i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR) ESTUDO DOS EFEITOS DE EXTRATOS DE GLÂNDULAS SALIVARES DE FÊMEAS DE Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari:Ixodidae) NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE HOSPEDEIROS PÓS INOCULADOS LETÍCIA MARIA GRÁBALLOS FERRAZ HEBLING Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular). Fevereiro – 2011 ESTUDO DOS EFEITOS DE EXTRATOS DE GLÂNDULAS SALIVARES DE FÊMEAS DE Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari:Ixodidae) NA RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE HOSPEDEIROS PÓS INOCULADOS Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling Orientadora: Prof.ª Dra. Maria Izabel Camargo Mathias Co-orientadora: Dra. Karim Christina Scopinho Furquim Rio Claro 2011 Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular). ii À minha família, Luiz Fernando, meu esposo, Lucas e Cecília, meus queridos filhos, que puderam compreender o tempo que lhes neguei durante a realização deste trabalho... . À “família Polivet”, pelo apoio e empenho para que eu pudesse dedicar-me a este trabalho.... Dedico esta dissertação... iii Agradeço de modo muito especial, A Deus que abençoa minha vida, À minha família e meus amigos que dela participam. À Profa. Dra. Maria Izabel Camargo Mathias e Dra. Karim Christina Scopinho Furquim pela preciosa orientação, apoio, atenção e amizade. iv A vida tem duas faces: Positiva e negativa O passado foi duro mas deixou o seu legado Saber viver é a grande sabedoria Que eu possa dignificar Minha condição de mulher, Aceitar suas limitações E me fazer pedra de segurança dos valores que vão desmoronando. Nasci em tempos rudes Aceitei contradições lutas e pedras como lições de vida e delas me sirvo Aprendi a viver. (“Assim eu vejo a vida”, Cora Coralina) v AGRADECIMENTOS Aos docentes do Departamento de Biologia da UNESP campus Rio Claro, sempre dispostos a esclarecer minhas dúvidas. Às Profªs. Dras. Ana Maria Costa Leonardo e Márcia Regina Brochetto Braga pelo auxílio na identificação de células e utilização do laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular. Ao Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara do Departamento de Patologia Veterinária da UNESP campus de Jaboticabal, cujos conselhos e sugestões foram de grande importância para a realização deste trabalho. Aos técnicos dos laboratórios do Instituto de Biociências- UNESP de Rio Claro Gerson de Mello Souza e Antonio Sérgio Pascon e à secretária do Departamento de Biologia, Lucila de Lourdes Segalla Franco pela importante cooperação. A todos os colegas da Pós-Graduação, Alexsandro Santana Vieira, Andréa Mendez Araújo, Bruno Rodrigues Sampieri, Débora Caperucci Gracias, Elen Nodari, Gabriela Ortiz , Izabella Calligaris, Pablo Henrique Nunes, Patrícia Rosa de Oliveira, Paula Brienza, Sandra Eloisi Denardi, Silvana Beani Poiani, Tamires dos Santos, e, especialmente, André Arnosti, Beatriz Ochandio, Danielli Thieza Giratto, Débora Laís Justo Jacomini e Gislaine Cristina Roma pelo companheirismo e por estarem sempre prontos a ajudar, demonstrando sempre sua amizade. Aos colegas da Faculdade Anhanguera de Rio Claro, pelo estímulo e apoio nessa empreitada. Aos amigos da Clínica Veterinária Polivet, Maria Aparecida Francisco Alves, Carolina Martins, Juliana Ferreira e Luciane Danieli Silveira Fagundes cujo apoio foi imprescindível para a realização deste trabalho. A Aldo Alves pela grande ajuda no cuidado com os coelhos utilizados neste trabalho. Aos coelhos que foram utilizados neste experimento, que os resultados aqui obtidos possam justificar sua utilização. vi SUMÁRIO Resumo 01 Abstract 04 1 Introdução 06 2 Objetivo 10 3 Material e Métodos 12 3.1 Material 12 3.1.1Obtenção das Larvas de Rhipicephalus sanguineus (Início da Colônia) 12 3.1.1.1 Construção do Mecanismo Inoculador 12 3.1.2Obtenção das Ninfas de R. sanguineus 12 3.1.2.1 Construção da Câmara Alimentadora (BECHARA et al., 1995) 13 3.1.2.2. Fixação da Câmara Alimentadora (BECHARA et al., 1995) 13 3.1.3. Obtenção das Fêmeas Adultas de R. sanguineus 13 3.2. Métodos 14 3.2.1 Preparação dos Extratos Glandulares 15 3.2.2 Inoculação dos Extratos nos Hospedeiros 16 3.2.3. Obtenção de Amostras de Pele da Região da Lesão de Fixação dos Carrapatos 16 3.2.4. Análise Histopatológica 17 3.2.5. Teste Desafio com Avaliação dos Desempenhos Alimentares e Reprodutivos (Potencial Biótico) das Fêmeas de R. sanguineus 17 3.2.6. Análise Histológica das Glândulas Salivares das Fêmeas de R. sanguineus Alimentadas nos Hospedeiros Imunizados com os Extratos 17 4. Resultados 34 Capitulo I PROTOCOL TO OBTAIN AND INOCULATE SALIVARY GLAND EXTRACTS OF Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI, IXODIDAE) IN RABBIT HOSTS 38 Capitulo II INOCULATION OF SALIVARY GLAND EXTRACT OBTAINED FROM FEMALE OF Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI, 59 vii IXODIDAE) WITH 2, 4 AND 6 DAYS OF FEEDING IN RABBIT: I. HISTOPATHOLOGY OF THE FEEDING LESION Capitulo III INOCULATION OF GLANDULAR EXTRACTS OF Rhipicephalus sanguineus FEMALES (LATREILLE, 1806) (ACARI, IXODIDAE) WITH 2, 4 AND 6 DAYS OF FEEDING IN RABBITS. II. INFLAMMATORY CELLS IN THE FEEDING LESION 85 Capitulo IV Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI, IXODIDAE) FEMALES FED ON RABBITS IMMUNIZED WITH EXTRACTS OF SALIVARY GLANDS IN DIFFERENT PERIODS OF THE SECRETORY CYCLE. ANALYSIS OF THE FEEDING AND REPRODUCTIVE PARAMETERS. 105 Capitulo V TICKS’ RESPONSE TO FEEDING ON HOST IMMUNIZED WITH GLANDULAR EXTRACTS OF Rhipicephalus sanguineus FEMALES FED FOR 2, 4 AND 6 DAYS. I. INACTIVITY OR EARLY DEGENERATION OF SALIVARY GLANDS? 134 5. Discussão Geral 137 6.Conclusões 146 7 Referências 148 Resumo Resumo_____________________________________________________________________ 1 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Resumo Este estudo abordou os efeitos de extratos de glândulas salivares de fêmeas de Rhipicephalus sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação (EGS2-EGS6) em coelhos New Zealand White virgens de infestação inoculados três vezes a intervalos de 21 dias. Os animais inoculados foram desafiados com carrapatos R. sanguineus, para verificar a influência dos extratos sobre a resposta imune-inflamatória dos hospedeiros. Foram estudadas as alterações histopatológicas na pele dos hospedeiros na região da lesão de fixação dos carrapatos, os parâmetros alimentar e reprodutivo das fêmeas obtidas da infestação desafio, bem como suas glândulas salivares aos 2, 4 e 6 dias de alimentação. Para obtenção dos extratos glandulares utilizou-se 55 fêmeas (110 glândulas salivares) com 2 dias de alimentação, 36 (72 glândulas) com 4 dias e 25 (50 glândulas) com 6 dias, de onde obteve-se os extratos: EGS2, a partir de glândulas salivares de fêmeas com 2 dias de alimentação; EGS4 com 4 dias, e, EGS6 com 6 dias. Os resultados revelaram que os diferentes extratos glandulares estimularam o desenvolvimento de resposta imune- inflamatória na pele dos hospedeiros comprometendo os processos alimentar e reprodutivo das fêmeas dos carrapatos. Os hospedeiros do grupo GT (EGS4) mostraram a formação de um intenso e precoce infiltrado de células inflamatórias, sinalizando que este foi o extrato mais eficaz no desenvolvimento da resposta imune-inflamatória local. Por outro lado, a resposta dos hospedeiros do grupo GT (EGS6) à infestação foi mais tardia e com menor ocorrência desse infiltrado. Já o processo inflamatório local nos hospedeiros do GT (EGS2) foi o menos intenso. O teste de desafio mostrou médias para os parâmetros alimentar e reprodutivo das fêmeas oriundas da infestação desafio que não foram significativamente diferentes, com exceção do peso médio de ingurgitamento das fêmeas do grupo GT (EGS6). Contudo, considerou-se que estes efeitos ocorreram em virtude das respostas desenvolvidas pelos hospedeiros, visto que a análise histopatológica da pele bem como o estudo histológico das glândulas salivares revelaram diferenças em relação à imunização com os diferentes extratos. Neste sentido, verificou-se que os extratos EGS2 e EGS4 poderiam alterar os parâmetros alimentar e reprodutivo dos carrapatos infestantes, mostrando ação na imunização dos hospedeiros contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Embora com ação específica, o EGS2 reduziu o número de descendentes (ação na reprodução) enquanto o EGS4 reduziu o número de carrapatos que ingurgitaram por completo (ação na alimentação), principalmente devido à morte dos mesmos. Além disso, ambos os extratos reduziram o consumo de sangue pelos ectoparasitas. Já o extrato EGS6 não foi eficaz, estimulando a alimentação dos ectoparasitas. Desta forma, embora estatisticamente as diferenças entre os parâmetros não tenham sido Resumo_____________________________________________________________________ 2 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling significativas, nos animais dos grupos GT, estas diferenças poderiam ser reflexo da imunização dos hospedeiros com os extratos glandulares, as quais influenciaram na resposta imune-inflamatória, fornecendo informações importantes para estudos futuros sobre o desenvolvimento de métodos de controle da infestação por carrapatos (vacinas). Abstract Abstract_________________________________________________________________________ 4 Abstract This study addressed the effects of salivary glands extracts of Rhipicephalus sanguineus females with 2, 4 and 6 days of feeding (EGS2-EGS6) in New Zealand White rabbits naive inoculated three times at intervals of 21 days. The inoculated animals were challenged with R. sanguineus ticks to verify the influence of extracts on the host’s immune-inflammatory response. Changes in the hosts’ skin at the feeding lesion, feeding and reproductive parameters as well salivary glands with 2, 4 and 6 days of feeding of females obtained from the challenge infestation were studied. To obtain the glandular extracts, we used 55 females (110 salivary glands) with 2 days of feeding, 36 (72 glands) with 4 days and 25 (50 glands) with 6 days, which were obtained the extracts: EGS2, from salivary glands of females with two days of feeding; EGS4 with 4 days and EGS6 with 6 days. The results revealed that the different glandular extracts stimulated the development of immune-inflammatory response in the hosts’ skin compromising the feeding and reproductive processes of the female ticks. The hosts of the TG group (EGS4) showed the formation of an early and intense infiltration of inflammatory cells, indicating that this extract was more effective in developing the local inflammatory-immune response. On the other hand, the response of the TG group hosts (EGS6) to the infestation was delayed and with lower incidence of this infiltrate. The local inflammatory process in the GT hosts (EGS2) was the less intense. The challenge test showed averages for feeding and reproductive parameters of females from infestation challenge that were not significantly different, with the exception of the engorgement average weight of females from TG group (EGS6). However, it was considered that these differences occurred because of the responses developed by the hosts, since the histopathology of the skin and the histological study of the salivary glands revealed these differences in relation to immunization with the different extracts. In this sense, it was found that the extracts EGS2 and EGS4 reduced feeding and reproductive parameters of infesting ticks, being effective in immunizing hosts against R. sanguineus tick infestation. Although acting specifically, the EGS2 reduced the number of offspring (action on reproduction) while the EGS4 reduced the number of ticks that engorged completely (action on feeding), mainly due to their death. Moreover, both extracts reduced the consumption of blood by ectoparasites. The EGS6 extract was not effective, stimulating feeding of the ectoparasites. Thus, although statistically the differences between the parameters were not significant, in animals from TG groups the differences are reflections of hosts’ immunization with glandular extracts that influenced the immune-inflammatory response, thus providing important information for future studies on the development of tick infestation control methods (vaccines). Introdução Geral Introdução__________________________________________________________________ 6 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 1.Introdução O carrapato Rhipicephalus sanguineus é popularmente conhecido como carrapato do cão por ter este animal como seu principal hospedeiro, embora também possa parasitar outros mamíferos, inclusive o homem (REY, 1973). É encontrado em regiões tropicais e temperadas (WALKER, 1994). Também é reconhecido como praga urbana por estar bem adaptado aos centros urbanos (LABRUNA; PEREIRA, 2001). Assim, é considerado um dos principais problemas parasitários em canis, ambientes domiciliar e peridomiciliar além de áreas rurais (PAZ et al. 2008). A espécie R. sanguineus tem importância em saúde pública e veterinária, pois além da ação espoliativa sobre o hospedeiro, é conhecida como vetor de patógenos como a Babesia canis e a Ehrlichia canis (DANTAS-TORRES, 2008). A alimentação dos carrapatos dá-se basicamente devido à ação combinada das estruturas bucais e da saliva, produzida pelas glândulas salivares (BALASHOV, 1972). Nos ixodídeos, as glândulas salivares são órgãos importantes para o sucesso biológico, atuando na produção de substâncias necessárias aos processos de fixação e alimentação (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985; GILL; WALKER, 1987) e também a evasão da resposta imune-inflamatória do hospedeiro (PECHOVÁ et al, 2002). Segundo Sonenshine (1991), a saliva é uma mistura complexa de substâncias que apresentam diferentes funções, como a manipulação dos processos hemostático, inflamatório e imunológico do hospedeiro. Sua ação anti-hemostática dá-se por aumento do fluxo sangüíneo na região da lesão de fixação, por meio da secreção de agentes vasoativos e anticoagulantes (SAUER et al., 2000). Sua ação anti-inflamatória e imunossupressora dá-se por substâncias que inibem a ação de citocinas envolvidas na resposta imune inata e adquirida (SAUER et al., 2000). A ação imunomoduladora da saliva dos carrapatos no hospedeiro acaba por atuar como facilitadora na transmissão de patógenos que encontram menores obstáculos à sua penetração e multiplicação (GILLESPIE et al., 2001; PECHOVÁ et al., 2002). Segundo Turni et al. (2002) diversas informações podem ser obtidas sobre a resistência adquirida por hospedeiros sensibilizados a diferentes espécies de carrapatos ou mesmo a uma só espécie, pois as moléculas imunossupressoras sintetizadas pelas glândulas salivares são diferentemente expressas durante a alimentação dos carrapatos. Além disso, glândulas salivares de espécies diferentes devem apresentar diferentes antígenos, em quantidades e concentrações diferentes (JAWORSKI et al., 1990; INOKUMA et al., 1994). A complexidade funcional das glândulas salivares, bem como a complexidade bioquímica da saliva é resultado da morfologia glandular. Assim, as glândulas salivares de fêmeas de carrapatos são compostas por ácinos dos tipos I, II e III (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985; GILL; Introdução__________________________________________________________________ 7 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling WALKER, 1987; SONENSHINE, 1991), onde aqueles do tipo I são agranulares e os II e III são granulares e atuam no processo de alimentação (BINNINGTON, 1978) e de osmorregulação do ectoparasita na fase de grande consumo de sangue (KAUFMAN; SAUER, 1982; SONENSHINE, 1991). Os ácinos do tipo II são constituídos pelas células secretoras dos tipos a, b, c1, c2, c3 e c4 (BINNINGTON, 1978) e em fêmeas de R. sanguineus, além destas, foram recentemente descritas as c5 e c6 (FURQUIM et al., artigo submetido). Sabe-se que as a estão envolvidas com a secreção do cemento (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985; FAWCETT et al., 1986; GILL; WALKER, 1987), e as b e c com a modulação da resposta do hospedeiro (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985). Os ácinos III, por sua vez, são constituídos por três tipos de células, as d, e e f (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985; GILL; WALKER, 1987; FURQUIM et al., artigo submetido), onde as d e e secretam componentes do cemento durante a fixação (BINNINGTON, 1978; WALKER et al., 1985; GILL; WALKER, 1987), e as f, substâncias relacionadas ao consumo de sangue pelo ectoparasita (BINNINGTON, 1978). Atualmente, o controle deste ectoparasita baseia-se no uso de acaricidas, no entanto, a toxicidade desses produtos e seu potencial de contaminação residual levam à busca de métodos eficientes de controle com baixo impacto tanto para o hospedeiro quanto para o meio ambiente (SAITO et al., 2005, NUTTAL et al. 2006). Assim, uma das formas de controle que atualmente tem merecido especial atenção é a utilização de vacinas, produzidas com apoio de técnicas de biologia molecular e de imunologia, que auxiliam na identificação de novos antígenos, oriundos principalmente dos aparelhos digestório, reprodutor e das glândulas salivares dos carrapatos. Estes métodos têm desenvolvido melhor resposta imune do hospedeiro e, portanto, habilitando-os a controlar essa ectoparasitose (TELLAM et al., 1992; WILLADSEN, 1997; NUTTAL et al., 2006). Uma proteção vacinal do hospedeiro contra o carrapato poderia prover também proteção contra as doenças transmitidas por estes ectoparasitas já que comprometeria a capacidade imunossupressora da saliva do carrapato permitindo ao hospedeiro montar uma resposta imune eficiente dificultando a transmissão de patógenos pela saliva do artrópode (NAZARIO et al. 1998; GILLESPIE et al., 2000; NUTTAL et al. 2006). A interação hospedeiro-ectoparasita envolvida no mecanismo de desenvolvimento de resistência aos carrapatos é bastante complexa (WILLADSEN, 1980; OBEREM, 1984). A ausência de resposta deletéria ao ácaro pode ser observada em algumas relações carrapato-hospedeiro (BRUMPT; CHABAUD, 1947; RANDOLPH, 1979). O cão doméstico, hospedeiro natural do R. sanguineus, não desenvolve resistência após repetidas infestações (CHABAUD, 1950; FERREIRA; Introdução__________________________________________________________________ 8 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling BECHARA, 1995; SZABÓ et al., 1995; BECHARA, 2006) ou após vacinação com extrato de carrapato adulto não alimentado seguida de infestação desafio com indivíduos da mesma espécie (BECHARA et al., 1995). No mesmo sentido, estudos realizados com o cachorro-do-mato Cerdocyon thous demonstraram que este ancestral do cão doméstico também não adquire imunidade à mesma espécie de carrapato (FERREIRA;BECHARA, 1995). Por outro lado, o carrapato R. sanguineus parece ser capaz de induzir marcada resistência em hospedeiros não habituais, como o coelho (CHABAUD, 1950) e cobaias submetidos à infestações sucessivas ou à vacinação com extrato de carrapato adulto não alimentado (BECHARA et al., 1995; SZABÓ et al., 1995; BECHARA, 2006). Brossard e Wikel (1997) relataram em hospedeiros resistentes ao carrapato a presença de neutrófilos e basófilos nas amostras de pele. Da mesma forma, Monteiro e Bechara (2008) demonstraram a presença de basófilos na lesão de fixação do carrapato Amblyomma cajennense em cabras submetidas a várias infestações. Além disso, Veronez et al. (2010) mostraram a presença de células inflamatórias provenientes de cobaias resistentes no lumem do intestino de carrapatos R. sanguineus infestantes. Diante dessas informações, este trabalho buscou obter dados que contribuíssem com o estudo do desenvolvimento de novas estratégias de controle do carrapato R. sanguineus através do desenvolvimento de resposta imune-inflamatória nos hospedeiros. Objetivo Objetivo_____________________________________________________________________ 10 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 2. Objetivo Geral: Avaliar a resposta imune-inflamatória de coelhos hospedeiros frente à inoculação de diferentes extratos (EGS2-EGS6) obtidos a partir de glândulas salivares de fêmeas de carrapato Rhipicephalus sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação. Específico: Avaliar a resposta dos hospedeiros sensibilizados e desafiados com R. sanguineus considerando-se: a) As alterações de caráter imune-inflamatório na lesão de fixação de fêmeas de R. sanguineus aos 2, 4 e 6 dias de alimentação nos hospedeiros do grupo teste bem como do grupo controle; b) A alimentação e a reprodução das fêmeas utilizadas na infestação desafio; c) As alterações no ciclo secretor de glândulas salivares de fêmeas com 2, 4 e 6 dias de alimentação fixadas em coelhos imunizados com os extratos (EGS2, EGS4 e EGS6). Material e Métodos Material_e_Métodos__________________________________________________________ 12 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 3. Material e Métodos 3.1. Material 3.1.1. Obtenção das Larvas de Rhipicephalus sanguineus (Início da Colônia) Para iniciar a colônia de R. sanguineus foram utilizadas quatro fêmeas matrizes completamente ingurgitadas, oriundas de colônia mantida em laboratório em condições controladas (28 o C ± 1ºC, 80% de umidade e de fotoperíodo de 12 horas) em estufa BOD no Departamento de Patologia Veterinária da UNESP campus de Jaboticabal (SP) e cedidas pelo Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara. A colônia em questão foi estabelecida em sala do Biotério do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP). Estas fêmeas foram mantidas em tubos plásticos, cuja tampa continha pequenos orifícios para oxigenação, onde ocorrereu a postura de ovos (15 dias após o completo ingurgitamento). Os ovos foram recolhidos e depositados no interior de um mecanismo inoculador desenvolvido pelo Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara (Fig. 1A). 3.1.1.1. Construção do Mecanismo Inoculador Seringas de 3 mL tiveram 2 cm de suas extremidades opostas às do êmbolo removidas. A abertura foi então vedada com algodão e o êmbolo foi removido, a massa de ovos foi depositada no interior da seringa, a abertura correspondente ao encaixe do êmbolo também foi vedada com algodão, este levemente umedecido. Na seqüência, o êmbolo foi encaixado parcialmente (Figs. 1A, 1C). O inoculador foi acondicionado em estufa BOD (Fig. 1B), até que ocorresse a eclosão das larvas, o que se deu em 7 dias. 3.1.2. Obtenção das Ninfas de R. sanguineus As larvas presentes no inoculador foram alocadas (1 inoculador/hospedeiro) no interior de câmaras alimentadoras fixadas em coelhos virgens de infestação (Figs. 1E-G). As larvas permaneceram alimentando-se até o ingurgitamento ( 7 dias) quando foram coletadas e mantidas em frasco plástico com a tampa contendo orifícios para a oxigenação. Os frascos Material_e_Métodos__________________________________________________________ 13 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling foram mantidos em condições controladas (28 o C ± 1ºC, 80% de umidade e fotoperíodo de 12 horas) em estufa BOD, até a muda para o estágio de ninfas, o que ocorreu em 7 dias. 3.1.2.1. Construção da Câmara Alimentadora (BECHARA et al., 1995) Um círculo de borracha fina de 9 cm de diâmetro foi cortado e revestido com tecido de algodão (que ficou em contato com a pele do hospedeiro). Em seguida outro círculo de 3.5 cm de diâmetro foi retirado do centro do círculo de 9 cm de diâmetro. Na borda deste foi fixado com cola plástica um tubo plástico de 2 cm de altura, que foi vedado internamente com a mesma cola e externamente com esparadrapo (Fig. 1D). Esse tubo plástico recebeu uma tampa com pequenos orifícios para que os carrapatos fossem supridos com ar (figs. 1E-G). 3.1.2.2. Fixação da Câmara Alimentadora (BECHARA et al., 1995) O hospedeiro, virgem de infestação, teve uma área da região dorsal tosada que recebeu uma camada de cola plástica (brascoplast®) (Fig. 1D). Da mesma forma, a câmara alimentadora (na região revestida com tecido de algodão) recebeu uma camada desta cola, que foi fixada na pele do coelho. A fixação foi reforçada com esparadrapo, que cobriu parte da câmara e da região tosada. Depois de fixada, a câmara alimentadora permaneceu 24 horas destampada para eliminar o odor da cola, para então serem depositados os carrapatos (larvas). Após a alocação das larvas, a primeira observação deu-se depois de 8 horas (tempo necessário para a acomodação dos parasitas), e a partir daí as seguintes deram-se diariamente. As larvas completamente ingurgitadas foram recolhidas, armazenadas nos inoculadores (Figs. 1H-I) e mantidas em condições controladas em estufa BOD (Fig. 1B), para a ecdise das ninfas, que ocorreu em 7 dias em média (Figs. 1K, L). 3.1.3. Obtenção das Fêmeas Adultas de R. sanguineus As ninfas foram alocadas em câmaras alimentadoras para engurgitamento que foram fixadas em coelhos virgens de infestação (Fig. 1J), segundo metodologia descrita por Bechara Material_e_Métodos__________________________________________________________ 14 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling et al. (1995). A primeira observação deu-se após 8 horas, e a partir daí as seguintes deram-se diariamente. Em 5 dias as ninfas completaram seu ingurgitamento (Figs. 1K-L), então foram coletadas e depositadas em tubos plásticos para sofrerem a muda para o estágio adulto (Fig. 1M), o que ocorreu em 5 dias. 3.2. Métodos Foram utilizadas fêmeas de R. sanguineus em jejum e submetidas a alimentação em coelhos New Zealand White. Os indivíduos em jejum (machos e fêmeas) foram oriundos de colônia mantida em estufa BOD em condições controladas (28 o C +/- 1ºC, 80% de umidade e fotoperíodo de 12 horas) em sala do Biotério do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP). As fêmeas em jejum foram utilizadas nas infestações A, B e C, que se realizaram em coelhos segundo procedimento descrito por Bechara et al. (1995). Foram realizadas três infestações, a saber: - Infestação A Foi realizada em coelhos virgens de infestação utilizando-se de 25 casais de carrapatos R. sanguineus/câmara (Figs. 1N, O), para aquisição de fêmeas de R. sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação, para produção dos extratos glandulares: EGS2, obtido a partir de glândulas salivares de fêmeas com 2 dias de alimentação, EGS4, a partir de glândulas de fêmeas com 4 dias de alimentação, e, EGS6, a partir de fêmeas com 6 dias de alimentação (Figs. 2A-C). Os períodos de alimentação escolhidos (2, 4 e 6 dias) foram determinados com base no ciclo secretor da glândula salivar, visto que indivíduos em jejum possuem as glândulas contendo ativas as células a, c1, c3, d e e, aqueles com dois dias de alimentação têm ativação das células b, c2, c4, c5, c6 e f, com 4 dias as c5 e f tornam-se inativas, permanecendo ativas apenas as a, b, c1-c4 e c6 e finalmente os indivíduos com seis dias de alimentação têm inativação das células c6 (FURQUIM, artigo submetido). Material_e_Métodos__________________________________________________________ 15 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Os extratos após serem preparados, foram adicionados de adjuvante completo de Freund e inoculados nos hospedeiros. - Infestação B (grupo teste GT) Foi realizada em 12 coelhos sensibilizados, sendo 4 inoculados com o extrato EGS2, 4 com o EGS4 e 4 com o EGS6, os quais foram submetidos à infestação desafio com 15 casais de carrapatos R. sanguineus adultos/hospedeiro (Figs. 6C, 7A). - Infestação C (grupo controle) Foi realizada em 8 coelhos virgens de infestação, sendo que 4 foram inoculados com mistura de adjuvante de Freund completo e tampão fosfato (grupo controle 2= GC2) e 4 não foram inoculados (grupo controle 1= GC1). Então, estes animais foram submetidos à infestação desafio com 15 casais de R. sanguineus adultos/hospedeiro (Fig. 7B). 3.2.1 Preparação dos Extratos Glandulares As fêmeas de R. sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação (infestação A) (Figs. 2A-C) foram retiradas do hospedeiro pela região do hipostômio com o auxílio de pinça cirúrgica por meio de movimentos circulares. A seguir, foram colocadas em placas de Petri para dissecção contendo solução salina (7,5 g de NaCl, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g de KH2PO4 e 1000 mL de água destilada), onde procedeu-se a remoção das glândulas salivares. Nas dependências do Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Biologia da UNESP Rio Claro (SP) as glândulas foram colocadas (separadamente por período de alimentação), em tubos eppendorfs contendo 200 µL de tampão fosfato pH 7.4, onde foram maceradas (Figs. 2D, E). Na seqüência os tubos foram centrifugados por 30 minutos a 10.000 xg (Fig. 2F), os sobrenadantes foram depositados em eppendorfs estéreis e encaminhados para a dosagem de proteínas, segundo metodologia descrita por Sedmark e Grossberg (1977) (método de Bradford) (Figs. 2G-I). Após a determinação do conteúdo protéico de cada amostra (Tabela 1), no interior de capela de fluxo laminar vertical pré-estéril (Figs. 3A, B), cada extrato foi, separadamente, diluído com tampão fosfato (concentração final de 0,2 µg/µL) e filtrado com auxílio de Material_e_Métodos__________________________________________________________ 16 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling unidades filtrantes estéreis (JBR610303, unidade filtrante descartável Millex GV, membrana durapore PVDF, Millipore, MilliUni), de 0,22 µm e diâmetro de 13mm, acopladas a seringas hipodérmicas (Figs. 3C-E). Depois os extratos foram aliquotados em volumes de 50 µL e novamente armazenados em eppendorfs estéreis em freezer a -20 o C. Somente no momento das inoculações realizou-se a mistura de cada um dos extratos (50 µL de extrato/hospedeiro) com 50 µL de adjuvante de Freund completo (referência n o F 5881, Sigma-Aldrich) (Fig. 3F). Tabela 1: Valores da dosagem protéica dos extratos obtidos a partir de glândulas salivares de fêmeas de Rhipicephalus sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação. Tempo de Alimentação 2 dias 4 dias 6 dias Concentração protéica 1,08 µg/µL 1,75 µg/µL 1,49 µg/µL 3.2.2 Inoculação dos Extratos nos Hospedeiros Em sala do Biotério do Departamento de Biologia da UNESP de Rio Claro (SP) os coelhos dos grupos GT (EGS2, 4 e 6) (4 coelhos/ extrato glandular) e do GC2 (4 coelhos) tiveram sua região dorso-lateral direita tosada (Fig. 4A) e subcutaneamente, via seringa hipodérmica, foram inoculados com os extratos EGS2, EGS4 e EGS6 (GT), bem como com AF+PBS (GC2) por três vezes a intervalos de 21 dias (Figs. 4B-D). Somente após 15 dias da última inoculação, todos os hospedeiros dos grupos GT (EGS2, 4 e 6) e GC1 e 2 foram submetidos à infestação desafio com 15 casais de R. sanguineus/hospedeiro (Figs. 4E-H, 5A-C). 3.2.3. Obtenção de Amostras de Pele da Região da Lesão de Fixação dos Carrapatos Os animais submetidos às infestações B e C tiveram amostras de pele retiradas do local da lesão de fixação das fêmeas de R. sanguineus aos 2, 4 e 6 dias após o início da alimentação, coletadas utilizando-se “punch” (saca-bocados) com 0,3 cm de diâmetro em área previamente anestesiada com xilocaina 2% sem vasoconstritor. No momento da coleta, o ectoparasita fixado ao hospedeiro foi seccionado na região do capítulo, permanecendo Material_e_Métodos__________________________________________________________ 17 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling somente o hipostômio fixado à pele do coelho. Com o “punch” posicionado no local e por meio de movimentos circulares retirou-se o fragmento de pele. As amostras coletadas foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% para histopatologia. 3.2.4. Análise Histopatológica Após a fixação, o material recolhido foi desidratado em concentrações crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e 95%), banhos de 20 minutos cada, foi transferido para resina de embebição, incluído e seccionado. A embebição e a inclusão foram em resina Leica. Os cortes foram seccionados com espessura de 3 m, recolhidos em lâminas de vidro e processados segundo a técnica de hematoxilina de Harris e eosina aquosa e Giemsa. As lâminas foram montadas em Bálsamo do Canadá e examinadas em fotomicroscópio Motic BA 300. 3.2.5. Teste Desafio com Avaliação dos Desempenhos Alimentares e Reprodutivos (Potencial Biótico) das Fêmeas de R. sanguineus Foi realizado em sala do Biotério do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP) utilizando-se as fêmeas infestantes dos coelhos dos grupos GT (infestação B) e GC1 e 2 (infestação C) (Figs. 5D-F, 6A-C, 7A-B). Para avaliação do efeito das imunizações foram considerados os seguintes parâmetros do ectoparasita: a) tempo necessário para as fêmeas completarem o ingurgitamento, b) porcentagem de recuperação de fêmeas em relação ao número liberado, c) avaliação do peso das fêmeas completamente ingurgitadas, d) tempo de oviposição, e) peso da massa de ovos, f) viabilidade dos ovos e g) índice de eficiência alimentar (peso da fêmea ingurgitada/tempo para fêmea completar o ingurgitamento) (JITTAPALAPONG et al., 2000a). A média desvio padrão dos parâmetros alimentares e reprodutivos foram analisados estatisticamente por meio do teste ANOVA com pós-teste de TUKEY, utilizando-se nível de significância de 5% (p < 0.05). Material_e_Métodos__________________________________________________________ 18 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 3.2.6. Análise Histológica das Glândulas Salivares das Fêmeas de R. sanguineus Alimentadas nos Hospedeiros Imunizados com os Extratos As fêmeas de carrapatos do grupo teste (GT) (infestação B) e controle (GC1 e GC2) (infestação C) com 2, 4 e 6 dias de alimentação foram retiradas do hospedeiro pela região do hipostômio com o auxílio de pinça cirúrgica por meio de movimentos circulares. A seguir, os carrapatos foram colocados em placas de Petri para dissecção contendo solução salina (7.5 g de NaCl, 2.38 g de Na2HPO4, 2.72 g de KH2PO4 e 1000 mL de água destilada) para a remoção das glândulas salivares. Na seqüência, as glândulas foram fixadas em paraformaldeido 4%, por 24 horas, a 4 o C. Após a fixação, o material foi desidratado em concentrações crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e 95%), banhos de 20 minutos cada, foi transferido para resina (Leica) de embebição, incluído e seccionado. O material foi seccionado com 3 µm de espessura. As seções recolhidas em lâminas de vidro foram coradas com hematoxiclina e eosina, montadas com bálsamo do Canadá e fotografadas em microscópio Motic BA 300. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 19 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 1: Imagens da colônia de carrapatos Rhipicephalus sanguineus estabelecida em sala no Biotério do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP). A. Estufa BOD onde ovos, larvas, ninfas e adultos de carrapatos foram mantidos. B. Inoculadores contendo ovos e acondicionados no interior da estufa BOD. C. Detalhe do inoculador contendo larvas. D. Material utilizado na preparação dos hospedeiros para receberem os carrapatos: máquina de tosa (1), cola plástica para fixação da câmara alimentadora (2), tubo plástico para confecção da câmara alimentadora (3) e câmara alimentadora para deposição dos ectoparasitas (4). E-G. Câmara alimentadora fixada com cola plástica e esparadrapo no dorso do hospedeiro. F- G. Detalhe da câmara aberta (F) e vedada com tampa contendo orifícios para oxigenação (G). H. Inoculador contendo larvas (5) e ninfas em jejum armazenadas em tubo plástico (6). I. Detalhe de H. J-L. Ninfas: (J) em início de alimentação no interior da camara alimentadora fixadas à pele do hospedeiro, (K) e (L) completamente ingurgitadas no interior de tubo plástico, onde as mesmas permanecem até se tornarem carrapatos adultos. L. Detalhe de K. M. Machos e fêmeas em jejum armazenados no interior de um tubo plástico. N-O. Machos e fêmeas em início de alimentação no interior da câmara alimentadora fixada à pele do hospedeiro. O. Detalhe de N. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 20 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 21 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 2: Imagens dos procedimentos para obtenção dos extratos glandulares (EGS2-EGS6) realizados no laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP). A-C. Carrapatos Rhipicephalus sanguineus no interior de câmara alimentadora fixada em coelho mantido em Biotério do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP). A. Infestação com carrapatos com 2 dias de alimentação. B. Infestação com carrapatos com 4 dias de alimentação. C. Com 6 dias de alimentação. D. Maceração das glândulas salivares em tubos eppendorf contendo tampão fosfato de sódio. E. Macerado glandular. F. Centrifugação do macerado glandular para obtenção dos extratos glandulares. G-H. Material e equipamento utilizado durante a dosagem protéica dos extratos glandulares. G. Cubetas onde o material teve a determinação da concentração protéica. H. Espectrofotometro para leitura e determinação do teor protéico. I. Freezer para armazenamento das alíquotas de 50 µL de cada um dos extratos EGS2-EGS6 (concentração final de 0,2 µg/µL). Material_e_Métodos__________________________________________________________ 22 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 23 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 3: Imagens dos procedimentos realizados no interior de capela de fluxo laminar do laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da UNESP de Rio Claro (SP) quando da preparação dos extratos glandulares (EGS2-EGS6) A. Esterelização a frio (luz UV= seta) dos materiais utilizados para a filtragem dos extratos. B. Fluxo laminar e seringas hipodérmicas (1), unidades filtrantes (2), tubos eppendorfs (3), pipeta (4) e ponteiras (5) para serem utilizados durante a filtragem dos extratos. C. Coleta do extrato com o auxílio de seringa hipodérmica (1) a qual foi acoplada à unidade filtrante (2). D. Seringa hipodérmica (1) e unidade filtrante (2). E. Filtragem do extrato (50 µL) e deposição em eppendorf estéril (3) contendo 50µL de adjuvante de Freund. F. Mistura (extrato e adjuvante) recolhida com auxílio de seringa hipodérmica estéril acoplada à agulha. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 24 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 25 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 4: Imagens dos procedimentos de inoculação dos extratos glandulares nos coelhos utilizados para realização das infestações desafio. A. Coelho hospedeiro utilizado na infestação desafio com a região dorso-lateral direita parcialmente tosada. B. Inoculação do extrato glandular. C e D. Desenvolvimento de granuloma (círculo pontilhado), devido ao processo inflamatório ali instalado após sucessivas inoculações dos extratos. C. Desenvolvimento de granuloma (círculo pontilhado) na pele de coelho após a realização da segunda inoculação. D. Desenvolvimento de granuloma (círculo pontilhado) após a realização da terceira inoculação E-H. Realização das infestações desafio. E. Detalhe de duas câmaras alimentadoras, uma com e outra sem tampa, em um único coelho. F-H. Detalhe de camaras alimentadoras destampadas mostrando diferentes etapas do processo alimentar do R. sanguineus. F. Estágio inicial de alimentação. G. Estágio alimentar mais avançado que o da figura F. H. Estágio alimentar intermediário. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 26 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 27 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 5: Imagens dos carrapatos R. sanguineus e dos coelhos utilizados nas infestações desafio. A-C. Câmaras alimentadoras destampadas mostrando diferentes etapas da alimentação do R. sanguineus. A. Estágio alimentar intermediário. B. Estágio final da alimentação. C. Fêmeas de R. sanguineus completamente ingurgitadas. D-F. Detalhe de câmaras alimentadoras fechadas em coelhos de diferentes grupos GT (EGS2-EGS6) utilizados para realização do teste de desafio. D. Coelho do grupo GT (EGS2). E. Coelho do GT (EGS4). F. Coelho representando aqueles do GT (EGS6). Material_e_Métodos__________________________________________________________ 28 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 29 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 6: Imagens dos coelhos utilizados durante as infestações desafio realizadas no Biotério do Departamento de Biologia da UNESP de Rio Claro (SP). A-B. Detalhe da câmara alimentadora fechada de coelhos dos grupos GC1 e GC2 utilizados para realização da infestação desafio (teste de desafio). A. Coelho do grupo GC2. B. Coelho do grupo GC1. C. Todos os indivíduos (4 coelhos/grupo) do grupo GT (EGS2-EGS6) em suas respectivas gaiolas utilizadas para realização do teste de desafio. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 30 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material_e_Métodos__________________________________________________________ 31 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figura 7: Imagens dos coelhos dos grupos GC1 e GC2 utilizados nas infestações desafio realizadas no Biotério do Departamento de Biologia da UNESP de Rio Claro (SP). A. Coelhos dos grupos CG2. B. Coelhos dos grupos CG1. Material_e_Métodos__________________________________________________________ 32 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Resultados Resultados__________________________________________________________________ 34 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 4. Resultados Os resultados obtidos no presente trabalho estão sendo apresentados na forma de capítulos, onde cada um contém um artigo submetido à publicação ou já publicado em periódico internacional especializado e com seletiva política editorial. CAPÍTULO 1 Título: Protocol to obtain and inoculate salivary gland extracts of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari, Ixodidae) in rabbit hosts. Autores: Karim Christina Scopinho Furquim, Maria Izabel Camargo Mathias, Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling, Danielli Thieza Giratto, Débora Laís Justo Jacomini, Márcia Regina Brochetto Braga and Gervásio Henrique Bechara Periódico: Ticks and Tick-Borne Diseases Situação: Submetido. CAPÍTULO 2 Título: Inoculation of salivary gland extract obtained from female of Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari, Ixodidae) with 2, 4 and 6 days of feeding in rabbit: I. Histopathology of the feeding lesion. Autores: Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling, Karim Christina Scopinho Furquim, Gervásio Henrique Bechara and Maria Izabel Camargo Mathias Periódico: Experimental and Applied Acarology Situação: Submetido. Resultados__________________________________________________________________ 35 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling CAPÍTULO 3 Título: Inoculation of glandular extracts of Rhipicephalus sanguineus females (Latreille, 1806) (Acari, Ixodidae) with 2, 4 and 6 days of feeding in rabbits. II. Inflammatory cells in the feeding lesion. Autores: Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling, Karim Christina Scopinho Furquim, Gervásio Henrique Bechara, Maria Izabel Camargo Mathias Periódico: Tissue and Cell Situação: Submetido. CAPÍTULO 4 Título: Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) (Acari, Ixodidae) females fed on rabbits immunized with extracts of salivary glands in different periods of the secretory cycle. Analysis of the feeding and reproductive parameters. Autores: Karim Christina Scopinho Furquim, Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling, Maria Izabel Camargo Mathias, Gislaine Cristina Roma, Leonardo Peres de Souza and Gervásio Henrique Bechara Periódico: Experimental and Applied Acarology Situação: Submetido. CAPÍTULO 5 Título: Tick’s response to feeding on host immunized with glandular extracts of Rhipicephalus sanguineus females fed for 2, 4 and 6 days. I. Inactivity or early degeneration of salivary glands? Resultados__________________________________________________________________ 36 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Autores: Karim Christina Scopinho Furquim, Maria Izabel Camargo Mathias, Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling, Gislaine Cristina Roma and Gervásio Henrique Bechara Periódico: Parasitology Research Situação: Publicado (DOI: 10.1007/s00436-010-2238-7). Capítulo I Capítulo I__________________________________________________________________ 38 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling PROTOCOL TO OBTAIN AND INOCULATE SALIVARY GLAND EXTRACTS OF Rhipicephalus sanguineus (LATREILLE, 1806) (ACARI, IXODIDAE) IN RABBIT HOSTS Karim Christina Scopinho Furquim a, * , Maria Izabel Camargo Mathias b , Letícia Maria Gráballos Ferraz Hebling b , Danielli Thieza Giratto b , Débora Laís Justo Jacomini b , Márcia Regina Brochetto Braga b and Gervásio Henrique Bechara a a Departamento de Patologia Veterinária, FCAV, UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Castellane, s/n, CEP: 14884-900, Jaboticabal, S.P., Brazil b Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP, Av. 24 A, nº 1515, Cx. Postal 199, CEP: 13506-900, Rio Claro, S.P., Brazil * Corresponding author. Fax: +55 19 35340009 E-mail address: karimfurquim@yahoo.com.br Capítulo I__________________________________________________________________ 39 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Resumo Glândulas salivares de fêmeas de Rhipicephalus sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação foram usadas para o desenvolvimento deste protocolo. Extratos estéreis de glândulas salivares induziram resposta imune em hospedeiros com eles inoculados sem, contudo, induzir-lhes patologias. Foram utilizadas 55 fêmeas alimentadas por 2 dias (110 glândulas salivares), 36 fêmeas alimentadas por 4 dias (72 glândulas salivares) e 25 fêmeas alimentadas por 6 dias (50 glândulas) para a obtenção de SGE2= extrato de glândula salivar de fêmeas alimentadas por 2 dias, SGE4= extrato de glândula salivar de fêmeas alimentadas por 4 dias, e SGE6= extrato de glândula salivar de fêmeas alimentadas por 6 dias. Após a remoção, as glândulas separadas por situação foram imersas em 200 µL de solução tampão., maceradas e centrifugadas. O sobrenadante foi recuperado e transferido a tubos eppendorf estéreis, e a concentração protéica foi determinada. A concentração protéica encontrada foi de 1.08 µg/µL no SGE2, 1.75 µg/µL no SGE4, e 1.49 µg/µL no SGE6. Após a determinação da concentração protéica, numa câmara de fluxo laminar pré-estéril, cada extrato foi diluído separadamente com tampão fosfato (concentração final de 0.2 µg/µL) e filtrado por meio de unidades filtrantes estéreis com poros de 0.22µm e 13 mm de diâmetro acopladas a seringas hipodérmicas. Foram obtidas 12 alíquotas de 50 µL para a realização das inoculações dos extratos (SGE2, SGE4, and SGE6). Cada extrato foi inoculado três vezes em grupos de 4 coelhos New Zealand White a intervalos de 21 dias. Imediatamente antes da inoculação, cada alíquota de extrato (50 µL contendo 10 µg de proteína ) foi adicionada de 50 µL de adjuvante completo de Freund. A inoculação subcutânea foi realizada utilizando-se seringas hipodérmicas na região dorso-lateral direita do hospedeiro. Decorridos 15 dias da última inoculação, os coelhos foram infestados com 15 casais de R. sanguineus em jejum. Esta metodologia descreveu um protocolo prático detalhado e procedimentos estandardizados para a realização de um experimento para a obtenção e inoculação de extratos glandulares que induzam uma resposta imune em hospedeiros sensíveis. Palavras-chaves: Rhipicephalus sanguineus, extratos de glândulas salivares, inoculação, sensibilização, resistência. Capítulo I__________________________________________________________________ 40 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Abstract Salivary glands of two, four, and six-day-fed Rhipicephalus sanguineus females were used to develop the present protocol. Sterile salivary gland extracts induced an immune response in inoculated hosts without inducing pathological conditions. Fifty-five two-day-fed females (110 salivary glands), 36 four-day-fed females (72 salivary glands), and 25 six-day- fed females (50 glands) were used to obtain SGE2= salivary gland extracts of two-day-fed females, SGE4= salivary gland extracts of four-day-fed females, and SGE6= salivary gland extracts of six-day-fed females. After removal, glands of each group were immersed in 200 µL phosphate buffer, macerated, and centrifuged. The supernatant was recovered and transferred to sterile eppendorf tubes and protein concentrations were determined. The protein concentrations found were 1.08 µg/µL in SGE2, 1.75 µg/µL in SGE4, and 1.49 µg/µL in SGE6. After determining the protein concentration in a pre-sterile vertical laminar flow hood, each extract was separately diluted with phosphate buffer (final concentration of 0.2 µg/µL) and filtered in sterile filtering units with pore size of 0.22 µm and 13 mm in diameter attached to hypodermic syringes. Twelve aliquots of 50 µL were obtained to perform 12 inoculations/gland extract (SGE2, SGE4, and SGE6). Each extract was inoculated three times in four naive New Zealand White rabbits at 21-day intervals. Immediately prior to inoculations, each aliquot (50 µL, 10 µg of protein) of each extract was mixed to 50 µL of Freund's complete adjuvant. Subcutaneous inoculation was carried out with hypodermic syringes in the right dorsolateral region of each host. Fifteen days after the third inoculation, rabbits were infested with 15 couples of unfed R. sanguineus. This methodology described a practical protocol with detailed and standardized procedures on how to set up and perform an experiment to obtain and inoculate tick gland extracts to induce an immune response in sensitized hosts. Keywords: Rhipicephalus sanguineus, salivary gland extracts, inoculation, sensitization, resistance. Capítulo I__________________________________________________________________ 41 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Introduction The salivary glands of ticks are organs that produce antigens that can stimulate defense mechanisms and evoke immune-inflammatory responses in their hosts (Sauer et al., 2000). According Sonenshine (1991), the saliva is a complex mixture that plays many roles, mainly in the manipulation of the host hemostatic, inflammatory, and immunological processes. Several studies have examined acquired resistance to ticks by hosts, as a response to successive infestations (Jittapalapong et al., 2000; Monteiro and Bechara, 2008; Monteiro et al., 2010; Caperucci et al., 2009, 2010; Veronez et al., 2010; Nunes et al., in press) or the inoculation of whole or parts (organs) of tick extracts (Wikel, 1981; Ferreira et al., 1996; Jittapalapong et al., 2000, 2008). Trager (1939) conducted the first study on acquired resistance to Dermacentor variabilis ticks in rabbits. Later, Shapiro et al. (1987) examined acquired resistance to Rhipicephalus appendiculatus in rabbits. Other studies on sensitized hosts with successive infestations (Jittapalapong et al., 2000; Monteiro and Bechara, 2008; Monteiro et al., 2010; Caperucci et al., 2009, 2010; Veronez et al., 2010; Nunes et al., in press) or the inoculation of molecules from salivary glands of three and five-day-fed ticks (Jittapalapong et al., 2000) demonstrated that the immunological response of hosts greatly affected the physiology of the ectoparasite, altering the feeding process and consequently the physiology of salivary glands and ovaries (Jittapalapong et al., 2000). According to Turni et al. (2002), much can be learned from the acquired resistance by hosts to different tick species or even the same species, as the immunosuppressive molecules synthesized by salivary glands are differently expressed during tick feeding. In addition, salivary glands of different species contain different antigens and concentrations (Jaworski et al., 1990; Inokuma et al., 1994). Studies on acquired resistance to ticks by hosts, especially those that induced by inoculation of antigens from ticks, are of special importance, as they are essential to more refined analysis that together with molecular and immunological techniques, can identify new molecules, especially from the digestive and reproductive systems of ticks and provide a framework for the development of vaccines. Another important aspect is the failure to develop resistance by the domestic dog after successive infestations with R. sanguineus (Chabaud, 1950; Ferreira and Bechara, 1995; Capítulo I__________________________________________________________________ 42 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Szabó et al., 1995; Bechara, 2006) or even after vaccination with extracts of unfed adult ticks followed by a challenge infestation (Bechara et al., 1994). According to Jittapalapong et al. (2000), since the domestic dog is the natural host of R. sanguineus, only immunization by inoculation of saliva or salivary gland extract could induce resistance. Based on this information and the veterinary importance of R. sanguineus ticks, the present study describes a protocol to obtain and inoculate sterile salivary gland extracts capable of inducing resistance in inoculated hosts. The preparation of sterile extracts was used to avoid the induction of pathological conditions in host rabbits. Materials and Methods This experiment was approved by Comitê de Ética em Pesquisa e Mérito Científico – UNIARARAS, Protocol nº 021/2009. Materials Twenty-five unfed R. sanguineus couples per host were used (Fig. 1A). Ticks were obtained from a colony maintained in BOD incubator under controlled conditions (28 o C ± 1ºC, 80% relative humidity, and 12-h photoperiod). Couples were allowed to feed on naive New Zealand White rabbits, following the procedure described by Bechara et al. (1995). Two, four, and six-day-fed female ticks were collected (Fig. 1B) for the preparation of salivary gland extracts: SGE2= salivary gland extract of two-day-fed females, SGE4= salivary gland extract of four-day-fed females, and SGE6= salivary gland extract of six-day-fed females (Fig. 1C). Fifty-five females (110 salivary glands) were used to obtain SGE2, 36 females (72 salivary glands) for SGE4, and 25 females (50 salivary glands) for SGE6, in order to obtain a protein level above 0.2 µg/µL (Table 1). Capítulo I__________________________________________________________________ 43 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Table 1: Protein concentrations of salivary gland extracts of two, four, and six-day-fed Rhipicephalus sanguineus females. Feeding Time 2 days 4 days 6 days Protein concentration 1.08µg/µL 1.75µg/µL 1.49µg/µL Extracts SGE2, SGE4, and SGE6 were inoculated in 12 naive New Zealand White rabbits (4 rabbits/extract) (Fig. 1D), followed by a challenge infestation (15 R. sanguineus couples/host) (Fig. 1E). The feeding periods (two, four, and six days) were determined based on the secretion cycle of the salivary gland previously described by (Furquim et al., submitted paper). During this period, b, c2, c4, c5, c6, and f cells become active in two-day-fed ticks, c5 and f become inactive in four-day-fed female ticks, and c6 are inactive in six-day-fed female ticks. Methods Preparation of gland extracts Two, four, and six-day-fed females were removed from the hosts by holding the region around the hypostome and making circular movements with the aid of tweezers. Ticks were placed in Petri dishes with colored paraffin, dissected under saline solution (7.5 g of NaCl, 2.38 g of Na2HPO4, 2.72 g of KH2PO4 and 1000 mL of distilled water), and salivary glands were removed. The removal of salivary glands differed depending on the feeding condition: in two-day-fed females, ticks were sectioned in half with the aid of tweezers (Fig. 2A, B), all organs were carefully removed (Fig. 2C) until salivary glands were exposed (Fig. 2D). In four and six-day-fed females, ticks were stocked with entomological pins with the dorsal region facing upward (Fig. 3). An incision was made in the central dorsal region with microscissors, from the posterior until the anterior portion of the body (Fig. 3A). To expose the organs, both dorsal halves were opened and secured with entomological pins (Fig. 3B). Intestine and ovaries were removed and the exposed salivary glands were collected (Fig. 3C). Capítulo I__________________________________________________________________ 44 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling The salivary glands, separated in groups according to the feeding times, were placed in eppendorf tubes containing 200 µL of phosphate buffer (pH 7.4), and macerated with a pestle. The material was centrifuged for 30 minutes at 10.000 xg. The supernatant was collected with a 100 µL pipette and placed in sterile eppendorf tubes. The protein concentration was determined according to Sedmark and Grossberg (1977) (Bradford method). The procedures were performed at the Laboratório de Biologia Molecular of the Departmento de Biologia of UNESP, Rio Claro, São Paulo State, Brazil. After the protein content of each sample was determined (0.2 µg/µL) in a pre-sterile vertical laminar hood, the extracts were filtered with sterile filtering units (pore size of 0.22 µm, 13 mm in diameter, JBR610303, Millex GV disposable filtering unit, Durapore membrane PVDF, Millipore, MilliUni) attached to hypodermic syringes. Aliquots of 50µL of extracts were obtained and stored in sterile eppendorf tubes in a freezer at -20 o C. Immediately before inoculations, extracts (50 µL of extract/host) were mixed with 50 µL of Freund's complete adjuvant (reference # F 5881, Sigma-Aldrich). Inoculation of gland extracts in hosts Twelve naive New Zealand White rabbits (4 rabbits/ gland extract) were used. The right dorso-lateral region was shaved and each extract was inoculated three times subcutaneously with a hypodermic syringe (SGE2, SGE4 or SGE6) at 21-day intervals (Fig. 1E). Fifteen days after the last inoculation, hosts were infested with 15 R. sanguineus couples/ host (Fig. 1F). Capítulo I__________________________________________________________________ 45 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figure 1 Sequence of procedures: A. Females of R. sanguineus allowed to feed on hosts (rabbits); B. Obtainment of two, four, and six-day fed females; C. Removal of salivary glands of two, four, and six-day-fed females; D. Preparation of gland extracts SGE2-SGE6; E. Inoculation of extracts in hosts (4 rabbits/extract); F. Infestation of inoculated rabbits with R. sanguineus ticks; u Capítulo I__________________________________________________________________lo I Capítulo I Capítulo I 46 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figure 2 Schematic representation of the procedure to remove the salivary glands of two-day-fed Rhpicephalus sanguineus females. or: organs; sg: salivary glands. A and B. Half section of the ticks (dotted line); C. Removing organs; D. Exposing salivary glands; Capítulo I__________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 47 Figure 2 Schematic representation of the procedure to remove the salivary glands of two-day-fed Rhpicephalus sanguineus females. or: organs; sg: salivary glands. A and B. Half section of the ticks (dotted line); C. Removing organs; D. Exposing salivary glands; Capítulo I__________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling 48 Capítulo I__________________________________________________________________ 49 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Figure 3 Schematic representation of the procedure remove the salivary glands of four and six-day-fed Rhipicephalus sanguineus females. in: intestine; sg: salivary glands. A. Incision in the central dorsal ticks region, from the posterior to the anterior portion of the body (dotted line); B. Removal of the intestine (dotted illustration); C. Exposed salivary glands; Capítulo I__________________________________________________________________ 50 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Capítulo I__________________________________________________________________ 51 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Discussion The protocol developed in this study to obtain salivary gland extracts of two, four, and six-day-fed R. sanguineus females provide a methodology and important quantitative information on an efficient protein concentrate to induce an immune response in inoculated hosts, without inducing pathological conditions. Many studies available in the literature have focused on the inoculation of extracts obtained from whole or parts of ticks (Wikel, 1981; Ferreira et al., 1996; Jittapalapong et al., 2000, 2008), including salivary glands. This study is the first to present information on how to obtain and inoculate salivary gland extracts of female ticks of R. sanguineus at specific feeding times (two, four, and six days). The process of developing resistance in animal hosts has been studied. The failure to develop resistance to some tick species (Brumpt and Chabaud, 1947; Randolph, 1979) is still poorly understood. The development of a protocol to obtain and inoculate salivary gland extracts allows the construction of a study model to examine the process of acquired resistance by hosts as well as its implications. An interesting example is the relationship between R. sanguineus and its natural host, the domestic dog, which does not develop resistance after repeated infestations (Chabaud, 1950; Ferreira and Bechara, 1995; Szabó et al., 1995; Bechara, 2006) or the inoculation of extracts of unfed adult ticks, followed by tick infestation (Bechara et al., 1994). When the domestic dog is inoculated with tick saliva or salivary gland extract, resistance is developed (Jittapalapong et al., 2000). In addition, in hosts inoculated with salivary gland extracts of three and five-day-fed ticks (Jittapalapong et al., 2000), the host immune response strongly affects the physiology of the ectoparasite, influencing the feeding process, the physiology of the salivary glands (Walker et al., 1985), and consequently reproduction (Jittapalapong et al., 2000). This protocol describes procedures to obtain salivary gland extract of two, four, and six-day-fed female ticks. These feeding periods were chosen based on a histological and histochemical study conducted by Furquim et al. (submitted paper) on the salivary glands of R. sanguineus females. These authors reported that different gland cells of acini II and III become active or inactive especially during this feeding interval. Since the salivary secretion Capítulo I__________________________________________________________________ 52 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling consists of glycoproteins, these cells do not participate in the formation of the cement cone, as the latter is composed of lipoproteins (Binnington, 1987), indicating that these cells have different roles than other secretory cells, which remain active during the entire gland cycle. Consequently, this suggests a specific and localized effect on the host immune-inflammatory response. Turni et al. (2002) showed that much can be learned about the acquired resistance to a tick species by sensitized hosts, as immunosuppressive molecules synthesized by salivary glands are differently expressed during the feeding period. In the present study, in addition to different expressed molecules, different concentrations were found in the corresponding glandular tissues during the feeding periods examined (two, four, and six days). Based on the protein concentration obtained, as the feeding process advanced in R. sanguineus females, the amount of secretion increased, and consequently the quantities of expressed proteins. The protein content found in the salivary glands of two, four, and six-day-fed females differed, therefore different quantities of glands were necessary for each specific extract. Unlike the obtained in this study, the procedure described by Jittapalapong et al. (2000) used 50 salivary glands in the preparation of gland extracts (15 glands from females and 10 glands from males) from three and five-day-fed individuals. These results support those obtained by Jaworski et al. (1990) and Inokuma et al. (1994), which reported that the salivary glands of different species contain different antigens, as well different quantities and concentrations, resulting in a different number of salivary glands needed in the protocol. Another important aspect of this protocol was the use of New Zealand White rabbits instead of dogs (Jittapalapong et al., 2000), as R. sanguineus can induce resistance in non- habitual hosts, such as rabbits (Chabaud, 1950) and guinea pigs when exposed to successive infestations or to vaccination with extracts of unfed adult ticks (Bechara et al., 1994; Szabó et al., 1995; Bechara, 2006). Since the main goal of this protocol was to obtain gland extracts capable of inducing an immune response in hosts, were used a host-model that could develop resistance to better understand how the host responds to the pre-immunization with saliva extracts of R. sanguineus produced in different moments of the gland cycle and that can affect the host defense system. Therefore, the protocol presented in this study provide detailed information on the setup and how to conduct a simple, safe, and efficient experiment to obtain different salivary gland extracts. This procedure with non-habitual hosts (rabbits) of R. sanguineus may be used Capítulo I__________________________________________________________________ 53 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling to answer important questions for future studies on the acquisition and expression of resistance processes. Acknowledgments This research has been supported by FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) (Grants no. 08/58443-7 and 07/59020-0) and CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) (Grant no. 308733/2006-1 and M.I. Camargo- Mathias and G.H. Bechara academic carrier research fellowships). Part of this work has been facilitated through the Integrated Consortium on Ticks and Tick-borne Diseases (ICTTD-3) supported by the European Union under contract number 510561-INCO. Capítulo I__________________________________________________________________ 54 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling References Bechara, G.H., 2006. Imunopatologia da interação carrapato-hospedeiro. In: Barros-Battesti, D.M., Arzua, M., Bechara, G.H. (Eds), Carrapatos de importância médico-veterinária da região neotropical: Um guia ilustrado para identificação de espécies. Vox/ICTTD-3/Butantan, São Paulo. Bechara, G.H., Szabó, M.P.J., Ferreira, B.R., Garcia, M.V., 1995. Rhipicephalus sanguineus tick in Brazil: feeding and reproductive aspects under laboratorial conditions. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 4 (2), 61-66. Bechara, G.H., Szabo, M.P.J., Mukai, L.S., Rosa, P.C.S., 1994. Immunization of dogs, hamsters and guinea pigs against the tick Rhipicephalus sanguineus using crude unfed adult tick extracts. Vet. Parasitol. 52, 79-90. Binnington, K.C., 1978. 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Capítulo I__________________________________________________________________ 55 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Chabaud, A.G., 1950. L’infestation par des ixodinés provoque-t-elle une immunité chez l’hôte (2me. Note). Ann. Parasit. 25, 474-479. Ferreira, B.R., Bechara, G.H., 1995. Imunidade a carrapatos Rhipicephalus sanguineus (Acarina:Ixodidae) em cachorro-do-mato Cerdocyon thous (Linnaeus) e no cão doméstico. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 32 (4), 232-237. Ferreira, B.R., Machado, R.Z., Bechara, G.H., 1996. Western blot analysis of tick antigens from a Rhipicephalus sanguineus unfed larval extract and identification of antigenic sites in tick sections using immunohistochemistry. A comparative study between resistant and susceptible host species. Vet. Parasitol. 62, 161-174. Inokuma, H., Kemp, D.H., Willadsen, P., 1994. 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Postal 199, CEP: 13506-900, Rio Claro, S.P., Brazil b Departamento de Patologia Veterinária, FCAV, UNESP, Via de Acesso Prof. Paulo Castellane, s/n, CEP: 14884-900, Jaboticabal, S.P., Brazil * Corresponding author. Fax: +55 19 35340009 E-mail address: micm@rc.unesp.br Capítulo II__________________________________________________________________ 60 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Resumo Este estudo analisou histopatologicamente a pele de coelhos previamente imunizados com extratos glandulares EGS2, EGS4 e EGS6 preparados a partir de glândulas salivares de fêmeas de Rhipicephalus sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação, na região da lesão de alimentação de fêmeas de R. sanguineus aos 2, 4 e 6 dias após a fixação. Neste trabalho, coelhos New Zealand White virgens de infestação foram inoculados com extratos (grupo teste=GT) ou com uma mistura de tampão fosfato e adjuvante completo de Freund (grupo controle 2=CG2). Cada coelho inoculado (GT e CG2) e não inoculado (CG1) foi subsequentemente infestado com R. sanguineus. Biópsias de pele foram coletadas dos coelhos na região da lesão de fixação aos 2, 4 e 6 dias de alimentação. Os resultados revelaram que a imunização de coelhos com os extratos glandulares induziu a aquisição de resistência contra testa espécie. Verificou-se ainda que o extrato EGS4 foi o mais eficaz no desenvolvimento da resposta imuno-inflamatória contra a infestação por esses ectoparasitas, caracterizando o processo pela presença de precoce e intenso infiltrado inflamatório. Por outro lado, o extrato EGS6 provocou o aparecimento de resistência mais tardia, com menor ocorrência de infiltrado e intensas áreas de edema no local da lesão de alimentação. Já o processo inflamatório decorrente da inoculação do extrato EGS2 foi o menos intenso. Os resultados obtidos permitiram concluir que a imunização com diferentes extratos obtidos a partir de glândulas salivares de fêmeas de R. sanguineus com 2, 4 e 6 dias de alimentação não alterou as características presentes no processo inflamatório, porém tornou-as precoce ou tardiamente mais intensas e dependentes do extrato inoculado. Palavras-chaves: Imunização, carrapato, Rhipicephalus sanguineus, glândula salivar, histopatologia. Capítulo II__________________________________________________________________ 61 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Abstract This study analyzed the histopathology of rabbit skin, previously immunized with EGS2, EGS4 and EGS6 gland extracts prepared from salivary glands of Rhipicephalus sanguineus female with 2, 4 and 6 days of feeding, at the region of the R. sanguineus female feeding lesion at 2, 4 and 6 days after tick attachment. In this work, infestation-naïve New Zealand White rabbits were inoculated either with the extracts (test group=GT) or with phosphate buffer and complete Freund’s adjuvant mixture (control group 2= GC2). Each extract-inoculated (GT e GC2) and non-inoculated (GC1) rabbit was subsequently infested with R. sanguineus. Skin biopsies were collected from the rabbit at the tick feeding lesion at 2, 4 and 6 days of feeding. Results revealed that rabbit immunization with gland extracts induced acquisition of resistance against this species. It should be stated that the EGS4 extract was the most effective in developing an immune-inflammatory response against ectoparasites, being this process characterized by the presence of an early and intense inflammatory cell infiltrate. On the other hand, EGS6 extract caused a later appearance of resistance with less infiltrate occurrence and intense edema at the feeding lesion site. As to the inflammatory process deriving from EGS2 extract inoculation, it was the less intense. It was concluded that immunization with different extracts from R. sanguineus female salivary glands did not change microscope features of the inflammatory process, although an earlier or more intense and later response, which was also dependent on the inoculate extract, was noticed. Keywords: Immunization, tick, Rhipicephalus sanguineus, salivary glands, histopathology. Capítulo II__________________________________________________________________ 62 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Introduction Rhipicephalus sanguineus tick or “dog tick” has the dog as its preferable host (Walker, 1994), although it can also be found parasitizing other mammals, including men. In addition to the spoliatory action on the host during hematophagy, these ticks also cause injury to the tissues. This fact makes ticks important to public health as they are involved in transmission of infectious agents (Barros-Batestti, 2006; Guglielmone et al., 2006). Tick feeding occurs due to the combined action of mouth structures with saliva, a secretion produced by salivary glands (Balashov, 1972). In Ixodidae, salivary glands are organs essential for their biological success, because they produce a mixture of bioactive components that acts on the ectoparasite attachment to the host, as well as on its immune response management, thus ensuring the success of the feeding process (Sonenshine, 1991; Sauer et al. 1995; Bowman and Sauer, 2004). Several studies have been conducted to understand the development mechanism of the host resistance to tick infections. Induction of resistance by effector mechanisms would be able to promote high-specificity protection against these infections (Wikel, 1981). Immune response to the presence of the parasite can be expressed in the tick feeding lesion on the host. Brossard and Wikel (1997) reported presence of neutrophils and basophils in skin samples from resistant hosts. Likewise, Monteiro and Bechara (2008) showed presence of basophils in feeding lesions of Amblyomma cajennense tick in goats subjected to several infections. In addition, Veronez et al. (2009) showed the presence of inflammatory cells from resistant guinea pigs in bowel lumen of infecting R. sanguineus ticks. Records provide studies that discuss the action of extracts obtained from full ticks (Szabó et al.; 1995) or even from their salivary glands only (Allen et al., 1979; Ramachandra e Wikel, 1981; Mejri et al., 2001; Turni et al., 2002; Zhou et al., 2006) on host immune response. By studying the immunogenic action of proteins obtained from R. haemaphysaloides salivary glands, Zhou et al. (2006) verified that these proteins were capable of immunizing rabbits and that the development of this defense strategy compromised the attachment and feeding processes of ticks that were subsequently attached to the hosts. While working with proteins obtained from Hyalomma anatolicum anatolicum salivary glands, Gill et al. (1986) verified that these proteins are expressed in a quantitative Capítulo II__________________________________________________________________ 63 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling and qualitative different way throughout the tick feeding process. In addition, Furquim et al. (submitted paper) showed that, once R. sanguineus tick feeding process starts, gland changes occur, such as activation of certain cells in specific periods of this process. This information supports the existence of a production mechanism of different molecules throughout the whole gland secretion cycle of this ectoparasite. In this sense, different molecules can cause different immune-inflammatory reactions in the host skin region close to the feeding lesion (Gill et al., 1986). Considering the information presented above, this study intended to verify the immunogenic action of salivary gland extracts from R. sanguineus (EGS2, EGS4, EGS6) on the immune-inflammatory response in rabbits by histopathological analysis of skin from these rabbits in tick feeding lesion site. Capítulo II__________________________________________________________________ 64 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Material e Methods Material In order to perform this study, skin samples from New Zealand White rabbits previously immunized with gland extracts (EGS2, EGS4, EGS6) were analyzed in the R. sanguineus tick feeding lesion site with 2, 4 and 6 days. For such, male and female R. sanguineus ticks derived from a colony maintained in a BOD incubator, under controlled conditions (28 o C ± 1ºC, 80% humidity and 12-hour photoperiod), located at Biotério do Departamento de Biologia da UNESP campus de Rio Claro (SP), were used in A, B, and C infections in rabbits, according to the procedure described by Bechara et al. (1995). - A infestation: Infestation-naïve rabbits were subsequently infested with 25 R. sanguineus tick couples/host for acquisition of females with 2 (55 subjects), 4 (36 subjects) and 6 (25 subjects) days of feeding. Salivary glands were removed from these females in order to obtain the extracts: EGS2= female gland extract with 2 days, EGS4= with 4 and EGS6= with 6 days. Determination of selected feeding periods (2, 4 and 6 days) was based on salivary gland secretion cycle, because fasting subjects have glands containing a, c1, c3, d, and e active cells, those with two days have b, c2, c4, c5, c6, and f active cells, those with 4 days have c5 and f inactive cells, while only a, b, c1-c4, and c6 cells remain active, and finally subjects with 6 days of feeding have c6 inactive cells (Furquim, 2007). After being processed, extracts were inoculated into the hosts subjected to B infestation. - B infestation (test group) 12 rabbits were sensitized, being 4 inoculated with EGS2 extract, 4 with EGS4 and 4 rabbits with EGS6. They were subsequently subjected to challenge infestation with 15 R. sanguineus tick couples/host. - C infestation (control group) 4 infestation-naïve rabbits were inoculated with complete Freund’s adjuvant and phosphate buffer mixture (control group 2) and 4 were not inoculated (control group 1). All 8 animals were subsequently subjected to a challenge infestation with 15 R. sanguineus tick couples/host. Capítulo II__________________________________________________________________ 65 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling This project was submitted to the Ethics Committee in Animal Research UNIARARAS, Fundação Hermínio Ometto, Araras, São Paulo, Brazil and was approved under protocol # 008/2009. Methods Preparation and inoculation of gland extracts Female R. sanguineus with 2, 4 and 6 days of feeding were collected and dissected in saline solution (7.5 g NaCl, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4 and 1000 mL distilled water) to remove their salivary glands. At facilities from Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Biologia da UNESP campus de Rio Claro (SP), Brazil, glands were placed separately by study status (obtained from females with 2, 4 and 6 days of feeding) in eppendorf tubes containing 200-µL 7.4-pH phosphate buffer. Then, glands were macerated, centrifuged by 30 minutes at 10,000 g, supernatant was collected and processed for protein content analysis according to methodology described by Sedmark and Grossberg (1977) (Bradford method) and concentration to be obtained could not be lower than 0.2 µg/µL. Following protein content analysis of each sample, extracts were filtered separately by study status with support of 0.22 µm sterile filtering units (JBR610303, Millex GV disposable filtering unit, durapore, PVDF, Millipore, MilliUni membrane) with 13 mm diameter, coupled to hypodermic syringes, inside a pre-sterile vertical laminar flow hood. After this, extracts were aliquoted in volumes of 50 µL and stored inside a freezer at –20 o C. Only at the moment of the inoculations, each extract was mixed (50 µL of extract/host) with 50 µL complete Freund’s adjuvant (reference # F 5881, Sigma-Aldrich), as well as with the mixture of Freund’s adjuvant with 7.4 pH phosphate buffer (AF+PBS). These procedures were also performed in pre-sterile vertical laminar flow. Rabbits from GT and CG2 groups had their dorsolateral right region sheared, same site where subcutaneous inoculation occurred (EGS2, EGS4 and EGS6), as well as with AF+PBS, via hypodermic syringe, three times at 21-day intervals. Only after 15 days from last inoculation, all hosts from GT and GC groups were subjected to a challenge infestation with 15 R. sanguineus tick couples/host. Capítulo II__________________________________________________________________ 66 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Histopathological Analysis Skin samples were collected from rabbits in tick feeding sites at 2, 4 and 6 days, by a “punch” with 0.3 cm in diameter. Upon collection, the ectoparasite attached to the host was cut at the head region, remaining only the hypostome attached to the rabbit skin. With the “punch” placed at the site and with circular moves, a piece of skin was removed. Obtained pieces were fixed in paraformaldehyde 4% at 4 o C, were dehydrated in a series of increasing concentrations of ethanol (70%, 80%, 90% and 95%), embedded in resin (Leica), and sectioned at 3 m thickness. Sections were mounted on glass slides and stained with hematoxylin-eosin. Slides were mounted with Canada balsam and examined and photographed under Motic BA 300 light microscope. Capítulo II__________________________________________________________________ 67 __________________________________________________________________________________________ Letícia M. G. Ferraz Hebling Results 1. Control Group 1 (GC1) Analysis of skin pieces showed similar changes when compared to collection times of 2, 4 and 6 days. Presence of a moderate epithelium stratification (Fig: 1A, 1C, 1E), formation of edema (Fig. 1B, 1D, 1F), presence of few inflammatory cells in connective tissue and moderately dilated capillaries (Fig. 1A, 1D, 1F) were noticed. Results of the analyses of skin pieces obtained from animals in control group 2 (GC2) were very similar to those obtained from GC1. 2. Test Group 1 (EGS2) In subjects from this group, feeding lesion showed mild changes in relation to those from control group subjects. These changes included less epithelium stratification with some diso