Campus de Botucatu Instituto de Biociências Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Atividade antibacteriana e mecanismos de ação da melitina e sua associação com oxacilina frente ao Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) Ana Flávia Marques Pereira BOTUCATU-SP 2022 Campus de Botucatu Instituto de Biociências Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Atividade antibacteriana e mecanismos de ação da melitina e sua associação com oxacilina frente ao Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) Ana Flávia Marques Pereira Orientador: Prof. Assoc. Ary Fernandes Júnior Coorientador: Prof. Dra. Carla dos Santos Riccardi Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutora no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração: Biologia de Parasitas e Microrganismos. Prof. Assoc. Ary Fernandes Júnior BOTUCATU-SP 2022 Dedico esta tese Aos meus pais Denise Marques Caldeira Pereira e José Carlos Pereira, pelo amor incondicional, por sempre acreditarem e incentivarem a seguir os meus sonhos. Obrigada por tudo! Amo vocês! Aos meus avós Jasmire Floriano Caldeira e Geraldo Marques Caldeira, por todos os ensinamentos e por todo o apoio sempre. Vocês são uma inspiração! Aos meus avós Maria Aparecida de Lorençato Pereira e Quirino de Freitas Pereira (in memoriam), que não estão mais presentes, mas deixaram marcas em minha vida. Aos meus tios Roseli Marques Caldeira e Arnaldo Jesus da Silva por sempre estarem presentes. Agradecimentos Aos amigos que fiz no laboratório de Bacteriologia e Produtos Naturais: Alessandra Sani, Débora Souza, Nicolas Ripari e Tatiane Zapata, obrigada pela ajuda e pelos momentos de alegria no laboratório. E as amigas que já saíram do laboratório e deixaram suas marcas: Alessandra Furlanetto, Bruna Andrade, Fernanda Alves, Lidiane Nunes e Mariana Albano. Com certeza o trabalho ficou mais leve e divertido com vocês. As minhas amigas da República Albergue: Agda, Doku, Thaís e Daisy, com certeza o meu dia a dia foi mais feliz com vocês. E sem esquecer das amigas que agora são ex- moradoras da República: Coca, Novinha, Pri Condor, Sol, Tinder, Tucura, Vitória e Zina. Obrigada pela amizade e pelo companheirismo. Um dos motivos de eu ter continuado aqui em Botucatu foi morar nessa república. Nunca esquecerei de vocês! A todos os professores, funcionários e técnicos do Departamento de Ciências Químicas e Biológicas do Setor Microbiologia e Imunologia, em especial a Prof. Dra. Vera Lúcia Mores Rall pela disponibilidade e ajuda sempre. A todos os professores da banca que aceitaram o meu convite e que irão acrescentar tanto ao meu trabalho! Obrigada Prof. Dra. Lidiane Nunes Barbosa, Prof. Dra. Lucilene Delazari dos Santos, Prof. Dr. Ricardo de Oliveira Orsi e Prof. Vera Lúcia Mores Rall. A Prof. Dra. Lucilene Delazari dos Santos por toda ajuda com a análise proteômica, sempre solícita e disposta a me ensinar. A minha coorientadora, Prof. Dra. Carla dos Santos Riccardi, que aceitou fazer parte desse projeto, se empenhou e disponibilizou-se a me ensinar novas técnicas e metodologias. Obrigada pelos ensinamentos, professora! Ao Professor Doutor Ary Fernandes Júnior por todos os anos de ensinamento e paciência. Cheguei no laboratório de Bacteriologia e Produtos Naturais em 2015 para fazer a minha iniciação científica e nunca imaginei que chegaria ao doutorado. Sou muito grata pelos conhecimentos e habilidades adquiridas durante esse tempo. Obrigada por sempre estar presente, me apoiando e ajudando nos momentos bons e ruins. Quando parecia que nada iria dar certo, sempre surgíamos com uma solução. E deu certo, professor! A sua vontade de ensinar me inspira, Ary Fernandes! Obrigada por tudo! O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, com número de processo 88882.183588/2018-01. Agradeço a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio com número de processo 2019/24850-0. “Aprender é a única coisa que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”. (Leonardo da Vinci) “Ao expandirmos o campo do conhecimento, apenas aumentamos o horizonte da ignorância”. (Henry Miller) Resumo A resistência bacteriana é um problema de saúde pública mundial e isolados resistentes como o Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), frequentemente causam infecções graves e de difícil tratamento. A pesquisa por novos agentes antimicrobianos é necessária e produtos naturais como os peptídeos antimicrobianos têm sido evidenciados, como é o caso da melitina, uma fração do veneno da abelha Apis mellifera, que já possui ação antimicrobiana reportada. A melitina pode apresentar atividade hemolítica, sendo ideais novas estratégias como um sinergismo com antibióticos ou associada a sistemas nanocarreados, como nanopartículas ou nanoemulsões. Os objetivos desse trabalho foram sintetizar uma nanopartícula de ouro conjugada com melitina (AuNPs melitina) e duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina, avaliar a atividade antibacteriana da melitina, da sua associação com oxacilina, dos antibióticos oxacilina e cefalotina, da AuNPs melitina e das nanoemulsões sobre MRSA ATCC 33591 e um MRSA isolado clínico, avaliar atividade antibiofilme dos produtos que apresentaram atividade antibacterina e investigar os seus mecanismos de ação sobre MRSA. As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram funcionalizadas com citrato de sódio e ativadas com 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS) e posterior conjugação da melitina; também foi realizada a síntese de duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina. A atividade antibacteriana sobre os isolados foi realizada de acordo com a metodologia Resazurin Microtiter Assay (REMA), para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) da melitina, antibióticos, AuNPs melitina e nanoemulsões com melitina. O sinergismo da melitina com antibióticos (oxacilina e cefalotina) foi testado por meio da curva de sobrevivência (time kill curve). A ação antibiofilme de melitina, oxacilina e da associação de melitina com oxacilina (mel+oxa) e a ação desses produtos sobre a membrana celular dos isolados foram verificadas. Ensaios de atividade hemolítica e de citometria de fluxo, citotoxicidade em células HaCaT, foram realizados. Os mecanismos de ação dos produtos testados com atividade antibacteriana foram investigados por meio da análise proteômica, sendo que a cepa MRSA ATCC foi tratada com concentrações subinibitórias dos tratamentos. As AuNPs melitina e as duas nanoemulsões diferentes contendo melitina foram sintetizadas, obtendo uma concentração final de 250 μg/mL de melitina em cada nanoestruturado, sendo que nenhum nanoestruturado apresentou ação antibacteriana frente à MRSA. A melitina apresentou uma CIM de 5,3 µg/mL sobre MRSA ATCC e de 4,0 µg/mL para MRSA isolado clínico; já a oxacilina apresentou CIM de 16 µg/mL para MRSA ATCC e de 8 µg/mL para MRSA isolado. A associação mel+oxa mostrou ser sinérgica e bactericida para ambos MRSA. Concentrações subinibitórias da mel+oxa foram capazes de reduzir a formação de biofilme de MRSA ATCC e concentrações suprainibitórias foram capazes de erradicar biofilmes estabelecidos. A melitina e mel+oxa mostraram ter ação sobre a permeabilidade da membrana celular pelo aumento na condutividade elétrica relativa, extravasamento de proteínas, liberação de ácidos nucleicos e efluxo de íons potássio e fosfato. A taxa de hemólise da melitina em sua CIM foi de 0,2%, já a combinação de mel+oxa, em sua CIM não apresentou hemólise em eritrócitos humanos. A melitina e mel+oxa não causaram apoptose ou morte tardia em células de queratinócitos HaCaT. A análise proteômica sobre MRSA ATCC mostrou que a melitina, oxacilina e mel+oxa causaram uma expressão diferencial de proteínas em relação ao controle, indicando ação sobre a síntese proteica e metabolismo energético. Os nanoestruturados contendo a melitina não apresentaram atividade antibacteriana nas concentrações e formulações testadas sobre MRSA. O tratamento mel+oxa mostrou atividade antibacteriana e antibiofilme sobre MRSA, não apresentou hemólise no valor da CIM e nem citotoxicidade em células HaCaT e mostrou ação sobre a membrana celular de MRSA e sobre diferentes alvos intracelulares, afetando principalmente o metabolismo energético e a síntese proteica de MRSA. A associação de melitina e oxacilina apresenta considerável potencial para o desenvolvimento de agentes antibacterianos ou de novos tratamentos contra MRSA. Palavras-chave: análise proteômica; atividade hemolítica; biofilme; citometria de fluxo; sinergismo Antibacterial activity and mechanisms of action of melittin and its association with oxacillin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Abstract Bacterial resistance is a global public health problem and resistant isolates such as methicillin- resistant Staphylococcus aureus (MRSA) often cause serious and difficult-to-treat infections. Research for new antimicrobial agents is necessary and natural products such as antimicrobial peptides have been evidenced, such as melittin, a fraction of the venom of Apis mellifera bee, which already has reported antimicrobial action. Melittin may have hemolytic activity and new strategies are ideal such as synergism with antibiotics or associated with nanocarried systems, such as nanoparticles or nanoemulsions. The objectives were to synthesize a gold nanoparticle conjugated with melittin (melittin AuNPs) and two different formulations of nanoemulsions containing melittin, to evaluate the antibacterial activity of melittin, its association with oxacillin, antibiotics oxacillin and cephalothin, AuNPs melittin and nanoemulsions on ATCC 33591 MRSA and a clinical isolate MRSA, to evaluate the antibiofilm activity of the producys that showed antibacterial activity and investigate its mechanisms of action on MRSA. Gold nanoparticles (AuNPs) were functionalized with sodium citrate and activated with 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) and subsequent conjugation of melittin; the synthesis of two different formulations of nanoemulsions containing melittin was also carried out. Antibacterial activity against the bacterial isolates was performed according to the Resazurin Microtiter Assay (REMA) to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of melittin, antibiotics, melittin AuNPs and melittin nanoemulsions. The synergism of melittin with antibiotics (oxacillin and cephalothin) was tested using the time kill curve. The antibiofilm action of melittin, oxacillin and the association of melittin with oxacillin (mel+oxa) were tested and the mechanisms of action of these products on the bacterial isolates cell membrane were verified. Hemolytic activity and flow cytometry assays, cytotoxicity in HaCaT cells, were performed. The proteomics analysis investigated the mechanisms of action of the tested products with antibacterial activity; the MRSA ATCC was treated with subinhibitory concentrations of the treatments. The synthesized AuNPs melittin and the two different nanoemulsions containing melittin, with a final concentration of 250 μg/mL of melittin in each nanostructure, showed no antibacterial action against MRSA. Melittin had a MIC of 5.3 µg/mL for MRSA ATCC and 4.0 µg/mL for isolate MRSA; oxacillin presented a MIC of 16 µg/mL for MRSA ATCC and 8 µg/mL for isolate MRSA. The mel+oxa association proved to be synergistic and bactericidal for both MRSA. Subinhibitory concentrations of mel+oxa reduced the biofilm formation of both MRSA and suprainhibitory concentrations eradicate established biofilms. Melittin and mel+oxa showed action on the permeability of the cell membrane, increased the relative electrical conductivity, promoted protein extravasation, released nucleic acids and caused efflux of potassium and phosphate ions.The hemolysis rate of melittin in its MIC was 0.2%, whereas the combination of mel+oxa, in its MIC, did not present hemolysis in human erythrocytes. Melittin and mel+oxa did not cause apoptosis or necrosis in HaCaT keratinocyte cells. Proteomic analysis on MRSA ATCC showed that melittin, oxacillin and mel+oxa caused a differential expression of proteins in relation to the control, indicating action on protein synthesis and energy metabolism. The mel+oxa treatment showed antibacterial and antibiofilm activity on MRSA, showing no hemolysis in its MIC value and no cytotoxicity in HaCaT cells and presented action on the MRSA cell membrane and on different targets, mainly affecting energy metabolism and protein synthesis. The association of melittin and oxacillin presents considerable potential for the development of antibacterial agents or new treatments against MRSA. Keywords: biofilm; flow cytometry; hemolytic activity; proteomic analysis; synergism Lista de Figuras Figura 1. Modelos do modo de ação dos peptídeos antimicrobianos em membranas plasmáticas: modelo barrel-stave, modelo poro toroidal e modelo de carpete (Fonte: PASUPULETI et al., 2012). ..................................................................................................... 29 Figura 2. Mudança de coloração durante o preparo da solução de AuNPs. A: solução de HAuCl4 · 3H2O sob agitação magnética; B: adição da solução de citrato de sódio; C: tempo 0: logo após a adição da solução; D: 5 minutos após; E: 20 minutos após; F: 45 minutos após (PEREIRA, A.F.M., 2022). ...................................................................................................... 38 Figura 3. Espectros de absorção de absorção obtidas nas formulações de AuNPs e AuNPs + Melitina. .................................................................................................................................... 50 Figura 4. Curva de sobrevivência da atividade inibitória, em densidade óptica 600 nm, de MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (C) e curva de sobrevivência da atividade bactericida, em Log UFC/mL, de MRSA ATCC (B) e MRSA Isolado (D). ..................................................... 54 Figura 5. Condutividade elétrica, em porcentagem (%), após 4 horas do tratamento de MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (B) com 1x CIM e 2x CIM melitina, oxacilina e a associação de melitina e oxacilina. .................................................................................................................. 55 Figura 6. Extravasamento de proteínas, expresso em µg/mL, após 4 horas do tratamento de MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (B) com 1x CIM e 2x CIM melitina, oxacilina e a combinação de melitina e oxacilina.......................................................................................... 56 Figura 7. Liberação de ácidos nucleicos, em densidade óptica de 260 nm, após 4 horas do tratamento de MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (B) com 1x CIM e 2x CIM melitina, oxacilina e a combinação de melitina e oxacilina. ................................................................... 57 Figura 8. Valores, em porcentagem (%), de inibição do biofilme por concentrações subinibitórias de 25%, 50% e 75% da CIM de melitina, oxacilina e associação de melitina com oxacilina sobre MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (B). ................................................ 60 Figura 9. Ação antibiofilme maduro, em densidade óptica 600 nm, da CIM, 5x CIM, 15x CIM e 20x CIM de melitina, oxacilina e da associação de melitina com oxacilina sobre MRSA ATCC (A) e MRSA Isolado (B). ................................................................................. 62 Figura 10. Análise de efeito citotóxico por indução de apoptose e morte tardia em células HaCaT usando marcação por Anexina V (FITC) e Iodeto de Propídeo. .................................. 66 Figura 11. Diagrama de Venn de todas as proteínas identificadas pela análise proteômica nos tratamentos (melitina, oxacilina e mel+oxa) em relação as proteínas identificadas no grupo controle. .................................................................................................................................... 68 Figura 12. Função molecular (A, melitina, C, oxacilina e E, mel+oxa) e processo biológico (B, melitina, D, oxacilina e F, mel+oxa) das proteínas diferencialmente expressas (up e down reglation) de MRSA exposto aos tratamentos em comparação ao controle. ............................ 72 file:///C:/Users/anafl/OneDrive/DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/TESE%20Repositório%20Ana%20Flávia%20M%20Pereira.docx%23_Toc117515475 file:///C:/Users/anafl/OneDrive/DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/TESE%20Repositório%20Ana%20Flávia%20M%20Pereira.docx%23_Toc117515475 file:///C:/Users/anafl/OneDrive/DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/DEFESA%20DOUTORADO/TESE%20Repositório%20Ana%20Flávia%20M%20Pereira.docx%23_Toc117515475 Lista de Tabelas Tabela 1. Interpretação dos resultados de citotoxicidade por citometria de fluxo, levando-se em conta o perfil de coloração e de morfologia da população celular analisada. .................... 46 Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) da melitina e dos antibióticos, expressa em µg/mL, frente à MRSA ATCC e Isolado.................................................................................. 51 Tabela 3. Concentração bactericida mínima (CBM) da melitina e dos antibióticos, expressa em µg/mL, frente à MRSA ATCC e Isolado. ........................................................................... 51 Tabela 4. Efluxo de íons potássio e fosfato, em mg/L, após o tratamento de MRSA ATCC com CIM e 2x CIM de melitina, oxacilina e a combinação de ambas nos tempos 0, 2 e 4 horas. .................................................................................................................................................. 58 Tabela 5. Efluxo de íons potássio e fosfato, em mg/L, após o tratamento de MRSA isolado com CIM e 2x CIM de melitina, oxacilina e a combinação de ambas nos tempos 0, 2 e 4 horas. .................................................................................................................................................. 58 Tabela 6. Valores, em porcentagem (%), da atividade hemolítica causada pelos tratamentos nas cinco diferentes concentrações testadas de melitina, oxacilina e mel+oxa. ....................... 64 Tabela 7. Resultado em percentual da população de células viáveis, de apoptose e morte tardia de células HaCaT após exposição a CIM e 2x CIM de metilina, oxacilina e mel+oxa. 65 Tabela 8. Proteínas de MRSA expressas em up ou down-regulation após os tratamentos T1 - Melitina, T2 - Oxacilina, T3 - Melitina/Oxacilina em comparação ao C - Controle (MRSA sem tratamento) segundo o teste de volcano plot e vips scores................................................ 70 Lista de Abreviaturas 2DE Eletroforese em gel bidimensional 6PGDH 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating 11-MUA ácido 11-mercaptoundecanóico acetil-CoA acetil coenzima A ADHE aldehyde-alcohol dehydrogenase agr Gene acessório regulador AspRS Aspartate–tRNA ligase AuNPs Nanopartículas de ouro BEC Concentração de erradicação do biofilme BSA Albumina sérica bovina CBM Concentração bactericida mínima CDC Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos CEP Comitê de ética em pesquisa CIM Concentração inibitória mínima CM chorismate mutase CSM Concentração subletal máxima DAHP 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato DnaK chaperone protein DnaK DO Densidade óptica dTMP 2’-deoxythymidine-5’-monophosphate dUMP 2’-deoxyuridine-5’-monophosphate EDC 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida EF-G elongation factor G ESI Ionização por eletrospray EUA Estados Unidos da América FDR False Discovery Rate FtsZ Cell division protein FtsZ GMP reductase Guanosina monofosfato redutase HaCaT Queratinócitos epidermais humanos HAuCl4 · 3H2O Ácido tetracloroáurico triidratado HCl Ácido clorídrico IMP Inosina monofosfato LC Cromatografia líquida LSPR Ressonância plasmônica de superfície localizada MgCl2 Cloreto de magnésio MHC Mueller Hinton caldo MHCII Mueller Hinton caldo II MPTs Modificações pós-traducionais mRNA RNAs mensageiros MRSA Staphylococcus aureus meticilina resistente MS/MS Espectrometria de massa em tandem MSCRAMMs Componentes da superfície microbiana que reconhecem moléculas adesivas da matriz MSSA Staphylococcus aureus suscetível à meticilina NaBH4 Borohidreto de sódio NaCl Cloreto de sódio NaOH Hidróxido de sódio NHS N-hidroxisuccinimida NPs Nanopartículas PAMs Peptídeos antimicrobianos PBP2a Proteína de ligação da penicilina PBS Tampão fosfato salino PCS Espectroscopia de correlação de fótons PDI Índice de polidispersão pH Potencial hidrogeniônico PIA Polissacarídeo intercelular adesina PK piruvate kinase PPP via das pentoses-fosfato REMA Resazurin microtiter assay RMN Espectroscopia de ressonância magnética nuclear ROS espécies reativas de oxigênio rRNA RNAs ribossomais SCCmec Cassete cromossômico estafilocócico SHMT serine hydroxymethyltransferase TCA cycle tricarboxylic acid cycle tRNA RNAs de transferência TS thymidylate synthase TSA Ágar triptona de soja TSB Caldo triptona de soja UFC Unidade formadora de colônia VISA S. aureus com resistência intermediária a vancomicina VRE Enterococcus vancomicina resistente VRSA S. aureus vancomicina resistente VSSA S. aureus sensíveis à vancomicina XMP Xantosina monofosfato YchF Ribosome-binding ATPase YchF Lista de Símbolos % Porcentagem Å Angstrom ºC Graus Celsius A Ampère g Força g h Hora kDa Quilodalton kHz Quilohertz Log Logaritmo M Molar m/v Massa/volume m/z Massa/carga mA Miliampère mg Miligrama mL Mililitro mm Milímetro mM Milimolar ms Milissegundo nL/min Litros normais por minuto nm Nanômetro ppm Partes por milhão s Segundo V Volt v/v Volume/volume μg Micrograma μL Microlitro Sumário 1. Introdução ............................................................................................................................. 24 1.1. Aspectos gerais de resistência bacteriana ...................................................................... 24 1.2. Staphylococcus aureus .................................................................................................. 25 1.2.1. Biofilme ...................................................................................................................... 26 1.3. Peptídeos antimicrobianos ............................................................................................. 28 1.3.1.Melitina ........................................................................................................................ 30 1.4. Sinergismo com antibióticos ......................................................................................... 32 1.5. Nanoemulsões ................................................................................................................ 32 1.6. Nanopartículas de ouro .................................................................................................. 34 1.7. Análise Proteômica ........................................................................................................ 36 2. Objetivos ............................................................................................................................... 37 3. Material e métodos ............................................................................................................... 37 3.1. Linhagens bacterianas.................................................................................................... 37 3.2. Produtos testados ........................................................................................................... 37 3.3. Síntese de Nanopartículas de ouro conjugadas com melitina........................................ 37 3.4. Síntese de Nanoemulsões com melitina ........................................................................ 39 3.5. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) ..................................................................................................................... 40 3.6. Curva de sobrevivência (atividade inibitória e atividade bactericida) .......................... 40 3.7. Ação sobre a membrana celular..................................................................................... 41 3.7.1. Permeabilidade da membrana celular ......................................................................... 41 3.7.2. Integridade da membrana celular ............................................................................... 42 3.7.3. Efluxo de íons potássio e fosfato ................................................................................ 42 3.8. Efeito dos tratamentos na formação do biofilme ........................................................... 43 3.9. Efeito dos tratamentos em biofilmes estabelecidos ....................................................... 43 3.10. Atividade hemolítica.................................................................................................... 44 3.11. Análise da citotoxicidade da melitina e oxacilina por citometria de fluxo ................. 44 3.12. Análise proteômica de MRSA submetida a concentrações subletais de melitina e de sua associação com oxacilina ............................................................................................... 46 3.12.1. Extração e quantificação de proteínas ...................................................................... 46 3.12.2. Eletroforese unidimensional ..................................................................................... 47 3.12.3. Digestão Enzimática das proteínas ........................................................................... 47 3.12.4. Sequenciamento peptídico por espectrometria de massas ........................................ 48 3.12.5. Análise dos dados de espectrometria de massas ....................................................... 48 3.13. Análise estatística ........................................................................................................ 49 4. Resultados e Discussão ......................................................................................................... 50 4.1. Síntese de nanopartículas de ouro conjugadas com melitina ........................................ 50 4.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) ..................................................................................................................... 51 4.3. Curva de sobrevivência (atividade inibitória e atividade bactericida) .......................... 53 4.4. Ação sobre a membrana celular..................................................................................... 55 4.4.1. Permeabilidade da membrana celular ......................................................................... 55 4.4.2. Integridade da membrana celular ............................................................................... 56 4.4.3. Efluxo de íons potássio e fosfato ................................................................................ 57 4.5. Efeito dos tratamentos na formação do biofilme ........................................................... 60 4.6. Efeito dos tratamentos em biofilmes estabelecidos ....................................................... 61 4.7. Atividade hemolítica...................................................................................................... 63 4.8. Análise da citotoxicidade da melitina e oxacilina por citometria de fluxo ................... 64 4.9. Análise proteômica de MRSA submetida a concentrações subletais de melitina e de sua associação com oxacilina...................................................................................................... 68 4.9.1. MRSA tratado com melitina ....................................................................................... 69 4.9.2. MRSA tratado com oxacilina ..................................................................................... 76 4.9.3. MRSA tratado com melitina em associação com oxacilina ....................................... 77 5. Conclusões ............................................................................................................................ 80 6. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 82 Apêndice ................................................................................................................................... 99 24 1. Introdução 1 1.1. Aspectos gerais de resistência bacteriana 2 As pesquisas por alternativas terapêuticas para as doenças infecciosas são necessárias 3 e devem ser constantes. Além disto, a resistência bacteriana tornou-se um problema de saúde 4 pública mundial devido ao uso intenso dos antibióticos. Segundo o Centro de Controle e 5 Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (CDC, 2019), essa resistência vem elevando a 6 mortalidade, morbidade e os custos com saúde sendo que ao redor de 2,8 milhões de pessoas 7 foram acometidas com infecções por bactérias resistentes aos antibióticos com um custo 8 estimado em mais de 20 bilhões de dólares por ano. Em 2019, cerca de cinco milhões de 9 mortes ocorreram no mundo associadas a infecções causadas por bactérias resistentes 10 (LAXMINARAYAN, 2022). 11 Algumas bactérias oportunistas Gram-positivas e Gram-negativas apresentam grande 12 resistência aos antibióticos, como é o caso das denominadas ESKAPE: Enterococcus faecium, 13 Staphylococcus aureus (S. aureus), Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, 14 Pseudomonas aeruginosa e algumas espécies de Enterobacter spp, sendo consideradas 15 potenciais causadoras de infecções com alta risco de mortalidade. Das bactérias Gram-16 positivas as que mais podem causar infecções de difícil tratamento são o Staphylococcus 17 aureus meticilina resistente (MRSA), S. aureus com resistência intermediária à vancomicina 18 (VISA), S. aureus vancomicina resistente (VRSA) e o Enterococcus vancomicina resistente 19 (VRE) (PFALZGRAFF; BRANDENBURG; WEINDL, 2018; TSAKOU et al., 2020). 20 Os genes de resistência aos antibióticos podem ser inatos da bactéria ou podem ser 21 adquiridos. A aquisição de genes de resistência pode ocorrer por meio de mutações 22 cromossomais que acontecem aleatoriamente, em uma frequência estimada de 10-9 por gene, 23 sendo que o rearranjo de sequências de nucleotídeos pode acontecer por inversões, 24 duplicações, inserções, deleções e transposições. As bactérias também podem adquirir genes 25 de resistência por meio de plasmídeos e outros tipos de elementos genéticos móveis por meio 26 de três processos: via bacteriófagos na transdução, na transformação quando há aquisição de 27 elementos genéticos que estão no ambiente que foram liberados por bactérias mortas ou pela 28 conjugação, processo em que bactérias adquirem os elementos genéticos móveis contendo 29 genes de resistência, geralmente por meio do pili (LAI et al., 2022). 30 25 Os mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos são distintos com destaque 1 para a inativação enzimática dos antibióticos, alteração dos sítios alvos do fármaco, alteração 2 da permeabilidade do fármaco (diminuindo a concentração intracelular dos antimicrobianos) e 3 pelo uso de bombas de efluxo (expulsão do fármaco do interior da célula) (UDDIN et al. 4 2021). 5 Algumas práticas podem ser aplicadas para tentar controlar a resistência bacteriana, 6 como regular e controlar a administração de antibióticos para que não haja o uso incorreto 7 e/ou prescrições erradas de antibióticos na clínica; necessidade de minimizar o uso na criação 8 animal restringindo apenas o uso em animais doentes e sob supervisão veterinária; reportar e 9 monitorar o uso de antibióticos e o aparecimento de isolados resistentes; desenvolvimento de 10 agentes antibacterianos e pesquisa por novos modelos de liberação controlada desses 11 fármacos como nanopartículas, nanoemulsões e lipossomas (UDDIN et al., 2021). 12 A resistência antimicrobiana estava restrita aos ambientes hospitalares, até que em 13 meados de 1990, começaram a aparecer isolados de origem comunitária, com destaque para o 14 Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) USA300 que emergiu como um dos 15 mais prevalentes nos EUA, depois se espalhando para o resto do mundo (LAI et al., 2022). 16 1.2. Staphylococcus aureus 17 O Staphylococcus aureus (S. aureus) é uma bactéria Gram-positiva e comensal, 18 presente na pele e mucosas, sendo carreada por 30 a 50% da população, principalmente 19 alojada na mucosa nasal. O S. aureus apresenta capacidade de formação de biofilme e 20 produção de toxinas e é oportunista, podendo causar infecções de pele e em tecidos moles, 21 infecções crônicas de feridas, endocardites, bacteremias nosocomiais, infecções sanguíneas, 22 pneumonias, osteomielite, infecções associadas a dispositivos implantáveis como cateteres, 23 podendo ocasionar quadros de sepse e até levar os pacientes a óbito (PARASTAN et al., 2020; 24 LIU, W. et al., 2021). 25 A partir de 1961, isolados de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) 26 associados aos ambientes hospitalares emergiram no Reino Unido e novos clones apareceram 27 e se espalharam pelo mundo. No final de 1980 e começo de 1990, isolados resistentes de 28 origem comunitária começaram a surgir. As infecções por MRSA são as mesmas que as de 29 Staphylococcus aureus suscetível à meticilina (MSSA), porém são de difícil tratamento, alta 30 26 mortalidade e alto custo com maiores estadias no hospital (LIU, Y. et al., 2021; LAI et al., 1 2022). 2 Segundo o CDC, o número de casos reportados de MRSA ultrapassaram 323 mil e 3 mais de 10 mil óbitos anuais (CDC, 2019); no Reino Unido, mais de 12 mil casos anuais de 4 bacteremias por MRSA foram relatados (PHE, 2020). MRSA apresenta resistência aos 5 macrolídeos, aminoglicosídeos, tetraciclinas e fluoroquinolonas, sendo as opções mais viáveis 6 de tratamento: tigeciclina, linezolida, ceftarolina, teicoplanina, daptomicina e vancomicina 7 (LIU, W. et al., 2021). 8 A resistência de MRSA está relacionada com o gene mecA e mecC que é carreado pelo 9 elemento móvel conhecido como cassete cromossômico estafilocócico (SCCmec). Existem 12 10 tipos de SCCmec (I-XII) e todos contêm o gene mecA (com exceção do tipo XI que contém o 11 homólogo mecC) e esse gene codifica a proteína de ligação à penicilina 2a (PBP2a). A PBP2a 12 possui uma baixa afinidade para os antibióticos β-lactâmicos e na presença desses antibióticos 13 há inibição da função das quatro proteínas nativas de ligação à penicilina de S. aureus (PBP1, 14 PBP2, PPB3 e PBP4), fazendo com que esses antibióticos não sejam eficazes (LEE et al., 15 2018; LIU, W. et al., 2021). 16 1.2.1. Biofilme 17 O biofilme é uma comunidade de microrganismos sésseis que se instala em superfícies 18 abióticas ou bióticas e está envolto por uma camada de matriz extracelular produzida por 19 essas bactérias. A composição da matriz polimérica inclui: proteínas, polissacarídeos e DNA 20 externo (eDNA), conferindo a estabilidade e proteção do biofilme. O biofilme pode ser 21 formado por uma ou mais espécies bacterianas (HØIBY et al., 2010; PARASTAN et al., 22 2021). O biofilme bacteriano costuma causar infecções crônicas com antibioticoterapia 23 persistente, inflamação e danos teciduais; e geralmente ocorre nos dentes, válvulas do coração 24 (endocardite), feridas crônicas e em dispositivos implantáveis como cateteres e stents 25 (HØIBY et al., 2010). 26 A comunidade bacteriana do biofilme altera algumas características como expressão 27 gênica, produção de proteínas e a susceptibilidade aos antibióticos em relação às células 28 planctônicas. As bactérias presentes no biofilme apresentam maior resistência, cerca de 100 a 29 1000 vezes mais resistentes aos antibióticos do que as bactérias na forma planctônica e são 30 27 menos susceptíveis a ação do sistema imune do hospedeiro. Os fatores que determinam essa 1 maior resistência são: camada de matriz polimérica extracelular no qual as células estão 2 embebidas; taxa de crescimento reduzida dentro dos biofilmes devido à baixa concentração de 3 oxigênio; baixa síntese proteica e baixa atividade metabólica (na superfície essas condições 4 são favoráveis, mas no centro do biofilme há baixa atividade); e a presença de células 5 persistentes (células dormentes e não crescentes na matriz do biofilme que são de difícil 6 erradicação). Nos biofilmes há elevadas taxas de mutação e ocorrem transmissões horizontais 7 de genes, contribuindo também para a sua resistência aos antimicrobianos (HØIBY et al., 8 2010; REFFUVEILLE et al., 2014; PARASTAN et al., 2021). 9 O início da formação do biofilme começa com a bactéria planctônica se aderindo a 10 uma superfície (biótica ou abiótica) por meio de forças de van der Waals, interações estéricas 11 e eletrostáticas e interações hidrofóbicas e hidrofílicas, sendo essa adesão irreversível; depois 12 ela se adere a matriz do hospedeiro por meio dos componentes da superfície microbiana que 13 reconhecem moléculas adesivas da matriz (MSCRAMMs) e de moléculas adesivas de 14 repertório expandido (SERAMs). As MSCRAMMs são proteínas que são ancoradas na parede 15 celular de S. aureus e desempenham função de adesão, invasão de células hospedeiras, evasão 16 do sistema imune e formação de biofilme. O polissacarídeo intercelular adesina (PIA) ou 17 poly-N-succinil-β-1,6-glucosamina (PNAG) tem sua síntese controlada pelo locus adesão 18 intercelular (ica): genes icaADBC e icaR são responsáveis pela adesão intercelular das células 19 bacterianas e pela adesão das células bacterianas com a superfície. O locus ica está presente 20 na maioria dos S. aureus, sendo um possível gene acessório (RUMBAUGH; SAUER, 2020; 21 PARASTAN et al., 2021). 22 Após a adesão, ocorre a formação das microcolônias que se ligam umas às outras e 23 começam a produzir a matriz polimérica extracelular que irá recobrir todo o biofilme. O 24 quarto passo da formação é a maturação das microcolônias e o estabelecimento de canais para 25 circulação de nutrientes dentro do biofilme, sendo que diferentes lugares do biofilme 26 apresentam diferentes condições de oxigênio, substrato, pH e diferentes expressões gênicas. 27 Após sua formação, algumas células bacterianas sésseis conseguem se converter a células 28 planctônicas e se dispersam em novos locais podendo desenvolver outros biofilmes 29 (RUMBAUGH; SAUER, 2020; PARASTAN et al., 2021). 30 28 No S. aureus o gene acessório regulador (agr) do sistema de quorum sensing (locus 1 cromossomal agrBDCA) funciona como uma comunicação entre as células bacterianas do 2 biofilme, sendo capaz de perceber a quantidade de moléculas sinalizadoras e de identificar sua 3 densidade populacional e podendo alterar a expressão de genes de acordo. Esse gene é 4 responsável por regular a formação do biofilme de S. aureus, regular os fatores de virulência, 5 síntese de enzimas e a resistência aos antibióticos (LIU, W. et al., 2021; PARASTAN et al., 6 2021). 7 1.3. Peptídeos antimicrobianos 8 Os produtos naturais são uma fonte de compostos ativos, apresentando grande 9 diversidade estrutural e química e muitos mecanismos de ação, sendo ideais para o 10 desenvolvimento de novos fármacos e agentes terapêuticos. Os compostos ativos ainda podem 11 passar por modificações químicas e estruturais visando uma melhor ação antibacteriana. 12 Cerca de 60% dos compostos químicos com ação antibacteriana são originários de produtos 13 naturais (ZHANG et al., 2020; MIETHKE et al., 2021). 14 Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são moléculas de defesa derivadas de vários 15 tipos de organismos vivos desde insetos, plantas, anfíbios, microrganismos até mamíferos. 16 Em geral, os peptídeos costumam ser anfipáticos, catiônicos, pequenos (12 a 50 aminoácidos) 17 e apresentam amplo espectro de ação contra bactérias, fungos, vírus e parasitas 18 (PFALZGRAFF; BRANDENBURG; WEINDL, 2018). A melitina, uma fração do veneno da 19 abelha Apis mellifera, é um exemplo de peptídeo antimicrobiano que vem sendo estudado 20 devido a sua rápida e eficiente ação contra uma grande variedade de microrganismos. 21 São conhecidos mais de 3000 PAMs e alguns são aprovados pela FDA (U.S. Food and 22 Drug Administration): colistina, gramicidina D, daptomicina, vancomicina, oritavancina, 23 dalbavancina e telavancina (LI et al., 2021). Os PAMs podem ser classificados em três tipos: 24 (1) peptídeos lineares que formam α-hélice e não contém resíduos de cisteína; (2) peptídeos 25 que contém muitos resíduos de prolina e/ou glicina e (3) peptídeos que contém resíduos de 26 cisteína e formam pontes de dissulfeto internamente (ELEFTHERIANOS et al., 2021). 27 Existem mecanismos que demonstram como os peptídeos ativos podem romper uma 28 membrana plasmática: modelo de carpete ou modelo detergente (carpet-like ou detergent-29 29 like), modelo poro barrel-stave e modelo poro toroidal (Figura 1). Os modelos de ação estão 1 relacionados com a constituição dos PAMs e com suas estruturas secundárias (LI et al., 2021). 2 3 Figura 1. Modelos do modo de ação dos peptídeos antimicrobianos em membranas 4 plasmáticas: modelo barrel-stave, modelo poro toroidal e modelo de carpete (Fonte: 5 PASUPULETI et al., 2012). 6 No modelo de carpete ou detergente, os peptídeos se acumulam na bicamada lipídica e 7 acabam perturbando a tensão superficial, gerando poros ou defeitos na membrana celular das 8 bactérias. Para esse modelo ocorrer são necessárias muitas moléculas do peptídeo que acabam 9 recobrindo a superfície da membrana justificando por isso o nome de carpete. Nessa interação, 10 os peptídeos ficam orientados de modo paralelo às membranas e acabam perturbando a 11 ordenação lipídica, facilitando a penetração de água e promovendo a distorção celular seguida 12 de morte (LI et al., 2021). 13 Os PAMs no modelo detergente ou carpete estão em uma alta concentração de e se 14 acumulam na membrana celular, causando um rompimento e formação de micelas. Nos 15 modelos barrel-stave e poro toroidal, os peptídeos acabam se inserindo na membrana celular; 16 no barrel-stave ocorre a formação de um poro em forma de barril, onde em seu centro há 17 30 somente a superfície hidrofílica dos peptídeos e sua parte hidrofóbica fica aderida a 1 membrana celular, funcionando como um canal de íons; já no poro toroidal, os peptídeos e as 2 cabeças dos lipídios da membrana interagem e se alinham para formar poros hidrofílicos 3 (EBENHAN et al., 2014; LI et al., 2021). 4 Os PAMs que são catiônicos apresentam uma afinidade pelas membranas plasmáticas 5 aniônicas das bactérias (ricas em fosfolipídeos, fosfatidilglicerol, cardiolipina e 6 fosfatidilserina) e também ocorrem interações hidrofóbicas entre os domínios anfipáticos dos 7 peptídeos e cadeias-acil da membrana lipídica (BROWN; HANCOCK, 2006; 8 WIRADHARMA; LIU; YANG, 2012; LI et al., 2021). A ação dos PAMs sobre as bactérias 9 provoca lise celular devido ao extravasamento de íons e conteúdos intracelulares, 10 despolarização do potencial da membrana e rompimento da membrana celular (LIU, Y. et al., 11 2021). Os PAMs apresentam vários mecanismos de ação, não atuando somente nas 12 membranas celulares das bactérias, mas também sobre alvos intracelulares. Um potencial alvo 13 dos peptídeos é o DNA genômico que afeta a expressão gênica e inibição da síntese de 14 macromoléculas ou destruição de substâncias necessárias para o metabolismo celular. Os 15 PAMs também podem agir sobre os ribossomos impedindo a síntese protéica além de poder 16 atuar sobre enzimas intracelulares e organelas (LI et al., 2021). 17 1.3.1.Melitina 18 O veneno da abelha Apis mellifera contém diversos compostos ativos e há dois que são 19 mais abundantes: a melitina, que representa cerca de 50% do peso seco do veneno e a 20 fosfolipase A2 que representa em média de 10 a 12% do peso seco. Também estão presentes 21 substâncias como: aminas biogênicas (histamina, dopamina, noradrenalina), peptídeos ativos 22 (apamina e peptídeo degranulador de mastócitos – MCD), componentes enzimáticos 23 (hialuronidase e fosfatase), entre outros componentes. Alguns peptídeos derivados desse 24 veneno já tem ação antimicrobiana reportada na literatura: melitina, apamina e secapina, 25 sendo a melitina destacada por suas várias atividades biológicas e efeitos terapêuticos 26 relatados, porém com elevada toxicidade (RADY et al., 2017; CARPENA et al., 2020). 27 A melitina é um peptídeo linear, catiônico, anfipático e pequeno que apresenta 26 28 resíduos de aminoácidos (PARAY et al., 2021). Possui atividade hemolítica, devido a sua 29 capacidade de se ligar aos eritrócitos induzindo a liberação de hemoglobina e promovendo 30 liberação de conteúdos citoplasmáticos (GUHA et al., 2021). A melitina apresenta várias 31 31 propriedades biológicas já reportadas na literatura tais como antibacteriana, antiviral, 1 antifúngica, anticâncer, antiparasitária além de poder desempenhar um papel 2 imunoterapêutico e ter efeitos anti-inflamatório e analgésico (GUHA et al., 2021; PARAY et 3 al., 2021). 4 A capacidade de redução da formação de biofilmes da melitina em algumas bactérias 5 já vem sendo relatada (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, 6 Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumoniae), podendo inclusive ocasionar a destruição 7 de biofilmes, impedir a ligação das bactérias com a superfície e matar as bactérias que estão 8 na matriz extrapolimérica (DOSLER; KARAASLAN; GERCEKER, 2016; BARDBARI et al., 9 2018; PICOLI et al., 2017; GUHA et al., 2021). 10 A estrutura da melitina em soluções foi determinada por meio da espectroscopia de 11 ressonância magnética nuclear (RMN). Na sequência primária a melitina é anfipática, a parte 12 N-terminal é mais hidrofóbica que a porção C-terminal, essa parte é polar e catiônica. Quando 13 a melitina se dobra e fica em conformação α-hélice, ela continua apresentando uma parte 14 hidrofóbica na superfície e uma parte polar na superfície oposta (GUHA et al., 2021). Em 15 soluções onde a melitina se encontra com baixa força iônica e/ou em pouca concentração, ela 16 se conforma como monômero e quando se encontra em alta concentração e/ou com alta força 17 iônica, ela se conforma em um tetrâmero de estrutura α-hélice. Quando a melitina interage 18 com as membranas da bicamada lipídica, ela apresenta conformação em α-hélice, podendo 19 causar rompimento na membrana (GUHA et al., 2021; PARAY et al., 2021). 20 A interação da melitina com membranas plasmáticas causa uma permeabilização dessa, 21 permitindo a passagem de íons, água e metabólitos através da membrana, causando morte 22 celular. A ação da melitina em membranas vai variar de acordo com a composição dos 23 lipídios, concentração de lipídios, temperatura e a concentração de melitina. Então não há 24 uma certeza de qual modo a melitina age no rompimento das membranas e nem dos processos 25 moleculares que levam a esse rompimento (PANDIDAN; MECHLER, 2019; GUHA et al., 26 2021). 27 A melitina pode apresentar atividade hemolítica em eritrócitos humanos e também é 28 citotóxica para vários tipos celulares (PARAY et al., 2021), sendo que essa citotoxicidade 29 pode ser avaliada por meio da citometria de fluxo, identificando a apoptose e necrose das 30 células. Visando evitar os seus efeitos colaterais, a melitina pode ser utilizada em associação 31 32 com antibióticos ou em sistemas nanocarreadores como nanopartículas ou nanoemulsões para 1 uma melhor estabilidade e eficiência (LI et al., 2021) 2 1.4. Sinergismo com antibióticos 3 O sinergismo de produtos com ação antimicrobiana e antibióticos convencionais visa o 4 aumento da eficácia da atividade antibacteriana; redução da dose dos antimicrobianos; 5 diminuição dos efeitos colaterais e evitando o desenvolvimento de resistência já que a 6 associação utiliza diferentes mecanismos de ação (LAI et al., 2022). 7 O uso combinado de antimicrobianos pode ser uma boa alternativa quando há 8 atividade sinérgica como por exemplo: o uso de gentamicinas com beta-lactâmicos para o 9 tratamento de endocardite por Streptococcus sp.; para evitar o risco de resistência aos 10 antibióticos; em infecções com mais de uma bactéria envolvida; e também visando aumentar 11 o espectro de ação em casos de infecções por bactérias resistentes (EDWARDS et al., 2021). 12 Os peptídeos antimicrobianos em associação com os antibióticos podem ser uma 13 combinação eficiente devido a ação dos peptídeos sobre membranas como formação de poros 14 e com isto permitindo a permeabilização da membrana e consequente morte celular. Isto 15 também pode atuar facilitando a entrada dos antibióticos no interior das células bacterianas 16 agindo sobre alvos intracelulares (LI et al., 2021; LIU, Y. et al., 2021). 17 A melitina apresenta sinergismo com outros peptídeos ativos, como a nisina e com 18 antibióticos convencionais e possui atividade bactericida contra bactérias resistentes aos 19 antibióticos convencionais (DOSLER; GERCEKER, 2012; DOSLER; KARAASLAN; 20 GERCEKER, 2016 BARDBARI et al., 2018; GUHA et al., 2021). 21 1.5. Nanoemulsões 22 Os compostos ativos de produtos naturais podem ter sua ação melhorada pela 23 nanotecnologia por ser possível a sua conjugação em nanopartículas ou nanoemulsões, 24 podendo obter maior solubilidade e aumento dos efeitos farmacológicos com melhor eficácia 25 e menos efeitos indesejados (ZHANG et al., 2020). 26 A nanoemulsão é uma dispersão coloidal composta de dois líquidos não solúveis que 27 são estabilizados por um agente surfactante. As nanoemulsões podem atuar como sistemas de 28 33 liberação controlada de fármacos e possuem tamanho médio que varia de 50 a 1000 nm 1 (CHANGEDIYA; JANI; KAKDE, 2019). 2 A diferença entre nanoemulsões e emulsões se dá pelo tamanho e formato das 3 partículas na solução. Existem duas formas clássicas de preparação de nanoemulsão sendo 4 estes métodos de alta energia ou baixa energia. No método de alta energia, são necessárias 5 energias mecânicas e/ou químicas, fazendo com que haja uma homogeneização de alta 6 pressão, sendo comum o uso de ultrassonicadores; enquanto o de baixa energia só se aproveita 7 das características físico-químicas do sistema (CHANGEDIYA; JANI; KAKDE, 2019). 8 Existem alguns métodos de preparação de nanoemulsões, sendo eles: 9  Inversão de fase: a nanoemulsão é gerada por meio da energia química 10 resultante do processo de emulsificação; 11  Inversão de fase por temperatura: a composição é constante, apenas a 12 temperatura é alterada, modificando as afinidades dos surfactantes pela água e 13 pelo óleo; 14  Composição da Inversão de fase: a composição da nanoemulsão é alterada em 15 temperatura constante. Nesse método a água ou óleo é adicionado 16 frequentemente sobre a misturas de óleo/surfactante ou água/surfactante; 17  Sonicação: tamanho da gotícula é reduzido por meio da sonicação; 18  Ultrassonicação: a sonda do ultrassonicador entra diretamente em contato com 19 o líquido provocando vibração mecânica e induzindo a cavitação (fenômeno 20 físico em que ocorre a vaporização de um líquido, formando bolhas de vapor 21 em um meio fluido, por causa da redução da pressão); 22  Microfluidizador: processa fluidos em altas pressões, nesse sistema são 23 produzidos impacto, cisalhamento e cavitação, produzindo então a 24 nanoemulsão; 25  Emulsificação de alta energia: algumas nanoemulsões precisam de energias 26 mecânicas ou químicas para serem formadas. Nos métodos de alta energia, a 27 energia mecânica é aplicada por homogeneizadores de alta pressão, agitação de 28 alto cisalhamento e/ou geradores de ultrassom, fazendo com que haja o 29 rompimento das fases de água e óleo e a formação de nanoemulsões; 30 34  Homogeneizador de alta pressão: utiliza o homogeneizador para produzir 1 nanoemulsões de até 1 nm, através de forças de cisalhamento hidráulico, 2 turbulência intensa e cavitação, pode ser utilizado para gerar gotas do tamanho 3 desejado; 4  Agitação de alto cisalhamento: as gotículas podem ser reduzidas utilizando 5 esse processo, porém o tamanho médio delas não irá passar de 200 nm; 6  Emulsificação de baixa energia: nesse método há formação de gotículas 7 pequenas e uniformes em relação ao processo de alta energia. Nesse método 8 são usadas altas concentrações de emulsificantes sintéticos; 9  Nanoemulsificação espontânea: ocorre de maneira espontânea por meio da 10 diluição em temperaturas constantes não havendo transição de fases durante a 11 síntese. A fase oleosa contém uma substância solúvel em água e quando 12 misturada com a água são formadas gotículas de óleo em água 13 (CHANGEDIYA; JANI; KAKDE, 2019). 14 O índice de polidispersão (PDI) sugere a homogeneidade do sistema, quanto mais alto 15 o PDI, menor é a uniformidade do tamanho da gota das nanoemulsões. O PDI e o tamanho 16 das partículas são avaliados por meio da espectroscopia de correlação de fótons (PCS). 17 Também devem ser analisadas a estabilidade das nanoemulsões frente a mudanças de 18 temperatura, umidade e luz (CHANGEDIYA; JANI; KAKDE, 2019). 19 1.6. Nanopartículas de ouro 20 As nanopartículas (NPs) são partículas com diâmetro que pode variar de 1 a 100 nm, 21 sendo diferenciadas de materiais bulk por suas características físicas, químicas, mecânicas 22 (dispersão de tamanho, área e razão de volume, estruturas de superfície, forma e aglomeração) 23 e terapêuticas. As nanopartículas na biologia são muito utilizadas para detecção de imagens 24 médicas (exemplo de uso em ressonância magnética); em ensaios biomoleculares; na 25 distribuição de medicamentos em um alvo específico; e no rastreamento celular (HAMMAMI 26 et al., 2021). 27 As nanopartículas de ouro (AuNPs) costumam ser melhores que outras nanopartículas 28 metálicas, pois apresentam alta estabilidade, boa solubilidade, biocompatibilidade e são 29 inertes (HAMMAMI et al., 2021). As AuNPs quando expostas a luz formam espectros de 30 absorção na UV-Visível, pois o campo elétrico oscilante (fóton incidente) é constante com a 31 35 excitação coletiva dos elétrons de condução, absorvendo radiação eletromagnética em uma 1 certa energia sendo esse fenômeno conhecido como ressonância plasmônica de superfície 2 localizada (LSPR). (PHILIP, 2008; KHAN; SAEED; KHAN, 2019). A mudança de cor que 3 ocorre na formação das AuNPs, de vermelho escuro para roxo, se deve ao aumento do 4 tamanho das partículas e isso ocorre devido LSPR e está na região visível do espectro 5 eletromagnético, podendo ser avaliada através da espectroscopia UV-Visível (MENON; 6 RAJESHKUMAR; KUMAR, 2017). 7 A síntese de AuNPs pode ocorrer por meio de diferentes processos físicos, químicos 8 e/ou biológicos. Alguns parâmetros podem modificar o tamanho das AuNPs: pH, temperatura 9 da reação, tempo de incubação, concentração do extrato de plantas (síntese verde), 10 concentração do sal metálico, entre outros. Alguns dos processos clássicos de síntese das 11 AuNPs são: 12  Síntese verde: os extratos de plantas são utilizados como redutores do ouro, 13 convertendo o Au3+ para Au0 e estabilizando as AuNPs. Os extratos de plantas 14 que contém algumas biomoléculas de polifenóis, flavonoides, polissacarídeos, 15 amionoácidos, fenóis e proteínas podem ser utilizados para esse fim; 16  Método de Turkevich-Frens: AuNPs podem ser sintetizadas com o agente 17 redutor citrato de sódio que tem uma boa atividade de peroxidase, o citrato é 18 negativamente carregado e apresenta um grande número de grupos carboxila 19 na superfície das AuNPs. Nessa reação, o citrato de sódio mais o ácido 20 tetracloroáurico na presença de água, sendo então o citrato oxidado a acetona 21 dicarboxílica (funciona como estabilizador) e o ácido tetracloroáurico é 22 reduzido a ouro metálico, formando as AuNPs estabilizadas; 23  Método de Brust-Schiffrin: nessa síntese há a formação de AuNPs 24 estabilizadas por tiolato. É uma metodologia simples, AuNPs com alta 25 estabilidade e é fácil para funcionalizar as AuNPs; 26  Método de Martin: o agente redutor é o borohidreto de sódio (NaBH4) e o 27 ácido clorídrico (HCl) e o hidróxido de sódio (NaOH) são utilizados como 28 agentes estabilizadores (FAN; CHENG; SUN, 2020; HAMMAMI et al., 2021). 29 A conjugação de PAMs com nanopartículas podem apresentar certas vantagens como 30 aumento da afinidade e da especificidade aos alvos das bactérias; efeito sinérgico com ação 31 36 bactericida, inclusive contra bactérias resistentes; facilitar a entrada dos PAMs; garantir a 1 ação sob os alvos intracelulares; menor toxicidade; alto espectro de ação contra bactérias 2 Gram-positivas e Gram-negativas; e baixa probabilidade de desenvolvimento de resistência 3 devido aos vários mecanismos de ação dos PAMs (GERA; KANKURI; KOGERMANN, 4 2021; HAN et al., 2021). 5 1.7. Análise Proteômica 6 A análise proteômica serve para o estudo de uma mistura de proteínas complexas, 7 como por exemplo um lisado de bactéria, podendo quantificar e identificar as proteínas de 8 uma amostra. Para a realização desse estudo, a amostra precisa ter as suas proteínas e/ou 9 peptídeos separados antes da inserção no espectrômetro de massas. Um dos métodos 10 utilizados para essa separação é a separação de proteínas por meio da eletroforese em gel 11 bidimensional (2DE), seguida pela digestão da amostra com tripsina e por fim a amostra é 12 separada por cromatografia líquida (LC), tipicamente de fase reversa, podendo já ser acoplado 13 com um instrumento de ionização por eletrospray (ESI) ou por meio do Orbitrap, as amostras 14 podem só passar pela digestão por tripsina e já passarem pelo espectrômetro (TSAKOU et al., 15 2020). 16 Para o estudo de lisados bacterianos, as modificações pós-traducionais (MPTs) de 17 proteínas costumam apresentar uma relevância biológica, podendo ser utilizadas para avaliar 18 diferenças entre tratamentos, sendo interessante não só a identificação, como a quantificação 19 das proteínas presentes na amostra, fornecendo um melhor entendimento do mecanismo 20 biológico investigado. Existem duas técnicas para o estudo de lisados bacterianos, sendo a 21 iTRAQ (método baseado na marcação de peptídeos) e a label-free (baseada na intensidade do 22 sinal precursor ou na contagem espectral) (TSAKOU et al., 2020). 23 A proteômica pode servir para identificar os perfis de proteínas em bactérias 24 resistentes; descobrir novos biomarcadores; analisar as interações patógeno e célula 25 hospedeira; avaliar a resposta das bactérias frente aos antimicrobianos e verificar ação das 26 nanotecnologias sobre as bactérias. Alterações dos perfis proteicos de um isolado bacteriano 27 podem demonstrar os níveis de resistência ou as diferentes reações fenotípicas da bactéria 28 frente a um antimicrobiano, podendo ser realizado um estudo comparativo (TSAKOU et al., 29 2020). 30 37 2. Objetivos 1 Os objetivos desse estudo foram realizar a síntese de uma nanopartícula de ouro 2 conjugada com melitina e duas formulações de nanoemulsões contendo melitina, verificar o 3 sinergismo entre a melitina e antibióticos (oxacilina e cefalotina), testar a ação antibacteriana 4 da melitina, oxacilina, cefalotina, melitina em combinação com oxacilina e das 5 nanopartículas e nanoemulsões contendo melitina sobre isolados de MRSA, avaliar a 6 atividade antibiofilme e investigar os possíveis mecanismos de ação dos tratamentos que 7 apresentaram ação antibacteriana frente a MRSA. 8 3. Material e métodos 9 3.1. Linhagens bacterianas 10 As linhagens bacterianas testadas foram: MRSA ATCC 33591 e um isolado clínico de 11 MRSA proveniente do Hospital das Clínicas de Botucatu e que se encontram armazenadas no 12 Departamento de Ciências Químicas e Biológicas, sendo ambas linhagens fortes produtoras 13 de biofilme. 14 3.2. Produtos testados 15 A melitina utilizada foi obtida através do veneno da abelha Apis mellifera e adquirida da 16 Sigma-Aldrich (Merck®) (pureza ≥ 65%). A oxacilina foi obtida também da Sigma-Aldrich 17 (pureza 815-950 μg/mg). A cefalotina foi fornecida pela empresa Teuto®. 18 Os produtos utilizados na síntese de nanopartículas: ácido tetracloroáurico triidratado 19 (HAuCl4 · 3H2O), ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) 20 carbodiimida (EDC), e N-hidroxisuccinimida (NHS) e tampão salina fosfato (PBS) foram 21 todos adquiridos da empresa Sigma-Aldrich. 22 3.3. Síntese de Nanopartículas de ouro conjugadas com melitina 23 A metodologia foi adaptada de Xie et al., 2009. O ouro proveniente do ácido 24 tetracloroáurico triidratado (HAuCl4 · 3H2O), é reduzido a ouro metálico por ação do citrato 25 de sódio, que atua como um agente redutor fraco e que também é um agente de revestimento 26 das nanopartículas de ouro (AuNPs). 27 https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/product/sigma/m7391?context=product https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/product/sigma/28221?context=product 38 Em uma solução de 95 mL de HAuCl4 · 3H2O, de 1,0 x 10-3 mol/L a 80 ºC, foi 1 adicionada uma solução de 5 mL de citrato de sódio 1% e a mistura permaneceu sob agitação 2 magnética a 95-100 ºC por 45 minutos. Houve uma mudança de coloração, de amarelo para 3 vermelho (Figura 2), indicando a formação de nanopartículas de ouro. As AuNPs obtidas 4 foram centrifugadas a 1500 g por 30 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi 5 ressuspendido em 3 mL de água deionizada. 6 7 Figura 2. Mudança de coloração durante o preparo da solução de AuNPs. A: solução de 8 HAuCl4 · 3H2O sob agitação magnética; B: adição da solução de citrato de sódio; C: tempo 0: 9 logo após a adição da solução; D: 5 minutos após; E: 20 minutos após; F: 45 minutos após 10 (PEREIRA, A.F.M., 2022). 11 Posteriormente, as nanopartículas foram submetidas a 5 minutos em ponteira 12 ultrassônica. Para a funcionalização da superfície das AuNPs, foram adicionados 30 μL de 13 uma solução de ácido 11-mercaptoundecanóico (11-MUA) [1,0 x10-3 mol/L, diluído em 14 álcool etílico absoluto] em 3 mL de AuNPs e ficaram sob incubação a 25 ºC por 1 hora. 15 39 Foram preparadas duas soluções: uma de 5 μL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) 1 carbodiimida (EDC) [1,0 x10-3 mol/L, diluído em tampão fosfato salino- PBS com pH 7,4] e 2 uma de 2 μL de N-hidroxisuccinimida (NHS) [1,0 x10-3 mol/L, diluído em PBS com pH 7,4] 3 e estas foram misturadas e imediatamente adicionadas à solução de AuNPs funcionalizada. 4 Após isso, as AuNPs ficaram sob incubação a 25 ºC por 1 hora. 5 Por fim, foi adicionado 1,5 mg de melitina pura nas AuNPs e as nanopartículas de 6 ouro contendo melitina foram incubadas a 4 ºC por 24 horas. Após o tempo de incubação, as 7 AuNPs com melitina foram centrifugadas a 1500 g por 30 minutos, o sobrenadante foi 8 armazenado e as AuNPs com melitina foram resuspendidas em tampão salina fosfato - PBS 9 (pH 7,4). O sobrenadante foi utilizado para quantificar a melitina que ficou presente nas 10 AuNPs, por meio da metodologia de Bradford (1976), sendo obtida a concentração final de 11 aproximadamente 250 μg/mL de melitina nas AuNPs ressuspendidas com PBS. 12 Para a caracterização das propriedades ópticas e da estrutura eletrônica das AuNPs foi 13 utilizada a espectrofotometria na região de UV-visível, as formulações AuNPs e AuNPs 14 conjugadas com melitina foram lidas no equipamento UV-M51 da BEL Engineering, essa 15 leitura foi realizada em um intervalo de comprimento de onda de 300 nm a 1000 nm. Essa 16 metodologia foi adaptada de Philip (2008). 17 3.4. Síntese de Nanoemulsões com melitina 18 Foram preparadas duas nanoemulsões diferentes modificando os agentes surfactantes, 19 feitas conforme metodologias adaptadas: nanoemulsão 1 utilizou 2,0% de óleo de soja, 2,0% 20 de tween 80, 1,0% de lecitina de soja e água destilada, conforme volume final desejado 21 (MEHMOOD; AHMED, 2020); já a nanoemulsão 2 utilizou 1,5% de óleo soja, 2,0% de 22 tween 20, 3,0% de span 80 e água (volume final desejado) (GOYAL et al., 2017; 23 YOUSEFPOOR et al., 2022). As duas nanoemulsões foram preparadas da mesma maneira, a 24 melitina foi diluída diretamente na água destilada e a fase oleosa das nanoemulsões foi 25 gotejada lentamente sobre o volume de água contendo melitina, em um recipiente em banho 26 de gelo, por ultrassonicação. Após a adição da fase oleosa, as nanoemulsões ficaram sobre 27 ultrassonicação por 5 min. Todo o processo de preparo e armazenamento das formulações se 28 deu sob abrigo da luz, para evitar a oxidação dos seus componentes, e após a formulação, elas 29 foram armazenadas em temperatura de geladeira (± 4 oC). Foram preparados 12 mL de cada 30 40 nanoemulsão contendo 3 mg de melitina incorporada, obtendo nanoemulsões com 1 concentração final de 250 μg/mL de melitina. 2 3.5. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração 3 bactericida mínima (CBM) 4 Foram realizados os ensaios de sensibilidade de acordo com a metodologia Resazurin 5 Microtiter Assay (REMA) adaptada de Martin et al. (2003), em microplacas de elisa de 96 6 poços, sendo as concentrações obtidas em Mueller Hinton caldo (MHC) em um volume final 7 de 200 μL. Os ensaios foram realizados em triplicata, conforme preconizado por Clinical and 8 Laboratory Standards Institute – CLSI (CLSI, 2018). Volumes de 100 μL dos produtos 9 testados foram colocados na placa de 96 poços, nas concentrações desejadas. Foram 10 preparadas suspensões bacterianas de acordo com a escala 0,5 de McFarland que corresponde 11 a 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL), seguido de inoculação das 12 bactérias nos respectivos poços das microplacas (100 μL) com uma concentração bacteriana 13 corrigida para o equivalente a 105 UFC/mL. As placas foram incubadas a 37 ºC por 24 horas. 14 Controles negativos foram feitos em todos os ensaios (MHC caldo sem inóculo) e os controles 15 de esterilidade dos produtos testados (MHC caldo com os antibacterianos). 16 Após incubação, foram realizadas leituras dos respectivos valores de concentração 17 inibitória mínima (CIM), definida como a menor concentração de cada tratamento capaz de 18 inibir o crescimento bacteriano, por meio da impressão visual com a adição do composto 19 revelador de oxirredução resazurina (0,01%), sendo verificado o crescimento quando a 20 coloração mudar da cor violeta para rosa. 21 A concentração bactericida mínima (CBM) foi obtida por meio de subculturas das 22 concentrações testadas nos ensaios de microdiluição utilizando placas de ágar Mueller Hinton 23 (MHA). As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 24 horas, sendo a CBM a menor 24 concentração em que não foi visualizada a formação de colônias. 25 3.6. Curva de sobrevivência (atividade inibitória e atividade bactericida) 26 Foram realizados os ensaios para obtenção das curvas de sobrevivência (time kill curve) 27 de atividade inibitória e atividade bactericida visando interação sinérgica dos antibióticos 28 41 oxacilina e cefalotina com a melitina sobre isolados de MRSA. Foram testados nesse ensaio 1 apenas os produtos que apresentaram atividade antibacteriana em MRSA. 2 A metodologia foi realizada de acordo com Pashaei et al. (2019) com modificações. Para 3 os ensaios de atividade inibitória foram realizados em microplacas de elisa de 96 poços, 4 utilizando o MHC com um volume final de 200 μL. Foram utilizadas as concentrações de 5 CIM para os produtos isoladamente (melitina, oxacilina e cefalotina) e combinações nas 6 proporções de 25% da CIM da melitina com 25% da CIM de oxacilina e 25% da CIM da 7 melitina com 25% da CIM de cefalotina. A combinação entre dois antibacterianos mostra 8 sinergismo quando a CIM para cada produto na combinação é menor ou igual a 25% das 9 CIMs de um produto isolado (MAHON; LEHMAN, 2019). Posteriormente foi adicionado o 10 inóculo de MRSA padronizado pela escala 0,5 de McFarland com uma concentração 11 bacteriana corrigida para o equivalente a 105 UFC/mL. Um controle contendo apenas o 12 inóculo de MRSA com meio de cultura também foi feito. As placas foram incubadas a 37 oC 13 por 24 horas em leitor de microplacas (Epoch 2 – BioTek) e leituras de contagem foram feitas 14 a cada 2 horas por 24 horas a 600 nm. Os ensaios foram feitos em triplicata. 15 Para determinação da atividade bactericida ou bacteriostática, alíquotas de outra placa 16 feita nas mesmas condições da incubada no leitor, foram inoculadas em MHA e incubadas a 17 37 oC por 24 horas. As UFC/mL foram expressas em log 10 UFC/mL. Os efeitos dos agentes 18 antimicrobianos (após 24 horas), foram considerados sinérgicos bacteriostáticos quando a 19 redução foi ≥2 e ≤3 log10 UFC/mL e bactericidas quando houve uma redução ≥3 log10 20 UFC/mL em relação ao controle (meio de cultura com inóculo de MRSA) (DOSLER, S.; 21 KARAASLAN; GERCEKER, 2016). 22 3.7. Ação sobre a membrana celular 23 3.7.1. Permeabilidade da membrana celular 24 A permeabilidade da membrana celular bacteriana foi determinada por meio de 25 metodologia adaptada descrita por Diao et al. (2014) e expressa em forma de condutividade 26 elétrica relativa. Após incubação à 37 ºC por 24 horas, a cultura de MRSA foi centrifugada a 27 3100 g por 10 min. O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com solução de 28 glicose 5% até que sua condutividade elétrica ficou próxima da condutividade elétrica da 29 solução de glicose 5% não inoculada. Concentrações no valor da CIM e 2 vezes o valor da 30 42 CIM (2x CIM) da melitina, oxacilina e da combinação de melitina + oxacilina foram 1 adicionadas à solução de glicose 5% e os valores de condutividade elétrica, assumidos como 2 L1. Foram adicionadas as mesmas concentrações dos produtos testados à solução isotônica de 3 MRSA e a cultura foi incubada a 37 ºC por 4 horas e depois foram realizadas as medições da 4 condutividade elétrica e os valores foram assumidos como L2. O controle foi obtido pela 5 condutividade elétrica de solução de glicose 5% contendo a cultura bacteriana e fervida em 6 banho-maria por 5 minutos (este valor foi considerado o L0). Essa foi a fórmula utilizada para 7 o cálculo da condutividade: 8 Condutividade elétrica relativa (%) = (L2 –L1) / L0 x 100 9 3.7.2. Integridade da membrana celular 10 A integridade da membrana celular de MRSA foi verificada por meio da determinação dos 11 constituintes intracelulares liberados no meio extracelular, incluindo extravasamento de 12 proteínas, medida por meio da metodologia de Bradford (1976) e liberação de ácidos 13 nucleicos de acordo com o método de Lv et al. (2011) modificado. Uma cultura de 50 mL de 14 de MRSA foi centrifugada (15 min, 5000 g), lavada 3 vezes com tampão fosfato e 15 ressuspendida em tampão fosfato 0,1 M. Cinco mL da suspensão celular foi incubada a 37 ºC 16 sob agitação por 4 horas na presença de diferentes concentrações (CIM e 2x CIM) de melitina, 17 oxacilina e da combinação de melitina + oxacilina. Dois mililitros de cada amostra foram 18 coletados e centrifugados a 10000 g por 7 min a 4 ºC. Os sobrenadantes foram coletados e 19 transferidos para uma microplaca de 48 poços e foram determinadas as concentrações de 20 proteínas extravasadas pelo método de Bradford com densidade óptica (DO) lida a 595 nm e 21 também foram determinados os ácidos nucleicos liberados nos sobrenadantes medindo-se a 22 absorção UV a 260 nm em espectrofotômetro. 23 3.7.3. Efluxo de íons potássio e fosfato 24 A concentração de íons potássio e fosfato foi determinada de acordo com a metodologia 25 modificada de Bajpai et al. (2016). Células de MRSA foram expostas a diferentes 26 concentrações de melitina, oxacilina e da combinação melitina + oxacilina (CIM e 2x CIM) 27 em água peptonada (8,5 g de NaCl + 1 g de peptona + 1 litro de água destilada) nos tempos 0, 28 2 e 4 horas. A cada intervalo de tempo, as concentrações de íons potássio e fosfato foram 29 medidas através dos kits de reação colorimétrica com tiras de teste e reagentes: MQuantTM 30 43 Potassium test e MQuantTM Phosphate test, de acordo com as instruções recomendadas pelo 1 fabricante. A concentração de fosfato (PO4 3-) e potássio (K) foi medida de modo 2 semiquantitativo por meio da comparação visual da zona de reação da fita com as escalas de 3 cores presentes no kit. O kit de potássio apresenta uma faixa de medição de: 250 – 450 – 700 4 – 1000 – 1500 mg/L K e a faixa do kit de fosfato é de: 10 – 25 – 50 – 100 – 250 – 500 mg/L 5 PO4 3-. Os resultados foram expressos em quantidade de íons (mg/L) livres medidos em cada 6 intervalo de tempo. 7 3.8. Efeito dos tratamentos na formação do biofilme 8 Diferentes concentrações subinibitórias, no valor de 25%, 50% e 75% da CIM, de 9 melitina, oxacilina e a combinação de ambas foram testadas na formação de biofilme de 10 MRSA por meio da metodologia adaptada de Stepanovic´ et al. (2007). Os isolados foram 11 cultivados overnight em 4 mL de caldo triptona de soja (TSB) contendo 1% de glicose e 12 padronizadas pela escala 0,5 de McFarland. 100 µL do inóculo foram dispensados em cada 13 poço de uma placa de 96 poços de fundo chato contendo 100 µL de diferentes concentrações 14 subinibitórias dos produtos testados ou 100 µL de TSB 1% glicose (para controle). Após 15 incubação estática (37 ºC/48 h), cada poço foi lavado três vezes com 200 µL de tampão PBS 16 estéril (pH 7,4) e a placa foi incubada a 25 ºC por 4h. O biofilme formado no fundo do poço 17 foi fixado com 150 µL de metanol absoluto por 20 min e após secagem overnight em 18 temperatura ambiente, o biofilme foi corado com 150 µL de cristal violeta 1% por 15 min, 19 posteriormente, a placa foi lavada em água corrente para retirada do excesso de corante e os 20 biofilmes corados foram ressuspendidos em 150 µL de ácido acético glacial (33%) para a 21 realização da leitura em espectrofotômetro a 570 nm. A formação de biofilme foi determinada 22 por meio da fórmula: (média do valor do tratamento/média do valor do controle) x 100 23 (Nostro et al., 2007). 24 3.9. Efeito dos tratamentos em biofilmes estabelecidos 25 Diferentes concentrações suprainibitórias, variando do valor da CIM a 20 vezes o valor da 26 mesma, de melitina, oxacilina e da combinação de ambas foram testadas na erradicação de 27 biofilme de MRSA por meio da metodologia adaptada de Johnson et al. (2002). As linhagens 28 foram cultivadas em 4 mL de TSB acrescido de 1% de glicose, padronizadas pela escala 0,5 29 de McFarland. 200 µL do inóculo foram dispensados em cada poço de uma placa de 96 poços 30 de fundo chato e a placa foi incubada a 37 ºC por 48 h, depois as células planctônicas foram 31 44 removidas e cada poço foi lavado três vezes com tampão PBS estéril (pH 7,4). Em seguida, 1 cada poço recebeu 200 µL de TSB contendo diferentes concentrações dos produtos testados e 2 200 µL de TSB (controle). As placas foram incubadas por 24 h a 37 ºC e depois lidas em 3 espectrofotômetro a 600 nm. Os valores de OD600 foram utilizados para verificar a 4 capacidade de remoção do biofilme maduro em relação ao controle. Amostras dos biofilmes 5 foram coletadas do fundo dos poços com auxílio de alças, semeadas em placas de ágar 6 triptona de soja (TSA) e incubadas (72 h/37 ºC). A mínima concentração de erradicação do 7 biofilme (BEC) foi determinada como a menor concentração na qual não houve crescimento 8 nas placas de TSA. 9 3.10. Atividade hemolítica 10 Para a realização do ensaio de atividade hemolítica, foi utilizado sangue de um doador 11 e esse experimento passou por avaliação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade 12 de Medicina de Botucatu - UNESP (Número do parecer: 3.720.202). 13 A atividade hemolítica foi avaliada conforme metodologia de Zarrinnahad et al. (2017). 14 O sangue heparinizado foi centrifugado a 1500 g por 10 min e depois foi lavado 3 vezes com 15 tampão fosfato salino (PBS). O sobrenadante foi descartado e uma suspensão de 2% dos 16 eritrócitos foi preparada com PBS. Diferentes concentrações de melitina, oxacilina e a 17 combinação de ambas (4x CIM, 2x CIM, CIM, 50% CIM e 25% CIM) foram diluídas em 18 PBS para se obter diferentes concentrações e foram pipetadas em uma placa de 96 poços junto 19 com 100 μl dos eritrócitos a 2%. O PBS e o Triton X-100 (1%) foram utilizados como 20 controles negativo e positivo, respectivamente. A placa foi incubada a 37 ºC por 2 horas e 21 depois centrifugada a 1100 g por 10 min. 100 μl do sobrenadante foram transferidos em outra 22 placa de 96 poços e a densidade óptica (DO) foi lida a 540 nm. A porcentagem hemolítica foi 23 calculada por meio da fórmula: ([DO amostra – DO controle negativo)]/ (DO controle 24 positivo – DO controle negativo)] x 100. 25 3.11. Análise da citotoxicidade da melitina e oxacilina por citometria de fluxo 26 Os produtos utilizados nesse ensaio foram testados de acordo com a CIM determinada 27 para a cepa MRSA ATCC. Para o ensaio, foram utilizados os valores de CIM e 2x CIM dos 28 tratamentos melitina, oxacilina e mel+oxa. E os tempos utilizados para o contato com a célula 29 45 testada foram determinados nos ensaios de curva de sobrevivência, sendo levado em conta o 1 tempo em que os produtos mostraram ser bactericidas. 2 Foram utilizadas as células, de linhagem comercial, aneuploides imortalizadas 3 derivadas de queratinócitos epidermais humanos (HaCaT). As células foram incubadas a 4 37 °C e 5% CO2 em DMEM 10% SFB com ausência de vermelho fenol. A suspensão celular 5 foi obtida de células em confluência máxima de 80% em frascos Tissue Treated de 75 cm2. As 6 células foram tratadas nas concentrações 5 e 10 µg/ mL de Melitina, por 4 horas, Oxacilina 16 7 e 32 µg/ mL por 4 horas, Melitina 2 µg/ mL + Oxacilina 4 µg/ mL por 8 horas e Melitina 4 8 µg/ mL + Oxacilina 8 µg/ mL por 8 horas. A viabilidade da suspensão celular pré-exposição 9 aos tratamentos foi determinada por contador automatizado Countess®. Realizou-se 10 exposição em diferentes tempos. 11 Após a exposição, as células foram marcadas com Anexina V (FITC) e Iodeto de 12 Propídeo (BD, Pharmigen®) conforme especificações do fabricante. Após marcação, 13 procedeu-se a leitura em citômetro de fluxo FACSCalibur BD® e análise em Cell Quest Pro 14 PAINT-A-GATE BD®. Após leitura, gerou-se gráficos em formato dot plot cuja distribuição 15 da população de células analisada foi feita em quatro quadrantes. No gráfico de perfil 16 morfológico, eixo horizontal Forward Scatter (FSC-H) representa o tamanho das células. O 17 eixo vertical Side Scatter (SSC-H), por sua vez, mostra-nos a granulosidade celular. Para os 18 experimentos foram utilizados controle negativo (CTL) sem a presença dos produtos 19 avaliados (HENRY; HOLLVILLE; MARTIN, 2013). 20 A Tabela 1 apresenta os dados para a interpretação das imagens geradas na citometria 21 de fluxo. 22 46 Tabela 1. Interpretação dos resultados de citotoxicidade por citometria de fluxo, levando-se 1 em conta o perfil de coloração e de morfologia da população celular analisada. 2 Marcação Estado da população das células Quadrante Anexina V (-) Iodeto de propídeo (-) Células duplo negativos (sem processo de morte) LL Anexina V (-) Iodeto de propídeo (+) Células positivas para IP (morte tardia) UL Anexina V (+) Iodeto de propídeo (-) Células positivas para Anexina V (apoptose) LR Anexina V (+) Iodeto de propídeo (+) Células duplo-positivas (morte tardia) UR 3.12. Análise proteômica de MRSA submetida a concentrações subletais de 3 melitina e de sua associação com oxacilina 4 3.12.1. Extração e quantificação de proteínas 5 Para esse ensaio foi utilizada apenas a cepa MRSA ATCC e os ensaios foram 6 realizados em triplicata em toda a análise proteômica. A metodologia utilizada na análise 7 proteômica foi a de Cavalcante et al. (2022). As quatro amostras utilizadas para a análise 8 proteômica foram: MRSA (controle) e MRSA juntamente com concentrações subinibitórias 9 no valor de 25% CIM de melitina (1,3 µg/mL), 25% da CIM de oxacilina (4 µg/mL) e 25% da 10 CIM da associação melitina e oxacilina (0,5 µg/mL de melitina + 1 µg/mL de oxacilina). 11 Os isolados de MRSA foram inoculados em Mueller Hinton Caldo II (MHCII), 12 incubados a 35 ºC por 24 horas e padronizados na escala 0,5 de MacFarland e incubados em 13 erlenmeyers contendo 100 mL de MHCII a 37 ºC por 18 horas juntamente com os tratamentos. 14 Após 18 horas, 50 mL de cada tratamento foram centrifugados por 15 minutos, 3220 g, a 4° C. 15 O sobrenadante foi removido e os pellets bacterianos foram lavados três vezes com PBS (10 16 mM, pH 7.4). Por fim, os pellets foram ressuspendidos com 200 uL de tampão de lise (Uréia 17 8 M, NaCl 75 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8, MgCl2 2 mM, Inibidor de Protease Roche 1x, 18 47 Benzonase 1 U) para rompimento celular osmótico das 4 amostras testadas. Para o 1 rompimento celular mecânico, as amostras foram submetidas ao ultrassom com probe: 2 equipamento Sonics Vibra-Cell VCX-600 Ultrasonic Processor, utilizando 5 pulsos de 1 3 minuto (Potência: 25 kHz, Amplitude: 20%, com 1 minuto de intervalo entre os ciclos de 4 sonificação) na presença de gelo moído. Ao final desse processo, as amostras foram 5 centrifugadas a 14.000 g por 30 minutos e os sobrenadantes (200 µL) foram coletados e 6 transferidos para microtubos plásticos novos. 7 As proteínas presentes nas amostras foram quantificadas pelo método de Bradford 8 (Bradford, 1976), utilizando o kit BioRad® Protein Assay, tendo soro de albumina bovina 9 (BSA), como proteína padrão. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro a 595 nm (1 10 μL da amostra em cada poço). 11 3.12.2. Eletroforese unidimensional 12 O controle de qualidade das extrações de proteínas foi realizado por meio da 13 eletroforese unidimensional, sob condições desnaturantes em sistema vertical (Mini VE, GE 14 Healthcare, Uppsala, Suécia), conforme metodologia de Laemmli, 1970. O gel de separação à 15 12% (m/v) e de empilhamento à 5% (m/v) de poliacrilamida foram utilizados para separação 16 das proteínas. Foram utilizados 100µg/10µL de proteína total de cada amostra por poço, 17 diluída (1:5) em tampão de corrida, contendo TRIS-HCl 60 mM, pH 6.8, 50% (v/v) glicerol, 2% 18 (m/v) SDS, 23 mM 2-mercapetanol e 0,1% (m/v) azul de bromofenol. As amostras foram 19 homogeneizadas e submetidas à 70 ºC em banho seco durante 7 minutos. O marcador de 20 massa molecular (Low Molecular Weight Markers, 96-14,4 kDa, GE Healthcare, Uppsala, 21 Suécia) foi utilizado para monitorar a corrida. A separação proteica foi efetuada sob 22 amperagem constante (15 mA/gel) e voltagem aberta (máximo de 300V). Os géis foram 23 corados com Coomassie coloidal G-250 e armazenados em ácido acético 10% (v/v). 24 3.12.3. Digestão Enzimática das proteínas 25 Inicialmente, 50 μg de proteínas totais de cada amostra foram diluídos em 60 μL de 26 bicarbonato de amônio 50 mM e em seguida, 25 μL do surfactante Padrão RapiGest SF 27 (Waters) foram adicionados às amostras, as quais foram incubadas a 37 oC por 60 minutos. 28 Em seguida, as amostras foram submetidas às etapas de redução e alquilação, utilizando DTT 29 10 mM e iodoacetamida 45 mM, respectivamente. A digestão enzimática em solução foi 30 realizada por meio da enzima tripsina na concentração 1:50 (enzima:amostra) solubilizada em 31 48 tampão bicarbonato de amônio (50 mM, pH 7.8). A hidrólise ocorreu durante 18 horas e foi 1 interrompida com a adição de 10 μL de ácido fórmico 5% (v/v). As amostras foram incubadas 2 por 90 minutos em temperatura ambiente e posteriormente, centrifugadas a 14.000 g, a 6 oC 3 por 30 minutos. O sobrenadante foi removido para um tubo novo. Os digestos trípticos 4 contidos em cada amostra foram submetidos às colunas de dessalinização Peptide Cleanup 5 C18 Spin (Agilent Tecnologies) seguindo as recomendações do fabricante. 6 3.12.4. Sequenciamento peptídico por espectrometria de massas 7 As análises de espectrometria de massas foram realizadas por meio de um 8 equipamento de nanocromatografia líquida Ultimate 3000 LC (Dionex, Germering, Germany) 9 acoplado ao equipamento de espectrometria de massas Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, 10 Bremen, Germany). As fases móveis utilizadas foram: A) ácido fórmico 0,1% (v/v) em água 11 LCMS e B) ácido fórmico 0,1% (v/v) em acetonitrila 80% (v/v). As amostras foram 12 carregadas em uma pré-coluna C18 - 30 µm x 5 mm (ThermoFisher Scientific), e 13 desalinizadas em um gradiente isocrático de 4%B por 3 minutos à um fluxo de 300 nL/min. 14 Em seguida, as amostras foram fracionadas por uma coluna analítica Reprosil-Pur C18-AQ (3 15 µm, 120 Å, 105mm) (PICOCHIP) utilizando um gradiente linear de 4-55%B por 30 min, 55% 16 à 90%B por 1 min, mantido à 90%B por 5 minutos e reequilibrado à 4%B por 20 minutos à 17 um fluxo de 300 nL/min. A ionização foi obtida utilizando uma fonte Nanospray ion source 18 (PICOCHIP). O modo de operação foi a ionização positiva utilizando o método DDA. Os 19 espectros MS foram adquiridos de m/z 200 a m/z 2000, resolução de 70.000 e 100 ms de 20 tempo de injeção. A câmara de fragmentação foi condicionada com energia de colisão entre 21 29 a 35% com resolução de 17.500, 50 ms de tempo de injeção, 4,0 m/z de janela de 22 isolamento e exclusão dinâmica de 10s. Os dados de espectrometria foram adquiridos por 23 meio do software Thermo Xcalibur (versão 4.0.27.19, ThermoFisher Scientific). 24 3.12.5. Análise dos dados de espectrometria de massas 25 Os dados brutos de espectrometria de massas no formato.RAW foram submetidos ao 26 software PatternLab [versão 4.0.0.84] (CARVALHO et al., 2016) para a identificação das 27 proteínas totais. Os principais parâmetros utilizados nessa ferramenta foram: banco de dados 28 UNIPROT (Taxonomy Staphylococcus aureus MRSA - 22.492 sequências em 26/12/2021); 29 enzima tripsina; permissão de 2 clivagens perdidas; modificação pós-traducional 30 carbamidometilação dos resíduos de cisteínas; modificação pós-traducional variável oxidação 31 49 dos resíduos de metionina; erros de tolerância MS e MS/MS de 0,0200 ppm. A taxa de FDR 1 (False Discovery Rate) máxima foi considerada ≤ 1%. 2 Uma matriz compatível com o software MetaboAnalyst 4.0® 3 (https://www.metaboanalyst.ca/) foi elaborada a partir dos dados proteômicos utilizando as 4 contagens espectrais de cada proteína identificada, as quais foram normalizadas para cada 5 proteína pela média ponderada das triplicatas técnicas de cada amostra (CHONG et al., 2014). 6 Análises T-student e Fold-change foram utilizadas baseadas no p<0,05 e Fc≥1,5, 7 respectivamente, em cada comparação amostral. Os dados evidenciados pela análise Volcano 8 Plot foram expressos em Log2-Fc. 9 A análise volcano plot forneceu as proteínas que foram expressas diferencialmente em 10 up-regulation (maior expressão da proteica) ou down-regulation (menor expressão proteica) 11 nos tratamentos em relação ao controle e a análise de importância da variável na projeção (vip 12 scores) permitiu a identificação das proteínas mais explicativas ou mais relevantes que foram 13 expressas em up-regulation ou down-regulation em relação ao controle (α≥ 1,5), incluindo as 14 que já apareceram no volcano plot, acrescentando mais informações sobre os mecanismos de 15 ação dos tratamentos (BOUDON et al., 2020; ARAUJO et al., 2022). 16 As proteínas foram submetidas à análise de enriquecimento por meio da classificação 17 de Ontologia Genética (Gene Ontology - GO) tais como “função molecular”, “processo 18 biológico” e “componente celular” no UNIPROT. O diagrama de venn foi feito por meio do 19 software disponível em (https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/). 20 3.13. Análise estatística 21 Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados dos experimentos foram 22 submetidos ao teste de One-Way ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Valores de p≤ 0,05 23 foram considerados para denotar diferença estatística significativa. As análises foram feitas no 24 GraphPad Prism 9.2®. 25 50 4. Resultados e Discussão 1 4.1. Síntese de nanopartículas de ouro conjugadas com melitina 2 As formulações de AuNPs e a AuNPs conjugada com melitina (AuNPs + Melitina) 3 foram lidas em espectrofotômetro em UV-Visível, com intervalo de comprimento de onda de 4 300 a 1000 nm e as suas bandas de absorbância se encontram na Figura 3. 5 6 Figura 3. Espectros de absorção de absorção obtidas nas formulações de AuNPs e AuNPs + 7 Melitina. 8 A AuNPs apresentou uma banda de absorbância em 525 nm, sendo isso referente ao 9 fenômeno da LSPR, estando dentro do padrão esperado para nanopartículas metálicas de ouro. 10 Essa banda de absorbância encontrada foi semelhante ao evidenciado na síntese de AuNPs 11 feita por Mythili et al. (2018), que apresentou uma banda de 530 nm e os espectros de 12 absorção encontrados por Borse e Konwar (2020) que variaram de 520 a 540 nm. Existem 13 alguns fatores que podem influenciar na frequência e na intensidade a banda de absorbância 14 como o tamanho das nanopartículas, forma das nanopartículas, espaçamento entre as 15 partículas das nanopartículas, funcionalização do solvente e/ou da superfície da nanopartícula, 16 entre outros (PHILIP, 2008; KHAN; SAEED; KHAN, 2019). 17 51 4.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração 1 bactericida mínima (CBM) 2 A Tabela 2 e Tabela 3 apresentam os resultados da concentração inibitória mínima 3 (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM), respectivamente. A melitina apresentou 4 ação antibacteriana (5,3 µg/mL para MRSA ATCC e 4,0 µg/mL para o isolado) e efeito 5 bactericida em 8,0 µg/mL para ambos isolados. A cepa MRSA ATCC apresentou valores de 6 CIM de 16,0 µg/mL para oxacilina e cefalotina, enquanto o MRSA isolado apresentou CIM 7 de 8,0 µg/mL para oxacilina e 2,0 µg/mL para cefalotina, porém ambos isolados apresentaram 8 o mesmo valor de CBM (16 µg/mL) para oxacilina. Por outro lado, a CBM obtida com 9 cefalotina foi superior para MRSA ATCC (32 µg/mL) do que para o isolado (2,0 µg/mL). 10 Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) da melitina e dos antibióticos, expressa em 11 µg/mL, frente à MRSA ATCC e Isolado. 12 MRSA Melitina Oxacilina Cefalotina AuNPs +melitina Nano 1+melitina Nano 2+melitina ATCC 5,3 ± 2,3aA 16,0 ± 8,0aA 16 ± 4,0aA >125,0bA >125,0bA >125,0bA Isolado 4,0 ± 4,0aA 8,0 ± 0,0aA 2,0 ± 1,0aB >125,0b >125,0bA >125,0bA Letras minúsculas diferentes na mesma linha representam diferenças significativas de atividade antimicrobiana entre 13 produtos para um mesmo microrganismo quando p≤0,05 e letras maiúsculas diferentes nas colunas representam diferenças 14 significativas de atividade antimicrobiana de um mesmo produto frente a microrganismos diferentes quando p≤0,05. 15 Tabela 3. Concentração bactericida mínima (CBM) da melitina e dos antibióticos, expressa 16 em µg/mL, frente à MRSA ATCC e Isolado. 17 Bactérias Melitina Oxacilina Cefalotina AuNPs +melitina Nano 1+melitina Nano 2+melitina ATCC 8,0 ± 2,0aA 16,0 ± 4,0aA 32 ± 0,0bA >125,0cA >125,0cA >125,0cA Isolado 8,0 ± 2,0abA 16,0 ± 8,0aA 2,0 ± 1,0bB >125,0cA >125,0cA >125,0cA Letras minúsculas diferentes na mesma linha representam diferenças significativas de atividade antimicrobiana entre 18 produtos para um mesmo microrganismo quando p≤0,05 e letras maiúsculas diferentes nas colunas representam diferenças 19 significativas de atividade antimicrobiana de um mesmo produto frente a microrganismos diferentes quando p≤0,05. 20 52 A AuNPs conjugada com melitina e as nanoemulsões 1 e 2 contendo melitina não 1 apresentaram ação antibacteriana sobre os isolados de MRSA quando testadas em 2 concentrações de melitina de até 125 μg/mL. Todos os brancos - formulações sem a presença 3 de melitina - (nanopartícula de ouro, nanoemulsão 1 e nanoemulsão 2) foram testados e 4 também não apresentaram ação antibacteriana frente as bactérias estudadas. As formulações 5 AuNPs+melitina, Nano1+melitina e Nano2+melitina não mostraram eficácia contra as 6 linhagens de MRSA testadas, por isso elas não foram utilizadas para a realização dos demais 7 ensaios. 8 Os nanoestruturados sintetizados não apresentaram atividade antibacteriana frente a 9 MRSA, existem alguns fatores que podem afetar essa atividade como os agentes químicos 10 utilizados na síntese, o tamanho das partículas e o formato das nanopartículas (CARROUEL 11 et al., 2010; WEBSTER; SEIL, 2012; AHMED et al., 2021; ÁLVAREZ-CHIMAL et al., 12 2022). O modo de preparo dos nanoestrurados pode também modificar a sua resposta em 13 meios biológicos sob pH diferentes, atividades enzimáticas e oxidativas e até variação de 14 temperaturas (ELSABAHY; WOOLEY, 2012). E ainda há outras condições que podem 15 influenciar a estabilidade de nanoestruturados sendo elas a aglomeração, partículas têm uma 16 alta energia superficial devido ao seu pequeno tamanho e então elas tendem a se aglomerar 17 para diminuir essa energia; e a sedimentação, o tamanho das partículas, sua densidade média e 18 a viscosidade podem contribuir para elas se sedimentarem (WU et al., 2011; SHAO et al., 19 2015). 20 As CIM e CBM de melitina determinadas em MRSA variaram de 4,0 a 5,3 μg/mL e de 21 8 μg/mL, respectivamente. Bevalian et al. (2019) obtiveram CIM e CBM de melitina em 22 isolados de S. aureus sensíveis à vancomicina (VSSA), S. aureus resistentes à vancomicina 23 (VRSA) e S. aureus com resistência intermediária à vancomicina (VISA), variando de 0,125 a 24 2 μg/mL e 0,125 a 4 μg/mL, respectivamente. 25 Alni et al. (2020) testaram a ação de melitina sobre isolados de MRSA e MSSA tendo 26 obtido média de CIM de 4,4 μg/mL e de 8,8 μg/mL para a CBM, valores estes semelhantes 27 aos obtidos em nosso estudo, sendo a média da CIM de melitina para os isolados de MRSA de 28 4,7 μg/mL e 8,0 μg/mL para CBM. Outros estudos também demonstraram valores de CIM 29 para a melitina sobre S. aureus similares aos encontrados em nosso estudo (DOSLER, 30 GERCEKER; 2012; PICOLI et al., 2017; PEREIRA et al., 2020). 31 53 4.3. Curva de sobrevivência (atividade inibitória e atividade bactericida) 1 Na Figura 4 são apresentadas as curvas de sobrevivência da atividade inibitória e a da 2 atividade bactericida dos antimicrobianos testados para MRSA ATCC e MRSA Isolado. 3 A melitina mostrou uma rápida ação inibitória, sendo essa ação também bactericida 4 em 2 horas para MRSA ATCC e em 4 horas para MRSA isolado. Já os antibióticos 5 apresentaram atividades inibitórias mais lentas e ação bactericida em 6 horas para oxacilina e 6 em 8 horas para cefalotina para ambos isolados. A associação entre melitina e cefalotina só 7 mostrou ser sinérgica e bactericida, depois de 8 horas em contato, apenas para MRSA isolado. 8 A associação entre melitina (25% CIM) e oxacilina (25% CIM) mostrou ação sinérgica e 9 bactericida após 6 horas para os dois isolados testados. A cefalotina associada a melitina 10 apresentou um efeito antagonista para MRSA ATCC, que significa um antimicrobiano 11 impedir o efeito de outro. Outras combinações entre fármacos antibacterianos já se mostraram 12 antagonistas, como exemplo penicilina com tetraciclina ou cloranfenicol que atua de maneira 13 antagônica frente a infecções pneumocócicas (ACAR, 2000). 14 Bevalian et al. (2019) também verificaram que a melitina contra isolados de VRSA 15 apresenta uma rápida e longa ação inibitória, mostrando ação bactericida nesses isolados no 16 intervalo de 15 minutos a 3 horas. Devido à ação bactericida da melitina, muitos 17 pesquisadores já demonstraram ação sinérgica da