Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Juliana Feltrin de Souza EFEITO  DA  AMOXICILINA  E  DO   FLUORETO  NO  DESENVOLVIMENTO  DO   ESMALTE  DENTÁRIO  DE  RATOS Araraquara 2013 ! Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Juliana Feltrin de Souza EFEITO DA AMOXICILINA E DO FLUORETO NO DESENVOLVIMENTO DO ESMALTE DENTÁRIO DE RATOS Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas - Área de Odontopediatria, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutor em Ciências Odontológicas. Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cássia Loiola Cordeiro Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri ARARAQUARA 2013 ! Souza, Juliana Feltrin de Efeito da amoxicilina e do fluoreto no desenvolvimento do esmalte de ratos / Juliana Feltrin de Souza.-- Araraquara: [s.n.], 2013. 108 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientador: Profa. Dra. Rita de Cássia Loiola Cordeiro 1. Esmalte dentário 2. Amelogênese 3. Hipoplasia do esmalte dentário 4. Amoxicilina 5. Fluoreto de sódio 6. Ratos I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646 Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP Juliana Feltrin de Souza Efeito da amoxicilina e do fluoreto e no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos Presidente e Orientador: Profª. Drª. Rita de Cassia Loiola Cordeiro (FOAr-UNESP) 1o Examinador: Profª. Drª. Lourdes dos Santos-Pinto (FOAr-UNESP) 2o Examinador: Profª. Drª. Ângela Cristina Cilense Zuanon (FOAr-UNESP) 3o Examinador: Profª Drª. Soraya Leal (UNB) 4o Examinador: Prof. Dr. Victor Arana- Chaves (Universidade de São Paulo) DADOS CURRICULARES JULIANA FELTRIN DE SOUZA Nascimento: 15/04/1986 – Rio Claro/ SP Filiação: Odair Apolinário de Souza e Célia Maria Feltrin de Souza FORMAÇÃO ACADÊMICA 2004-2007: Curso de Graduação Faculdade de Odontologia de Araraquara Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” 2008-2010: Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Área de Concentração em Odontopediatria, nível Mestrado, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2010-2013: Curso de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Área de Concentração em Odontopediatria, nível Doutorado, Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP Dedicatórias Dedicatórias Dedico este trabalho ... Primeiramente, a Deus, pelo dom da vida, por ser tão generoso comigo, pela família que tenho, e pelos amigos que colocou em minha vida. Agradeço-te Senhor, por sustentar-me diante dos momentos difíceis, fortalecendo-me e confortando meu coração diante dos obstáculos. Agradeço-te pela benignidade e paz em minha vida. Por guiar meus passos nos momentos decisivos, e pelas oportunidades que tem me dado. Dedicatórias Ao meu querido esposo Thiago, Pelo incentivo constante, por acreditar em mim e em meus objetivos. Agradeço pelo apoio emocional e pelas palavras positivas que me fazem seguir em frente. Agradeço pelo companheirismo, amizade e por sempre cuidar de mim. Por compreender os momentos de ausência, pelo amor, dedicação e por se fazer sempre presente. Te amo! Aos meus amados pais, Célia e Odair, Dedico este trabalho a vocês, que com amor incondicional sempre me incentivaram, apoiaram e proporcionaram meios para eu alcançar meus sonhos. Agradeço por transmitir os verdadeiros valores de vida, sendo exemplos de caráter, humildade, honestidade, dignidade e amor. Agradeço a confiança que sempre depositaram em mim, e a presença constante em minha vida. Amo vocês. Aos meus irmão Junior e minha cunhada Elisângela, Agradeço pelo amor fraterno, amizade, companheirismo e união mesmo que à distância. À Elisangela, és a irmã que Deus me deu, muito obrigada pela amizade, carinho e apoio. Agradeço a vocês por ajudarem sempre que precisei. Ao pequeno Théo, agradeço por preencher nossos dias de alegria, tornando nossas vidas mais leves. Dedicatórias Ao meu Co-orientador, Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri, Agradeço imensamente por abrir as portas do seu laboratório, e me sinto feliz por tê- lo como co-orientador, e por todo apoio que me dispensa, pelos ensinamentos, pela paciência em ensinar as técnicas e o estudo em animais. Agradeço por participar ativamente em todas as fases desse estudo e pelo convívio harmonioso. Por me confortar e transmitir segurança durante a realização dessa pesquisa. Por me incentivar e motivar ao aprimoramento. Parabenizo-te pelo caráter e dedicação no exercício da docência e da pesquisa, e pela valorização dos seus alunos. A minha querida orientadora Profª. Drª. Rita de Cássia Loiola Cordeiro Agradeço Tia Rita pela pessoa que és, e me sinto feliz em tê-la como orientadora, pela confiança que sempre depositou em mim, pelo constante incentivo e apoio desde o mestrado. Por me ensinar tanto com suas experiências pessoais e profissionais. Por apoiar na realização desta e de outras pesquisas. Pelas palavras que sempre me confortaram e me incentivaram, e por dispor de meios para que eu alcançasse meus objetivos. Muito obrigada pela sua valiosa orientação, que foi fundamental para minha formação acadêmica, pelo exemplo de humanismo e generosidade. Agradeço pela amizade, pelo convívio harmônico e alegre, por sua dedicação na minha formação durante esses anos. Agradecimentos Especiais Agradecimentos Especiais Aos professores da Disciplina de Odontopediatria, Profª. Drª. Lourdes dos Santos-Pinto, Profª. Drª. Rita de Cássia Loiola Cordeiro, Profª. Drª. Angela Cristina Cilense Zuanon, Prof. Dr. Cyneu Aguiar Pansani, Profª. Drª. Josimeri Hebling Costa, Profª. Drª. Elisa Maria Aparecida Giro, Prof. Dr. Fábio César Braga de Abreu e Lima, Profª. Drª. Fernanda Lourenção Brighenti pela dedicação que dispensaram em minha formação, por ensinar o exercício da Odontopediatria. À Profª. Drª. Lourdes dos Santos-Pinto, pelo apoio durante esses anos de pós-graduação, obrigada pelo incentivo, pelas oportunidades oferecidas, pela amizade, por nos ensinar com suas experiências profissionais, e pelo tempo dispensado em valiosas discussões. Aos professores da Disciplina de Histologia e Embriologia, Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri, Profª. Drª. Estela Sasso Cerri, Prof. Dr. Breno Henrique Caneguim por todo suporte e assistência prestados no desenvolvimento dessa pesquisa, pela amizade e convívio harmonioso. As professoras da Profa. Dra. Sato Alaluusua e a Profa. Dra. Carin Sahlberg, agradeço o apoio para realização dessa pesquisa, a troca de experiência cientifica, a recepção e hospitalidade durante meu estágio na Universidade de Helsinque. Agradeço por esta oportunidade. Agradecimentos Especiais Aos Professores Jayme A. Cury e Lívia M. Tenuta, da Universidade de Campinas, agradeço por ter aberto as portas do laboratório de Bioquímica realização desse estudo, dispor de técnicos e meios para a realização dos experimentos, pela colaboração nesse estudo. Ao meus orientadores de iniciação científica, Profª. Drª. Cinara Maria Camparis, Profª. Drª. Ana Lúcia Machado e Prof. Dr. Paulo Bolini, agradeço por despertar em mim o interesse pela pesquisa, pelo incentivo para seguir a carreira acadêmica. À Profª. Drª. Cinara, agradeço a amizade, os conselhos, por acreditar em meu potencial. Ao Grupo de Estudos da Hipomineralização Molar-Incisivo, Profª. Drª. Lourdes dos Santos-Pinto, Profª. Drª. Rita de Cássia Loiola Cordeiro, Profª. Drª. Angela Cristina Cilense Zuanon, Cristiane Maria Costa Silva, Camila Bullio Fragelli, Fabiano Jeremias, Marco Aurélio Benini Paschoal, Manuel Restrepo. Agradeço pela oportunidade do trabalho em equipe, juntos compartilhamos não apenas trabalhos científicos, trocamos experiência pessoais e profissionais, aprendemos muitos, e tudo isso foi fundamental para meu crescimento acadêmico e abriu portas para muitas oportunidades profissionais. A vocês Fabiano Jeremias, Camila Maria Fragelli, Manuel Restrepo, Diego Girotto e Marco Benini, muito obrigado pela amizade fraternal e trabalho em equipe. Agradeço a convivência diária, pelo incentivo mútuo. Agradecimentos Especiais Aos amigos do Laboratório de Histologia e Embriologia Priscila Oliveira, Breno Henrique Caneguim, Flávia Beltrame, Guilherme Ferreira da Silva, Rafael Ferino e Tiago Fonseca, agradeço a amizade fraternal, incentivo mútuo, trabalho em equipe, a paciência em ensinar e pela convivência alegre, muito obrigada pela ajuda de vocês e carinho. Aos queridos amigos da pós-graduação, curso de doutorado, Débora Salles, Fabiano Jeremias, Marco Benini, Letícia Lemos, Marcia Tanaka, Sandra Palomiro e Marília Correia, pela amizade, apoio, e pelo convívio agradável ao longo de todo esse período. Às queridas amigas, Gisele Amaral, Elcilaine Azevedo, Natália Aguiar, Sarah Sakima, Ana Lívia Cornélio, Chaine Pavone, Guiga Alves e Hérica Ricci, muito obrigada pelo apoio, companheirismo, carinho e por tornar meus dias mais agradáveis. À Gisele, muito obrigada por sua hospitalidade e apoio no período final do curso de doutorado. Amo vocês. À Marina Gramasco (aluno de graduação), Agradeço imensamente sua participação nesse estudo, sua colaboração foi fundamental para realização desse trabalho. Agradeço por se dispor a me ajudar com os animais, independente do horário, tratando-os com carinho. Muito obrigada! Agradecimentos Especiais A Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, na pessoa de seu Magnífico Reitor Prof. Dr. Julio Cezar Durigan e Vice- Reitora, Profa. Dra. Marilza Vieira Cunha Rudge. A Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP, na pessoa de seu Diretor Profª. Drª. Andreia Affonso Barreto Montandon e seu vice-Diretor Profª. Drª. Elaine Maria Sgavioli Massucato. Ao Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr, representado pelo chefe Profa. Dra. Lídia Parsekian Martins e pelo Vice-Chefe Prof. Dr. Fábio Cesar Braga de Abreu e Lima. Ao Departamento de Morfologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara – FOAr, representado pelo chefe Profa. Dra. Ana Maria Minarelli Gaspar e pelo Vice-Chefe Prof. Dr. Paulo Sérgio Cerri. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas coordenado pelo Prof. Dr. Osmir Batista de Oliveira Junior (coordenador) e pela Profª. Drª. Lídia Parsekian Martins (vice-coordenadora). Aos professores da Disciplina de Ortodontia, Prof. Dr. Ary dos Santos-Pinto, Prof. Dr. Dirceu Barnabé Ravelli, Prof. Dr. João Roberto Agradecimentos Especiais Gonçalves, Profª. Drª. Lídia Parsekian Martins, Prof. Dr. Luiz Gonzaga Gandini Junior e Prof. Dr. Maurício Tatsuei Sakima. Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, Adriano Ferreira Luiz, Ceres Maria Carvalho Galvão de Freitas, Maria Inês Carlos, Silvia Helena Acquarone Lavras, por estarem sempre dispostos a nos ajudar. Em especial à Maria Helena Matsumoto Komasti Leves, pelo auxílio na formatação desse trabalho, e Marley Cristina Chiusoli Montagnoli, pela elaboração da ficha catalográfica. Aos funcionários do Departamento de Clínica Infantil, Antônio Parciaseppe Cabrini, Dulce Helena de Oliveira, Sônia Maria Tircailo, Odete Amaral, Marcia Elena Carvalho Held, Cristina Ferreira Affonso, Pedro César Alves, Diego Cardoso Pendenza, Regina Aparecida Favarin e Tânia Ap. Moreira dos Santos, pela assistência e atenção em todos esses anos de pós-graduação. Aos funcionários da Disciplina de Histologia e Embriologia, Luis Antônio Potenza e Pedro Sérgio Simões por todo suporte e assistência prestados no desenvolvimento dessa pesquisa. Agradecimentos Especiais Aos funcionários da Seção de Pós-graduação, Mara Candida Munhoz do Amaral, José Alexandre Garcia e Mauricio Fernando Pioto Casellato, pelo apoio, atenção prestada, paciência e carinho que sempre me dispensaram. A todos os meus familiares, agradeço a presença constante, os sábios conselhos, os momentos alegres, e por sempre torcer por minhas conquistas. Aos colegas do curso de pós-graduação em Ciências Odontológicas - Área Odontopediatria, pelas experiências compartilhadas e pelo incentivo. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro fundamental para a realização e divulgação de todo o estudo. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida para realização desse curso de doutorado. Muito obrigada a todos que contribuíram para a realização deste trabalho. Resumo Resumo Souza JF. Efeito da amoxicilina e do fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2013. Resumo O uso da amoxicilina durante a primeira infância tem sido relacionado ao desenvolvimento de defeitos de esmalte denominados Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI). Ademais, há relatos de possível potencialização dos efeitos do fluoreto no esmalte pela amoxicilina. Objetivo: A proposta do presente estudo foi avaliar o efeito da amoxicilina, e da associação amoxicilina com fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos. Metodologia: O experimento foi dividido em três capítulos. Capítulo 1 - Quinze ratas prenhas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman) foram aleatoriamente distribuídas em três grupos que receberam, a cada 24 h, dose intragástrica de amoxicilina 100 mg/kg/dia (grupo GA100), amoxicilina 500 mg/kg/dia (grupo GA500) ou soro fisiológico (grupo GS), a partir do 130 dia de prenhez. Após o nascimento, doze filhotes de cada grupo receberam o mesmo tratamento das respectivas mães durante os períodos de 7 dias (n=6) e 12 dias (n=6) de vida. Após a eutanásia, as cabeças dos ratos foram removidas, fixadas e processadas para inclusão em parafina. Os cortes frontais da cabeça exibindo os primeiros molares superiores foram em parte corados com H&E e em parte submetidos à reação imuno-histoquímica para detecção de amelogenina e metaloproteinases da matriz-20 (MMP-20). Os cortes corados com H&E foram utilizados para análise morfológica e mensuração da espessura da camada de esmalte. A imunoexpressão para amelogenina e MMP-20 foram avaliados por análise semi- quantitativa (H-score). Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste Tukey com nível de significância de 5%. Capítulo 2 - Quinze ratas prenhas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman) foram aleatoriamente distribuídas em três grupos, que receberam, amoxicilina 100 mg/kg/dia (grupo GA100), amoxicilina 500 mg/kg/dia (grupo GA500) ou soro fisiológico (grupo GS), conforme descrito no capítulo 1. Após o nascimento, dez filhotes por grupo receberam o mesmo tratamento do 10 ao 400 dia de vida. Aos 40 dias, os animais sofreram eutanásia, os incisivos e molares foram extraídos, e submetidos às análise do conteúdo de cálcio, pelo método de titulação com EDTA, de fósforo por método colorimétrico usando espectrofotômetro. E a densidade eletrônica do esmalte nos Resumo primeiros molares foi analisada pela tomografia micro-computadorizada (XRM). Capítulo 3 - Quarenta ratos foram distribuídos, aleatoriamente, em quatro grupos, expostos ao fluoreto na água (100 ppm (mg F/L) ou à administração intragástrica de amoxicilina (500 mg/Kg peso), segundo as combinações: grupo controle (GS); grupo amoxicilina (GA), grupo fluoreto (GF) e grupo amoxicilina com fluoreto (GA+F). Após 60 dias, amostras de plasma e uma tíbia foram coletados e analisados quanto a concentração de fluoreto por meio de eletrodo de íon seletivo. Os incisivos foram submetidos à quantificação do grau de fluorose (por um software de análise de imagens, Dental fluorosis by Image Analysis – DFIA), a análise de conteúdo de cálcio, pelo método de titulação com EDTA, de fósforo por método colorimétrico usando espectrofotômetro, e determinações da espessura do esmalte e de sua microdureza. Resultados: Capítulo 1 - Aos 7 dias, diversas estruturas vacuolares foram observadas na porção citoplasmática distal dos ameloblastos dos ratos dos grupos GA100 e GA500; além disso, a espessura do esmalte foi significantemente menor nos grupos GA100 e GA500 quando comparado ao GS (p<0,001). Em contraposição, diferenças estatisticamente significantes não foram observadas entre os grupos no período de 12 dias (p=0,111). Diferenças entre os grupos também não foram observadas na intensidade de imunomarcação exibida pelos ameloblastos à anti-amelogenina (p=0,818) e à anti-MMP-20 (p=0,855). Capítulo 2 - Não foram observadas diferenças estatisticamente significante no conteúdo de cálcio (p=0,180), fósforo (p=0,054) e densidade eletrônica (p=0,150) entre os grupos. Capítulo 3 - Observou-se que a espessura do esmalte (p=0,228) e a concentração de cálcio (p=0,592) e fósforo (p=0,409) nos incisivos não diferiram estatisticamente entre os grupos. No entanto, a concentração de fluoreto nos tecidos dentário, ósseo e plasma foi maior nos grupos expostos em GF e GA+F (p<0.001). A análise fotográfica pelo índice DFIA e a microdureza mostraram diferenças significativas entre os grupos (p<0.001), sendo que GF apresentou maior severidade de hipomineralização do esmalte, seguido por GA+F e GA. Houve um aumento linear na dureza do esmalte quando nas profundidades de 10 µm a 30 µm, sendo esse aumento entre 4 a 5 KHN por µm de profundidade nos GA+F e GF, e entre a 7 a 8 KHN por µm nos grupos GA e GS. Os achados desse estudo mostraram que os animais expostos cronicamente ao fluoreto desenvolveram hipomineralização de esmalte, e a associação da amoxicilina não potencializou a severidade da Resumo hipomineralização. Conclusão: Capítulo 1 - Conclui-se que a amoxicilina pode provocar alterações durante a amelogênese, as alterações foram observadas no estágio secretor da matriz do esmalte, sugerindo atraso na aposição de matriz do esmalte. Capítulo 2 - Conclui-se que a amoxicilina não influenciou o conteúdo mineral dos incisivos e molares de ratos. Capítulo 3 - Concluímos que a amoxicilina não influenciou o desenvolvimento do esmalte, bem como não potencializou o efeito do fluoreto. Palavras-Chave: Amelogênese, Amoxicilina, Fluoreto de sódio. Abstract Abstract Souza JF. Effect of amoxicillin and fluoride on enamel development in rat teeth [Tese de Doutorado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2013. Abstract Background: Amoxicillin use in early childhood has been associated with molar- incisor hypomineralization. Moreover, it has been supposed an association between amoxicillin and fluoride on enamel defects. Aim. This study aimed to evaluate in vivo the effect of amoxicillin and amoxicillin associated with fluoride on the enamel development of rat tooth. Materials and Methods: The research was divided into three studies. Chapter 1 – Fifteen pregnant Holtzman rats (Rattus norvegicus albinus) were divided randomly into three groups to receive saline (SG), 100 mg/kg/day amoxicillin (A100G), or 500 mg/kg/day amoxicillin (A500G), intragastrically, from days 13 to 22 of pregnancy. Twelve offsprings per group got the same dose until day 12. After 7 and 12 days, the specimens were fixed and embedded in paraffin. In the HE- stained sections, the thickness of enamel matrix of upper molar germs was evaluated. Moreover, detection of amelogenin on day 7 and matrix metalloproteinase 20 (MMP - 20) on day 12 by immunohistochemistry were carried out. Chapter 2 - Fifteen rats (Rattus norvegicus, Albinus,Holtzman) were randomly divided into three groups to receive saline (SG), 100 mg/kg/day amoxicillin (A100G), or 500 mg/kg/day amoxicillin (A500G), as described in Chapter 1. Ten offspring per group received the same dose until day 40. The animals were euthanized on day 40. A total of 60 upper incisors and 60 upper first molars from 30 animals were dissected. Calcium (Ca) determination was performed by the compleximetric titration method and phosphorus (Pi) determination by colorimetric analysis using a spectrophotometer at 680 nm. A total of 30 lower first molars from 15 animals were analyzed under X-ray microtomography (XMT). Chapter 3 - Forty rats were, randomly, divided into four groups exposed to fluoride in water (100 ppm (mg F/L) or intragastric administration of amoxicillin (500 mg /kg body weight), according to the combinations: control group (SG); amoxicillin group (AG), fluoride group (FG) and amoxicillin with fluoride group (A+FG.) After 60 days, the animals were euthanized. The concentrations of fluoride in the plasma, tibia and incisors of the rats were determined. The incisors were also analysed by the fluorosis severity (by software image analysis, Dental fluorosis by Image analysis - DFIA), Abstract calcium content by compleximetric titration method and phosphorus content by colorimetric method, enamel thickness, and its hardness. Results: Chapter 1 - A100G and A500G groups showed lower thickness of the enamel matrix than GS (p<0.001) on day 7, but not on day 12 (p=0.111). On day 7, the treated groups showed morphological changes in ameloblasts, represented by vacuoles. The amelogenin (p=0.818) and MMP- 20 (p=0.855) immunostaining intensity did not differ among groups. Chapter 2 - There were no statistically significant differences in Ca content (p=0.180), Pi content (p=0.054), or XMT electron density (p=0.150) among the groups. Chapter 3 - The thickness of the enamel (p=0.228), Ca content (p= 0.592) and Pi content (p=0.409) were not statistically different among the groups. However, the concentration of fluoride in the tooth, bone, and plasma was higher in the FG and A+FG (p< 0.001) than AG and SG. The DFIA index and microhardness showed significant differences among groups (p<0.001), and FG presented greater severity hypomineralization enamel than SG, followed by A+FG and AG. The hardness increased linearly in the 10 µm a 30 µm depths, being from 4 to 5 KHN per mm in depth in the AG and A+FG, and from 7 to 8 KHN mm in depth in the AG and SG. The findings of this study showed that animals chronically exposed to fluoride developed enamel hypomineralization, and the association of amoxicillin had no role in the hypomineralization severity. Conclusion: Chapter 1 - Amoxicillin can cause changes only during secretory stage, suggesting a delay in ameloblasts differentiation. Chapter 2 – Amoxicillin did not affect the mineral content and electron density of rat teeth. Chapter 3 – Amoxicillin did not influence the development of the enamel, and did not potentiate the effect of fluoride . Key words: Amelogenesis, Amoxicillin, Sodium Fluoride. Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas # – Número % – Porcentagem ° GL – Gay Lussac: quantidade em mililitros de álcool absoluto contida em 100 mililitros de mistura hidro-alcoólica. < – Menor > – Maior BSA - Bovine Serum Albumins Ca – Cálcio CA – Coeficiente angular CDTA – Ácido ciclohexilendinitrilo tretra acético cm – Centímetro cm3 ou cc – Centímetro cúbico DFIA – Dental Fluorosis by Image Analysis DP – Desvio padrão E.U.A – Estados Unidos da América EDTA – Ácido etilenodiamino tetracético dissódico EP – Erro padrão F – Fluoreto g – Grama h – Hora H&E – Coloração com hematoxilina de Carazzi e eosina KHN – Knoop Hardness Number Kg – Quilograma kV – Quilovolt M – Molar mA – Miliampere mg – Miligrama mL – Mililitro nm – nanometro Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas oC – Grau Célsios p – Probabilidade estatística pH – potencial hidrogeniônico ou potencial de hidrogénio Pi – Fósforo inorgânico ppm – Parte por milhão R – Coeficiente de correlação linear s – Segundo TISAB II – Total Ionic Strength Adjustment Buffer (tampão acetado a 1,0 M, pH 5,0 com NaCl a 1,0 M e 0,4% CDTA) Tris- HCl – Solução tampão a base de tris(hidroximetil)aminometano e ácido clorídrico µg – Micrograma µm – Micrometro µM – Micromolar Sumário SUMÁRIO 1 Introdução ........................................................................................26 2 Proposição........................................................................................32 3 Capítulo 1...........................................................................................34 4 Capítulo 2...........................................................................................60 5 Capítulo 3...........................................................................................77 6 Considerações finais......................................................................100 Referências...........................................................................................102 Anexos..................................................................................................106 1 Introdução 26 Introdução 1 Introdução A formação do esmalte dentário é regulada por uma sequência de interações indutivas e recíprocas entre células epiteliais e ectomesenquimais (Arana-Chaves et al.4, 2004; Smith et al.41, 1995; Thesleff et al.49, 2001) sendo um processo dinâmico, no qual a biomineralização ocorre em uma matriz orgânica continuamente secretada, e orientada pelos ameloblastos, os quais apresentam múltiplas funções, atuando na síntese protéica, secreção, transporte iônico, e degradação das proteínas (Fincham et al.16, 1999; Kachburian, Arana25, 2002; Nanci et al.33, 1998; Smith et al.41, 1998). Classicamente, o processo da amelogênese é dividido em vários estágios de atividade do ameloblasto, denominados pré-secreção, secreção e maturação (Nanci et al.32, 2008; Reith37, 1970). Durante o estágio secretor, os ameloblastos tornam-se células, morfologicamente, cilíndricas, seus núcleos e mitocôndrias polarizam-se no sentido proximal, e a porção distal assume um aspecto cônico, o processo de Tomes. Nesse estágio ocorre a secreção e organização estrutural da matriz orgânica (Nanci et al.32, 2008; Smith et al.41, 1998) cujas principais constituintes são as amelogêninas, responsáveis pela formação da estrutura e espessura normal do esmalte dentário (Fincham et al.16, 1999; Nanci et al.33, 1998). As proteínas ameloblastina e enamelina representam cerca de 5% e 2%, respectivamente, promovem e guiam a formação dos cristais (Fincham et al.16, 1999; Smith et al.41, 1998). Uma vez que a espessura do esmalte se completa, os ameloblastos passam por um curto estágio de transição para o processo de maturação, no qual sofrem reorganização das organelas citoplasmáticas para o estágio de maturação. No estágio de maturação, os ameloblastos exibem diferentes características estruturais de acordo com sua atividade, alternando as bordas distais em superfícies lisas e pregueadas, permitindo a degradação da matriz proteica e aumento em largura dos cristais (Reith37, 1970; Nanci32, 2008). Neste período, as enamelisinas ou metaloproteinases da matriz-20 (MMP-20) são essenciais para o processamento pós-secretor e à degradação protéica, contribuindo para crescimento em largura dos cristais, e consequentemente, garantindo o aumento da dureza do esmalte (Simmer, Hu39, 2002). 27 Introdução A amelogênese é geneticamente controlada, mas susceptível às influências de fatores sistêmicos, ambientais ou hereditários (Alaluusua1, 2010; Suckling46, 1989). Experimentos em animais mostram que várias substâncias como fluoreto, cobalto, chumbo, bifosfanatos, tetraciclinas entre outras podem alterar a amelogênese (Alaluusua1, 2010; Alaluusua et al.2, 1996; Leite et al.28, 2011; Massa et al.30; Neiman, Eisenman34, 1975; Westergaard53, 1980). Dentre as alterações na amelogênese, maior atenção tem sido dada ao atraso da secreção da matriz, alterações do processamento da matriz protéica, inibição da nucleação dos cristais, atraso na remoção da matriz, e maturação do esmalte (Aoba e Fejerskov3, 2002; Simmer e Hu39, 2002; Suckling46, 1989), culminando em defeitos permanentemente registrados no esmalte. A cronologia de desenvolvimento dentário obedece a uma sequencia definida. Os primeiros molares permanentes iniciam seu desenvolvimento durante o quarto mês de gestação, e durante o primeiro ano de vida é completada a deposição de matriz de esmalte no terço oclusal da coroa, e assim, a maturação é iniciada (Alaluusua1, 2010; Suga47, 1989). A maturação é um longo processo, estendendo-se pelos três primeiros anos de vida da criança, tornando a estrutura do esmalte susceptível a influências de fatores externos. As características e a localização destas alterações podem fornecer indícios sobre o tempo e a natureza dos fatores etiológicos, os quais podem ser hereditários como na Amelogênese Imperfeita, adquiridos como na Fluorose dentária, e os de causa desconhecida como a Hipomineralização Molar-Incisivo (Alaluusua1, 2010; Weerheijm49, 2004; Weerheijm et al.52, 2001). A presença de alta concentração do fluoreto durante a amelogênese pode interferir na formação do esmalte. Essa influência é dependente do tempo da exposição, concentração da dose e nível de fluoreto no plasma sanguíneo (Bronckers et al.17; Catani et al.11, 2010). As hipóteses mais aceitas sobre a patogenia da Fluorose estão relacionadas à retenção de proteínas durante a fase de maturação da matriz do esmalte, à alteração na atividade proteolítica dessas proteínas, bem como às alterações no crescimento dos cristais. Consequentemente, a porosidade do 28 Introdução esmalte é aumentada, com subsequentes mudanças ópticas e físicas da superfície do tecido (Bronckers et al.17, 2009). Clinicamente, a Fluorose é representada por opacidade branca que varia de finas estriações até esmalte inteiramente esbranquiçado com manchas escurecidas, e depressões (da Cunha et al.22, 2006). Dentre os defeitos de esmalte, a Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI) tem sido foco de investigações. O termo refere-se à hipomineralização que acomete assimetricamente, os primeiros molares permanentes e está associada, frequentemente, a defeitos em incisivos (Weerheijm et al.87, 2001). Estudos epidemiológicos mostram dados de prevalência da HMI variando entre 2,8% a 44% em diversas partes do mundo (da Costa-Silva, et al.14, 2010; Jasulaityte et al.23, 2007; Jeremias et al.24, 2013; Soviero et al.45, 2009; Weerheijm et al.51, 2001; Whatling e Fearne54, 2008). Macroscopicamente, o esmalte afetado pela HMI apresenta opacidades que variam do branco ao amarelo-acastanhado com bordas bem definidas com o esmalte normal. Em casos mais severos, há perda da estrutura logo após a erupção dentária, deixando a dentina desprotegida, o que resulta em sensibilidade e em rápido desenvolvimento de lesões cariosas (Jalevik, Klingberg20, 2012; Jeremias et al.24, 2013; Souza et al.43, 2011; Weerheijm49, 2004). Esses dentes apresentam necessidade de frequente retratamentos devido à deficiente adesão aos materiais restauradores no esmalte alterado (Alaluusua1, 2010; Balmer et al.6 , 2005; Cho et al.12, 2008; Jalevik et al.21, 2001; Leppaniemi et al.29, 2001; Muratbegovic et al.31, 2007; Preusser et al.35, 2007; Weerheijm et al.50, 2003). Não há dados conclusivos sobre a etiologia da HMI. A assimetria dessa alteração sugere que os ameloblastos sejam afetados por fatores sistêmicos ou ambientais durante a amelogênese (Alaluusua1, 2010; Souza et al.42, 2012). Dentre as causas consideradas, a literatura relata problemas respiratórios, complicações no período pré-natal, baixo peso ao nascimento, desordem metabólica de cálcio e fosfato, uso de amoxicilina, bem como doenças de infância associadas à febre alta 29 Introdução (Alaluusua1, 2010; Arrow et al.5, 2009; Crombie et al.13, 2008; Jalevik et al.22, 2000; Souza et al.42, 2012; Souza et al.44, 2013; Whatling, Fearne54, 2008). O uso da amoxicilina durante a primeira infância tem sido associado aos defeitos de esmalte (Hong et al.17, 2004; Hong et al.18, 2005; Hong et al.19, 2011; Laisi et al.27, 2009; Sahlberg et al.38, 2013; Souza et al.42, 2012; Whatling, Fearne54, 2008). Souza et al.74 (2012); Laisi et al. 50 (2009); Whatling, Fearne89 (2008) observaram, em estudos retrospectivos, que crianças portadoras de HMI usavam amoxicilina com mais frequência do que crianças sem HMI. Laisi et al.50 (2009) observaram, em cultura de ameloblastos, que a alta concentração do medicamento resultou em alteração nos padrões de amelogênese. Kumazawa et al.48 (2012) observaram in vivo alteração na mineralização dentinária após a exposição à alta concentração de amoxicilina. Ademais, estudos mostram que o uso de amoxicilina associado ao fluoreto tem aumentado o risco aos defeitos de esmalte (Hong et al.17, 2004; Hong et al.,18, 2011; Hong et al.19, 2005). Em cultura de germes, Sahlberg et al. 65 (2013) observaram que a exposição à altas doses de amoxicilina potencializou o efeito da exposição ao fluoreto, resultando em alterações morfológicas nos ameloblastos e diminuição da matriz do esmalte. Em estudo coorte prospectivo, Hong et al. 36 (2011) acompanharam 357 crianças expostas ao fluoreto, a partir do nascimento até 13 anos de idade, e observaram que o uso da amoxicilina durante os 20-24 primeiros meses de vida aumentou significantemente o risco aos defeitos de esmalte. A amoxicilina é uma penicilina semi-sintética e pertence à classe das aminopenicilinas, apresenta amplo espectro de ação, sendo o antibiótico de primeira escolha no tratamento de infecções na primeira infância (Bergus et al.7, 1996; Bergus et al.8, 2001). Sua absorção pelo trato gastrointestinal atinge 75 a 90% da dose oral, sendo amplamente distribuída nos líquidos corporais, como saliva, leite, e placenta (Rang et al.62, 2011). O efeito crônico do fluoreto no desenvolvimento de fluorose dental é conhecido, porém o papel de outros agentes com possível efeito na amelogênese, como a amoxicilina, não tem sido estudado in vivo. Embora tem sido sugerido que a 30 Introdução amoxicilina possa potencializar o efeito do fluoreto no desenvolvimento do esmalte, ainda não há estudos conclusivos. Diante do exposto, torna-se oportuno investigar o efeito da amoxicilina e da associação amoxicilina com fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos, em doses estimadas para o metabolismo do animal, que simulam a exposição clínica a essas substâncias. 2 Proposição 32 Proposição 2 Proposição A proposição do estudo foi avaliar o efeito da amoxicilina e da associação amoxicilina e fluoreto no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos, assim como na estrutura do esmalte. Para isso, foram realizadas três pesquisas científicas, intituladas como: Capítulo I. Imunoexpressão para amelogenina e MMP-20 durante a amelogênese de molares de ratos expostos à amoxicilina Capítulo II. Efeito da amoxicilina nas propriedades físico-químicas do esmalte dentário de ratos Capítulo III. Efeito da amoxicilina associada ao fluoreto na estrutura dentária de ratos 3 Capítulo 1 34 Capítulo 1 Imunoexpressão para amelogenina e MMP-20 durante a amelogênese de molares de ratos expostos à amoxicilina Souza JFa, Gramasco M a, Cerri PSb, Jeremias Fa, Santos-Pinto La, Cordeiro RCLa aDepartamento de Clínica Infantil, Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Araraquara, SP, Brasil bDepartamento de Morfologia, Laboratório de Histologia e Embriologia, Faculdade de Odontologia de Araraquara, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Araraquara, SP, Brasil Correspondência: Rita de Cássia Loiola Cordeiro Departamento de Clínica Infantil Faculdade de Odontologia de Araraquara Universidade Estadual Paulista- UNESP Rua Humaitá, 1680 Telefone: 55(016) 33016331 Araraquara, São Paulo, Brasil CEP: 14801-903 e-mail: ritacord@foar.unesp.br *De acordo com as normas do periódico Archives of Oral Biology 35 Capítulo 1 Resumo O uso da amoxicilina durante a primeira infância tem sido relacionado ao desenvolvimento de defeitos de esmalte denominados Hipomineralização Molar- Incisivo (HMI). Porém, não há evidência in vivo sobre o possível efeito desse fármaco na amelogênese. Objetivo: A proposta do presente estudo foi avaliar o desenvolvimento do esmalte dentário de ratos tratados com amoxicilina. Material e Método: Quinze ratas prenhas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman) foram aleatoriamente distribuídas em três grupos que receberam, a cada 24 h, dose intragástrica de amoxicilina 100 mg/kg/dia (grupo GA100), amoxicilina 500 mg/kg/dia (grupo GA500) ou soro fisiológico (grupo GS), diariamente, a partir do 130 dia de prenhez. Após o nascimento, doze filhotes de cada grupo receberam o mesmo tratamento das respectivas mães durante os períodos de 7 dias (n=6) e 12 dias (n=6) de vida. Após a eutanásia, as cabeças dos ratos foram removidas, fixadas e processadas para inclusão em parafina. Cortes frontais da cabeça exibindo os primeiros molares superiores foram corados com H&E e submetidos à reação imuno- histoquímica para detecção de amelogenina e metaloproteinases da matriz-20 (MMP- 20). Os cortes corados com H&E foram utilizados para análise morfológica e mensuração da espessura da camada de esmalte. A imunoexpressão para amelogenina e MMP-20 foram avaliados por análise semi-quantitativa (H-score). Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste Tukey com nível de significância de 5%. Resultados: Aos 7 dias, diversas estruturas vacuolares foram observadas na porção citoplasmática distal dos ameloblastos dos ratos dos grupos GA100 e GA500; além disso, a espessura do esmalte foi significantemente menor nos grupos GA100 e GA500 quando comparado ao GS (p<0,001). Em contraposição, diferenças estatisticamente significantes não foram observadas entre os grupos no período de 12 dias (p=0,111). Diferenças entre os grupos também não foram observadas na intensidade de imunomarcação exibida pelos ameloblastos à anti-amelogenina (p=0,818) e à anti-MMP-20 (p=0,855). Conclusão: Nossos resultados sugerem que a amoxicilina possivelmente atrasou a indução e/ou a diferenciação dos ameloblastos explicando, pelo menos em parte, a significante redução na espessura do esmalte observada aos 7 dias. Palavras-Chave: Proteínas do esmalte dentário, Amelogênese, Amoxicilina, Hipoplasia do esmalte dentário. 36 Capítulo 1 Introdução A formação do esmalte dentário é regulada por uma sequência de interações indutivas e recíprocas entre células epiteliais e ectomesenquimais 73, 82. Durante a amelogênese, a biomineralização ocorre em uma matriz orgânica secretada pelos ameloblastos, os quais apresentam múltiplas funções, atuando na síntese protéica, secreção, transporte iônico e degradação protéica 30, 70. Assim, o ameloblasto exibe diferentes características morfológicas de acordo com sua atividade funcional, sendo reconhecidos cinco estágios distintos: morfogenético, diferenciação, secretor, maturação e protetor 45, 63. Durante o estágio secretor, os ameloblastos pré-secretores tornam-se células cilíndricas, seus núcleos e mitocôndrias polarizam-se no sentido proximal, e a porção distal assume um aspecto cônico, o processo de Tomes; nesse estágio ocorre a secreção e organização estrutural da matriz orgânica do esmalte. Uma vez que a espessura do esmalte se completa, os ameloblastos passam por um curto estágio de transição para o processo de maturação, nesse estágio os ameloblastos sofrem reorganização das organelas citoplasmáticas para o estágio de maturação. No estágio de maturação, os ameloblastos sofrem diferenciação e atividade de modulação, alternando as bordas distais em superfícies rugosas e lisas, atuando, respectivamente, na degradação da matriz proteica e no transporte de íons para a matriz, culminando no aumento do conteúdo mineral 59, 63. As amelogeninas que representam mais de 90% do total de proteínas no esmalte são consideradas críticas para a formação da estrutura do esmalte dentário, requeridas para compor um arcabouço para a deposição do fosfato de cálcio e formação dos cristais de hidroxiapatita; além disso, tem sido atribuído a essa proteína um papel modulador no crescimento da estrutura dos cristais do esmalte 30, 31. Além das amelogeninas, ameloblastina e enamelina representam, respectivamente, cerca de 5 % e 2 % das proteínas do esmalte, têm sido também associadas com a formação dos cristais do esmalte 68. As enamelisinas ou metaloproteinases da matriz-20 (MMP-20) são essenciais para o processamento pós-secretor e à degradação protéica durante o período de maturação do esmalte, contribuindo para crescimento em 37 Capítulo 1 largura dos cristais, e consequentemente, garantindo o aumento da dureza do esmalte 68. A amelogênese é geneticamente controlada, mas susceptível às influências de fatores sistêmicos, ambientais, locais e mecânicos. Dentre os defeitos de esmalte, a Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI) refere-se à hipomineralização que acomete, assimetricamente, os primeiros molares permanentes e está associada, frequentemente, a defeitos em incisivos 87. Estudos epidemiológicos mostram dados de prevalência da HMI que varia entre 2,8% a 44% em diversas partes do mundo 21, 43, 44, 77, 89. O esmalte afetado pela HMI apresenta opacidades que variam do branco ao amarelo-acastanhado com bordas bem definidas do esmalte normal. Em casos mais severos, há perda da estrutura do esmalte logo após a erupção dentária, favorecendo a sensibilidade e o rápido desenvolvimento de lesões cariosas 40, 44, 75, 84. A assimetria dessa alteração sugere que os ameloblastos sejam afetados por fatores sistêmicos ou ambientais durante a amelogênese 2, 4. Dentre as possíveis causas consideradas, estão os problemas respiratórios, complicações no período pré-natal, baixo peso ao nascimento, desordem metabólica de cálcio e fosfato, bem como, doenças de infância associadas à febre alta 2, 9, 20, 41, 74, 76, 89. A amoxicilina quando administrada na primeira infância tem sido associado aos defeitos de esmalte principalmente, à Hipomineralização Molar-Incisivo 35-37, 50, 65, 74, 89. A amoxicilina é uma penicilina semi-sintética e pertence à classe das aminopenicilinas, apresenta amplo espectro de ação, sendo o antibiótico de primeira escolha no tratamento de infecções na primeira infância 14, 15. Sua absorção pelo trato gastrointestinal atinge 75 a 90% da dose oral, é amplamente distribuída nos líquidos corporais, como saliva, leite e placenta 62. Estudos in vitro têm demonstrado que altas concentrações de amoxicilina causam alterações nos padrões de amelogênese 50, 65. Além disso, alterações na mineralização da dentina foram observadas em ratos tratados com amoxicilina 48. Assim, não há estudos in vivo que descrevam os efeitos da exposição crônica da amoxicilina no desenvolvimento do esmalte de ratos. Diante do exposto, o 38 Capítulo 1 propósito do presente estudo foi investigar se a amoxicilina interfere na estrutura dos ameloblastos, bem como na imunoexpressão das proteínas amelogeninas e MMP-20, proteínas que exercem um papel importante na secreção e maturação do esmalte, em molares de ratos. Material e Método Animais O presente estudo foi submetido a Comissão de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Odontologia – FOAr-UNESP (CEUA – Proc. nº 34/2010) que aprovou a sua realização. Foram utilizadas 15 ratas (Rattus norvegicus, albinus, Holtzman), com 2-3 meses de idade, pesando aproximadamente 250 g. As ratas foram mantidas no biotério da FOAr com temperatura (23±10C) e umidade relativa (55±5%) controladas, iluminação artificial por lâmpada fluorescente com foto períodos de 12h claro e 12 h escuro, com ração granulada e água ad libitum. Após 5 dias de adaptação, as ratas foram colocadas para o acasalamento ao final da tarde, após aproximadamente 12 h, realizou-se o lavado vaginal para verificar se espermatozoides estavam presentes e, dessa maneira, comprovação da prenhez (dia zero). O lavado aspirado foi analisado em microscópio de luz à fresco e após coloração pelo método de Shorr, de acordo com Marcondes et al.57 (2002). Procedimentos experimentais As ratas prenhas foram colocadas em gaiolas individuais de polipropileno e distribuídas aleatoriamente em 3 grupos, com 5 ratas cada. Os grupos foram identificados e receberam por via intragástrica (gavagem), diariamente: Grupo sham (GS) – soro fisiológico estéril, em volume correspondente ao administrado aos grupos GA500 e GA100. 39 Capítulo 1 Grupo A100 (GA100) – amoxicilina (Eurofarma genéricos, São Paulo, SP, Brasil) na concentração de 100 mg/kg de peso corpóreo. Grupo A500 (GA500) – amoxicilina na concentração de 500mg/kg de peso corpóreo. Os tratamentos seguiram a partir do 13º dia até o 22º dia de prenhez. Após o nascimento, os filhotes de cada prole, a partir do 1º dia até o 12º dia de idade receberam o mesmo tratamento das respectivas mães. A administração de amoxicilina a partir do 13º dia de prenhez foi realizada, pois este corresponde ao início de formação de germe do primeiro molar de ratos; enquanto que no 12º dia de idade, correspondente ao estágio de mineralização e maturação do esmalte do primeiro molar 66, os quais estão em fase eruptiva de penetração de mucosa 19. Após 7 e 12 dias, 6 ratos de cada grupo para cada período experimental sofreram eutanásia com sobredose de Cloridrato de Cetamina a 10% (Cetamin®- Syntec do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil) associado ao Cloridrato de Xilazina a 2% (Xilazin®- Syntec do Brasil Ltda, São Paulo, Brasil). Após a eutanásia, os ratos foram decapitados e as cabeças, imediatamente, imersas na solução fixadora. Processamento Histológico As cabeças dos ratos com 7 e 12 dias de idade foram imediatamente mergulhadas em solução de 4% de formaldeído (preparado a partir do paraformaldeído) tamponada com 0,1M de fosfato de sódio e pH ajustado em 7,2. Após 48 h de fixação, as cabeças foram descalcificados em solução a 7% de EDTA (ácido etilenodiamino tetracético dissódico), contendo 0,5% de formaldeído, e tamponada com fosfato de sódio 0,1 M e pH ajustado para 7,2; os espécimes permaneceram na solução de EDTA por 3 a 7 dias, dependendo do estágio do estágio de desenvolvimento dos germes dentários. Subsequentemente, os espécimes foram desidratados em concentrações crescentes de etanol, a partir da solução 30º GL, até o etanol absoluto, diafanizados em xilol e, após a infiltração em parafina a 58-60ºC, foram incluídos em parafina, de maneira a possibilitar a obtenção de cortes frontais. 40 Capítulo 1 Cortes seriados com 5µm de espessura foram obtidos com auxílio de um micrótomo (Thermo Microm, modelo HM 325, Massachusetts, EUA ) com navalhas de aço descartáveis (Leica 818, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Foram obtidos, aproximadamente, 60 cortes de cada cabeça contendo a porção central dos germes dos primeiros molares superiores. Os cortes foram obtidos paralelamente ao longo eixo dos molares em desenvolvimento. Três cortes foram aderidos a cada lâmina de vidro, totalizando cerca de 20 lâminas. Alguns cortes foram corados com hematoxilina de Carazzi/eosina (H&E) e alguns aderidos a lâminas silanizadas foram submetidos às reações imuno-histoquímicas. Análise Morfológica e mensuração da espessura do esmalte Os cortes corados com H&E foram utilizados para a análise morfológica, onde os seguintes parâmetros foram observados: estágio de desenvolvimento dos germes de primeiros molares superiores, espessura da matriz do esmalte, arranjo e morfologia dos ameloblastos. A fim de avaliar se a amoxicilina promove alguma alteração na secreção dos ameloblastos, a espessura do esmalte dos germes de primeiros molares superiores em desenvolvimento nos períodos de 7 e 12 dias de idade foi mensurada, com o auxílio de um microscópio de luz (BX51, Olympus, Tóquio, Japão) e um sistema de análise de imagens (Image Pro-Express 6.0, Olympus, Tóquio, Japão). Com a objetiva de 40x, imagens da região de ponta de cúspide dos molares foram capturadas com auxílio de uma câmera digital (Olympus DP-71, Tóquio, Japão) acoplada ao microscópio. Foram selecionados 3 cortes, com intervalo mínimo de 60 µm, dos germes dentários dos primeiros molares superiores dos 6 ratos de cada grupo, nos períodos de 7 e 12 dias de idade. Com auxílio do sistema de análise de imagem, a distância entre o limite amelo-dentinário e a porção distal da camada de ameloblastos foi mensurada; em cada corte, realizou-se 3 medidas obtendo-se, portanto, uma média por corte. Após a medida dos 3 cortes de cada germe dentário obteve-se uma média para cada animal. 41 Capítulo 1 Detecção imuno-histoquímica de amelogenina e metaloproteinase da matriz-20 (MMP-20) Considerando os estágios de formação e mineralização do esmalte, a detecção de amelogenina foi avaliada nos germes dentários dos ratos de 7 dias, enquanto que a detecção de MMP-20 foi avaliada nos germes dentários dos ratos de 12 dias de idade, em todos os grupos. Após a desparafinização e hidratação, os cortes foram mergulhados em tampão citrato de sódio 0,001M (pH 6,0) e submetidos, durante 30 minutos, ao tratamento no microondas à temperatura de 90-94°C, para recuperação antigênica. Após o resfriamento e inativação da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 5%, os cortes foram incubados com o anticorpo primário anti- amelogenina (Abcam, Califórnia, EUA) de camundongo produzido em coelho diluído em BSA (titulação 1:500) ou incubados com anti-MMP-20 de rato produzido em coelho (Rheabiotech, São Paulo, Brasil) diluído em BSA (titulação 1:500) durante 16 h, à temperatura de 4ºC. Subseqüentemente às lavagens com tampão TRIS-HCl 0,05M (pH 7,2), os cortes foram incubados com anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de camundongo/rato/cabra biotinilado (Kit Dako LSAB+ System-HRP, Dako, Califórnia, EUA) por 30 minutos, a temperatura ambiente. Após lavagem em tampão Tris-HCl, os cortes foram incubados com o complexo estreptavidina-peroxidase durante 30 minutos. Subseqüentemente as lavagens, a atividade da peroxidase foi revelada com solução de 3.3-diaminobenzidina (Betazoid DAB Chromogen Kit – Biocare Medical, Califórnia, EUA) durante 2-3 minutos; os cortes foram então contracorados com hematoxilina de Carazzi e montados em meio resinoso (Permount, Fisher Scientific, Nova Jersey, EUA). No controle negativo, os anticorpos primários (anti-amelogenina e anti-MMP-20) foram omitidos; nesta etapa, os cortes foram incubados com soro não imune. A fim de verificar possíveis diferenças no padrão da imunoexpressão de amelogenina e MMP-20 pelos ameloblastos, realizou-se uma análise quantitativa considerando a intensidade da imunomarcação. Em cada animal, foram utilizados 42 Capítulo 1 quatro cortes, com distância mínima de 60 µm, submetidos as reações para detecção de amelogenina e MMP-20. A análise da intensidade de marcação nos ameloblastos pela anti-amelogenina foi realizada em duas regiões: a região do terço cervical da face vestibular e/ou palatina da coroa do germe dentário e a região de cúspide. Na análise da intensidade de marcação dos ameloblastos para MMP-20, considerou-se 3 regiões distintas: região de cúspide, regiões média e cervical das face vestibular e/ou palatina da coroa do germe dentário. A intensidade de marcação das proteínas foi categorizada, em cada região, em escores (1) fraco, (2) moderado e (3) forte; esta análise foi realizada por um examinador calibrado (kappa 0,80). Análise semi-quantatitiva foi realizada utilizando o H-score, ∑Pi(i+1), onde i representa a intensidade da marcação (1, 2 ou 3) e Pi é a porcentagem das áreas marcadas em cada categoria 33. Tratamento estatístico dos dados As avaliações dos três grupos experimentais deste estudo, quanto a espessura da matriz do esmalte, escores de intensidade de marcação de amelogenina e escores de intensidade de marcação de MMP-20 foram realizadas por análises de variância. Essas análises foram complementadas por comparações múltiplas pelo teste de Tukey, por meio do software Statistica versão 8.0 (StatSoft Inc, Oklahoma, EUA). Adotou-se o nível de significância de 5% para a tomada de decisão. Resultados Análises Morfológica e Morfométrica Os cortes frontais das cabeças de ratos com 7 dias revelaram os germes dentários dos primeiros molares superiores contendo camadas de matriz de dentina e matriz de esmalte em formação por quase toda a extensão da coroa dentária; as camadas de dentina e esmalte apresentaram-se evidentemente mais espessadas nas 43 Capítulo 1 pontas de cúspides dos molares (Fig. 1A). Os ameloblastos, exibindo formato cilíndrico e núcleo situado na porção proximal do citoplasma, dispunham-se em uma camada única de células adjacentes à superfície da matriz do esmalte (Figs. 1A, 2C e 3A). A papila dentária em diferenciação exibiu odontoblastos na sua periferia, justapostos à superfície da matriz orgânica de dentina, ou seja, à pré-dentina. Na porção cervical da coroa dentária em formação, o esmalte estava representado por uma delgada camada de matriz orgânica justaposta à camada de matriz de dentina. Em continuidade aos ameloblastos, os epitélios interno e externo do órgão epitelial do esmalte estendiam-se constituindo a alça cervical e delimitando, parcialmente, a papila dentária (Fig. 1A). Aos 7 dias, os germes dentários de ratos tratados com amoxicilina (GA100 e GA500) mostraram características gerais semelhantes às descritas para o grupo controle. No entanto, nos animais dos grupos GA100 e GA500, a camada do esmalte estava, aparentemente, delgada em relação aos molares do grupo controle (Figs. 2A-2E). Além disso, estruturas com aspecto semelhante ao de vacúolos foram, frequentemente, observadas na porção proximal do citoplasma dos ameloblastos dos molares dos animais tratados com amoxicilina (Figs. 3B e 3C). Aos 12 dias, os germes dos primeiros molares dos grupos controle e amoxicilina (GA100 e GA500) apresentaram um evidente espessamento das camadas de esmalte e dentina em comparação aos germes dentários dos ratos de 7 dias (Compare a Fig. 1A com a Fig. 1B e Figs. 2F-2J com Figs. 2A-2E). Neste período, o início da formação da dentina radicular, constituída por uma camada delgada de matriz orgânica, foi observado nos germes dos molares (Figs. 1B, 2F e 2G). Os ameloblastos revestindo o esmalte dentário apresentaram formato cúbico evidenciando, portanto, uma redução no seu tamanho. Além disso, nas pontas de cúspides dos molares foi possível observar somente remanescentes da matriz acidófila do esmalte, preenchendo o espaço delimitado pela camada de ameloblastos (Figs.1B e 2H-2J). A camada do esmalte apresentou espessura, aparentemente, semelhante nos animais dos grupos controle e tratados com amoxicilina (Figs. 2H- 2J). Figuras 1A e 1B – Fotomicrografias de cortes frontais de cabeça de ratos mostrando germes dentários de 1º molar superior de ratos com 7 (1A) e 12 (1B) dias do grupo controle (GS). Fig. 1A – germe dentário em fase de formação de coroa exibe uma camada de matriz orgânica do esmalte (Me) por toda extensão do órgão epitelial do esmalte (OE); uma contínua camada de ameloblastos (A) cilíndricos e polarizados são observados em íntima justaposição à matriz do esmalte (Me). Odontoblastos (Od) são observados na periferia da papila dentária em diferenciação (Pd), adjacentes à superfície da dentina (D). Ac, alça cervical; Fd, folículo dentário; To, trabéculas ósseas. Barra: 150 μm Fig. 1B – germe dentário em fase de formação de raiz. Uma contínua camada de ameloblastos (A) exibindo formato cúbico reveste a camada de espessura variável do esmalte (Me); note na porção mais cervical da coroa, o término do esmalte (seta) e início da formação da dentina radicular (DR). Na região de cúspide (asteriscos), o espaço do esmalte apresenta-se parcialmente preenchido com a matriz do esmalte (Me). D, dentina; Od, camada de odontoblastos; Pd, papila dentária em desenvolvimento; Fd, folículo dentário; To, trabéculas ósseas. Barra: 150 μm. Figuras 2A-2J – Fotomicrografias de cortes frontais de cabeça de ratos mostrando germes dentários de 1º molar superior de ratos com 7 (2A-2E) e 12 (2F-2J) dias tratados com solução fisiológica (GS), 100 mg (GA100) ou 500 mg (GA500) de amoxicilina. Figuras 2A (GA100) e 2B (GA500) – germes dentários em fase de formação de coroa (ratos de 7 dias). Uma camada contínua de ameloblastos (A), exibindo formato cilíndrico, reveste a superfície da matriz do esmalte (Me). Na periferia da papila dentária em diferenciação (Pd) são observados odontoblastos (Od) adjacente à superfície da dentina em formação (D). To, trabéculas ósseas. Barra: 60μm. Figuras 2C (GS), 2D (GA100) e 2E (GA500) – Detalhe da região de cúspide de molares de ratos com 7 dias, mostrando ameloblastos (A) com formato cilíndrico e núcleo situado no porção citoplasmática proximal da célula (setas). A espessura da matriz do esmalte (Me) apresenta-se reduzida nas cúspides dos molares dos grupos GA100 (Fig. 2D) e GA500 (Fig. 2E) em comparação ao grupo GS (Fig. 2C). Od, odontoblastos; To, trabéculas ósseas. Barra: 30 μm. Figuras 2F (GA100) e 2G (GA500) – germes dentários de ratos de 12 dias apresentando o 1º molar em fase de formação de raiz. A matriz do esmalte (Me) com espessura variável nas diferentes regiões da coroa apresenta-se revestida por ameloblastos de formato cúbico (A). Uma camada fina de dentina em formação é observada no terço cervical da raiz (DR). Od, odontoblastos na periferia da papila dentária em diferenciação (Pd). Barra: 60 μm. Figuras 2H (GS), 2I (GA100) e 2J (GA500) – Detalhe da região de cúspide de molares de ratos com 12 dias, mostrando o espaço do esmalte com remanescentes da matriz do esmalte (Me). Os ameloblastos (A) com formato cúbico delimitam o espaço do esmalte. Barra: 30 μm. Figuras 3A-3C – Fotomicrografias mostrando ameloblastos (A) na região de cúspide aos 7 dias. Figs. 3A (GS), 3B (GA100) e 3C (GA500) – ameloblastos (A) com formato cilíndrico e núcleos situados na porção citoplasmática proximal. Estruturas esféricas com tamanho variado com aspecto semelhante a vacúolos (setas) são observadas na porção citoplasmática distal dos ameloblastos (A) nos germes dentários dos ratos tratados com amoxicilina (Figs. 3B e 3C). Me, matriz do esmalte; PT, processo de Tomes. Barra: 6 μm. 47 Capítulo 1 A análise quantitativa da espessura do esmalte na região de cúspide revelou uma redução significante (p<0,001) nos molares dos ratos dos grupos GA100 e GA500 em comparação ao grupo controle, no período de 7 dias (Compare a Fig. 2C com a Fig. 2D e Fig. 2E; Fig. 4). Um significante aumento na espessura do esmalte foi verificado no período de 12 dias, em todos os grupos. No entanto, diferenças estatisticamente significantes não foram detectadas entre os grupos (p=0,111) nos germes dos molares de ratos de 12 dias (Figs. 2H-2J; Fig. 4). 0 50 100 150 200 250 GS GA500 GA100 Es pe ss ur a (µ m ) 7 dias 12 dias b a a c c c Figura 4 – Médias amostrais (colunas) e intervalos de confiança de 95% para as médias (barras verticais) de espessura da matriz do esmalte de germes de molares aos 7 e 12 dias. Nota: Médias acompanhadas de letras iguais não são significativamente diferentes pelo teste de Tukey (p>0,05). Imuno-histoquímica para detecção de Amelogenina e MMP-20 A reação imuno-histoquímica para detecção de amelogenina realizada nos cortes frontais de molares de ratos com 7 dias revelou imunomarcação no citoplasma dos ameloblastos e na matriz do esmalte (Figs. 5A-5C). Embora toda a extensão da camada de ameloblastos foi imunopositiva à amelogenina, um padrão distinto de imunomarcação foi observado nas diferentes regiões, ou seja, na região de cúspide e região cervical da coroa dos molares em desenvolvimento. Na região cervical da 48 Capítulo 1 coroa dos molares, a intensidade da imunomarcação para amelogenina foi, frequentemente, maior quando comparado ao da região de cúspide. Além disso, os valores obtidos para intensidade de imunomarcação anti-amelogenina, nas duas regiões analisadas, foram maiores no GS em comparação aos grupos GA100 e GA500. No entanto, diferenças estatisticamente significantes não foram detectadas entre as duas regiões, nos diferentes grupos (Tabela 1). Tabela 1 – Médias (DP) de escores de Intensidade de marcação de Amelogenina. Grupo Regiões Cúspide Cervical GS 308 (82) a 325 (55) a GA100 225 (32) a 285 (49) a GA500 275 (55) a 300 (65) a Nota: Médias acompanhadas de letras iguais não são significativamente diferentes pela anova: p>0,05. Os cortes submetidos a reação imuno-histoquímica para detecção de MMP-20 realizada nos molares de ratos de 12 dias exibiram ameloblastos e a matriz do esmalte imunomarcados (Figs. 6A-6D). Embora diferenças estatísticas não foram detectadas entre as regiões e grupos analisados, a análise dos valores obtidos com o H-score revelou que os ameloblastos na região média da coroa dos molares apresentou menor intensidade da imunopositividade à MMP-20 em relação as demais regiões, nos grupos GS e GA100; no grupo GA500, os valores obtidos nas regiões média e cervical das coroas dos molares foram semelhantes (Tabela 2). Tabela 2 – Médias (DP) de escores de Intensidade de marcação de MMP-20. Grupo Regiões Cúspide Média Cervical GS 292 (58) a 258 (38) a 283 (61) a GA100 300 (45) a 250 (45) a 292 (74) a GA500 283 (52) a 258 (66) a 258 (20) a Nota: Médias acompanhadas de letras iguais não são significativamente diferentes pela anova ou teste de Tukey: p>0,05 (as diferenças ocorreram na horizontal). Figuras 5A-5C – Fotomicrografias de corte frontal de cabeça de rato mostrando germe dentário de 1º molar de rato com 7 dias do grupo controle (GS) submetido a reação imuno-histoquímica anti- amelogenina e contracorado com hematoxilina. Fig. 5A - A camada de ameloblastos (A) exibe uma evidente imunopositiva (em castanho) por toda a sua extensão. Fig. 5B – na região de cúspide do molar, área demarcada em 5A, alguns grânulos imunomarcados (setas) são observados dispersos na porção distal dos ameloblastos (A). Fig. 5C – na região de cervical do molar, área demarcada em 5A, os ameloblastos (A) exibem evidente imunomarcação citoplasmática. Me, matriz de esmalte; D, dentina; Od, odontoblastos; Pd, papila dentária em diferenciação; Ac, Alça cervical. Barras: 150 μm (5A) e 15μm (5B e 5C). Figuras 6A-6D – Fotomicrografias de corte frontal de cabeça de rato mostrando germe dentário de 1º molar de rato com 12 dias do grupo controle (GS) submetido a reação imuno-histoquímica anti-MMP- 20 e contracorado com hematoxilina. Fig. 6A – toda extensão da camada de ameloblastos (A) apresenta imunopositividade à MMP-20; a matriz do esmalte exibe fraca e heterogeneamente positiva à MMP-20. As Figs. 6B-6D mostram as regiões de cúspide (Fig. 6B), média (Fig. 6C) e cervical (Fig. 6D) demarcadas em 6A. Evidente imunomarcação citoplasmática (em castanho) é observada nos ameloblastos nas diferentes regiões do molar em desenvolvimento. Me, matriz de esmalte; D, dentina; Od, odontoblastos; Pd, papila dentária em diferenciação. Barras: 150 μm (5A), 15 μm (5B) e 15 μm (6C e 6D). 50 Capítulo 1 Discussão Não há dados conclusivos sobre os fatores etiológicos da Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI) 2, 11, 38, 50, 88, 89. Estudos têm associado o uso de amoxicilina com a presença de HMI em humanos 38, 50, 74, 76, 89. Porém não há evidências se o defeito de esmalte está associado à doença infecciosa ou à febre ou ao tratamento com amoxicilina, ou a ambos 2, 74. Pouco é conhecido sobre a patogenia da HMI, se está relacionado à secreção da matriz proteica e/ou maturação dessa matriz, tornado obscuro o distúrbio ocorrido no ameloblasto. Sabe-se que dentes afetados pela HMI apresentam o esmalte com espessura normal, porém poroso e susceptível à fratura; há evidências de que o esmalte apresenta redução de 20% do conteúdo mineral 24, 28, 42. Tem sido relatado também que o esmalte com HMI contém maior concentração de proteínas oriundas do fluido oral e sangue, porém as proteínas típicas do esmalte não apresentam alterações significantes 56. O conhecimento dos fatores envolvidos na patogenia da HMI é essencial para prevenção dessas lesões, dado o sucesso ocorrido na prevenção dos defeitos de esmalte induzidos pela tetraciclina e fluoreto 17, 83. O modelo animal têm sido utilizado para investigar o efeito de fatores sistêmicos e ambientais no desenvolvimento do esmalte dentário, uma vez que o esmalte é uma estrutura que não sofre processo remodelação semelhantemente ao tecido ósseo; portanto, o distúrbio promovido por determinados agentes podem permanecer registrados a estrutura do esmalte 1, 17, 58, 66. Ademais, os germes de molares de ratos permitem estudar de vários estágios da amelogênese em um mesmo corte, possibilitando a correlação desses estágios com os eventos da amelogênese que ocorrem em humanos 58. Até o momento, o presente estudo é o primeiro a avaliar in vivo o efeito da exposição crônica da amoxicilina no desenvolvimento do esmalte dentário de ratos. As doses de 100 mg/kg e 500 mg/kg de amoxicilina por dia foram estimadas simulando a exposição da criança à amoxicilina nos primeiros anos de vida, de acordo com a Academia Americana de Pediatria 5. Como metabolismo do rato e humano não são similares, houve a necessidade de doses mais altas de amoxicilina 51 Capítulo 1 para analisar efeito da amoxicilina no desenvolvimento do esmalte dentário em ratos, como aquelas observadas nos estudos prévios que avaliaram o efeito de substâncias como fluoreto, macrolídeos e outros fatores na amelogênese 1, 17, 53. Os nossos resultados mostraram que a espessura do esmalte foi significantemente reduzida aos 7 dias, indicando que a amoxicilina deve interferir com o início da amelogênese, promovendo um atraso na diferenciação dos ameloblastos ou no processo de síntese da matriz protéica. Neste período os ameloblastos em estágio de secreção, com formato cilíndrico alto, núcleo elíptico e polarizado, apresentaram na sua porção citoplasmática distal estruturas com tamanho variado e aspecto semelhante aos vacúolos, sugerindo uma possível interferência da amoxicilina na síntese e secreção das proteínas do esmalte. Estas alterações foram observadas em ambos os grupos (ratos tratados com 100 mg/kg ou 500 mg/kg de amoxicilina) e, portanto, não foram dose dependente. Alterações semelhantes foram descritas com a adição de 2,0 a 3,6 mg/mL de amoxicilina ou amoxicilina associada ao fluoreto (12 µM ou 15 µM NaF) ao meio de cultura contendo germes de molares de camundongos, essas alterações foram associadas a um efeito inibitório da amoxicilina na diferenciação dos ameloblastos 65. De fato, diferenças significantes na espessura do esmalte não foram detectadas entre os grupos tratados e controle nos ratos com 12 dias. Assim é possível que a menor espessura de esmalte encontrada aos 7 dias possa ser resultado de um atraso no processo de diferenciação dos ameloblastos a partir das células do epitélio interno do órgão do esmalte. Alterações na função do ameloblastos são responsáveis por alteração na composição orgânica da matriz ou diminuição do conteúdo inorgânico 88. Apesar das alterações observadas aos 7 dias, diferenças no padrão de imunoexpressão da amelogenina pelos ameloblastos não foram observadas. As amelogeninas são as principais proteínas secretadas na fase de secreção da matriz protéica, essenciais para a deposição e crescimento dos cristais de hidroxiapatita 30, 31, 60. Acredita-se que moléculas de amelogeninas formem nanosferas que constituem um arranjo estrutural complexo que desempenha um papel modulador na deposição e orientação dos cristais de hidroxiapatita 31. Assim, considerando que alterações significantes na imunoexpressão para amelogenina não foram observadas nos molares de ratos 52 Capítulo 1 tratados com amoxicilina, é concebível sugerir que a amoxicilina não tenha provocado alterações na mineralização do esmalte e, consequentemente, não induziu a HMI em ratos. No entanto, há evidências de que o processo de mineralização do esmalte depende de enzimas, dentre elas a MMP-20, que degradam proteínas do esmalte a fim de possibilitar a sua mineralização 1, 10, 68, 70, 73. A análise da imunoexpressão da MMP-20 na camada de ameloblastos nos primeiros molares de ratos de 12 dias, período final de secreção e início de maturação do esmalte, não revelou diferenças significantes entre os grupos tratados e controle. Portanto, estes resultados reforçam a ideia de que a amoxicilina não promove distúrbios no processo de mineralização e/ou maturação do esmalte. Esses dados sugerem que a exposição crônica à amoxicilina tenha influência em fases específicas da amelogênese; é possível que a amoxicilina promova uma interferência na diferenciação dos ameloblastos como previamente relatado por Sahlberg et al.65 (2013). Embora o mecanismo de ação da amoxicilina na amelogênese ainda não seja conhecido 2, 50, 65. É possível que a amoxicilina interfira na deposição e mineralização da matriz de dentina que exerce um papel indutor sobre os pré-ameloblastos em diferenciação 82. Ratos tratados com 3,0 g de amoxicilina apresentaram molares com áreas extensas de dentina hipomineralizada indicando, portanto, que a amoxicilina pode promover distúrbios no processo de mineralização da dentina 48. Estudos em animais relatam a interferência de outros fatores na amelogênese, como os hormonais, nutricionais, sistêmicos, genéticos e ambientais 1, 17, 47, 53, 58, 65, 83, 88. Esses fatores externos influenciam os ameloblastos e a amelogênese, diferentemente, dependendo dos estágios do ciclo de vida do ameloblasto, resultando em diferentes tipos de defeitos. Bronckers et al.17 (2009) descreveram a susceptibilidade dos ameloblastos ao fluoreto nos diferentes períodos da amelogênese, salientando que no estágio morfogenético, os ameloblastos são resistentes ao fluoreto; em contraposição, os pré-ameloblastos são susceptíveis às doses moderadas de fluoreto, resultando em alteração na estrutura celular e redução síntese protéica. No estágio secretor, a crônica exposição ao fluoreto também reduziu a espessura do esmalte em aproximadamente 10% 72, 91. Dentre os fatores estudados e sua patogenia, é conhecido que o fluoreto causa hipomineralizada pois interfere na 53 Capítulo 1 retenção de proteínas como as ameloblastinas e as enamelinas durante a fase de maturação da matriz do esmalte, provoca alteração na atividade proteolítica dessas proteínas, e alteração crescimento dos cristais 16, 17. O uso de macrolídeo durante a amelogênese, em ratos, provocou aumento de picnose nos ameloblastos em estágio de transição (secretor/maturação), e áreas pontuais com alterações degenerativas nos ameloblastos durante a maturação. Em análise microradiográfica, revelaram áreas hipomineralizadas na superfície do esmalte indicando um possível efeito inibitório do fármaco no processo de diferenciação no estágio secretor-maturação do ameloblasto 1. Alterações estruturais nos ameloblastos e na matriz de esmalte foram também reportadas em consequência ao tratamento com tetraciclina; ameloblastos exibindo picnose, grânulos de autofagia e ausência de processo de Tomes estavam frequentemente associados à uma matriz do esmalte irregular e com espessura diminuída em algumas áreas 88. De acordo com os dados observados, conclui-se que a amoxicilina interferiu nos estágios iniciais da amelogênese, provocando redução da matriz do esmalte e alterações morfológicas nos ameloblastos. Não há evidência sobre o mecanismo de ação desse fármaco na amelogênese, dentre as hipóteses estudadas, acredita-se que a amoxicilina provoca atraso na diferenciação dos ameloblastos em células secretoras. É possível que a amoxicilina possa atrasar o processo de mineralização da dentina 48 e consequentemente atrasar a diferenciação dos ameloblastos. Estudos experimentais são necessários para evidenciar o mecanismo de ação da amoxicilina em ameloblastos, incluindo análise ultraestrutural de experimentos in vitro. Agradecimentos Agradeço ao Sr. Luis Antônio Potenza e Pedro Sérgio Simões pela assistência técnica. As agências FAPESP (11/13569-6; 11/17209-4) e CAPES pela contemplação de recursos para realização desta pesquisa. 54 Capítulo 1 Referências 1.   Abe  T,  Miyajima  H,  Okada  K.  Effects  of  a  macrolide  antibiotic  on  enamel   formation   in  rat   incisors-­‐-­‐primary   lesion  of  ameloblast  at   the   transition   stage.  The   Journal  of  veterinary  medical   science  /   the   Japanese  Society  of   Veterinary  Science  2003;65:985-­‐8.   2.   Alaluusua  S.  Aetiology  of  Molar-­‐Incisor  Hypomineralisation:  A  systematic   review.  European  archives   of   paediatric   dentistry   :   official   journal   of   the   European  Academy  of  Paediatric  Dentistry  2010;11:53-­‐8.   3.   Alaluusua  S,  Lukinmaa  PL,  Koskimies  M,  Pirinen  S,  Holtta  P,  Kallio  M,  et   al.   Developmental   dental   defects   associated   with   long   breast   feeding.   European  journal  of  oral  sciences  1996;104:493-­‐7.   4.   American  Academy  of  Pediatrics  Subcommittee  on  Management  of  Acute   Otitis   M.   Diagnosis   and   management   of   acute   otitis   media.   Pediatrics   2004;113:1451-­‐65.   5.   Arrow   P.   Risk   factors   in   the   occurrence   of   enamel   defects   of   the   first   permanent   molars   among   schoolchildren   in   Western   Australia.   Community  dentistry  and  oral  epidemiology  2009;37:405-­‐15.   6.   Bartlett   JD,  Beniash  E,   Lee  DH,   Smith  CE.  Decreased  mineral   content   in   MMP-­‐20   null  mouse   enamel   is   prominent   during   the  maturation   stage.   Journal  of  dental  research  2004;83:909-­‐13.   7.   Beentjes  VE,  Weerheijm  KL,  Groen  HJ.  Factors  involved  in  the  aetiology  of   molar-­‐incisor  hypomineralisation   (MIH).  European   journal   of   paediatric   dentistry   :   official   journal   of   European   Academy   of   Paediatric   Dentistry   2002;3:9-­‐13.   8.   Bergus  GR,  Levy  BT,  Levy  SM,  Slager  SL,  Kiritsy  MC.  Antibiotic  use  during   the  first  200  days  of  life.  Archives  of  family  medicine  1996;5:523-­‐6.   9.   Bergus   GR,   Levy   SM,   Kirchner   HL,   Warren   JJ,   Levy   BT.   A   prospective   study   of   antibiotic   use   and   associated   infections   in   young   children.   Paediatric  and  perinatal  epidemiology  2001;15:61-­‐7.   10.   Bronckers   AL,   Jansen   LL,   Woltgens   JH.   Long-­‐term   (8   days)   effects   of   exposure   to   low   concentrations   of   fluoride   on   enamel   formation   in   hamster   tooth-­‐germs   in   organ   culture   in   vitro.  Archives   of   oral   biology   1984;29:811-­‐9.   11.   Bronckers   AL,   Lyaruu   DM,   DenBesten   PK.   The   impact   of   fluoride   on   ameloblasts   and   the  mechanisms   of   enamel   fluorosis.   Journal   of   dental   research  2009;88:877-­‐93.   12.   Cerri  PS,  Pereira-­‐Junior  JA,  Biselli  NB,  Sasso-­‐Cerri  E.  Mast  cells  and  MMP-­‐ 9   in   the   lamina  propria  during  eruption  of   rat  molars:  quantitative  and   immunohistochemical  evaluation.  Journal  of  anatomy  2010;217:116-­‐25.   13.   Crombie   FA,   Manton   DJ,   Weerheijm   KL,   Kilpatrick   NM.   Molar   incisor   hypomineralization:   a   survey   of   members   of   the   Australian   and   New   Zealand   Society   of   Paediatric   Dentistry.   Australian   dental   journal   2008;53:160-­‐6.   55 Capítulo 1 14.   da  Costa-­‐Silva  CM,  Jeremias  F,  de  Souza  JF,  Cordeiro  Rde  C,  Santos-­‐Pinto   L,  Zuanon  AC.  Molar  incisor  hypomineralization:  prevalence,  severity  and   clinical   consequences   in   Brazilian   children.   International   journal   of   paediatric   dentistry   /   the   British   Paedodontic   Society   [and]   the   International  Association  of  Dentistry  for  Children  2010;20:426-­‐34.   15.   Fagrell   TG,   Dietz   W,   Jalevik   B,   Noren   JG.   Chemical,   mechanical   and   morphological  properties  of  hypomineralized  enamel  of  permanent  first   molars.  Acta  odontologica  Scandinavica  2010;68:215-­‐22.   16.   Fearne  J,  Anderson  P,  Davis  GR.  3D  X-­‐ray  microscopic  study  of  the  extent   of  variations  in  enamel  density  in  first  permanent  molars  with  idiopathic   enamel   hypomineralisation.   British   dental   journal   2004;196:634-­‐8;   discussion  25.   17.   Fincham  AG,  Moradian-­‐Oldak  J,  Simmer  JP.  The  structural  biology  of  the   developing   dental   enamel   matrix.   Journal   of   structural   biology   1999;126:270-­‐99.   18.   Fincham   AG,   Simmer   JP.   Amelogenin   proteins   of   developing   dental   enamel.  Ciba  Foundation  symposium  1997;205:118-­‐30;  discussion  30-­‐4.   19.   Gunduz   B,   Karakas   A,   Terzi   H,   Oner   J,   Serin   E,   Kukner   A.   The   effect   of   pinealectomy   and   leptin   hormone   on   the   proliferation   and   apoptosis   activation   in   Syrian   hamster   testis   in   different   photoperiods.   International  journal  of  andrology  2009;32:343-­‐52.   20.   Hong   L,   Levy   SM,   Warren   JJ,   Bergus   GR,   Dawson   DV,   Wefel   JS,   et   al.   Primary   tooth   fluorosis   and   amoxicillin   use   during   infancy.   Journal   of   public  health  dentistry  2004;64:38-­‐44.   21.   Hong   L,   Levy   SM,   Warren   JJ,   Broffitt   B.   Amoxicillin   use   during   early   childhood  and  fluorosis  of  later  developing  tooth  zones.  Journal  of  public   health  dentistry  2011;71:229-­‐35.   22.   Hong  L,  Levy  SM,  Warren  JJ,  Dawson  DV,  Bergus  GR,  Wefel  JS.  Association   of   amoxicillin   use   during   early   childhood   with   developmental   tooth   enamel   defects.   Archives   of   pediatrics   &   adolescent   medicine   2005;159:943-­‐8.   23.   Jalevik   B.   Enamel   hypomineralization   in   permanent   first   molars.   A   clinical,   histo-­‐morphological   and   biochemical   study.   Swedish   dental   journal  Supplement  2001:1-­‐86.   24.   Jalevik   B,   Klingberg   G.   Treatment   outcomes   and   dental   anxiety   in   18-­‐ year-­‐olds  with  MIH,   comparisons  with  healthy   controls   -­‐   a   longitudinal   study.   International   journal   of   paediatric   dentistry   /   the   British   Paedodontic   Society   [and]   the   International   Association   of   Dentistry   for   Children  2012;22:85-­‐91.   25.   Jalevik   B,   Noren   JG.   Enamel   hypomineralization   of   permanent   first   molars:  a  morphological  study  and  survey  of  possible  aetiological  factors.   International   journal   of   paediatric   dentistry   /   the   British   Paedodontic   Society   [and]   the   International   Association   of   Dentistry   for   Children   2000;10:278-­‐89.   56 Capítulo 1 26.   Jalevik  B,  Odelius  H,  Dietz  W,  Noren  J.  Secondary  ion  mass  spectrometry   and   X-­‐ray   microanalysis   of   hypomineralized   enamel   in   human   permanent  first  molars.  Archives  of  oral  biology  2001;46:239-­‐47.   27.   Jasulaityte   L,  Weerheijm  KL,   Veerkamp   JS.   Prevalence   of  molar-­‐incisor-­‐ hypomineralisation   among   children   participating   in   the  Dutch  National   Epidemiological  Survey  (2003).  European  archives  of  paediatric  dentistry   :   official   journal   of   the   European   Academy   of   Paediatric   Dentistry   2008;9:218-­‐23.   28.   Jeremias   F,   de   Souza   JF,   Silva   CM,   Cordeiro   Rde   C,   Zuanon   AC,   Santos-­‐ Pinto  L.  Dental  caries  experience  and  Molar-­‐Incisor  Hypomineralization.   Acta  odontologica  Scandinavica  2013;71:870-­‐6.   29.   Katchburian  E,  Arana  V.  Esmalte.  In:  Histologia  e  embriologia  oral:  texto,   atlas,  correlações  clínicas.  Rio  de   Janeiro:  Guanabara  Koogan,  2002:171-­‐ 203.   30.   Kuijpers  MH,  van  de  Kooij  AJ,  Slootweg  PJ.  Review  article.  The  rat  incisor   in  toxicologic  pathology.  Toxicologic  pathology  1996;24:346-­‐60.   31.   Kumazawa  K,   Sawada  T,  Yanagisawa  T,   Shintani  S.  Effect  of   single-­‐dose   amoxicillin  on  rat  incisor  odontogenesis:  a  morphological  study.  Clinical   oral  investigations  2012;16:835-­‐42.   32.   Laisi  S,  Ess  A,  Sahlberg  C,  Arvio  P,  Lukinmaa  PL,  Alaluusua  S.  Amoxicillin   may   cause  molar   incisor   hypomineralization.   Journal   of   dental   research   2009;88:132-­‐6.   33.   Leite  GAS,  R.M.M.  S,   J.M.  T,  Porto   IM,  Souza  FB,  Gerlach  RF.  Exposure  to   lead   exacerbates  dental   fluorosis.  Archives   of   oral   biology   2011;56:695-­‐ 702.   34.   Mangum   JE,   Crombie   FA,  Kilpatrick  N,  Manton  DJ,  Hubbard  MJ.   Surface   integrity   governs   the   proteome   of   hypomineralized   enamel.   Journal   of   dental  research  2010;89:1160-­‐5.   35.   Marcondes  FK,  Bianchi  FJ,  Tanno  AP.  Determination  of  the  estrous  cycle   phases  of  rats:  some  helpful  considerations.  Brazilian  journal  of  biology  =   Revista  brasleira  de  biologia  2002;62:609-­‐14.   36.   Massa  LF,  Bradaschia-­‐Correa  V,  Arana-­‐Chavez  VE.   Immunocytochemical   study  of  amelogenin  deposition  during  the  early  odontogenesis  of  molars   in   alendronate-­‐treated   newborn   rats.  The   journal   of   histochemistry   and   cytochemistry  :  official  journal  of  the  Histochemistry  Society  2006;54:713-­‐ 25.   37.   Nanci  A.  Enamel:  Composition,  Development  and  Structure.   In:  Nanci  A,   ed.  Ten  Cate's  Oral  Histology,  Development,  Structure,  and  Function.  Rio  de   Janeiro:  Elsevier,  2008:141-­‐90.   38.   Nanci   A,   Zalzal   S,   Lavoie   P,   Kunikata   M,   Chen  W,   Krebsbach   PH,   et   al.   Comparative  immunochemical  analyses  of  the  developmental  expression   and   distribution   of   ameloblastin   and   amelogenin   in   rat   incisors.   The   journal   of   histochemistry   and   cytochemistry   :   official   journal   of   the   Histochemistry  Society  1998;46:911-­‐34.   57 Capítulo 1 39.   Rang   HP,   Dale   MM,   Ritter   JM,   Flower   RJ,   Henderson   G.   Antibacterial   drugs.  In:  Rang  &  Dale's  Pharmacology.  UK:  Elsevier  Health  Sciences  UK,   2011.   40.   Reith  EJ.  The  stages  of  amelogenesis  as  observed  in  molar  teeth  of  young   rats.  Journal  of  ultrastructure  research  1970;30:111-­‐51.   41.   Sahlberg   C,   Pavlic   A,   Ess   A,   Lukinmaa   PL,   Salmela   E,   Alaluusua   S.   Combined   effect   of   amoxicillin   and   sodium   fluoride   on   the   structure   of   developing  mouse  enamel  in  vitro.  Archives  of  oral  biology  2013.   42.   Schours   I,  Massler  M.  The   teeth.   In:  Farris  EJ,  Griffith   JQ,  eds.  The  rat   in   laboratory  investigation:  Hafner  Publishing  Co:  New  York,  1963:104-­‐60.   43.   Simmer   JP,   Hu   JC.   Expression,   structure,   and   function   of   enamel   proteinases.  Connective  tissue  research  2002;43:441-­‐9.   44.   Smith   CE.   Cellular   and   chemical   events   during   enamel   maturation.   Critical  reviews  in  oral  biology  and  medicine  :  an  official  publication  of  the   American  Association  of  Oral  Biologists  1998;9:128-­‐61.   45.   Smith  CE,  Nanci  A,  Denbesten  PK.  Effects  of  chronic  fluoride  exposure  on   morphometric   parameters   defining   the   stages   of   amelogenesis   and   ameloblast   modulation   in   rat   incisors.   The   Anatomical   record   1993;237:243-­‐58.   46.   Smith  CEe,  Nanci  A.  Overview  of  morphological  changes  in  enamel  organ   cells   associated   with   major   events   in   amelogenesis.   The   International   journal  of  developmental  biology  1995;39:153-­‐61.   47.   Souza  JF,  Costa-­‐Silva  CM,  Jeremias  F,  Santos-­‐Pinto  L,  Zuanon  AC,  Cordeiro   RC.   Molar   incisor   hypomineralisation:   possible   aetiological   factors   in   children   from   urban   and   rural   areas.   European   archives   of   paediatric   dentistry  :  official  journal  of  the  European  Academy  of  Paediatric  Dentistry   2012;13:164-­‐70.   48.   Souza  JF,  Jeremias  F,  Costa  Silva  CM,  Santos-­‐Pinto  L,  Zuanon  AC,  Cordeiro   Rde  C.  Hipomineralización  Incisivo  y  molar:  Diagnóstico  diferencial.  Acta   Odontol  Venezolana  2011;49:1-­‐  8.   49.   Souza  JF,  Jeremias  F,  Costa-­‐Silva  CM,  Santos-­‐Pinto  L,  Zuanon  AC,  Cordeiro   RC.   Aetiology   of   molar-­‐incisor   hypomineralisation   (MIH)   in   Brazilian   children.  European  archives  of  paediatric  dentistry  :  official  journal  of  the   European  Academy  of  Paediatric  Dentistry  2013.   50.   Soviero  V,  Haubek  D,  Trindade  C,  Da  Matta  T,  Poulsen  S.  Prevalence  and   distribution  of  demarcated  opacities  and  their  sequelae  in  permanent  1st   molars  and   incisors   in  7   to  13-­‐year-­‐old  Brazilian  children.  Acta  Odontol   Scand  2009;67:170-­‐5.   51.   Thesleff  I,  Keranen  S,  Jernvall  J.  Enamel  knots  as  signaling  centers  linking   tooth  morphogenesis  and  odontoblast  differentiation.  Advances  in  dental   research  2001;15:14-­‐8.   52.   Tredwin   CJ,   Scully   C,   Bagan-­‐Sebastian   JV.   Drug-­‐induced   disorders   of   teeth.  Journal  of  dental  research  2005;84:596-­‐602.   53.   Weerheijm   KL.   Molar   incisor   hypomineralization   (MIH):   clinical   presentation,  aetiology  and  management.  Dental  update  2004;31:9-­‐12.   58 Capítulo 1 54.   Weerheijm  KL,   Jalevik  B,  Alaluusua  S.  Molar-­‐incisor  hypomineralisation.   Caries  research  2001;35:390-­‐1.   55.   Westergaard   J.   Structural   changes   induced   by   tetracycline   in   secretory   ameloblasts   in   young   rats.   Scandinavian   journal   of   dental   research   1980;88:481-­‐95.   56.   Whatling   R,   Fearne   JM.   Molar   incisor   hypomineralization:   a   study   of   aetiological   factors   in   a   group   of   UK   children.   International   journal   of   paediatric   dentistry   /   the   British   Paedodontic   Society   [and]   the   International  Association  of  Dentistry  for  Children  2008;18:155-­‐62.   57.   Zhou  R,   Zaki  AE,   Eisenmann  DR.  Morphometry   and   autoradiography  of   altered   rat   enamel   protein   processing   due   to   chronic   exposure   to   fluoride.  Archives  of  oral  biology  1996;41:739-­‐47.     4 Capítulo 2 60 Capítulo 2 Effect of amoxicillin on the physical-chemical properties of enamel in rat teeth Souza JFa, Cerri PSb, Alaluusua Sc , Santos-Pinto La, Jernvall Jd, Sova Sd, Cordeiro RCLa aDepartment of Pediatric Dentistry, Dental School, UNESP - Univ. Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, Brazil bDepartment of Morphology, Laboratory of Histology and Embryology, Dental School, UNESP - Univ. Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, Brazil cDepartment of Pediatric and Preventive Dentistry, Institute of Dentistry, University of Helsinki, Helsinki, Finland dEvolution and Development Group, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland Short title: Amoxicillin and enamel developing Key words: X-Ray Microtomography, Dental Enamel, Amoxicillin, Amelogenesis. Word count: 2,970 Corresponding author: Rita de Cássia Loiola Cordeiro Faculdade de Odontologia de Araraquara - Departamento de Clinica Infantil Rua Humaitá, 1680 14801-903 Araraquara-SP Brazil Phone: +55 16 3301-6331. Fax: +55 16 3301-6329 E-mail: ritacord@foar.unesp.br *De acordo com as normas do periódico Calcified Tissue International 61 Capítulo 2 Abstract Background: Amoxicillin use in early childhood has been associated with molar- incisor hypomineralization. Cultured mouse molars have shown that amoxicillin interferes with enamel formation. However, there is no information of the amoxicillin effect on developing enamel in vivo. Aim. The aim of the study was to evaluate the effect of amoxicillin on the enamel structure of rat teeth. Materials and methods: Fifteen pregnant Holtzman rats (Rattus norvegicus albinus) were distributed randomly into three groups to receive saline (SG), 100 mg/kg/day amoxicillin (A100G), or 500 mg/kg/day amoxicillin (A500G), intragastrically, from days 13 to 22 of pregnancy. Ten offspring per group received the same dose until day 40. The animals were euthanized on day 40. A total of 60 upper incisors and 60 upper first molars from 30 animals were dissected. Calcium (Ca) determination was performed by the compleximetric titration method and phosphorus (Pi) determination by colorimetric analysis using a spectrophotometer at 680 nm. A total of 30 lower first molars from 15 animals were analyzed under X-ray microtomography (XMT). Differences in Ca and Pi content and electron density among the groups were analyzed by one-way ANOVA, using Statistica version 8.0 (StatSoft Inc, Tulsa, OK, USA). Results: Statistical differences were not observed in Ca content (p=0.180), Pi content (p=0.054), or XMT electron density (p=0.150) among the groups. Conclusion: Amoxicillin did not affect the mineral content of rat molars and incisors. Key words: X-Ray Microtomography, Dental Enamel, Amoxicillin, Amelogenesis. 62 Capítulo 2 Introduction The amelogenesis is a complex process involving cellular proliferation and differentiation by means of sequential interactions between epithelial and ectomesenchymal cells 59, 82. Amelogenesis has classically been divided into three major stages of the ameloblast life cycle, namely secretion, transition, and maturation. During the secretory stage, ameloblasts secrete large quantities of protein matrix (predominantly amelogenin), in which the enamel crystals grow. At the end of secretion, the ameloblasts deposit a final layer of aprismatic enamel with small crystals. Once the full thickness of enamel has been deposited, the cells undergo a short transitional stage into maturation. At this stage, the degradation of matrix proteins accelerates and the mineralization increases progressively until its completion 59, 63. Tooth development is a strictly gene-regulated process, but it undergoes influence of systemic and environmental factors. Strict regulation of the secretion and processing of organic enamel matrix is a prerequisite for the formation of mineral crystals 69, 71. Disturbances in the amelogenesis may result in defects in the enamel structure and composition, such as hypomineralized enamel 27, 78, 79. Experimental studies using animals have been reported pathological changes of the enamel surface as a result of exposure to toxic doses of several agents, including fluoride, amoxicillin, environmental toxicants (such as dioxins), and tetracycline 3, 17, 65, 88. Amoxicillin use during early childhood has been associated with enamel defects 2, 36, 37, 50, 65, 74, 89. Molar-incisor hypomineralization (MIH) is described as a hypomineralization of systemic origin of one to four first permanent molars and it is frequently associated with involvement of the permanent incisors 87. In MIH, porous enamel can break down easily, especially under the influence of masticatory forces, leaving dentin unprotected and thus predisposing to the development of carious lesions 44, 85, 87. The prevalence of MIH has been reported to range from 2.8 to 44% 21, 43, 44, 77, 86, 89. 63 Capítulo 2 Several studies have been described the microstructure of hypomineralized enamel as presenting less distinct prism sheaths and disorganized enamel. Moreover, the mechanical properties, hardness, and modulus of elasticity of enamel affected by MIH have lower values compared with normal enamel 24, 42, 79, 90 Other studies have shown changes in the chemical composition of molars affected by MIH 28, 42, 55. Experimental in vitro studies have investigated the effect of amoxicillin on tooth development 48, 50, 65. Amoxicillin alone, or associated with fluoride, has been found to affect amelogenesis in cultured mouse molars, resulting in reduced enamel thickness, which is indicative of delayed onset of the secretory stage by ameloblasts 65. In an in vivo study, dentin mineralization was found to be disturbed in rat molars after exposure to a single dose of amoxicillin 48. X-ray microtomography (XMT) has been employed for assessment of the severity of defects in enamel and other hard tissues 25, 26, 28. It is an essential tool, as it provides the opportunity to acquire high-quality morphological information with high spatial resolution by means of an accurate, quantitative method. It visualizes hidden details of structures and enables quantitative analyses such as measurement of actual mineral densities in mineralized tissues 26. The enamel structure and its chemical composition are complex, and different methods shoul