FABIANA NAKASHIMA Fenótipo Lewis negativo: potencial fator de risco para infecção por cepa RH de Toxoplasma gondii em gestantes São José do Rio Preto 2010 FABIANA NAKASHIMA Fenótipo Lewis negativo: potencial fator de risco para infecção por cepa RH de Toxoplasma gondii em gestantes Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Genética junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos ___________________________________________________________ São José do Rio Preto 2010 Nakashima, Fabiana. Fenótipo Lewis negativo: potencial fator de risco para infecção por cepa RH de Toxoplasma gondii em gestantes / Fabiana Nakashima. - São José do Rio Preto: [s.n.], 2010. 96f. : il.; 30 cm. Orientador: Luiz Carlos de Mattos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Imunogenética. 2. Toxoplasma gondii. 3. Toxoplasmose - Gestantes. 4. Grupos sanguíneos. 5. Fenótipo Lewis negativo. I. Mattos, Luiz Carlos de. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 575 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP Fabiana Nakashima Fenótipo Lewis negativo: potencial fator de risco para infecção por cepa RH de Toxoplasma gondii em gestantes Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Luiz Carlos de Mattos Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP Orientador Prof. Dr. Wilson Baleotti Junior Faculdade de Medicina de Marília - FAMEMA Profª. Drª. Marilanda Ferreira Bellini IBILCE-UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto, 23 de Fevereiro de 2010. “Dedico este trabalho ao meu pai Etsuo Nakashima e minha mãe Maria Célia Narciso” AGRADECIMENTOS Desejo expressar os meus sinceros agradecimentos: A Deus; Ao Ministério da Educação – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pela bolsa concedida; Ao Ministério da Ciência e Tecnologia – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq; A Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”; Ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Instituo de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE/UNESP; À Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto; Ao Instituto Adolfo Lutz de São Paulo – IAL; A Auckland University of Technology pelo acesso on line à Biblioteca; Aos membros da banca, Prof. Dr. Wilson Baleotti Junior, Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini, Profa. Dra. Claudia Regina Bonini Domingos, Prof. Dr. Haroldo Wilson Moreira pelo aceite para a composição da banca; À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Genética Profa. Dra. Claudia Regina Bonini-Domingos; Ao Professor Dr. Luiz Carlos de Mattos pela oportunidade de desenvolver esta pesquisa, pela paciência e por tudo que me ensinou durante este período; À Cinara de Cássia Brandão de Mattos por ter ajudado na realização deste trabalho, por ter cedido às amostras objetos de estudado desta pesquisa, pelas discussões e conselhos; A Profa. Dra. Vera Lúcia Pereira-Chioccola pela colaboração e o apoio concedido durante a execução deste trabalho; À Daniela Prudente Teixeira Nunes por ser uma amiga presente, por me ajudar a superar todas as dificuldades e desafios encontrados durante o desenvolvimento desta pesquisa e na minha vida pessoal. Por escutar, incentivar, corrigir e discutir os assuntos relacionados a este trabalho. Pelas risadas, palhaçadas e as festas que deixaram minha vida mais prazerosa; À Ana Iara Costa Ferreira que colaborou no desenvolvimento deste trabalho. Pelas brincadeiras, conversas, conselhos e pela amizade que tanto aprecio; À Juliana, Denise e Giselda, pela amizade, valiosas discussões e pela disponibilidade em ajudar; À Aline Sumitani Murakami que sempre me escutou e esclareceu dúvidas sobre o curso. Pelas risadas e crises que compartilhamos juntas; À minha irmã Fabrícia Nakashima D’errico, meu cunhado Tiago de Jesus Leite D’errico e o meu irmão Fabio Nakashima pelo apoio e confiança; À minha família que sempre esteve disposta a escutar meus desabafos; Aos colegas de Mestrado, principalmente para Márcia Maria Urbanin Castanhole, Ana Luíza; Pela amizade e companheirismo da Joana Ribeiro de Oliveira, da Clélia Kimura Teixeira, do Lucas Trevizani Rasmussen e da Eloísa Lourenço Sampaio que mesmo longe torcem por mim. Resumo Introdução: A infecção por Toxoplasma gondii em gestantes associa-se aos riscos de transmissão congênita. Este protozoário infecta os humanos utilizando como rota de infecção o trato gastrintestinal, onde se dá a síntese dos antígenos fucosilados Lea e Leb que determinam os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis [Le(a+b-), Le(a+b+) e Le(a-b-)]. A expressão destes fenótipos resulta de interações epistáticas entre os genes FUT2 (Secretor) e FUT3 (Lewis) que codificam as fucosiltransferases FUTII e FUTIII, respectivamente. Mutações no gene FUT3 determinam a ausência de fucosilação dos oligossacarídeos precursores do tipo 1 resultando na expressão do fenótipo Le(a-b-). A infecção por T. gondii e a expressão dos antígenos Lewis ocorrem no mesmo órgão e, embora aparentemente independentes, podem estar relacionadas entre si. Objetivo: Investigar a associação o sistema histo-sanguíneo Lewis e a infecção por T. gondii da cepa RH. Material e Métodos: Foram selecionadas 209 amostras de soro e de DNA genômico estocadas no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP, coletadas de gestantes atendidas no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do Hospital de Base da Fundação Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto – FUNFARME. Uma triagem para detecção dos anticorpos anti-T. gondii foi realizada nas amostras de soro pelo método hemaglutinação indireta (HAI). O ensaio imunoenzimático (ELISA) foi empregado para identificar os anticorpos específicos da classe IgG contra a cepa RH. Cento e noventa e cinco amostras de soro que apresentaram resultados concordantes entre os dois testes foram selecionadas para compor os grupos “reagente” e “não reagente”. Para inferir os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis, as amostras de DNA genômico correspondentes foram genotipadas para as mutações G428A do gene FUT2, T202C e C314T do gene FUT3 por PCR-RFLP e PCR-SSP, respectivamente. Os dados foram analisados utilizando o teste exato de Fisher e o nível de significância adotado foi de 5%. Resultados: Dentre as 195 amostras concordantes nas técnicas de HAI e ELISA, 116 (59,5%) apresentaram-se reagentes e 79 (40,5%) não reagentes. Entre as reagentes, 30 (25,86%) apresentaram o fenótipo Le(a+b-), 68 (58,62%) Le(a+b+) e 18 (15,52%) Le(a-b-). Os valores encontrados para as não reagentes foram iguais a 12 (15,19%) para Le(a+b- ) e 67 (84,81%) para Le(a+b+). As diferenças entre as frequências dos fenótipos Lewis foram estatisticamente significantes para Le(a-b-) [p=0,0001; OR: 29.863; IC 95%: 1.771-503.630], Le(a+b+) [p=0,0001; OR: 0,2537; IC 95%: 0,1239-0,5198] mas não para Le(a+b-) [p=0,0795; OR: 1.948; IC 95%: 0,9275-4.090]. Além destas, encontramos diferenças estatisticamente significantes quando comparamos a frequência de cada fenótipo Lewis: Le(a-b-) Vs Le(a+b-) [p=0,0118; OR: 15.165; IC 95%: 0,8463 – 271.710]; Le(a-b-) Vs Le(a+b+), [p=0,0001; OR: 36.460; IC 95%: 2.152-617.680] Le(a+b-) Vs Le(a+b+), p=0,0206; OR: 2.463; IC 95%: 2.463-5.214]. Conclusão: O fenótipo Le(a-b-) inferido a partir das genotipagens FUT2 e FUT3 está associado á infecção por cepas RH de T. gondii. Palavras-chave: sistema histo-sanguíneo Lewis; FUT3; FUT2; Toxoplasma gondii; toxoplasmose; gestante. Abstract Introduction: Toxoplasma gondii Infection in pregnant women is associated with risks of congenital transmission. This protozoa infects humans using as infection rout the gastro intestinal tract, where occur the synthesis of fucosylated Lea and Leb antigens which determine Lewis histo-blood group phenotypes [Le(a+b-), Le(a+b+), Le(a-b-)]. The expression of these phenotypes results from epistatic interactions between FUT2 (Secretor) and FUT3 (Lewis) genes which codes both the FUTII and FUTIII fucosyltransferases, respectively. Single nucleotide polymorphisms affecting FUT3 gene determine the absence of type 1 oligosaccharide precursor fucosylation and the expression of Le(a-b-) phenotype. The entrance of T. gondii and the expression of Lewis histo-blood group system occur in the same organ, probably there is some link between them. Objective: The aim of this study was to test the hypothesis that the Lewis histo-blood group system is associated with infection by T. gondii. Material e Method: A total of 209 serum sample and genomic DNA sample stored at the Immunogenetics Laboratory from the Molecular Biology Department of Medicine School in São José do Rio Preto – FAMERP, obtained from pregnant women who attended in the High-Risk Pregnancy Clinic of Hospital de Base were enrolled in this study. Anti-T. gondii antibodies were screened by indirect hemagglutination test. ELISA assays were used to identify specific IgG antibodies to RH strain. One hundred and ninety-five serum samples, with identical results between both tests were selected to compose the groups “reagent’ and “non reagent”. To infer the Lewis histo-blood group system phenotypes, genomic DNA samples corresponding to the serum sample were genotyped for the G428A mutation of the FUT2 gene and T202C and C314T of FUT3 gene by PCR-RFLP and PCR- SSP assays, respectively. The data were analyzed by Fisher’s exact test and the level of significance was 5%. Results: Of the 195 selected serum samples, 116 (59,5%) were reagents and 79 (40,5%) were non reagents. Among those reagents, 30 (25,86%) were phenotype as Le(a+b-), 68 (58,62%) as Le(a-b+) and 15 (15,52%) as Le(a-b-). The values found for the no reagents were equal to 12 (15.19%) for Le(a+b-) and 67 (84.81%) for Le(a+b+). The differences between the frequencies of the Lewis phenotytypes were statistically significant for Le(a-b-) [p=0,0001; OD: 29.863; IC 95%: 1.771-503.630], Le(a+b+) [p=0,0001 OD: 0,2537; IC 95%: 0,1239- 0,5198] but not to Le(a+b-) [p=0,0795 OD: 1.948; IC 95%: 0,9275-4.090]. Besides these, we found statistically significant differences when comparing the frequency of each phenotype Lewis: Le(a-b-) Vs Le(a+b-) [p=0,0118; OR: 15.165; IC 95%: 0,8463-271.710]; Le(a-b-) Vs Le(a+b+), [p=0,0001; OR: 36.460; IC 95%: 2.152- 617.680]; Le(a+b-) Vs Le(a+b+) [p=0,0206; OR: 2.463; IC 95%: 2.463-5.214]. Conclusion: The Le(a-b-) phenotype inferred by genotyping of the genes FUT2 and FUT3 is associated with infection by RH strain of T. gondii. Keywords: Lewis histo-blood group system; FUT3; FUT2; Toxoplasma gondii; toxoplasmosis; pregnancy. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Soroprevalência encontrada em gestantes de diversos lugares do mundo ............................................................ 22 Figura 2 Formas infectantes do Toxoplasma gondii. Oocisto esporulado (A), taquizoíto (B) e cisto tecidual (C) ........... 25 Figura 3 Estruturas e organelas do taquizoíto .............................. 26 Figura 4 Vias de contaminação por Toxoplasma gondii ................ 28 Figura 5 Invasão e replicação do Toxoplasma gondii nas células hospedeiras ..................................................................... 29 Figura 6 Representação esquemática da síntese dos antígenos Lewis ................................................................................ 34 Figuras do Artigo Figura 1 Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 7,5% do fragmento de 1033 pares de bases do gene FUT2 digerido com a enzima AVA II, ilustrando os genótipos GA (1, 2 e 6); AA (3 e 5); GG (4). M representa o marcador de 100 pares de bases .................................... 61 Figura 2 Perfil eletroforético em gel de agarose a 2% dos genótipos TT (A), TC (B) e CC (C) do gene FUT3, mutação T202C. M representa o marcador de 100 pares de bases .......................................................................... 62 Figura 3 Perfil eletroforético em gel de agarose a 2% dos genótipos CC (D), CT (E) e TT (F) do gene FUT3, mutação C314T. M representa o marcador de 100 pares de bases .......................................................................... 63 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Genes, alelos, fucosiltransferases, oligossacarídeo precursor e antígenos dos sistemas histo-sanguíneos Secretor e Lewis ............................................................... 33 Quadro 2 Combinações das formas ativas e inativas das fucosiltransferases FUTII e FUTIII na expressão dos antígenos e dos fenótipos Lewis no trato gastrintestinal e nos eritrócitos..................................................................... 35 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Resultados das genotipagens G428A do gene FUT2 e T202C e C314T do gene FUT3 e os fenótipos Lewis inferidos para o trato gastritnestinal ..................................... 64 Tabela 2 Valores absolutos e percentuais dos resultados reagente (R) e não reagente (NR) das 195 amostras de soro avaliadas por HAI e ELISA, de acordo com os fenótipos Lewis inferidos para o trato gastrintestinal (TGI) e, o valor p calculado pelo teste exato de Fisher. Os valores de Odds Ratio (OR) e intervalo de confiança (IC) a 95% ..................... 65 Tabela 3 Valor p calculado pelo teste exato de Fisher para as comparações entre os fenótipos Lewis. Os valores de Odds Ratio (OR) e do intervalo de confiança (IC) a 95%........................................................................................ 66 Tabela 4 Frequência dos fenótipos Lewis inferidos de acordo com os grupos reagente e não reagente ......................................... 67 LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS µl Microlitro cDNA Ácido Dexorribonucleico Complementar dATP Deoxinucleotídio Trifosfatado de Adenina dCTP Deoxinucleotídio Trifosfatado de Citosina dGTP Deoxinucleotídio Trifosfatado de Guanina dNTP Deoxinucleotídio Trifosfatado DO Densidade Ótica dTTP Deoxinucleotídio Trifosfatado de Timina ELISA Ensaio Imunoenzimático FAMERP Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto Fuc Fucose FUT2 Gene Secretor FUT3 Gene Lewis FUTII α-2-L-fucosiltransferase FUTIII α-3/4-L-fucosiltransferase G1 Grupo 1 G2 Grupo 2 Gal Galactose GlcNAc N-Acetilglicosamina H2O2 Peróxido de Hidrogênio H2SO4 Ácido Sulfúrico HGH 1s Primer sense referente ao gene do hormônio do crescimento HGH 2 as Primer anti-sense referente ao gene do hormônio de crescimento IAL Instituto Adolfo Lutz de São Paulo IFI Imunofluorescência Indireta IFN- γ Interferon-gama IgA Imunoglobulina de classe A IgE Imunoglobulina de classe E IgG Imunoglobulina de classe G IgM Imunoglobulina de classe M IL-12 Interleucina -12 MgCl2 Cloreto de Magnésio mL Mililitro mM Milimol Ng Nanograma NK Natural Killer OP Oligossacarideo Precursor Pb Pares de base PCR Reação em cadeia da Polimerase PCR-RFLP Reação em cadeia da Polimerase - Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição PCR-SSP Reação em cadeia da Polimerase – Primers de sequência específica SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida TBE Tris (Tris hidroximetil aminometano), Ácido Bórico e EDTA (Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético) TGI Trato Gastrintestinal Α Alfa Sumário Introdução Toxoplasmose..................................................................................... 19 Toxoplasma gondii............................................................................... 23 Ciclo Biológico do Toxoplasma gondii ................................................ 27 Imunidade do Hospedeiro ................................................................... 30 Diagnóstico de Infecção por Toxoplasma gondii e da Toxoplasmose 31 Sistema Histo-Sanguíneo Lewis ......................................................... 31 Biosíntese dos Antígenos Lea e Leb.................................................... 32 Sistema Histo-Sanguíeno Lewis como Fator de Risco para infecção por Toxoplasma gondii ....................................................................... 37 Objetivos Geral.................................................................................................... 39 Específicos.......................................................................................... 39 Resultados Manuscrito a ser submetido à publicação à Revista Blood ................ 40 Conclusões ................................................................................................. 68 Referências Gerais ..................................................................................... 69 Apêndice APÊNDICE A - Resumo apresentado e premiado em 1º LUGAR na apresentação em forma de pôster durante a III Jornada de Ginecologia e Obstetrícia da SOGESP-Região Noroeste/Sudoeste, centro de Convenções UNIP, São José do Rio Preto, SP, 2009 ....... 81 APÊNDICE B - Resumo apresentado e premiado em 2º LUGAR na apresentação em forma de pôster durante a III Jornada de Ginecologia e Obstetrícia da SOGESP-Região Noroeste/Sudoeste, centro de Convenções UNIP, São José do Rio Preto, SP, 2009 ....... 83 APÊNDICE C - Resumo apresentado em forma de pôster durante o XI Simpósio de Genética & I Simpósio IMC-IBILCE Células-Tronco.. 84 APÊNDICE D - Resumo apresentado em forma de pôster durante o 55º Congresso de Genética da Sociedade Brasileira de Genética .... 86 APÊNDICE E - Resumo apresentado em forma de pôster durante o XXI Congresso Brasileiro de Parasitologia II Encontro de Parasitologia do Mercosul da Sociedade Brasileira de Parasitologia. 88 APÊNDICE F - Resumo apresentado em forma de pôster durante o 54º Congresso de Genética da Sociedade Brasileira de Genética..... 89 APÊNDICE G - Resumo apresentado em forma de pôster durante V Congresso Científico da UNIRP ......................................................... 91 Anexo ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da FAMERP . 93 ANEXO B – Resumo do Artigo Publicado no Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases – Original paper - ISSN 1678-9199. V. 16, n 1, p. 87- 95, 2010...................................... 94 Autorização para reprodução .................................................................... 96 19 Introdução Toxoplasmose Toxoplasmose é uma doença infecciosa causada pelo protozoário Toxoplasma gondii (CARRUTHERS, 2002; CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007). Nos humanos, a infecção pode ocorrer de duas formas: congênita ou pós-natal. Na forma congênita, a mãe infectada transmite o protozoário via placentária para o feto (HILL; DUBEY, 2002). As infecções pós-natais ocorrem na maioria dos casos por meio da ingestão de alimentos (frutas, verduras e carnes de origem animal) ou água contaminados por T. gondii e, em menor frequência, por transfusão de componentes sanguíneos, transplantes de órgãos sólidos e de medula óssea (HILL; DUBEY, 2002; GIFFONI, 2007). Uma característica importante deste parasito é a capacidade de resistir às respostas imunológicas desenvolvidas pelo organismo infectado. Nestes casos, o hospedeiro permanece cronicamente infectado, mas não apresenta evidências da doença (ABBAS et al., 2008). Entretanto, pode ocorrer a reativação da infecção dependendo do estado imunológico do hospedeiro. Esta situação tem sido observada em pacientes submetidos a terapias imunossupressoras comumente utilizadas no transplante de órgãos sólidos e de medula óssea. As fontes de reinfecção podem ser órgãos e tecidos ou mesmo o enxerto do doador (CARRUTHERS, 2002; HILL; DUBEY, 2002). A infecção por T. gondii é mundialmente disseminada entre os animais e o homem. Sua prevalência varia de um país para outro, oscila entre as áreas geográficas de um mesmo país e depende das condições ambientais, dos hábitos culturais, da higiene e da idade do hospedeiro (REY; RAMALHO, 1999; CAMARGO, 2001; CARRUTHERS, 2002; HILL; DUBEY, 2002; GIFFONI, 2007). Estima-se que entre 16% a 40% da população dos Estados Unidos e do Reino Unido esteja infectada. Na América Central, na América do Sul e no continente Europeu, estes valores variam de 50% a 80% (HILL; DUBEY, 2002). Estudos realizados no Brasil mostraram que a prevalência de infecção por este protozoário é 20 alta, variando entre 40 a 75% (CANTOS et al., 2000; COÊLHO et al., 2003; VAZ et al., 2008). Apesar de alta em todo o mundo, a prevalência de infecção por T. gondii e sua evolução para a toxoplasmose depende principalmente do estado imunológico do hospedeiro (FERREIRA, M et al., 2007), da virulência da cepa, do número de parasitos infectantes e da rota de infecção (DIAS; FREIRE, 2005). Dentre as cepas identificadas do T. gondii, observaram que a cepa RH é frequentemente isolada de infecções humanas (SOARES, 2004; VALLOCHI et al., 2005; FERREIRA, I et al., 2008). Em indivíduos imunocompetentes, a infecção aguda é assintomática na maioria dos casos (GUIMARÃES et al., 1993; CARRUTHERS, 2002), mas em casos de infecções sintomáticas, os sintomas clínicos mais comuns são as linfodenopatias, febre, fadiga, dores musculares, dor de garganta e dor de cabeça (HILL; DUBEY, 2002). A toxoplasmose em indivíduos imunocomprometidos pode ser grave e muitas vezes fatal. De acordo com Hill e Dubey (2002), 10% dos pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) nos Estados Unidos, e 30% na Europa morrem de toxoplasmose. De acordo com os estudos de Passos e colaboradores (2000), no Estado de São Paulo a taxa de mortalidade por toxoplasmose nos anos de 1988 e 1991 foi de 25,4% nos pacientes com SIDA. Embora o protozoário consiga invadir quaisquer órgãos e tecidos, o sistema nervoso central (SNC) é o local mais afetado nestes indivíduos, causando graves danos ao paciente (HILL; DUBEY, 2002). Um estudo realizado no SNC de pacientes com SIDA nos Estados do Rio de Janeiro e São Paulo mostrou que a infecção oportunista mais frequente é por T. gondii (34,1%), seguida pela criptococose (13,5%) (CHIMELLI et al., 1992). As gestantes constituem um grupo especial de risco em relação à toxoplamose devido ao fato de que a transmissão congênita do T. gondii pode ocorrer se houver infecção aguda durante o período gestacional (CAMARGO, 2001), ou se infecções crônicas forem reativadas (DETANICO; BASSO, 2006). O risco e a gravidade desta forma de transmissão dependem do período gestacional em que a mulher se infecta (AJZENBERG et al, 2002), sendo que a infecção durante o primeiro trimestre é mais grave do que no segundo e no terceiro (GIFFONI, 2007). Quando a infecção por T. gondii atinge os fetos pode levar ao desenvolvimento da 21 Tétrade de Sabin, caracterizada por hidrocefalia, retinocoroidite, calcificações cerebrais e retardo mental ou perturbações neurológicas (GUIMARÃES et al., 1993). Como a infecção por este parasito pode se dar em qualquer período da gestação, é recomendável que se faça triagem sorológica a cada quatro ou cinco semanas, utilizando testes sensíveis e de rápida execução (CAMARGO, 2001). O estudo realizado por Pappas e colaboradores (2009), indica que a prevalência de infecção em gestantes é alta em diversas áreas no mundo (Figura 1). Estudos realizados no Brasil mostraram prevalência de infecção de 67% no norte do Paraná (REICHE et al., 2000), 74% em Rio Verde – Goiás (GIFFONI, 2007), 60% em Botucatu – São Paulo (OLBRICH; MEIRA, 2004) e 57,3 % na região noroeste paulista (GALISTEU et al., 2007). Segundo Carruthers (2002), estima-se que a infecção por T. gondii atinge um dentre 1000 recém-nascidos nos Estados Unidos. Camargo Neto e coloboradores (2000) estimam que a prevalência de infecção congênita no Brasil seja de um caso para cada 3000 recém-nascidos. 22 Figura 1. Soroprevalência encontrada em gestantes de diversos lugares do mundo. Adaptada de Pappas, 2009. 60% 40 – 60% 20 – 4’0% 10 - 20% Ausência de dados < 10% 23 Toxoplasma gondii O agente etiológico da toxoplasmose é um parasito intracelular obrigatório que pertence ao filo Apicomplexa, classe Sporozoa, ordem Eucoccidiida, família Sarcocystidae, genêro Toxoplasma, espécie Toxoplasma gondii. Existem três formas infectantes para o homem denominadas esporozoítos (oocistos), taquizoítos e bradizoítos (REY, 2008) (Figura 2). Os oocistos são liberados nas fezes dos gatos domésticos e, portanto, são encontrados no meio ambiente, podendo contaminar alimentos como frutas, verduras e água de consumo humano. Esta forma é resistente a várias condições ambientais e permanece infectante por até 18 meses. Além disso, resiste a temperaturas que variam de 10ºC negativos à 54ºC por até 106 dias (DUBEY et al., 1998; TENTER et al., 2000; REY, 2008). Os bradizoítos são encontrados em cistos teciduais que podem permanecer viáveis por toda a vida do hospedeiro (DUBEY et al., 1998). Estes cistos se alojam em tecidos musculares de animais de consumo humano como bovinos, suínos e aves. Foi demonstrado por meio de ensaios laboratoriais que estas formas são resistentes ao aquecimento (50ºC por 10 minutos e 60ºC por quatro minutos) e refrigeração (1ºC a 4ºC por mais de três semanas e - 1ºC e - 8 ºC por mais de uma semana) (MILLAR, 2005). No homem, a infecção crônica por bradizoíto pode ocorrer em qualquer órgão, mas acomete preferencialmente o miocárdio, o sistema nervoso central e os músculos esqueléticos (COSTA, 2007). Os taquizoítos são encontrados livres em diversos fluídos corporais (saliva, leite, urina, lágrima e sêmen) durante a fase aguda (MILLAR, 2005). Estes dependem de um habitat intracelular para se replicar e, portanto não resistem muito tempo fora das células hospedeiras. A multiplicação deste parasito dentro do citoplasma celular é rápida e caracterizada pela formação de rosetas que provocam a ruptura da célula hospedeira, liberando os taquizoítos para invadir outras células (Figura 2B) (COSTA, 2007). Esta forma infectante está intimamente relacionada à transmissão congênita, pois é a única capaz de atravessar a placenta e se alojar no feto (MILLAR, 2005). Estas três formas apresentam em comum estruturas especializadas que consistem em conóide, anel polar, microtúbulos subpeliculares e organelas 24 secretoras conhecidas como micronemas, roptrias e grânulos densos (DUBEY et al., 1998) (Figura 3). O protozoário ainda exibe locomoção dependente de actina e miosina, conhecida como “gliding motility”, que favorece sua migração e invasão das células hospedeiras (TOMLEY; SOLDATI, 2001; CARRUTHERS, 2002). A invasão das células hospedeiras é rápida (menos de 10 segundos) e depende de processos sequenciais tais como: 1. contato entre o pólo apical do parasito com a membrana das células alvo; 2. protrusão do conóide; 3. modificação da membrana celular do hospedeiro; 4. secreção do conteúdo das organelas (JOINER; DUBREMETZ, 1993; ORTEGA-BARRIA; BOOTHROYD, 1999). Os micronemas atuam no reconhecimento e na adesão facilitando a penetração do parasito na célula hospedeira, enquanto as roptrias agem no processo de invaginação celular criando o vacúolo parasitóforo, e os grânulos densos estão envolvidos com a aquisição de nutrientes da célula hospedeira (CARRUTHERS et al., 1999; COSTA, 2007; MEIRA, 2008). 25 B CA BB CAA Figura 2. Formas infectantes do Toxoplasma gondii. Oocisto esporulado (A), taquizoíto (B) e cisto tecidual (C). Figura A Adaptada de hht:/tp/www.ipec.fiocruz.br/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=55&infoid=69; Figuras B e C de: http://www.biof.ufrj.br/laminario.html (10/08/2009) http://www.ipec.fiocruz.br/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=55&infoid=69 http://www.biof.ufrj.br/laminario.html 26 Figura 3. Estruturas e organelas do taquizoíto. Adaptada de Baum, 2006. 27 Ciclo Biológico do Toxoplasma gondii O ciclo evolutivo do T. gondii é heteroxeno, sendo o gato doméstico e outros felídeos silvestres os hospedeiros definitivos, pois neles ocorre tanto a fase sexuada quanto a assexuada (Figura 4) (SPEER; DUBEY, 1998). A infecção por T. gondii nestes hospedeiros se dá principalmente pela ingestão de cistos teciduais ou oocistos (GIFFONI, 2007). Quando a infecção se dá pela ingestão de cistos teciduais, os bradizoítos liberados pela ação enzimática do estômago e do intestino delgado invadem as células intestinais do duodeno, iniciando o desenvolvimento de ciclos assexuais (DUBEY et al., 1998). Na fase sexuada, os gametas masculinos e femininos se unem gerando o zigoto que é envolto por uma parede cística, denominado de oocisto não esporulado, o qual é liberado nas fezes do hospedeiro (MILLAR, 2005). Os oocistos esporulam dentre um a cinco dias tornando-se infectantes (DUBEY et al., 1998). Os humanos são infectados ao ingerir esta forma, pois os esporozoítos contidos nos oocisto são liberados no intestino, onde conseguem invadir as células intestinais. Nesta fase os esporozoítos passam à forma de taquizoítos, os quais são recobertos com vacúolos e se replicam rapidamente levando à lise da célula infectada e liberando mais taquizoítos, que invadem outras células na fase aguda (Figura 5) (GIFFONI, 2007). Na fase crônica, os bradizoítos segregam em microcistos e assumem formas císticas de resistência que caracterizam a fase de latência, assim permanecendo por toda a vida do hospedeiro (CAMARGO, 2001; CARRUTHERS et al., 2000). 28 Figura 4. Vias de contaminação por T. gondii. Adaptada de Lynfield e Guerina, 1997. 29 Figura 5. Invasão e replicação do Toxoplasma gondii nas células hospedeiras. Adaptada de http://www2.bc.edu/~gubbelsj/Toxoplasma.html (14/07/2009). http://www2.bc.edu/~gubbelsj/Toxoplasma.html 30 Imunidade do Hospedeiro A fase aguda da infecção acontece entre os primeiros oito a doze dias, quando o taquizoíto se replica rapidamente em diferentes tecidos (CARRUTHERS, 2002). A infecção estimula a síntese da citocina IL-12 e interferon-γ que por sua vez ativam os linfócitos T CD4, CD8 e a célula Natural Killer (NK) impedindo a disseminação do parasito (LIEBERMAN; HUNTER, 2002; MILLER et al., 2008). Com isso se dá a redução progressiva da replicação do taquizoíto, que se diferencia para a forma bradizoíto dentro de cistos teciduais para se proteger dentro da célula hospedeira (COSTA, 2007). Desde que não haja inflamação ou infiltração de células imunes, os cistos teciduais permancem invisíveis nos tecidos. Em casos de deficiência dos linfócitos T, da célula NK e do interferon-γ, o bradizoíto pode se reconverter em taquizoíto, o qual se replica rapidamente gerando regiões esféricas de necrose tecidual que são visíveis nas imagens tomadas por tomografia computadorizada e ressonância magnética (CARRUTHERS, 2002). A imunidade humoral contra o T. gondii é caracterizada pela produção de anticorpos das classes IgM (Imunoglobulina de classe M), IgG, IgA e IgE (CHARDÉS et al., 1990). Os anticorpos IgM são os primeiros a serem expressos, seguidos por anticorpos IgG, que persistem por toda a vida do hospedeiro. Os anticorpos IgM não atingem níveis plasmáticos elevados e tendem a declinar de modo rápido, em poucos meses. Os anticorpos IgA também são produzidos nas fases iniciais da infecção, mas não são detectados durante a fase crônica. Portanto, são considerados bons marcadores de infecção aguda (CHARDÉS et al., 1990). A resposta imune ao T. gondii, mediada por anticorpos IgE é de curta duração e por isso a presença desses anticorpos pode ser considerada como mais um indicador de infecção recente. Todavia, em alguns casos pode-se constatar persistência de IgE por até onze meses (ASHBURN et al., 1995). 31 Diagnóstico de Infecção por Toxoplasma gondii e da Toxoplasmose Devido à presença de sintomas inespecíficos ou mesmo ausência deles, o diagnóstico de infecção por T. gondi e da toxoplasmose é essencialmente laboratorial, incluindo métodos diretos que evidenciam o parasito além dos indiretos, baseados na detecção de anticorpos específicos (CAMARGO, 1975; FRENKEL, 1996). Normalmente os métodos sorológicos são aplicados na rotina laboratorial para deteção de anticorpos das classes IgM e IgG (HILL; DUBEY, 2002). O ensaio imunoenzimático (ELISA) e imunofluorescência indireta (IFI) estão entre os mais utilizados. No entanto, estes métodos não fornecem informações precisas sobre o estado imune ou a resistência do hospedeiro. A presença dos anticorpos específicos sugere que o hospedeiro foi infectado em algum momento da sua vida. Anticorpos IgM anti-T. gondii são considerados marcadores de infecção aguda, enquanto IgG estão relacionadas com a fase crônica (CAMARGO, 2001). Sistema Histo-Sanguíneo Lewis O sistema histo-sanguíneo Lewis, assim denominado por apresentar seus antígenos tanto nos eritrócitos como em outros tecidos, é controlado pelo gene FUT3 (19p13.3). O isolamento do cDNA deste gene mostrou uma região codificadora de 1083 pb capaz de expressar uma proteína de 361 aminoácidos, conhecida como FUTIII (α-3/4-L-fucosiltransferase) (KUKOWSKA-LATALLO et al., 1999). Os alelos do gene FUT3 são representados, na genética clássica, por Le (gene funcional) e le (gene não funcional), e portanto os possíveis genótipos podem ser: LeLe, Lele e lele (DANIELS, 1995). A enzima FUTIII atua na expressão fenotípica do sistema Lewis por meio da fucosilação de oligossacarídeos precursores (OP) do tipo 1 (Galβ1→3NAcGlcβ1-R) e do tipo 2 (Galβ1→4NAcGlcβ1-R). Estes precursores apresentam uma extremidade terminal livre e não reduzida à qual podem ser adicionadas moléculas de fucose, e uma outra oposta, que pode ser ligada carboidratos, lipídeos ou proteinas (DANIELS, 1995; HENRY et al., 1995; ORIOL, 1995; SCHENKEL-BRUNNER, 2000). 32 A fucosilação do OP do tipo 1 permite a expressão dos antígenos Lea e Leb, os quais podem ser expressos nos tecidos de origem endodérmica. Por outro lado, a fusosilação do OP do tipo 2 leva à produção dos antígenos Lex e Ley em tecidos de origem mesodérmica como o endotélio vascular (Quadro 1) (DANIELS, 1995). Portanto, a expressão destes antígenos depende do tipo do oligossacarídeo disponível no tecido (RAVN; DABELSTEEN, 2000). Como os OPs dos tipos 1 e 2 podem ser glicosilados por diferentes glicosiltransferases, o sistema Lewis apresenta relações bioquímicas, genéticas e imunológicas com os sistemas histo-sanguíneos ABO e Secretor (HENRY; SAMUELSSON, 2000). Biosíntese dos Antígenos Lea e Leb A síntese dos antígenos glicolipídicos Lea e Leb resulta da interação dos genes FUT3 (19p.13.3) e FUT2 (19q13.3). O gene FUT3 codifica a fucosiltransferase FUTIII, a qual fucosila o OP tipo 1 para formar o antígeno Lea. Paralelamente, a fucosiltransferase FUTII, codificada pelo gene FUT2, fucosila o mesmo precursor para formar o antígeno H tipo 1. A posterior fucosilação desse antígeno pela FUTIII dá origem ao antígeno Leb (Quadro 1; Figura 6) (MOLLICONE et al., 1994; NISHIHARA et al., 1994; DANIELS, 1995; SCHENKEL-BRUNNER, 2000). Os indivíduos que expressam as formas ativadas das fucosiltransferases FUTII e FUTIII sintetizam os antígenos Lea e Leb no trato gastrintestinal, são classificados como secretores positivos e apresentam o fenótipo eritrocitário Le(a-b+). Aqueles que possuem apenas a FUTIII também sintetizam o antígeno Lea no trato gastrintestinal, são classificados como secretores negativos e seu fenótipo eritrocitário será Le(a+b-). Por outro lado, os indivíduos que não possuem a FUTIII expressam o fenótipo eritrocitário Le(a-b-) e poderão ser secretores positivos ou negativos, na dependência de possuírem ou não a FUTII (SCHENKEL-BRUNNER, 2000). O quadro 2 mostra os fenótipos Lewis que resultam das combinações das formas ativas e inativas das FUTII e FUTIII no trato gastrintestinal (TGI) e nos eritrócitos. 33 Genes Alelos Fucosiltransferases OP Antígenos FUT2 (Se) Se α-2-L-fucosiltransferase (FUTII) Tipo 1 H tipo 1 se Inativa - - FUT3 (Le) Le α-3/4-L-fucosiltransferase (FUTIII) Tipo 1 Lea; Leb Tipo 2 Lex; Ley le Inativa - - Quadro 1. Genes, alelos, fucosiltransferases, oligossacarídeo precursor e antígenos dos sistemas histo-sanguíneos Secretor e Lewis. 34 Figura 6. Representação esquemática da síntese dos antígenos Lewis. Galα1-3-GlcNAc-R Fuc α1- 4 Galβ1-3-GlcNAc-R Oligossacarídeo Precursor do tipo 1 FUTII FUTIII Le a H tipo 1 FUTIII Galα1-3-GlcNAc-R α1-2 Fuc Galα1-3-GlcNAc-R Fuc α1- 4 α1-2 Fuc Le b 35 FUTII FUTIII Antígenos Lewis Fenótipo no TGI Fenótipo eritrócitário Ativa Ativa Lea e Leb Le(a+b+) Le(a-b+) Inativa - Le(a-b-) Le(a-b-) Inativa Ativa Lea Le(a+b-) Le(a+b-) Inativa - Le(a-b-) Le(a-b-) Quadro 2 . Combinações das formas ativas e inativas das fucosiltransferases FUTII e FUTIII na expressão dos antígenos e dos fenótipos Lewis no trato gastrintestinal e nos eritrócitos. 36 Os antígenos do sistema Lewis são expressos principalmentes em tecidos de origem endodérmica como as glândulas salivares, mucosa gástrica, células intestinais e pancrêas. Estes antígenos circulam no plasma com ajuda das lipoproteínas e são adsorvidos passivamente pelos eritrócitos, linfócitos e plaquetas (HENRY et al., 1995). No geral, estes antígenos são encontrados nas secreções, principalmente na forma de glicoproteína e no plasma como glicolipídeo (MOLLICONE et al., 1994). A frequência destes fenótipos varia entre as diferentes populações. Em caucasianos, a frequência do fenótipo Le(a+b-) é de 22%, Le(a-b+) 72% e Le(a- b-) 6%. Em japoneses, o fenótipo Le(a-b-) não chega a atingir 2% enquanto nos negróides a frequência varia entre 20 e 25% (BEIGUELMAN, 2003). A expressão do fenótipo Le(a-b-) resulta de mutações que inativam o gene FUT3, levando à expressão da FUTIII não funcional. Até o momento, foram encontradas treze mutações em ponto responsáveis pela expressão deste fenótipo (T59G, G508A, T1067A, T202C, C314T, C445T, G484A, G667A, G808A, G760A, G13A, G1022T e G47C) (SOEJIMA; KODA, 2005). Vários estudos demonstraram que as mutações T202C e C314T são frequentes em causasianos e estão relacionadas ao fenótipo Le(a-b-) (SALOMAA et al., 2000; SOEJIMA; KODA, 2005). No Brasil foram encontrados valores iguais a 24% e 13,7% (CINTRA; MATTOS, 2006) e 17,7% e 16,9% (GRADELLA, 2007) para as mutações T202C e C314T, respectivamente. A mutação frequentemente encontrada no gene FUT2, em caucasianos, consiste na substiuição de uma base G por outra A no nucleotídeo 428 do exon 2. Esta alteração inibe a expressão da forma funcional da FUTII e, portanto, seus portadores são incapazes de sintetizar o antígeno H tipo 1. Como consequência, não podem expressar o antígeno Leb mesmo na presença da forma ativa da FUTIII (SCHENKEL-BRUNNER, 2000). Nos indivíduos Lewis e secretor positivos, a FUTII é altamente ativa sob a cadeia precursora do tipo 1 em relação à FUTIII. Assim, ocorre a produção maior do antígeno H tipo 1, que posteriormente, é fucosilado pela FUTIII, transformando-o no antígeno Leb. Isso não significa que não ocorre a produção dos antígenos Lea, mas como a FUTII é mais competitiva, ocorre produção de maior quantidade do antígeno Leb do que o antígeno Lea, levando ao fenótipo eritrocitário Le(a-b+) (MOLLICONE et al., 1994). 37 O fenótipo eritrocitário Le(a+b+) é comum em aborígenes australianos, japoneses, chineses e polinésios. Este fenótipo resulta da presença de um alelo FUT2 (Sew: Weak), que expressa uma enzima de baixa atividade, permitindo que grande parte do oligossacarídeo precursor tipo 1 seja transformado no antígeno Lea (MOLLICONE et al., 1994). Os fenótipos do sistema Lewis nos eritrócitos podem ser alterados em casos de doenças e outras condições. Isso pode acontecer pelo fato de que os antígenos do sistema Lewis são adsorvidos nos eritrócitos no plasma. Este fenômeno foi observado em pacientes com cânceres do pâncreas, estômago, ducto biliar, cólon, mama e bexiga. Além destes, também há indícios de que, em gestantes, cirrose alcoólica, pancreatites alcoólicas, infecções virais e parasitárias, podem alterar os fenótipos Lewis. Assim, a fenotipagem eritrocitária do sistema Lewis não é suficiente, isoladamente, para determinar e caracterizar a expressão dos antígenos deste sistema no trato gastrintestinal. A genotipagem FUT3 constitui uma estratégia de maior confiabilidade para se inferir os fenótipos Lewis tanto nos eritrócitos como em outros tecidos e secreções (HENRY et al., 1995). Sistema Histo-Sanguíeno Lewis como Fator de Risco para Infecção por Toxoplasma gondii Devido ao grande impacto epidemiológico e clínico da infecção por T. gondii em pacientes com imunodeficiências, portadores de lesão ocular, gestantes e neonatos, estudos vem sendo desenvolvidos. Como este protozoário consegue invadir vários tipos celulares e atravessa as barreiras hematoencefálica e transplacentária, sugere-se que seja capaz de reconhecer componentes abundantes da matriz extracelular ou moléculas de superfície amplamente distribuídas como receptores (ORTEGA-BARRIA; BOOTHROYD, 1999; CARRUTHERS et al., 2000; CARRUTHERS, 2002; SIBLEY, 2004; BARRAGAN, et al., 2005). Crane e Dvorak (1982) estudaram a influência de diferentes tipos de monossacarídeos na infecção da cepa RH do T. gondii em células de músculo esquelético de embrião bovino e verificaram que carboidratos influenciam o índice de penetração. Maior índice foi observado na presença de concentração de 50 mM de 38 fucose. Estudo in vitro realizado por de Carvalho e colaboradores (1991) também mostrou que os taquizoítos aderem a membrana das células alvo reconhecendo as moléculas de N-Acetilglicosamina (GlcNAc) e galactose (Gal) conjugadas à albumina marcada com partículas de ouro. Curiosamente, os monossacarídeos acima referidos estão presentes na estrutura dos oligossacarídeos precursores do tipo 1 que dão origem aos antígenos histo-sanguíneos ABO, H e Lea e Leb no trato gastrintestinal, local utilizado como rota de infecção por T. gondii. É possível que a fucose, a GlcNAc e a Gal influenciam a suscetibilidade ou a resitência à infecção por T. gondii. Estudos relacionando o sistema sanguíneo ABO como fator de risco para infecção por T. gondii encontraram prevalência de infecção no tipo sanguíneo B (MIDTVEDT; VAAGE, 1989; SALIBAY et al., 2008) e no grupo AB (LÓPEZ et al., 1993; ZHIBURt et al., 1997; KOLBEKOVA et al., 2007). Nestes estudos, a determinação dos fenótipos ABO foi baseada na pesquisa dos antígenos eritrocitários apenas, o que não se reflete no trato gastrintestinal, local utilizado pelo T. gondii para infectar o hospedeiro humano. Recentemente, nosso grupo de estudo não encontrou diferenças estatisticamente significantes entre a presença de anticorpos anti-T. gondii, o sistema ABO e o os fenótipos Secretor positivo e negativo em 367 gestantes da região noroeste do Estado de São Paulo (Mattos et al,2008). O sistema histo-sanguineo Lewis não foi explorado em nenhum dos estudos supracitados, sendo de fundamental importância, uma vez que seus antígenos fucosilados contribuem para a diversificação dos glicoconjugados ABO e Secretor expressos no trato gastrintestinal (DANIELS, 1995; HENRY et al., 1995; SCHENKEL-BRUNNER, 2000). 39 Objetivos Geral: Testar a hipótese de que o sistema histo-sanguíneo Lewis está associado à infecção por T. gondii da cepa RH. Específicos 1. Definir dois grupos de amostras de soro de gestantes: “reagente” – presença de anticorpos anti-T. gondii, e “não reagente” – ausência de anticorpos anti-T. gondii; 2. Verificar em cada um dos grupos a presença de anticorpos anti-T. gondii de classe IgG específicos para cepa RH; 3. Identificar as mutações G428A do gene FUT2, T202C e C314T do gene FUT3 em ambos os grupos; 4. Inferir os fenótipos Lewis do trato gastrintestinal a partir das genotipagens FUT2 e FUT3; 5. Verificar a associação entre os fenótipos Lewis e a presença de anticorpos anti-T. gondii da cepa RH. 40 Resultados Manuscrito a ser submetido à publicação à revista Blood, fator de impacto 10.43, Qualis A1. Fenótipo Lewis negativo: Potencial fator de risco para infecção por Toxoplasma gondii da cepa RH em gestantes Nakashima, F1; Brandão de Mattos, C. C2; Ferreira A. I. C2; Spegiorin, L. C. J. F3; Pereira-Chioccola, V4; Meira, C. S4; Mattos, L. C2 1 – Departamento de Biologia – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE–UNESP 2– Laboratório de Imunogenética – Departamento de Biologia Molecular – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP 3 – Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP/ Hospital de Base – FUNFARME 4- Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos – Instituto Adolfo Lutz – São Paulo – IAL-SP 41 Resumo A transmissão congênita do Toxoplasma gondii é de grande importância clínica devido às graves consequências que podem afetar a saúde do feto. Os genes FUT3 (19p.13.3) e FUT2 (19q.13.3) codificam as enzimas FUTIII e FUTII respectivamente. A fucosilação dos oligossacarídeos precursores tipo 1 (β-Galactose1→3βN- Acetilglicosamina1-R) por estas enzimas resulta na síntese dos antígenos Lea e Leb, os quais determinam os fenótipos Le(a+b-), Le(a+b+) e Le(a-b-) do sistema histo- sanguíneo Lewis no trato gastrintestinal. Considerando que o T. gondii utiliza como rota de infecção o trato gastrintestinal, e que os antígenos do sistema histo- sanguíneo Lewis são expressos neste órgão, o objetivo deste trabalho foi investigar a associação entre estes dois eventos. Para tanto, foram selecionadas 209 amostras de soro e de DNA genômico estocadas no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP, coletadas de gestantes atendidas no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do Hospital de Base da Fundação Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto - FUNFARME. Nas amostras de soro, uma triagem para detectar anticorpos anti-T. gondii foi realizada com o método de hemaglutinação indireta (HAI). Nestas amostras foram também pesquisados os anticorpos IgG anti-T. gondii da cepa RH com o método ensaio imunoenzimático (ELISA). Dentre as 209 amostras, 195 (93,3%) apresentaram resultados concordantes entre as técnicas HAI e ELISA e, por isso, foram selecionadas para compor os grupos: “reagente” e “não reagente”. Para inferir os fenótipos do sistema histo-sanguíneo Lewis, as amostras de DNA genômico correspondentes às de soro foram genotipadas para as mutações G428A do gene FUT2, T202C e C314T do gene FUT3 por PCR-RFLP e PCR-SSP, respectivamente. Os dados foram analisados utilizando o teste exato de Fisher e o nível de significância adotado foi de 5%. Das 195 amostras, 116 (59,5%) apresentaram-se reagentes e 79 (40,5%) não reagentes. Entre as não reagentes, 12 (15,19%) apresentavam o fenótipo Le(a+b-) e 67 (84,81%) Le(a+b+). No grupo reagente foram encontrados 30 (25,86%) Le(a+b-), 68 (58,62%) Le(a+b+) e 18 (15,52%) Le(a-b-). As frequências obtidas entre os grupos reagente e não reagente apresentaram diferenças estatisticamente significantes para Le(a+b+) [p=0,0001; OR: 0,2537; IC 95%: 0,1239-0,5198] e Le(a-b-) [p=0,0001; OR: 29.863; IC 95%: 42 1.771-503.630], mas não para Le(a+b-) [p=0,0795; OR: 1.948; IC 95%: 0,9275-4.090]. Diferenças estatisticamente significante também foram observadas quando se comparou as frequências de cada fenótipo isoladamente: Le(a-b-) Vs Le(a+b-) [p=0,0118; OR: 15.165; IC 95%: 0,8463 - 271.710]; Le(a-b-) Vs Le(a+b+) [p=0,0001; OR: 36.460; IC 95% 2.152 - 617.680]; Le(a+b-) Vs Le(a+b+) [p=0,0206; OR: 2.463; IC 95%: 2.463 - 5.214]. Com este estudo concluímos que o fenótipo Le(a-b-) inferido a partir das genotipagens FUT2 e FUT3 está associado à infecção por cepas RH de T. gondii. Palavras-chave: sistema histo-sanguíneo Lewis; Toxoplasma gondii; FUT2; FUT3; toxoplasmose; gestantes. 43 Introdução Toxoplasmose é uma doença infecciosa causada pelo protozoário Toxoplasma gondii (CARRUTHERS, 2002; CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007). A doença apresenta alta taxa de mortalidade em indivíduos imunocomprometidos (CHIMELLI et al., 1992; HILL; DUBEY, 2002) e é responsável por abortos (PAPPAS et al., 2009) e pelo desenvolvimento da Tétrade de Sabin nos recém-nascidos (GUIMARÃES et al., 1993). Em virtudes dos riscos da transmissão congênita que podem ocorrer quando a gestante se encontra na fase aguda da doença (CAMARGO, 2001), ou quando infecções crônicas são reativadas neste período (DETANICO; BASSO, 2006), a infecção por este protozoário é de grande importância epidemiológica e clínica. No Brasil, a prevalência de infecção por T. gondii em gestante é alta, chegando atingir 67% no norte do Paraná (REICHE et al., 2000), 74% em Rio Verde – Goiás (GIFFONI, 2007), 60% em Botucatu – São Paulo (OLBRICH; MEIRA, 2004) e 57,3% no noroeste paulista (GALISTEU et al., 2007). T. gondii é um protozoário intracelular obrigatório que invade vários tipos celulares e é capaz de atravessar as barreiras hematoencefálica e a placentária. Alguns estudos sugerem que esta habilidade de invasão está relacionada à capacidade do protozoário reconhecer e aderir moléculas amplamente distribuídas no hospedeiro (ORTEGA-BARRIA; BOOTHROYD, 1999; CARRUTHERS et al., 2000; CARRUTHERS, 2002; SIBLEY, 2004; BARRAGAN et al., 2005). No final dos anos 80 foi proposto que o grupo B do sistema ABO representa um potencial fator de risco para a infecção por T. gondii (MIDTVEDT; VAAGE, 1989) sendo confirmado por alguns estudos subsequentes (LÓPEZ et al., 1993; ZHIBURT et al., 1997; KOLBEKOVA et al., 2007; SALIBAY; CLAVERIA, 2005). Entretanto, outros relatos demonstraram resultados discordantes (GILL, 1985; LECOLIER et al., 1990), mesmo quando o status Secretor foi considerado (MATTOS et al., 2008). O sistema histo-sanguíneo Lewis caracteriza-se pela expressão de moléculas glicosiladas no trato gastrintestinal (ORIOL, 1995), um local frequentemente utilizado pelo T. gondii para invadir os seres humanos (REY, 2008). 44 Este sistema é controlado pelos genes FUT2 (19q.13.3) e FUT3 (19p.13.3) os quais regulam a síntese dos antígenos Lea e Leb por meio da expressão da fucosiltransferases FUTII e FUTIII (SCHENKEL-BRUNNER, 2000). As combinações entre estes antígenos determinam diferentes fenótipos Lewis no trato gastrintestinal, os quais podem ser inferidos a partir da genotipagem FUT2 e FUT3 (HENRY et al., 1995; HENRY, 1996). Pelo fato do T. gondii utilizar o trato gastrintestinal como rota de infecção e pelas evidências de que carboidratos e outras moléculas glicosiladas constituem potenciais receptores para microrganismos, este trabalho teve como objetivo testar a hipótese de que o sistema histo-sanguíneo Lewis está associado à infecção por cepas RH deste parasito. Material e Métodos Aspectos éticos Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP sob paracer número 089/2005. Amostras analisadas Foram selecionadas 209 amostras de soro e de DNA genômico estocadas no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Biologia da FAMERP, coletadas de gestantes atendidas no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do Hospital de Base da Fundação Faculdade Regional de Medicina de São José do Rio Preto – FUNFARME. 45 Sorologia para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii e genotipagem da substituição G428A do gene FUT2 A pesquisa de anticorpos anti-T. gondii e a genotipagem da substituição G428A do gene FUT2 foram previamente realizadas nas amostras de acordo dados publicados em Mattos e colaboradores (2008). A sorologia foi realizada pelo método de Hemaglutinação indireta (HAI) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante (IMUNO-HAI-TOXO-Wama Diagnóstica, São Carlos, Brasil) e a identificação da substituição G428A do gene FUT2 foi realizada com o uso do método de Reação em Cadeia da Polimerase – Polimorfismo de Tamanho de Fragmentos de Restrição (PCR-RFLP), de acordo com o protocolo de Svensson e colaboradores (2000). Pesquisa de IgG anti- Toxoplasma gondii da cepa RH O ensaio imunoenzimático (ELISA) foi utilizado para pesquisar os anticorpos específicos da classe IgG contra a cepa RH, a qual prevalece na população do estado de São Paulo (FERREIRA et al., 2008; VALLOCHI et al., 2005). O protocolo desenvolvido foi o mesmo aplicado rotineiramente pelos pesquisadores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo (IAL), padronizado por Meira (2008). Em primeiro momento, os antígenos cultivados pelo IAL, foram diluídos em tampão bicarbonato de sódio 0,1 M pH 8.5 na concentração de 1 μg/mL para sensibilizar os orifícios das microplacas de poliestireno utilizadas. No segundo momento, as amostras de soro foram diluídas 1:200 na solução leite desnatado-PBS a 5% e distribuídas em duplicata às microplacas posteriormente incubadas por 50 minutos a 37ºC. Em seguida 50 μL do anticorpo anti-IgG humana conjugada a peroxidase diluído 1:20.000 em PBS-Leite desnatado a 5% (Sigma) foram adicionados as placas que foram incubadas por mais 50 minutos a 37º C. Com adição de 100 μL do substrato enzimático (0,5 mg/mL de o-fenilenodiamina diluído em fosfato de sódio dibásico 0,1M pH 4.5, ácido cítrico 0,1M; H2O2 0,1%) as placas 46 foram incubadas novamente em câmara escura por 30 minutos, a 37°C. A reação foi interrompida após adicionar 50 μL de ácido sulfúrico (H2SO4) 4N a cada orifício. O valor de Densidade Ótica (DO) de cada amostra testada em duplicatas foi obtido pelo espectrofotômetro (Labsystens Multiskan) em comprimento de onda de 492 nm. Ao final, a média aritmética das DO de cada amostra foi calculada e utilizada para comparação com o valor de referência (cut-off). O valor do cut-off foi obtido pelo cálculo da média aritmética das DO de 20 amostras de soro previamente identificadas como não reagentes, acrescido de duas vezes o valor de desvio-padrão. Quando as médias de DO das amostras testadas em duplicata apresentaram valores de DO maior que do cut-off foram consideradas reagentes (presença de anticorpos anti-T. gondii) e quando menores que este valor, não reagentes (ausência de anticorpos anti-T. gondii). Genotipagem do gene FUT3 A identificação das substituições T202C e C314T do gene FUT3 foi realizada com o uso do método de Reação em Cadeia da Polimerase – Pimers de sequência específica (PCR-SSP), de acordo com o protocolo de Grahn et al (2001). Para cada substituição duas reações de amplificação foram preparadas com: 7,7 µL de água MilliQ, 1,5 µL do PCR Buffer 10X, 0,8 µL de MgCl2 (50 Mm), 1 µL de dNTP a 20mM (dATP, dCTP, dGTP e dTTP - Invitrogen), 0,5 U DNA polimerase (Invitrogen), 3 µL de DNA genômico a 100 ng/mL. Em cada tubo de reação foram incluídos 0,2 µL a 20 mM dos Primers sense (s) e anti-sense (as) (HGH1s - 5’- GCCTTCCCAACCATTCCCTT-3’) (HGH2as - 5’- TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC- 3’) do controle interno de amplificação e o primer 55as (5’- TTCTGGAGGGGAGAGGCT-3’). Além destes, foram adicionados na reação 0,2 µL a 20 mM dos Primers específicos para cada substituição analisada [T202C (50s - 5’- CCCTCCTGATCCTGCTATG-3’ ou 49s - 5’- ACCCTCCTGATCCTGCTAC-3’); C314T (52s - 5’-GTACCCACAGGCAGACACG-3’ ou 51s - 5’- TGTACCCACAGGCAGACAT-3’)] totalizando o volume final de 15 µl. Ambas as reações diferiram entre si pela adição de Primers sense específicos utilizados para cada substituição. Em uma das reações foi adicionado o 47 Primer sense específico para o alelo selvagem [T202C (50s) ou C314T (52s)] e na outra foi adicionado o Primer sense específico para o alelo mutante [T202C (49s) ou C314T (51s)]. As condições de amplificação para a identificação da substituição T202C foram de 96ºC 60 segundos (s), cinco ciclos de 96ºC 20 s, 70ºC 45 s, 72ºC 25 s, 21 ciclos de 96ºC 25 s, 65ºC 50 s, 72ºC 30 s, quatro ciclos de 96ºC 30 s, 55ºC 60 s, 72ºC 90 s, 72ºC 60 s e - 4ºC infinito. Para a mutação C314T as condições de amplificação foram de 96 ºC por 60 s, cinco ciclos de 96ºC 20 s, 70ºC 45 s, 72ºC 25 s, 21 ciclos de 96ºC 25 s, 67ºC 50 s, 72ºC 30 s, quatro ciclos de 96ºC 30 s, 55ºC 60 s, 72ºC 90 s e - 4ºC infinito. Após a amplificação, os fragmentos amplificados foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio. Os tempos de corridas eletroforéticas foram de 60 minutos para a mutação T202C e de 30 minutos para a C314T, a 120 volts. O tamanho dos fragmentos correspondentes ao alelo selvagem e o alelo mutante da substituição T202C foi de 1045 e 1044 pares de bases, enquanto que para a mutação C314T foi de 932 e 933 pares de bases, respectivamente. O fragmento correspondente ao controle interno de amplificação continha 428 pares de bases. Análise estatística Para calcular as diferenças das proporções dos fenótipos Lewis inferidos entre os grupos “reagente” e “não reagente” foi utilizado o teste exato de Fisher e o nível de significância adotado foi igual a 5%. 48 Resultados Dentre as 209 amostras, 195 (93,3%) foram selecionadas para este estudo por apresentarem resultados concordantes entre as técnicas HAI e ELISA. Deste total, 116 (59,5%) apresentaram anticorpos anti-T. gondii e 79 (40,5%) mostraram-se não reagentes. As figuras de 1 a 3 ilustram os perfis eletroforéticos dos fragmentos amplificados por PCR-RFLP e PCR-SSP para as mutações G428A (FUT2), T202C e C314T (FUT3). A tabela 1 contém os resultados das genotipagens FUT2 e FUT3 e os fenótipos Lewis inferidos para o trato gastrintestinal. Na tabela 2 estão os valores absolutos e percentuais dos resultados reagente e não reagente das amostras de acordo com o fenótipo Lewis inferido, bem como o valor p obtido pelo teste exato de Fisher. A frequência do fenótipo Le(a-b-) mostrou diferença estatisticamente significante quando comparada com às dos fenótipos Le(a+b-) e Le(a+b+) em conjunto (Tabela 2), e separadamente (Tabela 3). As frequências dos fenótipos Lewis inferidos de acordo com os grupos reagente e não reagente estão ilustrados na tabela 4. Discussão Relatos prévios sugerindo associação entre o sistema histo- sanguíneo ABO e a infecção por T. gondii (MIDTVEDT; VAAGE, 1989; LECOLIER et al., 1990; LÓPEZ et al., 1993; ZHIBURT et al., 1997; ANGSTROM et al., 2004; SALIBAY; CLAVEIRA, 2005; KOLBEKOVA, 2007), estimularam-nos a investigar este fenômeno em relação ao sistema histo-sanguíneo Lewis. Este sistema, que expressa no trato gastrintestinal os antígenos Lea e Leb sob ação das fucosiltransferases FUTII e FUTIII, além de contribuir para a glicosilação de diferentes moléculas e para a diversificação das cadeias oligossacarídicas ligadas a proteínas e lipídeos, interage com o sistema histo-sanguíneo ABO (ORIOL, 1995; HENRY, 2001). 49 A importância dos antígenos Lea e Leb bem como de outros carboidratos dos sistemas histo-sanguíneos como receptores para microrganismos que colonizam o trato gastrintestinal vem sendo explorada (BOREN et al., 1993; HENRY, 2001; IMBERTY; VARROT, 2008). Além do T. gondii utilizar o trato gastrintestinal como rota de infecção em humanos, há evidências de que suas roptrias ligam moléculas glicosiladas como parte do processo de invasão celular (de CARVALHO et al., 1991; ORTEGA-BARRIA; BOOTHROYD, 1999; CARRUTHERS et al., 2000). Estes dados fundamentaram nossa hipótese. Para investigar a associação entre o sistema histo-sanguíneo Lewis e a infecção por pela cepa RH do T. gondii, selecionamos amostras de soro e DNA genômico de gestantes com e sem anticorpos de classe IgG para este parasito, identificados com o uso do método hemaglutinação indireta, previamente analisadas por nosso grupo (MATTOS et al., 2008). Estas amostras foram re-avaliadas pelo método ELISA validado por Meira e colaboradores (2008), os quais demonstraram sua adequada sensibilidade e especificidade na investigação de anticorpos específicos para a cepa RH. Apenas as amostras com resultados “reagente” e “não reagente” concordantes por hemaglutinação indireta e ELISA foram utilizada para a composição dos grupos. Optamos por estes dois métodos sorológicos para compor os grupos, pois os mesmos são rotineiramente empregados em laboratório de análises clínicas e apresentam os parâmetros de sensibilidade e especificidade adequados para o diagnóstico da toxoplasmose (CONCUERA et al., 1981 apud PINTO et al., 2009). O percentual de infecção em gestantes por T. gondii é elevado nas diferentes áreas do Brasil (REICHE et al., 2000; OLBRICH; MEIRA, 2004; GIFFONI, 2007; PAPPAS, 2009), incluindo a região noroeste paulista (GALISTEU et al., 2007). Entretanto, estes estudos não identificaram anticorpos específicos para a cepa RH, mas é possível que a mesma seja prevalente na região de origem das amostras analisadas neste estudo, visto que recentes relatos demonstraram sua predominância em aidéticos e não aidéticos do Estado de São Paulo (FERREIRA et al., 2008; VALLOCHI et al., 2005). Portanto, os resultados encontrados neste estudo refletem os índices de infecção pela cepa RH no noroeste paulista. As frequências dos fenótipos Lewis inferidos a partir da genotipagem FUT2 e FUT3, independente da presença ou não de anticorpos IgG, foram similares àquelas descritas para a população brasileira (BEIGUELMAN, 2003). Portanto, as 50 amostras selecionadas, embora oriundas apenas de gestantes, é representativa da região noroeste do Estado de São Paulo. O uso da genotipagem FUT2 e FUT3 para inferir os fenótipos Lewis em mulheres grávidas é justificado. A síntese dos antígenos Lea e Leb ocorre durante a gestação, mas a expressão dos fenótipos eritrocitários Le(a+b-) e Le(a-b+) sofre variações devido às alterações fisiológicas comuns na gravidez. Há demonstrações de que mulheres fenotipadas como Le(a+b-) e Le(a-b+) expressam o fenótipo Le(a-b-) durante a gravidez (HAMMAR et al., 1981). Portanto, a fenotipagem eritrocitária não se constitui em um procedimento confiável para a investigação do sistema Lewis em gestantes e torna-se necessário o uso de métodos moleculares (HENRY et al., 1995). A escolha pela genotigem das mutações G428A do gene FUT2, T202C e C314T do gene FUT3 para inferir os fenótipos Lewis [Le(a+b-); Le(a+b+); Le(a-b-)] no trato gastintestinal baseou-se em estudos que demostraram prevalência destas substituições na população brasileira (CINTRA; MATTOS, 2006a; CINTRA; MATTOS, 2006b; GRADELLA, 2007). A mutação T59G do gene FUT3 também é frequente na população brasileira (GRADELLA, 2007), porém não foi considerada neste estudo uma vez que nem sempre está relacionada ao fenótipo Lewis negativo genuíno (NISHIHARA et al., 1999; SOEJIMA; KODA, 2005). Neste estudo, o fenótipo Le(a+b-) foi inferido a partir da combinação da homozigose para a mutação G428A do gene FUT2 com os alelos selvagens T202C e C314T do gene FUT3, pois foi observado que estas mutações são comuns na região noroeste do Estado de São Paulo (CINTRA; MATTOS, 2006a). O fenótipo Le(a+b+) foi inferido da presença dos alelos selvagens de ambos os genes. Este último fenótipo aparece nos eritrócitos como Le(a-b+) mas de fato, seus portadores expressam os antígenos Lea e Leb no trato gastrintestinal (HENRY et al., 1995; HENRY, 1996). Portanto, a notação Le(a+b+) reflete o real fenótipo Lewis neste local utilizado pelo T. gondii como rota para infectar os humanos. A inferência do fenótipo Le(a-b-) foi baseada na presença de um ou ambos alelos mutantes do gene FUT3, independente da mutação G428A. Estas estratégias foram sugeridas por estudos que demonstraram que a expressão eritrocitária dos fenótipos Lewis nem sempre é concordante com os genótipos. Assim, são adequadas para definir de maneira mais precisa os verdadeiros fenótipos Lewis do trato gastrintestinal (HENRY et al., 1995; HENRY, 1996). 51 A comparação das frequências dos fenótipos Lewis entre reagentes e não reagentes mostraram diferenças estatisticamente significantes. Os fenótipos Le(a+b-) e Le(a+b+) foram observados em ambos os grupos, mas o fenótipo Le(a-b- ) foi encontrado apenas nas amostras reagentes. Desta forma, os resultados aqui relatados demonstram pela primeira vez, pelo conhecimento dos autores, forte associação deste fenótipo com a infecção por cepa RH de T. gondii. As razões para esta associação não são totalmente compreendidas. É possível que diferentes fatores contribuam para os resultados relatados neste estudo. O fenótipo Le(a-b-) caracteriza-se pela ausência dos antígenos Lea e Leb tanto nos eritrócitos como no trato gastrintestinal e portanto, seus portadores expressam apenas o oligossacarídeo precursor (OP) tipo 1 na presença de mutações que inativam o gene FUT2, ou o antígeno H tipo 1 quando expressam normalmente a enzima FUTII. Em sua extremidade dissacarídica terminal, o OP tipo 1 possui uma molécula de galactose ligada a outra de N-Acetilglicosamina (Galβ1→3NAcGlc-R), a qual pode ser modificada pelas enzimas FUTII e FUTIII pela adição de uma ou duas moléculas de fucose, para formar os antígenos H tipo 1, Lea ou Leb, respectivamente (SCHENKEL-BRUNNER, 2000). Como a expressão dos antígenos Lea e Leb depende da presença da enzima FUTIII, mutações que inativam o gene FUT3 são crucial para manutenção da estrutura inalterada do OP tipo 1 e do antígeno H tipo 1. Portanto, a ausência dos antígenos Lea e Leb pode favorecer a aderência do T. gondii membrana no processo de invasão celular. Análises experimentais demonstraram que proteínas das roptrias do T. gondii aderem a moléculas de Gal e NAcGlc (de CARVALHO et al., 1991). Estas observações oferecem, pelo menos em parte, fundamentação para os resultados observados neste estudo, pois a maior frequência de infecção ocorreu nos indivíduos Le(a-b-). Nestes indivíduos, a extremidade dissacarídica do OP tipo1 não é modificada pela enzima FUTIII, embora possa ser fucosilada pela enzima FUTII para formar o antígeno H t ipo 1 (ORIOL, 1995). Portanto, é possível que combinação de Gal com NAcGlc na composição da estrutura oligossacarídica do OP tipo 1 e do antígeno H tipo1 favoreça a aderência de cepas RH do T. gondii às células hospedeiras e contribua para a maior suscetibilidade do fenótipo Le(a-b-) à infecção. A suscetibilidade do fenótipo Le(a-b-) não parece ser absoluta pois amostras pertencentes aos demais fenótipos Lewis foram encontradas nos grupos 52 reagente e não reagente. As diferenças entre as frequências dos fenótipos Le(a+b-) e Le(a+b+) nestes grupos foram estatisticamente significantes. Amostras Le(a+b-) mostraram maior índice de infecção que aquelas Le(a+b+). As razões para estas diferenças não são totalmente compreendidas, porém é possível que variações estruturais nos antígenos Lea e Leb contribuam para estas observações. O antígeno Lea é monofucosilado e sua síntese é dependente da enzima FUTIII. O antígeno Leb é difucosilado, mas sua síntese é dependente das enzimas FUTII e FUTIII. Portanto, estas moléculas apresentam variações na conformação espacial as quais, além de serem distinguidas por anticorpos monoclonais específicos, podem atuar como receptores para microrganismos (KARLSSON, 1995). De fato, análises experimentais demonstram que os antígenos H tipo 1, Lea e Leb atuam como ligantes para adesinas expressas pelo bacilo Helicobacter pylori (BOREN et al., 1993; ALKOUT et al., 1997). Estes antígenos são derivados do mesmo oligossacarídeo precursor e diferem entre si pelo número e localização das moléculas de fucose adicionadas (ORIOL, 1995). Análises experimentais demonstraram que moléculas de fucose são excluídas da região onde ocorre o processo ativo penetração dos taquizoítos da cepa RH de T. gondii em células endoteliais humanas na formação do vacúolo parasitóforo (STUMBO et al., 2002). Portanto, pode-se presumir que células que não expressam moléculas fucosiladas apresentam propensão à infecção por este parasito. O papel da fucose na suscetibilidade à infecção por T. gondii é desconhecido. Embora a ausência deste monossacarídeo possa favorecer a infecção dos indivíduos Le(a-b-) é possível que variações na concentrações dos antígenos Lea e Leb também se relacionem com a suscetibilidade a este parasito. Há demonstrações de que a concentração do antígeno Leb varia no plasma de mulheres grávidas e não grávidas, mas concentrações reduzidas foram observadas apenas nas grávidas (HAMMAR et al., 1981). Os antígenos Lea e Leb são sintetizados no trato gastrintestinal e transportados para o plasma (HENRY et al., 1995; HENRY, 1996). É possível que as variações na concentração plasmática destes antígenos refletem a redução, mas não a ausência absoluta de síntese destes antígenos no trato gastrintestinal. Se a ausência de fucose favorece a infecção de células endoteliais humanas pelos taquizoítos da cepa RH do T. gondii (STUMBO et al., 2002) pode-se presumir que indivíduos que não expressam antígenos fucosilados estão sob risco elevado de infecção. Coincidentemente, o 53 maior percentual de infecção por esta cepa foi observado nas amostras Le(a-b-), seguido das Le(a+b-) e das Le(a+b+). Embora este estudo não tenha analisado a aderência in vitro da cepa RH do T. gondii aos antígenos do sistema histo-sanguíneo Lewis, seus resultados sugerem que os diferentes fenótipos influenciam a taxa de infecção. Todas as amostras Le(a-b-) mostraram-se reagentes mas aproximadamente três quartos das Le(a+b-) e metade das Le(a+b+) apresentaram este resultado sorológico. Como as diferenças entre estes fenótipos resultam essencialmente da presença ou não de antígenos monofucosilados e difucosilados, é possível que a presença da fucose contribua para a redução da aderência de taquizoítos da cepa RH do T. gondii ao epitélio gastrintestinal humano. Em conclusão, este estudo demonstrou que o fenótipo Le(a-b-) inferido a partir das genotipagens FUT2 e FUT3 está associado à infecção por cepas RH de T. gondii. 54 Referências ALKOUT, A. M. et al. Isolation of a cell surface component of Helicobacter pylori that binds H type 2, Lewis (a) and Lewis (b) antigens. Gastroenterology, v. 112, p. 1179- 1187, 1997. ANGSTROM, J. et al. 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M representa o marcador de 100 pares de bases. 932/933 pb 428 pb M D (52s) E (52s) F (52s) E (51s) F (51s) D (51s) 64 Tabela 1. Resultados das genotipagens G428A do gene FUT2 e T202C e C314T do gene FUT3 e os fenótipos Lewis inferidos para o trato gastrintestinal. FUT2 (G428A) FUT3 (T202C) FUT3 (C314T) Reagente Não Reagente Fenótipos (TGI) CC 22 10 Le(a+b-) AA TT+TC CT 8 2 Le(a+b-) TT 0 0 Le(a-b-) CC 0 0 Le(a-b-) AA CC CT 2 0 Le(a-b-) TT 1 0 Le(a-b-) CC 52 45 Le(a+b+) GG + GA TT+TC CT 16 22 Le(a+b+) TT 4 0 Le(a-b-) CC 1 0 Le(a-b-) GG + GA CC CT 9 0 Le(a-b-) TT 1 0 Le(a-b-) Total 116 79 65 Tabela 2. Valores absolutos e percentuais dos resultados reagente (R) e não reagente (NR) das 195 amostras de soro avaliadas por HAI e ELISA, de acordo com os fenótipos Lewis inferidos para o trato gastrintestina (TGl) e, o valor p calculado pelo teste exato de Fisher. Os valores de Odds Ratio (OR) e intervalo de confiança a 95%. Fenótipos (TGI) Total N(%) R N(%) NR N(%) p OR IC 95% Le(a+b-) 42 (21,54%) 30 (25,86%) 12 (15,19%) 0,0795 1.948 0,9275-4.090 Le(a+b+) 135 (69,23) 68 (58,62%) 67 (84,81%) 0,0001 0,2537 0,1239-0,5198 Le(a-b-) 18 (9,23%) 18 (15,52%) 0 (0%) 0,0001 29.863 1.771-503.630 Total 195 (100%) 116 (59,5%) 79 (40,5%) 66 Tabela 3. Valor p calculado pelo teste exato de Fisher para as comparações entre os fenótipos Lewis. Os valores de Odds Ratio (OR) e do intervalo de confiança (IC) a 95%. Fenótipos Lewis P OR IC 95% Le(a-b-) X Le(a+b-) 0,0118 15.165 0,8463 - 271.710 Le(a-b-) X Le(a+b+) 0,0001 36.460 2.152 - 617.680 Le(a+b-) X Le(a+b+) 0,0206 2.463 2.463 - 5.214 67 Tabela 4. Frequência dos fenótipos Lewis inferidos de acordo com os grupos reagente e não reagente Fenótipo Lewis Inferido Reagente % (n) Não reagente % (n) TOTAL % (n) Le(a+b-) 71,40 (30) 28,6 (12) 100,0 (42) Le(a+b+) 50,4 (68) 49,6 (67) 100,0 (135) Le(a-b-) 100,0 (18) 0,0 (0) 100,0 (18) 68 Conclusões 1. O sistema histo-sanguíneo Lewis está associado à infecção por T. gondii da cepa RH. 2. A combinação dos métodos de HAI e ELISA favore a definição dos grupos “reagentes” e “não reagentes” para anticorpos IgG anti –T. gondii da cepa RH. 3. A infecção por cepas RH do T. gondii é comum em gestantes da região noroeste paulista que apresentam sorologia reagente para a toxoplasmose. 4. A identificação das mutações G428A do gene FUT2, T202C e C314T do gene FUT3 constitui uma estratégia confiável para inferir os fenótipos Lewis em ambos os grupos. 5. O fenótipo Lewis negativo [Le(a-b-)] está associado ao maior risco para a infecção por cepas RH de T. gondii, enquanto os fenótipos Le(a+b-) e Le(a+b+) apresentam menor risco de infecção por cepas RH de T. gondii. 6. O processo de fucosilação controlado pelos genes FUT2 e FUT3 reduz o risco de infecção por cepas RH de T. gondii. 69 Referências Gerais ABBAS, A. K; LICHTMAN, A. H; PILLAIS, S. Imunidade aos Microrganismos. 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