Adriana Beatriz Barretto Tratamento da Endometriose Peritoneal com Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico Estudo Experimental em Coelhas Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Área de Concentração em Bases Gerais da Cirurgia e Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista – UNESP, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Cirurgia. Orientador: Prof. Dr. Rogério Saad-Hossne Botucatu 2012 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Barretto, Adriana Beatriz. Tratamento da endometriose peritoneal com injeção local de ácido acetilsalicílico : estudo experimental em coelhas / Adriana Beatriz Barretto. – Botucatu : [s.n], 2012 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Rogério Saad-Hossne Capes: 40102149 1. Endometriose. 2. Aspirina. 3. Coelho como animal de laboratório. Palavras-chave: Aspirina; Coelhos fêmeas; Endometriose; Estudo experimental. Dedicatória Dedicatória Dedicatória Dedico aos meus pais, CCecília e GGilmar, Por todos os seus exemplos, pelos esforços que sempre fizeram para que eu tivesse um bom estudo, tudo o que fizeram não foi em vão e tudo foi observado com muito carinho e atenção, pois sei que por muitas vezes foi mais do que difícil superar os desafios. Por todo tempo dedicado a minha formação, pela estruturação familiar que temos, por tudo o que são para mim, com certeza o maior e melhor exemplo de pessoas dignas e respeitadas. Sem vocês, estar onde estou, conquistando o meu caminho, não teria o mesmo valor. Dedico ao meu irmão e sua esposa, AAndré e SSabrina, O sucesso de vocês é um dos motivos que me faz levantar todos os dias e desejar cada vez mais, tenho muito orgulho de ter vocês em minha vida. E por fim à pessoa mais maravilhosa que já entrou na minha vida, meu namorado e futuro marido, PPaulo, Você apareceu na minha vida para me mostrar que nenhum problema no mundo é o suficiente para desequilibrar alguém, tenho muito orgulho de te ter ao meu lado, meu namorado, meu melhor amigo, meu confidente, meu conselheiro, meu futuro marido. Me faltam palavras para dizer o quanto você é importante para mim. Agradecimentos Especiais Agradecimentos Especiais Agradecimentos Especiais Ao meu orientador Prof. Dr. Rogério Saad Hossne, ao qual eu serei sempre grata por me proporcionar a possibilidade de chegar onde cheguei e me incentivando a querer sempre mais. Agradecimentos Especiais Ao Dr. Rafael Denadai, por toda disponibilidade e ajuda em grande parte da finalização do trabalho, sua parceria foi essencial para o enriquecimento da dissertação e do meu conhecimento. Ao Prof. Dr. Juan Llanos, sempre disposto a ajudar de todas as formas para o meu crescimento profissional. Ao técnico do laboratório Ednelson Henrique Bianchi, uma das pessoas com mais conhecimento que já encontrei, obrigada por todas as horas disponíveis ao meu dispor, por todas as aulas sobre todos os assuntos imagináveis, por todo o conhecimento a mim passado e principalmente por ter aberto as portas para a sua amizade. À SSolange Peron Bueno Angela por seu conhecimento específico que engrandeceu a dissertação em toda a parte histológica. Agradecimentos AGRADECIMENTOS Agradecimentos Agradeço a todas as pessoas que me auxiliaram na concretização deste trabalho, com muita dedicação e qualificação profissionais: Ao Abílio e a Adnice, grande parte do meu crescimento foi consequência da atenção e carinho de vocês, obrigada nunca será o suficiente para retribuir tudo o que já fizeram por mim, horas e horas sem dormir que jamais trocaria por nada, muitas risadas, choros, perdas e conquistas em todo este tempo próximo a vocês. Continuem sempre com este coração enorme que cativa a qualquer um. Muito obrigada. Aos amigos que fiz durante estes anos na pós-graduação, os quais sempre estiveram à disposição para me ajudar em qualquer momento: Bruna, Karen, Carlos, Maila, Mariana, Renata, Gabrielli, vocês são mais do que especiais. À Luana Amaral, secretária do Departamento de Cirurgia, a qual se tornou uma grande amiga. À minha prima-irmã Mariana Leme Bernabé, para você minha pequena grande mulher eu só posso dizer que sua ajuda sempre foi fundamental, só por sentar do meu lado por horas e dar apoio moral enquanto estudava. Mesmo com seus 16 anos, disponibilizou de seu tempo para me ajudar a procurar artigos, traduzir textos, melhorar frases, observar lâminas e escolher fotos. Você é meu orgulho, muito obrigada por existir na minha vida. À todos aqueles que, direta ou indiretamente, colaboraram na realização desta dissertação de mestrado, Muito Obrigada! Epígrafe Epígrafe Epígrafe O amor entre pais e filhos é como uma doce canção de ninar Nossa vida com eles é como viver uma eterna poesia... eterna magia... Com eles renascemos... revivemos... Encontramos nossa parte perdida, escondida ou mesmo ocultada pelo peso do tempo que passou. Um filho, conforta, abriga, desvenda, revela e ilumina o nosso caminho. É uma porta aberta para qualquer situação... Um filho é o sol do meio dia, a lua e as estrelas nas noites de escuridão... É a nossa bússola, nosso norte... nosso sul... É a beleza de um céu azul... É como a rota de um navio, a bússola que nos direciona a um porto seguro... Enfim um filho é o milagre realizado em nós para que DDeus nos abasteça de esperança e realização... E você querida filha, é o CCRISTAL que me fortalece a alma e o coração... Maria Cecilia Leme Barretto Sumário SUMÁRIO Sumário Lista de Figuras........................................................................................... 16 Lista de Tabelas.......................................................................................... 19 1. Introdução................................................................................................ 21 1.1 Aspectos Demográficos, Clínicos e Diagnósticos da Endometriose. 22 1.2 Tratamento da Endometriose............................................................ 23 1.3 Apresentação da Linha de Pesquisa Envolvendo o Ácido Acetilsalicílico.................................................................................... 24 1.4 Histórico do Ácido Acetilsalicílico...................................................... 27 1.5 Tratamento da Endometriose com Ácido Acetilsalicílico................... 30 2. Objetivos.................................................................................................. 31 3. Material e Método.................................................................................... 33 3.1 Ética................................................................................................... 34 3.2 Animais.............................................................................................. 34 3.3 Protocolo e Grupos Experimentais.................................................... 35 3.4 Técnicas Cirúrgicas e Anestésica..................................................... 36 3.4.1 Indução de Lesões Endometriais............................................. 36 3.4.2 Aferição Dimensional e Tratamento das Lesões...................... 38 3.4.3 Tratamento e Sacrifício............................................................ 38 3.5 Solução Teste.................................................................................... 38 3.6 Formas de Análise dos Resultados – Avaliação do Efeito dos Tratamentos..................................................................................... 39 3.6.1 Avaliações Histopatológicas dos Focos Endometriais............. 39 3.7 Análise Estatística............................................................................. 40 4. Resultados............................................................................................... 41 4.1 Análise Qualitativa............................................................................. 42 4.1.1 Figuras..................................................................................... 43 4.2 Análise Quantitativa.......................................................................... 47 4.2.1. Tabelas.................................................................................... 48 5. Discussão................................................................................................ 50 6. Conclusões.............................................................................................. 58 7. Referências............................................................................................. 60 Sumário ANEXO........................................................................................................ 71 Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética em Experimentação Animal.......... 72 Artigo - Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos..... 73 Resumo....................................................................................................... 75 Introdução.................................................................................................... 76 Material e Métodos...................................................................................... 78 Animais.................................................................................................. 78 Cirurgias................................................................................................ 79 Solução Teste........................................................................................ 80 Resultados................................................................................................... 81 Grupo 1 – Animais tratados com solução fisiologia (controle) e sacrificados 20 dias após o tratamento.................................................. 81 Grupo 2 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados após 10 dias do tratamento.................................. 82 Grupo 3 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados após 20 dias do tratamento.................................. 83 Análise Estatística.................................................................................. 84 Discussão.................................................................................................... 86 Conclusão.................................................................................................... 88 Referências.................................................................................................. 89 Artigo - Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits... 93 Abstract………………………………………………………………………...... 95 Introduction………………………………………………………………………. 96 Materials and Methods…………………………………………………………. 98 Animals………………………………………………………………………. 98 Surgeries…………………………………………………………………….. 99 Test Solution………………………………………………………………… 100 Results………………………………………………………………………….... 101 Group 1 – Animals treated with physiological solution (control) and sacrificed 20 days after treatment…………………………………………. 101 Group 2 – Animals treated with solution of acetylsalicylic acid (20%) and sacrificed 10 days after treatment……………………………………. 102 Sumário Group 3 – Animals treated with solution of acetylsalicylic acid (20%) and sacrificed 20 days after treatment……………………………………. 103 Statistical Analysis………………………………………………………….. 104 Discussion……………………………………………………………………….. 105 Conclusion……………………………………………………………………….. 107 References………………………………………………………………………. 108 Lista de Figuras Lista de figuras Lista de Figuras Figura 1 - Fórmula estrutural do ácido acetilsalicílico (adaptado de Schrör, 2009)......................................................................... 30 Figura 2 - Implante de foco endometrial no peritôneo............................ 37 Figura 3 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%...................................................................... 43 Figura 4 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%...................................................................... 44 Figura 5 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 400x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%...................................................................... 44 Figura 6 - Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%............. 45 Figura 7 - Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 400x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%............. 45 Figura 8 - Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 400x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%....................................................... 46 Figura 9 - Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 100x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%....................................................... 46 Artigo - Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos Figura 1 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%...................................................................... 81 Figura 2 - Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%............. 82 Figura 3 - Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 400x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%....................................................... 84 Lista de Figuras Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits Figure 1 - Group 1 (control) – endometriosis developed 10 days after treatment with 0.9% physiological solution. Note peritoneal endometriosis implants with preserved glands and stroma permeated by mild lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate and rare eosinophils. (hematoxylin-eosin; original magnification 100x)……………………………………………... 101 Figure 2 - Group 2 (treatment) – endometriosis developed 20 days after treatment with bicarbonate solution of 20% acetylsalicylic acid. Note areas of epithelium and stroma partially preserved permeated by intense lymphocytic and eosinophilic infiltrate. (hematoxylin-eosin; original magnification 100x)……………………………………………... 102 Figure 3 - Group 3 Slides (treatment) – necrosis 20 days after treatment with bicarbonate solution of 20% acetylsalicylic acid. Note intense inflammatory infiltrate lymphoplasmacytic, glandular and stromal collapse, abundant apoptotic bodies and extensive necrosis. (hematoxylin-eosin; original magnification 400x)……………. 103 Lista de Tabelas Lista de tabelas Lista de Tabelas Tabela 1 - Histórico do ácido acetilsalicílico (adaptado de SCHRÖR, 2009 e Bayer, 2012)................................................................. 28 Tabela 2 - Tamanho dos implantes de endometriose macroscopicamente e porcentagem de tecido endometrial microscopicamente................................................................... 48 Tabela 3 - Tamanho dos implantes após 20 dias de tratamento com injeção local de solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20% (Grupo 3 – Tratamento 20 dias)................ 49 Artigo - Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos Tabela 1 - Tamanho dos implantes de endometriose macroscopicamente, microscopicamente e porcentagem de tecido endometrial.................................................................... 85 Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits Table 1 - Size of endometriotic implants: macroscopically, microscopically and as a percentage of endometrial tissue….. 104 Introdução 21 I – INTRODUÇÃO Introdução 22 1.1 Aspectos Demográficos, Clínicos e Diagnósticos da Endometriose A endometriose é uma doença ginecológica caracterizada pela presença de tecido endometrial além dos limites uterinos (FILIGHEDDU et al., 2010), que acomete mulheres jovens em idade reprodutiva com taxas variáveis de 2 a 7%, podendo chegar a 25% das mulheres entre os 30 e 40 anos de idade (MONTEFORTE et al., 1995). Um número significativo de mulheres é assintomático. Quando sintomáticas, dor pélvica como dismenorréia (dor associada à menstruação) é a manifestação mais frequentemente reportada. Geralmente, as dores tendem a ser mais intensas no período pré-menstrual, melhorando após o término da menstruação. Outros sintomas que podem estar presentes são: dor lombar, disquezia (movimentos intestinais dolorosos e/ou difíceis), dor durante a micção e dispareunia (dor na relação sexual). Além disso, a endometriose geralmente está associada à infertilidade, como resultado das aderências que distorcem a anatomia pélvica e prejudicam a liberação do óvulo e captura do mesmo (AMARAL et al., 2009). De acordo com GIUDICE e KAO (2004) a prevalência de endometriose pode chegar a 60% em mulheres com dores pélvicas ou infertilidade, mais especificadamente a prevalência de endometriose em mulheres na idade reprodutiva é estimada em 10%, em mulheres com dor pélvica crônica pode chegar a até 82%, e naquelas submetidas à investigação de infertilidade, entre 20% e 50% (AMARAL et al., 2009). Introdução 23 O exame diagnóstico tido como padrão-ouro para confirmação da doença é a análise anatomopatológica de peças obtidas através de métodos invasivos como videolaparoscopia e laparotomia (SCHOR et al., 1999; AMARAL et al., 2009). O fato de a endometriose requerer um método invasivo para o diagnóstico dificulta ou até impede a realização de pesquisas controladas objetivando o estudo de novas drogas e terapêuticas (SCHOR et al., 1999). 1.2 Tratamento da Endometriose Quanto à terapêutica, a primeira e melhor opção é a cirúrgica, primeiro pela retirada dos focos de endometriose, segundo por ser aquela que demonstra os mais altos índices de resolução (EVERS, 1995; HOLOCH & LESSEY, 2010; AL-JEFOUT, 2011). Apesar disto, a taxa de recorrência pode chegar a 47% (HART et al., 2008, CATENACCI et al., 2009 & CONTRAN et al., 2007). Ensaios clínicos buscam novas opções terapêuticas no âmbito farmacológico com o intuito de: diminuir o número de procedimentos invasivos, impedir a invasão endometriótica ectopicamente, melhorar a evolução prognostica e reduzir os índices de recidivas. Estudos com drogas sistêmicas como agonistas de GnRH (Gonadotropin-Releasing Hormone) (SAKATA, 1990), danazol (SAKATA, 1990), inibidores da aromatase (YANO, 1996), imunomoduladores (Fator de Necrose Tumoral-alfa recombinante humano) (D`ANTONIO, 2000), antiinflamatórios não esterodiais (celecoxib, indometacina, sulinac e ibuprofeno) (EFSTATHIOU, 2005), inibidores de Introdução 24 aromatase (BILOTAS et al., 2010), rosiglitazone (OLIVARES et al., 2011), resveratrol (BRUNER-TRAN et al., 2011) e bazedoxifene (KULAK et al., 2011) demonstraram sucesso na regressão dos implantes ectópicos. O mesmo foi observado por IGELMO (1999) e SOMIGLIANA (1999), utilizando interferon - 2b e interleucina-12 respectivamente por via tópica intra-peritoneal. Entretanto, o teste terapêutico com novos medicamentos requer uso de modelos experimentais primariamente aos testes clínicos com humanos (Conselho Nacional de Saúde, 1996; BRICK et al., 2008). A escolha do modelo deve ser baseada na maior fidedignidade fisiopatogênica entre o modelo animal e o ser humano. 1.3 Apresentação da Linha de Pesquisa Envolvendo o Ácido Acetilsalicílico Ao considerar a relevância epidemiológica e as dificuldades terapêuticas da endometriose, novas opções de tratamento necessitam ser desenvolvidas e testadas. Para que tais alternativas terapêuticas tenham aplicabilidade espera- se que sejam eficazes, de fácil execução e baixo custo financeiro e apresentem pouco ou nenhum efeito colateral. Neste contexto, pesquisas experimentais desenvolvidas desde a década de 70 e ainda em desenvolvimento no Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina de Botucatu, nas quais foram estudados os efeitos do ácido acetilsalicílico e de seus derivados em diferentes modelos animais, embasaram a aplicação do ácido acetilsalicílico no presente estudo. Introdução 25 A seguir estão apresentados brevemente os principais estudos relacionados com a linha de pesquisa supracitada, que permitirá justificar e entender a ideia do uso do ácido acetilsalicílico. Hossne1*, em 1972 apresentou a possibilidade do uso de “soluções esclerosantes” em cães para o tratamento da hiperplasia prostática benigna. Nesta época preconizava-se o emprego da criocirurgia que tinha como objetivos a necrose inicial com posterior fibrose do orgão, sendo que este efeito poderia ser então reproduzido com o uso destas soluções. Algumas soluções foram testadas inicialmente, porém com resultados insatisfatórios: glicose hipertônica e oleato de monoetanolamina. Em seguida foi testada uma solução intitulada “esclerosante”, cuja composição era o fenol, o ácido acético glacial, glicerina e água bidestilada. A ação desta droga foi então estudada, no Laboratório de Cirurgia Experimental, em tecido prostático de cães e verificou que a mesma acarretava necrose tecidual e posterior fibrose. Destes trabalhos resultaram as primeiras teses desta linha de pesquisa. Frente aos bons resultados obtidos, a solução foi usada no tratamento local do carcinossarcoma de Walker 256 implantado no fígado de ratos, cujos resultados evidenciaram a destruição do tecido neoplásico hepático. Em 1992 (Saad-Hossne) estudaram-se os efeitos da solução sobre o fígado e serosa peritoneal de cobaias normais, onde se observou que no tecido hepático a solução acarretou necrose de coagulação e no peritônio não foram observadas alterações macro e microscópicas. 1 *comunicação pessoal Introdução 26 Em 1997 (Saad-Hossne) foram estudados os efeitos da “solução esclerosante” no tumor ascítico de Ehrlich, in vitro e in vivo, com objetivo principal de investigar se a solução acarretava necrose e destruição das células tumorais, tendo como proposta final o embasamento da sua aplicação terapêutica na ascite neoplásica. Os resultados mostraram que in vitro a solução acarretava morte das células tumorais e que in vivo houve a redução das células tumorais e aumento de células inflamatórias em suspensão no líquido ascítico, sendo esta resposta dose dependente. Com o intuito de identificar o efeito de cada um dos componentes, bem como concentrações menos tóxicas desta solução, foi iniciado estudo de cada um dos compostos de forma isolada. O ácido acético apresentou bons resultados in vitro. Com vistas à redução de riscos de toxicidade e objetivando o estudo de cada um dos componentes e seus derivados, iniciaram-se pesquisas in vivo com o ácido acético isoladamente. Alguns autores já haviam estudado a dose letal e grau de toxicidade em trabalhos experimentais e outros, mostraram os efeitos necrotizantes no fígado em humanos. A partir destes trabalhos, o uso de outra droga menos tóxica foi cogitado, amplamente utilizada em medicina, semelhante ao ácido acético – o ácido acetilsalicílico - um éster do ácido acético que contém o componente salicílico de efeito sabidamente queratolítico. Assim, em 2001 (Saad-Hossne), foram estudados, de forma qualitativa, os efeitos da solução de ácido acetilsalicílico (AAS) e da solução de ácido Introdução 27 acético em fígado de animais sadios e portadores de tumor, usado como modelo in vitro as células em suspensão de carcinoma VX-2 e in vivo células tumorais VX-2 implantadas em fígado de coelhos. Concluiu-se que in vitro, a solução de ácido acetilsalicílico e a solução de ácido acético causam morte (inviabilidade) das células neoplásicas. No estudo in vivo, utilizando fígado de animais sadios, ambas as soluções acarretam após 24 horas do tratamento necrose de coagulação com destruição localizada do tecido hepático; após 14 dias do tratamento as lesões desapareceram ou foram substituídas por processo cicatricial (fibrose). Nos animais com carcinoma VX-2 hepático, ambas as soluções acarretaram após 24 horas necrose do tecido tumoral; decorridos sete dias as áreas destruídas se mostraram livres de tecido tumoral com regeneração do tecido hepático. Em conformidade com esta linha de pesquisa e mediante resultados anteriormente obtidos, foram realizados os trabalhos contidos neste texto, onde se buscou estudar os efeitos da aspirina® em diversos modelos experimentais em animais e em tecido humano (cólon). 1.4. Histórico do Ácido Acetilsalicílico O ácido acetilsalicílico é um fármaco do grupo dos anti-inflamatórios não-esteroides (AINE), utilizado como anti-inflamatório, antipirético, analgésico e também como antiagregante plaquetário. Em estado puro, é um pó cristalino branco ou cristais incolores, pouco solúvel em água, facilmente solúvel no álcool e solúvel no éter. Introdução 28 Uma recente revisão (SCHRÖR, 2009) discutiu detalhadamente toda a história da aspirina® desde a sua criação. Os principais marcos históricos relacionados a descoberta e o uso do ácido acetilsalicílico foram resumidos na tabela 1. Tabela 1- Histórico do ácido acetilsalicílico (adaptado de SCHRÖR, 2009 e Bayer, 2012). Data Evento Séc. V a.C. Hipócrates descreveu que o pó da casca do Salgueiro (Spiraea ulmaria) conhecida também por “chorão” (que contém salicilatos, mas é potencialmente tóxico), aliviava dores e diminuía febre. 1763 Edmund Stone descreveu de forma científica as propriedades antipiréticas da casca do Salgueiro. 1828 O princípio ativo da casca do salgueiro (salicina ou ácido salicílico) foi isolado na sua forma cristalina pelo farmacêutico francês Henri Lerouxe e pelo químico italiano Raffaele Piria. 1859-1874 Kolbe sintetizou o ácido salicílico na sua forma pura pela primeira vez. Heyden, seu aluno, passou a desenvolver em larga escala e inaugurou a primeira fábrica de produção de ácido salicílico em 1874 e, em alguns anos, eram produzidas toneladas da droga. 1876 Stricker divulga o ácido salicílico como analgésico e anti- inflamatório no Charité, em Berlim. 1897 Pesquisando um medicamento para dores reumáticas que fosse melhor tolerado por seu pai, o Dr. Felix Hoffmann, um jovem químico da Bayer, sintetizou o ácido acetilsalicílico, princípio ativo da aspirina®. 1899 Heinrich Dreser, diretor do Departamento de Farmacologia da Bayer, publicou o primeiro estudo sobre o tratamento farmacológico do ácido acetilsalicílico. E nomeou a substância como Aspirina (A – de acetil, Spir – de Spiraea ulmaria e in – sufixo utilizado na época). 1899 Em 1o de fevereiro, o nome Aspirin® é submetido a registro de marca no Escritório Imperial de Patentes de Berlim, sendoconcedido no dia 6 de março do mesmo ano. Introdução 29 Tabela 2- Histórico do ácido acetilsalicílico (adaptado de SCHRÖR, 2009 e Bayer, 2012). (Continuação) 1929 A aspirina® é mecionada por José Ortega y Gasset na publicação “A Revoução das Massas”: “A vida do homem médio é hoje mais fácil, cômoda e segura que a do mais poderoso em outro tempo. Que lhe importa não ser mais rico que os outros, se o mundo o é e lhe proporciona magníficas estradas de rodagem, de ferro, telégrafo, hotéis, segurança física e aspirina®?”. 1950 Aspirina® entra para o Guinness Book of Records como o analgésico mais vendido do mundo. 1950 Craven, um clínico geral de Glendale (Califórnia), estudou 400 pacientes e encontrou que a aspirina® preveniu eventos isquêmicos cardíacos. 1967-1968 O'Brien, Zucker e Weiss publicaram os primeiros estudos mecanicista sobre o efeito antiplaquetário da aspirina®. 1971 John Vane, do Royal College of Surgeons, publicou estudos sobre o mecanismo de ação do ácido acetilsalicílico. 1971 Brian Smith e Willlis descobrem a inibição da síntese de prostaglandinas em plaquetas pelo ácido acetilsalicílico, justificando o efeito anti-plaquetário da substância. 1982 John Vane recebe Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia pela descoberta do mecanismo de ação do ácido acetilsalicílico. 1983 Publicação do primeiro estudo duplo-cego placebo-controlado sobre o uso de ácido acetilsalicílico em homens com síndrome coronariana aguda. A incidência de infarto agudo do miocárdio e mortes dentro de 3 meses foi reduzida em 50%. 1997 100 anos que o Dr. Felix Hoffmann produziu de forma bem sucedida o princípio ativo da aspirina®. 2009 A Bayer completou 110 anos de registro da Aspirina®. Sua fórmula molecular (figura 1) consiste em tratar o ácido salicílico com anidrido acético, em presença de ácido sulfúrico, que atua como catalisador. Técnicas como filtração a vácuo e recristalização podem ser empregadas. Introdução 30 Figura 1- Fórmula estrutural do ácido acetilsalicílico (adaptado de Schrör, 2009). 1.5 Tratamento da Endometriose com Ácido Acetilsalicílico Em conformidade com os mais de 100 anos de uso do ácido acetilsalicílico e com os resultados obtidos na linha de pesquisa descrita previamente, surgiu à ideia de testar os efeitos do ácido acetilsalicílico em focos endometriais induzidos em animais de experimentação. Dessa maneira, recentemente, SIQUEIRA et al. (2011) estudaram os efeitos do ácido acetilsalicílico a 5% em focos de endometriose induzidos em peritônio de coelhas e encontraram que 10 dias após o tratamento a solução de ácido acetilsalicílico foi eficaz na destruição dos focos de endometriose comparando- se com o grupo controle, existindo, no entanto, focos endometriais remanescentes. Julga-se então justificado o emprego do ácido acetilsalicílico embasando adequadamente a presente proposta. Objetivo 31 II – OBJETIVO Objetivo 32 Avaliar os efeitos da solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico (aspirina®) a 20% nos implantes peritoneais de endométrio autólogo de coelhas adultas para embasar método terapêutico para o tratamento da endometriose. O intuito principal do presente estudo experimental é o de responder os seguintes questionamentos: Quais as taxas de destruição (ou eliminação) serão encontradas nos focos de endometriose 10 e 20 dias após injeção da solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico na concentração de 20%? A solução de ácido acetilsalicílico a 20% é capaz de destruir ou eliminar os focos de endometriose após 10 e 20 dias do tratamento? Material e Método 33 III - MATERIAL E MÉTODO Material e Método 34 3.1. Ética O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu Universidade Estadual Paulista (FMB- UNESP), de acordo com o protocolo número 107/05 (CEEA-UNESP Botucatu). Os coelhos foram mantidos de acordo com as diretrizes do Care and Use of Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) e de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). 3.2. Animais Foram utilizados 30 coelhos Nova Zelândia Botucatu, adultos, fêmeas e virgens, com peso aproximado de 3000 g. Estes animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual Paulista (UNESP) Campus de Botucatu. O número de coelhas foi baseado no cálculo do tamanho amostral para validação estatística e de acordo com a orientação do estatístico. As coelhas foram mantidas em gaiolas apropriadas com controle de luz, umidade, temperatura, água e alimentação. Foram submetidas a 12 horas de exposição à luz; temperatura mantida de 20ºC a 25ºC; umidade relativa variável entre 40% a 60%. Alimentação com ração industrializada e água ad libitum. Material e Método 35 O peso das coelhas foi aferido anteriormente à realização de cada laparotomia, com a finalidade de termos base de comparação entre cada coelha e certificação de que a manutenção diária destas foi a mais semelhante possível. Logo, com a equivalência no ganho de peso, poderemos inferir influências ambientais mínimas nos resultados a serem encontrados. 3.3 Protocolo e Grupos Experimentais Com o objetivo de avaliar os efeitos da solução nos focos de endometriose peritoneal em coelhas, os animais foram sacrificados 10 e 20 dias após o término do tratamento. O tempo foi escolhido com base no estudo de SIQUEIRA et al., 2011, em que a análise histopatológica revelou destruição parcial dos focos de endometriose 10 dias após a aplicação intralesional de ácido acetilsalicílico a 5%. E o novo período, 20 dias, para observar a evolução do tratamento. Estes animais foram divididos em 3 grupos experimentais: Grupo 1 – 10 animais Neste grupo os animais foram tratados com solução fisiológica 0,9% (controle) e sacrificados 20 dias após o tratamento da endometriose. Grupo 2 – 10 animais Neste grupo os animais foram tratados com a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados 10 dias após o tratamento da endometriose. Material e Método 36 Grupo 3 – 10 animais Neste grupo os animais foram tratados com a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados 20 dias após o tratamento da endometriose. 3.4 Técnica Cirúrgica e Anestésica Foram realizadas 3 laparotomias em cada coelha. A primeira correspondente à cirurgia de indução da endometriose. A subsequente realizada 20 dias após a primeira cirurgia, com a finalidade de visualizar os focos de endometriose e aplicar a droga em estudo. A última laparotomia foi aquela seguida de sacrifício animal, avaliação macroscópica e preparo de material para avaliação histopatológica. 3.4.1 Indução de Lesões Endometrióticas Os animais foram anestesiados por via endovenosa com solução de quetamina 10% (1ml/kg) e xilasina 2% (0,5ml/kg). Realizou-se a tricotomia da parede abdominal com uso de lâminas e, a seguir, aplicou-se as técnicas de anti-sepsia. Todos os procedimentos foram realizados com luvas de látex estéreis, lavadas previamente com soro fisiológico a 0,9% (SIQUEIRA et al., 2011). Após a anestesia, os animais foram submetidos à laparotomia conforme a técnica descrita por SILVA et al. (2004). Iniciando-se com uma incisão longitudinal mediana da parede abdominal, de aproximadamente 2cm. Através Material e Método 37 desta obteve-se acesso à cavidade pélvica, onde foi ressecado cerca de 4cm do corno uterino. O fragmento uterino foi imerso em solução fisiológica 0,9% a 4ºC durante 4 minutos. Após este tempo, procedeu-se à incisão longitudinal do corno uterino ressecado, delimitando um fragmento de 5,0 X 5,0 mm seguida da separação do endométrio das outras camadas uterinas, foram feitos dois fragmentos por coelha. Os endométrios foram então suturados no peritôneo, um do lado direito e outro do lado esquerdo (para obter número maior de amostras), com fio Vicryl 6.0 (figura 2), próximos à linha Alba, na localidade onde a maioria dos vasos foi visualizada. Após o implante os animais foram mantidos em cativeiro durante 20 dias, período em que a viabilidade e tamanho do enxerto são máximos: 100% e 2,5cm, segundo estudo realizado por SILVA et al. (2004) e pelo piloto feito antes do início do trabalho. Figura 2 – Implante de foco endometrial no peritôneo. Material e Método 38 3.4.2 Aferição Dimensional e Tratamento das Lesões Ao 30º dia pós-operatório, as coelhas foram submetidas a uma segunda laparotomia para visualização das lesões e estabelecimento da área de endometriose encontrada (largura e comprimento) através do uso de um paquímetro. 3.4.3 Tratamento e Sacrifício O momento da realização do sacrifício foi 10 e 20 dias da aplicação do medicamento, conforme o grupo experimental. O sacrifício foi realizado na dose de 200mg/kg de pentobarbital, por via intravenosa. 3.5 Solução Teste O ácido acetilsalicílico foi fornecido por um laboratório de manipulação (Opção Fênix LTDA., São Paulo, Brasil). Para a obtenção da solução a 20% foi feita diluição de 1000mg de ácido acetilsalicílico em 5ml de bicarbonato de sódio a 10%, formando a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20%. A solução foi preparada 10 minutos antes do seu uso. Material e Método 39 3.6 Forma de Análise dos Resultados - Avaliação do Efeito dos Tratamentos 3.6.1 Avaliações Histopatológicas dos Focos Endometriais Após a ressecção cirúrgica cuidadosa de todos os 60 implantes de endometriose, todas as peças cirúrgicas foram mantidas em formol a 10% tamponado durante 2 dias. A seguir, as peças foram processadas no processador automático de tecidos (Leica TP 1020), emblocadas em parafina (Leica EG 1160), cortadas no micrótomo (Leica RM 2145), em cortes 4μ, aquecidas em estufa (Modelo Fanem – 02EB) a 60oC durante 12 horas e coradas no colorador automático (Leica Auto-Stainer XL) para hematoxilina- eosina (HE) por meio de montagem Permacet (Fisher) das lâminas em processador (Leica CU500). Para cada animal foi montada uma lâmina com dois focos endometriais cada, perfazendo um total de 30 lâminas. As lâminas obtidas foram examinadas ao microscópio óptico para identificação e caracterização das lesões e posteriormente submetidas à análise morfométrica por intermédio de sistema analisador de imagens Kontron Elektronic GMBH (Kontron AG, Eching/München, Germany) e programa Kontron KS-300 v2.0(Kontron AG, Eching/München, Germany). Foram analisados qualitativamente e quantitativamente o processo inflamatório, a hemorragia e a apoptose e também mensurada a presença de endometriose. A análise de todas as lâminas foi efetuada aleatoriamente por um médico patologista experiente sem o conhecimento prévio quanto ao protocolo correspondente ao foco endometrial em estudo. Material e Método 40 O tecido endometrial remanescente foi avaliado qualitativamente em campo claro e quantitativamente utilizando o software de imagem Kontron KS300 V2.0 (Kontron AG, Eching/München, Germany). Este programa de computador pode medir várias tonalidades dentro do espectro de cores azul, vermelho e verde. A cor de interesse em lâminas histológicas coradas com HE foi o vermelho (tecido endometrial). Este software permite ao operador delinear uma região de interesse fazendo um esboço à mão livre dessa área usando o mouse do computador. O programa, então, apresenta a cor 1 como uma área percentual que contém vermelho. A área mais representativa de cada foco endometrial foi escolhida para todas as 30 lâminas avaliadas. Esta região de interesse foi analisada para a contagem do tecido endometrial remanescente (em porcentagem). 3.7 Análise Estatística Na análise descritiva, os dados foram resumidos em médias e desvios padrão. Nas comparações entre grupos foi utilizado o teste T Student. Os programas estatísticos utilizados foram o SPSS versão 11.0 e o SAS, versão 8.01. O nível de significância adotado foi 0,05. Resultados 41 IV – RESULTADOS Resultados 42 4.1 Análise Qualitativa Observou-se ganho de peso em todas as 30 coelhas avaliadas, certificando que a manutenção diária destas foi a mais semelhante possível. Grupo 1 – Animais tratados com solução fisiológica 0,9% (controle) e sacrificados 20 dias após o tratamento. À macroscopia todos os implantes formavam estruturas císticas, sendo metade delas hemorrágica; este aspecto foi confirmado à microscopia que evidenciou formações císticas em todas as lâminas, com revestimento epitelial colunar em agrupamento glandular associado a um estroma de células fusiformes: cisto de tecido endometrial. Em 8 das 10 lâminas, o endométrio estava em fase proliferativa – foram vistas regiões com inúmeras mitoses e uma quantidade pequena de apoptoses celulares o que demonstrou que o tecido endometrial teve seu crescimento livre neste período. Grupo 2 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico a 20% (tratamento 1) e sacrificados após 10 dias do tratamento. Todos os implantes observados no momento da re-operação tinham aspecto hemorrágico e se encontravam aderidos ao conteúdo da cavidade endometrial. À microscopia mostrou pequenos focos de cisto de tecido endometrial em todas as lâminas, sendo um aspecto inferior quando comparado ao grupo controle. Acompanhado de hemorragia, fibrose, processo inflamatório e apoptose, sem exceções. Resultados 43 Grupo 3 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico a 20% (grupo 2) e sacrificados após 20 dias do tratamento. Macroscopicamente os implantes deste grupo foram de difícil visualização, apresentando aderência ao conteúdo da cavidade endometrial. Na microscopia não foi possível encontrar formação cística de endometriose assim como evidências de processo inflamatório em todas as lâminas, sendo observadas apenas grandes áreas de necrose e apoptose. 4.1.1 Figuras Grupo 1 – Animais tratados com solução fisiológica 0,9% (controle) e sacrificados 20 dias após o tratamento. Figura 3 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%. O corte revela implantes endometrióticos peritoniais com glândulas e estroma preservados permeados por discreto infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário e raros eosinófilos. Resultados 44 Figura 4 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%. O corte revela implantes endometrióticos peritoniais com glândulas e estroma preservados permeados por discreto infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário e raros eosinófilos. Notam-se macrófagos com hemossiderina na luz. Figura 5 - Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 400x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%. Detalhe revelando raros corpos apoptóticos. Resultados 45 Grupo 2 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico a 20% (tratamento 1) e sacrificados após 10 dias do tratamento. Figura 6 - Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Revela áreas de epitélio e estroma parcialmente preservados permeados por intenso infiltrado inflamatório linfoplasmocitário e eosinofílico. Figura 7 - Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 400x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Nota-se aumento do número de corpos apoptóticos, revelando sinais de necrose celular. Resultados 46 Grupo 3 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico a 20% (grupo 2) e sacrificados após 20 dias do tratamento. Figura 8- Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 400x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Revela intenso infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário, colapso glandular e estromal, corpos apoptóticos abundantes e extensa necrose. Figura 9 - Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 100x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Áreas de fibrose cicatricial, revelando proliferação de fibroblastos, fibras de colágeno e infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear. Resultados 47 4.2. Análise Quantitativa A análise quantitativa revelou que o grupo 2 (tratamento 10 dias) tinha menor área macroscópica e menos tecido endometrial remanescente (p<0,0001 para todas as comparações), quando comparado ao grupo 1 (controle). Como não foram evidenciadas lesões endometriais nos animais do grupo 3 (tratamento 20 dias), não foram realizadas mensurações macroscópicas e a análise quantitativa histopatológica demonstrou ausência completa de tecido endometrial em todas as amostras analisadas, revelando apenas necrose tecidual. Por não existir endometriose remanescente foi aconselhado pelo estatístico a exclusão do grupo 3 no teste estatístico. Resultados 48 4.2.1 Tabelas As dimensões encontradas no grupo 1 (controle), grupo 2 (tratamento 10 dias) encontram-se na tabela 2 e o grupo 3 (tratamento 20 dias) está representado na tabela 3. Tabela 2 - Tamanho dos implantes de endometriose macroscopicamente e porcentagem de tecido endometrial microscopicamente. Grupo Controle Grupo Tratamento (10 dias) Macroscopia Microscopia Macroscopia Microscopia Dimensões (mm) Área (mm2) Tecido endometrial (%) Dimensões (mm) Área (mm2) Tecido endometrial (%) 130x59 7670 91 58x45 2610 7 97x73 7081 81 82x50 4100 10 125x72 9000 95 68x45 3060 3 100x76 7600 86 82x60 4920 5 102x78 7956 94 91x56 5096 9 84x65 5460 71 59x47 2773 6 75x62 4650 73 60x57 3420 7 88x77 6776 77 71x43 3053 3 96x69 6624 79 72x49 3528 4 98x80 7840 86 70x47 3290 7 M±DP 7065±1268 83±8 M±DP 3585±857 6±2 M = Média; DP = Desvio padrão; p<0,0001 Teste T Student Resultados 49 Tabela 3 - Tamanho dos implantes após 20 dias de tratamento com injeção local de solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20% (Grupo 3 – Tratamento 20 dias). Grupo Tratamento (20 dias) Macroscopia Microscopia Dimensões (mm) Área (mm2) Tecido endometrial (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 Discussão 50 V – DISCUSSÃO Discussão 51 A endometriose é um assunto que vem sendo discutido e estudado há muitos anos. Teorias como a da indução, que propõe que um fator bioquímico endógeno induz a transformação de células peritoneais indiferenciadas em tecido endometrial (LEVANDER et al., 1955 e MERRILL, 1966) e como a da metaplasia celômica, onde ocorre a substituição de uma célula adulta por outro tipo celular (RUSSO et al., 2000 e DINULESCU et al., 2005) são teorias pouco aceitas. Entretanto, Sampson em 1927, justifica o surgimento da endometriose pela presença de menstruação retrógrada, esta teoria baseia-se na suposição de que a endometriose é causada pela semeadura ou implantação de células endometriais por regurgitação transtubária durante a menstruação, existindo dados clínicos e experimentais sólidos apoiando essa hipótese (SAMPSON, 1927, HANEY et al., 1987 e RAMEY & ARCHER, 1993). Os únicos modelos animais que podem desenvolver espontaneamente a endometriose são os primatas. No entanto, o modelo com animais desta ordem torna-se limitado pelo alto custo de manutenção e pelas inúmeras reservas no âmbito ético (HIRATA et al., 2005). Modelos experimentais com ratos, apesar de não apresentarem evolução espontânea da lesão, são modelos amplamente utilizados desde sua implementação pioneira por GOLAN et al. e por JONES, ambos em 1984, seguidos por VERNON & WILSON (1985), RAJKUMAR et al. (1990) e SHARPE et al. (1991) em camundongos (CUMMINGS & METCALF, 1995, SOMIGLIANA et al., 1999 e ROSSI et al., 2000), em hamsters (STEINLEITNER et al., 1991) e coelhos (SCHENKEN & ASCH, 1980; DUNSELMAN et al., 1989; HOMM et al., 1989). Desses modelos não-primatas, principalmente ratos e Discussão 52 camundongos, têm sido desenvolvidos nos últimos anos (MIELI et al., 2002, NETO et al., 2007 e 2011, BATISTA et al., 2009). O modelo consiste em ressecar cirurgicamente uma porção do útero, fragmentar em pedaços pequenos, e reintroduzir, principalmente por sutura, na cavidade peritoneal (GRUMMER, 2006). De acordo com estudo (SILVA et al., 2004) que avaliou a evolução de lesões de endometriose em coelhas, todos os focos endometriais foram visualizados à laparoscopia 4 (quatro) semanas após o implante peritoneal. A aplicação destes modelos é apropriada para investigação dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento das lesões peritoneais. Também é adequada para a avaliação dos efeitos de diversas medicações tais como imunomoduladores e antiinflamatórios (GRÜMMER, 2006), foco deste estudo. Experimentos com ratos como os de REZENDE (1997), SCHOR (1999), NETO (2007), AMARAL (2009) e KONDO (2011), são bem acessíveis, entretanto requerem um manejo cirúrgico mais delicado, devido à implementação e execução do estudo ser dependente da fase hormonal do animal (GRÜMMER, 2006) e possuírem maior susceptibilidade ao erro na aferição do tamanho das lesões. Estes motivos levaram à escolha do modelo experimental de autotransplante endometrial ectópico em coelhas. A seleção da via intraperitoneal para estudo torna-se interessante, pois, além da constatada ausência de malefícios à integridade do peritônio, torna-se possível minimizar a ocorrência de efeitos sistêmicos associados ao uso do medicamento (KETTEL & HUMMEL, 1997). Discussão 53 Com base em estudos anteriores (SAAD-HOSSNE et al., 2004(b), SAAD-HOSSNE et al., 2007 e SIQUEIRA et al., 2011) que utilizaram diferentes períodos de avaliação do tratamento após a aplicação do ácido acetilsalicílico (24, 48 e 72 horas e 7, 10 e 14 dias) em diferentes modelos experimentais, decidimos estimar os efeitos do ácido acetilsalicílico em dois momentos, 10 e 20 dias após a aplicação da droga em questão. Em estudo prévio SIQUEIRA et al. (2011) demonstraram que 10 dias após a injeção de ácido acetilsalicílico a 5% houve apenas destruição parcial dos focos de endometriose. Dessa maneira, com o objetivo de aumentar a eficácia terapêutica, no presente estudo, avaliamos os efeitos do ácido acetilsalicílico em uma concentração maior (20%) em um mesmo período (10 dias) e em um período maior (20 dias). A quantidade de solução de ácido acetilsalicílico utilizada em cada animal neste estudo também foi baseada em estudos anteriores (SAAD-HOSSNE et al., 2004(b) e 2007). Observamos que após 10 dias de tratamento os implantes obtiveram os resultados semelhantes ao trabalho de SIQUEIRA et al. (2011), com 10 dias de tratamento e solução de 5% de ácido acetilsalicílico, quando comparado ao grupo controle. Entretanto, no grupo 3, com 20 dias de tratamento com solução de ácido acetilsalicílico a 20%, as áreas endometrióticas foram extintas, restando apenas necrose em seu lugar. Estudos prévios com diferentes tratamentos (LOBO et al., 2008, OLIVARES et al., 2011, DELGADO-ROSAS et al., 2011 e KULAK et al, 2011) também evidenciaram destruição dos focos de endometriose. MIELI et al. (2002) utilizaram laser de vapor de cobre para o tratamento da endometriose Discussão 54 induzida em coelhas e encontraram em 31% dos casos, 100% de destruição dos focos de endometriose, e nas coelhas tratadas ainda com endometriose remanescente, houve diminuição em 69,85% na quantidade de glândulas. NETO et al. (2007), utilizaram a sinvastatina para avaliar alterações macroscópicas e histológicas de endometriose experimental em ratas e demonstraram que a sinvastatina impediu o crescimento dos focos de endometriose. Da mesma forma BATISTA et al. (2009) induziram a endometriose em ratas e as tratou com 0,8mg/kg/dia de dexametasona. O tratamento reduziu a inflamação nos implantes endometriais, o teor de colágeno no estroma e significativamente a área ocupada pelas glândulas, concluindo que a dexametasona, na dosagem utilizada, reduz os efeitos estrogênicos em implantes endometriais em ratas. NETO et al. (2011) avaliaram as alterações macroscópicas e histológicas em endometriose experimental em ratas, após tratamento com Uncaria tomentosa (cat's claw) e mostraram que o tratamento com Uncaria tomentosa provocou uma redução acentuada no crescimento ao longo do tempo (p=0,009), quando comparado com o controle. Embora nestes estudos (SIQUEIRA et al., 2011, MIELI et al., 2002, BATISTA et al., 2009 e NETO et al., 2011) tenha ocorrido destruição parcial dos focos de endometriose, nenhum deles foi totalmente eficaz, ao melhor do conhecimento da autora este é o primeiro estudo que utilizando ácido acetilsalicílico atingiu a destruição de 100% dos focos de endometriose implantados em coelhas. Discussão 55 Uma vez que uma série de estudos tem relatado que o aumento da proliferação celular e diminuição da apoptose de células endometriais facilitam sua sobrevivência e implantação ectópica destas células em mulheres com endometriose (KHAN et al., 2009), drogas que induzam a apoptose são relevantes tanto para a prevenção e quanto para o tratamento da endometriose. Neste contexto, neste estudo analisou-se também a indução de apoptose em todas as amostras, para averiguar se a droga utilizada induz a morte celular programada nos focos de endometriose. No grupo 1 (controle) foram encontradas poucas células apoptótica nas 10 lâminas, enquanto no grupo 2 (10 dias tratamento) foi possível observar em todas as lâminas um grande número de células neste estágio e no grupo 3 (20 dias tratamento) foram encontradas também uma grande quantidade de células apoptóticas sem rastro de endometriose em todas as lâminas, restando apenas necrose tecidual, demonstrando que o ácido acetilsalicílico induz a apoptose de forma progressiva com o passar do tempo. SIQUEIRA et al. (2011) em seu estudo com ácido acetilsalicílico a 5% e OLIVARES et al. (2011) com celecoxib e rosiglitazone (combinado ou separado) observaram histologicamente a presença de apoptose nos focos de endometriose. Pode-se observar então no Grupo 3 uma melhor resposta para o tratamento, onde encontramos necrose e apoptose em grande número. De acordo com ROTHWELL et al., 2011, a ingestão regular de anti-inflamatórios não-esteróides, inibidores da ciclooxigenase (COX), como a aspirina, pode induzir a apoptose em diversas linhagens de células cancerigenas (DIKSHIT et Discussão 56 al., 2006) e em focos de endometriose (OLIVARES et al., 2011). No entanto, os mecanismos moleculares através dos quais a apoptose é induzida, não são bem compreendidos (DIKSHIT et al., 2006), existindo vários mecanismos propostos, incluindo inibição da função do proteassoma, a ativação da via de ceramida, ativação de caspases, a super-estimulação de várias proteínas pro- apoptóticas e estresse oxidativo (DIKSHIT et al., 2006 e JANA, 2008). Em estudos na área da oncologia, a super-expressão da COX-2 é comumente encontrada em muitos cânceres (IWATA et al., 2007 e GROOT et al., 2007) existindo uma relação causal com a supressão do sistema imune do hospedeiro, com uma maior resistência à apoptose e a estimulação do crescimento de células cancerígenas e invasão (IWATA et al., 2007 e GROOT et al., 2007). Portanto, a inibição da COX-2 torna-se um relevante alvo terapêutico (IWATA et al., 2007 e GROOT et al., 2007). De acordo com o relatado pode-se assumir que o uso da aspirina nos focos de endometriose pode ter estimulado a apoptose através da inibição da COX-1 e 2. Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se observar grande indução de apoptose, levando a 100% de destruição de todos os focos de endometriose, mostrando que o ácido acetilsalicílico quando comparado aos outros trabalhos supracitados obteve resultados promissores. Visando a aplicabilidade clínica dos resultados apresentados aqui, novos estudos são necessários para investigar os efeitos do ácido acetilsalicílico aplicado através do acesso laparoscópico, que vem sendo descrita como o Discussão 57 padrão para o diagnóstico e tratamento da endometriose (SCHOR et al., 1999; AMARAL et al., 2009) e também para avaliar os efeitos do ácido acetilsalicílico em células endometriais humanas in vitro e posteriormente in vivo. Alem disto o estudo quantitaivo da endometriose pela coloração com caspase, pode confirmar os dados qualitativos ora observados. Conclusões 58 VI – CONCLUSÕES Conclusões 59 Com base no método empregado e no modelo experimental utilizado, com vista ao objetivo estabelecido, chegamos às seguintes conclusões: No grupo avaliado 10 dias após o tratamento a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20% causou hemorragia, fibrose, processo inflamatório e apoptose dos focos endometriais. Após 20 dias, houve eliminação completa do tecido endometrial, existindo infiltrados de processo inflamatórios, apoptose e grandes áreas de necrose. Conclui-se então que a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20% em 10 dias causa destruição parcial dos focos de endometriose. E no tempo de 20 dias de tratamento a destruição foi total, ou seja, a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico é eficaz no tratamento da endometriose peritoneal experimental em coelhas autólogas, no tempo de 20 dias. Referências 60 VI – REFERÊNCIAS Referências 61 1. Amaral VF, Dal Lago EA, Kondo W, Souza LC, Francisco JC. Development of an experimental model of endometriosis in rats. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões. 2009; 36: 250-5. 2. Anazetti MC, Melo PS. Morte celular por apoptose: uma visão bioquímica e molecular. Metrocamp pesquisa. 2007; 1: 37-58. 3. Batista APC, Medeiros PL, Teixeira AAC, Teixeira VW. 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Anexo 71 Anexo Anexo 72 Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética em Experimentação Animal Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 73 Artigo - Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 74 Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos Adriana Beatriz Barretto1, Rafael Denadai1, Ednelson Henrique Bianchi2, Solange Peron Bueno Angela3 e Rogério Saad-Hossne1 1 – Departamento de Cirurgia e Ortopedia, Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. 2 – Departamento de Cirurgia Experimental, Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. 3 – Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brasil. Conflitos de interesse: Nenhum Auxílio financeiro: CAPES e FAPESP-Brasil Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 75 RESUMO O objetivo do presente estudo foi estimar os efeitos da injeção local da solução de ácido acetilsalicílico a 20% em implantes de endométrio autólogo intraperitoneal. Foram utilizadas 30 coelhas adultas dividas em 3 grupos de 10 coelhas, com indução da endometriose peritoneal. Após 20 dias da indução da endometriose as coelhas foram randomizadas e de acordo com os grupos receberam os determinados tratamentos: solução fisiológica 0,9% por 20 dias (grupo 1, controle), solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20% durante 10 dias (grupo 2, tratamento) e solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20% durante 20 dias (grupo 3, tratamento). Os focos de endometriose foram removidos e preparados em lâminas para análise histológica. Foi utilizado um programa de computador para análise das lâminas e aferição da área total de endometriose remanescente. A área do grupo 2 (tratamento 10 dias) foi significativamente menor que a área de endometriose no grupo 1 (controle) e no grupo 3 (tratamento 20 dias), a área não foi aferida por não ter restado endometriose remanescente em nenhuma das 10 lâminas. O tratamento com ácido acetilsalicílico em um período de 20 dias destrói toda a área de endometriose. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 76 INTRODUÇÃO A endometriose é uma doença ginecológica caracterizada pela presença de tecido endometrial além dos limites uterinos [1], que acomete mulheres jovens em idade reprodutiva com taxas variáveis de 2 a 7%, podendo chegar a 25% das mulheres entre os 30 e 40 anos de idade [2]. Um número significativo de mulheres é assintomática, e quando sintomáticas envolvem dor pélvica como dismenorréia, dor lombar, disquezia, dor durante a micção e dispareunia. Em alguns casos pode causar a infertilidade [3]. O exame diagnóstico tido como padrão-ouro para confirmação da doença é a análise anatomopatológica de peças obtidas através de métodos invasivos, como videolaparoscopia e laparotomia [3-4]. A primeira e melhor opção atualmente é a cirúrgica, entretanto, a taxa de recorrência pode chegar a 47% [5-7], seguida pelo uso de drogas que podem minimizar as dores, mas que não eliminam a doença. Baseando-se no mecanismo de desenvolvimento mais difundido da doença, o de Sampson, que justifica o surgimento da endometriose pela presença de menstruação retrógrada [8], os únicos modelos animais que podem desenvolvê-la espontaneamente são os primatas. No entanto, o modelo com animais desta ordem torna-se limitado pelo alto custo de manutenção e pelas inúmeras reservas no âmbito ético [9]. Modelos experimentais com ratos, apesar de não apresentarem evolução espontânea da lesão, são modelos amplamente utilizados desde sua implementação pioneira por Golan e Jones, ambos em 1984 [10-11]. O modelo consiste em ressecar cirurgicamente uma porção do útero, cortar em pedaços pequenos, e reintroduzir, principalmente por sutura, na cavidade peritoneal Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 77 [12]. De acordo com estudo [13] que avaliou a evolução de lesões de endometriose em coelhas, todos os focos endometriais foram visualizados à laparoscopia 4 (quatro) semanas após o implante peritoneal. No presente estudo utilizou-se o ácido acetilsalicílico (aspirina) devido ao seu uso generalizado e aos estudos experimentais anteriores que temos reunidos sobre o assunto. Nestes estudos, os autores demonstram os efeitos do ácido acetilsalicílico sobre tecidos normais (fígado e mucosa do cólon de coelhos); realizaram a injeção de ácido acetilsalicílico (2,5% e 5,0%) no lobo esquerdo do fígado de coelhos e não encontraram alterações na evolução clínica, peso e nas dosagens bioquímicas, quando comparados ao controle (solução salina), aplicaram ácido acetilsalicílico a 5% na forma de enema em mucosa colorretal de coelhos e também não encontraram nenhuma alteração na mucosa do cólon, quando comparado com o controle (solução salina). Em outros dois estudos, os autores observaram efeitos citolíticos e anti-tumorais (in vitro e in vivo) do ácido acetilsalicílico. No primeiro, estudaram células tumorais VX-2 incubadas com ácido acetilsalicílico (2,5% e 5%) e encontraram que a viabilidade das células tumorais diminui progressivamente e que ao final de 30 minutos todas as células tumorais eram inviáveis [14]. No outro estudo, avaliaram os efeitos do ácido acetilsalicílico a 5% em tumor VX-2 implantado em fígado de coelhos e encontraram uma destruição do tumor hepático experimental, sem alterações na evolução clínica, peso e dosagens bioquímicas [15]. Seguindo esta linha de pesquisa, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da injeção local de ácido acetilsalicílico em implantes peritoneais de endometriose, num modelo experimental em coelhas. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 78 Materiais e Métodos O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu Universidade Estadual Paulista (FMB- UNESP), de acordo com o protocolo número 107/05. Os coelhos foram mantidos de acordo com as diretrizes do Care and Use of Laboratory Animals (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) e de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Animais Quarenta coelhos adultos, fêmeas, virgens, pesando aproximadamente 2500g foram mantidos em gaiolas apropriadas em condições controladas condições de luz, umidade, temperatura, água e alimentos. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados com os animais sob anestesia geral através de administração intravenosa de 30 mg de sódio / kg de 3% pentobarbital. Os animais foram anestesiados por via endovenosa com solução de quetamina 10% (1ml/kg) e xilasina 2% (0,5ml/kg). Realizou-se a tricotomia da parede abdominal com uso de lâminas e, a seguir, aplicou-se as técnicas de anti-sepsia. Todos os procedimentos foram realizados com luvas de látex estéreis, lavadas previamente com soro fisiológico a 0,9% [16]. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 79 Cirurgias Após a anestesia, os animais foram submetidos à laparotomia conforme a técnica descrita por Silva [13]. Iniciando-se com uma incisão longitudinal mediana da parede abdominal, de aproximadamente 2cm. Através desta obteve-se acesso à cavidade pélvica, onde foi ressecado cerca de 4cm do corno uterino. O fragmento uterino foi imerso em solução fisiológica 0,9% a 4ºC durante 4 minutos. Após este tempo, procedeu-se à incisão longitudinal do corno uterino ressecado, delimitando um fragmento de 5,0 X 5,0mm seguida da separação do endométrio das outras camadas uterinas, foram feitos dois fragmentos por coelhas. Os endométrios foram então suturados, um do lado direito do peritôneo e o outro do lado esquerdo, com fio Vicryl 6.0, próximo à linha Alba, na localidade onde a maioria dos vasos foi visualizada, com a face endometrial livre voltada para a luz da cavidade abdominal. Após o implante os animais foram mantidos em cativeiro durante 20 dias, período em que a viabilidade e tamanho do enxerto são máximas: 100% e 2,5 cm, segundo estudo realizado por Silva [13] e pelo piloto feito antes do início do trabalho. Ao 30º dia pós-operatório, as coelhas foram submetidas a uma segunda laparotomia para visualização das lesões e estabelecimento da área de Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 80 endometriose encontrada (largura e comprimento) através do uso de um paquímetro e submetida a analise estatística (Teste T Student). O momento da realização do sacrifício foi 10 e 20 dias da aplicação do medicamento, conforme o grupo experimental. O sacrifício foi realizado na dose de 200mg/kg de pentobarbital, por via intravenosa. Solução Teste A solução teste para a obtenção da solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20% foi feita através da diluição de 1000mg de ácido acetilsalicílico em 5ml de bicarbonato de sódio a 10%, formando a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20%. A solução foi preparada 10 minutos antes do seu uso. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 81 Resultados Grupo 1 – Animais tratados com solução fisiologia (controle) e sacrificados 20 dias após o tratamento À macroscopia todos os implantes formavam estruturas císticas, sendo metade delas hemorrágica; este aspecto foi confirmado à microscopia que evidenciou formações císticas em todas as lâminas, com revestimento epitelial colunar em agrupamento glandular associado a um estroma de células fusiformes: cisto de tecido endometrial. Em 8 das 10 lâminas, o endométrio estava em fase proliferativa – foram vistas regiões com inúmeras mitoses e uma quantidade pequena de apoptoses celulares o que demonstrou que o tecido endometrial teve seu crescimento livre neste período. Figura 2: Lâmina Grupo 1 (controle) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 10 dias de tratamento com solução fisiológica 0,9%. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 82 O corte revela implantes endometrióticos peritoniais com glândulas e estroma preservados permeados por discreto infiltrado inflamatório linfo- plasmocitário e raros eosinófilos. Grupo 2 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados após 10 dias do tratamento Todos os implantes observados no momento da re-operação tinham aspecto hemorrágico e se encontravam aderidos ao conteúdo da cavidade endometrial, sendo de difícil identificação visual qual aspecto macroscópico possuía o implante. À microscopia mostrou pequenos focos de cisto de tecido endometrial em todas as lâminas, sendo um aspecto inferior quando comparado ao grupo controle. Acompanhado de hemorragia, fibrose, processo inflamatório e apoptose, sem exceções. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 83 Figura 3: Lâmina Grupo 2 (tratamento) / aumento 100x – endometriose desenvolvida com 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Revela áreas de epitélio e estroma parcialmente preservados permeados por intenso infiltrado inflamatório linfoplasmocitário e eosinofílico. Grupo 3 – Animais tratados com solução de ácido acetilsalicílico (20%) e sacrificados após 20 dias do tratamento Macroscopicamente os implantes deste grupo também foram de difícil visualização, apresentando aderência ao conteúdo da cavidade endometrial. Na microscopia não foi possível encontrar formação cística de endometriose assim como evidências de processo inflamatório em todas as lâminas, sendo observado apenas grandes áreas de necrose e apoptose. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 84 Figura 4: Lâmina Grupo 3 (tratamento) / aumento 400x – necrose após 20 dias de tratamento com solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico 20%. Revela intenso infiltrado inflamatório linfo-plasmocitário, colapso glandular e estromal, corpos apoptóticos abundantes e extensa necrose. Análise Estatística As áreas dos grupos 1 (controle) e 2 (tratamento 10 dias) foram aferidas em mm e a área com tecido endometrial em porcentagem. Foi feita análise estatística através do Teste T Student e encontrada, tanto para a área quanto para o tecido endometrial, uma diferença entre os grupos estatisticamente significante, mostrando uma grande diminuição do foco de endometriose (tabela 1). Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 85 Tabela 1 - Tamanho dos implantes de endometriose macroscopicamente, microscopicamente e porcentagem de tecido endometrial. Grupo Controle Grupo Tratamento (10 dias) Macroscopia Microscopia Macroscopia Microscopia Dimensões (mm) Área (mm2) Tecido endometrial (%) Dimensões (mm) Área (mm2) Tecido endometrial (%) 130x59 7670 91 58x45 2610 7 97x73 7081 81 82x50 4100 10 125x72 9000 95 68x45 3060 3 100x76 7600 86 82x60 4920 5 102x78 7956 94 91x56 5096 9 84x65 5460 71 59x47 2773 6 75x62 4650 73 60x57 3420 7 88x77 6776 77 71x43 3053 3 96x69 6624 79 72x49 3528 4 98x80 7840 86 70x47 3290 7 M±DP 7065± 1268 83±8 Média±DP 3585± 857 6±2 M = Média; DP = Desvio padrão p<0,0001 Teste T Student No grupo 3 (tratamento 20 dias), não houve aferição do tamanho das lesões por não ter sido encontrada endometriose remanescente em nenhuma das 10 lâminas analisadas, sendo excluída do teste estatístico. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 86 Discussão Com base em estudos anteriores [15,17] que utilizaram diferentes períodos de avaliação (24, 48 e 72 horas e 7, 10 e 14 dias, respectivamente) após a intervenção terapêutica com ácido acetilsalicílico, sendo um trabalho precursor a este com 24 horas e 10 dias respectivamente e com concentração da droga de 5% [16], decidimos estimar os efeitos do ácido acetilsalicílico em dois momentos diferentes, ou seja, 10 e 20 dias após a aplicação da droga em questão, em que sua concentração também foi alterada e aumentada para 20%. A quantidade injetada em cada animal neste estudo também foi baseada em estudos anteriores [15,17]. Em estudos prévios com diferentes tratamentos, tais como laser de vapor de cobre [18], sinvastatina [19], dexametasona [20], Uncaria tomentosa (cat's claw) [21] também foram testados em animais experimentais, apresentando resultados com destruição de parte dos focos de endometriose, impedimento do crescimento após o uso da droga e diminuição da área endometriótica, respectivamente. De forma similar, no estudo de Siqueira [16], foi apresentado o uso da solução de ácido acetilsalicílico 5% com resposta positiva ao objetivo do trabalho porém não totalmente satisfatória. Os focos de endometriose foram apenas parcialmente destruídos [16]. No presente estudo foi averiguado o que aconteceria com o aumento da concentração da solução (20%) em um período semelhante (10 dias) e em um tempo superior (20 dias) de tratamento. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 87 As respostas encontradas foram que em 10 dias de tratamento os implantes obtiveram os resultados semelhantes ao trabalho de Siqueira [16], com 10 dias de tratamento com solução de 5% de ácido acetilsalicílico, o que nos leva a entender que a dosagem não é significante no aumento de 15%. Entretanto no grupo 3, com 20 dias de tratamento com solução de ácido acetilsalicílico 20% a resposta foi de que as áreas endometrióticas foram extintas, restando apenas necrose em seu lugar. Foi avaliada também a indução de apoptose em todas as amostras. No grupo 1 (controle) foram encontrados alguns sinais de células apoptótica nas 10 lâminas, no grupo 2 (10 dias tratamento) foi possível observar um grande número de células neste estágio em todas as lâminas e no grupo 3 (20 dias tratamento) em todas as lâminas foram encontradas células apoptóticas sem rastro de endometriose, restando apenas necrose tecidual, outros autores [16,22,23] também evidenciaram que o AAS a 5% e outras drogas respectivamente induzem a apoptose em focos endometriais. Este trabalho nos leva a gerar uma nova pauta, um novo modelo experimental para o estudo sem a necessidade do método invasivo para a injeção local da droga. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 88 Conclusão Com base no método empregado e no modelo experimental utilizado, com vista ao objetivo estabelecido, chegamos às seguintes conclusões: No grupo avaliado 10 dias após o tratamento a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20% causou hemorragia, fibrose, processo inflamatório e apoptose dos focos endometriais. Após 20 dias, houve eliminação completa do tecido endometrial, existindo infiltrados de processo inflamatórios, apoptose e grandes áreas de necrose. Conclui-se então que a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico a 20% em 10 dias causa destruição parcial dos focos de endometriose. E no tempo de 20 dias de tratamento a destruição foi total, ou seja, a solução bicarbonatada de ácido acetilsalicílico é eficaz no tratamento da endometriose peritoneal experimental em coelhas autólogas, no tempo de 20 dias. Artigo – Efeitos da Injeção Local de Ácido Acetilsalicílico a 20% na Endometriose Peritoneal – Estudo Experimental em Coelhos 89 Referências 1. Filigheddu N, Gregnanin I, Porporato PE, Surico D, Perego B, Galli L, Et al. Differential expression of microRNAs between eutopic and ectopic endometrium in ovarian endometriosis. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010. 2. Monteforte CA, Nava C, Carnevale GP. Preliminary results of therapeutical association of GnRH and a-interferon in the treatment of pelvic endometriosis. In: Coutinho EM, Spinola P, deMoura LH, editors. Progress in the Management of Endometriosis. London, England: Parthenon Publishing. 1995; 305–8. 3. Amaral VF, Dal Lago EA, Kondo W, Souza LC, Francisco JC. Development of an experimental model of endometriosis in rats. Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões. 2009; 36: 250-5. 4. Schor E, Freitas V, Soares Junior JM, Simões MJ, Baracat EC. Endometriose: Modelo experimental em ratas. 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Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits 93 Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits 94 Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits Adriana Beatriz Barretto1, Rafael Denadai1, Ednelson Henrique Bianchi2, Solange Peron Bueno Angela3 e Rogério Saad-Hossne1 1 – Department of Surgery, Botucatu Medical School, Sao Paulo State University (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil 2 – Department of Experimental Surgery, Botucatu Medical School, Sao Paulo State University (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil 3 – Department of Pathology, Botucatu Medical School, Sao Paulo State University (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil Conflitos de interesse: Nenhum Auxílio financeiro: CAPES e FAPESP-Brasil Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits 95 ABSTRACT The objective of the present study was to estimate the effects of local injection of acetylsalicylic acid solution into intraperitoneal implants of autologous endometrium. The 30 adult female rabbits utilized were divided into 3 groups of 10 each, in which peritoneal endometriosis was induced. Twenty days after endometriosis induction the rabbits were randomized and according to group received the following treatments: physiological solution 0.9% for 20 days (Group 1, control), bicarbonate solution of acetylsalicylic acid 20% for 10 days (Group 2, treatment) and bicarbonate solution of acetylsalicylic acid 20% for 20 days (Group 3, treatment). The endometriosis foci were removed and prepared on slides for histological analysis. A computer program was utilized to analyze the slides and measure the total area of remaining endometriosis. Group 2 (10- day treatment) presented a significantly smaller endometriosis area than Group 1 (control) and Group 3 (20-day treatment); the area was not measured on account of lack of endometriosis residue in any of the 10 slides. The 20-day treatment with acetylsalicylic acid destroys the entire endometriosis area. Keywords: AAS, Aspirin, Endometriosis, Experimental Study Artigo – Effects of Local Injection of 20% Acetylsalicylic Acid on Peritoneal Endometriosis – An Experimental Study in Rabbits 96 INTRODUCTION Endometriosis is a gynecological disease characterized by the presence of endometrial tissue beyond the uterine limits [1], afflicts young women of reproductive age at rates varying from 2 to 7%, and approaches 25% among women between 30 and 40 years of age [2]. A significant number of women are asymptomatic, and when symptomatic they involve pelvic pain with dysmenorrhea, back pain, dyschezia, painful urination and dyspareunia. In some cases it can cause infertility [3]. The diagnostic exam considered the gold standard for confirmation of the disease is the anatomopathological analysis of pieces obtained through invasive methods such as videolaparoscopy and laparotomy [3-4]. Currently, the first and best option is surgery, but the recurrence rate can approach 47% [5-7], followed by the use of drugs that can minimize the pains, but without eliminating the disease. Based on the mechanism of more widespread development of the disease, identified by Sampson, which explains the appearance of endometriosis by presence of retrograde menstruation [8], primates provide th