhodophyta in general (Vis & Sheath, 1999; Necchi et al., 2007; Lam et al., 2012). Despite the many geographically widespread records, only a few Sirodotia species have been recognized worldwide based on both molecular and morphological data: S. suecica Kylin (temperate regions of North America and Europe), S. delicatula Skuja (South America, Japan, and Southeast Asia) and S. huillensis W. West & G.S. West (tropical and subtropical regions of the Americas and Asia) (Necchi, 1991; Necchi et al., 1993, 2007; Vis & Sheath, 1999; Lam et al., 2012). Molecular studies of Sirodotia have provided insights into the infrageneric taxonomy. Vis and Sheath (1999) analyzed S. suecica, S. tenuissima, and S. huillensis from North America and proposed S. tenuissima to be synonymous with S. suecica but kept S. huillensis as a distinct species. Recently, DNA sequence data for S. delicatula from Brazil have shown this species to be morphologically and genetically distinct from S. huillensis and S. suecica (Necchi et al., 2007). Further molecular studies of Sirodotia delicatula from Brazil indicated the existence of cryptic species (Paiano & Necchi, 2013). Johnston et al. (2014) showed S. delicatula from Malaysia and Brazil to be genetically distinct. Considering the proximity to the type locality (Indonesia) of S. delicatula, they suggested that the 31 Malaysian specimen represents S. delicatula, while the Brazilian species most likely is a new species. The genus Sirodotia has been collected in India and species identified using morphological observations. Biswas (1934, 1949) reported Sirodotia cirrhosa Skuja ex M.S.Balakrishnan & B.B.Chaugule from north-east India based on the identification by Skuja (Ganesan et al., 2018). Sirodotia cirrhosa was synonymized with S. huillensis by Kumano (2002). However, Sirodotia cirrhosa has been listed as a distinct species by Guiry & Guiry (2020). Three other species of Sirodotia have been collected and described in India: S. huillensis (Welwitsch ex West & G.S.West) Skuja, S. iyengarii Baluswami & Babu (1999) and S. moniliformis Skuja (Ganesan et al., 2018). Specimens from India identified as S. huillensis and S. iyengarii are probably not attributable to Sirodotia because some morphological characteristics (twisted or contorted carpogonial branches, gonimoblast developing from the hypogynous cell and compact arrangements of carposporophytes) in their descriptions are not consistent with the current genus circumscription. Sirodotia moniliformis Skuja is of uncertain taxonomic status (Ganesan et al., 2018). Recent Indian Batrachospermales collections allowed us to assess their true diversity and to compare these collections with previously described species using newly generated morphological and DNA sequence data. This study describes a new species of Sirodotia found in the State of Assam, India, based on morphological and molecular evidence. 2.3. Material and methods Three samples of Sirodotia were collected from two localities in the State of Assam, India, for morphological and molecular analyses (Table 2). Voucher specimens were deposited in the Herbarium SJRP (São Paulo State University, Campus of São José do Rio Preto, SP, Brazil). The diagnostic characters currently applied in the genus Sirodotia (see Necchi, 1991; Necchi et al., 1993; Vis & Sheath, 1999; Kumano, 2002; Necchi et al., 2007; Lam et al., 2012) were used for morphological analyses. All measurements were made as described by Necchi (1990). For observations and measurements, we used an Olympus SZH10 stereoscope and an Olympus BH-2 light microscope (Olympus Corp., Tokyo, Japan). Photomicrographs were taken with a Leica DFC 320 digital camera using LAS (Leica 32 Application Suite) capture and image analysis software coupled to a Leica DM5000 microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Protocols for DNA extraction, PCR amplification, purification and DNA sequencing were described in our previous studies: Rossignolo & Necchi (2016), Necchi et al. (2018; 2019). DNA sequences were generated for two molecular markers: the plastid-encoded RuBisCO large-subunit gene (rbcL), and the barcode region of the mitochondrial encoded cytochrome c oxidase subunit 1 (COI-5P). Analyses were conducted including DNA sequence data from previously published studies (Tables S1-S2) available in GenBank (Benson et al., 2013). For COI-5P sequence data (664 bp), distance analysis using Neighbor Joining (NJ) and TIM2+G (Transition model, unequal base frequency and Gamma parameter) as model determined as the best- fit model of sequence evolution by the corrected Akaike Information Criterion (cAIC) by jModeltest 2.1.4 (Darriba et al., 2012) performed with Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA version X, Kumar et al., 2018) with 1,000 bootstrap replicates. For phylogenetic analyses of the rbcL sequence data (1,282 bp), a GTR + I + G was determined by cAIC using jModelTest 2.1.4. Maximum likelihood (ML) topologies and bootstrap values from 10,000 bootstrap replicates were inferred using RAxML graphic user interface version 1.5 (Silvestro & Michalak, 2012). Bayesian analysis (BA) was performed in MrBayes 3.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) with three runs of five chains of Metropolis coupled Markov Chain Monte Carlo (MCMC) for 10 x 106 generations saving one tree every 1000 generation. The first 500 trees were removed as burn-in prior to determining the posterior probabilities. Burn-in cutoff was estimated in Tracer 1.7.1 (Rambaut et al., 2018). 33 TABLE 2. Description of collecting sites and GenBank accession numbers for samples of Sirodotia assamica sp. nov. from India analyzed in this study. Species/code Location, date and herbarium number GenBank accession COI-5P rbcL Sirodotia sp. – IN1a India: Assam, Nagaon District, Chapanala; 26º19'13.7"N, 92º10'16.5" E; O. Necchi Jr., J.A. West, E.K. Ganesan & F. Yasmin, 23.ii.2018 (SJRP 32583). MN508239 MN496129 Sirodotia sp. – IN1b India: Assam, Nagaon District, Chapanala; 26º19'13.7"N, 92º10'16.5" E; F. Yasmin, 25.ii.2019 (SJRP 32584) ----- ----- Sirodotia sp. – IN2 India: Assam, Sonapur, Tegheria; 26º05’52” N, 92º02’02”; F. Yasmin, 24.ii.2019 (SJRP 32585). MN508240 MN496130 Source: Author's own production 2.4. Results and discussion 2.4.1. Molecular analyses Two rbcL and two COI-5P sequences were newly generated in this study (Table 2). These sequences were compared to GenBank DNA sequences (68 of rbcL and 12 of COI-5P) from specimens collected in Africa, Australia, Brazil, Costa Rica, Finland, India, Malaysia, Mexico, New Zealand and USA (Table S1, S2). Both the BA and ML analyses of the rbcL sequences resulted in the same tree topology such that only the ML tree is shown (Fig. 2). Phylogenetic analyses showed the genus Sirodotia as a well-supported clade with two major subclades: the first comprising S. suecica specimens from several regions of the world (Africa, Australia, Finland, USA and New Zealand) and the second containing all remaining specimens, including the Sirodotia assamica sp. nov. specimens from India (Fig.2). This second major subclade contains sequences identified as S. huillensis (from Mexico and the USA), Sirodotia spp. from Brazil, S. aff. huillensis (from Africa), and S. delicatula (from Malaysia) (Fig. 2, Table S1). The DNA sequences from Brazil represent three new species yet to be described (Paiano & Necchi 2013). Our specimens from India formed a well-supported clade sister to S. delicatula from Malaysia. The divergence 34 between DNA sequences from India and S. delicatula was high (2.5–2.7%), whereas the intraspecific divergence between the two Indian sequences was low (0.4%). Divergence levels among the sequences from India and Malaysia indicate that they represent two separate species. The sequence from Malaysia is considered the true S. delicatula because the specimens were collected near Indonesia, the type locality (Johnston et al. 2014). The COI-5P NJ tree (Fig. 3, Table S2) showed two well-supported groups: a group comprised of S. suecica DNA sequences from Africa, Canada, and USA; and a group containing DNA sequences of the remaining species: Sirodotia spp. (Brazil), S. huillensis (USA), and the two sequences from India. The DNA sequences from India formed a clade with high support representing a distinct species with high interspecific divergence (6.9–10.1%) to the other species and a low intra-specific divergence (0.5%). The sequence divergences observed in rbcL and COI-5P from species of Sirodotia (0.4% and 0.5%) are within the intraspecific variation previously observed in others species of the order Batrachospermales (Agostinho et al. 2014; Rossignolo & Necchi 2016; Necchi et al. 2018, 2019). These data indicate that the DNA sequences from India represent a distinct species that is described below. 35 FIGURE 2. Maximum likelihood phylogenetic tree based on rbcL DNA sequences. The numbers associated with the nodes indicate the bootstrap values (BS) for maximum likelihood and posterior probability (PP) for Bayesian analysis, respectively. Nodes without values indicate BS ≤ 70% and PP ≤ 0.70. Sample codes as in Table 2. Source: Author's own production 36 Source: Author's own production 2.4.2. Morphological analyses and taxonomic proposals Sirodotia assamica Necchi, Rossignolo, Yasmin, West and Ganesan sp. nov. (Fig. 4 a–h) Description. Plants dioecious or monoecious, irregularly branched; apices straight; apical cells protruse. Whorls dense or loose, pear-shaped or obconical, contiguous, 400–665 µm in diameter. Internodes 547–1177 µm in length. Cortical filaments well- developed, with two to four layers. Primary fascicles straight, 6–12 cell storeys; proximal cells cylindrical or ellipsoidal, 17–42 µm in length, 7–13 µm in diameter; distal cells obovoidal, ellipsoidal or sub-spherical, 9–14 µm in length, 5–9 in diameter; di- or trichotomously branched. Secondary fascicles abundant, covering the entire internode, equal to or shorter than the length of the primary fascicles. Spermatangia spherical, terminal or sub-terminal, arranged in clusters on primary or secondary fascicles, 6–8 µm wide. Carpogonial branches straight or slightly curved, short, 7–23 µm long, composed of 1–5(–6) disc- or barrel-shaped cells, 5–9 µm long, 4–8 µm wide, arising from periaxial cells of primary fascicles; involucral FIGURE 3. Distance tree (neighbor joining) of COI-5P DNA sequences for Sirodotia species and Batrachospermales outgroup taxa. The numbers associated with the nodes indicate the bootstrap values, nodes without values indicate support < 70%. Sample codes as in Table 2. 37 filaments few and short, composed of 1–3 short-cylindrical or ellipsoidal cells. Carpogonia asymmetrical, with a hemispherical protuberance on one side of the basal portion, 37–64 µm in length, 10–16 µm in diameter; trichogynes elongate- cylindrical, ellipsoidal or lageniform, sessile or pedicellate. Carposporophyte diffuse with no definite shape. Gonimoblast initial developing from protuberant side of the carpogonium; gonimoblast filaments prostrate, creeping among fascicles or cortical filaments along the main axis; with erect branches of 1–4 cylindrical or ellipsoidal cells, producing carposporangia at the tips; carposporangia obovoidal or sub-spherical, 11–14 µm in length, 6–8µm in diameter. Holotype: India, Assam, Nagaon District, Chapanalla; 26º19’13.7” N, 92º10’16.5” E; coll. F. Yasmin, 25.ii.2019 (SJRP 32584). Holotype specimen not sequenced. Paratypes: India, Assam, Sonapur, Tegheria; 26º05’52” N, 92º02’02” E; coll. F. Yasmin, 24.ii.2019 (SJRP 32583); India, Assam, Nagaon District, Chapanalla; coll. O. Necchi Jr. et al., 23.ii.2018 (SJRP 32585). DNA sequences: COI-5P (MN508239, MN508240) and rbcL (MN496129, MN496130). Remarks: Sirodotia assamica most distinguishing feature is the occurrence of spermatangia arranged in clusters, thus far described only for S. huillensis. However, these two species are genetically highly divergent (4.5%–5.0% for rbcL and 9.6%– 10.1% for COI-5P). Sirodotia assamica is most closely comparable to S. cirrhosa, S. delicatula and S. sinica based on the vegetative and reproductive characteristics and the occurrence in or near India (Table 3). Sirodotia assamica differs from S. sinica in having longer carpogonia (37–64 µm versus 20–41 µm in length, respectively), by the arrangement of spermatangia in clusters and smaller carposporangia (11–14 µm x 6–8 µm versus 12–18 µm x 8–10 µm, respectively). Sirodotia assamica differs from S. delicatula in having larger whorls (400–665 µm versus 137–306 µm in diameter, respectively), greater number of cell storeys in primary fascicles (6–12 versus 4–6 cells, respectively), longer carpogonia (37–64 µm x 25–40 µm in length, respectively) and spermatangia in clusters. Moreover, they are genetically quite divergent (2.5– 2.7% for rbcL and 4.2%–4.7% for COI-5P). Sirodotia cirrhosa was described by Balakrishnan & Chaugule (1980) from northern and southern India. However, S. cirrhosa differs from S. assamica in having shorter carpogonia (37–64 µm x 29–41 µm long) and smaller carposporangia (11–14 µm x 8–11 µm long) and lacking 38 spermatangia arranged in clusters. There are no molecular data for comparison since S. cirrhosa has not been reported since the record by Balakrishnan & Chaugule (1980). Moreover, the nomenclatural type of S. cirrhosa is not available for a comparative analysis since it is not lodged in the UPS herbarium (Uppsala University, Sweden), where it was supposed to be deposited according to Balakrishnan & Chaugule (1980). 39 FIGURE 4. Sirodotia assamica sp. nov. a. Main axis. b. Whorl showing densely arranged gonimoblast filaments along the internode (arrow). c. Primary fascicles and spermatangia (Sp) in clusters on a primary fascicle. d. Carposporangia (Cp), prostrate (Pr) and erect (Er) gonimoblast filaments. e. Detail of spermatangia (Sp) in clusters on primary fascicle. f. Spermatangia (Sp) in clusters on a secondary fascicle. g. A carpogonium with a mature trichogyne (Tr) and a basal hemispherical protuberance (PB). h. Fertilized carpogonium with attached spermatium and gonimoblast initial (GI) on the same side of the basal protuberance. Scale bar: 100 µm for figure a; 50 µm for figures b, c and f; 20 µm for figures d,e,g and h. Source: Author's own production. 40 M o rp h o lo g ic a l c h a ra c te rs S . a s s a m ic a S . c ir rh o s a S . d e li c a tu la S . h u il le n s is S . s in ic a W h o rl s S e p a ra te d , 4 0 0 – 6 6 5 µ m w id e 9 5 – 5 4 0 µ m w id e S e p a ra te d , 1 3 7 – 3 0 6 µ m w id e S e p a ra te d , 1 6 2 – 5 4 0 µ m w id e S e p a ra te d P ri m a ry f a s c ic le s 6 – 1 2 c e lls 5 – 9 c e lls 4 – 6 c e lls 3 – 1 2 c e lls 7 – 1 0 c e lls C a rp o g o n iu m l e n g th 3 7 – 6 4 µ m lo n g ,1 0 – 1 6 µ m w id e 2 9 – 4 1 µ m lo n g , 6 ,5 -8 ,5 µ m w id e 2 5 – 4 0 µ m lo n g 2 8 ,5 – 5 3 µ m lo n g 2 0 – 4 1 µ m lo n g C a rp o g o n ia l b ra n c h e s 7 – 2 3 µ m lo n g , 1 – 5 ( -6 ) d is c - o r b a rr e l- s h a p e d c e lls 3 – 5 b a rr e l- s h a p e d c e lls 8 – 1 5 µ m lo n g , 3 – 5 b a rr e l- s h a p e d c e lls 2 – 5 b a rr e l- s h a p e d c e lls 1 0 – 2 0 µ m le n g h t, 2 – 6 b a rr e l- s h a p e d c e lls O ri g in o f th e g o n im o b la s t fi la m e n ts o n t h e p ro tu b e ra n t s id e o f th e c a rp o g o n iu m o n t h e p ro tu b e ra n t s id e o f th e c a rp o g o n iu m o n t h e p ro tu b e ra n t s id e o f th e c a rp o g o n iu m o n t h e p ro tu b e ra n t s id e o f th e c a rp o g o n iu m o n t h e p ro tu b e ra n t s id e a n d t h e o p p o s ite s id e o f th e c a rp o g o n iu m S p e rm a ta n g ia s p h e ri c a l, te rm in a l o r s u b -t e rm in a l, in c lu s te rs , 6 – 8 µ m w id e s u b g lo b u la r, t e rm in a l, s in g ly o r in p a ir s , 6 – 7 µ m w id e T e rm in a l, s p h e ri c a l, 4 – 8 µ m w id e T e rm in a l, s u b -t e rm in a l, in c lu s te rs o r a lo n e , s p h e ri c a l, 5 – 8 µ m w id e te rm in a l o n f a s c ic le s , 5 – 9 µ m w id e C a rp o s p o ra n g ia te rm in a l, o b o vo id a l, 1 1 – 1 4 µ m lo n g , 6 – 8 µ m w id e e lli p s o id a l to o b o vo id a l, 8 – 1 1 µ m lo n g , 5 .5 – 8 µ m w id e s p h e ri c a l, 6 – 8 µ m w id e O b o vo id a l, 1 0 – 1 3 µ m lo n g , 6 – 8 µ m w id e O vo id a l o r o b o vo id a l, 1 2 – 1 8 µ m lo n g 8 – 1 0 µ m w id e G e o g ra p h ic d is tr ib u ti o n I n d ia - A s s a m ( A s ia ) In d ia - A s s a m , B u rm a In d ia , Ja va a n d S o u th In d ia ( A s ia ) In d o n e s ia , M a la ys ia ( A s ia ) A n g o la ( A fr ic a ), In d ia , M a la ys ia , In d o n e s ia ( A s ia ), U S A , M e xi c o ( N o rt h A m e ri c a ) C h in a , Ja p a n ( A s ia ) R e fe re n c e s T h is s tu d y B a la kr is h n a n & C h a u g u le (1 9 8 0 ) S ku ja ( 1 9 3 8 ), K u m a n o (1 9 8 2 , 2 0 0 2 ), N e c c h i e t. a l. (1 9 9 3 ) S ku ja ( 1 9 3 1 ), B a la kr is h n a n & C h a u g u le ( 1 9 8 0 ), K u m a n o (2 0 0 2 ), N e c c h i e t a l. ( 2 0 0 7 ), E la ya P e ru m a l e t a l. ( 2 0 1 5 ) Ja o ( 1 9 4 1 ), K u m a n o (2 0 0 2 ) T A B L E 3 . C o m p a ra tiv e m o rp h o lo g y a n d d is tr ib u tio n o f S ir o d o tia s p e c ie s . S o u rc e : A u th o r's o w n p ro d u c ti o n . 41 2.5. Conclusion Sirodotia assamica is here proposed as a new species from the northeastern State of Assam in India based on molecular and morphological evidence. The most distinctive morphological character for the new species is the spermatangia arranged in clusters. Although this character is also observed in S. huillensis, both species are genetically highly divergent (4.5–5.0% for rbcL and 9.6–10.1% for COI-5P). The specimens from India formed a well-supported clade sister to S. delicatula from Malaysia. The divergence between DNA sequences from India and S. delicatula was high for rbcL (2.5–2.7%), whereas the intraspecific divergence between the two Indian sequences was low (0.4%). The DNA sequences for COI-5P from India formed a clade with high support representing a distinct species with high interspecific divergence (6.9–10.1%) to the other species and a low intraspecific divergence (0.5%). Acknowledgements Rossignolo and Necchi are grateful to the Brazilian agencies FAPESP (2016/07808- 1, 2016/16320-2) and CNPq (302415/2017-3) for financial support by grants and scholarship and to Morgan L. Vis, Ohio University, for the review of a preliminary version of the manuscript. Yasmin thankfully acknowledge the financial support of Department of Biotechnology, Government of India through Institutional Biotech Hub (No. BT/04/NE/2009). 2.6. References Agostinho, D.C. & Necchi, O. 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Morphological characters of Sirodotia assamica sp. nov. specimens examined in this study. Sample codes as in Table 2. Values for the morphometric data represent range and mean ± standard deviation (in parentheses). N= 15 except if otherwise indicated. TABLE S4. Reproductive characters of Sirodotia assamica sp. nov. specimens examined in this study. Sample codes as in Table 2. Values for the morphometric data represent range and mean ± standard deviation (in parentheses). N= 15 except if otherwise indicated. 46 TABLE S1. Sequences of rbcL for Sirodotia species from Genbank used in the analysis (Fig.2). Species GenBank Accession number Locality Reference S. aff. huillensis JF344717 South Africa: X31-5 No. 1, Sabie River Catchment. Gerhard Strydom. iv.2000. (BHO A-1447, MICH). Lam et al. (2012) S. delicatula KF557560 Malaysia: Selangor, Tributary of Gombak River in University of Malaysia Forest Reserve, unavailable coordinates, 27.viii.2018. Johnston et al. (2014) S. delicatula AF126410 Costa Rica: Rt. 16 ~8km south of San Vito. 18.ii.1998. Lam et al. (2012) S. huillensis AF126414 Mexico: Rt. 120 in Jalpar. 24.iv.1997. Lam et al. (2012) S. huillensis JN408523 USA: Outlet canal of Montezuma Well, Arizona, 34º38’57” N, 111º45’08” W; T.A. Dempster. 24.iv.2011. (BHO A-0437, MICH). Lam et al. (2012) S. huillensis JF344716 USA: Barton Spring, Austin, Texas, 30º15’50” N, 97º46’17” W; M.L. Vis & E. Johnston. 16.xii.2010. (BHO A-0410, MICH) Lam et al. (2012) Sirodotia sp.1a DQ646474 Brazil: Minas Gerais, Serra do Cipó National Park, Alto do Palácio river, 100m from the highway MG-010. 19º17'00"S, 43º33'00"W, 25.vii.2003. Necchi et al. (2007) Sirodotia sp.1a DQ646476 Brazil: São Paulo state, São José do Rio Preto, Macaco river, 20º50'31"S, 49º21'07"W, culture isolate. Necchi et al. (2007) Sirodotia sp.1a KC951857 Brazil: São Paulo State, Guapiaçu, near the city, Córrego Cavenague, 20°47'14"S, 49°13'23"W; O. Necchi Jr., 02.vi.2008 (SJRP 31917). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KC951862 Brazil: Espírito Santo State, Domingos Martins, Pedra Azul, , “Rota do Lagarto” Road, 20°24'49"S, 41°02'23"W; O. Necchi Jr., 05.vii.2009 (SJRP 31920). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KC951865 Brazil: Goiás State, Alto Paraíso de Goiás, Chapada dos Veadeiros National Park, 14°09’58’’S, 47°50’39’’W; O. Necchi Jr., 06.iv.2010 (SJRP 31923). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KC951866 Brazil: Mato Grosso State, Rosana river, BR- 163, between Sinop and Sorriso, 11°57’26’’S, 55°31’01’’W; O. Necchi Jr., 27.ix.2010 (SJRP 31924). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KC951867 Brazil: Mato Grosso State, Baixada Morena, Roquete River, Route BR-163, towards Santarém, 11º32’20’’S, 55°31,14’’W; O. Necchi Jr., 19.ix.2010; 10 m Paiano & Necchi (2013) 47 Sirodotia sp. KC951869 Brazil: Mato Grosso State, Sinop, BR-163, sentido Santarém; 11°36’04’’S, 55°25’38’’ W; O. Necchi Jr., 25.ix.2010 (SJRP 31925). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. JF701687 U.S.A.: New Hampshire, near Enfield, 43°38′ N, 72°09′ W. Necchi & Oliveira (2011) S. suecica AF029158 U.S.A.: Rhode Island, Chipuxet River at Rt. 138, West Kingston. 27.vi.1992 Vis et al. (1998) S. suecica AF126407 USA: Canada, 33 km west of Goose Bay on road to Churchill Falls, Labrador. 30. vii. 1993. Vis & Sheath (1999) S. suecica AF209977 Australia: Nigger Creek, Herberton, Queensland; 17º23’00” S, 145º23’00” E; T. J. Entwisle (2430), 03.vii.1994 (MEL). Vis & Entwisle (2000) S. suecica JF344715 Australia: Dom Dom Creek, Anderson Road crossing, ~1 km west of Naberthong, Victoria, 37º33’54” S, 145º39’08” E; T.J. Entwisle (3394), 05.i.2010 (NSW). Lam et al. (2012) S. suecica JF344718 U.S.A.: Big Beaver Creek, at US 176 bridge crossing, Calhoun Co., South Carolina. E.K. Hollingsworth. 16.v.2008 (BHO, MICH). Lam et al. (2012) S. suecica JF344719 New Zealand: Wanganui River, Beach track at the end of La Fontaine Road, 43º07’48” S, 170º36’37” E; M. L. Vis. 04.xii.2005 (BHO, MICH, WELT A027220, A027221). Lam et al. (2012) S. suecica JF344721 Finland: Nytkymenjoki River, Hasakoski Rapid, (isolate 2) FI-10. P. Eloranta. 07.viii.2008 (MICH). Lam et al. (2012) S. suecica JF344722 Finland: Kärkelänjoki River, Karjulankoski Rapid, (isolate 3) FI-18, 60º16’18” N, 23º35’49” E; P. Eloranta. 23.vi.2009. (MICH). Lam et al. (2012) S. suecica JN408524 South Africa: Tributary of the Bot River off Van der Stel Pass Road near Cape Town; 34º09’31.5” S, 19º13’33” E; M.L. Vis, W.B. Chiasson & G. Ellis. 22.viii.2005. (BHO A- 0264, MICH). Lam et al. (2012) S. tenuissima JF344724 Finland: Tarhapäänkoski, Horhanvirta River, (isolate 5) FI-22, 62º20’29” N, 24º44’05” E; P. Eloranta. 16.vii.2010 (MICH). Lam et al. (2012) S. tenuissima JF344725 Finland: Uittamonkoski Rapid, outlet of Lake Uittamonjärvi, (isolate 6) FI-23. P. Eloranta. 16.vii.2010. (MICH). Lam et al. (2012) S. tenuissima AF126420 USA: Town Rd. in Coventry, Rhode Island. 18.iv. 1992. Vis & Sheath. (1999) a. Reported as Sirodotia delicatula. Source: Author's own production 48 Tabela S2. Sequences of COI-5P for Sirodotia species obtained from Genbank used in the analyses (Fig 3). Species GenBank Accession number Locality Reference S. huillensis EU636739 U.S.A.: San Marcos, San Marcos river, Texas. M. L. Vis & R. G. Sheath. 1.xii.1993. Sherwood et al. (2008) S. suecica EU636737 Canada: Labrador, un-named stream, 33 km west of Goose Bay on road to Churchill Falls. M. L. Vis & R. G. Sheath. 30.vii.1993. Sherwood et al. (2008) S. suecica EU636738 South Africa: Tibutary of the bot river Vander Stel Pass, road near Cape Town. Sherwood et al. (2008) S. suecica KM055337 U.S.A.: Big Beaver Creek, at US 176 bridge crossing, Calhoun Co., South Carolina. E.K. Hollingsworth. 16.v.2008 (BHO: A-0268, MICH). Lam et al. (2012) Sirodotia sp. KF010483 Brazil: Espirito Santo state, Afonso Cláudio, Comunidade de Lajinha, near Rod. ES-165, 20°15'01"S, 41°03'43"W; O. Necchi Jr., 04.vii.2009 (SJRP 31922). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010486 Brazil: São Paulo State, Mirassol, River S. José dos Dourados, near fish pond “Aporé”, 20º48'45"S, 49º34'29"W; 25.vi.2008 (SJRP 31918). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010487 Brazil: Espírito Santo State, Domingos Martins, Pedra Azul, “Rota do Lagarto” Road, 20º24'49"S, 41º02'23"W; 05.vii.2009 (SJRP 31920). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010488 Brazil: Goiás State, Alto Paraíso de Goiás, Chapada dos Veadeiros National Park, 14º09’58’’S, 47º50’39’’W; 06.iv.2010 (SJRP 31923). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010489 Brazil: Mato Grosso State, River Rosana, Route BR-163, between Sinop and Sorriso, 11º57’26’’S, 55º31’01’’W; 27.ix.2010 (SJRP 31924). Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010490 Brazil: Mato Grosso State, Baixada Morena, Roquete River, Route BR-163, towards Santarém, 11º32’20’’S, 55°31,14’’W; 19.ix.2010. Paiano & Necchi (2013) Sirodotia sp. KF010491 Brazil: Mato Grosso State, Sinop, BR- 163, sentido Santarém; 11°36’04’’S, 55°25’38’’ W; 25.ix.2011 (SJRP 31925). Paiano & Necchi (2013) Source: Author's own production 49 Le ng th Di am et er Le ng th Di am et er IN 1a Di oe ci ou s (m al e) Pe ar -s ha pe d, O bc on ic al 40 0 – 52 3 (4 44 .2 ± 4 0. 2) De ns e 54 7 – 11 77 (9 29 .8 ± 2 17 .2 ) 6 – 12 (8 .4 ± 1 .5 ) Cy lin dr ic al , e llip so id al 17 – 3 2 (3 1. 5 ± 6. 2) Cy lin dr ic al , e llip so id al 7 – 13 (8 .5 ± 1 .5 ) El lip so id al , ob ov oi da l, su b- sh pe ric al , 9 – 13 (1 0. 9 ± 1. 2) El lip so id al , ob ov oi da l, su b- sp he ric al 5 – 9 (6 .4 ± 0 .8 ) IN 1b M on oe ci ou s Pe ar -s ha pe d, O bc on ic al 42 2 – 66 5 (5 61 .3 ± 6 8. 6) De ns e 61 2 – 94 9 (7 54 .4 ± 1 01 .7 ) 8 – 11 (9 .8 ± 1 .0 ) Cy lin dr ic al , e llip so id al 26 – 4 2 (3 0. 4 ± 5. 1) Cy lin dr ic al , e llip so id al 7 – 11 (8 .7 ± 1 .0 ) O bo vo id al 9, 5 – 13 (1 1. 2 ± 1. 4) O bo vo id al 6 – 9 (7 .0 ± 0 .8 ) 95 0 – 10 88 (1 01 5. 6 ± 40 .4 ) Lo os e 41 2 – 59 9 (4 74 .2 ± 5 5. 8) Di oe ci ou s (m al e) IN 2 Pe ar -s ha pe d, O bc on ic al O bo vo id al 6 – 8 (7 .0 ± 0 .6 ) O bo vo id al 12 – 1 4 (1 2. 9 ± 0. 8) Cy lin dr ic al , e llip so id al 8 – 10 (8 .7 ± 0 .5 ) Cy lin dr ic al , e llip so id al 22 – 2 8 (2 4. 5 ± 2. 0) 7 – 9 (8 .0 ± 0 .7 ) In te rn od es Pr im ar y fa sc ic le Sh ap e Di am et er Ar ra ng em en t Nu m be r o f c el ls Pr ox im al TA B LE S 3. M or ph ol og ic al c ha ra ct er s of S iro do tia a ss am ic a sp . n ov . s pe ci m en s ex am in ed in th is s tu dy . S am pl e co de s as in T ab le 2 . V al ue s fo r t he m or ph om et ric d at a re pr es en t ra ng e an d m ea n ± st an da rd d ev ia tio n (in p ar en th es es ). N= 1 5 ex ce pt if o th er w is e in di ca te d. Di st al Sa m pl e Se xu al ity W ho rl S o u rc e : A u th o r' s o w n p ro d u c ti o n 50 S pe rm at an gi a Le ng th D ia m et er S ha pe N um be r of ce lls o f ca rp og on ia l b ra nc he s Le ng th D ia m et er S ha pe D ia m et er S am pl e C ar po go ni um C ar po sp or an gi a IN 1a – – – – – – – 6 – 7 (6 .4 ± 0 .4 ) IN 1b 37 – 6 4 (5 1. 7 ± 7, 3) 10 – 1 6 (1 1. 6 ± 1. 4) el on ga te d cy lin dr ic al , el lip so id al o r l ag en ifo rm 1 – 5 (- 6) 6 – 8 (7 .2 ± 0 .1 ) O bo vo id al – 6 – 8 (7 .1 ± 0 .7 ) G on im ob la st fil am en t c el l nu m be r 11 – 1 4 (1 2. 2 ± 0. 8) T ab le S 4. R ep ro du ct iv e ch ar ac te rs o f S iro do tia a ss am ic a s p. n ov . s pe ci m en s ex am in ed in th is s tu dy . S am pl e co de s as in T ab le 2 . V al ue s fo r t he m or ph om et ric d at a re pr es en t r an ge a nd m ea n ± st an da rd d ev ia tio n (in p ar en th es es ). N = 15 e xc ep t i f o th er w is e in di ca te d. 1 – 4 6 – 8 (7 .1 ± 0 .5 ) IN 2 – – – – – – –– F S o u rc e : A u th o r' s o w n p ro d u c ti o n 51 3. CAPITULO 2 Revision of the genus Sirodotia (Batrachospermales, Rhodophyta) with description of four new species Natalia L. ROSSIGNOLO1, Morgan L. VIS2, Monica O. PAIANO3, Pertti ELORANTA4, Janinna LEE5, John A. WEST6, E.K. GANESAN7, Farishta YASMIN8, Phaik-Eem LIM9 & Orlando NECCHI Jr1*. 1 São Paulo State University, Zoology and Botany Department, Cristóvão Colombo, 2265, 15054-000 São José Rio Preto, São Paulo, Brazil; nataliarossignolo@yahoo.com.br 2 Ohio University, Department of Environmental and Plant Biology, OH, USA; vis-chia@ohio.edu 3 University of Hawai, School of Life Sciences, Honolulu, HI, USA; mpaiano@hawaii.edu 4 University of Helsinki, Department of Biological and Environmental Sciences, Finland; pertti.eloranta@elisanet.fi 5 Institute of Nature Conservation, Department of Freshwater Biology PAS Al. A. Mickiewicza 3, Poland; kwandrans@iop.krakow.pl 6 School of Biosciences 2, University of Melbourne, Parkville VIC 3010, Australia; jwest@unimelb.edu.au 7 Oceanographic Institute, Universidad de Oriente, Venezuela; ekganesan@gmail.com 8 Nowgong College, Botany Department, Nagaon, 782001, Assam, India; farishtayasmin@gmail.com 9 Institute of Ocean and Earth Sciences (IOES), University of Malaya, Malaysia; phaikeem@gmail.com * Corresponding author: o.necchi@unesp.br . Running title: Revision of Sirodotia (Batrachospermales) Artigo que será submetido à publicação na revista "Cryptogamie, Algologie", http://sciencepress.mnhn.fr/en/periodiques/algologie mailto:o.necchi@unesp.br http://sciencepress.mnhn.fr/en/periodiques/algologie 52 3.1. ABSTRACT Genera of the freshwater red algal order Batrachospermales have been systematically revised using molecular and morphological data, but Sirodotia remains to be thoroughly reviewed. In this investigation, DNA sequence data for the rbcL, COI-5P and LSU markers for specimens collected worldwide were combined with morphological observations. Phylogenetic analyses showed the genus to be a monophyletic group with high support. Inter and intraspecific divergence values were well-delineated with higher interspecific (2.1-7% and 4.4-10.5%) and lower intraspecific (0-2.4% and 0-3.8%) variations for rbcL and COI-5P sequences, respectively. The LSU sequences revealed lower interspecific divergence values than the COI-5P sequences (0.7-3.3%) indicating lower resolution as a barcode marker. Nine species are recognized based on DNA sequence data, morphological characters and geographic distribution. Five species were previously described (S. assamica, S. delicatula, S. huillensis, S. kennedyi and S. suecica) and four new species are proposed (S. amazonica, S. aquiloamericana S. cryptica, and S. delicatuliformis). Diagnostic characters for the genus are confirmed to be asymmetric carpogonia with a basal protuberance and carposporophytes diffuse with indeterminant prostrate filaments producing determinate erect branches terminating in carposporangia. The following morphological characters were applied to distinguish species: primary fascicle cell number, spermatangial arrangement, origin of gonimoblast filament and size of carposporangia. Based on morphology, three species are proposed as synonyms of S. suecica (S. sinica, S. segawae and S. yutakae) and one species as synonyms of S. delicatula (S. ateleia). The status of three species (S. cirrhosa, S. gardneri and S. huangshanensis) could not be confirmed due to lack of type specimens or uninformative diagnostic characters. Keywords: Batrachospermales, biogeography, COI-5P, freshwater Rhodophyta, LSU (28S), molecular systematics, rbcL, Sirodotia 53 3.2. INTRODUCTION Over the past two decades, the systematics of the freshwater red algal order Batrachospermales has been extensively studied using molecular and morphological data (VIS et al., 1998; ENTWISLE et al., 2009). Recent revisional studies of sections within Batrachospermum have been conducted in order to rectify the paraphyly of this genus in relation to other genera of the order and resulting in most sections raised to generic rank (SALOMAKI et al., 2014; NECCHI et al., 2018, 2019; ROSSIGNOLO & NECCHI, 2016; VIS et al., 2020). Using combined morphological observations and DNA sequence data numerous new genera have been established within the order as follows: Psilosiphon (Entwisle, 1989), Balliopsis (SAUNDERS & NECCHI, 2002), Petrohua (VIS et al., 2007), Kumanoa (ENTWISLE et al., 2009), Sheathia (SALOMAKI et al., 2014), Nocturama (ENTWISLE et al., 2016), Torularia (as Setacea, ROSSIGNOLO & NECCHI 2016 and Wynne 2019), Lympha (EVANS et al., 2017), Volatus (CHAPUIS et al., 2017), Virescentia (N