Universidade Estadual Paulista – UNESP “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências e Tecnologia de Presidente Prudente Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais – PosMat “Avaliação in vitro e in vivo da Capacidade Antioxidante e Antitumoral da Fração C do Látex de Hevea brasiliensis RRIM 600” Leandra Ernst Kerche Silva Orientador: Prof. Dr. Aldo Eloizo Job Presidente Prudente 2017 Leandra Ernst Kerche Silva “Avaliação in vitro e in vivo da Capacidade Antioxidante e Antitumoral da Fração C do Látex de Hevea brasiliensis RRIM 600” Tese apresentada como requisito à obtenção do título de Doutor à Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Materiais, área de concentração de Biomateriais, sob orientação do Prof. Dr. Aldo Eloizo Job. Presidente Prudente 2017 Ficha catalográfica elaborada por DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO UNESP - Bauru Kerche-Silva, Leandra Ernst. Avaliação in vitro e in vivo da capacidade antioxidante e antitumoral da fração C do látex de Hevea brasiliensis RRIM 600 / Leandra Ernst Kerche Silva, 2017 106 f. : il. Orientador: Aldo Eloizo Job Tese (Doutorado)–Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências, Bauru, 2017 1. Látex. 2. Fração C. 3. Hevea brasiliensis. 4. Antioxidante. I. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Ciências. II. Título. Dedico este trabalho ao meu marido João Lucas e aos meus filhos João Marcos e Laura, por aguentarem minha ausência em tantos momentos e me suportarem com amor incondicional. Eu amo vocês. “todavia, para nós há um só Deus, o Pai, de quem são todas as coisas e para quem existimos; e um só Senhor, Jesus Cristo, pelo qual são todas as coisas, e nós também, por Ele.” (I Cor 8:6) “É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem em uma penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota.” (Theodore Roosevelt) AGRADECIMENTOS • Agradeço primeiramente a Deus por ter me concedido a oportunidade de fazer o doutorado e por ter me dado forças para prosseguir até o fim. Eu sei que Deus enviou pessoas maravilhosas para me ajudar a trilhar esse caminho. Minha gratidão sem fim! • Agradeço ao meu marido maravilhoso, João Lucas, que teve paciência em tantos momentos de desespero, por ter me dado suporte e muito carinho, e ter me ajudado a vencer essa batalha. Só ele e Deus para saber a dificuldade de trabalhar e levar um doutorado ao mesmo tempo! Eu te amo, meu amor!! Você e nossos filhos são as coisas mais preciosas que tenho na vida. Tudo isso é por vocês! • Agradeço aos meus pais, Marcos e Sandra, e minha irmã Renata, por também me darem tanto suporte. Minha mãe morou 4 meses comigo enquanto eu estudava para a prova da POSMAT. Me ajudou a cuidar dos meus bebês para que eu pudesse galgar mais esse degrau em minha vida! Obrigada pelo carinho, pelo amor, pelo suporte tantas vezes financeiro! Amo vocês! • Agradeço também aos meus sogros, João e Sonia, por também me suportarem de diversas formas. Seja cuidando dos bebês, seja fazendo comida para mim, seja financeiramente, vocês sempre estiveram aqui por mim. Amo vocês. Muito obrigada! • Agradeço ao meu orientador, prof. Aldo, que aceitou me orientar mesmo sabendo que eu não estaria ali todos os dias, todos os momentos. Mesmo assim, acreditou que eu podia realizar esse trabalho. Obrigada pelas broncas, pela ajuda e por acreditar em mim! • Agradeço de forma mais que especial à prof.ª Alessandra Cecchini. Me recebeu em seu laboratório, disponibilizou materiais e equipamentos, confiou no meu projeto e me ajudou de diversas formas. Não tenho nem palavras para agradecer tamanho suporte. Sem você, esse trabalho não existiria! Muito obrigada! • Agradeço também de forma especial à Iriana e à Poliana, dois anjos do Laboratório de Patologia Molecular da Universidade Estadual de Londrina, que me ajudaram e fizeram muito por mim! Esse trabalho também é de vocês! • Agradeço à minha amiga e grande ajudante Dalita. Sua chegada possibilitou os meios para a realização de uma grande parte desse trabalho. Quando eu te via como minha veterana na UEL, jamais imaginava que um dia estaríamos vivendo essa grande aventura juntas. Obrigada pelo suporte! Do fundo do meu coração! • Agradeço também às companheiras de jornada Danna e Andressa, pelas risadas, pela ajuda, pela companhia! • Agradeço à minha aluna de iniciação científica Caroline, pelos fins de semana em que me ajudou a montar lâminas, pelas coletas de látex, centrifugação, leitura das lâminas... muito obrigada!!! • Agradeço também ao Eidi, da APTA, pela disponibilização do laboratório de cultivo celular. Obrigada por esse suporte! • Agradeço à UNOESTE e à minha coordenadora querida, Dr.ª Nilva Galli, pelo suporte e por acreditar em meu trabalho! • Agradeço às minhas amigas Pistow e Mazzucks pela simples presença em minha vida! Tudo fica mais leve porque tenho vocês!! E agora minhas sobrinhas Júlia e Manuela! Amo vocês!!! • Agradeço à POSMAT, à FAPESP, ao CNPq e à CAPES pelo apoio financeiro direto ou indireto. • Agradeço também a cada pessoa que foi importante direta ou indiretamente na realização desse trabalho, e que por falta de memória, mas não de gratidão, possa não ter sido mencionada nessas linhas. “Aqui, no entanto, nós não olhamos para trás por muito tempo, nós continuamos seguindo em frente, abrindo novas portas e fazendo coisas novas, porque somos curiosos, e a curiosidade continua nos conduzindo por novos caminhos. Siga em frente.” (Walt Disney) ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva i RESUMO KERCHE-SILVA, L. E. Avaliação in vitro e in vivo da Capacidade Antioxidante e Antitumoral da Fração C do Látex de Hevea brasiliensis RRIM 600. 2017. 106f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências e Tecnologia – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Presidente Prudente, São Paulo. Biomateriais podem ser definidos como dispositivos que entram em contato com sistemas biológicos tanto na forma de sólidos quanto de líquidos e géis. Para um novo biomaterial, são necessários testes toxicológicos e de interação in vitro e in vivo. O látex é uma substância branca e leitosa que exsuda da casca da Hevea brasiliensis quando a mesma é perfurada e que tem sido apontado como um biomaterial promissor. O látex quando centrifugado em alta velocidade é separado em três frações: a fração com partículas de borracha, uma fração aquosa chamada fração C e uma fração de fundo chamada fração B. A fração C é a fração metabolicamente ativa do látex. Assim, o presente estudo investigou os potenciais efeitos antioxidantes, citotóxicos, genotóxicos e antitumorais da fração C do látex da Hevea brasiliensis. Para isso, foram utilizados os testes de sequestro de radicais livres e capacidade antioxidante total em meio in vitro sem células; o teste do MTT, o ensaio do cometa, avaliação de morte celular com coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio (PI) e avaliação de parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo em meio in vitro com duas linhagens celulares, a CHO-k1, linhagem de células normais de epitélio de ovário de hamster, e a B16F10, linhagem de células de melanoma murino; e a ação da fração C na indução de carcinoma de células escamosas (SCC) em camundongos SKH-1 por exposição crônica à radiação UVB. Nossos resultados mostraram que a fração C é antioxidante, com capacidade para sequestrar os radicais HO• e NO• e o H2O2. A fração C não alterou a viabilidade celular das células CHO-k1, não induziu danos no DNA dessas células, não induziu apoptose e necrose e nem alterou a quantidade de tiol total e de malonaldeído (MDA) nessas células. No entanto, para a linhagem celular B16F10, a fração C mostrou atividade antitumoral, reduzindo a viabilidade celular, induzindo danos no material genético, induzindo morte celular e alterando os níveis de tiol e MDA nessas células. Nos animais que foram expostos cronicamente à radiação UVB, a fração C protegeu os eritrócitos e a pele dos animais do estresse oxidativo promovido pela irradiação e protegeu as células da pele de transformação maligna para SCC. Em resumo, nossos resultados mostraram que a fração C do látex da H. brasiliensis apresenta propriedades terapêuticas antioxidantes e antitumorais. Palavras-chave: látex, fração C, Hevea brasiliensis, antioxidante, antitumoral. ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva ii ABSTRACT KERCHE-SILVA, L. E. In vitro and in vivo evaluation of antioxidant and antitumor capacity of Latex C-serum from Hevea brasiliensis RRIM 600. 2017. 106 p. Thesis (PhD, Doctoral). Faculdade de Ciências e Tecnologia – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Presidente Prudente, São Paulo. Biomaterials can be defined as devices that come in contact with biological systems in the form of solids, liquids and gels. In vitro and in vivo toxicological tests are needed for a new biomaterial to come out. Latex is a white and milky solution that exsudes from Hevea brasiliensis bark when perforated, and it has been appointed as a new promising biomaterial. When centrifuged in high speed, latex can be separated in three parts: rubber particle fraction, aqueous C-serum fraction and a bottom fraction called B-serum. C- serum is the part that is metabolically active. In this way, the aim of this work was to investigate potential antioxidant, cytotoxic, genotoxic and antitumor effects of latex C- serum from Hevea brasiliensis. For this purpose, we used in vitro free-radical scavenger and total antioxidant capacity tests; MTT test, comet assay, staining with Hoechst 33342 and Propidium Iodide (PI) to evaluate cell death, and evaluation of biochemical parameters of oxidative stress in Chinese hamster ovary epithelium normal cell line, CHO-k1, and murine melanoma cell line, B16F10; and C-serum effects in the induction of squamous cell carcinoma (SCC) in SKH-1 mice by chronic UVB exposure. Our results show that latex C-serum is an antioxidant compound that was able to scavenge HO• and NO• radicals and H2O2. C-serum did not alter the cell viability in CHO-k1 cells and it did not promote DNA damage in these cells, it did not alter the levels of apoptotic and necrotic cells for this cell lineage and did not alter total thiol and MDA levels in these cells. However, for B16F10 cells, latex C-serum presented antitumor effect, reducing cell viability, inducing DNA damage and cell death, and altering total thiol and MDA levels in these cells. In the animals chronically exposed to UVB radiation, latex C-serum protected the erythrocytes and skin cells from oxidative stress promoted by the irradiation, and prevented skin cells from malignant transformation to SCC. In summary, this work shows that latex C-serum from Hevea brasiliensis present antioxidant and antitumor therapeutic properties. Keywords: latex, C-serum, Hevea brasiliensis, antioxidant, antitumor. ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva iii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Etapas do ciclo de vida de um biomaterial .......................................................2 Figura 2. O látex de Hevea brasiliensis ao exsudar da casca ..........................................4 Figura 3. Frações do látex fresco obtidas após centrifugação .........................................5 Figura 4. Partículas de borracha envolvidas por uma camada proteína-fosfolipídio .......6 Figura 5. Esquema representativo das diferentes camadas da pele ..................................8 Figura 6. Penetração dos diferentes raios UV nas camadas da pele ................................9 Figura 7. Fontes endógenas e exógenas de espécies reativas na pele, e mecanismos de defesa antioxidante ..........................................................................................................10 Figura 8. Modelo mostrando a formação de espécies reativas de oxogênio (ERO) em dois sistemas na célula ............................................................................................................13 Figura 9. Estrutura química do ascorbato .......................................................................17 Figura 10. Estrutura química do α-tocoferol ..................................................................17 Figura 11. Proteção da peroxidação lipídica de membrana pelo α-tocoferol, e posterior regeneração do mesmo pelo ascorbato ............................................................................18 Figura 12. Classificação dos nucleoides de células B16F10 no ensaio do cometa após coloração com GelRed ....................................................................................................31 Figura 13. Classificação morfológica das células apoptóticas, necróticas e normais ......32 Figura 14. Camundongo SKH-1 após 15 semanas de irradiação por radiação UVB .......34 ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva iv Figura 15. Capacidade de sequestro do radical hidroxil (HO•) por diferentes concentrações da fração C do látex ..................................................................................39 Figura 16. Capacidade de sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2) por diferentes concentrações da fração C do látex ..................................................................................40 Figura 17. Capacidade de sequestro do óxido nítrico (NO•) por diferentes concentrações da fração C do látex .........................................................................................................41 Figura 18. Capacidade antioxidante total de diferentes concentrações da fração C do látex .........................................................................................................................................42 Figura 19. Porcentagem de células de ovário de hamster chinês (CHO-k1) viáveis no teste de viabilidade celular (MTT) ...................................................................................43 Figura 20. Porcentagem de células de melanoma murino (B16F10) viáveis no teste de viabilidade celular (MTT) ...............................................................................................44 Figura 21. Score de dano celular no ensaio do cometa em células de ovário de hamster chinês (CHO-k1) .............................................................................................................45 Figura 22. Score de dano celular no ensaio do cometa em células de melanoma murino (B16F10) .........................................................................................................................46 Figura 23. Porcentagem de células apoptóticas da linhagem CHO-k1 após exposição de 24 h a três concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis (5, 50 e 100 µg/ml) .....48 Figura 24. Porcentagem de células necróticas da linhagem CHO-k1 após exposição de 24 h a três concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis (5, 50 e 100 µg/ml) .....48 Figura 25. Comparação entre as porcentagens de células normais, apoptóticas e necróticas da linhagem CHO-k1 .....................................................................................49 ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva v Figura 26. Porcentagem de células apoptóticas da linhagem B16F10 após exposição de 24 h a três concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis (5, 50 e 100 µg/ml).......50 Figura 27. Porcentagem de células necróticas da linhagem B16F10 após exposição de 24 h a três concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis (5, 50 e 100 µg/ml)............51 Figura 28. Comparação entre as porcentagens de células normais, apoptóticas e necróticas da linhagem B16F10 ......................................................................................51 Figura 29. Fração C do látex de Hevea brasiliensis induz morte celular em células de melanoma murino (B16F10) ...........................................................................................52 Figura 30. Avaliação dos níveis de tiol total nas células CHO-k1 ...................................53 Figura 31. Avaliação dos níveis de tiol total nas células B16F10 ...................................54 Figura 32. Avaliação dos níveis de malonaldeído (MDA) nas células CHO-k1 .............55 Figura 33. Avaliação dos níveis de malonaldeído (MDA) nas células B16F10 ..............55 Figura 34. Quantificação da atividade da catalase nos eritrócitos de animais não irradiados e irradiados .....................................................................................................57 Figura 35. Quantificação dos níveis de glutationa (GSH) em eritrócitos de animais não irradiados e irradiados .....................................................................................................58 Figura 36. Capacidade antioxidante total (TRAP) em animais não irradiados e irradiados medida pelo método da quimioluminescência .................................................................60 Figura 37. Quantificação da atividade da catalase cutânea em animais não irradiados e irradiados ........................................................................................................................61 Figura 38. Quantificação dos níveis de glutationa (GSH) em animais não irradiados e irradiados ........................................................................................................................62 ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva vi Figura 39. Quantificação dos níveis de malonaldeído (MDA) em animais não irradiados e irradiados ......................................................................................................................63 Figura 40. Avaliação histopatológica das lesões induzidas por radiação UVB em camundongos SKH-1 ......................................................................................................65 Figura 41. Efeito da fração C do látex de Hevea brasiliensis no desenvolvimento de AK e SCC e proliferação epidérmica .....................................................................................66 ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva vii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS B16F10 Células de melanoma murino CAT Catalase CBC Carcinoma basocelular CEC Carcinoma espinocelular CHO-k1 Células de ovário de hamster chinês DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DTNB 5-5’-ditio-bis-2-ácido-nitrobenzoico DXR Dororrubicina ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio GSH-Px Glutationa peroxidase GSH Glutationa reduzida GSSG Glutationa oxidada H2O2 Peróxido de hidrogênio HO• Radical hidroxil HCT116 Adenocarcinoma colorretal humano HeLa Carcinoma de colo de útero HepG2 Carcinoma hepatocelular humano Hoechst 33342 Trihidrocloreto de BisBenzimidina H33342 LMP Baixo ponto de fusão MDA Malonaldeído MED Dose mínima eritematosa MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio NO• Radical óxido nítrico PBS Tampão fosfato-salino PI Iodeto de propídio RNA Ácido ribonucleico ROO• Radical peroxil SOD Superóxido dismutase SKH-1 Camundongos hairless ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva viii TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TRAP Capacidade antioxidante total VC Viabilidade celular UV Radiação Ultravioleta ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva ix SUMÁRIO Resumo i Abstract ii Lista de Figuras iii Lista de Abreviaturas e Siglas vii 1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………... 1 1.1 Biomateriais……………………………………………………….................... 1 1.2 Látex…………………………………………………………………………... 3 1.2.1 Látex da Hevea brasiliensis…………………………………………………. 3 1.3 Câncer de pele…………………………………………………………………. 7 1.3.1 Radiação UV, Estresse Oxidativo e Câncer…………………………………. 9 1.3.2 Câncer de pele não melanoma……………………………………………….. 11 1.3.3 Câncer de pele melanoma…………………………………………………… 11 1.4 Estresse Oxidativo e Antioxidantes………………………………………....… 12 1.4.1 Espécies reativas e Estresse Oxidativo............................................................. 12 1.4.2 Defesas antioxidantes...................................................................................... 14 1.5 Estresse Oxidativo e Câncer de Pele................................................................... 19 1.6 Fotoprotetores..................................................................................................... 20 2 OBJETIVOS........................................................................................................ 22 2.1 Objetivos Gerais................................................................................................. 22 2.2 Objetivos Específicos......................................................................................... 22 3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 24 3.1 Coleta do látex e obtenção da fração C................................................................ 24 3.2 Preparo da fração C para os testes in vitro........................................................... 24 3.3 Preparo dos cremes de fração C para os testes in vivo.......................................... 25 3.4 Testes in vitro em meio sem células.................................................................... 25 3.4.1 Atividade de sequestro de radicais hidroxil (HO•)............................................ 25 3.4.2 Atividade de sequestro de peróxido de hidrogênio (H2O2)............................... 26 3.4.3 Atividade de sequestro do radical óxido nítrico (NO•)..................................... 26 ____________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva x 3.4.4 Capacidade antioxidante total.......................................................................... 27 3.5 Testes in vitro em meio com células.................................................................... 28 3.5.1 Linhagens celulares CHO-k1 e B16F10 e Condições de Cultura..................... 28 3.5.2 Doxorrubicina.................................................................................................. 28 3.5.3 Teste de Viabilidade Celular............................................................................ 29 3.5.4 Ensaio do Cometa............................................................................................ 29 3.5.5 Detecção morfológica de células apoptóticas e necróticas............................... 31 3.5.6 Parâmetros de Estresse Oxidativo.................................................................... 32 3.6 Testes in vivo....................................................................................................... 33 3.6.1 Animais, irradiação UVB e tratamento com o creme de fração C..................... 33 3.6.2 Análise antioxidante de eritrócitos................................................................... 35 3.6.3 Análise antioxidante da pele............................................................................ 35 3.6.4 Análise histopatológica.................................................................................... 37 3.7 Análise estatística............................................................................................... 37 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 38 4.1 Testes in vitro em meio sem células.................................................................... 38 4.2 Testes in vitro em meio com células.................................................................... 42 4.3 Testes in vivo....................................................................................................... 56 5 CONCLUSÕES................................................................................................... 68 REFERÊNCIAS..................................................................................................... 69 ANEXOS................................................................................................................. 88 Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal.................................... 89 Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 BIOMATERIAIS Os biomateriais representam cerca de 300 mil dos produtos utilizados na área da saúde há cerca de 10 anos [1]. Dentre eles estão os dispositivos médicos (biossensores, tubos de circulação sanguínea, sistemas de hemodiálise), materiais implantáveis (como suturas, placas, substitutos ósseos, tendões, telas ou malhas, válvulas cardíacas, lentes, dentes), dispositivos para a liberação de medicamentos (na forma de filmes, implantes subdérmicos e partículas), órgãos artificiais (como coração, rim, fígado, pâncreas, pulmões, pele) e curativos, dentre outros [2]. Biomateriais podem ser definidos como dispositivos que entram em contato com sistemas biológicos (incluindo fluidos biológicos), com aplicações diagnósticas, vacinais, cirúrgicas ou terapêuticas. Os biomateriais podem ser constituídos de compostos de origem sintética ou natural, assim como de materiais naturais quimicamente modificados, tanto na forma de sólidos quanto de géis, pastas ou mesmo líquidos, não sendo necessariamente fabricados, como válvulas cardíacas de porcos e retalhos de pele humana tratados para uso como implantes [2]. As características necessárias para o uso de um biomaterial são biocompatibilidade, não ser tóxico e nem carcinogênico, apresentar bioestabilidade, propriedades mecânicas adequadas, peso e densidade adequados, ter custo baixo, ser reprodutível e de fácil fabricação [3]. Os biomateriais devem também estar associados a uma determinada resposta biológica particular, disparada por sinais originados em nível molecular que incluem: correntes elétricas, distribuição eletrônica, conformação molecular, estado de agregação ou propriedades físico-químicas locais particulares, características que podem ser introduzidas por arranjos especiais de grupos funcionais sobre uma estrutura polimérica, reações de reticulação, propriedades particulares de superfície e arranjos macromoleculares [4]. Até o século XIX, a abordagem adotada no desenvolvimento e aplicação dos biomateriais era do tipo tentativa e erro. No início do uso de biomateriais de forma mais sistematizada, nas proximidades da década de 1950, o foco era o material em si, então buscava-se materiais bioinertes. Com o passar do tempo, o alvo de busca tornou-se a bioatividade dos biomateriais, e mais recentemente, o objetivo tem sido a regeneração de um tecido funcional de fato, com foco, então, no aspecto biológico [5]. Em suma, com o Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 2 passar do tempo, o objetivo de obtenção de materiais biocompatíveis, que pudessem substituir um tecido danificado e prover suporte mecânico, com mínima resposta biológica do paciente, passou para os materiais biodegradáveis, com capacidade de serem incorporados ou absorvidos pelo tecido hospedeiro, e mais recentemente o foco tornou- se os materiais biomiméticos, materiais que participam de forma ativa no processo de recuperação, atuando de forma específica, em nível celular, no hospedeiro [6]. São várias as etapas envolvidas desde a identificação da necessidade de um biomaterial até a utilização e análise final do produto. O processo se inicia com a identificação da necessidade de um biomaterial, que pode ser o tratamento de uma doença, a substituição de um órgão ou o uso meramente cosmético. A seguir, desenvolve-se o projeto e síntese do material para testes diversos e, com base na escolha dos que se mostrarem mais apropriados, encaminha-se para testes toxicológicos e de interação in vivo e in vitro. Em seguida são enfocados aspectos regulatórios relacionados à pré- aprovação no mercado, aos estudos clínicos iniciais, à triagem clínica e ao acompanhamento de longo prazo. O desenvolvimento tem sequência mesmo após a aprovação do uso clínico do material, com análise e registro de explants extraídos de pacientes visando o entendimento de eventuais falhas para sua correção. A Figura 1 ilustra os passos de desenvolvimento de um biomaterial. Figura 1. Etapas do ciclo de vida de um biomaterial, desde a sua concepção baseada em uma necessidade específica, até seu uso clínico e avaliação posterior (adaptada de Pires, A. L. R. et al., 2015 [2]). Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 3 1.2 LÁTEX O látex é sintetizado numa rede de anéis laticíferos, organizados como sistemas de vasos paracirculatórios, na casca interna das plantas. O látex é o citoplasma das células laticíferas, e sua composição assemelha-se com a composição das células comuns, exceto por possuir de 30-45% de borracha natural [7]. O metabolismo dessas células praticamente consiste em transformar sacarose em cis-poli-isopreno, o composto químico mais abundante do látex, responsável pela formação da borracha [8]. Diferentemente das outras células vegetais, os vacúolos dos laticíferos são pequenos e apresentam pequenas vesículas lisossomais: os lutoides, que além de apresentarem solutos orgânicos e minerais de baixo peso molecular, apresentam grandes quantidades de proteínas aniônicas e catiônicas [7]. Uma grande gama de proteínas já foi descrita nos fluídos do látex, incluindo proteínas solúveis de biossíntese da borracha, defesa da planta e de metabolismo oxidativo [9,10]. É provado que plantas laticíferas são uma rica fonte de biomoléculas ativas, e sua eficácia é frequentemente embasada pelo seu uso prévio na medicina popular [11]. O látex exsudado apresenta, além do cis-poli-isopreno, metabólitos secundários e proteínas, em concentrações muito maiores que nas folhas. Dentre esses metabólitos, encontram-se diversas substâncias que são biologicamente ativas, incluindo compostos que asseguram resistência a herbívoros através de efeitos tóxicos e antinutritivos. Muitos desses compostos relacionados à defesa das plantas (borracha, cisteíno-proteases, alcaloides, etc.) aparecem no látex de grupos filogeneticamente distantes, sugerindo funções comuns e evolução convergente [12]. 1.2.1 Látex da Hevea brasiliensis O látex da Hevea brasiliensis exsuda da casca quando esta é perfurada (Figura 2). A maior parte do látex colhido é coagulada para a fabricação de produtos da “borracha seca”, incluindo pneus automotivos. O látex da H. brasiliensis pode ser estabilizado numa forma não coagulada através da amoniação, o que permite que o látex seja utilizado para fabricação de outros produtos, como as luvas de procedimentos cirúrgicos [13]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 4 Figura 2. O látex de Hevea brasiliensis ao exsudar da casca após perfuração da mesma (www.mundoeducacao.bol.uol.com.br). Um terço do peso do látex da H. brasiliensis é constituído de borracha natural13, porém 1 a 2% do seu peso é constituído de proteínas, o que pode contabilizar centenas de proteínas [14,15]. Outros constituintes como lipídeos, quebrachitol, ácidos ribonucleicos e sais orgânicos também estão presentes [16]. Nos últimos anos, estudos têm sido publicados sobre um novo material, a biomembrana de látex da Hevea brasiliensis, que tem se mostrado um importante indutor de cicatrização de feridas, regeneração de parede esofágica de cachorros, e regeneração de membranas timpânicas, através de mecanismos envolvidos com o aumento da vascularização [17-19]. Esse aumento da vascularização seria induzido por fatores de crescimento vascular presentes no látex e que, através de indução angiogênica, aceleraria o fechamento de feridas através da formação de um novo epitélio de revestimento [20,21]. Além de formar as biomembranas, – que representam um coloide complexo feito de partículas de borrachas e corpos lutoides suspensos em um meio rico de proteínas e outros solutos – o látex pode ser centrifugado em alta velocidade, e separado em frações que consistem em: uma camada superior de partículas de borracha, uma fase aquosa conhecida como fração C (Centrifuged-serum), e uma fração de fundo, fração B (Bottom- serum), composta pelos corpos lutoides [22-24] (figura 3). Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 5 Figura 3. Frações do látex fresco obtidas após centrifugação – A: partículas de borracha, B: Centrifuged serum (Fração C), C: Bottom serum (Fração B). As partículas de borracha constituem entre 25-45% do volume de látex fresco e apresentam um diâmetro médio de 50 Å a 3 µm, sendo as partículas normalmente esféricas [25,26]. Essas partículas são formadas por moléculas hidrofóbicas que ficam separadas do meio hidrofílico intracelular por um filme de proteínas e lipídios [27]. As principais proteínas localizadas na superfície das partículas de borracha são chamadas Hev b 1 e Hev b 3, sendo a primeira encontrada nas partículas de borracha maiores (acima de 0,4 µm de diâmetro), e a última é mais abundante em partículas de borrachas menores [28-30]. A associação de proteínas com fosfolipídios foi descoberta por Bowler, em 1953 [31], e o mesmo evidenciou o fato de que esta associação confere carga negativa para a partícula de borracha, estabilizando-as como coloides [28]. Um novo modelo tem sido proposto para explicar a nanoestrutura da superfície de partículas de borracha natural, conforme evidenciado na Figura 4. Esse modelo apresentaria um núcleo hidrofóbico de partículas de borracha natural, rodeado por moléculas de proteínas e fosfolipídios com cerca de 20 nm de espessura [32]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 6 Figura 4. Partículas de borracha envolvidas por uma camada proteína-fosfolipídio (adaptado de Nawamawat et al., 2011 [32]). Esse modelo proporciona a medição direta da espessura da camada de superfície e do arranjo molecular das proteínas e dos fosfolipídios, sugerindo também a quantificação de proteínas em 84% e fosfolipídios 16% [32]. O tamanho das partículas tem sido relatado entre 0,30 e 0,70 µm [33]. A fração C do látex da H. brasiliensis é composta de uma solução rica em carboidratos, eletrólitos, proteínas e aminoácidos. Essa solução refere-se ao meio aquoso, no qual todas as organelas encontradas no látex estão suspensas, contendo, dessa forma, uma grande variedade de proteínas relacionadas com o metabolismo celular [29]. A quantidade de proteínas encontradas na fração C é significativa, provavelmente na casa de centenas, sendo, inclusive, as enzimas associadas com a via de biossíntese da borracha também encontradas nesse soro [28]. O principal carboidrato que compõe a fração C é o monossacarídeo quebrachitol (1-metil inositol) e não se tem uma implicação exata com a sua função no látex. Acredita- se que esse composto tenha a capacidade de sequestrar radicais peroxinitritos, tendo assim uma função protetora [34,35]. Alguns carboidratos encontrados no látex podem ser oxidados a ácidos voláteis (fórmico, acético e propiônico), sendo uma das medidas de qualidade do látex [36]. A fração C e seus constituintes têm sido implicados em diversas propriedades biológicas, como propriedades antioxidantes e antifúngicas [37,38]. Porém, a primeira aplicação do potencial terapêutico da fração C foi sugerida quando uma sub-fração da mesma mostrou propriedades anti-proliferativas específicas contra linhagens celulares de Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 7 origem maligna [39]. Lam e colaboradores (2012) [40] estudaram as sub-frações da fração C em duas linhagens celulares originadas de cânceres humanos – adenocarcinoma hepatocelular (HepG2) e adenocarcinoma colorretal (HCT116) –, e o estudo mostrou que a ação anti-proliferativa da fração C foi específica para a linhagem de carcinoma hepático, e que a morte não acontecia por via apoptótica. A importância desse estudo está no fato de que de 10% a 20% apenas dos carcinomas hepatocelulares podem ser completamente removidos cirurgicamente [41,42]. Se a fração C do látex puder ser utilizada especificamente nas células malignas do fígado, as mesmas poderão ter o seu crescimento suprimido e até mesmo poderão ser eliminadas após a cirurgia de remoção do tumor, aumentando as chances de recuperação dos hepatócitos saudáveis [40]. Este resultado torna-se interessante por vários fatores, sendo os principais o baixo custo e a simplicidade na produção da fração C, e sua abundância em regiões produtoras de látex. Constituindo a fração B encontram-se os lutoides, componentes não isoprênicos mais abundantes no látex de H. brasiliensis. Estes são vacúolos esféricos, com diâmetros entre 0,5 e 3 µm, e que conduzem à interrupção do fluxo de látex por serem osmoticamente sensíveis e incharem dentro dos vasos laticíferos [43, 44]. No interior dos lutoides encontram-se diversas substâncias dissolvidas, tais como ácidos orgânicos, sais minerais, proteínas, açúcares, e algumas organelas como ribossomos e retículo endoplasmático [45]. A principal proteína encontrada nesses vacúolos é a heveina [29]. O látex, em suas diferentes frações, apresenta grande potencial para uso como biomaterial. E como estudos prévios mostraram a ação específica antitumoral da fração C em células HepG2 [40] e carcinoma de colo de útero humano (HeLa) [39], testes em outros tipos de cânceres, como o câncer de pele, podem trazer resultados significativos. 1.3 CÂNCER DE PELE O câncer de pele é a neoplasia mais comum no mundo. Vários são os fatores etiológicos envolvidos com a neoplasia cutânea, como: fenótipo da pele, localização geográfica, exposição solar [46], redução da camada de ozônio, entre outros, sendo a exposição à radiação ultravioleta (UV) o fator mais importante [47]. A radiação UV tem a capacidade de induzir mutações epigenéticas, promovendo a expansão da população de células iniciadas, além de inflamação dérmica, hiperplasia epidérmica, alteração na expressão de múltiplos genes associados com a proliferação, diferenciação e produção de Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 8 citocinas [48], além de formar dímeros de pirimidina, provocar peroxidação lipídica, e formação de espécies reativas de oxigênio (ERO). O câncer de pele pode ser classificado em dois grandes grupos: o melanoma e o não-melanoma. O melanoma é originário dos melanócitos, e é raro se comparado ao não melanoma [49]. Porém, a incidência do melanoma tem aumentado nas últimas quatro décadas. No ano de 2011, mais de 75 mil norte-americanos foram diagnosticados com melanoma, e mais de 9 mil foram a óbito. No Brasil, de acordo com o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA), no ano de 2016, houve 5.670 novos casos de melanoma (sendo 3 mil homens e 2.670 mulheres) e em torno de 1.547 óbitos. Esse câncer apresenta a característica de se disseminar via linfática para regiões corpóreas distantes do sítio primário, possuindo alto potencial metastático, além de ser menos responsivo às terapias sistêmicas [50]. O câncer não melanoma, por sua vez, é originado a partir das células epidérmicas, variando a sua origem da camada basal da epiderme, resultando no carcinoma basocelular (CBC), ou se originando da camada espinhosa, resultando no carcinoma espinocelular (CEC) [49] (figura 5). O câncer não melanoma é o mais comum, acometendo mais de 1,2 milhão de pessoas por ano nos EUA [51,52], e esta alta incidência representa uma preocupação pública devido aos altos custos de medicamentos, à morbidade causada e aos resultados estéticos [53]. No Brasil, o acometimento deste tipo de câncer é o mais frequente em ambos os sexos, sendo que em homens a maior ocorrência se dá nas regiões Centro-Oeste, Sul e Norte, e em mulheres ocorre de forma homogênea em todas as regiões [54]. De acordo com dados do INCA, em 2016 no Brasil, 175.760 indivíduos foram diagnosticados com câncer de pele não melanoma. Figura 5. Esquema representativo das diferentes camadas da pele. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 9 1.3.1 Radiação UV, Estresse Oxidativo e Câncer A radiação ultravioleta (UV) tem a capacidade de provocar diversas reações fotoquímicas ao alcançar a pele. As ondas de radiação penetram diretamente, interagindo com as células da epiderme e da derme (figura 6). Inicialmente, esta interação pode estimular a produção de melanina, visível sob a forma de bronzeamento da pele, ou pode levar a pequenas inflamações ou graves queimaduras. A exposição crônica é considerada um dos agentes mais importantes para o desenvolvimento de doenças cutâneas malignas e o envelhecimento [55-57]. Figura 6. Penetração dos diferentes raios UV nas camadas da pele (adaptado de Birch- Marchin e Swalwell, 2010 [58]). Os raios solares contêm a radiação UV A, B e C. Os raios UVC incidem em um comprimento de onda que varia entre 180 e 290 nm, enquanto os raios UVB incidem entre 290 e 320 nm, e os raios UVA entre 320 e 400 nm. Os raios UVA e UVB são os principais responsáveis pela maior parte das lesões cutâneas devido à excessiva exposição à radiação solar [59,60]. Embora haja muito mais radiação UVA do que UVB no espectro solar (95% : 5%), a radiação UVB é 1000 vezes mais eficaz em produzir eritema do que a UVA. A UVB requer de 2,0 a 5,0 J/cm2 para produzir uma dose mínima eritematosa (1 MED), Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 10 dependendo de alguns fatores como cor da pele, por exemplo. Na pele de camundongo hairless, por exemplo, uma única dose de 1,5 J/cm2 equivale a 1 MED [61]. Em regra geral, quanto menor for o comprimento de onda da radiação UV, maior é o efeito biológico. A radiação UVB pode provocar algumas alterações inflamatórias, como inibir a função das células natural killer (NK), assim como bloquear processos de apoptose e lise celular por modificações na expressão do gene p53. Essas alterações estão diretamente correlacionadas com a carcinogênese, podendo-se dizer, portanto, que a radiação UVB é responsável pelo câncer na pele humana, como os carcinomas de células basais escamosas e os melanomas malignos [62,63]. E a pele está continuamente exposta a uma combinação de fatores, além das radiações UV, como agentes químicos, que induzem a formação excessiva de espécies reativas (figura 7) [64]. As primeiras evidências in vitro sugeriram que todo o espectro UV (UVA, UVB e UVC) seria capaz de gerar estresse oxidativo pelo aumento de espécies reativas, e resultar em danos no DNA [65,66]. Porém, a radiação UVB além de aumentar a formação de espécies oxidativas, atua alterando os níveis de enzimas antioxidantes intracelulares [67-69]. Figura 7. Fontes endógenas e exógenas de espécies reativas na pele, e mecanismos de defesa antioxidante (adaptado de Guaratini et al., 2007 [64]). Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 11 1.3.2 Câncer de Pele Não Melanoma O carcinoma basocelular (CBC) é a neoplasia mais comum do mundo. Deriva das células tronco da camada basal da epiderme e dos folículos pilosos. Apresenta crescimento lento [70,71], e é localmente invasivo, com baixo potencial metastásico, sendo facilmente tratável por excisão cirúrgica se diagnosticado precocemente [55]. A exposição à radiação UV é o fator mais representativo no aparecimento da doença, sendo que os indivíduos que sofreram exposição solar aguda até os 20 anos têm o risco aumentado em até três vezes de ser acometido por CBC [72]. Já a exposição solar crônica está mais associada ao aparecimento de carcinoma espinocelular (CEC) também conhecido como carcinoma de células escamosas (SCC). A proporção de ocorrência na população é de quatro a cinco CBC para cada um CEC. No entanto, o registo de CBC pelas entidades de saúde não é obrigatório, podendo ser a frequência ainda mais alta [71]. O CEC é a segunda neoplasia do tipo não melanoma mais comum no mundo, e é duas vezes mais comum em homens do que em mulheres, muito provavelmente devido à maior exposição solar por consequência de algumas profissões, descuidado com o filtro solar, uso de cabelo mais curto e uso de roupas que não protegem muito a região do tronco e face [73,74]. Além de estar associado à exposição solar crônica, outros fatores, como exposição ao arsênio, infecções virais por HPV, tratamento com imunossupressores para transplantes de órgãos, inflamação crônica e úlceras, também contribuem para o aparecimento do CEC [74-76]. O CEC é localmente invasivo, com crescimento mais rápido e agressivo do que o CBC, com potencial para metástase e com taxa de mortalidade mais alta [70]. 1.3.3 Câncer de Pele Melanoma Os melanócitos são células dendríticas presentes na epiderme e cuja principal função é a síntese e transferência dos grânulos de melanina para os queratinócitos circunvizinhos [77]. A coloração da pele é definida por esses grânulos de melanina que podem ser compostos por eumelanina (pigmento marrom ou preto), feomelanina (pigmento amarelo ou vermelho) ou uma mistura de ambos [78]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 12 Indivíduos expostos à radiação UV têm aumentado a quantidade de melanócitos, gerando mudanças proliferativas, e essas mudanças são classificadas de acordo com a agressividade em: 1 – nevo melanocítico benigno; 2 – nevo displásico; 3 – melanoma de crescimento radial; 4 – melanoma de crescimento vertical; 5 – melanoma metastático [77]. Tanto o nevo melanocítico benigno quanto o displásico são considerados marcadores para o melanoma, e sua presença aumenta o risco de desenvolvê-lo. O nevo displásico, inclusive, é considerado uma lesão precursora do melanoma [79-81]. O melanoma em si corresponde ao estágio final da carcinogênese melanocítica, na qual a instabilidade genética das células iniciadas leva a um aumento da sua capacidade proliferativa e de invasão [80]. Porém, assim como em qualquer sistema neoplásico, o melanoma pode eventualmente escapar de etapas durante o seu desenvolvimento, e aparecer mesmo na ausência de lesões intermediárias, surgindo até mesmo da transformação maligna de células precursoras [82]. 1.4 ESTRESSE OXIDATIVO E ANTIOXIDANTES 1.4.1 Espécies Reativas e Estresse Oxidativo A oxidação constitui-se como parte essencial da vida aeróbia e, assim, as espécies reativas são produzidas naturalmente pelo nosso organismo, envolvidas em diversos processos como produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular, fotossíntese e síntese de substâncias biológicas importantes. As espécies reativas dividem-se em dois grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de nitrogênio (ERN). As ERO distribuem-se em espécies radicalares, com elétrons desemparelhados centrados no átomo de oxigênio, como a hidroxila (HO•), o superóxido (O2•-), a peroxila (ROO•) e a alcoxila (RO•), e não-radicalares, como o oxigênio (O2), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o ácido hipocloroso (HClO). Dentre as ERN incluem-se o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2 -), nitratos (NO3 -) e peroxinitritos (ONOO-). Algumas dessas espécies são altamente reativas no organismo, atacando apenas lipídios, outras atacam lipídios, Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 13 proteínas e o DNA [83, 84]. A figura 8, abaixo, exemplifica a formação de diferentes ERO na célula. Figura 8. Modelo mostrando a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em dois sistemas na célula. O ânion superóxido (O2•-) é produzido pelo complexo enzimático NADPH oxidase (Dinucleótido de nicotinamida e adenina fosfato oxidase), presente nas membranas celulares, e pelas mitocôndrias durante a cadeira transportadora de elétrons. A dismutação do O2•- pela enzima superóxido dismutase (SOD) é acompanhada da formação de H2O2 e então pela formação do radical HO•. O HO• é altamente reativo, apresentando a capacidade de oxidar todos os tipos de biomoléculas, especialmente os lipídios, formando radicais ROO• capazes de gerar novas espécies reativas (adaptado de Pospíšil et al., 2014) [85]. O radical HO• é o mais deletério ao organismo, pois apresenta uma meia-vida curta, e dificilmente é sequestrado in vivo. Este radical frequentemente ataca as moléculas por abstração de hidrogênio e por adição a insaturações, e as formas de controlar a sua presença na célula são reparando os danos ou inibindo a sua formação [83]. O radical HO• pode ser formado por dois mecanismos principais: • reação de Fenton, que se caracteriza pela reação do H2O2 com metais de transição como o Fe2+ e o Cu+, sendo que o Fe2+ apresenta maior relevância por sua maior biodisponibilidade [86,87]: Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 14 • homólise da água por exposição à radiação ionizante [87]: O radical HO• causa danos aos lipídios, proteínas, membranas celulares (citoplasmática, nuclear e mitocondrial), RNA e DNA, sendo que no último ele ataca tanto as bases nitrogenadas quanto a desoxirribose. A interação com as bases nitrogenadas ocorre devido à eletrofilicidade do HO• com os sítios de alta densidade eletrônica das insaturações das mesmas. A interação com a desoxirribose ocorre pela abstração de um dos seus átomos de hidrogênio, e que leva à ruptura de fita simples ou dupla no DNA [49]. A inabilidade celular de reparar os danos que ocorrem nesse processo pode levar a célula à morte, ou provocar o aparecimento de mutações levando à carcinogênese ou ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas [88]. Nos aminoácidos e proteínas, esse radical reage com a cadeia lateral, atacando especialmente cisteína, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina. O ataque a esses aminoácidos gera danos, como quebra de ligações com a geração de fragmentos, que podem ter como resultado a perda de atividade enzimática, citólise e até a morte celular [89]. O peróxido de hidrogênio (H2O2) não é um radical, porém consegue se difundir pelas membranas celulares com rapidez e tem a capacidade de gerar radicais HO• na presença de metais de transição. Na ausência dos metais de transição, é pouco reativo e somente oxida proteínas que apresentem resíduos de metionina ou grupos tiol muito reativos, como a glutationa (GSH), por exemplo [90]. O H2O2 é originado in vivo pela dismutação do ânion radical superóxido (O2•-) durante a β-oxidação dos ácidos graxos ou pelas enzimas superóxido dismutase (SOD). Outras enzimas, como a glutationa peroxidase (GSH-Px), também fazem a remoção do H2O2 das células, porém essa remoção é limitada, o que indica que praticamente todas as células de mamíferos são expostas a determinadas concentrações de H2O2 [90]. O radical óxido nítrico (NO•) é produzido nas células de alguns tecidos, pela ação da enzima óxido nítrico sintase a partir da arginina, oxigênio e NADPH, gerando também NADP+ e citrulina. O radical NO• em si não é suficientemente reativo para atacar o DNA diretamente, mas pode reagir com o ânion radical O2•-, gerando peroxinitritos (ONOO-) Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 15 que podem sofrer reações secundárias gerando agentes capazes de nitrar aminoácidos aromáticos e bases nitrogenadas [91,92]. Muitas são as defesas antioxidantes nos organismos para lidar com as espécies reativas, e para que os danos causados pelas mesmas sejam mínimos. Quando há um desequilíbrio entre a produção de EROs e ERNs e a quantidade de antioxidantes atuando, com saldo em favor do primeiro, denomina-se estresse oxidativo [93, 94]. 1.4.2 Defesas Antioxidantes O estresse oxidativo é combatido por antioxidantes produzidos pelo organismo ou absorvidos da dieta. De acordo com Halliwell (2000) [95], antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa concentração, comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação do mesmo. Os antioxidantes endógenos, produzidos pelo próprio organismo, podem agir enzimaticamente, a exemplo da superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT), ou não enzimaticamente como o tripeptídeo glutationa (GSH). Os antioxidantes exógenos, consumidos através da dieta, são representados, principalmente, pelo ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno (pró-vitamina A) e os compostos fenólicos [93]. 1.4.2.1 Antioxidantes Endógenos A SOD é um conjunto de metaloproteínas que exercem o maior papel no sistema antioxidante, catalisando a conversão do ânion radical O2•- em H2O2 e O2 [96]. Nos mamíferos, é possível encontrar três isoformas da SOD: CuZn-SOD (SOD1), existente no citoplasma; Mn-SOD (SOD2), distribuída na matriz mitocondrial, e a SOD extracelular (SOD3), localizada nos fluidos extracelulares, como linfa, fluído sinovial, e plasma [97]. A GSH-Px apresenta papel significativo na prevenção de danos oxidativos na célula através da redução de hidroperóxidos [98]. Duas classes distintas desta enzima são conhecidas – a GSH-Px selênio dependente e a GSH-Px selênio independente, cada uma possuindo maior especificidade por um determinado substrato [99]. O primeiro tipo é capaz de reduzir o H2O2 e uma imensa variedade de hidroperóxidos orgânicos. O segundo tipo reduz qualquer hidroperóxido orgânico, com exceção do H2O2 [100]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 16 A CAT é considerada o maior componente da defesa antioxidante primária, atuando na catálise da decomposição de H2O2 em água, dividindo esta função com a GSH- Px. A ação da CAT ocorre preferencialmente em altas concentrações de H2O2, e estudos mostram que a atividade da CAT se encontra significativamente diminuída em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais [101]. O tripeptídeo γ-L-glutamil-L-citeinil-glicina conhecido como glutationa (GSH) é requerido em diversos processos celulares interconectados com a manutenção e regulação do status redox da célula, devido à sua capacidade de existir em diferentes formas redox [102]. Sob condições fisiológicas, a GSH reduzida é a forma encontrada em concentrações de 10 a 100 vezes maiores do que a sua forma oxidada (GSSG). A GSSG é predominantemente produzida pela ação catalítica da GSH-Px, assim como através de reações diretas da GSH com compostos eletrolíticos, como por exemplo os radicais livres [103]. E a proporção encontrada entre as formas reduzida e oxidada da GSH é um importante indicador do ambiente redox e, ao mesmo tempo, contribui para o entendimento de mecanismos moleculares como a proliferação e diferenciação celular [104]. 1.4.2.2 Antioxidantes Exógenos A vitamina C é uma vitamina hidrossolúvel, encontrada nos organismos na forma de ascorbato (figura 9). O ascorbato desempenha papeis metabólicos como agente redutor, reduzindo metais de transição (especialmente Fe3+ e Cu2+) presentes nos sítios ativos das enzimas ou nas formas livres no organismo [105]. Por ser um bom agente redutor, o ascorbato pode ser oxidado pela maioria das espécies reativas radicalares, que chegam ou são formadas, nos compartimentos aquosos dos tecidos [83]. O ascorbato atua contra a peroxidação lipídica de duas maneiras: • no plasma sanguíneo, doa hidrogênios para os lipídios circulantes, impedindo a sua peroxidação e posterior deposição na parede dos vasos; • na membrana plasmática, em parceria com o α-tocoferol, também doando hidrogênios as fosfolipídios, impedindo sua peroxidação [106]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 17 Figura 9. Estrutura química do ascorbato [83]. A vitamina E é constituída por quatro tocoferóis, e secundariamente por quatro tocotrienois, sendo o α-tocoferol (figura 10) o mais ativo [107]. O α-tocoferol tem a capacidade de doar H para o radical ROO•, interrompendo a peroxidação lipídica em cadeia. Cada tocoferol pode reagir com até dois radicais ROO• e, nesse caso, o tocoferol é desativado de forma irreversível. Por isso, os tocoferóis necessitam do mecanismo de regeneração sinergética com o ascorbato nas membranas celulares, e com a ubiquinona na membrana mitocondrial [106,108] (figura 11). Figura 10. Estrutura química do α-tocoferol [83]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 18 Figura 11. Proteção da peroxidação lipídica de membrana pelo α-tocoferol, e posterior regeneração do mesmo pelo ascorbato (adaptado de Barreiros et al., 2006 [83]). Dentre os carotenoides, o β-caroteno é a mais importante fonte de vitamina A. Os carotenoides formam um tipo incomum de agentes redutores, pois funcionam em baixos níveis de oxigênio. A maior parte dos tecidos biológicos apresentam baixos níveis de oxigênio, o que faz com que os carotenoides sejam importantes antioxidantes. In vivo, esses antioxidantes sequestram os radicais ROO•, reduzindo a oxidação do DNA e dos lipídios [109]. Os polifenóis, e em particular os flavonoides, possuem estrutura ideal para o sequestro de espécies reativas, sendo antioxidantes mais efetivos que o ascorbato e o α- tocoferol. A atividade de sequestro dos flavonoides está diretamente ligada ao potencial de oxidação do mesmo e das espécies a serem sequestradas. Quanto menor for o seu potencial de oxidação, maior é sua atividade como sequestrador de espécies reativas, e esse potencial está diretamente relacionado ao número de hidroxilas dos flavonoides [110,111]. A lipofilicidade do flavonoide também influencia na sua atividade antioxidante, já que dessa atração resulta a sua interação com as membranas celulares. Os flavonoides que são assimilados pelas membranas exercem a função de moduladores de Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 19 fluidez, gerando um impedimento físico para a difusão de espécies reativas, impedindo o estresse oxidativo [112]. 1.5 ESTRESSE OXIDATIVO E CÂNCER DE PELE O estresse oxidativo é importante do ponto de vista biomédico por estar relacionado com diversos tipos de doenças, como doenças neurodegenerativas (Mal de Alzheimer, Mal de Parkinson, Esclerose Lateral Amiotrófica, etc.), doenças inflamatórias (Artrite Reumatoide), doenças cardiovasculares (distrofias musculares), alergias, disfunções do sistema imunológico, diabetes, envelhecimento e câncer. O excesso de ERO pode saturar os mecanismos de defesa celulares, e as moléculas intracelulares se tornam seriamente danificadas, afetando as células vizinhas [113]. A pele espontaneamente responde ao aumento dos níveis de ERO induzido por radiação UV ou agentes químicos e as mesmas podem promover diversos aspectos do desenvolvimento e progressão do câncer de pele, como: i) proliferação celular; ii) evasão da apoptose; iii) invasão de tecidos e metástases; e iv) angiogênese. Proliferação celular descontrolada requer a regulação positiva de diversas vias de sinalização intracelular, incluindo cascatas envolvidas na sobrevivência, proliferação e progressão do ciclo celular. O efeito mais significativo das ERO nas vias de sinalização tem sido observado nas vias da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK/AP1) e do fator nuclear kappa B (NK-κB) [114]. A indução de vias sensíveis às alterações redox durante a proliferação celular é necessária, já que a divisão celular exige muita energia e a produção de metabólitos da geração dessa energia deve ser tamponada para prevenir danos oxidativo e morte celular [115]. As ERO como o H2O2 e o ânion O2 •- podem induzir mitose em diversos tipos celulares [116]. Uma das características-chave das células tumorais é a habilidade de sobrevivência quando comparadas às células normais. Nas células normais, as ERO podem induzir danos no DNA que iniciam o processo de tumorigênese e subsequente progressão do tumor. No entanto, nas células tumorais, as ERO podem mediar a ativação de vias de transdução de sinais que estão envolvidas com a transmissão de informação inter e intracelulares e que são críticas para dar suporte à sobrevivência [117]. Uma das enzimas envolvidas com esse suporte é a quinase serina-treonina Akt, que regula negativamente as defesas antioxidantes e promove sobrevivência tumoral [118]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 20 As ERO estão envolvidas com o aumento da invasão tumoral e metástase pela elevação nas taxas de migração celular. Durante a transformação em carcinoma invasivo, as células epiteliais sofrem profundas alterações em sua morfologia e modo adesivo, resultando na perda da polarização normal, se transformando em uma célula altamente invasiva [117]. Um estudo prévio mostrou que altas taxas de H2O2 em carcinomas podem induzir a formação de metástases pulmonares [119], provavelmente por diminuir a ligação das células tumorais à lâmina basal. Por exemplo, o estresse oxidativo regula a expressão da proteína de adesão intracelular-1 (ICAM-1), uma proteína de superfície celular presente nas células epiteliais que regula a migração celular [120]. Tumores sólidos induzem uma resposta angiogênica para formar uma nova rede vascular para suprir as células tumorais com nutrientes e oxigênio [121]. As ERO têm sido apontadas como um dos fatores importantes de estímulo para a sinalização angiogênica. Um estudo mostrou que a administração de H2O2 ou drogas produtoras de estresse oxidativo, como a doxorrubicina, ativa a angiogênese in vivo [122]. As ERO estão relacionadas com o câncer de pele por corresponder a um dos efeitos mais significativos da exposição à radiação UV. O controle da formação das ERO pela radiação UV é de extrema importância para a prevenção dos efeitos deletérios da exposição solar, e automaticamente a prevenção do câncer de pele, e esse controle pode ser feito através do equilíbrio redox e do uso de fotoprotetores para a prevenção da formação das ERO [123]. 1.6 FOTOPROTETORES A utilização de fotoprotetores é a principal abordagem cosmética contra os efeitos nocivos da radiação UV. Vários estudos têm demonstrado que o uso contínuo de fotoprotetores reduz os casos de queratose actínica (AK), carcinomas e diminui o desenvolvimento de novos nevos, além de evitar o envelhecimento precoce da pele [124- 127]. Fotoprotetores são preparações cosméticas que possuem diversas formas de apresentação. Podem ser encontrados na forma de loções hidro-alcoólicas, óleos, géis oleosos, emulsões óleo em água, emulsões água em óleo, bastões, aerossóis e outros. As loções hidro-alcoólicas em si apresentam reduzida proteção, pois o filme formado sobre a pele é irregular [128]. Introdução _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 21 As formulações fotoprotetoras apresentam ação física ou química que atenua o efeito da radiação UV por mecanismos de absorção, dispersão ou reflexão da radiação. A qualidade de um fotoprotetor depende do seu FPS (Fator de Proteção Solar) à radiação UVB, da medida de proteção PPD (Persistent Pigment Darkening) ou UVA-PF (Fator de Proteção à radiação UVA), e das suas propriedades físico-químicas como: formação de película ideal sobre a pele, estabilidade, baixa hidrossolubilidade e hipoalergenicidade [129-131]. Muitos produtos cosméticos presentes no mercado apresentam antioxidantes incorporados visando combater os sinais de envelhecimento da pele. Diversos trabalhos investigam a ação destes antioxidantes na fotoproteção, analisando seus efeitos protetores frente aos danos moleculares gerados por estresse oxidativo induzido pela radiação UV [132,133]. Pesquisas de novas substâncias para utilização em protetores solares estão sendo extensivamente realizadas, e há um crescente interesse para o desenvolvimento de fotoprotetores baseados em produtos naturais com atividade antioxidante [134]. Dessa forma, a utilização da fração C como componente antioxidante de um fotoprotetor, associado a outras propriedades já documentadas para o látex (e.g. cicatrizante, regenerativa, angiogênica, etc.), se torna interessante. Objetivos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 22 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS Avaliar a capacidade antioxidante da fração C do látex de Hevea brasiliensis em modelo experimental in vitro sem células, em meio in vitro com duas linhagens celulares e em modelo experimental in vivo de câncer de pele não melanoma induzido por radiação UVB. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Os objetivos específicos do trabalho foram avaliar: • a capacidade de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis de sequestrar espécies reativas (HO•, H2O2 e NO•) in vitro em meio sem células; • a capacidade antioxidante total de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis in vitro em meio sem células através do método de redução do molibdênio; • o efeito de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis sobre a viabilidade celular das linhagens CHO-k1 e B16F10 através do teste do MTT; • a genotoxicidade de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis nas linhagens CHO-k1 e B16F10 através do Ensaio do Cometa; • a indução de apoptose e necrose de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis sobre as linhagens CHO-k1 e B16F10, através da técnica de detecção morfológica de células apoptóticas e necróticas por dupla coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio; • os parâmetros de estresse oxidativo, através da dosagem de glutationa (GSH) e malonaldeído (MDA), nas linhagens CHO-k1 e B16F10 tratadas com diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis; • a capacidade antioxidante de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis nos eritrócitos de camundongos hairless (SKH-1) após irradiação crônica com radiação UVB, através da avaliação da atividade da catalase (CAT) e dosagem de GSH; • a capacidade antioxidante de diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis na pele de camundongos SKH-1 após irradiação crônica com radiação Objetivos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 23 UVB, através das dosagens de MDA e GSH, através da avaliação da capacidade antioxidante total da pele (TRAP) e da atividade da CAT; • histopatologicamente a pele de camundongos SKH-1 após tratamento com diferentes concentrações da fração C do látex de H. brasiliensis e irradiação crônica com radiação UVB. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 24 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 COLETA DO LÁTEX E OBTENÇÃO DA FRAÇÃO C O látex foi coletado de diferentes seringueiras (Hevea brasiliensis) clones RRIM 600, na Fazenda Indiana localizada na região de Presidente Prudente-SP, em 25 de junho de 2013. A sangria das árvores foi realizada com uma faca em forma de U, em cortes sucessivos a partir de uma altura de 1,20m do solo. O látex foi então levado ao laboratório, dividido em microtubos de 2,0 ml, tipo Eppendorf, e centrifugado a 17968g por 30 minutos em uma centrífuga da marca Fanem, tipo Microhemato, modelo 2410. A essa velocidade, o látex se separa em três partes diferentes22 (figura 3). Utilizando uma seringa, a fração aquosa intermediária, correspondente à fração C do látex, foi removida e separada em tubos de 15 ml, tipo Falcon. Esses tubos foram levados ao freezer a -4ºC, para que as partículas de borracha remanescentes precipitassem e pudessem ser removidas posteriormente. 3.2 PREPARO DA FRAÇÃO C PARA OS TESTES IN VITRO A fração C reservada nos tubos tipo Falcon foi filtrada sucessivamente em filtros com poros de 14 µm (Qualy, Brasil) e posteriormente em filtros com poros de 7 µm (Quanty, Brasil). A mesma foi então pesada e diluída em PBS (Phosphate Buffer Saline) até chegar a uma concentração de 200 µg/ml, que foi considerada a solução-mãe. Essa solução teve seu pH corrigido para 7,4, e a partir dela foram preparadas outras 9 concentrações: • 0,02 µg/ml; • 0,2 µg/ml; • 1 µg/ml; • 2 µg/ml; • 5 µg/ml • 10 µg/ml • 20 µg/ml; • 50 µg/ml; e • 100 µg/ml. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 25 Todas as soluções foram então filtradas para descontaminação, em fluxo laminar, em filtros com poros de 0,22 µm (Kasvi, Brasil), e estocadas em geladeira para uso posterior. 3.3 PREPARO DOS CREMES DE FRAÇÃO C PARA OS TESTES IN VIVO Para a preparação dos cremes para os testes in vivo, foi preparado um veículo não iônico, conforme descrito por Takahashi e colaboradores (1999) [135]. Esse veículo foi preparado no Laboratório de Farmacotécnica da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), com a seguinte composição: • Álcool cetearílico; • Polysorbato 60; • Estearato de Octila; • Dispersão coloidal ácido graxo/ésteres; • Metilparabeno; • Propilparabeno; • EDTA dissódico; • Propilenoglicol; • Aminopropanol Ultra; • Isotiazolinona; • Ciclopentoxalano; • Água destilada. Após a preparação do veículo, foi adicionada a fração C do látex até chegar à concentração final de 1%, 2% e 10%. Os cremes foram reservados em recipientes próprios para pomadas, em geladeira (4 ºC), até o uso. 3.4 TESTES IN VITRO EM MEIO SEM CÉLULAS 3.4.1 Atividade de sequestro de radicais hidroxil (HO•) A atividade sequestradora de radicais HO• da fração C do látex foi medida de acordo com Smirnoff e Cumbes (1989) [136], com modificações conforme Liu e colaboradores (2010) [137]. Os radicais HO• foram gerados a partir de FeSO4 e H2O2, e detectado a partir de sua habilidade de hidroxilar o salicilato. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 26 A mistura de 2 ml continha 0,5 ml de FeSO4 (1,5 mM), 0,35 ml de H2O2 (6 mM), 0,15 ml de salicilato de sódio (20 mM), e 1 ml das diferentes concentrações da fração C do látex (0,02; 0,2; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100 e 200 µg/ml). Ácido L-ascórbico (1000 µg/ml), Vitamina C, foi utilizado como controle positivo e para comparação com as diferentes concentrações da fração C. Após incubação de 1 hora a 37 ºC, a absorbância do sacilitato hidroxilado foi medida espectrofotometricamente a 562 nm. A porcentagem de radicais sequestrados foi calculada assim: %𝐻𝑂∙𝑠𝑒𝑞𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 = 1 − 𝐴2 − 𝐴3 𝐴4 𝑥100, onde A1 é a absorbância da amostra de fração C ou do ácido ascórbico, A0 é absorbância do controle, e A2 é a absorbância do branco sem o salicilato de sódio. 3.4.2 Atividade de sequestro de peróxido de hidrogênio (H2O2) A capacidade de sequestro de H2O2 foi medida de acordo com Liu e colaboradores (2010) [137]. A mistura para as reações continha 1ml de H2O2 (0,1 mM) preparado na hora, 1 ml das diferentes concentrações da fração C do látex (0,02; 0,2; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100 e 200 µg/ml), 0,1 ml de molibdato de amônio (3%), 10 ml de H2SO4 2M, e 7 ml de KI 1,8 M. Ácido L-ascórbico (1000 µg/ml), Vitamina C, foi utilizado como controle positivo e para comparação com as diferentes concentrações da fração C. A mistura foi titulada contra 5 mM de Na2S2O3 até a cor desaparecer. A atividade de sequestro foi calculada assim: %𝐻3𝑂3𝑠𝑒𝑞𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 = (𝑉4 − 𝑉2) 𝑉4 𝑥100, onde V0 é o volume da solução de Na2S2O3 usada para titular a mistura controle e V1 é o volume da solução de Na2S2O3 usada para titular a mistura com as amostras e ácido ascórbico. 3.4.3 Atividade de sequestro do radical óxido nítrico (NO•) O NO• gerado a partir do nitroprussiato de sódio foi medido através do reagente Griess, pelo método de Marcocci e colaboradores (1994) [138]. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 27 A mistura com volume final de 3 ml, contendo as concentrações da fração C de látex (0,02; 0,2; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100 e 200 µg/ml) e nitroprussiato de sódio (5mM) em PBS, foi incubada a 25 ºC por 150 min. Após a incubação, amostras (0,5 ml) foram removidas e diluídas com 0,5 ml de reagente de Griess (1% sulfanilamida, 2% ácido o- fosfórico e 0,1% naftil-etilenodiamina). A absorbância do cromóforo formado foi medida a 546 nm, e a inibição da formação de NO• foi estimada pela comparação entre os valores de absorbância da amostra com a fração C e do controle sem a fração C. Ácido L- ascórbico (1000 µg/ml), Vitamina C, foi utilizado como controle positivo e para comparação com as diferentes concentrações da fração C. A atividade de sequestro foi calculada assim: %𝑁𝑂∙𝑠𝑒𝑞𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 = 1 − 𝐴2 𝐴3 𝑥100, onde A0 é a absorbância do controle, e A1 a absorbância da amostra contendo a fração C do látex ou ácido ascórbico. 3.4.4 Capacidade antioxidante total A capacidade antioxidante total foi determinada de acordo com Pietro e colaboradores (1999) [139]. As concentrações da fração C do látex (0,02; 0,2; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100 e 200 µg/ml) foram adicionada em um tubo tipo Eppendorf e misturadas a 1 ml de uma solução reagente contendo 0,6 M de H2SO4, 28 mM de NaH2PO4, e 0,4 mM de molibdato de amônio. Os tubos foram encapados com papel alumínio e incubados a 95 ºC por 90 min. A absorbância foi medida a 695 nm após as amostras esfriarem a temperatura ambiente. Ácido L-ascórbico (1000 µg/ml), Vitamina C, foi utilizado como controle positivo e para comparação com as diferentes concentrações da fração C. A capacidade antioxidante total foi calculada assim: 𝐶𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (%) = 1 − 𝐴2 𝐴3 𝑥100, onde A1 é a absorbância da amostra ou do ácido ascórbico, e A0 a absorbância do controle. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 28 3.5 TESTES IN VITRO EM MEIO COM CÉLULAS 3.5.1 Linhagens celulares CHO-k1 e B16F10 e Condições de Cultura As células de epitélio de ovário de hamster chinês (CHO-k1), gentilmente cedidas pela Dr.ª Dalita G. S. M. Cavalcante, foram crescidas em meio de cultura HAM- F10:DMEM (1:1), suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de mistura de penicilina/estreptomicina, todos produtos da Sigma-Aldrich, Brasil. As células de melanoma murino (B16F10), gentilmente cedidas pela Prof.ª Dr.ª Alessandra Lourenço Cecchini da Universidade Estadual de Londrina, foram crescidas em meio DMEM high-glucose (Gibco® Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de mistura de penicilina/estreptomicina, ambos Sigma-Aldrich, Brasil. Ambas linhagens foram mantidas em uma incubadora com atmosfera umedecida de 5% de CO2 a 37 ºC. Todos os experimentos foram realizados cultivando 105 células em placas de 24 poços por 24 horas, com exceção do teste de viabilidade celular, onde as células foram cultivadas em placas de 96 poços, quando as células apresentavam 80% de confluência, no mínimo. 3.5.2 Doxorrubicina O cloridrato de doxorrubicina (DXR), também conhecido como adriamicina, é um antibiótico antineoplásico do grupo das antraciclinas, isolado a partir de culturas fúngicas de Streptomyces peucetus var. caesius, relatado como de uso recorrente em oncologia humana. Clinicamente, a DXR tem atividade significativa contra considerável número de tumores, incluindo alguns que são refratários a outros fármacos [140]. Estudos têm comprovado que o estresse oxidativo e a produção de radicais livres estão envolvidos no modo de ação da DXR, especialmente em termos da ação antitumoral [141,142]. No presente estudo, a DXR (Doxorubicin hydrochloride, Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil, CAS 25316-40-9) foi dissolvida em água destilada até atingir uma concentração final de 0,75 µg/ml e foi protegida da luz. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 29 3.5.3 Teste de Viabilidade Celular A viabilidade das células CHO-k1 e B16F10, tratadas com as dez concentrações de fração C do látex (0,02; 0,2; 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100 e 200 µg/ml), foi avaliada por meio da análise colorimétrica do brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H- tetrazólio ou MTT (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), por meio do protocolo proposto por Mosmann (1983) [143], em placa de 96 poços. Células tratadas com PBS foram consideradas como controle negativo. Foram realizadas 8 repetições em triplicata para cada tratamento. Após o período de exposição (24h) das células aos diferentes tratamentos, o meio foi aspirado e as células incubadas por 3 horas em 200 µl de solução de MTT. Em seguida, a solução de MTT foi aspirada cuidadosamente e o formazan precipitado foi ressuspendido em 200 µl de dimetilsulfóxido (DMSO). A viabilidade celular (VC) foi avaliada por espectrofotometria, no Leitor Universal de ELISA (Readwell Touch, Robonik, Índia), no comprimento de onda de 492 nm, no laboratório de Imunologia Clínica da Universidade do Oeste Paulista. As células tratadas com PBS (controle negativo) foram consideradas como apresentando 100% de VC. A VC das células tratadas foi determinada pela seguinte fórmula: 𝑉𝐶 = 𝐴𝑏𝑠D − 𝐴𝑏𝑠EF 𝐴𝑏𝑠GD − 𝐴𝑏𝑠EF 𝑥100, onde AbsT é a absorbância das células tratadas com as diferentes concentrações da fração C de látex, AbsBr é a absorbância encontrada para o branco (poços contendo apenas meio de cultura) e AbsCT é a absorbância encontrada para o controle negativo. A partir do teste de VC nas células CHO-k1, juntamente com os testes antioxidantes in vitro em meio sem células, foram escolhidas três concentrações com alta capacidade de sequestro de radicais livres e com alta VC para serem trabalhadas nos outros testes (5, 50 e 100 µg/ml). 3.5.4 Ensaio do Cometa O Ensaio do Cometa foi realizado em condições alcalinas, conforme proposto por Singh e colaboradores (1988) [144], com algumas modificações, conforme descrito por Speit e Hartmann (1999) [145]. Lâminas de vidro foram previamente preparadas, onde a Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 30 agarose de ponto de fusão normal (normal melting point ou NMP) foi aplicada sobre as lâminas e as mesmas permaneceram horizontais, em temperatura ambiente, por 24h para secagem. As linhagens celulares CHO-k1 e B16F10 foram expostas a três concentrações da fração C do látex (5, 50 e 100 µg/ml) por 24 h, em placa de 24 poços. A DXR (0,75 µg/ml) foi utilizada como controle positivo e o PBS foi utilizado como controle negativo. Todos os tratamentos foram realizados em triplicata. Após o tempo de tratamento, as células foram tripsinizadas, centrifugadas e 20 µl de cada amostra foi misturada a 150 µl de agarose de baixo ponto de fusão (low melting point ou LMP) e a suspensão celular obtida foi transferida para duas lâminas que continham agarose NMP. Uma lamínula foi adicionada e as lâminas foram levadas à geladeira (4 ºC) para solidificar por 30 minutos. A lamínula foi então cuidadosamente retirada e a lâmina foi mergulhada em uma solução lisadora alcalina (pH 10), recém preparada, contendo NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, 10% DMSO, 1 ml Triton X-100, por 1 hora a 4 ºC e protegidas da luz. Ao final do período de lise, as lâminas foram transferidas para uma cuba de eletroforese contendo um tampão altamente alcalino (pH 13) que continha NaOH 300 mM e EDTA 1 mM) e foram incubadas a 4 ºC por 20 minutos, para permitir o desnovelamento do DNA. Após esse período, uma corrente de 25 V e 300 mA foi aplicada por 20 minutos na cuba e logo após as lâminas foram submergidas em um tampão neutralizador (Tris 0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos, e deixadas para secar à temperatura ambiente. As lâminas foram estocadas a 4 ºC em geladeira para posterior análise. Para análise das lâminas foi aplicado 50 µl do corante GelRed (33%) e os nucleoides foram imediatamente evidenciados usando um microscópio de fluorescência Olympus IX51 em 400 x (filtro de excitação 420-490 nm; filtro de emissão 520 nm). Foram analisadas 100 nucleoides por lâmina, sendo 300 células por tratamento. Em cada lâmina, as células foram visualizadas e classificadas de acordo com 4 classes, de acordo com o tamanho da calda conforme o seguinte: classe 0, quando não há calda; classe 1, quando há uma pequena calda com o comprimento menor do que o diâmetro do nucleoide; classe 2, quando a calda é até 2 vezes maior do que o diâmetro do nucleoide; e classe 3, quando a calda é mais do que 2 vezes maior do que o diâmetro do nucleoide (figura 12). O score dos 300 nucleoides analisados por tratamento, foi obtido de acordo com a fórmula de Manoharan e Banerjee (1985) [146], com modificações, conforme a seguir: Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 31 𝑆𝑐𝑜𝑟𝑒 = (1𝑥𝑛2 + 2𝑥𝑛3 + 3𝑥𝑛L), onde n = número de células analisado em cada classe. Figura 12. Classificação dos nucleoides de células B16F10 no ensaio do cometa após coloração com GelRed. A: classe zero, B: classe 1; C: classe 2; D: classe 3. 3.5.5 Detecção morfológica de células apoptóticas e necróticas A detecção morfológica das células apoptóticas e necróticas foi realizado de acordo com o descrito por Carminati (2005) [147], com algumas modificações. As linhagens celulares CHO-k1 e B16F10 foram expostas a três concentrações da fração C do látex (5, 50 e 100 µg/ml) por 24 h, em placa de 24 poços. A DXR (0,75 µg/ml) foi utilizada como controle positivo e o PBS foi utilizado como controle negativo. Para a visualização de células apoptóticas e necróticas, dois corantes fluorescentes foram empregados: o Hoechst 33342 (bisBenzimide H33342 trihydrochloride, Sigma- Aldrich, São Paulo, Brasil) e o Iodeto de Propídeo (PI) (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil). O corante Hoechst 33342 é utilizado para corar DNA em células viáveis e o PI somente pode penetrar células com membrana celular danificada, sendo útil então para a identificação da integridade da membrana celular. Após o tempo de tratamento, as células foram tripsinizadas e centrifugadas, e ressuspendidas em meio de cultura. Alíquotas de 100 µl da solução contendo as células foram simultaneamente incubadas com 50 µl de PI (1000 µg/ml), 25 µl de Hoechst 33342 (1000 µg/ml) e 25 µl de PBS a 37 ºC por 5 minutos. 50 µl da solução total foi depositada sobre uma lâmina e a mesma coberta com lamínula, e analisada em microscópio de fluorescência Olympus IX51 em 400 x com filtro DAPI. Foram analisadas 500 células por lâmina, totalizando 1500 células por tratamento, sendo discriminadas as células apoptóticas, necróticas e normais de acordo com o seguinte critério: • Células apoptóticas: núcleo azul com corpos apoptóticos; • Células necróticas: núcleo vermelho íntegro ou em vesículas; Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 32 • Células normais: núcleo íntegro, corado em azul (Figura 13). Figura 13. Classificação morfológica: (A) células apoptóticas, (B) necróticas (em vermelho) e normais (em azul), de acordo com a coloração fluorescente com Hoescht 33342 e Iodeto de Propídio. 3.5.6 Parâmetros de Estresse Oxidativo Para a determinação dos parâmetros de estresse oxidativo, as linhagens celulares CHO-k1 e B16F10 foram expostas a três concentrações da fração C do látex (5, 50 e 100 µg/ml) por 24 h, em placa de 24 poços. A DXR (0,75 µg/ml) foi utilizada como controle positivo e o PBS foi utilizado como controle negativo. Esses parâmetros foram analisados no Laboratório de Patologia Geral da Universidade Estadual de Londrina, sob orientação da prof.ª Dr.ª Alessandra Lourenço Cecchini. A quantificação de tiol total foi determinada utilizando 5,5’-ditiobis (ácido 2- nitrobenzoico, DTNB), conforme descrito por Hu (1994) [148]. A quantificação de grupos tiol total foi calculada usando uma curva de calibração preparada com GSH (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil), e os resultados foram expressos em tiol µM/g de proteína. Aldeídos sempre são produzidos em processos de peroxidação lipídica, sendo o malonaldeído (MDA) o mais abundante. O conteúdo de MDA foi determinado por cromatografia líquida de alta performance em um sistema HPLC LC-20AT® (Shimadzu, Kyoto, Japan), conforme descrito por Victorino e colaboradores (2013) [149]. As suspensões celulares foram incubadas com ácido perclórico e então com 0,5 M de ácido tiobarbitúrico a 100 ºC por 30 minutos. A reação foi então resfriada e centrifugada a 5000 A) B) Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 33 g a 4 ºC. As leituras foram tiradas a 535 nm durante 11 minutos, em uma taxa de vazão de 0,8 ml/min a 35 ºC, e os resultados foram expressos em MDA nM/g de proteína. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951) [150], modificado por Miller (1959) [151]. Albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. 3.6 TESTES IN VIVO Todos os testes in vivo foram realizados no Departamento de Patologia Geral da Universidade Estadual de Londrina, sob orientação da Prof.ª Dr.ª Alessandra Lourenço Cecchini. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso Animal da Universidade Estadual de Londrina sob o no 6738.2015.40 (em anexo). 3.6.1 Animais, irradiação UVB e tratamento com o creme de fração C Camundongos hairless SKH-1 machos, pesando entre 20-25 g, tiveram acesso à comida e água ad libitum. Todos foram tratados de acordo com as orientações do Instituto Nacional de Saúde. A câmara de irradiação foi ajustada com uma lâmpada UVB fluorescente PHILIPS TL/12 40 W, com uma faixa de emissão entre 270 a 400 nm, com picos máximos de 313 nm. A emissão UVB foi medida usando um Radiômetro modelo IL- 1700 (International Light, USA) com um sensor para UV (SED005) e UVB (SED240), que detectou que a radiação UVB constituía 73% do total de radiação emitida nas condições experimentais. A taxa de emissão da radiação UVB foi de 0,47 x 10-4 mW/cm2 e os animais foram expostos a uma dose diária de radiação UVB de 0,228 mJ/cm2 (dose cumulativa = 17,1 J/cm2). A câmara de irradiação utilizada apresenta como medidas 1,30m X 0,43 m X 0,45 m, e o local para se colocar a caixa com os animais para irradiação situa-se 15 cm abaixo da lâmpada. Os animais foram tratados topicamente no dorso com ~50 mg dos cremes e irradiados durante 16 minutos, 5 dias na semana, por 15 semanas, conforme descrito por Burns e colaboradores (2012) [152], com modificações (figura 14). Os grupos de animais, contendo 8 camundongos cada, foram divididos em: • Grupo controle não irradiado: os animais desse grupo não receberam irradiação e nem tratamento com o creme; Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 34 • Grupo controle irradiado: os animais receberam apenas irradiação, mas não foram tratados com o creme de fração C; • Grupo irradiado com creme sem fração C: os animais receberam irradiação e foram tratados apenas com o veículo, sem a fração C do látex; • Grupo irradiado com creme com fração C a 1%: os animais receberam irradiação e foram tratados com o creme contendo 1% de fração C; • Grupo irradiado com creme com fração C a 2%: os animais receberam irradiação e foram tratados com o creme contendo 2% de fração C; • Grupo irradiado com creme com fração C a 10%: os animais receberam irradiação e foram tratados com o creme contendo 10% de fração C. Após a irradiação, o creme era completamente removido do dorso do animal. Após os tratamentos, 1,5 ml de sangue total foi colhido por punção cardíaca, e 1 cm2 de pele da região dorsal foi removido. 0,5 cm2 da pele removida foi congelado em freezer -80 ºC e o outro 0,5 cm2 foi fixado em formalina tamponada 5% para posterior inclusão em parafina. Todos os parâmetros analisados foram medidos em triplicatas. Figura 14. Camundongo SKH-1 após 15 semanas de irradiação por radiação UVB. A seta aponta as lesões encontradas no dorso do animal, provocadas pela irradiação crônica. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 35 3.6.2 Análise antioxidante de eritrócitos Os eritrócitos foram obtidos de sangue heparinizado e lavados três vezes com solução salina 0,9% a 4 ºC. A atividade da CAT foi medida conforme descrito por Aebi (1984) [153], com modificações conforme descrito por Panis e colaboradores (2012) [154]. Os eritrócitos foram diluídos a 1:80 de água destilada, e incubados em um sistema contendo 1 M de Tampão TRIS e 200 mM de solução de H2O2. A cinética de absorbância foi monitorada em 240 nm, em um espectrofotômetro UV-Vis modelo UV-1650 PC® (Shimadzu, Kyoto, Japan). Os resultados estão expressos em valores de absorbância por minuto por mililitro de amostra (Abs.min-1.ml-1). Os níveis de GSH foram determinados de acordo com o descrito por Tietze (1969) [155], onde 30 µl de eritrócitos diluídos em uma proporção de 1:100 em água deionizada, e incubados com 60 µM de 5,5’-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico, DTNB) em 1 M de tampão TRIS foram medidos a 412 nm, e os resultados foram expressos em µg de GSH. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951) [150], modificado por Miller (1959) [151]. Albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. 3.6.3 Análise antioxidante da pele 3.6.3.1 Preparação do tecido Os homogenatos da pele da região dorsal foram preparados conforme o descrito por Peres e colaboradores (2011) [156]. As peles foram homogeneizadas em um homogeneizador Ultraturrax, contendo 10 mg de tecido/ml ou 50 mg de tecido/ml em 30 mM de tampão KH2PO4/K2HPO4 e 120 mM de KCl em pH 7,4. O sobrenadante da concentração de 10 mg de tecido/ml foi utilizado para determinar a capacidade antioxidante total (TRAP). O sobrenadante da concentração de 50 mg de tecido/ml foi utilizado para determinar a atividade da catalase, os níveis de GSH e a peroxidação lipídica. 3.6.3.2 Medida da capacidade antioxidante total (TRAP) A capacidade antioxidante total do homogenato de pele foi medido por quimioluminescência, conforme descrito por Repetto e colaboradores (1996) [157], em Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 36 uma reação contendo 20 µM de 2-azobis-(2-amidinopropano) (ABAP) e 200 µM de luminol, um sistema gerador de radicais alcoxil. Após a emissão máxima ter sido alcançada, 70 µl de trolox foi adicionado ao meio de reação. Depois, o trolox foi substituído por 100 µl do sobrenadante de tecido. O tempo que a amostra segurou a emissão dos fótons (peak hindering time) é comparado com o padrão trolox. Os resultados foram expressos em µM de Trolox. 3.6.3.3 Atividade da Catalase (CAT) A atividade da catalase foi determinada de acordo com Cohen e colaboradores (1970) [156], modificado por Aebi (1984) [153]. A absorbância do H2O2, em 1M de tampão HCl-TRIS, pH 8,0, foi monitorada em 240 nm. Alíquotas do sobrenadante de pele (50 mg de tecido/ml) foi adicionado ao meio e a diminuição da absorbância foi monitorada por 5 minutos. Os resultados foram expressos como ABS/mg proteína/min. A decomposição do H2O2 está diretamente relacionada com a diminuição da absorbância. 3.6.3.4 Avaliação dos níveis de GSH Os níveis de glutationa reduzida (GSH) foram determinados pelo 5,5’-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico, DTNB) evidenciados pela formação de uma coloração amarelada, de acordo com método descrito por Tietze (1969) [155]. Os resultados foram expressos em µM GSH/mg de proteína total. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Lowry et al. (1951) [150], modificado por Miller (1959) [151]. Albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. 3.6.3.5 Avaliação da Peroxidação Lipídica O malondialdeído (MDA) formado durante a peroxidação lipídica faz parte dos compostos reativos com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), gerando um composto colorido, o aducto (TBA)2-MDA. Após a extração desse aducto com n-butanol, o mesmo absorve luz no comprimento de onda de 532 nm. Os níveis de TBARS foram medidos de acordo com o descrito por Oliveira e Cecchini (2002) [159], expressos em nM/50 mg de tecido. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 37 3.6.4 Análise histopatológica As lesões induzidas por radiação UVB crônica de cada animal foram removidas para análise histológica. O mesmo procedimento foi realizado para os animais não irradiados. Após removidas, as lesões foram fixadas em formalina tamponada 10%, armazenadas em etanol 70% e embebidas em parafina para posterior seccionamento. Foram feitos cortes de 5 µm e os mesmos foram corados com hematoxilina e eosina (H&E). A avaliação histopatológica de cada lâmina foi baseada no diagnóstico de queratose actiníca (AK), e carcinoma de células escamosas (SCC) que é caracterizado por invação dérmica [160-163], considerando o aparecimento destes dois eventos na mesma lâmina. As áreas de AK foram determinadas pelo software ImageJ (imagej.net) [164]. 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPad Prism® 6 (GraphPad, San Diego, CA, USA), obtido através de licença pela Universidade Estadual de Londrina. Todos os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. As médias obtidas no teste do MTT foram calculadas e avaliadas estatisticamente utilizando One-Way ANOVA seguida do teste de Dunnet, sob significância de 95%. Para todos os outros testes, as médias obtidas foram avaliadas estatisticamente utilizando One- Way ANOVA seguida do teste de Tukey para múltiplas comparações, sob significância de 95%. Resultados e Discussão _________________________________________________________________________ Leandra Ernst Kerche Silva 38 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 TESTES IN VITRO EM MEIO SEM CÉLULAS A atividade antioxidante de alguns compostos em sistemas biológicos pode ser explicada através de vários mecanismos, incluindo atividade de sequestro de espécies reativas, ligação com íons de metais de transição que podem agir como agentes catalíticos, decomposição ou redução de peróxidos, abstração de