UNESP - Universidade Estadual Paulista Instituto de Química - Araraquara TESE DE DOUTORADO Imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter Asiaticus em citros. LUCAS MOREIRA SILVA Araraquara 2023 Lucas Moreira Silva Imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter Asiaticus em citros. Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Hideko Yamanaka Araraquara-SP 2023 DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: Lucas Moreira Silva Nascimento: 03/10/1993 Nacionalidade: Brasileiro Naturalidade: Carmo do Paranaíba/MG - Brasil Estado Civil: Solteiro Filiação: Monir Reis Moreira e Selma Luiza da Silva Moreira E-mail: lucassilvamg0@gmail.com ou luca.m.silva@unesp.br Endereço: Rua Prof. Francisco Degni, 55 Bairro: Quitandinha. CEP: 14800-060 Araraquara/SP. 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO Doutorado em Biotecnologia (andamento) UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara/SP. Período: 09/2018 – 03/2023 Título da tese: Imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter Asiaticus em citros. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Hideko Yamanaka Bolsa: CAPES mailto:lucassilvamg0@gmail.com mailto:luca.m.silva@unesp.br Mestrado em Biotecnologia UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Araraquara/SP. Período: 08/2016 – 09/2018 Título da dissertação: Síntese e caracterização de MIP-magnético para desenvolvimento de sensor eletroquímico para determinação de ciprofloxacina em amostras complexas para aplicação biotecnológica Orientadora: Prof.a Dr.a Maria del Pilar Taboada Sotomayor Coorientador: Dr. Marcos Vinicius Foguel Bolsa: CAPES Graduação em Biotecnlogia UFU - Universidade Federal de Uberlândia, Campus de Patos de Minas, Patos de Minas/MG Período: 08/2011 – 08/2016 Título do trabalho de conclusão de curso: Ziram herbicide determination using a polished silver solid amalgam electrode. Orientadora: Prof. a Dr. a Djenaine de Souza Publicações SILVA, LUCAS M.; FOGUEL, MARCOS V.; SOTOMAYOR, MARIA DEL PILAR T. Use of two functional monomers for a new approach to the synthesis of a magnetic molecularly imprinted polymer for ciprofloxacin. Journal of Materials Research and Technology, v. 15, p. 511-523, 2022. Doi: 10.1016/j.jmrt.2021.08.023. SILVA, CAIO CÉSAR GONÇALVES; SILVA, LUCAS MOREIRA; E SILVA, BEATRIZ COSTA; GARRIDO, SAULO SANTESSO; BOLDRIN, MARIA VALNICE ; DE SOUZA, DJENAINE. Cathodic stripping voltammetric determination of β-cyfluthrin, a pyrethroid insecticide, using polished silver solid amalgam electrode. Journal of Solid State Electrochemistry, v. 24, p. 1-8, 2020. Doi: 10.1007/s10008-020-04538-w. SILVA, L. M; DE SOUZA, D. Ziram herbicide determination using a polished silver solid amalgam electrode. Electrochimica Acta, v. 224, p. 541-550, 2016. DOI: 10.1016/j.electacta.2016.11.133 Artigos submetidos Lucas Moreira Silva; Antonio Ap. Pupim Ferreira; Hideko Yamanaka. Diseases affecting citrus: characteristics and diagnostic approaches. Biotechnology Advances. Submetido em 30/01/2023. Lilian D. Moura Torquato; Lucas Moreira Silva; Beatriz Costa E Silva; Caroline V. Rodrigues; Daiana Camila Da Silva; Sandra I. Maintinguer; Maria Valnice Boldrin Zanoni. The role of surface properties of bagasse biochars in electron transfer mediation during the bioconversion of glycerol into H2 and high added-value products. Bioresource Technology. Submetido em 05/02/2023. Capítulo de livro Hideko Yamanaka; Lucas Moreira Silva. Métodos potenciométricos. Cap. 2; p. 31-56. In: Métodos eletroanalíticos: conceitos, experimentos e aplicações. Organizado por Nelson Ramos Stradiotto [et al.]. – São Paulo: Cultura Acadêmica, 2021. ISBN: 978-65-5954-175-1 SILVA, L. M.; FOGUEL, M. V.; SOTOMAYOR, M. D. P. T. Ciprofloxacin: analytical methods for its monitoring in the environment. In: Ciprofloxacin: biosynthesis, applications, and adverse effects. Nova science publishers, 2018. Produção tecnológica Depósito de pedido de Patente intitulado 22CI025 - IMUNOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DIAGNÓSTICO HUANGLONGBING (HLB) de autoria de Lucas Moreira Silva; Antonio Aparecido Pupim Ferreira; Hideko Yamanaka. Agência UNESP de Inovação AUIN, 2022. Participação em eventos científicos Apresentação de trabalho System for butylparaben analysis de autoria de Maria Letícia Mendes Soares, Lucas Moreira Silva, Carolina Venturini Uliana, Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes e Hideko Yamanaka foi apresentado na forma de Poster durante o XX Encontro Nacional de Química Analítica/XII Congresso Ibero-Americano de Química Analítica, realizado em Bento Gonçalves, RS, de 25 a 28 de setembro de 2022. Apresentação de trabalho Study of the photoelectroreduction of Ti/TiO2 nanotubes modified by UIO-Zr-NH2 metal-organic framework de autoria de Kallyni Irikura, Lucas Moreira Silva, Regina Frem, Maria Valnice Zanoni foi apresentado na forma de Oral durante o XX Encontro Nacional de Química Analítica/XII Congresso Ibero-Americano de Química Analítica, realizado em Bento Gonçalves, RS, de 25 a 28 de setembro de 2022. Apresentação de trabalho Dispositivo para extração e degradação de corantes em efluentes de salões de cabeleireiros por fotocatálise autoria de Giovanna de Deus Sperandio, Kallyni Irikura, Lucas Moreira Silva, João Carlos de Souza, Maria Valnice Boldrin Zanoni, foi apresentado na forma de Poster durante o 1ª fase do XXXIII Congresso de Iniciação Científica da Unesp, realizado em Araraquara por meio da plataforma Even3,, SP, de 28 a 29 de outubro de 2021. Apresentação de trabalho Otimização de sistema microfluídico para análise eletroquímica do butilparabeno de autoria de Maria Letícia Mendes Soares, Lucas Moreira Silva, Carolina Venturini Uliana, Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes e Hideko Yamanaka, foi apresentado na forma de Pôster durante o 1ª fase do XXXIII Congresso de Iniciação Científica da Unesp, realizado em Araraquara por meio da plataforma Even3, SP, de 28 a 29 de outubro de 2021. Apresentação de trabalho Comportamento eletroquímico de butilparabeno empregando dispositivo 3D de autoria de Maria Letícia Mendes Soares, Lucas Moreira Silva, Carolina Venturini Uliana, Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes e Hideko Yamanaka, foi apresentado na forma de Pôster durante o 1ª fase do XXXII Congresso de Iniciação Científica da Unesp, realizado em Araraquara, SP, de 20 a 22 de outubro de 2020. Apresentação de trabalho Amperometric immunosensor for aflatoxin B1 de autoria de Lucas Moreira Silva, Carolina Venturini Uliana, Jaime Ricardo Vega Chacon, Miguel Miguel e Hideko Yamanaka foi apresentado na forma de Oral durante o XXII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, realizado em Ribeirão Preto, SP, de 01 a 05 de setembro de 2019. Ribeirão Preto, setembro de 2019. Apresentação de trabalho Electrochemical sensor for β-cyfluthrin, a pyrethroid insecticide, in citrus sample by cathodic stripping voltammetry at p-AgSAE electrode de autoria de Caio César Gonçalves Silva, Lucas Moreira Silva, Maria Valnice Zanoni e Djenaine De Souza foi apresentado na forma de Oral durante o XXII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, realizado em Ribeirão Preto, SP, de 01 a 05 de setembro de 2019. Atividades didáticas Realização de estágio supervisionado à docência na disciplina Análise Instrumental Quantitativa – Teórica/Prática para o curso de bacharelado em Farmácia sob supervisão da Profa. Dra. Fabíola Manhas Verbi Pereira em 2022/02. Realização de tutoria na disciplina Análise Instrumental Quantitativa – Teórica/Prática para o curso de bacharelado em Farmácia sob supervisão da Profa. Dra. Fabíola Manhas Verbi Pereira e Profa Dra. Hideko Yamanaka em 2021/02. Realização de estágio supervisionado à docência na disciplina Química Analítica Qualitativa - Prática para o curso de bacharelado em Engenharia Química sob supervisão da Profa. Dra. Mirian Cristina dos Santos em 2021/01. Realização de estágio docência na disciplina de Bioquímica Geral e Experimental II – Turma teórica para o curso de bacharelado em química sob supervisão da Profa. Dra. Denise Bevilaqua em 2021/01. Participação em banca Participação em banca de Fernanda Cristina de Oliveira Lopes Martins. “Dental amalgam electrode as voltammetric detection of triazine-based: application in natural water samples. 2019”. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Uberlândia desenvolvido sob orientação da Profa. Dra. Djenaine De Souza. Outras atividades Participação como membro de comissão organizadora de evento de extensão: IQ de Portas Abertas, ocorrido no Instituto de Química da UNESP de Araraquara, no dia 18 de novembro de 2022. Participação como membro de comissão organizadora de evento de extensão: Pint of Science Brasil, ocorrido na Cervejaria Avenida 42 em Araraquara, no período de 07 a 09 de novembro de 2022. Participação como membro de comissão organizadora de evento de extensão: Semana Nacional de Ciência e Tecnologia, ocorrido no Shopping Lupo 42 em Araraquara, no período 18 a 20 de outubro de 2018. Dedico este trabalho a Deus pelo dom da vida, aos meus pais Monir e Selma, pelo amor e apoio na minha vida. “É de sonho e de pó O destino de um só Feito eu perdido Em pensamentos Sobre o meu cavalo É de laço e de nó De jibeira o jiló Dessa vida Cumprida a sol” (Romaria - Renato Teixeira) “O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem.” (Grande Sertão Veredas - João Guimarães Rosa) “O sucesso consiste em ir de derrota em derrota sem perder o entusiasmo.” (Winston Churchill) E aprendi que se depende sempre De tanta, muita, diferente gente Toda pessoa sempre é as marcas Das lições diárias de outras tantas pessoas (Caminhos do Coração - Elba Ramalho) Eu sou apenas um rapaz latino-americano Sem dinheiro no banco sem parentes importantes E vindo do interior (Apenas um Rapaz Latino Americano - Belchior) AGRADECIMENTOS A Deus, por sua infinita bondade e misericórdia para com minha vida, dando-me força nos momentos difíceis, coragem e sabedoria. A Ele toda honra e toda glória, pois todas as conquistas e vitórias alcançadas em minha de vida é para glorificar seu nome. Aos meus pais, Monir e Selma, e ao meu irmão Mateus, por sempre apoiarem meus caminhos e incentivar a minha formação. Às minhas avós Andrezina e Helena (in memoria), por sempre me colocar em suas orações. Vó Lena, a senhora sempre me dizia: “A única coisa que não podem te tirar são os estudos!”. À minha família, pelo apoio, e por entender os momentos que eu não pude estar com vocês. À Prof.a Dr.a Hideko Yamanaka, pela orientação enriquecedora, pela confiança depositada, o apoio nos momentos difíceis, pela compreensão, pelo o incentivo, pela amizade e pelos ensinamentos tão essenciais ao desenvolvimento deste trabalho e construção da minha carreira. A senhora me ensinou não só ser um profissional, mas também, a ser um ser humano. Sou extremamente grato! Ao Dr. Antonio Apareceido Pupim Ferreira, pela coorientação, confiança, paciência, ensinamento, amizade, incentivo, conselhos, ensinamentos e discussões sempre pertinentes e instigantes, que levaram a execução deste trabalho. Prof. Dr. Assis Vicente Benedetti e ao Dr. Nelson Arno Wulff pela avaliação e contribuições cientificas para o desenvolvimento deste trabalho no Exame Geral de Qualificação. Às Profas. Dras. Denise Bevilaqua; Raquel Fernandes Pupo Nogueira; Mirian Cristina Dos Santos e Fabiola Manhas Verbi Pereira, pela supervisão nas distintas atividades à docência que pude experimentar durante o período deste doutorado. Vocês contribuíram de forma muito significativas em minha formação! Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido por ter cedido de forma solícita o uso do liofilizador para etapas de avaliação de estabilidade do material. Ao Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus), pela colaboração técnico-cientifica e por ceder sua estrutura física e operacional. A Me. Elaine Cristina Martins, pela colaboração na execução deste trabalho, por colaborar no preparo de todas as amostras de extratos vegetais utilizadas, análise utilizando técnica de qPCR neste trabalho, pelas contribuições cientificas sempre pertinentes em nossas reuniões. Obrigado por me receber de tão bem todas as vezes que fui ao Fundecitrus. Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota pela oportunidade, atenção e profissionalismo prestado durante meu estágio no Laboratório de Eletroquímica, Eletroanalítica e Desenvolvimento de Sensores – LEEDS, na UNICAMP em Campinas. A todos os integrantes do grupo, Rúbia, João Paulo, Patrícia, Thais Rabelo, Neuryelen, Rafel, Dahwin e Regina e Tais Xastre. Obrigado pela amizade construída, pelas discussões cientificas sempre pertinentes e instigantes, por todos os momentos de descontração, pelos cafés, almoços no RA (porque lá é servido no prato e não bandeja, rs), pelo suporte nos momentos de estresse e desânimo, e por toda a parceria que tornaram esses meses que estive com vocês inesquecíveis. Aos amigos de fora do laboratório, Tatiana, Samuel e Luiz, obrigado pelo apoio, por todos os momentos de descontração, amizade construída. Obrigado por também fazerem que meus dias em Campinas tenham sido tão bons! Prof. Dr. William Reis de Araujo por ter cedido de forma solícita o uso da impressora de corte a laser de CO2 a seu aluno de doutorado Me. Lucas Felipe de Lima pelas orientações no uso no equipamento. Aos meus amigos da UNESP, Caio, Kallyni, Saidy, Hernan, Thais, Karen, Weida, João Pedro, Lilian, João Perine, Bárbara, Carolina Zambom, Nayara Melo. Obrigado pela amizade construída, por todos os cafés e os momentos de descontração, pelo suporte nos momentos de estresse e desânimo, e por toda a parceria que tornaram esses anos inesquecíveis! A Maria Leticia, minha primeira aluna de IC, obrigado pelo apoio e companheirismo. Meu papel era ensinar a você, mas você não tem noção do quanto me ensinou. Além disso, me mostrou que estou certo em seguir nessa carreira acadêmica! A todos os colegas do GEAr pelas discussões científicas e momentos de descontração durante os cafés. Ao Rev. Luiz Mello, pelo acolhimento, pelas conversas e orientações, pelos momentos de descontração, você foi instrumento da benção de Deus em minha vida. Estendo os meus agradecimentos a todos da Igreja Presbiteriana Boas Novas, vocês foram instrumentos de Deus em minha vida! A Kezia e ao Gustavo, por terem me acolhido como um irmão/filho em sua casa e em suas vidas. Pelo apoio e a amizade construída de forma tão orgânica, pois sei que posso contar com vocês sempre. Seja para compartilhar felicidades, uma piada, uma risada ou para dividir uma tristeza, uma lágrima. Por meio de vocês eu pude ver um pouco do Reino aqui! Vocês são benção de Deus em minha vida! A Débora e ao Octavio, por sempre me receberem tão bem em sua casa e deixar que eu faça parte de suas vidas. Pela amizade construída de forma tão leve. Pelo apoio em horas difíceis, pelos nossos almoços e tardes na piscina, nossos jantares e conversas que iam até a madrugada. Vocês são benção de Deus na minha vida e são muito especiais em minha caminhada! Sei que posso contar com vocês sempre! A Profa. Dra Djenaine de Souza, minha orientadora de IC que se tornou uma amiga. Muito obrigado por todo do apoio profissional e pessoal! Obrigado pelos ensinamentos e discussões cientificas sempre pertinentes e instigantes, pelos conselhos de vida, pelo apoio nas horas difíceis, e pelas alegrias compartilhadas, por todos os momentos de descontração sempre acompanhadas de um bom café ou um bom vinho. Agora nos tonamos além de amigos colegas de profissão! A Maraíza, pela amizade de longo tempo, e hoje de longa distância também. Obrigado por sempre me receber de forma tão generosa e acolhedora em sua casa, pelo apoio e incentivo nas horas difíceis, por entender os momentos que eu não pude estar próximo e mostras que a amizade não se altera com a distância e o tempo! Ao meu trio de crossfit Marina e Maria Eduarda, pelos treinos em equipe, pelo apoio e nossas brincadeiras no dia a dia! Meus dias ficam mais leves quando treinamos em conjunto. A todos os colegas de esporte do Box 036. Muito obrigado por fazerem parte desta caminhada, pelos treinos em conjunto e momentos de descontração. Ao meu amigo Estevão Áquila, pelo apoio, incentivo e a amizade construída de forma tão natural. Você sabe o valor desta conquista meu amigo! Sei que posso contar com você sempre! Seja para compartilhar conquistas, uma piada, um café da tarde, um almoço, uma risada ou para dividir uma tristeza, uma lágrima. Por meio de você eu pude ver como Deus coloca pessoas certas nos momentos certos! Às funcionárias da Seção Técnica de Pós-Graduação e da Biblioteca por sempre estarem à disposição para ajudar, informar e tirar dúvidas. A todos os funcionários do Instituto de Química, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. Ao Instituto de Química da UNESP pela infraestrutura e acolhida durante esses anos. Ao Instituto Nacional de Tecnologias Alternativas para Detecção, Avaliação Toxicológica e Remoção de Contaminantes Emergentes e Radioativos (INCT-DATREM); Proc. CNPq 465571/2014-0 e Proc. FAPESP 2014/50945-4. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) Código de Financiamento 001. E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. “Porque Dele, e por Ele, e para Ele são todas as coisas; glória, pois, a Ele eternamente. Amém!” Romanos 11:36 https://dailyverses.net/pt/romanos/11/36 i RESUMO A citricultura é um dos setores mais bem organizados da agroindústria brasileira, dispondo de fundações empresariais de assessoria e monitoramento da produção e da qualidade dos citros. Atualmente a produção brasileira está concentrada no denominado de cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais, região geográfica que engloba 481 municípios e 12 mil fazendas, totalizando uma área plantada de mais de 400 mil hectares, sendo responsável por 60% da produção mundial de suco de laranja. Entanto, a citricultura vem enfrentando alguns desafios em função da disseminação de diferentes doenças, das quais podemos ressaltar o Huanglongbing (HLB) também nomeada “greening”, que é provocada pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus as quais são transmitidas para as plantas pelo psilídeo Diaphorina citri. A detecção de plantas contaminadas com “greening” no pomar ocorre de forma visual e geralmente subjetiva e os métodos laboratoriais existentes demandam tempo de análise e elevado custo financeiro. Desta maneira, no presente trabalho desenvolveu-se um imunossensor impedimétrico seletivo para a detecção e determinação de HLB em amostras de citros. O anticorpo anti-HLB, obtido comercialmente a partir da proteína de membrana externa (OMP), foi imobilizado sobre nanopartícula magnética previamente sintetizada e caracterizada. O anticorpo devidamente imobilizado foi colocado em contato com as diferentes amostras de extratos de folhas de plantas cítricas, após a reação de afinidade com o antígeno realizou-se a etapa de lavagem do material para minimizar o efeito de matriz. O monitoramento da reação de afinidade foi efetuado por espectroscopia de impedância eletroquímica, empregando como eletrodo de trabalho o carbono vítreo contendo em seu interior um imã de neodímio. O dispositivo desenvolvido distingue as amostras positivas ao HLB das amostras negativas ao HLB e das positivas ao CTV. Os resultados obtidos pelo imunossensor impedimétrico corroboraram os dados alcançados pela técnica equivalente a técnica “padrão ouro” qPCR. Palavras chaves: Citricultura; Greening, Huanglongbing (HLB); Diagnóstico; Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE); Imunossensor eletroquímico; Biossensor; Nanopartículas magnéticas. ii ABSTRACT Citrus farming is one of the best-organized sectors of the Brazilian agroindustry, with business foundations for advising and monitoring citrus production and quality. Currently the Brazilian production is concentrated in the so-called citrus belt of São Paulo and Minas Gerais, a geographic region that encompasses 481 municipalities and 12,000 farms, totaling a planted area of over 400,000 hectares, accounting for 60% of world production of orange juice. However, citrus farming has been facing a decline in productivity and quality of the fruits generated due to the spread of different diseases, of which we can highlight Huanglongbing (HLB) also known as “greening”, which is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanas, which are transmitted to plants by the psyllid Diaphorina citri. The detection of plants contaminated with “greening” in the crop occurs visually and is generally subjective, and existing laboratory methods demand analysis time and high financial cost. Thus, the present work developed a selective impedimetric immunosensor for the detection and determination of HLB in citrus samples. The anti-HLB antibody, obtained commercially from the outer membrane protein (OMP), was immobilized on a previously synthesized and characterized magnetic nanoparticle. The immobilized antibody was placed in contact with different samples of extracts of citrus plant leaves, after the affinity reaction with the antigen, material was washed to minimize the matrix effect. The monitoring of the affinity reaction was carried out by electrochemical impedance spectroscopy, using glassy carbon containing the neodymium magnet as the working electrode. The developed device distinguishes HLB-positive samples from HLB- negative samples and CTV-positive ones. The results obtained by the impedimetric immunosensor corroborated the data obtained by the technique equivalent to the “gold standard” technique qPCR. Keywords: Citriculture; Huanglongbing (HLB); Diagnosis; Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS); Electrochemical immunosensor; Biosenor; Magnetic nanoparticles. iii LISTA DE FIGURAS Figura 1: Rota de dispersão de citros pelo mundo. 1) Indochina, 2) Oriente Médio; 3) Norte da África, 4) Península Ibérica, 5) Caribe e 6) Brasil. ......................................................................... 2 Figura 2: Classificação dos produtores de laranja do mundo em milhões de toneladas. ............... 5 Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura em vasos do floema de citros com Candidatus Liberibacter asiaticus e b) psilídeo Diaphorina citri. ..................................................................... 9 Figura 4: Sintomas típicos do HLB. Em a) ramos e em b) frutos. ............................................... 10 Figura 5: Ciclos térmicos realizados por PCR. ............................................................................ 12 Figura 6: Representação de molécula de imunoglobulina IgG. ................................................... 15 Figura 7: Tipos de ELISA. a) direto; b) indireto; c) sanduíche e d) competitivo ........................ 16 Figura 8: Número de publicações exibidas em uma pesquisa no site Science Direct. Palavras- chave empregadas: "citrus diseases diagnostic PCR", "citrus diseases diagnostic ELISA" e "citrus diseases diagnostic electrochemical biosensors". ......................................................................... 18 Figura 9: Representação geral de biossensores. ............................................................................ 19 Figura 10: Mecanismo de formação de partículas em solução. Curva a) nucleação simples e crescimento uniforme por difusão explicado pelo modelo de LaMer e Dinegar; Curva b) nucleação, crescimento e agregação de subunidades e Curva c) evento de nucleação múltipla e amadurecimento de Ostwald. ........................................................................................................ 24 Figura 11: Esquema da modificação da superfície de mNPs com sílica empregando um alcoxisilano. ................................................................................................................................... 27 Figura 12: Representação esquemática dos fasores E e I. ........................................................... 32 Figura 13: Curvas e esquemas característicos da impedância eletroquímica. Em (a) Diagrama de Nyquist ou plano complexo e em (b) Diagrama de Bode. ............................................................ 34 Figura 14: Modelos de DCE. Em a) modelo descrito por Helmholtz e em b) modelo descrito por Grahame. ....................................................................................................................................... 37 Figura 15: Representação de síntese de mNP em modificação com APTES, formado mNP|A. .......................................................................................................................... 44 Figura 16: Preparação dos extratos de folhas de plantas cítricas; a) coleta e identificação de material; b) higienização das folhas coletadas; c) extração de pecíolo; d-e) processamento da amostra e f) transferência para tubo. ............................................................................................. 53 Figura 17: Imagens de folhas de plantas de laranja (Citrus sinensis) com diferentes caracteristicas. Em a) folha sadia; em b) nervura central amarela; em c) manchas verdes e amarelas; em d) deficiência de nutrientes e em e) mosqueado. ............................................................................... 58 iv Figura 18: a) DRX das (▬) mNP e (▬) mNP|A e em b) picos de DRX disponíveis na base de dados Inorganic Crystal Structure Database ICSD Number 082432. ........................................... 60 Figura 19: Em a) estrutura espinélica cúbica de magnetita centrada na face. Em b) ampliação de um tetraedro e um octaedro adjacente compartilhando um átomo de oxigênio. Grandes esferas rotuladas por Fetet e Feoct representam átomos de ferro em sub-redes c. ....................................... 61 Figura 20: Espectro de FTIR das mNP (▬) e mNP|A (▬). ........................................................ 62 Figura 21: Representação da silanização das mNP com APTES. ............................................... 63 Figura 22: Espectro de FTIR de mNP|A (▬) e mNP|A-Ac (▬). ................................................ 64 Figura 23: Curvas de potencial zeta de mNP (■) e mNP|A (■). .................................................. 65 Figura 24: Imagem de MET com ampliação de 100 nm das partículas de Fe3O4 (mNP). .......... 67 Figura 25: Imagens de MET das partículas de Fe3O4 (mNP) e Fe3O4|APTES (mNP|A) com ampliação de 50 e 20 nm respectivamente. ................................................................................... 68 Figura 26: Histograma de distribuição de tamanho das partículas Fe3O4@APTES (mNP|A). ... 69 Figura 27: (a) Curvas de histerese magnética em (1) mNP (▬) e (2) mNP|A (▬); em (b) Curvas de histerese magnética em (3) mNP|A-glut (▬); (4) mNP|A-glut-Ac (▬); (5) mNP|A-glut-Ac-bloq (▬) e (6) mNP|A-glut-Ac-bloq-OMP (▬). .......................................... 70 Figura 28: Em a) diagramas de Nyquist em diferentes concentrações de mNP|A, volume fixo de 10,0 µL sobre a superfície do mGCE; em b) diagramas de angulo de fase referentes as diferentes concentrações de mNP|A. Avaliou-se as diferentes [mNP|A] sendo mGCE (■); 0,25 (●); 0,50 (▲); 0,65 (▼); 0,75 (♦) e 1,00 mg mL-1 (◄). ....................................................................................... 71 Figura 29: Relação entre Rtc e concentração de mNP|A adicionada sobre a superfície do mGCE (■); índice de recobrimento θ (■) em função da concentração de mNP|A.. ................................. 73 Figura 30: Relação entre Cdl e concentração de mNP|A adicionada sobre a superfície do mGCE. ....................................................................................................................................................... 74 Figura 31: (a) Diagramas de Nyquist em diferentes volumes de mNP|A, concentração fixa de 0,75 mg mL-1 sobre a superfície do mGCE; em (b) múltiplos diagramas de angulo de fase referentes as diferentes volumes de mNP|A. Avaliou-se os diferentes volumes de mNP|A sendo mGCE (■); 2,5 (●); 5,0 (▲); 7,5 (▼); 10,0 (♦) e 12,25 μL (◄).. ................................................ 75 Figura 32: Em a), relação entre Rtc e volume de mNP|A adicionada sobre a superfície do mGCE (-■-); índice de recobrimento θ (-■-) em função do volume de mNP|A; em b) Relação entre Cdl (-■-) e volume de mNP|A adicionada sobre a superfície do mGCE. ......................................................................................................... 76 Figura 33: Diagramas de Nyquist em diferentes concentrações de Ac imobilizados sobre mNP|A em solução tampão PBS 10 mM, pH 7,5. Em a) após imobilização com Ac; em b) após bloqueio com glicina 0,5% m/v e em c) após incubação com OMP 150,0 ng mL-1. Avaliou-se as diferentes [Ac] sendo 1,0 (■); 3,0 (●); 6,0 (▲); 7,5 (▼); 12,5 (⬥); 25,0 (◄); 50,0 (►); 75,0 e 100,0 ng mL-1 (⬢). ........................................................... 78 v Figura 34: Efeito da concentração de Ac imobilizada sobre mNP|A em cada etapa de preparo do dispositivo. Sendo mNP|A-Ac (-■-); mNP|A-Ac-bloq (-●-) e mNP|A-Ac-bloq-pep-OMP (-▲-). ............................................................................................... 79 Figura 35: Diagramas de Nyquist referentes a imobilização de Ac sobe mNP|A em diferentes valores de pH. Em (a) após imobilização com Ac; em (b) após bloqueio com glicina 0,5% m/v e em (c) após incubação com OMP 150,0 ng mL - 1. Avaliou-se os diferentes valores de pH sendo 5,0 (■); 5,5 (●); 6,0 (▲); 6,5 (▼); 7,0 (⬥) e 7,5 (◄)................................................................... 81 Figura 36: Relação entre a resposta eletroquímica e o pH do meio de imobilização de Ac. Sendo mNP|A-Ac (-■-); mNP|A-Ac-bloq (-●-) e mNP|A-Ac-bloq-pep-OMP (-▲-). ............................ 82 Figura 37: Diagramas de Nyquist em meio, contendo ou não, Tween 20 na etapa de imobilização e incubação com OMP.Em (a) após imobilização com Ac; em (b) após bloqueio com glicina 0,5% m/v e em (c) após incubação com OMP 150,0 ng mL- 1. Avaliou-se os meios reacionais sendo PBS(1) (■); PBST(1) (●); PBS(2) (▲) e PBST(2) (▼). .............................................................. 83 Figura 38: Relação entre a resposta eletroquímica e o pH do meio de imobilização de Ac. Sendo mNP|A-Ac (-■-); mNP|A-Ac-bloq (-●-) e mNP|A-Ac-bloq-pep-OMP (-▲-). ................. 84 Figura 39: Diagramas de Nyquist referentes a diferentes concentrações de glutaraldeído sobre mNP|A. Avaliou-se os diferentes [glutaraldeído] sendo mNP|A (■); 0,1 (●); 0,5 (▲); 1,0 (▼); 2,5 (⬥) e 5,0 % m/v (◄). .................................................................................................................... 85 Figura 40: Diagramas de Nyquist referentes a imobilização de Ac sobe mNP|A em diferentes concentrações de glutaraldeído. Em (a) após imobilização com Ac; em (b) após bloqueio com glicina 0,5% m/v e em (c) após incubação com OMP 150,0 ng mL- 1. Avaliou-se os diferentes [glutaraldeído] sendo 0,1 (●); 0,5 (▲); 1,0 (▼); 2,5 (⬥) e 5,0 % m/v (◄). ................................ 86 Figura 41: Efeito das diferentes concentrações de glutaraldeído na imobilização de Ac sobre mNP|A. Sendo mNP|A-glut(-■-); mNP|A-glut-Ac (-●-); mNP|A-glut-Ac-bloq (-▲-) e mNP|A-Ac-bloq- pep-OMP (-▼-). ............................................................................................................................ 87 Figura 42: Diagramas de Nyquist referentes aos diferentes tempos de imobilização de Ac na concentração de 6,0 ng mL-1 sobe mNP|A. Avaliou-se os diferentes tempos de imobilização de Ac anti-HLB, sendo 0,25 (■); 0,50 (●); 1,0 (▲); 1,5 (▼); 2,0 (⬥); 3,0 (◄); 4,0 (►); 6,0 (⬢) e 16 horas(★). .............................................................................................................................. 88 Figura 43: Efeito do tempo de imobilização de Ac sobre mNP|A no sinal impedimétrico. ........ 89 Figura 44: Diagramas de Nyquist referentes aos diferentes tempos de bloqueio com solução de glicina 0,5 % m/v sobre mNP|A-Ac. Avaliou-se os diferentes [glicina], sendo 0,25 (■); 0,50 (●); 1,0 (▲); 1,5 (▼); 2,0 (⬥); 3,0 (◄); 4,0 (►); 6,0 (⬢) e 16 horas(★). ......................................... 90 Figura 45: Efeito do tempo de bloqueio com solução de glicina 0,5% m/v mNP|A-Ac no sinal impedimétrico. ............................................................................................................................... 91 vi Figura 46: Diagramas de Nyquist referentes aos diferentes tempos de incubação entre mNP|A- Ac, em a) meio reacional com ausência de surfactante Tween 20, em b) meio reacional com presença de surfactante Tween 20. Avaliou-se os diferentes tempos de incubação de pep-OMP, sendo 0,25 (■); 0,50 (●); 1,0 (▲); 1,5 (▼); 2,0 (⬥); 3,0 (◄); 4,0 (►); 6,0 (⬢) e 16 horas(★). . 92 Figura 47: Avaliação do sinal impedimétrico referente ao tempo de incubação de Ag na concentração de 150,0 ng mL- 1, em meio de solução tampão PBS 10 mM, pH 7,4, na ausência(- ■-) e presença(-●-) de surfactante Tween 20. ............................................................................... 93 Figura 48: Possível representação 3D de pep-OMP realizada no software Pymol. ..................... 94 Figura 49: Diagramas de Nyquist referentes aos diferentes valores de pH empregados para a incubação de Ag e mNP|A-Ac. Avaliou-se os diferentes valores de pH sendo 5,0 (■); 5,5 (●); 6,0 (▲); 6,5 (▼); 7,0 (⬥) e 7,5 (⬢). ................................................................................................... 95 Figura 50: Avaliação do sinal impedimétrico referente ao pH do meio de incubação de Ag na concentração de 150,0 ng mL-1, em meio de solução tampão PBST 10 mM. .............................. 96 Figura 51: Relação do sinal impedimétrico em função das diferentes diluições de Ac (-■-) e Ag (-●-), partindo de um estoque de 6,0 ng mL-1. .............................................................................. 97 Figura 52: Diagramas de Nyquist referentes as diferentes concentrações de pep-OMP, intervalo de 0,0 fg mL- 1 - 50,0 pg mL - 1. Avaliou-se as diferentes [pep-OMP] em meio de solução de PBST 10,0mM pH 7,5; sendo 0,0 fg mL-1 (■); 1,0 fg mL-1 (●); 10,0 fg mL-1 (▲); 100,0 fg mL-1 (▼);500,0 fg mL-1 (⬥); 1,0 pg mL-1 (◄); 10,0 pg mL-1 (►) e 50,0 pg mL-1 (⬢). ...................... 98 Figura 53: Curva analítica construída, pep-OMP no intervalo de 1,0 fg mL-1 a 50,0 pg mL-1. As barras de erro mostram o desvio padrão obtido a partir da triplicata dos dados dos experimentos. ....................................................................................................................................................... 99 Figura 54: Em (a) Diagramas de Nyquist e em (b) diagramas de Bode das etapas de construção do biossensor. (c) CEE ajustado para mGCE e mNP|A e m (d) ) CEE austado para mNP|A-Ac e mNP|A-Ac-OMP. Sendo 1) mGCE (■) e ajuste matemático (▬); 2) mNP|A (●) e ajuste matemático (▬); 3) mNP|A-Ac (▲) e ajuste matemático (▬) e 3) mNP|A-Ac-pep-OMP (⬢) e ajuste matemático (▬). ............................................................................................................... 102 Figura 55: Gráfico de Hanes-Woolf. ......................................................................................... 106 Figura 56: Estabilidade das mNP|A-Ac nas diferentes condições de estocagem. Em a) material estocado em suspensção a temperatura ambiente em banca a 25 °C (SpA-mNP@-Ac); em b) material estocado em suspensção em geladeira a temperatura de 4 °C (SpG-mNP@-Ac) e em c) material liofilizado (L-mNP|A-Ac). ............................................................................................ 108 Figura 57: Diagramas de Nyquist referente as diferentes formas de “clean up” avaliadas. Em a) amostras não fortificadas e em b) amostras fortificadas com 500,0 fg mL-1 de pep-OMP. As diferentes formas de “clean up” estão indicadas como 1) resposta nas condições otimizadas em meio de solução tampão PBST 10,0 mM pH 7,5 (■); 2) amostra sem etapa de centrifugação (●); 3) amostra com etapa de centrifugação (►) e 4) uso de kaolin (◄). ......................................... 109 vii Figura 58: Valores de Rtc mensurados nas diferentes maneiras de “clean up” avaliadas; em a) mNP|A-Ac incubadas por 3,0 h em pull de extratos de folhas de plantas cítricas negativas ao C.Las (branco) (■) e mNP|A-Ac incubadas por 3,0 h em pull de extratos de folhas de plantas cítricas negativas ao C.Las fortificadas com 500,0 fg mL-1 de pep-OMP (fortificado) (●). Em b) valores de ΔΔRtc = ΔRtc após forticação - ΔRtc branco. .......................................................................... 110 Figura 59: Adição de padrão em “pull” de amostras de extratos vegetais cítricos fortificada com 1,0 fg mL-1 Pep-OMP. ................................................................................................................. 111 Figura 60: Valores de ΔRtc para amostras de extratos de folhas de plantas cítrica; sendo amostras negativas a C.Las. (■) e amostras positivas a C.Las. (●). ........................................................... 113 Figura 61: Representação gráfica “Box plot” dos valores de ΔRtc exibidos pelas amostras L2.1, L3.1, L4.1, L6.1 e L9.1 em função do número de lavagens utilizando solução tampão PBST 10,0 mM pH 7,5 após incubação com mNP|A-Ac. Sendo valor de ΔRtc mensurado após 3 etapas de lavagem (⬥); após 5 etapas de lavagem (⬥) e após 7 etapas de lavagem (⬥). ...................... 116 Figura 62: Em a) mNP|A-Ac incubadas por 3,0 h em pull de extratos de folhas de plantas cítricas negativas a Ca. Liberibacter spp. (branco) (■) e mNP|A-Ac incubadas por 3,0 h em pull de extratos de folhas de plantas cítricas negativas a Ca. Liberibacter spp. fortificadas com 500,0 fg mL-1 de pep-OMP (fortificado) (●). Em b) valores de ΔΔRtc = ΔRtc após forticação - ΔRtc branco. ............................................................................... 117 Figura 63: Valores de ΔRtc para amostras de de extratos de folhas de plantas cítrica; sendo amostras negativas a Ca. Liberibacter spp. (■) e amostras positivas a C.Las (●). ..................................... 119 viii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Produção de laranja por região do cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais. ...... 6 Tabela 2: Características ideais de um biossensor. ...................................................................... 20 Tabela 3: Combinação dos diferentes meios de imobilização de Ac e captura de Ac. ................ 49 Tabela 4: Relação entre as diferentes diluições de Ag e Ac empregadas, partindo de concentrações estoque de 6,0 ng mL-1. ................................................................................................................. 51 Tabela 5: Identificação das 20 primeiras amostras de extratos de folhas de plantas cítricas. ...... 55 Tabela 6: Identificação das amostras de extratos de folhas de plantas cítricas avaliadas para diagnóstico de C.Las utilizando o imunossensor impedimétrico. ................................................. 57 Tabela 7: Figuras de mérito. ....................................................................................................... 100 Tabela 8: Parâmetros obtidos na caracterização do eletrodo de carbono vítreo por EIE nas diferentes etapas de modificação. ................................................................................................ 101 Tabela 9: Comparativo entre os valores de ΔRtc e Ct exibidos pelas diferentes amostras de extratos de folhas de plantas cítricas. ........................................................................................................ 114 Tabela 10: Comparativo entre os valores de ΔRtc e Ct exibidos pelas diferentes amostras de extratos de folhas de plantas cítricas. .......................................................................................... 120 ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A: Ampere a: Amplitude de perturbação Ac: Anticorpo AC: Corrente alternada Ag: Antígeno APTES: (3-Aminopropil) trietoxissilano AS: Assintomática ATR: Reflectância total atenuada C: Capacitância 𝐶dl: Capacitância da dupla camada eletroquímica 𝐶𝑖 0: Concentração real de espécies na interface de trabalho 𝐶𝑖 𝑏: Concentração das espécies no seio da solução C∞: Concentração do analito no seio da solução Ca. L. americanus ou C.Lam: Candidatus Liberibacter americanus Ca. L. asiaticus ou C.Las: Candidatus Liberibacter asiaticus CEE: Circuito elétrico equivalente CPE: Constant phase element – elemento de constante de fase Ct: Cicle threshold – ciclo limiar CTV: Virus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus) CVC: Clorose variegada dos citros D: Coeficiente de difusão DCE: Dupla camada elétrica DEF: Deficiência de nutrientes x dmed: Diâmetro médio DNA: Ácido desoxirribonucleico dNTPs: Desoxinucleotidos trifosfatos DRX: Difratometria de raios X E: Potencial elétrico E0: Potencial padrão EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético EIE: Espectroscopia de impedância eletroquímica ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay EtOH: Etanol F: Constante de Faraday Fe3O4: Magnetita FTIR: Fourier-transform infrared spectroscopy – Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier glut: glutaraldeído Hc: Campo coercitivo HLB: Huanglongbing Hz: Hertz I: Corrente elétrica I0: Corrente de troca ICSD: Inorganic crystal structure database Ig: Imunoglobulina IHP: Plano interno de Helmholtz IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry j: Operador imaginário xi K: Kelvin k0: Constante de transferência eletrônica Kd: Constante de dissociação kDa: Quilodalton kg: Quilograma LD: Limite de detecção LQ: Limite de quantificação MET: Microscopia eletrônica de transmissão mGCE: Eletrodo de trabalho de carbono vítreo contendo em seu interior um imã de neodímio min: min mNP|A: Magnetita-APTES mNP|A-glut: Magnetita-APTES-glutaraldeído mNPs: nanopartículas magnéticas MOSQ: Mosqueado MR: Magnetização remanescente Ms: Magnetização de saturação MVA: Manchas verdes e amarelas n: número de elétrons por mol de substância N2: Gás nitrogênio NA: Nervura central amarela ng: Nanograma nm: Nanometro OCP: Open circuit potential - potencial de circuito aberto OMP: Outer membrane protein xii OPH: Plano de externo Helmholtz PBS: solução tampão fosfato salino PBST: solução tampão fosfato salino contendo sufactante Tween 20 PCR: Polymerase chain reaction - reação em cadeia da polimerase pep-OMP: peptídeo-OMP (antígeno empregado para produção do anticorpo anti-HLB) qPCR: PCR quantitativo r: Coeficiente de correlação R: Constante dos gases R: Resistor rpm: Rotação por minuto 𝑅𝑠: resistência da solução eletrolítica 𝑅𝑡𝑐: resistência de transferência de carga Rtcl: resistência a transferência de cargas do eletrodo sem modificação. Rtcm: resistência a transferência de cargas do eletrodo após modificação SAM: Self-assembled monolayer – monocamada automontada SD: Devio padrão sin: Função trigonométrica seno SiO2: Óxido de silício t: Tempo T: Tesla tan: função trigonométrica tangente V: Volt v: Volume VSM: Vibrating Sample Magnetometer xiii �̅� : Média aritmética Z: Impedância total Z’: Impedância real -Z’’: Impedância imaginária ZCPE: Reatância capacitiva Zw: Impedância de Warburg δ: deformações angulares representadas ΔRtc: Rtc após etapa incubação com Ag - Rtc anterior a etapa de incubação com Ag (branco) ΔΔRtc = ΔRtc após fortificação - ΔRtc branco. µg: Micrograma µL: Microlitro 2θf : Ângulo final 2θi : Ângulo inicial θ: Índice de recobrimento ϕ: Ângulo de fase Ø: Diâmetro médio de poro ν: Deslocamento axial οC: Grau Celsius σ: Coeficiente de difusão de Warburg Ω: ohm % Rec: Porcentagem de recuperação 𝜔: Frequência angular xiv SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 1.1. Aspectos históricos e econômicos da citricultura ........................................................... 1 1.2. Pragas que afetam a citricultura ..................................................................................... 7 1.3. Huanglongbing (HLB) ou greening ................................................................................ 8 1.4. Identificação e detecção de HLB em citros ................................................................... 11 1.5. Biossensores: definições e propriedade ......................................................................... 19 1.6. Espectroscopia de impedância eletroquímica ............................................................... 30 2. OBJETIVO .................................................................................................................... 41 3. METODOLOGIA ......................................................................................................... 42 3.1. Reagentes e soluções ...................................................................................................... 42 3.2. Síntese e modificação de mNP ....................................................................................... 43 3.3. Caracterizações físicas ................................................................................................... 44 3.4. Medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) .................................. 45 3.5. Avaliação da concentração e volume de mNP|A sobre m-GCE ................................... 46 3.6. Otimização dos parâmetros experimentais de construção do imunossenor impedimétrico ................................................................................................................. 46 3.6.1. Concentração de anticorpo anti-HLB ...................................................................... 46 3.6.2. Efeito do pH do meio de imobilização de Ac-HLB ................................................ 48 3.6.3. Emprego de Tween 20 na imobilização de Anti-HLB ............................................ 48 3.6.4. Concentração de glutaraldeído ................................................................................ 49 3.6.5. Tempo de imobilização de Ac sobre mNP|A ........................................................... 50 3.6.6. Tempo de bloqueio de mNP|A-Ac .......................................................................... 50 3.6.7. Tempo de incubação de mNP|A-Ac com OMP ....................................................... 50 3.6.8. Efeito do pH do meio de incubação entre mNP|A-Ac e Ag pep-OMP ................... 50 3.6.9. Variação da diluição de Ac e Ag .............................................................................. 51 3.7. Construção de curva analítica ....................................................................................... 52 xv 3.8. Estabilidade do imunossensor impedimétrico ............................................................... 52 3.9. Aplicação em amostras de extratos de folhas de plantas cítricas ................................. 52 3.9.1. Preparo de extratos cítricos para análise em biossensor ......................................... 52 3.9.2. “Clean up” da amostra ............................................................................................. 53 3.9.3. Construção de curvas de recuperação ..................................................................... 54 3.9.4. Otimização das condições de análise de EIE em amostras de extratos de folhas de plantas cítricas ............................................................................................................................. 54 3.10. Diagnóstico de HLB em amostras de extratos de folhas de plantas cítricas ............... 56 3.10. Extração de DNA vegetal e procedimento qPCR .......................................................... 58 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 60 4.1. Caracterizações físicas ................................................................................................... 60 4.1.1. Difratometria de raios X .......................................................................................... 60 4.1.2. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho médio com transformada de fourier (FTIR) ............................................................................................................................. 62 4.1.3. Potencial zeta (ζ) ..................................................................................................... 64 4.1.4. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ....................................................... 66 4.1.5. Magnetometria de amostra vibrante (VSM) ............................................................ 69 4.2. Avaliação da concentração de mNP|A. ......................................................................... 70 4.3. Volume de mNP|A .......................................................................................................... 75 4.4. Concentração de anticorpo anti-HLB imobilizado ....................................................... 77 4.5. pH do meio reacional de imobilização de Ac-HLB ....................................................... 80 4.6. Influência de tween 20 ................................................................................................... 82 4.7. Efeito da concentração de glutaraldeído ....................................................................... 85 4.8. Tempo de imobilização de anticorpo ............................................................................. 88 4.9. Tempo de bloqueio ......................................................................................................... 90 4.10. Tempo de incubação Ac-Ag ........................................................................................... 91 4.11. Efeito do pH do meio de incubação entre mNP|A-Ac e Ag pep-OPM ......................... 94 4.12. Diluição de Ac e Ag ........................................................................................................ 96 xvi 4.13. Curva analítica ............................................................................................................... 97 4.14. Descrição do circuito elétrico equivalente (CEE) ....................................................... 100 4.15. Determinação da constante de dissociação Ac-Ag ..................................................... 104 4.16. Estudo da estabilidade de Ac imobilizados sobre mNP|A ........................................... 106 4.17. Aplicação em amostras de extratos vegetais ............................................................... 108 5. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 122 6. REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 124 1 INTRODUÇÃO 1. INTRODUÇÃO 1.1. Aspectos históricos e econômicos da citricultura O termo citros refere-se a todas as espécies pertencentes ao gênero Citrus spp., bem como, os gêneros Poncirus e Fortunella sp. e híbridos destes gêneros também são caracterizados como frutos cítricos. Dessa forma quando o termo for mencionado, caracteriza- se como todas as espécies pertencentes a família das Rutaceae. (LURO et al., 2017; SCORA, 1975) Assim sendo classifica-se como citrus todas as variedades de limões (Citrus limonum), toranja (Citrus máxima), tangerinas (Citrus reticulata) e laranjas (Citrus sinensis). (CITRUSBR, 2021) Devido à forma como foram disseminados os frutos e sementes das espécies que compõem o gênero Citrus, é difícil determinar o local exato de origem destes. No entanto, os primeiros registros datam de cerca 2000 a.C, nos quais o termo “Citruts” foi mencionado na lista de tributos que seriam oferecidos ao Imperador Yu na dinastia Hsia, na atual região da China. Nos dias de hoje, sabe-se que as espécies de citros se originaram nas regiões tropicais e subtropicais do Sudeste Asiático, em uma ampla faixa de terra, situada aproximadamente entre os paralelos 15°N e 25ºN e meridianos 90°E e 115°E. (CITRUSBR, 2021; GMITTER; HU, 1990; LURO et al., 2017; SCORA, 1975) Com o desenvolvendo da humanidade, as plantas de citros foram espalhadas pelo planeta. Nos meados dos anos de 323 a.C, há registros utilizando o termo “Citron” em documentos do Imperador romano Alexandre, O Grande. Nestes documentos relata-se o cultivo de frutas cítricas dentro dos limites de seu império por agrônomos de Roma. Com a queda do império romano e a expansão moura sobre a região do Oriente Médio, Mediterrâneo, Norte da África e Península Ibérica, árvores de laranja azeda (Citrus aurantium) eram descritas por volta 1.150 d.C. como plantas ornamentais e dotada de características extraordinárias. Seu plantio era muito comum nos pátios das casas árabes abastadas, geralmente associada a uma fonte ou a um lago e já eram conhecidas suas propriedades alimentícias e medicinais. (GMITTER; HU, 1990; SCORA, 1975) A chegada dos citros nas Américas se deu por meio de Cristóvão Colombo, em uma de suas expedições no sec. XV. Desta maneira, foram levadas as primeiras frutas para as Antilhas e Haiti que posteriormente foram dispersas. Já era de conhecimento geral que plantas cítricas tinham como objetivo criar um abastecimento de vitamina C, substância que era 2 INTRODUÇÃO utilizada como antídoto do escorbuto, doença que eliminava as tripulações no período das Grandes Navegações. (GMITTER; HU, 1990; SCORA, 1975) A Figura 1 exibe o caminho percorrido pelos citros desde a sua saída da região da China por volta do ano 2000 a.C até sua chegada ao Novo Mundo no século XV. Figura 1: Rota de dispersão de citros pelo mundo. 1) Indochina, 2) Oriente Médio; 3) Norte da África, 4) Península Ibérica, 5) Caribe e 6) Brasil. Fonte: Autoria própria. No Brasil, os primeiros frutos vieram com a colonização portuguesa mais precisamente no ano de 1530 na Bahia. Devido à adaptação geográfica e climática das plantas ao novo continente, os novos habitantes plantavam as árvores de citros nos pomares de suas propriedades onde, por volta de 1800 na cidade de Salvador, foi identificado uma variedade brasileira denominada de laranja Bahia, baiana ou laranja de umbigo, dando assim início a citricultura brasileira. (GMITTER; HU, 1990; RIBEIRO ROSSI; VITALE TORKOMIAN, 2015; SCORA, 1975) A partir deste momento, a laranja Bahia foi amplamente propagada através de mudas enxertadas. Devido a fatores diplomáticos, técnicos norte-americanos em citricultura da cidade de Riverside, no estado da Califórnia, receberam três mudas de laranja Bahia. Este intercâmbio foi fundamental para o início da citricultura nos dois países. (CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MULLER, 1989; RIBEIRO ROSSI; VITALE TORKOMIAN, 2015) Inicialmente o plantio de árvores cítricas tinha apenas caráter doméstico, sendo cultivada em quintais urbanos e rurais para consumo familiar, assim no período preliminar a 3 INTRODUÇÃO evolução da citricultura coincide com os acontecimentos históricos ocorridos no Brasil no período de 1822 a 1889. Neste período houve grandes mudanças na produção agrícola do país, em que a produção de açúcar deu espaço ao café, e no trabalho houve uma substituição da mão de obra escrava pelos imigrantes europeus. (CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MULLER, 1989) As geadas de 1918 e 1929, fizeram com que o cultivo do café diminuísse no Estado de São Paulo possibilitando assim a abertura de espaço para a produção de outras culturas agrícolas, oferecendo condições básicas de infraestrutura operacional e econômico-financeira herdadas da cultura cafeeira. A rota citrícola foi a mesma do café ao longo das principais linhas ferroviárias que cruzavam o estado de São Paulo, fator importante por se tratar de um produto perecível. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989) O crescimento da citricultura paulista foi cessado por uma crise econômica e fitossanitária no final da década 40 e início da década de 50 do século XX, tendo como agravante a II Guerra Mundial, a qual trouxe uma diminuição de 77% das exportações de fruta in natura para a Europa. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; KALATZIS; ALVES; PAULILLO, 1999; MAIA, 1992; MULLER, 1989) Esta baixa nas exportações ocasionou uma diminuição de recursos financeiros dos produtores para manutenção dos pomares. Assim, foi necessário que o governo do estado de São Paulo interferisse no mercado, comprando as laranjas no interior e vendendo na capital, sem objetivo de lucro. Essa ação visava apenas aumentar o consumo das laranjas e tangerinas que se perdiam nos pomares. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989) Como solução, o porta-enxerto de limão cravo (Citrus×limonia) foi a solução encontrada para o combate da Tristeza dos citros, pois este apresenta resistência à disseminação da doença da raiz para a copa das plantas infectadas. Com a retomada dos investimentos no setor no final dos anos 50, houve uma expansão agrícola para as regiões norte e nordeste do estado de São Paulo. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989) Apesar da recuperação dos pomares paulistas e da retomada da produção e exportação citrícola no Brasil, foi também na década de 1950 que entrou em cena um novo personagem, com traços marcantes e duradouros, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, agente do cancro cítrico. Originária da Ásia, essa bactéria causadora de lesões nos frutos, folhas e ramos 4 INTRODUÇÃO entrou no Brasil por meio de mudas trazidas clandestinamente do Japão. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989) Influenciado pelo ritmo de crescimento da população mundial e restabelecimento da economia no período pós II Guerra Mundial, houve um aumento na procura e consumo de frutas pelos países atingidos, assim, elevando os valores pagos por produtos do gênero. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989; RIBEIRO ROSSI; VITALE TORKOMIAN, 2015). Este aumento favoreceu o surgimento, no final dos anos 40 nos USA, das primeiras empresas de produção e/ou exportação de suco concentrado de laranja, consolidando o país como maior produtor de laranjas do mudo no ano de 1960. Entretanto, devido a uma forte geada no natal de 1962 ocorrida na Flórida, principal região produtora de laranja dos USA, houve uma eliminação de 13 milhões de laranjeiras, acarretando uma queda de 50% da produção norte- americana. Em termos numéricos, na safra 1961/1962 a produção foi de 115,878 milhões de galões de suco, enquanto em 1962/1963 caiu para 51,387 milhões, diminuindo assim a oferta no mercado e consequentemente dobrou o valor do galão, de 2,0 a 2,5 para 3,5 a 4,0 dólares. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; MAIA, 1992; MULLER, 1989; RIBEIRO ROSSI; VITALE TORKOMIAN, 2015) A crise na produção norte-americana foi determinante para a abertura de espaço no mercado mundial de suco concentrado. Como o Brasil que estava em uma fase de modernização de sua agricultura, caracterizada justamente pela desarticulação do chamado “complexo rural”, com a constituição dos “complexos agroindustriais”, os quais se dariam através da substituição da economia rural por atividades agrícolas integradas à indústria, pela intensificação da divisão do trabalho e das trocas intersetoriais e com a especialização da produção agrícola, o Brasil foi estimulado a ingressar nesse mercado, tornando-se um dos países que mais se beneficiaram com a crise da produção americana. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; HASSE, 1987; KALATZIS; ALVES; PAULILLO, 1999; MAIA, 1992; MULLER, 1989; RIBEIRO ROSSI; VITALE TORKOMIAN, 2015) Ao longo dos anos 1980 a 1990, houve uma intensificação na demanda externa de suco concentrado de laranja juntamente com a implantação do contrato-padrão entre os citricultores e as indústrias do setor. Devido a conflitos fitossanitários e econômicos houve uma reestruturação da citricultura paulista, proporcionando a criação de associações de produtores e atuação do estado na legislação do setor. Isso refletiu no aumento da qualidade do suco 5 INTRODUÇÃO produzido, passando a ter padrões internacionais denominados de FCOJ (Frozen Concentrated Orange Juice), tornando-se uma comódite. (BORGES; MIRANDA COSTA, 2005; CARVALHO et al., 2019; FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO), 2021; KALATZIS; ALVES; PAULILLO, 1999) Em termos numéricos, (Figura 2), o Brasil produziu 10,7 milhões de toneladas de laranja na safra 2022 (NEVES et al., 2011), estes números refletem 33% da produção mundial de laranja, sendo 53% destinado à produção de suco concentrado e cerca de 85% da produção é exportada. (AGRONEGÓCIO, 2022; COSTA; GUILHOTO; IMORI, 2013; FUNDECITRUS, 2021a) A China produziu 10,6 milhões de toneladas em 2021/2022, sendo a região de Jiangxi a maior produtora do país. Os EUA produziram 5,6 milhões de toneladas, com a Califórnia respondendo por 62% da produção total de citros dos EUA, Flórida 36% e Texas e Arizona produzindo os 2% restantes. (CITRUS INDUSTRY MAGAZINE, 2022) Na União Europeia, a Espanha é o maior produtor de laranjas do continente, com 3,2 milhões de toneladas produzidas no mesmo período. (EUROPEAN COMMISSION, 2022) Figura 2: Classificação dos países produtores de laranja do mundo em milhões de toneladas. Brasil China Índia EUA México Espanha Egito 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 P ro d u çã o e m m il h õ es d e to n el ad as Países produtores de laranja Fonte: (AGRONEGÓCIO, 2022; FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO), 2021; NATIONMASTER, 2022). 6 INTRODUÇÃO Toda a produção brasileira está concentrada no denominado de cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais, região geográfica que engloba 481 municípios e 12 mil fazendas, totalizando uma área plantada de mais de 400 mil hectares. O cinturão citrícola é subdividido em cinco macrorregiões (norte, noroeste, centro, sul e sudoeste), que por sua vez são subdivididas em microrregiões distintas. Na Tabela 1 estão dispostos os valores de produção em milhões de caixas de laranja de cada região e as microrregiões pertencentes a cada uma destas. (CITRUSBR, 2021; FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO), 2021; FUNDECITRUS, 2021b; NATIONMASTER, 2022) Tabela 1: Produção de laranja por região do cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais. Macroregião Microregião Milhões de caixas de laranja Norte Triangulo Mineiro 67,55 Bebedouro Altinópolis Noroeste Votuporanga 21,95 São José do Rio Preto Centro Duartina 70,78 Matão Brotas Sul Porto Ferreira 45,85 Limeira Sudoeste Avaré 56,84 Itapetininga Fonte: (CITRUSBR, 2022; FUNDECITRUS, 2022a). Na safra 2022, os embarques de suco de laranja brasileiro atingiram 658.448 toneladas. Em receita, as exportações somaram US$ 1.067 bilhões, causando uma arrecadação de impostos de US$ 180 milhões e gerando 200 mil empregos diretos e indiretos, de acordo com a Associação Nacional dos Exportadores de Sucos Cítricos (CitrusBR). (CNA, 2022; GROUP, 2022; NEVES, 2018; S.A, 2022) Diante do exposto, observa-se que o Brasil representa uma importante participação na produção mundial de laranja, impactando de forma direta e indireta a economia do país e a vida dos trabalhadores do setor. Como a maior parte desta produção tem como objetivo a exportação para os mercados europeus e norte-americanos, o monitoramento fitossanitário dos pomares é de suma importância, pois as diferentes pragas que acometem as plantações de citros diminuem de forma significativa a produção, acarretando um déficit na quantidade e qualidade da laranja consumida pelo mundo. 7 INTRODUÇÃO 1.2. Pragas que afetam a citricultura As doenças que afetam a citricultura podem ser causadas por diferentes tipos de microrganismos, que podem ser fungos, vírus ou bactérias. Estes dependem de fatores climáticos, geográficos e/ou biológicos para a sua propagação nos pomares, expressão de sintomas para que possam ser identificadas as possíveis doenças. (EL KAHLOUT; ABU- NASER, 2019) Entre as doenças causadas por fungos que afetam a citricultura, destacam-se a Pinta Preta proveniente da infecção com fungo Guignardia citricarpa Kiely (CHUNG; PERES; TIMMER, 2019; TRAN et al., 2017) e a Podridão Floral, ocasionada pelas diferentes espécies de fungos dos complexos Colletotrichum acutatum e C. gloeosporioides, sendo a principal espécie C. abscissum, que pertence ao complexo C. acutatum. (KURAMAE-IZIOKA et al., 1997; TIMMER; PERES, 2015) Em relação a doenças causadas por vírus que atacam de forma significativa a citricultura, ressalta-se a Leprose dos Citros, causada pelo vírus Citrus leprosis vírus (CiLV), classificado como pertencente à família Cilevirus, O CiLV é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis, assim favorecendo a rápida dispersão entre os pomares produtores de citros, as plantas apresentam sintomas iniciais entre 2 a 3 após infecção, sendo os principais o surgimento de lesões arredondadas e lisas nas folhas, de coloração de verde-pálida a amarela, e pode haver ocorrência de anéis necróticos no centro; nos frutos, as lesões geralmente são rasas e necróticas, distribuídas por toda a superfície. Nos frutos verdes, observa-se um halo amarelo em torno da lesão e, à medida que ele amadurece, as lesões se tornam escuras e pouco deprimidas. Ataques intensos provocam a queda dos frutos, principalmente no caso em que as lesões estão próximas ao pedúnculo. (BASSANEZI et al., 2019; KITAJIMA; CHAGAS; RODRIGUES, 2003; LOCALI-FABRIS et al., 2006) A Tristeza dos Citros é ocasionada pelo Citrus tristeza virus (CTV), vírus este que é restrito ao floema das plantas pertence ao gênero Closterovirus. Como meio de propagação, há dois vetores biológicos, o pulgão preto dos citros (Toxoptera citricida) e o piolho do algodão (Aphis gossypii), que se alimentam do floema das plantas cítricas infectadas, assim o vírus permanece retido no trato digestório dos insetos por até 24 a 36 horas, possibilitando a infecção de novas plantas. (BAR-JOSEPH; MARCUS; LEE, 1989; GARNSEY, S. M.; LEE, 1989; 8 INTRODUÇÃO LEON M. et al., 2006; MÜLLER, G.W.; TARGON, M.L.P.N.; CARVALHO, S.A.; SOUZA; RODRIGUES, 2005; NIBLETT et al., 2000) Com relação às infecções por bactérias, destacam-se o Cancro Cítrico, provocada pela Xanthomonas citri subsp. citri, classificada como gram-negativa, e propagada pelas gotículas água contaminadas que são levadas pelo vento que entram em contato com os estômatos das folhas. A entrada da bactéria nas plantas é favorecida pela presença da lagarta minadora dos citros Phyllocnistis citrella, que realiza a abertura de entradas canais nas folhas. A doença Huanglongbing (HLB) é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter americanus (Ca. L. americanus) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. L. asiaticus). (GOTTWALD, 2013; TEIXEIRA et al., 2008a). Também conhecido como “greening”, esta foi identificada pela primeira vez na China, no ano de 1995, o termo huanglongbing significa “doença do ramo amarelo”, devido aos sintomas que as plantas positivas apresentam em suas folhas. (BOVÉ; BARROS, 2006; DA GRAÇA et al., 2016) 1.3. Huanglongbing (HLB) ou greening No ano de 2004 foi confirmado o primeiro caso de HLB, no município de Araraquara/SP, e em cerca de um ano após a identificação do patógeno na região, o "greening" atingiu 47 municípios do estado de São Paulo. Após essa identificação, a doença passou a ser considerada o principal problema fitossanitário dos citros do país. (TEIXEIRA et al., 2008a) Nos EUA o HLB foi reconhecido pela primeira vez em Miami, no estado da Flórida, em 2005; no ano seguinte, a doença já havia contaminado os citros de doze condados da Flórida. A área de plantio na Flórida diminuiu 30% desde o surto da doença em 2005, juntamente com um declínio de 74% na produção. Os danos estimados da doença nos últimos 5 anos somam mais de US$ 1 bilhão por ano, com quase 5.000 empregos perdidos anualmente. Estima-se que 90% a área cultivada e 80% das árvores cítricas na Flórida sejam afetadas pela doença. (DA GRAÇA et al., 2016; LI et al., 2020) No Brasil estima-se que do ano 2005, ano em que teve início o controle oficial do HLB por meio da erradicação de plantas infectadas, até julho de 2011, só no Estado de São Paulo, mais de 12 milhões de árvores de laranja foram erradicadas com sintomas da doença. (BASSANEZI et al., 2011; BASSANEZI, R. B.; LOPES, S. A.; BELASQUE JR.; J.; SPOSITO, M. B.; YAMAMOTO, P. T.; MIRANDA, M. P.; TEIXEIRA, D. C.; WULFF, 2010) Na safra 2020/2021, segundo levantamento realizado pelo FUNDECITRUS, 22,37% das laranjeiras do 9 INTRODUÇÃO cinturão citrícola de São Paulo e Triângulo/Sudoeste Mineiro estão contaminadas com HBL, esse percentual equivale a 41 milhões de árvores. (FUNDECITRUS, 2001, 2021c) O HLB é caudado pela bactéria Candidatus Liberibacter americanus (Ca. L americanus) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca. L. asiaticus), as quais são bactérias do tipo gram-negativas pertencentes a família Rhizobiaceae, possuem morfologia bacilforme com tamanhos entre 2 a 3 µm, Figura 3a. São bactérias restritas ao floema e sua transmissão ocorre pelo psilídeo Diaphorina citri, Figura 3b. Ele adquire a bactéria ao se alimentar nas plantas doentes e a transmite ao se alimentar nas sadias. Tanto a aquisição quanto a transmissão da bactéria ocorrem depois de 15 min de alimentação, mas quanto mais tempo ele se alimenta, maiores são as taxas. (DA GRAÇA et al., 2016; DUAN et al., 2009; FUNDECITRUS, 2019) Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura em vasos do floema de citros com Candidatus Liberibacter asiaticus e b) psilídeo Diaphorina citri. Fonte: (FUNDECITRUS, 2019; TANAKA et al., 2007). O sintoma característico do HBL é a presença de um ou mais ramos com folhas amareladas, quando jovens, e mosqueadas, quando maduradas. O mosqueado se caracteriza por manchas irregulares no limbo foliar, que alternam gradativamente entre o verde e o amarelo, sem simetria entre as duas metades da folha. Em alguns casos, a nervura da folha fica grossa e mais clara (amarelada), podendo também ficar áspera (corticosa), conforme mostrado na Figura 4a. Os frutos apresentam amadurecimento anormal, com tamanho reduzido, exibem manchas amarelas e caem precocemente. Ao cortar o fruto (Figura 4b), é possível verificar internamente filetes alaranjados na columela a partir da região do pedúnculo, sementes abortadas (necrosadas) e o albedo (parte branca da casca) com espessura maior que a de um fruto sadio. Os sintomas podem aparecer de 6 a 12 meses após infecção O suco das frutas doentes tem sabor 10 INTRODUÇÃO mais ácido, menos doce e mais amargo. (DA GRAÇA et al., 2016; DUAN et al., 2009; FUNDECITRUS, 2019) Figura 4: Sintomas típicos do HLB. Em a) ramos e em b) frutos. Fonte: (FUNDECITRUS, 2019). Atualmente são empregadas medidas de controle do HLB em pomares citrícolas, como: a erradicação de plantas ornamentais nos municípios produtores de citros, em especial a murta ou dama da noite (Murraya paniculata) que favoreçam a cópula do inseto vetor; aplicação de defensivos, com a finalidade de contenção do inseto vetor, e após diagnóstico positivo de plantas cítricas, deve-se realizar a eliminação destas dos pomares. (DA GRAÇA et al., 2016; FUNDECITRUS, 2001) A detecção das plantas infectadas com HLB, geralmente, é realizada de forma subjetiva, por meio de observações visuais de um ou mais ramos com folhas amareladas, porém estes sintomas podem ser confundidos com outras doenças como, por exemplo, a Gomose, a Clorose Variegada dos Citros (CVC), ou com alguns dos tipos de deficiência nutricional de 11 INTRODUÇÃO micronutrientes, como zinco, manganês, magnésio ou cobre. Todavia, devem-se considerar também os casos de plantas que estão infectadas, mas no período de incubação da bactéria, 6 a 12 meses, dificultando a detecção e o controle da contaminação na pomar (Bové & Barros, 2006; da Graça et al., 2016; Yamamoto et al., 2014). Deste modo, utiliza-se de técnicas laboratoriais para os diagnóstico das diferentes doenças que acometem as pomars produtoras de citros, viabilizando o monitoramento da propagação das diferentes doenças, facilitando a implementação de medidas de manejo para contenção das mesmas. 1.4. Identificação e detecção de HLB em citros Com o desenvolvimento da biologia molecular e a manipulação de materiais biológicos a partir das ciências ômicas, permitiu-se o avanço de técnicas analíticas de caracterização e quantificação, promovendo o progresso no diagnóstico de doenças patogênicas associadas aos citros. Desta forma, as técnicas utilizadas como ‘padrão ouro’ no diagnóstico de doenças na citricultura são a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e o Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima - ELISA -do ingles “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” A PCR convencional foi desenvolvida por Kary Mullis em 1983, que lhe valeu o prêmio Nobel de química em 1993. A PCR é uma técnica biomolecular que tem como princípio a geração de milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência específica de DNA, partindo de um ou poucos segmentos desta sequência de origem. A reação ocorre em três etapas térmicas distintas de forma cíclica, as quais são desnaturação (94-98°C), alinhamento (50-65°C) e extensão (75°C). A realização de PCR são necessários os seguintes componentes; 1) uma fita de DNA molde que contém uma sequência específica de DNA a ser amplificada (DNA alvo); 2) enzima Taq DNA polimerase, ou Taq polimerase (EC 2.7.7.7), oriunda de bactéria Thermus aquaticus, uma extremófila encontrada em fontes hidrotermais; 3) desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), utilizados como monômeros para construção da nova sequência de DNA gerada; 4) primers, que são sequências de DNA de fita simples, com 15 a 30 nucleotídeos, complementares a região 3’ da sequências alvo, os primers têm como função a sinalização da região inicial da sequência alvo a ser reconhecida pela enzima Taq polimerase; 5) solução tampão adequada para a atividade enzimática da Taq polimerase contendo íons bivalentes utilizados como cofatores enzimáticos, usualmente é utilizado Mg2+. A cada ciclo sucessivo (Figura 5), a sequência alvo inicial mais todas as sequências recém geradas tornam-se modelo para o próximo ciclo de 12 INTRODUÇÃO alongamento, levando à amplificação exponencial da região específica do alvo de DNA. A fórmula usada para calcular o número de cópias de DNA formadas após um determinado número de ciclos é N = N0*2n, em que N0 Número inicial de DNA molde e n é o número de ciclos. Assim, um conjunto de reação para 30 ciclos, com N0 igual a 1 resulta em 240, ou 1,0995x1012 cópias da região original do alvo de cadeia dupla. Figura 5: Ciclos térmicos realizados por PCR. Fonte: Autoria própria. Os resultados obtidos de uma reação de PCR podem ser visualizados empregando técnica de separação eletroforética em gel de agarose e utilizando como corante o brometo de etídio, molécula orgânica intercaladora de dupla hélice das moléculas de DNA que apresenta fluorescência quando irradiada com luz ultravioleta (UV), possibilitando assim a visualização da banda de interesse. Jagoueix et al. (JAGOUEIX; BOVÉ; GARNIER, 1996) descreveram o primeiro protocolo para distinguir Liberobacter asiaticum de Liberobacter africanum para o diagnóstico de HLB em amostras de laranja doce (Citrus sinensis) usando DNA ribossomal (rDNA). Os autores utilizaram primers universais fD1 e rP112 para amplificação geral de 16S rDNA procariótico e iniciadores OI2c e OI1, definidos a partir das sequências 16S rDNA de Ca. L. asiaticus e Ca. L. africanum, os autores definiram 2 primers (OI2c e OI1) e um primer (OA1), respectivamente, para avaliação por PCR. 13 INTRODUÇÃO O par OI1/OI2c amplificou as duas espécies, enquanto o par OI2c/OA1 amplificou preferencialmente L. africanum. Portanto, este procedimento pode ser utilizado para o diagnóstico de HLB em plantas cítricas, independentemente das cepas de Liberobacter presentes na cultura. O trabalho de Jagoueix et al. (JAGOUEIX; BOVÉ; GARNIER, 1996) forneceu um precedente para o uso de rDNA no diagnóstico de doenças dos citros, especialmente HBL. Com o desenvolvimento da instrumentação laboratorial, foi desenvolvido uma nova forma de monitoramento em tempo real das medidas de PCR, a qPCR (PCR quantitativo) ou PCR em Tempo Real (RT-PCR). Nesta técnica há uma combinação da metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. (HEID et al., 1996; RODRÍGUEZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2014; VANGUILDER; VRANA; FREEMAN, 2008) A metodologia permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizadas em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e possibilitando o desenvolvimento de método qualitativo e quantitativo para a detecção de sequências alvos de DNA. (HEID et al., 1996; RODRÍGUEZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2014; VANGUILDER; VRANA; FREEMAN, 2008) Os métodos mais comuns de detecção no qPCR são o uso de corantes fluorescentes que se ligam a DNA de dupla fita, destaca-se como corante mais utilizado o SYBR Green I (SG), ou sondas hidrolisantes específicas a certas sequências de DNA, a mais empregada é a TaqMan. (RODRÍGUEZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2014; TAJADINI; PANJEHPOUR; JAVANMARD, 2014; VANGUILDER; VRANA; FREEMAN, 2008) Os dados quantitativos de qPCR podem ser analisados de forma absoluta ou relativa. Na quantificação absoluta, o número total de cópias do produto do PCR é obtido após interpolação em curva padrão previamente estabelecida. (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; RODRÍGUEZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2014). Para avalição da quantificação relativa, o sinal da sequência de interesse é comparado com o de um sinal controle. Para este método, mede-se o valor de Ct, que é o número do ciclo em que o sinal de fluorescência emitido durante o qPCR atinge um limiar significantemente acima da fluorescência de fundo. Assim, menores valores de Ct indicam maiores níveis de expressão, pois são necessários menos ciclos de amplificação para atingir o limiar. (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; RODRÍGUEZ-LÁZARO; HERNÁNDEZ, 2014; VANGUILDER; VRANA; FREEMAN, 2008) Assim, o diagnóstico laboratorial mais utilizado na detecção e 14 INTRODUÇÃO quantificação de HLB é o teste biomolecular de qPCR. (BOINA; BLOOMQUIST, 2015; DING et al., 2016; TEIXEIRA et al., 2008b) Morgan e colaboradores (MORGAN et al., 2012) descrevem em seu trabalho o uso de repetições intragênicas quase idênticas de genes de profagos para Ca. L. asiaticus, o gene LJ900, que foram monitorados utilizando qPCR por sonda TaqMan(®) e marcador SYBR Green. Os autores exibiram valores de Ct obitidos de 3,71 utilizando sonda sonda TaqMan(®) e 9,88 para marcador SYBR Green. Desta forma foi possível detectar Ca. L. asiaticus a partir de amostras de psilídeos e diferentes variedades de plantas cítricas sugerindo novo método de detecção de HLB. (MORGAN et al., 2012) Morgan e colaboradores (WULFF et al., 2019) analisaram HLB em 226 amostras de citros oriundas de diferentes cidades do cinturão citrícula São Paulo e Minas Gerais. Dado o número total de amostras analisadas, podemos dizer que a incidência de amostras infectadas com fitoplasma 16SrIII é de 0,23%. Para efeito de comparação, Ca. L. asiaticus é detectado em uma média de 75,3% das amostras analisadas. Para tal avaliação empregou-se o par de primers Pint_fw_III e Pint_rv_III em sistema de detecçao qPCR utilizando sonda TaqMan(®). (WULFF et al., 2019) Outro método importante para o diagnóstico da doença dos citros é baseado na reação anticorpo-antígeno, a técnica de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). O teste ELISA foi desenvolvido por Peter Perlmann e Eva Engvall no ano de 1971 e baseado na interação antígeno-anticorpo (Ag-Ab) com a finalidade de quantificar um antígeno, molécula alvo, de interesse que pode ser um composto orgânico, um peptídeo, uma proteína, um vírus ou uma bactéria. (ENGVALL; JONSSON; PERLMANN, 1971; LINDENMANN, 1984; TAYLOR; SHI; BARR, 2011) Os anticorpos (Ac) são glico-proteínas de conformação globulinas, imunoglobulinas (Ig) que apresentam em geral um peso molecular de ~150 kDa. Existem diferentes tipos de anticorpos, chamados isótipos, diferenciados pela forma da cadeia pesada que apresentem que são: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Cada isótipo desempenha funções diferentes em mamíferos de onde são produzidos, contribuindo para dirigir a resposta imunitária conforme cada tipo de corpo estranho que encontram. (BOGUSZEWSKA et al., 2019; ENGVALL; JONSSON; PERLMANN, 1971; TAYLOR; SHI; BARR, 2011). Na Figura 6 está representada a Ig do tipo G (IgG). Estas globulinas são produzidas por linfócitos B e reagem de forma específica ao antígeno (Ag) que induziu a sua produção. Os Ac apresentam estrutura na forma “Y” e uma região constante pesada (Fc) e duas cadeias variáveis (Fab). São formados por duas cadeias 15 INTRODUÇÃO maiores (cadeias pesadas, H, “heavy”) e duas cadeias menores (cadeias leves, L, “light”), sendo duas regiões constantes CH e CL, e duas regiões variáveis VH e VL, as que são denominadas de paratopo, onde ocorre o bioreconhecimento do epítopo e formação do complexo Ag-Ac. A cadeia leve se liga à cadeia pesada por pontes dissulfeto. (LINDENMANN, 1984; LITMAN et al., 1993; TAYLOR; SHI; BARR, 2011) Figura 6: Representação de molécula de imunoglobulina IgG. Fonte: Autoria própria. Existem quatro tipos principais de ELISAs: direto, indireto, sanduíche e competitivo. Cada tipo é descrito abaixo com um diagrama que ilustra como os analitos e anticorpos são ligados e usados, Figura 7. As análises são realizadas em espectrofotômetro ou fluorímetro, a depender do tipo de marcação empregada. (BOGUSZEWSKA et al., 2019; TAYLOR; SHI; BARR, 2011) 16 INTRODUÇÃO Figura 7: Tipos de ELISA. a) direto; b) indireto; c) sanduíche e d) competitivo Fonte: Autoria própria. Diante de todos os problemas que o HLB tem causado na citricultura, Pagliaccia e colaboradores (PAGLIACCIA et al., 2017), usaram a proteína efetora SDE1 secretada por Ca. L. asiaticus, como marcador de detecção de árvores infectadas com HLB. Os autores inocularam e purificaram anticorpo policlonal a partir de soro de coelho por cromatografia de afinidade seguida da avaliação de sua afinidade para o reconhecimento do antígeno SDE1 por ELISA indireto. Proteínas SDE1 purificadas foram adicionadas a extratos saudáveis de floema de plntas de toranja (Citrus × paradisie) e laranja doce (Citrus × sinensis). (PAGLIACCIA et al., 2017). Experimentos de ELISA indireto foram realizados com extratos proteicos de tecidos de árvores assintomáticas e sintomáticas, em ambos os casos das mesmas árvores sabidamente infectadas por Ca. L. asiaticus. Quatro árvores deram sinais positivos que foram estatisticamente significativos (p < 0,001), em comparação com o tecido saudável. As amostras assintomáticas testaram negativo por qPCR, provavelmente devido à ampla distribuição de SDE1, em comparação com células Ca. L. asiaticus, nos citros infectados analisados. Os autores demonstraram a viabilidade do uso de SDE1 como biomarcador para a detecção de HLB em extratos vegetais. (PAGLIACCIA et al., 2017) O gene omp, codifica uma proteína de membrana externa (OMP), foi considerado o candidato mais promissor para estudar a variabilidade inter e intraespécies. Tal proteina 17 INTRODUÇÃO participa de trocas entre meio externo e interno, e em alguns casos, pode estar envolvida na patogenicidade do microorganismo, atuando assim como um antígeno na detecção de HLB em citros. No entanto, esse tipo de proteína possui uma estrutura muito complexa, dificultando sua expressão em Escherichia coli. (RUIZ; SILHAVY, 2005) Lu e colaboradores, (LU et al., 2013) propuseram dois anticorpos policlonais para a proteína Omp com o auxílio de análises de bioinformática. Esses anticorpos Omp foram usados para detectar cepas de Ca. L. asiaticus em diferentes amostras de citros infectadas com diferentes patógenos e/ou deficiência nutricional, sintomas que levam à confusão na identificação do HLB no campo, assim possibilitanto melhora nas abordagens atuais para diagnosticar o HLB. Os pesquisadores compararam a resposta obtida por ELISA indireto e PCR, na detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus em amostras de citros. Foram avaliadas 481 amostras de diferentes espécies do gênero citros de 18 origens geográficas diferentes. Os anticorpos desenvolvido por Lu e colaboradores foram capazes de detectar “Ca. L. asiaticus” em 45,7% das amostras sintomáticas avaliadas, e os resultados da detecção foram corroborados pelo ensaio de PCR, que detectou Ca. L. asiaticus em 56,2% das amostras sintomáticas. Assim, os autores propõem os anticorpos desenvolvidos como teste diagnóstico para HLB em amostras de extratos vegetais. As técnicas biomoleculares empregadas no diagnóstico de HLB em citros, apesar de apresentarem baixos limites de detecção e dependendo das condições experimentais uma especificidade adequada, estas por sua vez requerem laboratórios equipados e mão de obra altamente qualificada, gerando um alto custo operacional para a cadeia citricultora. Nesse sentido, novos métodos de diagnóstico como os biossensores podem ser uma opção viável, visto que são dispositivos muito sensíveis, com baixo custo de análise, permitindo miniaturização e uso em campo. Na Figura 8 são exibidos os números de publicações obtidos em uma busca no site Science Direct empregando as palavras-chave; " citrus diseases diagnostic PCR ", " citrus diseases diagnostic ELISA " e " citrus diseases diagnostic electrochemical biosensors " no período de 2012 a 2022. 18 INTRODUÇÃO Figura 8: Número de publicações exibidas em uma pesquisa no site Science Direct. Palavras-chave empregadas: "citrus diseases diagnostic PCR", "citrus diseases diagnostic ELISA" e "citrus diseases diagnostic electrochemical biosensors". 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022 0 20 40 60 80 100 120 140 N ú m er o d e p u b li ca çõ es Ano PCR ELISA Biossensor eletroquímico Fonte: Autoria própria. A Figura 8 indica um número considerável de publicações (período 2012-2022) na plataforma envolvendo o diagnóstico de doenças em citros com predominância da utilização da técnica de PCR e crescente o número de publicações envolvendo biossensores eletroquímicos. Nesse caso, salta de 5 artigos em 2012 para 60 no ano de 2022. Nesta tese desenvolveu-se um imunossensor impedimétrico para detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus em citros. Resumidamente, foram sintetizadas nanopartículas magnéticas que foram modificadas para imobilizar anticorpo anti proteína OMP. As amostras de folhas de citros, que se estiverem contaminadas contém o antígeno pep-OMP, foram devidamente preparadas, e colocadas em contato com o anticorpo imobilizado. Com auxílio de imã, as nanopartículas magnéticas são separadas da suspensão da amostra, lavadas adequadamente, colocadas sobre eletrodo de carbono vítreo contendo em seu interior o imã de neodímio para então efetuar as medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica. A seguir são apresentados conceitos importantes empregados no desenvolvimento do dispositivo. 19 INTRODUÇÃO 1.5. Biossensores: definições e propriedade A União Internacional de Química Pura e Aplicada “International Union of Pure and Applied Chemistry” - (IUPAC) define biossensores como dispositivos analíticos constituídos por um elemento de reconhecimento biológico, acoplado a um transdutor que transforma o sinal resultante da interação do analito com o elemento biológico em um sinal físico mensurável e um amplificador de sinal responsável pela leitura e processamento eletrônico da medição. Dependendo do analito, o elemento de reconhecimento pode ser uma enzima, um anticorpo, um antígeno, uma proteína, uma organela ou uma célula inteira, Figura 9. (HAMMOND et al., 2016; THÉVENOT et al., 2001) Os biossensores podem ser classificados quanto ao transdutor utilizado, sendo mais comuns os ópticos que relacionam alterações do acoplamento de onda evanescente com os plásmons de superfície, piezelétricos que avaliam a variação de oscilação do cristal de quartzo com a massa adsorvida sobre ele e os eletroquímicos utilizam das propriedades elétricas da interface eletrodo/solução. Figura 9: Representação geral de biossensores. Fonte: Autoria própria. O primeiro biossensor eletroquímico foi desenvolvido por Clark e Lyons em 1962 e era conhecido como eletrodo enzimático. (CLARK; LYONS, 1962) Esse biossensor utilizava a glicose oxidase imobilizada em uma membrana de acrilamida, em eletrodos de Pt e detectava o consumo de oxigênio sob altos potenciais de redução. Assim, quantificou-se a variação da concentração de oxigênio dissolvido que, por sua vez, era proporcional à concentração de glicose. (CLARK; LYONS, 1962; UPDIKE; HICKS, 1967) 20 INTRODUÇÃO Estes dispositivos devem apresentar algumas caraterísticas ideais, as quais estão destacadas na Tabela 2, no entanto, não há dispositivo que apresente máxima eficiência em todas estas características. Isso se dá devido as diferentes matrizes avaliadas, desta maneira cabe ao desenvolvedor a avaliação de qual destas características apresentam maior relevância na aplicação do biossensor desenvolvido. Tabela 2: Características ideais de um biossensor. Características Definição Sensibilidade Um pequeno incremento na concentração do analito causa grande variação no valor do sinal analítico medido aferido. Seletividade Discriminação entre o analito e as demais espécies químicas presentes na amostra relacionadas, minimizando análises falso-positivos. Reprodutibilidade O dispositivo desenvolvido deve apresentar pequenas variações de sinal em relação as diferentes vezes que este foi preparado. Precisão O dispositivo deve exibir pequena variação de sinal entre as replicatas realizadas em uma mesma análise. Robustez O biossensor deve ser insensível às condições ambientais (temperatura, pH, interferências eletrônicas, e outros). Tempo de análise Análises rápidas, com respostas para o analito alvo em "tempo real". Detecção de multianalítos Um biossensor que possa detectar vários analitos simultaneamente, é altamente desejável. Regeneração A capacidade de regeneração da superfície de ligação, permitindo múltiplas medições pelo mesmo elemento é ideal. Custo unitário e operacional Baixo custo unitário e operacional para reagentes e outros materiais, permitindo uma aplicação mais ampla do sistema do dispositivo. Tamanho e peso Possibilidade de miniaturização. Interface com o usuário Idealmente, são desejados sistemas totalmente automatizados, ou que exigem pouco conhecimento e habilidades do operador Fonte: (BHALLA et al., 2016; THÉVENOT et al., 2001) Os principais campos de aplicação dos biossensores são: diagnóstico de doenças (BRAZACA et al., 2020; RAVALLI et al., 2015; SANTOS; BUENO; DAVIS, 2018; TRICOLI; NERI, 2018), segurança alimentar (FOGUEL et al., 2016; MOHAMMAD DANESH et al., 2016; ZHANG et al., 2021, 2020), monitoramento ambiental (FURST; HOEPKER; FRANCIS, 2017; KUMAR; KUMARI; SHARMA, 2020; LEONARDO; TOLDRÀ; CAMPÀS, 2021; YANG et al., 2015) e agricultura (COPPEDÈ et al., 2017; FREITAS et al., 2019a; KRIVITSKY et al., 2021; ZHAO et al., 2020) Entre os diversos tipos de biossensores eletroquímicos, os imunossensores constituem uma categoria de dispositivos que dispõe de uma atenção especial, pois estes apresentam eficiência adequada em basicamente todas as características dispostas na Tabela 2, devido à grande afinidade da interação antígeno-anticorpo, tornando-se possível o desenvolvimento de 21 INTRODUÇÃO sensores bastante seletivos com aplicações em diferentes matrizes. (BARHOUM; J. FORSTER, 2022; BOFFADOSSI et al., 2020; MARTINS et al., 2021; OU et al., 2023; REGIART et al., 2020) Por definição, um imunossensor é um dispositivo sensorial constituído por um anticorpo ou antígeno acoplado a superfície de um transdutor físico, o qual converte o sinal biológico de imunoafinidade em um sinal físico mensurável. (FELIX; ANGNES, 2018; YAMANAKA et al., 2009) A imobilização e organização de anticorpos sobre a superfície dos eletrodos pode ser realizada por vias distintas, sendo estas não covalente ou covalente. A via não covalente utiliza de caraterísticas inerentes dos anticorpos e/ou da superfície a qual estes irão ser acoplados. Desta forma, ocorre a adsorção de forma aleatória dos anticorpos sobre a superfície dos transdutores por meio de interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio ou por forças de Van der Waals. (FELIX; ANGNES, 2018). A utilização desta via para o desenvolvimento de um imunossensor tem como vantagem a reprodutibilidade e simplicidade do método de imobilização, possibilitando a realização da fabricação em série dos dispostos e a preservação da atividade e seletividade da biomolécula. (FELIX; ANGNES, 2018; GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022; YAMANAKA et al., 2009) Estes tipos de interações são reversíveis e podem ser facilmente alteradas pela mudança da temperatura, força iônica do meio ou pH. Assim, favorecendo a renovação da superfície transdutora, possibilitando a reutilização da mesma e diminuindo os custos no desenvolvimento do dispositivo. Todavia, o excesso de material biológico depositado pode formar múltiplas chamadas e bloquear a superfície do transdutor, atuando como uma membrana difusional. (FELIX; ANGNES, 2018; GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022; YAMANAKA et al., 2009) Outra desvantagem da utilização de imobilizações não covalente é que no caso dos anticorpos, a porção Fab não se encontra organizada de forma que ocorra a máxima eficiência no reconhecimento do antígeno, diminuindo a sensibilidade e detectabilidade do imunossensor. Em virtude disto, pode-se utilizar Proteína A de Staphylococcus aureus e/ou Proteína G de Streptococcus como direcionadores na imobilização doa anticorpos, devido à sua capacidade de adsorver seletivamente a região Fc dos anticorpos entre os domínios CH2 e CH3 e não interferir na especificidade da biomolécula pelo antígeno após o processo de adsorção. (GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022; PRIETO-SIMÓN; SAINT; VOELCKER, 2014; YAMANAKA et al., 2009) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?name=Streptococcus+sp.+group+G&rn=1 22 INTRODUÇÃO A construção de imunossensores via imobilização covalente pode ser realizada de diferentes maneiras. Uma destas maneiras é a formação de monocamadas auto-organizadas, do inglês “self-assembled monolayers” – SAM. Estas podem ser construídas pela da afinidade inerentemente forte em grupos tióis por Au, Au-SH, utilizando como ligantes moléculas orgânicas bifuncionais (HS-R-NH2, HS-R-COOH) altamente organizadas sobre a superfície do eletrodo. (FELIX; ANGNES, 2018; GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022; YAMANAKA et al., 2009) Porém, a formação de SAM não é restrita apenas a superfícies de Au, é possível realizar este tipo de modificação sobre superfícies de carbono, possibilitado a construção destas estruturas pela formação de uma ligação covalente entre molécula de diaminoalcano (NH2- (CnH2n+2)-NH2) e o carbono por meio de uma eletrooxidação. (GAO; GUISÁN; ROCHA- MARTIN, 2022; PRIETO-SIMÓN; SAINT; VOELCKER, 2014) Outra maneira de construção de inunossensores eletroquímicos é a utilização de nanomateriais como plataforma para a imobilização de forma covalente sobre a superfície dos eletrodos. A nanotecnologia é um assunto em pleno desenvolvimento e refere-se à ciência e tecnologia de projetar, construir, manipular e entender materiais e sistemas em nanoescala (variação de tamanho de aproximadamente 1 a 100 nm), o que levou a muitas aplicações abrangentes em uma miríade de áreas, como na saú