UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS Staphylococcus aureus ISOLADOS EM DIFERENTES PONTOS DO FLUXOGRAMA DE PRODUÇÃO DO LEITE Viviane de Souza Médica Veterinária JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Julho de 2010 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS Staphylococcus aureus ISOLADOS EM DIFERENTES PONTOS DO FLUXOGRAMA DE PRODUÇÃO DO LEITE Viviane de Souza Orientador: Prof. Dr. Antonio Nader Filho Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva) JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Julho de 2010 Souza, Viviane de S719e Epidemiologia molecular dos Staphylococcus aureus isolados em diferentes pontos do fluxograma de produção do leite / Viviane de Souza. – – Jaboticabal, 2010 ix, 63 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2010 Orientador: Antonio Nader Filho Banca examinadora: Luciano Menezes Ferreira, Luiz Francisco Zafalon, Oswaldo Durival Rossi Junior, Angela Cleusa de Fátima Banzatto de Carvalho Bibliografia 1. Staphylococcus aureus. 2. Epidemiologia molecular. 3. Mastite. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 637.1:616-036.22 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR VIVIANE DE SOUZA – nascida na cidade de Uberaba – Minas Gerais, em 18 de Julho de 1979. Médica Veterinária, formada pela Universidade Federal de Uberlândia, no ano de 2003. Realizou estágio na Embrapa Gado de Leite, onde acompanhou e executou atividades no Laboratório de Qualidade do Leite e Microbiologia. Em agosto de 2003 iniciou o Curso de Capacitação para Médicos Veterinários, Responsáveis Técnicos em estabelecimentos produtores de alimentos de origem animal e estagiou no Laboratório de Análises Físico-Químicas e Microbiológicas de Alimentos de Origem Animal e Água, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, FCAV, Unesp – Câmpus de Jaboticabal – SP. Ingressou no curso de pós- graduação desta Universidade, em 2004, e obteve título de Mestre em Medicina Veterinária, área de concentração em Medicina Veterinária Preventiva, em julho de 2006 com a dissertação intitulada “Características físico-químicas, microbiológicas, celulares e detecção de resíduos de antibióticos em amostras de leite de tanque comunitário”. Em 2005 concluiu o curso de Pós-graduação “Lato-Sensu” em Processamento e controle de qualidade em carne, leite, ovos e pescado, pela Universidade Federal de Lavras. Trabalhou como Fiscal Agropecuário no Instituto Mineiro de Agropecuária, na cidade de Sacramento - MG, por dois anos e oito meses. Em março de 2007, iniciou suas atividades no curso de Doutorado, no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, FCAV, Unesp – Câmpus de Jaboticabal – SP. Atualmente, trabalha nos Laticínios Scala, na cidade de Sacramento – MG. A todos vocês que compartilharam dos meus ideais! Dedico essa conquista com muita gratidão! Aos meus pais, Joel e Josina Às minhas irmãs Valéria e Vera Aos meus irmãos Joel e Joelcio Aos meus sobrinhos Thyago, Vítor e Lucas À minha sobrinha e afilhada Lorena A Deus, por sempre iluminar meu caminho AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Antonio Nader Filho, pela orientação e, principalmente, pela confiança e amizade. Minha eterna gratidão por todos os ensinamentos! Ao Prof. Dr. Oswaldo Durival Rossi Júnior, pelos ensinamentos e pelas sugestões que contribuíram para o aprimoramento deste trabalho. Ao Prof. Dr. Luciano Menezes Ferreira, ao Pesquisador Dr. Luiz Francisco Zafalon e à Prof. Dra. Angela Cleusa de Fátima Banzatto de Carvalho, pela participação na banca examinadora, e pelas valiosas sugestões para a conclusão do presente trabalho. Aos produtores rurais integrantes dos tanques comunitários da Gameleira – Sacramento-MG, por tornar possível a realização desta pesquisa. Às queridas amigas Poliana e Sandra... Vocês foram fundamentais na execução deste trabalho. Obrigada pela amizade! Aos amigos Fernanda, Bel e Flávio, pelo auxílio prestado durante o experimento. À Liliana Biondi Naka (Lila) e Waldemar Dibeli Júnior (Diba), pela amizade, conselhos e companheirismo. Saibam que tenho um carinho enorme por vocês! Ao Prof. Dr. Antônio Sérgio Ferraudo, pela realização das análises estatísticas. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Câmpus de Jaboticabal, pela oportunidade do curso de pós-graduação. Aos professores e funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal. Ao CNPq pela bolsa concedida e à FAPESP pelo auxílio financeiro. Às minhas eternas amigas Bruna Alexandrino, Fernanda Rezende, Natacha, Roberta e Thaís... Obrigada pela convivência e momentos descontraídos durante todos esses anos! A todos que contribuíram direta ou indiretamente na execução deste trabalho. i SUMÁRIO Página Lista de Tabelas .................................................................................................. iii Lista de Figuras ................................................................................................... v Lista de Quadros ................................................................................................. vi RESUMO ............................................................................................................. vii ABSTRACT ......................................................................................................... ix 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 2 3. OBJETIVOS........................................................................................................... 15 4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 16 4.1. Características das propriedades rurais e da população bovina .............. 16 4.2. Seleção dos animais ................................................................................. 19 4.3. Colheita das amostras ............................................................................... 19 4.3.1. Amostras dos óstios papilares ............................................................ 22 4.3.2. Amostras de leite dos quartos mamários ............................................ 22 4.3.3. Amostras dos insufladores da ordenhadeira mecânica ...................... 23 4.3.4. Amostras das superfícies internas dos latões, baldes, coadores e dos tanques de expansão comunitários e da tubulação utilizada para transvase do leite ................................................................................................ 23 4.3.5. Amostras de leite dos latões de cada propriedade e dos tanques de expansão comunitários ....................................................................................... 24 4.3.6. Amostras obtidas das mãos dos ordenhadores .................................. 25 4.3.7. Amostras de água das propriedades e da água utilizada para higienização dos tanques de expansão comunitários ......................................... 25 4.4. Exames laboratoriais ................................................................................ 26 ii 4.4.1. Isolamento e identificação das estirpes de estafilococos coagulase- positivos ............................................................................................................... 26 4.4.1.1. Teste da catalase ............................................................................. 26 4.4.1.2.Teste da coagulase livre em tubo ..................................................... 27 4.4.1.3. Teste de Voges-Proskauer ............................................................... 27 4.5. Caracterização molecular dos isolados ..................................................... 27 4.5.1. Extração de DNA ................................................................................. 28 4.5.2. Amplificação de Fragmentos de DNA Cromossômico ........................ 29 4.6. Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) ...................................... 31 4.7. Classificação dos pulsotipos ..................................................................... 33 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 34 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 51 7. CONCLUSÕES .................................................................................................... 52 8. REFERÊNCIAS ............................................................................................... 53 iii Lista de Tabelas Página Tabela 1. Pontos de colheita das amostras provenientes das seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 1, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 ................................................................................ 20 Tabela 2. Pontos de colheita das amostras provenientes das seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 2, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 ................................................................................ 21 Tabela 3. Distribuição das estipres de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem das amostras nas seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 1, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 ................................................................................ 36 Tabela 4. Distribuição das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem das amostras nas seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 2, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 .............................................................................. 38 iv Tabela 5. Distribuição das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem, entre as amostras provenientes das 12 propriedades estudadas, com os respectivos padrões de macrorrestrição do crDNA ......... 45 Tabela 6. Distribuição das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem, entre as amostras provenientes de cada propriedade estudada, com os respectivos padrões de macrorrestrição do crDNA ......... 48 v Lista de Figuras Página Figura 1. Eletroforograma da ATCC 25923, utilizada como cepa controle positivo nas análises moleculares para confirmação da espécie Staphylococcus aureus .............. 31 Figura 2. Eletroforogramas das amostras submetidas à análise molecular para confirmação das estirpes de Staphylococcus aureus ..................................................... 35 Figura 3. Exemplos de padrões de macrorrestrição do crDNA das estirpes de Staphylococcus aureus submetidas à Eletroforese em Gel de Campo Pulsado .......................... 42 Figura 4. Dendrograma gerado por análise computadorizada de perfis clonais do DNA de Staphylococcus aureus em Eletroforese em Gel de Campo Pulsado .......................... 43 vi Lista de Quadros Página Quadro 1. Características gerais das seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 1, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 ........................... 17 Quadro 2. Características gerais das seis propriedades rurais que entregavam leite no tanque de expansão comunitário 2, Sacramento-MG, janeiro a abril de 2009 ........................... 18 Quadro 3. Figuras da tubulação de PVC utilizada para auxiliar o transvase de leite no tanque de expansão comunitário 2 .. 24 Quadro 4. Sequência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para identificação da espécie de Staphylococcus aureus e os respectivos tamanhos dos fragmentos esperados ............. 30 vii EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS Staphylococcus aureus ISOLADOS EM DIFERENTES PONTOS DO FLUXOGRAMA DE PRODUÇÃO DO LEITE RESUMO – A mastite bovina é a principal doença do gado leiteiro em todo o mundo, devido a sua elevada ocorrência, aos prejuízos econômicos que acarreta aos produtores e à perda da qualidade do leite. Dentre os agentes da mastite, o Staphylococcus aureus é o mais frequentemente isolado. Sabe-se que o conhecimento do perfil molecular deste microrganismo é de fundamental importância para uma melhor compreensão dos estudos epidemiológicos de dispersão deste patógeno nas propriedades rurais. Sendo assim, durante o período de janeiro a abril de 2009, 222 vacas lactantes pertencentes a 12 propriedades rurais situadas no Município de Sacramento-MG foram submetidas ao California Mastitis Test (CMT). Foram colhidas amostras de leite dos quartos reagentes ao CMT, assim como do leite produzido em cada propriedade rural e do leite de conjunto das 12 propriedades contido em dois tanques de expansão comunitários. Paralelamente, foram colhidas, também, amostras dos óstios papilares, dos latões, dos baldes, dos coadores, dos insufladores das ordenhadeiras, das mãos dos ordenhadores, da superfície dos tanques de expansão, da tubulação auxiliar no transvase do leite, da água utilizada no processo de produção e da água utilizada para higienização dos tanques comunitários. A partir das 446 amostras colhidas nos diversos pontos, 244 estirpes foram isoladas e caracterizadas bioquimicamente como estafilococos coagulase-positivos. O fragmento de DNA cromossômico específico da espécie de S. aureus foi amplificado em 106 estirpes, das quais 103 foram submetidas à eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os pontos de colheita de amostras que apresentaram maior frequência de isolamento de estirpes de Staphylococcus aureus foram os óstios papilares (31,1%), o leite das vacas reagentes ao CMT (21,7%), os insufladores das ordenhadeiras mecânicas (21,7%), o leite dos latões (6,6%) e o leite contido nos tanques de expansão comunitários (5,6%). Neste estudo houve heterogeneidade genética entre as 103 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas, uma vez que foram identificados 32 pulsotipos diferentes, cujo pulsotipo 1 foi o que apresentou maior similaridade entre as estirpes isoladas nos viii diferentes pontos do fluxograma de produção do leite. A maior ocorrência de isolamentos do pulsotipo 1 das estirpes de Staphylococcus aureus foi observada nas amostras colhidas dos óstios papilares (10,6%), seguidas pelas amostras de leite das fêmeas reagentes ao CMT (5,8%) e insufladores das ordenhadeiras mecânicas (3,8%), evidenciando, portanto, a importância desses pontos no mecanismo de transmissão desses agentes nas propriedades estudadas. Palavras-chave: mastite, Staphylococcus aureus, tanque comunitário, PCR, PFGE. ix MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF Staphylococcus aureus ISOLATES AT DIFFERENT SITES IN THE MILK PRODUCTION FLOWCHART ABSTRACT- Bovine mastitis is a main disease in milk cattle worldwide. Staphylococcus aureus is the most frequently isolated among mastitis agents. The microorganism’s molecular profile is of paramount importance for a better understanding of epidemiologic studies of these pathogens on farms and ranches. Two hundred twenty-two cows on 12 farms in the municipality of Sacramento-MG, Brazil were tested by the California Mastitis Test (CMT) between January and April 2009. Milk samples were collected from four CMT reagents, from the milk produced on each farm and from milk collectively collected from the 12 farms and maintained in two community bulk tanks. At the same time samples of papillary ostia were collected from milk pails, cans, sieves, milking machine insufflators, milkers’ hands, from the water used on the 12 farms and from the two community bulk tanks. Two hundred and forty-four strains among the 446 samples collected from several sites were isolated and biochemically characterized as positive coagulase Staphylococcus. Chromosome DNA fragment, specific to S. aureus, was amplified in 106 strains. Further, when 103 S. aureus strains underwent pulsed field gel electrophoresis (PFGE), the samples’ collection sites with the highest isolation frequency of S. aureus strains were papillary ostia (31.1%), milk of cows which reacted to CMT (21.7%), the insufflators of milking machines (21.7%), milk in pails (6.6%) and milk in the community bulk tanks (5.6%). Since 32 different pulsotypes were identified, genetic heterogeneity existed among the 106 S. aureus isolated strains. Pulsotype 1 had the highest similarity among the S. aureus isolated strains at the different sites of the milk production flowchart. Since highest isolation frequency of pulsotype 1 of S. aureus strains were papillary ostia (10.6%), milk of cows which reacted to CMT (5.8%), the insufflators of milking machines (3.8%), the importance of the above sites for the transmission of the agent among the different properties under analysis is evident. Keywords: mastitis, Staphylococcus aureus, community bulk tank, PCR, PFGE. 1. INTRODUÇÃO O setor lácteo possui grande importância para o segmento agropecuário brasileiro. De acordo com o censo do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2006 existiam aproximadamente 1,34 milhões de propriedades produtoras de leite no país. Para aumentar a competitividade e incrementar ainda mais a demanda por produtos lácteos, o setor tem a missão de melhorar a qualidade da matéria-prima, ponto de extrema importância para o futuro da cadeia produtiva do leite no Brasil. Com a melhoria da qualidade, pode-se almejar crescimento ainda maior das exportações e a elevação do consumo no mercado interno (ALVIM et al., 2009). Considerando-se que o preenchimento de todos os critérios desejáveis de qualidade depende de um programa de saúde para o rebanho, baseado principalmente em medidas de prevenção e adoção de práticas de higiene adequadas, a mastite é considerada uma enfermidade de grande importância nos sistemas de exploração pecuária, principalmente devido aos prejuízos causados pela redução na produção de leite e pela baixa qualidade do leite produzido. Dentre os agentes etiológicos da mastite, o Staphylococcus aureus apresenta elevada prevalência nos rebanhos estudados. Sabe-se que o conhecimento do perfil molecular desses microrganismos é de fundamental importância para uma melhor compreensão dos estudos epidemiológicos de dispersão deste patógeno nas propriedades rurais, de modo a favorecer a elaboração de protocolos de profilaxia e controle das mastites. Diante das poucas informações disponíveis sobre a epidemiologia do Staphylococcus aureus em pequenas propriedades produtoras de leite no sistema de tanques de expansão comunitários, estudou-se 12 dessas propriedades situadas na região da Gameleira, Município de Sacramento-MG. 2 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. O cenário atual do setor lácteo O setor lácteo brasileiro avançou nos últimos anos em virtude da atuação dos distintos elos da cadeia produtiva do leite. Dentre os avanços alcançados, pode-se citar a granelização do leite, o pagamento pelo leite valorizando sólidos e qualidade, a Instrução Normativa nº 51 instituída pelo Ministério da Agricultura, em busca da melhoria da qualidade do leite e da rastreabilidade. Independentemente das mudanças que o setor lácteo brasileiro passou nos últimos anos, BARROS & SIMÃO FILHO (2009) enfatizam que diversos fatores precisam ser melhorados como: a redução da informalidade, consolidação e maior integração da indústria, ganhos de produtividade na fazenda, melhoria na qualidade do leite e maior acesso a outros mercados. Considerando que dentro desse novo cenário de modernização da colheita de leite, a palavra-chave é racionalização com otimização do processo, as indústrias captadoras de leite optam pelo fechamento ou cancelamento de linhas de leite deficitárias ou que geram baixa eficiência, especialmente aquelas mais distantes das fábricas ou de difícil acesso para os caminhões e compostas por produtores que apresentam pequena escala de produção (SANTOS & FONSECA, 2003). Sendo assim, no momento em que a Instrução Normativa nº 51 era discutida, falou-se que milhares de produtores poderiam sair da atividade por não terem condições de se ajustar à norma e encontrarem dificuldades em adquirir resfriadores individualmente, devido a seu alto custo. Para evitar esse problema, a norma criou a possibilidade dos mesmos resfriarem o leite em tanques comunitários (tanques em regime de condomínio), formando associações de produtores utilizando um único tanque de expansão o qual é instalado em uma propriedade e recebe leite de outras propriedades. Dessa forma, o investimento fica pulverizado entre vários pequenos produtores, o que viabiliza a permanência na atividade e reduz a comercialização do leite informal e a ocorrência do êxodo rural (RIBEIRO & TEIXEIRA, 2000). 3 De acordo com a Instrução Normativa nº 22 (BRASIL, 2009), o tanque comunitário deve ser instalado em local adequado, provido de paredes, cobertura, pavimentação, iluminação, ventilação e condições de acesso apropriadas, e ainda possuir ponto de água corrente de boa qualidade e local próprio para higienização das mãos, latões e demais utensílios. O tanque, os latões e demais utensílios devem ser higienizados logo após a entrega do leite, em local apropriado, utilizando água corrente de boa qualidade, detergentes, sanitizantes e utensílios de limpeza apropriados e específicos. Segundo BRITO et al. (2006), para que os produtores que fazem uso dos tanques comunitários atendam as exigências da Instrução Normativa nº 51 (BRASIL, 2002), é necessário maior atenção à higiene da ordenha, lavagem e limpeza dos utensílios e à qualidade da água. Além disso, devem ser adotadas medidas relacionadas à organização dos produtores como conscientização e treinamentos. 2.2. Considerações sobre a mastite bovina A mastite é considerada a doença que causa os maiores prejuízos à produção leiteira, devido à redução na quantidade e na qualidade do leite e derivados lácteos, custo com medicamentos, aumento da mão de obra e tempo de descarte do leite após o tratamento até a total eliminação dos resíduos de antibióticos utilizados (COSTA et al., 1999; SANTOS, 2003). Segundo BRITO (2009), a mastite continua a ser um dos maiores entraves para a melhoria da qualidade do leite no Brasil. Patógenos da mastite interferem na qualidade do leite porque invadem os tecidos e alteram os processos de síntese no interior da glândula mamária. Isso resulta em redução da produção e alterações na composição do leite. O leite de vaca com mastite apresenta teores de lactose, caseína, gordura, cálcio e fósforo menores que o leite normal. Ao mesmo tempo aumentam, de forma indesejável, os teores de cloreto, sódio, o potencial de rancificação e o número de células somáticas (BRITO et al., 2003). De acordo com a intensidade do processo inflamatório, as mastites são classificadas em clínica e subclínica. A mastite clínica caracteriza-se por modificações 4 visíveis no leite, como a presença de grumos de fibrina ou pus e, muitas vezes, alterações na glândula mamária como aumento de volume, presença de dor, aumento de temperatura e rubor. A mastite subclínica, por sua vez, não apresenta sinais clínicos evidentes. O leite apresenta aspecto macroscópico normal e não há sinais visíveis de inflamação do úbere, podendo ser detectada somente por provas indiretas com o leite, como o California Mastitis Test (CMT) (RADOSTITS et al., 2002). Levando-se em consideração as características do agente infeccioso há as mastites contagiosas e as ambientais. Nas mastites contagiosas, a fonte primária dos agentes é o próprio úbere das vacas infectadas, com seus respectivos quartos infectados. Nestes casos a disseminação no rebanho ocorre durante a ordenha, transmitindo-se o agente de um quarto mamário quando infectado para outros, pelas mãos dos ordenhadores, pelos panos ou esponjas de uso múltiplo ou copos das teteiras no processo de ordenha mecânica e outros fômites. Já nas mastites ambientais a fonte primária da infecção é essencialmente o ambiente onde a vaca é explorada. Neste caso a infecção ocorre com maior freqüência entre as ordenhas, pelas novas chances de contaminações externas à sala de ordenha (LANGONI, 2007). 2.2.1. Staphylococcus aureus As infecções intramamárias causadas por S. aureus apresentam implicações importantes em Saúde Pública, tendo em vista que toxinas podem ser excretadas no leite e permanecer estáveis nos produtos destinados aos consumidores (FAGUNDES & OLIVEIRA, 2004). Entre as características morfofisiológicas do S. aureus, destacam-se as seguintes: são cocos Gram-positivos, imóveis, anaeróbios facultativos, apresentando metabolismo fermentativo com produção de ácido e não gás, não fotossintético, não esporulado, catalase positivos, e capazes de multiplicar-se em meio com 10% de cloreto de sódio. São microrganismos mesófilos, com temperatura de desenvolvimento de 7 a 48ºC e ótima de 37°C, em pH na faixa de 4,0 a 10,0 (KLOOS & BANNERMAN, 1999). 5 O S. aureus é classificado entre os patógenos contagiosos, uma vez que a exposição de quartos mamários não infectados é geralmente limitada ao processo de ordenha (FOX & GAY, 1993; SMITH & HOGAN, 1993). A principal fonte de infecção são animais com quartos mamários infectados por S. aureus, além da pele do úbere e dos tetos contaminados, enquanto os bocais da ordenhadeira são considerados a principal via de transmissão da infecção (MYLLYS et al., 1997). A prevalência da mastite por S. aureus em rebanhos leiteiros ocorre devido à sua alta infectividade associada a fatores de virulência que conferem ao microrganismo a capacidade de se instalar no parênquima mamário, formar microabscessos, resistir à fagocitose e sobreviver no interior de fagócitos, restringindo, dessa forma, o acesso dos agentes antimicrobianos, mesmo quando administrados em concentrações terapêuticas (ARAÚJO & ANDRIOLI, 1996). BRITO et al. (1999) conduziram um estudo para definir os padrões de infecção intramamária de 48 rebanhos em propriedades de exploração leiteira do Estado de Minas Gerais, totalizando 6.315 amostras de leite de um total de 1.609 animais. Isolaram-se 3.919 microrganismos, sendo 3.637 de quartos mamários com infecção por um único agente e 283 de infecção mista. Detectaram S. aureus em 19,2% das amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação, o qual foi o patógeno primário mais frequentemente isolado, estando presente em 98% dos rebanhos estudados. BRITO et al. (2006) realizaram exames microbiológicos de 72 amostras de leite provenientes de 24 rebanhos, sendo que, S. aureus foi isolado em 82% das amostras. Visando avaliar a ocorrência e a etiologia da mastite subclínica, PEREIRA et al. (2007) estudaram 31 rebanhos leiteiros localizados na região Sul de Minas Gerais, nos quais 2.368 amostras de leite de vacas foram submetidas ao CMT. Os principais patógenos identificados foram estafilococos coagulase-positivos (35,6%) e os índices de mastite subclínica variaram de 18,6% até 89,7%, com 54,8% dos rebanhos analisados apresentando taxas superiores a 50%, e em 19,4% os índices foram superiores a 70%. 6 ZAFALON et al. (2008), em trabalho realizado em Nova Odessa-SP, isolaram S. aureus do leite, óstios e insufladores, porém não isolaram do leite do tanque de expansão, da água de lavagem dos insufladores e da oriunda das torneiras para a lavagem dos tetos. 2.2.2. Diagnóstico da mastite O diagnóstico da mastite clínica é realizado a partir da observação de alteração no leite utilizando a caneca de fundo escuro e presença de sinais da inflamação com dor, edema no úbere e redução na secreção do leite. No entanto, a mastite subclínica pode ser melhor caracterizada pelo aumento da Contagem de Células Somáticas, devido ao influxo de leucócitos, uma vez que o leite está aparentemente normal. A prova do California Mastitis Test (CMT), desenvolvida por SCHALM & NOORLANDER (1957) a partir do fenômeno de Whiteside, surgiu devido à necessidade de um teste rápido e eficiente, realizado a campo, para o diagnóstico da mastite subclínica. O CMT, apesar de ser subjetivo, tem a vantagem de ser utilizado ao pé da vaca, e estima o número de células somáticas no leite. Trata-se de um kit que consta de uma raquete com quatro receptáculos, onde são misturados aproximadamente 2 mL de leite com 2 mL de reagente. A ação do detergente aniônico é lisar os leucócitos liberando material genético (DNA) das células, ocorrendo viscosidade, que é proporcional ao número de células presentes na amostra de leite (LANGONI, 2007). A Contagem de Células Somáticas (CCS) é considerada um dos principais indicadores da qualidade do leite. Esta investigação pode ser efetuada diretamente no leite do tanque de expansão ou no leite de animais individualmente, com a colheita sendo realizada nos quartos glandulares separadamente (RUEGG, 2001). Alguns fatores podem influenciar os resultados da CCS no leite, como o estágio de lactação, sendo maiores as contagens tanto no início como no final da lactação, a idade do animal e o estresse, que também podem aumentar o número de células somáticas no leite (LANGONI, 2007). 7 Segundo esse mesmo autor, para a realização do diagnóstico microbiológico, as amostras de leite devem ser semeadas em meios de culturas seletivos, os quais permitem o isolamento dos principais patógenos envolvidos nas mastites. Compreende ainda, a caracterização bioquímica dos isolados, possibilitando a caracterização fenotípica e genotípica, bem como a realização do antibiograma. O cultivo de amostras de leite de vacas, individualmente, seguido de identificação bacteriana, pode ser realizado como parte da pesquisa para a presença de mastites nos rebanhos. Por detectar, especificamente, o quarto infectado, as amostras individuais são preferíveis, pois resultam em menor número de quartos a serem tratados (RADOSTITS et al., 2002). Porém, segundo ELIAS (2007), do ponto de vista prático e econômico, uma vez instituídos programas de controle, esse manejo apresenta-se pouco efetivo, pelo custo e mobilização de mão de obra para um número elevado de amostras, principalmente pela atual tendência dos produtores ao aumento do número de animais em lactação. Segundo SANTOS (2007), a análise do leite do tanque é uma ferramenta útil para avaliar a qualidade do leite e monitorar a saúde da glândula mamária nos rebanhos. Quando realizadas rotineiramente, estas análises, associadas a informações sobre práticas de manejo adotadas podem auxiliar na resolução de problemas de mastite e de qualidade do leite. A cultura do leite do tanque tem sido usada como um método de triagem para a presença de patógenos das mastites nos rebanhos. As principais vantagens dos métodos estão associadas ao menor custo, maior facilidade de colheita de amostras e redução do número de amostras a serem processadas. Em contrapartida, apresenta limitações como: ausência de um teste padrão para colheita e cultivo das amostras, que vão desde a forma da colheita até o número e a frequência de amostragens (ELIAS, 2007; SANTOS, 2007). 8 2.3. Caracterização molecular dos isolados de Staphylococcus aureus Do ponto de vista epidemiológico, é de grande importância a determinação da origem dos organismos envolvidos na etiologia da mastite bovina. Nesse contexto, a caracterização exata dos patógenos se faz imprescindível para a detecção das vias de transmissão e fontes de infecção, além de permitir o monitoramento da disseminação de estirpes bacterianas entre populações animais (LANGE et al., 1999). Segundo PRATA et al. (2006) deverá ser dada ênfase à caracterização molecular para a identificação correta das espécies de microrganismos envolvidos na mastite, assim como à identificação dos genes responsáveis pelos fatores de virulência dos principais patógenos, que fornecerão subsídios a estudos epidemiológicos e permitirão a rastreabilidade de tais patógenos ao longo da cadeia produtiva do leite. As limitações conferidas pelos métodos de cultivo levaram ao desenvolvimento de técnicas de reação em cadeia pela polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) para a identificação dos agentes etiológicos das mastites. A técnica propicia uma opção promissora para uma rápida identificação bacteriana pela utilização de sequências de DNA espécie-específicas. Além disso, as técnicas baseadas na PCR permitem a detecção de microrganismos mesmo em números reduzidos (FORSMAN et al., 1997; PHUEKTES et al., 2003). O desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia pela polimerase (PCR), propicia um método de detecção e identificação direta de patógenos (MEYER et al., 1991). A técnica de PCR apresenta três etapas: extração do ácido nucléico, sua amplificação e posterior visualização do produto. O desempenho satisfatório do método depende, entre outros, da escolha acertada dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) e da técnica utilizada na extração do ácido nucléico da amostra (COLLINS et al., 1994). FERREIRA (2008), em trabalho realizado em rebanho localizado em Nova Odessa-SP, caracterizou 245 estirpes de S. aureus, e observou que os isolamentos foram mais frequentes entre as amostras de leite (61,2%), seguidas pelo óstio papilar (26,4%) e insufladores (12,2%). 9 Segundo estudos de OLIVEIRA (2001), realizado em cinco propriedades leiteiras da região noroeste do Estado de São Paulo, o leite, foi também, o produto que apresentou a maior ocorrência (85,0%) de estirpes de S. aureus isoladas. No entanto, obteve somente 1,5% de isolamentos nos insufladores, enquanto que nenhuma estirpe foi isolada dos óstios papilares. FAGUNDES (2007) observou percentuais de 3,9% e 6,7% de S. aureus no leite individual nas regiões de São Carlos e Ribeirão Preto, respectivamente. Quanto ao leite de mistura, verificou-se que a ocorrência de S. aureus foi de 19% em ambas regiões. 2.4. Estudo epidemiológico-molecular de Staphylococcus aureus O objetivo dos estudos de genotipagem é fornecer evidências laboratoriais de que agentes etiológicos epidemiologicamente relacionados, ou seja, isolados durante um período determinado de tempo e em uma área geográfica específica, também seriam geneticamente relacionados e, assim, representariam uma mesma estirpe que se disseminou (TENOVER et al., 1995). Em relação à mastite bovina, a caracterização da diversidade genética dos S. aureus isolados de rebanhos leiteiros é fundamental para uma melhor compreensão do padrão de dispersão do patógeno. Tais informações podem auxiliar na elaboração de estratégias mais eficientes que visam à redução dos casos de infecção, uma vez que a partir dos perfis moleculares é possível inferir relações genéticas existentes entre os diferentes clones, detectar o fluxo gênico e traçar rotas de dispersão da infecção no rebanho (KAPUR et al., 1995). Segundo KAPUR et al. (1995), existe uma heterogeneidade genética considerável em populações naturais de S. aureus, a qual pode ser explorada para investigar a disseminação dos isolados de origem humana e animal. A dificuldade de erradicação deste agente infeccioso dos rebanhos leiteiros pode estar relacionada à infecção por clones altamente transmissíveis (SMITH et al., 1998). A associação entre os isolados de S. aureus provenientes de mastites e os locais de isolamento são de extrema importância epidemiológica. As linhas de ordenha são locais de intenso manejo, que podem propiciar condições de veiculação de patógenos 10 para a glândula mamária, especialmente S. aureus, caso sejam negligenciados os procedimentos de desinfecção dos equipamentos de ordenha e de higiene da glândula mamária durante a pré ordenha (SANTOS et al., 2003). Entre as técnicas de análise genotípica, a eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE) de fragmentos obtidos por macrorrestrição parece ser o método de maior sensibilidade, pois pode detectar variações genéticas entre isolados bacterianos filogeneticamente e epidemiologicamente relacionados, inclusive S. aureus (ZADOKS et al., 2002). Segundo TENOVER et al. (1995), a técnica de PFGE é uma ferramenta de tipagem de maior poder discriminatório para S. aureus, por detectar variações genéticas menores entre estirpes epidêmicas e é considerada um bom método para estabelecimento de relações clonais em estudos epidemiológico-moleculares. Na PFGE, padrões de restrição de genomas bacterianos completos são analisados e comparados. O cromossomo bacteriano é digerido por uma endonuclease de restrição de corte raro, com o objetivo de produzir um número moderado de fragmentos de DNA. Para proteger o DNA bacteriano de danos mecânicos, os microrganismos são imobilizados pela mistura da suspensão bacteriana em agarose fundida antes da lise celular. Os blocos contendo DNA purificado e digerido são inseridos em géis de agarose e os fragmentos do DNA separados por eletroforese em gel de campo pulsado, no qual a orientação do campo elétrico sofre alternância. Os perfis de restrição de DNA dos isolados são comparados para determinar a relação entre eles (LUKINMAA et al., 2004; TENOVER et al., 1997; TENOVER et al., 1995). Para cada espécie de microrganismos deve ser aplicada a enzima de restrição que melhor aponte as variações entre estirpes e, no caso de S. aureus, a enzima SmaI é a mais indicada (VAN BELKUM et al., 1998). A resolução da PFGE depende de vários fatores como: composição e concentração de agarose, solução tamponante, tensão da corrente elétrica (voltagem), tempo de pulso e tempo de corrida eletroforética. Outros fatores como grau de uniformidade, a força relativa dos campos elétricos, o ângulo entre os campos elétricos que se alternam de acordo com cada aparelho utilizado, a temperatura de corrida e 11 ainda, a integridade do DNA, também podem afetar o limite de resolução da técnica (MAGALHÃES et al., 2005). A interpretação dos resultados de PFGE é realizada de acordo com os critérios definidos por TENOVER et al. (1995), que consideram três classes de relação entre os isolados: isolados que apresentam até três bandas diferentes são considerados relacionados, isolados apresentando de quatro a seis bandas diferentes são classificados como possíveis relacionados e os isolados que apresentam sete ou mais bandas diferentes são considerados não relacionados. Segundo TENOVER et al. (1995), a relação de similaridade entre dois isolados pode ser estimada com base nos critérios de interpretação para os padrões de fragmentos de bandas, produzidos pela digestão do DNA cromossômico com a enzima SmaI. Dois isolados são considerados geneticamente idênticos quando os padrões de fragmentos de restrição presentes em ambos os isolados apresentem o mesmo número de bandas com o mesmo peso molecular. A interpretação epidemiológica desses resultados é que os isolados são considerados derivados de uma mesma estirpe. As amostras são consideradas idênticas se mostrarem 100% de similaridade e são consideradas clonalmente relacionadas se apresentarem similaridade superior a 80%. O dendrograma ilustra relações filogenéticas e proporciona uma representação visual de linhagens, similaridades e diferenças genéticas entre grupos (SINGH et al., 2006). Segundo MAGALHÃES et al. (2005), a PFGE é uma técnica bastante complexa com um poder discriminatório muito elevado. É considerado padrão ouro em epidemiologia molecular, mas ressaltam, porém, que métodos de tipagem não substituem dados epidemiológicos, somente auxiliam e, se utilizados isoladamente, podem levar a conclusões equivocadas. FERREIRA (2008) submeteu 245 estirpes de S. aureus isoladas do leite de casos de mastite, dos óstios papilares e dos insufladores da ordenhadeira mecânica, à PFGE. Observou-se que houve a manutenção e a disseminação clonal dos pulsotipos identificados nas amostras analisadas. A análise de PFGE revelou 39 pulsotipos 12 distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Trabalho realizado por SANTOS (2009) identificou 32 perfis genéticos, agrupados em 12 linhagens, a partir dos 107 isolados de leite, material de insufladores, pele do úbere, mãos e fossas nasais de ordenhadores provenientes de 11 rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2.5. Medidas de controle da mastite O preenchimento de todos os critérios desejáveis de qualidade depende de um programa de saúde para o rebanho, baseado principalmente em medidas de prevenção, adoção de práticas de higiene adequadas antes, durante e após a ordenha, e de conservação e transporte do leite em condições de higiene e temperatura adequadas (BRITO & BRITO, 1998). Segundo LANGONI (2007), as medidas de controle estão relacionadas aos aspectos higiênicos referentes aos animais, às pessoas responsáveis pela ordenha, ao meio ambiente, especialmente estábulo e sala de ordenha. Os aspectos higiênicos relacionados à ordenhadeira, assim como os parâmetros de vácuo e o número de pulsações, também são extremamente importantes para o êxito de um programa de controle de mastites. Algumas práticas mais frequentemente recomendadas em programa de controle da mastite são: a higienização dos equipamentos de ordenha, o uso de antisséptico antes e após a ordenha (pré e pós-dipping), ordenha dos animais infectados por último, tratamento apropriado dos casos clínicos, antibioticoterapia dos casos subclínicos durante a secagem e descarte das vacas com mastites crônicas recidivantes (COSTA et al., 1999). Segundo MELO (2008), considerando-se a capacidade de estirpes de S. aureus formarem biofilmes e aderirem a diversas superfícies, principalmente de equipamentos e instalações no ambiente de ordenha, ressalta-se a importância da desinfecção e higiene adequada destes equipamentos para a eliminação desses agentes. 13 De acordo com MURRAY (1998), a fonte mais provável de contaminação primária de alimentos por S. aureus é o próprio ser humano que ao manusear os alimentos pode contaminar o produto cru, os equipamentos, e/ou o produto final. Segundo DINGWELL et al. (2004), um ponto crucial na profilaxia é a higiene do ordenhador. Suas mãos são o grande agente transmissor de bactérias para o úbere, o leite e todo o material utilizado durante o processo de obtenção do leite. Trabalho realizado por TONDO et al. (2000) examinando a contaminação por S. aureus em leite e derivados e sua relação com os isolados e as fontes de contaminação, verificaram ocorrência de 35,2% de S. aureus nos seres humanos, manipuladores dos alimentos. Em propriedades rurais destinadas à produção leiteira, a água também destaca- se como via de transmissão de agentes causadores de mastites. Segundo ADESIYUN et al. (1997) e AMARAL et al. (2004), a água utilizada em propriedades leiteiras pode ser importante veículo de microrganismos patogênicos para o leite e para a glândula mamária. Assim, existe a necessidade da desinfecção e controle de qualidade da água utilizada na produção de leite, com os objetivos de minimizar os riscos à saúde humana e animal. Um suprimento de água de boa qualidade para a lavagem dos utensílios (baldes, latões, tanque de refrigeração e equipamentos de ordenha), tetos das vacas e mãos dos ordenhadores, é essencial. Água com qualidade microbiológica não satisfatória, utilizada no processo de ordenha, tem sido indicada como um fator que pode influenciar tanto a qualidade microbiológica quanto a contagem de células somáticas do leite. A qualidade química da água também deve ser observada, pois muitas vezes a dureza da água afetará na ação dos detergentes empregados para limpeza (BRITO et al., 2003). AMARAL et al. (2003), ao analisarem 180 amostras de água pertencentes a 30 propriedades leiteiras situadas na região Nordeste do Estado de SP, observaram que o maior número de isolados de S. aureus ocorreu na água utilizada no local da ordenha. AMARAL et al. (2004) avaliaram o risco da qualidade da água na qualidade do leite e na saúde da glândula mamária de vacas de 30 propriedades do estado de São Paulo, analisando amostras de água das fontes de abastecimento, saída do 14 reservatório e do estábulo. Observou-se que 90% das amostras das fontes, 86,7% das oriundas dos reservatórios e 96,7% originadas dos estábulos estavam em desacordo com os padrões de potabilidade. S. aureus foram isolados na água nos três pontos de colheita, sendo que em 100% das amostras de água utilizada nos estábulos, esses microrganismos foram capazes de produzir enterotoxinas. Diante do exposto, idealizou-se o presente trabalho com a finalidade de atingir os objetivos que serão apresentados a seguir. 15 3. OBJETIVOS 3.1. Investigar a frequência de isolamento de estirpes de Staphylococcus aureus em amostras de leite das fêmeas reagentes ao CMT, no leite individual e de conjunto de 12 propriedades leiteiras e em diferentes pontos do fluxograma de produção. 3.2. Conhecer as características genotípicas das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas em diferentes pontos do fluxograma de produção do leite. 3.3. Estabelecer a relação epidemiológica existente entre as estirpes de Staphylococcus aureus isoladas, com vistas à localização e às vias de transmissão. 16 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Características das propriedades rurais e da população bovina Foram estudadas 12 propriedades rurais situadas na região da Gameleira, município de Sacramento-MG, entre as quais seis realizavam a ordenha manualmente, uma vez ao dia, e entregavam o leite no tanque de expansão comunitário 1. Em três das seis propriedades restantes, a ordenha era efetuada mecanicamente através do sistema “balde ao pé” duas vezes ao dia, e as demais realizavam a ordenha manualmente, uma vez ao dia. O leite oriundo dessas outras seis propriedades era entregue no tanque de expansão comunitário 2. A produção diária total do leite das seis propriedades, que entregavam leite no tanque comunitário 1 era de aproximadamente 200 L. Já a produção diária total do leite das outras propriedades, que entregavam leite no tanque comunitário 2, era de aproximadamente 700 L. O rebanho bovino nas propriedades era constituído em sua maioria por animais mestiços e a alimentação baseava-se em uma dieta composta por milho moído, farelo de soja, farelo de algodão, calcário calcítico, suplementos minerais, pastagens variadas e, ainda, silagem de milho. Muito embora o teste da caneca telada ou de fundo escuro seja amplamente difundido, uma vez que leite contendo grumos não pode ser incorporado ao leite de mistura, em nenhuma das propriedades objeto do presente estudo esta prática era realizada. Nos Quadros 1 e 2 estão dispostas as características gerais das propriedades, as quais foram avaliadas segundo os procedimentos e medidas higiênicas adotados durante o processo de obtenção do leite. 17 Q ua dr o 1. C ar ac te rí st ic as ge ra is da s se is pr op rie da de s ru ra is qu e en tr eg av am le ite no ta nq ue de ex pa ns ão co m un itá rio 1 , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. C ar ac te rí st ic as P ro pr ie da de s 1 2 3 4 5 6 N º an im ai s em la ct aç ão 12 09 16 17 06 08 N º an im ai s co m m as tit e cl ín ic a 0 0 0 0 0 0 R ea liz aç ão d e te st e de m as tit e cl ín ic a N ão N ão N ão N ão N ão N ão R ea liz aç ão C M T N ão N ão N ão N ão N ão N ão T ip o de o rd en ha M an ua l M an ua l M an ua l M an ua l M an ua l M an ua l P ré -d ip pi ng N ão N ão N ão N ão N ão N ão P ós -d ip pi ng N ão N ão N ão N ão N ão N ão N º an im ai s em la ct aç ão : va ca s le ite ira s em p ro du çã o; N º an im ai s co m m as tit e cl ín ic a: n úm er o de v ac as c om p re se nç a de g ru m os n o le ite n o m om en to d o te st e da c an ec a de f un do es cu ro in di ca nd o m as tit e cl ín ic a; F az t es te m as tit e cl ín ic a: u so p el a pr op rie da de d o te st e da c an ec a do f un do e sc ur o co m o ro tin a na o rd en ha ; F az te st e C M T : u so p el a pr op rie da de d o C al ifo rn ia m as tit is t es t pa ra d ia gn ós tic o de m as tit e su bc lín ic a no r eb an ho ; P ré -d ip pi ng : an tis se ps ia do s te to s at ra vé s da i m er sã o co m d es in fe ta nt e an te s da o rd en ha ; P ós -d ip pi ng : im er sã o do s te to s co m d es in fe ta nt e ap ós a o rd en ha . 18 Q ua dr o 2. C ar ac te rí st ic as g er ai s da s se is p ro pr ie da de s ru ra is q ue e nt re ga va m le ite n o ta nq ue d e ex pa ns ão co m un itá rio 2 , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. C ar ac te rí st ic as P ro pr ie da de s 1 2 3 4 5 6 N º an im ai s em la ct aç ão 40 15 22 32 18 27 N º an im ai s co m m as tit e cl ín ic a 0 0 0 1 0 0 R ea liz aç ão d e te st e de m as tit e cl ín ic a N ão N ão N ão N ão N ão N ão R ea liz aç ão C M T N ão N ão N ão N ão N ão N ão T ip o de o rd en ha M ec ân ic a ba ld e ao p é M ec ân ic a ba ld e ao p é M an ua l M ec ân ic a ba ld e ao p é M an ua l M an ua l P ré -d ip pi ng N ão S im N ão N ão N ão N ão P ós -d ip pi ng N ão N ão N ão N ão N ão N ão D es in fe cç ão te te ira s en tr e or de nh as N ão N ão - N ão - - N º an im ai s em la ct aç ão : va ca s le ite ira s em p ro du çã o; N º an im ai s co m m as tit e cl ín ic a: n úm er o de v ac as c om p re se nç a de g ru m os n o le ite n o m om en to d o te st e da c an ec a de f un do es cu ro in di ca nd o m as tit e cl ín ic a; F az t es te m as tit e cl ín ic a: u so p el a pr op rie da de d o t es te d a ca ne ca d o fu nd o pr et o co m o ro tin a na o rd en ha ; F az t es te C M T : us o pe la p ro pr ie da de d o C al ifo rn ia m as tit is t es t pa ra d ia gn ós tic o de m as tit e su bc lín ic a no r eb an ho ; P ré - di pp in g: a nt is se ps ia do s te to s at ra vé s da i m er sã o co m d es in fe ta nt e an te s da o rd en ha ; P ós - di pp in g: im er sã o do s te to s co m d es in fe ta nt e ap ós a o rd en ha ; D es in fe cç ão te te ira s en tr e or de nh as : p ro ce di m en to p ar a hi gi en iz aç ão d as te te ira s en tr e um a ni m al e o ut ro d ur an te a o rd en ha . 19 4.2. Seleção dos animais Durante o período de janeiro a abril de 2009, 222 vacas lactantes aparentemente sadias, pertencentes a 12 propriedades rurais, foram submetidas ao California Mastitis Test (CMT). O teste foi usado como triagem dos casos de mastite subclínica no rebanho, em que foram consideradas positivas as amostras de leite dos quartos mamários que apresentaram escore ≥ 1 ao CMT (SCHALM & NOORLANDER, 1957). Assim, foram colhidas amostras de leite dos animais reagentes ao CMT, exceto daqueles que estavam nos primeiros dez dias de lactação ou nos 30 dias anteriores a secagem, bem como das fêmeas que apresentavam mastite clínica. Para a realização do CMT, foram desprezados três jatos de leite e, em seguida, colhidos cerca de dois mililitros em cada um dos quatro compartimentos circulares da bandeja plástica. Depois do escoamento do excesso de leite efetuado por inclinação da bandeja, foi adicionada em cada compartimento, igual quantidade do reagente, tendo- se o cuidado de evitar a formação de espuma. A homogeneização foi efetuada por meio de movimentos circulares e uniformes, durante 10 a 15 segundos, quando realizavam- se as leituras e a interpretação da prova (SCHALM & NOORLANDER, 1957). Assim, foram consideradas positivas as misturas (leite + reagente) que apresentaram evidente formação de gel viscoso, acompanhadas ou não pela coloração violeta, e negativas as misturas que permaneceram inalteradas, ou seja, sem a clara evidenciação de viscosidade (HIPOLITO et al., 1965). 4.3. Colheita das amostras As tabelas 1 e 2 mostram a distribuição dos pontos de colheita das 446 amostras obtidas nas 12 propriedades rurais, de acordo com dois tanques de expansão comunitários objetos desta investigação. 20 T ab el a 1. P on to s de c ol he ita da s am os tr as p ro ve ni en te s da s se is p ro pr ie da de s ru ra is q ue e nt re ga va m le ite n o ta nq ue d e ex pa ns ão c om un itá rio 1 , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. Pr op Le ite Ós tio La tõe s L im po s Ba lde s Co ad ore s Le ite do lat ão Le ite do Ta nq ue Co mu nit ár io Mã os do s Or de nh ad or es Ág ua da s Pr op rie da de s Ág ua T an qu e Co mu nit ár io Su pe rfí fic ie do Ta nq ue Co mu nit ár io To tal n n n n n n n n n n n 1 14 14 1 1 1 1 1 2 2 1 3 41 2 10 10 1 1 1 1 1 2 2 1 - 30 3 10 10 1 1 1 2 2 - 3 1 - 31 4 11 11 1 1 1 1 1 2 4 1 2 36 5 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 1 14 6 - - 1 1 1 1 1 2 1 1 - 9 To tal 47 47 6 6 6 7 7 10 13 6 6 16 1 (- ) S em c ol he ita d e am os tr as . 21 T ab el a 2. P on to s de c ol he ita d as a m os tr as p ro ve ni en te s da s se is pr op rie da de s ru ra is q ue e nt re ga va m le ite n o ta nq ue d e ex pa ns ão c om un itá rio 2 , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. (-) S em c ol he ita de a m os tra s. Pr op Le ite Ó st io In su fla do re s an te s da or de nh a In su fla do re s ap ós a or de nh a La tõ es L im po s Su pe rfí fic ie da Tu bu la çã o Le ite do la tã o Le ite d o Ta nq ue Co m un itá rio M ão s do s O rd en ha do re s Ág ua d as Pr op rie da de s Ág ua T an qu e Co m un itá rio Co ad or es Ba ld es To ta l n n n n n n n N n n n n n 1 20 20 20 20 4 6 1 1 2 2 1 - - 97 2 21 21 16 16 4 - 1 1 2 2 - 1 - 85 3 2 2 - - 4 - 1 1 2 2 1 1 1 17 4 11 11 16 16 5 - 1 1 2 2 1 1 - 67 5 - - - - 1 - 2 1 2 2 - 1 1 10 6 - - - - 1 - 2 1 2 1 - 1 1 9 To ta l 54 54 52 52 19 6 8 6 12 11 3 5 3 28 5 22 4.3.1. Amostras dos óstios papilares Foram colhidas amostras dos óstios papilares dos quartos das fêmeas reagentes ao CMT, utilizando-se, para tanto, suabes estéreis acondicionados em tubos contendo água peptonada a 0,1%. Assim, os suabes eram friccionados sobre o óstio papilar, em movimentos circulares e posteriormente mergulhados nos respectivos tubos (INGAWA et al., 1992). Todos os suabes utilizados durante o experimento foram adquiridos prontos – swab sampler com água peptonada tamponada 3MTM. Em seguida, estas amostras foram acondicionadas em caixa de material isotérmico contendo gelo e levadas, para isolamento e identificação bacteriana, ao Laboratório de Análises de Alimentos de Origem Animal e Água do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Câmpus de Jaboticabal-SP, UNESP. 4.3.2. Amostras de leite dos quartos mamários As amostras foram colhidas de acordo com os procedimentos recomendados pelo National Mastitis Council (HARMON et al., 1990). Após a limpeza do óstio papilar com álcool etílico 70% (v/v) utilizou-se tubos de ensaio esterilizados para acondicionamento das amostras individuais de 2 a 5 mL de leite, de cada quarto mamário, antes do início da ordenha. Estas amostras foram acondicionadas em caixa de material isotérmico contendo gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação bacteriana. 23 4.3.3. Amostras dos insufladores da ordenhadeira mecânica Nas três propriedades que possuíam ordenhadeira mecânica, antes do início e ao final da ordenha, suabes estéreis acondicionados em tubos contendo água peptonada a 0,1% foram friccionados em movimentos circulares na porção final de cada um dos insufladores em todos os conjuntos de ordenhadeiras, conforme recomendação de McDONALD et al. (1993). Os suabes acondicionados em tubos contendo água peptonada a 0,1% foram transportados em caixa de material isotérmico contendo gelo e levados ao laboratório para isolamento e identificação bacteriana. 4.3.4. Amostras das superfícies internas dos latões, baldes, coadores e dos tanques de expansão comunitários e da tubulação utilizada para transvase do leite Suabes acondicionados em tubos contendo água peptonada a 0,1% foram friccionados nas superfícies internas dos latões higienizados, utilizados para acondicionamento do leite até o momento da entrega nos tanques de expansão comunitários, nos baldes, nos coadores e na superfície de um tanque de expansão comunitário higienizado (antes do transvase do leite) e na superfície da tubulação higienizada (PVC), utilizada para auxiliar o transvase de leite no tanque de expansão comunitário 2 (Quadro 3). Posteriormente os suabes foram mergulhados nos respectivos tubos e foram acondicionados em caixa de material isotérmico contendo gelo e levados ao laboratório para isolamento e identificação bacteriana. 24 Quadro 3. Figuras da tubulação de PVC utilizada para auxiliar o transvase de leite no tanque de expansão comunitário 2. 4.3.5. Amostras de leite dos latões de cada propriedade e dos tanques de expansão comunitários Para a colheita das amostras de leite oriundas dos tanques de expansão comunitários, realizou-se a homogeneização do leite do tanque acionando-se o agitador por um tempo mínimo de cinco minutos. Após a homogeneização, um volume de 20 mL foi retirado com o auxílio de uma concha esterilizada, da parte superior e central do tanque, e acondicionado em frasco de vidro esterilizado (BRITO et al., 1998). Todas as amostras foram acondicionadas em caixa de material isotérmico contendo gelo e levadas ao laboratório para isolamento e identificação bacteriana. 25 4.3.6. Amostras obtidas das mãos dos ordenhadores Suabes estéreis mergulhados em água peptonada a 0,1% foram passados nos espaços interdigitais, nos espaços subungueais e sobre as palmas das mãos dos ordenhadores, e posteriormente mergulhados nos respectivos tubos. Somente em uma das 12 propriedades não foi possível a obtenção de amostras das mãos do ordenhador. Os suabes acondicionados em água peptonada a 0,1% foram transportados em caixa de material isotérmico contendo gelo e levados ao laboratório para isolamento e identificação bacteriana. 4.3.7. Amostras de água das propriedades e da água utilizada para higienização dos tanques de expansão comunitários As amostras de água foram colhidas diretamente das torneiras e mangueiras existentes nas salas de ordenha, após o escoamento por três minutos, assim como nos reservatórios das propriedades e nas salas onde os tanques de expansão comunitários estavam instalados, com os devidos cuidados de assepsia, em frascos de vidro esterilizados, em quantidade aproximada de 400 mL (APHA, 2001). As amostras foram diluídas, quando necessário, até a diluição 10-3 e submetidas à técnica de membrana filtrante (membrana Schleicher e Schuell de 0,45 µ e 47 mm de diâmetro, ref. nº 1794-0) em sistema de filtro acoplado em kitasato conectado à bomba de vácuo. Inicialmente foram filtrados 10 mL da amostra diluída e posteriormente 10 mL da amostra pura. Entre cada amostra foram filtrados 100 mL de água destilada estéril (APHA, 2001). Para cada amostra foi utilizado uma membrana, a qual foi colocada em placa de petri contendo ágar Baird-Parker. As colônias suspeitas foram avaliadas segundo suas características morfológicas e tintoriais (Mac FADDIN, 1976). 26 4.4. Exames laboratoriais 4.4.1. Isolamento e identificação das estirpes de estafilococos coagulase- positivos As amostras obtidas do leite provenientes dos quartos mamários das fêmeas reagentes ao CMT e as amostras de leite obtidas nos latões das propriedades e nos tanques comunitários, foram semeadas diretamente em placas de petri, contendo ágar Baird-Parker com auxílio de alça de semeadura e incubadas a 37°C por 24 a 48 horas. As amostras oriundas dos óstios papilares, dos insufladores dos conjuntos de ordenha, dos latões, dos baldes, dos coadores, da superfície da tubulação e das mãos dos ordenhadores foram semeadas em ágar Baird-Parker com os suabes utilizados nas colheitas e incubadas a 37°C por 24 a 48 horas. A seguir, 3 a 5 colônias foram semeadas em tubos com ágar nutriente inclinado e incubadas a 37°C por 24 horas. Após, foram preparados esfregaços corados pelo método de Gram e as culturas apresentadas em forma de cocos Gram-positivos e agrupados sob a forma de cachos de uva foram submetidas às provas de catalase, da coagulase livre e de produção de acetoína (VP) (Mac FADDIN, 1976). 4.4.1.1. Teste da catalase Após 24 h de cultivo em ágar nutriente, com uma alça bacteriológica flambada, retirou-se uma determinada quantidade de cultivo de Staphylococcus spp. Logo após foi feito um esfregaço em uma lâmina de vidro limpa, adicionando-se uma gota de água oxigenada (H2O2) a 3% sobre os microrganismos na lâmina. As estirpes que apresentaram imediato borbulhamento (liberação de gás) foram consideradas positivas (Mac FADDIN, 1976). 27 4.4.1.2. Teste da coagulase livre em tubo Para a execução da prova de coagulase, as estirpes foram semeadas em tubos contendo caldo de infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion - BHI), e incubadas a 35°C por 24 horas. Em seqüência acrescentaram-se, em tubos de ensaio (10 x 70 mm), 0,3 mL desta cultura e 0,5 mL de plasma de coelho diluído a 1:5 em solução de cloreto de sódio a 0,85% esterilizada. Após agitação, os tubos foram incubados em banho-maria a 37ºC e as leituras realizadas após 1, 2, 3, 4 e 24 horas. O resultado foi considerado positivo quando ocorria coagulação do plasma (GARCIA et al.,1980). No presente trabalho, os microrganismos isolados que não provocaram coagulação do plasma de coelho não foram submetidos às demais provas de identificação para S. aureus, apesar da possibilidade, segundo SOUTO (2006), de isolados de S. aureus de infecções intramamárias apresentarem características bioquímicas atípicas, não demonstrando comportamento bioquímico clássico, como por exemplo, reação de coagulase positiva. 4.4.1.3. Teste de Voges-Proskauer Para verificar a produção da acetoína a partir da glicose, as estirpes de estafilococos foram inoculadas em tubos contendo caldo de cultivo MRVP (Methyl-red Voges-Proskauer Broth) e incubadas à 37 °C por 48 h. Em seguida, foi adicionada 0,6 mL de uma solução de alfa-naftol a 5% e 0,2 mL de solução de hidróxido de potássio a 40% (reativo de Barrit) em cada tubo. Após agitação foi feita a leitura, sendo considerados positivos os tubos em que a cultura apresentou a coloração vermelha após 15 min (Mac FADDIN, 1976). 28 4.5. Caracterização molecular dos isolados A caracterização molecular dos isolados foi realizada em todas as estirpes que apresentaram-se como cocos Gram-positivos, agrupados sob a forma de “cachos de uva” e que se mostraram positivas nos testes da catalase, da coagulase e de Voges- Proskauer. 4.5.1. Extração de DNA Para a extração de DNA das estirpes isoladas utilizou-se o Kit Invitek®, – Extração de Material Genômico, que continha o protocolo de extração de DNA para bactérias Gram-positivas, as soluções de lise, de extração e de lavagem e colunas de purificação. Foi centrifugado 1,5 mL de cultura em caldo BHI (37°C/18h a 24h) a 10.000 rpm por 3 min e 30 s. Em seguida, todo o sobrenadante foi descartado em solução de hipoclorito de sódio. O precipitado foi ressuspendido em 400 µL de Ressuspension Buffer R, transferido para o Extration Tube L e incubado a 37°C por 10 min, sob constante agitação. Posteriormente, a amostra foi incubada a 65°C por 10 min e por fim incubada a 95°C por 5–10 min sobre constante agitação. Para manter as amostras sobre agitação constante utilizou-se Thermomixer compact. Foi adicionado à amostra 400 µL de Binding Buffer B6, homogeneizou-se e em seguida todo o conteúdo do Extration Tube L foi transferido para o RTA Spin Filter Set, incubada a temperatura ambiente por 1 min e centrifugada a 12.000 rpm por 1 min e 30 s, com posterior descarte do filtrado. Ao RTA Spin Filter Set foi adicionado 500 µL de Wash Buffer I. Posteriormente a amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 1 min e 30 s. O filtrado foi descartado juntamente com o tubo, sendo que o RTA Spin Filter Set foi colocado em um novo tubo RTA Receiver. 29 Ao RTA Spin Filter Set foi adicionado 600 µL de Wash Buffer II e posteriormente a amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 1 min e 30 s. Após o descarte do filtrado, a amostra foi novamente centrifugada para prover total eliminação do Wash Buffer II, a 13.200 rpm por 3 min e 30 s, sendo o filtrado descartado juntamente com o tubo. O RTA Spin Filter Set foi colocado em um RTA Receiver de 1,5 mL. Ao RTA Spin Filter Set foi adicionado 200 µL do Elution Buffer D, previamente aquecido a 56°C. A amostra foi incubada a temperatura ambiente por 1 min, e em seguida, centrifugada a 8.000 rpm por 1 min e 30 s. O filtrado continha o material genético desejado, sendo armazenado em freezer -20°C até o momento da utilização nas reações de PCR. 4.5.2. Amplificação de Fragmentos de DNA Cromossômico A caracterização molecular dos Staphylococcus aureus foi efetuada a partir da amplificação de fragmentos de DNA cromossômico específico para estes microrganismos, de acordo com o protocolo descrito por MARTINEAU et al. (1998). Desse modo, apenas as estirpes identificadas genotipicamente por esta técnica como sendo desta espécie foram submetidas aos testes seguintes. As reações compreenderam volume final de 20 L contendo 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 M de cada oligonucleotídeo iniciador Sa442-1 (5’- AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG- 3’) e Sa442-2 (5’- CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA- 3’), e 0,5 U de Taq polimerase em amplificação do tipo host-start. As misturas de PCR foram submetidas à desnaturação, por 3 min, a 94C e, posteriormente, a 30 ciclos de 1 s, a 95C, para desnaturação e 30 s, a 55C, para pareamento e extensão dos oligonucleotídeos iniciadores. O produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose, em cuba horizontal. Sendo assim, 10 µL do produto amplificado foram aplicados em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo a uma concentração de 50 µL/L e submetido à corrida eletroforética a 120 V por 90 min. Utilizou-se marcador de peso 30 molecular de 100 pares de bases (pb) (Invitrogen, Brasil), disposto no gel juntamente com todas as amostras analisadas em cada eletroforese, como padrão para o tamanho das bandas de DNA formadas. O tamanho dos segmentos amplificados era de 108 pb. O produto de eletroforese foi visualizado em aparelho fotodocumentador Gel Doc 2000 – BioRad. Foram tomados os devidos cuidados para evitar-se a contaminação de utensílios e equipamentos de laboratório com o material genético. As amostras foram extraídas, amplificadas e visualizadas na mesma sequência. A inclusão de um controle negativo foi realizada durante todo o procedimento, para prevenir riscos de resultados falsos positivos em todas as reações. Foi utilizada a ATCC 25923 como cepa controle positiva de S. aureus em todas as reações. Quadro 4. Sequência de oligonucleotídeos iniciadores (Invitrogen, Brasil) utilizados para identificação da espécie de Staphylococcus aureus e os respectivos tamanhos dos fragmentos esperados (MARTINEAU et al., 1998) Primers Sequência Tamanho do fragmento esperado - pares de bases Sa442-1 5’-AATCTTTGTCGGTACACGATATTCTTCACG-3’ Sa442-2 5’-CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA-3’ 108 pb 31 Figura 1. Eletroforograma da ATCC 25923, utilizada como cepa controle positivo nas análises moleculares para confirmação da espécie S. aureus; PM: Marcador de Peso Molecular Ladder 100 (Invitrogen®); C.P.: Controle positivo (utilização de DNA da ATCC 25923); C.N.: Controle Negativo (utilização de água Mili-Q estéril e filtrada) 4.6. Eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed-Field Gel Electrophoresis – PFGE) De acordo com o protocolo estabelecido por McDOUGAL et al. (2003), uma alçada de cultura pura de S. aureus estocada em BHI e mantida sob refrigeração foi semeada em 5 mL de caldo THB (Todd-Hewitt Broth) e incubados em agitação vigorosa a 35-37°C por 18-24 h. O ajuste da concentração bacteriana foi feito em espectrofotômetro com a adição de salina e absorbância de 0,9 a 1,1 com comprimento de onda de 610 nm. Duzentos microlitros da suspensão bacteriana foram centrifugados a 12.000 rpm por 2 a 4 min, e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi ressuspendido em 300 µL de tampão TE (10mM Tris HCl, 1 mM EDTA [pH 8,0]) e equilibrado em banho-maria 108 pb  PM CP CP CP CP CN 32 a 37°C por 10 min. Foram utilizados, para a lise celular, 40 µL de solução de lisostafina (1 mg/mL em 20 mM de acetato de sódio) e, acrescidos à suspensão bacteriana, 300 µL de solução 20% de agarose low-melting (em tampão TE), gentilmente homogeneizados e dispostos nos moldes para a confecção dos blocos. A solidificação da mistura foi realizada em temperatura ambiente por 10 min ou em refrigerador a 4°C por 5 min. Em seguida, os blocos foram removidos dos moldes e adicionados em tubos contendo 3 mL de tampão de lise EC (6 mM Tris HCl, 1 M NaCl, 100 mM EDTA, 0,5% Brij-58, 0,2% de deoxicolato de sódio, 0,5% de lauroylsarcosine, pH 8,0) e incubados a 37°C por, no mínimo, 4 h. Posteriormente, o tampão de lise EC foi descartado e adicionados 4 mL de tampão TE, incubando a 37°C por 30 min, e esta troca repetida, no mínimo, mais três vezes. Até posterior utilização para a digestão restritiva com enzima SmaI, que cliva o DNA cromossômico no local de restrição CCC-GGG, os blocos foram armazenados a 4°C. Para a digestão restritiva com SmaI, foi transferido um bloco para novo tubo de ensaio com 200 µL de tampão de restrição 1x, para equilíbrio do bloco, e incubados a 30°C por, pelo menos, 30 min. Após a remoção deste tampão, foram acrescidos 200 µL de reação, desta vez com 5 µL da enzima SmaI, em cada tubo, com incubação a 30°C por 4 h. Após a solidificação do gel de agarose de grau cromossomal (cromosomal grade agarose, BioRad) a 1% preparado em tampão 0,5x TBE, os blocos foram introduzidos diretamente nos poços formados com a retirada do pente que acompanha o aparelho. Para a vedagem, foi utilizada a mesma agarose equilibrada a, aproximadamente, 56°C, com a finalidade de impedir que os blocos saiam dos poços. A eletroforese foi executada com célula de eletroforese CHEF-DR III (BioRad, Melville, N. Y.) e, como padrão, foi utilizado DNA do bacteriófago λ, que serviu como controle dos parâmetros de corrida das unidades CHEF-DR. Os padrões de corrida foram os seguintes: pulso inicial, 5 s; pulso final, 40 s; voltagem, 200 V ou 6 V/cm; tempo, 21 h; e temperatura, 14°C. 33 Para que os fragmentos de DNA fossem corados, os géis foram colocados, sob imersão, em 100 µL de tampão TE com 1,5 µL de brometo de etídio, por 45 min. Em seguida foram descorados em água destilada, por 25 min, e fotografados posteriormente para a visualização dos diferentes pulsotipos no sistema de fotodocumentação GelDoc® (BioRad). 4.7. Classificação dos pulsotipos A classificação dos pulsotipos em grupos foi gerada pelo dendrograma resultante da análise de agrupamento por método hierárquico utilizando como medida de semelhança entre os pulsotipos o coeficiente de Jaccard e a ligação dos grupos pelo método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages) (SNEATH & SOKAL, 1973). O software STATISTICA versão 7 foi utilizado no processamento da análise de agrupamento. As análises foram realizadas no Departamento de Ciências Exatas da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Câmpus de Jaboticabal-SP, UNESP. 34 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Isolamento e identificação das estirpes de estafilococos coagulase- positivos de acordo com pontos de colheita das amostras Das 446 amostras colhidas nos diversos pontos do fluxograma do leite, foram isoladas e identificadas 244 estirpes de estafilococos coagulase-positivos, as quais foram submetidas à amplificação de fragmentos de DNA Cromossômico específico da espécie de S. aureus. 5.2. Amplificação de Fragmentos de DNA Cromossômico Entre as 244 estirpes de estafilococos coagulase-positivos, o fragmento de DNA cromossômico específico da espécie de S. aureus foi amplificado em 106 amostras. Os produtos da reação de amplificação de algumas amostras submetidas à análise molecular para confirmação das estirpes de Staphylococcus aureus estão apresentados na Figura 2. A distribuição das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem das amostras, estão apresentadas nas Tabelas 3 e 4. 35 Figura 2. Eletroforogramas gerado de amostras submetidas à análise molecular para confirmação das estirpes de Staphylococcus aureus. PM: Marcador de Peso Molecular Ladder 100 (Invitrogen®) C.P.: Controle positivo (utilização de DNA da ATCC 25923) C.N.: Controle Negativo (utilização de água Mili-Q estéril e filtrada) 108 pb  108 pb PM PM 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 CP CN PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 36 T ab el a 3. D is tr ib ui çã o da s es tir pe s de S ta ph yl oc oc cu s au re u s is ol ad as d e ac or do c om a o rig em d as a m os tr as , n as s ei s pr op rie da de s ru ra is q ue e nt re ga va m l ei te n o ta nq ue d e ex pa ns ão c om un itá rio 1 , S ac ra m en to -M G , ja ne iro a ab ril de 2 00 9. P ro p. Le ite Ó st io La tõ es B al de s C oa do re s Le ite d o la tã o Le ite d o T an qu e C om un itá rio M ão s do s or de nh ad or es Á gu a da s pr op rie da de s Á gu a do T an qu e C om un itá rio S up er fíc ie T an qu e C om un itá rio T ot al n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % 1 3 8, 0 7 19 ,0 - - - - - - 1 2, 7 1 2, 7 1 2, 7 - - - - - - 13 35 ,1 2 2 5, 4 2 5, 4 - - - - - - 1 2, 7 - - - - - - - - - - 5 13 ,5 3 5 13 ,5 1 2, 7 - - - - - - 1 2, 7 1 2, 7 - - - - - - - - 8 21 ,7 4 - - 5 13 ,5 - - 1 2, 7 - - 1 2, 7 1 2, 7 - - - - - - - - 8 21 ,7 5 1 2, 7 1 2, 7 - - - - - - - - 1 2, 7 - - - - - - - - 3 8, 0 6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - T ot al 11 29 ,6 16 43 ,3 - - 1 2, 7 - - 4 10 ,8 4 10 ,8 1 2, 7 - - - - - - 37 10 0, 0 37 Na Tabela 3, observa-se que as estirpes de S. aureus obtidas dos óstios papilares e do leite das fêmeas reagentes ao CMT foram os locais que apresentaram o maior número de isolados, com 16 (43,3%) e 11 (29,6%) estirpes, respectivamente. Considerando-se que os S. aureus são patógenos contagiosos, cujos principais sítios de localização nos animais são representados pelo leite dos quartos infectados e superfícies da pele do úbere e do teto, e que a transmissão desses microrganismos ocorre usualmente entre as vacas durante a ordenha, os dados inseridos nesta Tabela, evidenciam, portanto, que a realização correta da antissepsia dos tetos antes da ordenha é de fundamental importância. Os dados da Tabela 3, mostram que na propriedade 1, houve o isolamento de uma (2,7%) estirpe de S. aureus nas mãos do ordenhador. Considerando-se que nessa propriedade a ordenha era realizada manualmente, esse achado ratifica a importância da higienização das mãos, diante da possibilidade de constituírem-se em uma importante via de contaminação e transmissão de S. aureus durante o processo de obtenção do leite. Observa-se ainda, que houve a presença de S. aureus em quatro (10,8%) amostras de leite do latão das propriedades. Esses microrganismos foram também isolados em quatro (10,8%) amostras do leite de conjunto contido no tanque comunitário. Este achado talvez possa ser atribuído às precárias condições higiênicas dos baldes, latões e coadores utilizados na obtenção do leite que certamente influenciaram na qualidade microbiológica deste produto, independentemente da provável ocorrência de falhas nos procedimentos de higienização do tanque comunitário. Acrescenta-se ao exposto, a possibilidade da ocorrência de contaminações por estes microrganismos ao longo do trajeto do leite, desde sua obtenção até o momento em que foi colocado no tanque comunitário. Neste sentido, PHILPOT & NICKERSON (2002) assinalam que a inadequada limpeza do tanque de expansão assim como dos utensílios auxiliares utilizados na obtenção do leite, pode levar ao acúmulo de resíduos no leite em suas superfícies, de modo a servir de substrato para a multiplicação bacteriana. 38 T ab el a 4. D is tr ib ui çã o da s es tir pe s de S ta ph yl oc oc cu s au re us is ol ad as d e ac or do c om a o rig em d as a m os tr as , na s se is pr op rie da de s ru ra is q ue e nt re ga va m l ei te n o ta nq ue d e ex pa ns ão c om un itá rio 2 , S ac ra m en to -M G , ja ne iro a ab ril de 2 00 9. P ro p. Le ite Ó st io In su fla do re s an te s da or de nh a In su fla do re s ap ós a or de nh a La tõ es B al de s C oa do re s S up er fíc ie da T ub ul aç ão Le ite do la tã o Le ite d o T an qu e C om . M ão s do s or de nh ad or es Á gu a da s pr op . Á gu a T an qu e C om . T ot al n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % 1 3 4, 2 5 7, 0 - - 3 4, 2 - - - - - - 1 1, 4 - - 1 1, 4 - - 1 1, 4 - - 14 20 ,2 2 5 7, 0 6 8, 7 1 1, 4 4 6, 0 1 1, 4 - - - - - - - - - - 2 2, 8 - - - - 19 27 ,5 3 1 1, 4 - - - - - - 2 2, 8 - - 2 2, 8 - - 1 1, 4 - - - - - - - - 6 8, 7 4 3 4, 2 6 8, 7 8 12 ,0 7 10 ,0 - - 1 1, 4 - - - - - - 1 1, 4 - - - - - - 26 38 ,0 5 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1, 4 - - 1 1, 4 1 1, 4 - - 3 4, 2 6 - - - - - - - - - - - - - - - - 1 1, 4 - - - - - - - 1 1, 4 T ot al 12 16 ,8 17 24 ,4 9 13 ,4 14 20 ,2 3 4, 2 1 1, 4 2 2, 8 1 1, 4 3 4, 2 2 2, 8 3 4, 2 2 4, 8 - - 69 10 0, 0 39 Na Tabela 4, observa-se que a ocorrência de estirpes de S. aureus obtidas dos óstios papilares e do leite das fêmeas reagentes ao CMT foram os locais de isolamento que apresentaram o maior número de isolados, com 17 (24,4%) e 12 (16,8%) estirpes, respectivamente. De acordo com SANTOS & FONSECA (2007), a incidência de infecções está altamente correlacionada com o número de patógenos presentes na extremidade dos tetos. Assim, acredita-se que a ocorrência de S. aureus nos pontos em questão, possa estar diretamente associada à ausência da execução dos procedimentos de antissepsia dos tetos antes e após a ordenha. Neste sentido, sabe-se que a realização do pré-dipping (antissepsia dos tetos antes da ordenha) reduz a contaminação dos tetos e o risco de novas infecções intramamárias, além de melhorar a eficiência da ordenha. A realização do pós-dipping (antissepsia dos tetos após a ordenha) com desinfetante à base de iodo e a imersão completa dos insufladores em balde com solução clorada (hipoclorito de sódio) dos insufladores das ordenhadeiras são medidas importantes para o controle da mastite (SANTOS & FONSECA, 2007). A investigação realizada por PHILPOT & NICKERSON (2002) utilizando os produtos disponíveis no mercado para a realização do pós-dipping, de acordo com os protocolos estabelecidos pelo National Mastitis Council, mostrou que nesta etapa do processo de obtenção do leite pode-se reduzir em pelo menos 50% a taxa de infecção por microrganismos contagiosos. De acordo com os dados inseridos na Tabela 4, observa-se que houve o isolamento de estirpes de S. aureus nos insufladores das ordenhadeiras mecânicas, antes e após a ordenha, em nove (13,4%) e 14 (20,2%) ocasiões, respectivamente. Esses achados demonstram que os insufladores da ordenhadeira podem constituir em uma importante via de contaminação e transmissão de S. aureus durante a obtenção do leite. Segundo KIM (1995) a higiene e a desinfecção do equipamento de ordenha é uma importante medida para a redução do número de microrganismos no leite. Segundo FONSECA & SANTOS (2001), a limpeza dos equipamentos de ordenha quando não respeitados os procedimentos corretos de tempo e temperatura e a utilização e concentração de detergentes, pode levar ao acúmulo de componentes do leite no 40 sistema, propiciando a multiplicação de microrganismos que irão contribuir para o aumento de até 10% da contaminação bacteriana do leite. De acordo com a Tabela 4, observa-se que houve isolamento de estirpes de S. aureus nos latões, baldes e coadores, em três (4,3%), um (1,4%) e dois (2,8%) respectivamente, reforçando a deficiente higienização realizada nos utensílios das propriedades desta investigação. Observa-se ainda que houve a ocorrência de estirpes de S. aureus em uma (1,4%) amostra obtida da superfície da tubulação auxiliar no transvase do leite. Esta ocorrência pode ser atribuída à inadequada higienização empregada na tubulação, o que pode ter favorecido a formação de biofilme no utensílio em questão. Considerando-se a capacidade de estirpes de S. aureus formarem biofilmes e aderirem a diversas superfícies, principalmente de equipamentos e instalações no ambiente de ordenha, ressalta-se a importância da desinfecção e da higiene adequada destes equipamentos para a eliminação desses agentes (MELO, 2008). Os dados inseridos na Tabela 4 mostram que houve o isolamento de três (4,2%) estirpes de S. aureus nas mãos dos ordenhadores. Sabendo-se que as mãos constituem uma importante via de contaminação e transmissão de S. aureus durante o processo de obtenção do leite, esse achado demonstra a importância da higienização das mãos. Observa-se, ainda, que houve a presença de S. aureus em três (4,2%) amostras de leite do latão das propriedades. Esses microrganismos foram também isolados em duas (2,8%) amostras do leite de conjunto contido no tanque comunitário. Este achado talvez possa ser atribuído às precárias condições higiênicas dos utensílios utilizados na obtenção do leite que certamente influenciaram na qualidade microbiológica deste produto, independentemente da provável ocorrência de falhas nos procedimentos de higienização do tanque comunitário. Segundo FAGUNDES (2007), pelo fato de S. aureus ser uma bactéria de origem contagiosa e sua disseminação entre os animais dar-se principalmente durante a ordenha, pelas más condições de higiene dos animais, dos ordenhadores e dos 41 procedimentos de ordenha, pode-se relacionar a presença de S. aureus às condições de higiene encontradas nas propriedades. Sabendo-se que em propriedades rurais destinadas à produção leiteira, a água também se destaca como via de transmissão de agentes causadores de mastites, conforme dados inseridos na Tabela 4, observa-se que no presente estudo houve a ocorrência de S. aureus em 2 (4,8%) amostras de água das propriedades. Na propriedade 1, acredita-se que a água contaminada favoreceu a possível formação de biofilmes nos insufladores da ordenhadeira, tornando-o um local de elevada transmissibilidade da enfermidade. Na propriedade 5, a água utilizada possivelmente constituiu fonte de contaminação para as mãos do ordenhador. Segundo FERREIRA (2008), a formação de biofilme nos insufladores, caso ocorram falhas na manutenção e na higiene dos equipamentos, pode contribuir para a troca de genes de resistência entre os microrganismos que ali colonizam. De acordo com ADESIYUN et al. (1997) e AMARAL et al. (2004), a água utilizada em propriedades leiteiras pode ser importante veículo de microrganismos patogênicos para o leite e para a glândula mamária. Sendo assim, existe a necessidade da desinfecção e controle de qualidade da água utilizada na produção de leite, com os objetivos de minimizar os riscos à saúde humana e animal. FERREIRA (2008) ao estudar as 245 estirpes de S. aureus isoladas dos casos de mastite e de outros sítios de localização em uma propriedade rural, observou que os isolamentos foram mais frequentes entre as amostras de leite, seguidas pelas amostras dos óstios papilares e dos insufladores. Do mesmo modo, OLIVEIRA (2001), em estudo realizado em cinco propriedades leiteiras da região noroeste do estado de São Paulo, observou que o leite foi o ponto de colheita que apresentou maior ocorrência de estirpes de S. aureus. Deve-se assinalar, contudo, que o referido autor observou a presença destes microrganismos em apenas 1,5% dos insufladores, enquanto que nenhuma estirpe foi isolada dos óstios papilares. 42 5.3. Eletroforese em gel de campo pulsado No momento da realização da eletroforese em gel de campo pulsado, observou- se que três estirpes de S. aureus não atingiram a concentração bacteriana necessária para a execução da prova. Sendo assim, 103 estirpes de S. aureus foram submetidas à PFGE. Alguns exemplos dos produtos amplificados obtidos na análise dos géis da eletroforese de campo pulsado estão apresentados na Figura 3, enquanto o dendrograma dos produtos amplificados, gerado pelo algoritmo UPGMA, pode ser visualizado na Figura 4. Figura 3. Exemplos de padrões de macrorrestrição do crDNA das estirpes de Staphylococcus aureus, submetidas à PFGE. PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 PM 43 44 Segundo SANTOS et al. (2003), a associação entre os isolados de S. aureus provenientes de mastites e os locais de isolamento é de extrema importância epidemiológica. As linhas de ordenha são locais de intenso manejo, que podem propiciar condições de veiculação de patógenos para a glândula mamária, especialmente S. aureus, caso sejam negligenciados os procedimentos de desinfecção dos equipamentos de ordenha e de higiene da glândula mamária durante a pré ordenha. De acordo com o método de análise de agrupamento utilizado foi possível classificar as estirpes de S. aureus analisadas em 32 grupos. A classificação dos pulsotipos foi realizada pela análise do dendrograma de acordo com o estabelecido por TENOVER et al. (1997), os quais estabelecem que, as amostras com até 70% de similaridade são agrupadas como mesmo pulsotipo. Na Tabela 5 estão apresentados os 32 padrões distintos encontrados para as estirpes de S. aureus de acordo com a origem das amostras provenientes das 12 propriedades estudadas. 45 T ab el a 5. D is tr ib ui çã o da s es tir pe s de S ta ph yl oc oc cu s au re us i so la da s de a co rd o co m a o rig em , en tr e as a m os tr as p ro ve ni en te s da s 12 pr op rie da de s es tu da da s, c om o s re sp ec tiv os p ad rõ es d e m ac ro rr es tr iç ão d o cr D N A , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. P ul so ti po L ei te d as fê m ea s Ó st io L ei te L at ão L ei te T an qu e C om . In s. a nt es or de nh a In su fl ad or es a pó s or de nh a L at õe s B al de s C oa do re s M ão s S up . T ub Á gu a P ro p. T ot al n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % n % 1 6 5, 8 11 10 ,6 2 1, 9 2 1, 9 2 1, 9 2 1, 9 1 1, 0 26 25 ,2 2 2 1, 9 2 1, 9 3 1 1, 0 2 1, 9 1 1, 0 4 3, 8 4 1 1, 0 1 1, 0 1 1, 0 1 1, 0 4 3, 8 5 1 1, 0 2 1, 9 3 2, 9 6 3 2, 9 3 2, 9 7 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 8 2 1, 9 2 1, 9 9 2 1, 9 1 1, 0 3 2, 9 10 2 1, 9 1 1, 0 3 2, 9 11 2 1, 9 1 1, 0 1 1, 0 4 3, 8 12 2 1, 9 2 1, 9 13 1 1, 0 1 1, 0 14 1 1, 0 1 1, 0 1 1, 0 3 2, 9 15 2 1, 9 4 3, 8 6 5, 8 16 1 1, 0 1 1, 0 17 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 18 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 19 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 20 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 21 2 2 1, 9 22 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 23 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 24 1 1, 0 2 1, 9 3 2, 9 25 3 2, 9 1 1, 0 4 3, 8 26 2 1, 9 1 1, 0 3 2, 9 27 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 28 1 1, 0 1 1, 0 29 1 1, 0 1 1, 0 1 1, 0 3 2, 9 30 1 1, 0 1 1, 0 31 1 1, 0 1 1, 0 2 1, 9 32 1 1, 0 1 1, 0 T ot al 25 24 ,3 30 29 ,1 7 6, 8 6 5, 9 9 8, 8 15 14 ,6 2 2, 0 2 2, 0 1 1, 0 3 3, 0 1 1, 0 2 2, 0 10 3 10 0, 0 46 De acordo com os dados inseridos na Tabela 5, no presente estudo houve heterogeneidade genética entre os isolados, uma vez que foi observado um grande número de pulsotipos. Esses achados se assemelham aos obtidos por FERREIRA (2008) que obteve 39 pulsotipos, das 245 estirpes de S. aureus isoladas do leite de casos de mastite, dos óstios papilares e dos insufladores da ordenhadeira mecânica, em trabalho realizado em Nova Odessa-SP. Observa-se, também na Tabela 5, que o pulsotipo 1 apresentou a maior prevalência entre os pulsotipos encontrados, com 25,2% (26) das estirpes tipadas, seguido pelos padrões 15, 3, 4, 11 e 25, com 5,8% (6), 3,8% (4), 3,8% (4), 3,8% (4), 3,8% (4), respectivamente. LANGE et al. (1999) observaram, ao pesquisar 66 estirpes de S. aureus isoladas de leite de vacas com mastite no sul do Brasil, 33 pulsotipos distintos e, também, a presença de um mesmo padrão de macrorrestrição do crDNA em 15,1% das amostras. FERREIRA (2008) observou que o pulsotipo 29 apresentou a maior prevalência entre os padrões de macrorrestrição do crDNA, com 15,1% (31) das estirpes tipadas, seguido pelos padrões 17, 24, 9 e 20, com 10,7% (22), 9,3% (19), 6,9% (14) e 5,8% (12), respectivamente. Segundo ROBERSON et al. (1994) a elevada variabilidade entre os padrões fenotípicos e genotípicos pode decorrer da diversidade dos locais nos quais os S. aureus são encontrados, uma vez que estes microrganismos podem ser isolados do leite de vacas acometidas de mastite clínica e subclínica, da superfície da pele dos tetos, dos insufladores das ordenhadeiras, e dos ordenhadores. No presente estudo, o pulsotipo 1 apresentou maior similaridade entre as estirpes de S. aureus isoladas nos diferentes pontos do fluxograma de obtenção do leite, evidenciando, portanto, a disseminação do agente entre as diferentes propriedades. A maior distribuição do pulsotipo 1 das estirpes de Staphylococcus aureus foi observada nos óstios papilares, seguido pelo leite das fêmeas reagentes ao CMT e insufladores das ordenhadeiras mecânicas com 11 (10,6%), 6 (5,8%), 4 (3,8%) respectivamente, evidenciando com isso, a importância desses pontos no mecanismo 47 de transmissão do agente entre as diferentes propriedades estudadas. Os resultados obtidos sugerem, ainda, que os procedimentos usuais de higiene adotados durante a ordenha, a limpeza e a desinfecção dos utensílios e dos equipamentos nas propriedades objeto desta investigação, não foram realizados adequadamente. Na Tabela 6 pode ser observada a distribuição das estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de acordo com a origem, entre as amostras provenientes de cada propriedade estudada, com os respectivos pulsotipos. 48 T ab el a 6. D is tr ib ui çã o da s es tir pe s de S ta ph yl oc oc cu s au re us i so la da s de a co rd o co m a o rig em , en tr e as a m os tr as p ro ve ni en te s de c ad a pr op rie da de e st u da da , c om o s re sp ec tiv os p ad rõ es d e m ac ro rr es tr iç ão d o cr D N A , S ac ra m en to -M G , j an ei ro a ab ril de 2 00 9. P ul so ti po P 1 P 2 P 3 P 4 P 5 P 6 P 7 P 8 P 9 P 10 P 11 P 12 T an qu e C om . 1 T an qu e C om . 2 n n n n n n n n n n n n 1 1 Ó , 1 L 1 Ó 2 L , 1 L L , 1 Ó 1 Ó 3 Ó , 2 L 1 L , 1 L L 1 IL 2 IL , 4 Ó , 2 I S 1 L T 1 L T 2 2 Ó 3 1 L L 2 Ó 1 L 4 1 M 1 Ó 1 IS 1 L T 5 1 L 2 Ó 6 2 L 1 L 7 1 IL , 1 Ó 8 1 Ó 1 Ó 9 2 L 1 Ó 10 1 L 1 L 1 IS 11 1 L L , 1 A 1 L L 1 L T 12 2 IL 13 1 L T 14 1 C 1 Ó 1 T A 15 1 L 2 IS 2 IS 1 L 16 1 L 17 1 L A , 1 M 18 1 Ó , 1 L L 19 1 Ó , 1 I S 20 1 L , 1 I S 21 2 Ó 22 1 L , 1 Ó 23 1 A 1 IL 24 1 Ó 1 L 1 IS 25 1 IS , 3 Ó 26 1 L L 1 L 1 L 27 1 S L 1 IS 28 1 S L 29 1 IS , 1 M 1 B 30 1 S L 31 1 Ó 1 L T 32 1 B T ot al 12 3 9 7 2 - 12 19 4 25 2 1 5 2 Ó = ós tio ; L= le ite d as f êm ea s re ag en te s ao C M T ; LL = le ite d o la tã o da s pr op rie da de s; I L= in su fla do r an te s da o rd en ha ; IS = in su fla do r ap ós a o rd en ha ; LT = le ite d o ta nq ue co m un itá rio ; M = m ão d os o rd en ha do re s; A = ág ua d as p ro pr ie da de s; C = co ad or ; T A = tu bu la çã o au xi lia r no tr an sv as e do le ite ; LA = la tã o; B = ba ld e. P 1 a P 5= P ro pr ie d ad e 1 à P ro pr ie da de 5 q ue e nt re ga va m l ei te n o ta nq ue d e ex pa ns ão c om un itá rio 1 . P 1 a P 6= P ro pr ie da de 1 à P ro pr ie da de 6 q ue e nt re ga va m l ei te n o ta nq ue d e ex pa ns ão co m un itá rio 1 . P 7 a P 12 = P ro pr ie da de 1 à P ro pr ie da d e 6 qu e e nt re ga va m le ite n o ta nq ue d e ex p an sã o co m un itá rio 2 . 49 Os dados inseridos na Tabela 6 revelam que o pulsotipo 1 esteve presente em 8 (66,6%) das 12 propriedades estudadas. Esse pulsotipo se manifestou nos isolados de óstios papilares, leite das fêmeas reagentes ao CMT, leite do latão das propriedades, insufladores das ordenhadeiras mecânicas e no leite do tanque comunitário. Depreende-se, portanto, que os isolados de mesmo perfil genético identificados nos insufladores das ordenhadeiras mecânicas, nos óstios papilares e no leite refletem a importância das ordenhadeiras mecânicas como via de transmissão deste agente etiológico da mastite. SANTOS (2009) em estudo epidemiológico-molecular associado à mastite bovina em propriedades de exploração leiteira dos Estados de São Paulo e Pernambuco observou que o isolamento de S. aureus pertencente ao mesmo perfil genético em insufladores e a partir de amostras de leite reflete o papel do equipamento de ordenha como possível via de transmissão na mastite bovina no rebanho. Observou ainda que a pele do úbere constituiu também em uma importante via de transmissão da mastite. FERREIRA (2008) observou que houve a manutenção e a disseminação clonal de alguns pulsotipos identificados nas amostras analisadas. Segundo esse mesmo autor, a ocorrência de estirpes de S. aureus com pulsotipos iguais em uma mesma colheita evidenciou, nas amostras de leite, óstios papilares e insufladores da ordenhadeira mecânica, a relação epidemiológica existente entre as fontes de infecção e vias de transmissão. No presente estudo, acredita-se que a disseminação do S. aureus nas diferentes propriedades pode ser atribuída a proximidade existente entre as mesmas, o que possivelmente favorece a troca de animais, sem observar os protocolos de controle sanitário dos rebanhos. Acredita-se ainda, que a disseminação observada pode ser explicada pelo fato de que o sistema de uso do tanque de expansão para refrigeração do leite era comunitário. Assim, no momento da entrega do leite, os latões eram higienizados mecanicamente no local onde os tanques de expansão estavam instalados, favorecendo a disseminação de microrganismos. 50 Segundo FAGUNDES (2007), a disseminação de S. aureus entre diferentes propriedades, possivelmente pode ocorrer através da troca ou venda de animais entre as propriedades. A ocorrência de S. aureus evidencia a importância do diagnóstico destes agentes nas mastites bovinas, cuja identificação proporciona o delineamento de programas de controle mais racionais e efetivos. Desse modo, com a redução da ocorrência desta enfermidade, além da diminuição das despesas com o tratamento, serão criadas condições propícias para a melhoria da qualidade do leite produzido em nosso meio. Segundo ZECCONI & PICCININI (1999) a variabilidade genotípica sugere a necessidade de identificar clones ou subtipos antes mesmo de serem adotadas medidas específicas no controle da mastite. Tais informações poderão auxiliar na elaboração de estratégias mais eficientes que visem à redução dos casos de infecção, uma vez que a partir dos perfis moleculares é possível inferir relações genéticas existentes entre os diferentes clones, detectar o fluxo gênico e traçar rotas de dispersão da infecção no rebanho (KAPUR et al., 1995). 51 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS O conhecimento do perfil molecular dos Staphylococcus aureus auxilia na melhor compreensão dos estudos epidemi