RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 05/04/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Lucas Solla Mathias Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em adipócitos subcutâneos humanos in vitro Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor(a) em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra. Célia Regina Nogueira Botucatu 2024 Lucas Solla Mathias Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em adipócitos subcutâneos humanos in vitro Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor(a) em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra. Célia Regina Nogueira Botucatu 2024 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Mathias, Lucas Solla. Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em adipócitos subcutâneos humanos in vitro / Lucas Solla Mathias. - Botucatu, 2024 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Célia Regina Nogueira Capes: 40101002 1. Proteínas Quinases Ativadas por Mitógeno. 2. Fosfatidilinositol 3-Quinase. 3. Purinas - Receptores. 4. Tecido adiposo. 5. Triiodotironina. Palavras-chave: MAPK; PI3K; Sistema purinérgico; Tecido adiposo; Triiodotironina. unesp• UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA ATA DA DEFESA PÚBLICA DA TESE DE DOUTORADO DE LUCAS SOLLA MATHIAS, DISCENTE DO PROGRAMA DE PÔS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA EM CLINICA M~DICA, DA FACULDADE DE MEDICINA - CÃMPUS DE BOTUCATU. Aos 05 dias do mês de abril do ano de 2024, às 08:00 horas, no(a) Sala 2 de Reuniões do Prédio da Administração da FMB/Unesp, realizou-se a defesa de TESE DE DOUTORADO de LUCAS SOLLA MATHIAS, intitulada Avallação da ação da Trtlodotlronlna (T3) no sistema purlnérglco, com participação de vias extranucleares, em tecido adiposo humano. A Comissão Examinadora foi constituída pelos seguintes membros: Profa. Ora. CELIA REGINA NOGUEIRA DE CAMARGO (Orientador(a) - Participação Presencial) do(a) Depto. de Clínica Médica / FM/Botucatu - Unesp, Profa. Ora. ADRIANA CAMARGO FERRASI (Participação Presencial) do(a) Depto. de Clínica Médica / FM/Botucatu • Unesp, Prof. Dr. ROBSON FRANCISCO CARVALHO (Participação Presencial) do(a) Depto. de Biologia Estrutural e Funcional/ IB/Botucatu - Unesp, Profa. Ora. DENISE ENGELBRECHT ZANTUT WITTMANN (Participação Virtual) do(a) Depto. de Clínica Médica / FCM/Campinas - Unicamp, Profa. Ora. MARIA TEREZA NUNES (Participação Virtual) do(a) Depto de Fisiologia e Bioquímica / Instituto de Ciências Biomédicas - Usp. Após a exposição pelo doutorando e arguição pelos membros da Comissão Examinadora que participaram do ato, de forma presencial e/ou virtual, o discente recebeu o conceito final:_ o.~:çc...--A~~ __ • Nada mais havendo, foi lavrada a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelo(a) Presidente(a) da Comissão Examinadora. Profa. Ora. CELIA REGINA NOGUEIRA DE CAMARGO ·-•--ca.,,...•-· lw.: Prol IMrio Ruo,.,,. GwnartN MonteMg,o. tln", 11111817, ~. S1o Paulo tillPllwwwfmb.ur.p.brlpodílD1..dwCHPJ.41.0l191110011-!3 Por sugestão da comissão examinadora da defesa de Doutorado, o título da pesquisa foi alterado de “Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em tecido adiposo humano” para “Avaliação da ação da triiodotironina (T3) no sistema purinérgico, com participação de vias extranucleares, em adipócitos subcutâneos humanos in vitro”. Registro de impacto esperado O presente trabalho investigou a ação do hormônio triiodotironina (T3), em eventos fisiológicos não descritos em adipócitos subcutâneos humanos. Os resultados observados, promovem o entendimento do papel do hormônio no tecido adiposo, permitindo identificar possíveis causas dos efeitos observados em fisiopatologias do tecido adiposo. Expected impact record The present work investigated the action of the hormone triiodothyronine (T3) in undescribed physiological events in human subcutaneous adipocytes. The results observed promote the understanding of the role of the hormone in adipose tissue, allowing us to identify possible causes of the effects observed in pathophysiology of adipose tissue. Agradecimentos Agradeço à Deus, por me capacitar, e me conceder força e resiliência nos momentos mais difíceis. Sem Ele nada seria possível. Obrigado, muito especial, a Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), que me acolheu desde a graduação. Todo o conhecimento adquirido ao longo do meu percurso eu devo a esta Universidade. Gostaria de agradecer à Faculdade de Medicina de Botucatu e ao Programa de Pós-Graduação de Fisiopatologia em Clínica Médica, particularmente a coordenadora Professora Doutora Daniela Ponce e a secretária Bruna Zanella. Obrigado a Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) e todos os colaboradores, que sempre estiveram disponíveis para auxiliar no desenvolvimento do trabalho. Agradeço à Professora Doutora Célia Regina Nogueira, por todos os anos de orientação, paciência e parceria. Por me aceitar em seu grupo de pesquisa, por tudo que me ensinou, por incentivar todos os meus planos e meu trabalho. Agradeço ao grupo do Laboratório de Bases Genéticas das doenças endócrinas pela consideração e cooperação ao longo do meu percurso no laboratório. Sobretudo a Doutora Miriane de Oliveira, pelo auxílio na cultura celular e obtenção de reagentes, e ao Mestre Igor Deprá, pela contribuição no processamento de amostras para quantificação de Malonaldeído e Carbonilação proteica. Obrigado à Professora Doutora Camila Correa Camacho e seu grupo de pesquisa, em especial à Mestre Juliana Silva Siqueira, pela contribuição na realização da quantificação de malonaldeído e carbonilação proteica. Meus agradecimentos à Universidade do Porto, ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar e ao Professor Doutor Paulo Correia de Sá, por ter acreditado no meu trabalho e pela orientação nos períodos que estive em Portugal. Agradeço também ao grupo do laboratório de Farmacologia e Neurobiologia, em especial à Professora Doutora Maria Adelina Costa e a Doutora Carina Herman-de-Sousa, pelo auxílio na cultura celular e obtenção de reagentes, bem como a Doutora Fátima Ferreirinha pela contribuição na microscopia confocal de imunofluorescência, aos Mestre Catarina Andrês e ao Doutor Rui Pinto-Cardoso pela participação nos ensaios de bioluminescência; agradeço também à Doutora Teresa Magalhães-Cardoso e aos Mestres Ana Luísa Afonso Lopes e Diogo Silva pelo auxílio na realização e otimização dos ensaios cromatográficos. Obrigado a minha banca de qualificação, Doutora Caroline Serrano e Doutora Miriane de Oliveira, pela brilhante contribuição com minha tese. Agradeço também a minha banca de defesa, a Doutora Adriana Camargo Ferrasi, a Doutora Denise Engelbrecht Zantut Wittmann, a Doutora Maria Tereza Nunes, e ao Doutor Robson Francisco Carvalho, pelas sugestões irretocáveis. Gostaria de agradecer à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo investimento em meu trabalho e pelas bolsas, de doutorado no país (2020/06763-0) e de estágio de pesquisa no exterior (2021/12247-7). Um agradecimento especial à minha família, em particular, aos meus pais, Renato Mathias e Adriana Solla, que investiram em minha educação e acreditaram que ela poderia mudar minha realidade. Além de, terem acompanhado todas as etapas do meu doutorado, sempre me apoiando. Aos meus irmãos, Gustavo Mathias e Leonardo Mathias, e aos meus avós Vera Solla, Ivoni Taffo e Reynaldo Mathias, por todo carinho e amor. E meu sobrinho, Pietro Oliveira Mathias, sua doçura me fortaleceu em diversos momentos. Agradeço também às pessoas especiais que estão sempre comigo, Aline Choung, João Carvalho, Marcia Matsuhara, Milena de Paula. Obrigado por todo o apoio, carinho e paciência. Sobretudo ao Diego Pettigrosso, que me acompanhou ao longo do doutorado; e à Bruna Moretto Rodrigues, amiga de longa data, que me apresentou a Doutora Célia Regina Nogueira e o grupo de pesquisa do Laboratório de Bases Genéticas das doenças endócrinas. Sumário Lista de Figuras 12 Abreviaturas 14 Resumo 18 Abstract 20 1. Introdução estendida 22 1.1. Tecido Adiposo 22 1.2. Sistema Purinérgico 27 1.2.1. Receptores purinérgicos acoplados à proteína G 31 1.2.2. Canais iônicos controlados por ligante P2X 32 1.3. Hormônios Tireoideanos 33 1.4. Vias citoplasmáticas 36 1.4.1. via MAPK/ERK 36 1.4.2. via PI3K/AKT 37 1.5. Hormônios Tireoideanos, Sistema Purinérgico, Tecido adiposo, vias citoplasmáticas 40 2. Justificativa 47 3. Hipótese 48 4. Objetivos 49 4.1. Objetivo Geral 49 4.2. Objetivos específicos 50 5. Materiais e Métodos 51 5.1. Estudo in vitro 51 5.2. Ensaio MTT 52 5.4. Contagem nuclear das células 53 5.5. Coloração Oil Red O 53 5.6. Quantificação de ácidos graxos livres (FFA) 53 5.7. Quantificação de liberação de Glicerol 54 5.8. Extração proteica 54 5.9. Dosagem de Malonaldeído (MDA) 55 5.10. Carbonilação proteica 56 5.11. Quantificação do ATP extracelular 56 5.12. Microscopia confocal de Imunofluorescência 57 5.13. Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) 58 6. Análise Estatística 61 7. Resultados 62 7.1. Artigo expandido 62 7.2. Resultados extras 99 8. Discussão e Considerações finais 103 9. Referências 109 10. Material suplementar 126 11. Anexos 133 11.1.1. BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids 133 11.1.2. Biochemical Pharmacology 134 11.1.3. Molecular and Cellular Endocrinology 135 Lista de Figuras 1. Introdução estendida 22 Figura 1. Comparação entre as características dos diferentes tipos de tecido adiposo. Adaptada de (Lee et al., 2021) (Imagem criada em BioRender.com). 24 Figura 2. Esquema da cascata de sinalização das enzimas purinérgicas. Adaptada de (Yegutkin, 2014). (Imagem criada em BioRender.com). 29 Figura 3. Esquema da sinalização purinérgica com os subtipos de receptores purinérgicos e suas respectivas moléculas ativadoras. P2X sensíveis ao ATP (P2X1-7); P2Y sensíveis ao ATP e ADP (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14) e P1 sensíveis à ADO (A1, A2A, A2B, A3). Adaptada de (Yegutkin, 2014). (Imagem criada em BioRender.com). 31 Figura 4. Esquema das vias celulares da MAPK/ERK 1/2 e PI3K. As quinases são ativadas por sinais transmitidos pela fosforilação sequencial delas. Na MAPK/ERK, a ativação de receptor de tirosina quinase (RTK) causa fosforilação de Ras, pelo recrutamento do complexo Grb2/SOS. Ras ativa Raf, que por sua vez ativa MEK, que leva a fosforilação de ERK1/2. Sendo que, o inibidor PD98059 age sobre a MEK. Na via da PI3K, a ativação de receptor de tirosina quinase (RTK) causa fosforilação da PI3K, que converte PIP2 em PIP3, recrutando proteínas como a AKT e PDK1. Assim que a AKT é ativada, pode regular a mTOR. Sendo que, o inibidor LY294002 age sobre a PI3K. (Imagem criada em BioRender.com) 39 5. Materiais e Métodos 51 Tabela 1. Pontos da curva padrão BSA 55 Tabela 2. Anticorpos utilizados na técnica de Imunofluorescência 58 Tabela 3. Gradiente de eluição nos diferentes tempos 59 Tabela 4. Pontos da curva padrão 60 Tabela 5. Resumo das metodologias utilizadas no trabalho 60 7. Resultados 62 Figure 1. MTT assay for PD98059 doses (10μM, 20μM, and 50μM) after 24-hour treatments. The analyzed results are presented as a percentage of control values. PD 5μM=5μM PD98059, PD 10μM=10μM PD98059, PD 20μM=20μM PD98059, PD 50μM=50μM PD98059. Data is expressed as mean±standard deviation (ANOVA-one way complemented by Tukey's test). Readings were taken at an absorbance of 570nm. * p<0.05 73 Figure 2. MTT assay for LY294008 doses (10μM, 20μM, and 50μM) after 24-hour treatments. LY 5μM=5μM LY294008, LY 10μM=10μM LY294008, LY 20μM=20μM LY294008, LY 50μM=50μM LY294008, C = no treatment. Data is expressed as mean±standard deviation (ANOVA-one way supplemented with Tukey's test). The analyzed results are presented as a percentage of control values. Absorbance reading conducted at 570nm. * p<0.05; **** p<0.0001. 74 Figure 3. MTT assay for the doses of PD98059 (5 μM), LY294008 (5 μM), and T3 (10 nM) after 24-hour treatments. T3 = 10 nM triiodothyronine, PD = 5μM PD98059, LY = 5μM LY294008, C = untreated control. Data are expressed as median and interquartile range (Kruskall-Wallis test supplemented by Dunn's test); n = 5. Readings were taken at an absorbance of 570nm. 75 Figure 4. LDH assay. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C = untreated. Data are expressed as mean±standard deviation (one-way ANOVA complemented by Tukey's test); n=2. Readings performed at an absorbance of 405 nm. 76 Figure 5. Nuclear quantification of cells after 24-hour treatments. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C=untreated. Data are expressed as mean±standard deviation (one-way ANOVA complemented by Tukey's test); n=3. 76 Figure 6. Lipid accumulation quantification by Oil Red staining after 24-hour treatments. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C=untreated. Data are expressed as mean±standard deviation (one-way ANOVA supplemented by Tukey's test); n=3. * p<0.05; *** p<0.0005. 77 Figure 7. Image of lipid accumulation by Oil Red staining after 24-hour treatments. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C=untreated control. Micrographs acquired at 10x magnification. 78 Figure 8. Glycerol and fatty acids release assay after 24-hour treatments. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C= untreated. (A) Quantification of glycerol release. (B) Quantification of free fatty acids release. Data are expressed as mean±standard deviation (one-way ANOVA followed by Tukey's test); n=3. Readings performed at 570nm absorbance. 79 Figure 9. Oxidative Stress Assays. T3 = 10 nM triiodothyronine, PD = 5μM PD98059, LY = 5μM LY294008, C = untreated. (A) Malondialdehyde Assay. Readings taken at absorbance of 532 nm and 600 nm. (B) Protein Carbonylation Assessment. Readings taken at absorbance of 450 nm. Data is presented as mean ± standard 12 deviation (one-way ANOVA, followed by Tukey's test); n=3. 80 Figure 10. Extracellular ATP release assay. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5 μM PD98059, LY=5 μM LY294008, C = untreated. Data is expressed as median and interquartile range (Kruskall-Wallis test followed by Dunn's test); n=3. Readings were taken at an absorbance of 562 nm. * p<0.05 ; **p<0.01 ; **** p< 0.001. 81 Figure 11. Immunocytochemical detection of P2X7, NTPD1, NTPD3, CD73 in human adipocytes treated for 24 hours with T3, PD, and/or LY. T3=10 nM triiodothyronine, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C=untreated. Nuclei are stained in blue with DAPI. Micrographs were acquired from random fields of two different wells per treatment group, and were obtained using a confocal laser scanning microscope with the same acquisition settings. Green color represents the labeling of the proteins of interest and blue color represents the nuclei (DAPI). Scale bars: 40 μm. Data are expressed as mean±standard deviation (one-way ANOVA followed by Tukey's test). For more details on the immunofluorescence labeling, please refer to the Materials and Methods section. * p<0.05 ; ** p<0.01 ; **** p< 0.001. 83 7.2. Resultados extras 99 Figura 1. Ensaio de MTT para as doses de PD98059 (50μM) e LY294008 (20μM) após tratamentos de 24 horas. Os resultados analisados são apresentados como porcentagem dos valores de controle. T3=10 nM triiodotironina, PD 50uM =50μM PD98059, LY 20uM=20μM LY294008, C = sem tratamento. Os dados são expressos como média±desvio padrão (ANOVA-one way complementado pelo teste de Tukey). Leitura realizada em absorbância de 570nm. ** p<0,01 ; **** p< 0,0001. 99 Figura 2. Detecção imunocitoquímica de P2Y1 e P2Y11 após tratamento de 24 horas. T3=10 nM triiodotironina, PD=5μM PD98059, LY=5μM LY294008, C=sem tratamento. Os núcleos são corados em azul com DAPI. As micrografias foram adquiridas de campos aleatórios de dois poços diferentes por grupo de tratamento, e foram obtidas com um microscópio confocal de varredura a laser usando as mesmas configurações de aquisição. A cor verde representa a marcação dos receptores P2X7, P2Y1 ou P2Y11 e a cor azul representa os núcleos (DAPI). Escala de barras: 40 μm. Os dados são expressos como média±desvio padrão (ANOVA one-way complementado pelo teste de Tukey). Para obter mais detalhes sobre a marcação de imunofluorescência, consulte a seção Materiais e Métodos. **p<0,01 ; ****p<0,0001. 101 Figura 3. Quantificação de adenosina após tratamentos de 24 horas. T3=10 nM triiodotironina e C= sem tratamento. Dados são expressos como como média±desvio padrão (Teste-t Student). 102 8. Discussão e Considerações finais 103 Figura 5. Esquema geral do mecanismo de ação do T3 na modulação da via ATP/P2X7 por meio das vias MAPK/ERK e PI3K em adipócitos subcutâneos humanos. O T3 ativa as vias extranucleares, estimulando a maior expressão do receptor P2X7. O hormônio reduz a expressão de NTPDase 1, NTPDase 3 e NT5E, favorecendo o acúmulo de ATP no espaço extracelular. (Imagem criada em BioRender.com) 108 10. Material suplementar 126 Figura 1. Cromatograma dos diferentes tratamentos. (A) Análise cromatográfica do grupo Controle (B) Análise cromatográfica do grupo T3. 127 Figura 2. Cromatograma dos pontos da reta padrão 130 Figura 3. Quantificação proteica das amostras de três experimentos independentes, para dosagem de MDA e Carbonilação proteica 132 13 Abreviaturas TAB - tecido adiposo branco TAG - triacilglicerol FFA - ácidos graxos livres ROS - espécies reativas de oxigênio ATP - adenosina 5´trifosfato PI3K - fosfatidil inositol 3 quinase MAPK - proteína quinase ativada por mitógeno ADO - adenosina TA - tecido adiposo TAM - tecido adiposo marrom UCP1 - desacoplamento da proteína 1 PPAR - receptor ativado por proliferador de peroxissoma C/EBP- proteína de ligação ao potenciador CCAAT ATGL - lipase de triacilglicerol do adipócito HSL - lipase sensível ao hormônio MGL - lipase de monoglicerídeos DAG - diacilglicerol MAG - monoacilglicerol Bif-1 - fator 1 de interação Bax LepRb - receptor de leptina JAK2 - janus quinase 2 AdipoR - receptor de adiponectina ADP - adenosina difosfato 14 AMP - adenosina monofosfato E-NTPDase - ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases NPP - ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase ALP - fosfatases alcalinas CD73 - ecto-5'-nucleotidase ADA - adenosina desaminase ADK - adenosina quinase UTP - trifosfato de uridina UDP - difosfato de uridinA GPCR - receptor acoplado à proteína G PKC - proteína quinase C HT - hormônios tireoidianos T4 - tiroxina T3 - triiodotironina rT3 - triiodotironina reversa TRH - hormônio liberador de tireotrofina TSH - hormônio estimulador da tireoide TBG - globulina de ligação à tiroxina TTR - transtirretina MCT - transportador monocarboxilato OATP - polipeptídeo transportador de ânion orgânico DIO - desiodase T2 - 3,5-diiodotironina T1AM - 3-iodotirononamina 15 TA4 - ácido 3,5,3',5'-tiroacético TA3 - ácido 3,5,3'-tiroacético TA1 - ácido 3-tiríoacético TR - receptor de hormônios tireoidianos TRE - receptores com elementos responsivos aos hormônios tireoidianos RXR - receptores de retinóide X ERK - quinase regulada extracelularmente JNK - quinase N-terminal c-Jun RTK - receptor de tirosina quinase GRB2 - fator de crescimento-receptor bound-2 SOS - Shc/son de sevenless MEK - proteínas mitógenas extracelulares PD98059 - 2-(2-Amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopiran-4-ona LY294002 - 2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona) PIP2 - fosfatidilinositol-4,5-bifosfato PIP3 - fosfatidilinositol-3, 4,5-bifosfato PDK1 - proteína quinase 1 dependente de fosfoinositide-3 PTEN - fosfatase e homólogo de tensina PP2A - proteína fosfatase 2A MDA - malonaldeído cAMP - AMP cíclico PDE - fosfodiesterase PKA - proteína quinase A FOXO1 - forkhead Box O1 16 TNF-α - fator de necrose tumoral alfa a1-ARs - a1 adrenoceptores Ca 2+ - cálcio Na + - sódio K+ - potássio IL-6 - interleucina 6 TBARS - substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio LDH - lactato desidrogenase DAPI - 4′,6-diamidino-2-phenylindole 17 Resumo A obesidade está associada ao desenvolvimento de inflamação crônica no tecido adiposo branco (TAB) e a uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), resultando em elevados níveis de estresse oxidativo. O TAB armazena energia na forma de triacilglicerol (TAG), que ao sofrer lipólise, é hidrolisado em ácidos graxos livres (FFA) e glicerol. O hormônio tireoidiano T3 regula a taxa metabólica basal, estimula a lipólise, aumenta a produção de adenosina 5'-trifosfato (ATP) e a produção de calor, regulando a termogênese. Sabe-se que o T3 modula a transcrição gênica e tradução proteica por meio das vias citoplasmáticas da fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e/ou proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) no TAB. A molécula de ATP pode ou não ser hidrolisada por ação de ecto-enzimas. O ATP e seus derivados atuam no meio extracelular sinalizando por meio dos receptores purinérgicos, expressos no TAB, regulando o metabolismo lipídico. O receptor P2X7 é sensível ao ATP e, quando ativado, é capaz de modular o metabolismo lipídico, adipogênese, lipólise e inflamação. Existe uma importante relação entre o hormônio tireoidiano e a sinalização purinérgica em diferentes sistemas fisiológicos e patológicos, mas essa relação ainda é pouco elucidada na literatura, especialmente no TAB. Nosso trabalho tem como objetivo demonstrar a relação existente entre a ação do T3 na modulação da sinalização purinérgica em adipócitos subcutâneos humanos, bem como determinar se essa ação é mediada por mecanismos não nucleares, por meio das vias MAPK/ERK e PI3K. Para isso, pré-adipócitos humanos (HPAd-802s-05A), após a diferenciação, foram submetidos ao tratamento com T3 (10nM) por 24 horas, na presença ou ausência de inibidores das vias MAPK/ERK (PD98059, 5 μM) e PI3K (LY294002, 5 μM). Os seguintes 18 parâmetros foram analisados: viabilidade celular (MTT, LDH e contagem nuclear), acúmulo lipídico (coloração Oil Red), lipólise basal (ensaio de ácidos graxos livres e glicerol), estresse oxidativo (dosagens de malonaldeído e carbonilação proteica), expressão proteica dos receptores purinérgicos P2 e ectonucleotidases (imunofluorescência), quantificação do ATP extracelular (ensaio de bioluminescência luciferina-luciferase HS II) e liberação/acúmulo extracelular de adenosina (ADO) (cromatografia líquida de ultra performance - UHPLC). Demonstramos que o T3 desempenha um papel importante na redução da expressão de NTPDase1, NTPDase3 e ecto-5'-nucleotidase, resultando no aumento da concentração extracelular de ATP. Evidenciamos também que o hormônio aumentou a expressão do receptor P2X7, acompanhado de uma maior liberação/acúmulo de ATP extracelular, e esses efeitos foram abolidos pelo bloqueio das vias MAPK/ERK e PI3K. Com isso, evidenciamos que o T3 modula a sinalização ATP/P2X7 por meio das vias MAPK e PI3K em adipócitos subcutâneos humanos. 19 Abstract Obesity is associated with the development of chronic inflammation in white adipose tissue (WAT) and increased production of reactive oxygen species (ROS), resulting in high levels of oxidative stress. TAB stores energy in the form of triacylglycerol (TAG), which, upon undergoing lipolysis, is hydrolyzed into free fatty acids (FFA) and glycerol. The thyroid hormone T3 regulates the basal metabolic rate, stimulates lipolysis, increases the production of adenosine 5'-triphosphate (ATP) and heat production, regulating thermogenesis. It is known that T3 modulates gene transcription and protein translation through the cytoplasmic phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) and/or mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in WAT. The ATP molecule may or may not be hydrolyzed by the action of ecto-enzymes. ATP and its derivatives act in the extracellular environment, signaling through purinergic receptors, expressed in the WAT, regulating lipid metabolism. The P2X7 receptor is sensitive to ATP and, when activated, is capable of modulating lipid metabolism, adipogenesis, lipolysis and inflammation. There is an important relationship between thyroid hormone and purinergic signaling in different physiological and pathological systems, but this relationship is still poorly understood in the literature, especially in WAT. Our work aims to demonstrate the relationship between the action of T3 in modulating purinergic signaling in human subcutaneous adipocytes, as well as determining whether this action is mediated by non-nuclear mechanisms, through the MAPK/ERK and PI3K pathways. For this, human pre-adipocytes (HPAd-802s-05A), after differentiation, were subjected to treatment with T3 (10nM) for 24 hours, in the presence or absence of MAPK/ERK pathway inhibitors (PD98059, 5 μM) and PI3K (LY294002, 5 μM). The following parameters were analyzed: cell viability (MTT, LDH 20 e number of nuclei), lipid accumulation (Oil Red staining), basal lipolysis (free fatty acid and glycerol assay), oxidative stress (measurements of malonaldehyde and protein carbonylation), protein expression of purinergic receptors P2 and ectonucleotidases (immunofluorescence), quantification of extracellular ATP (luciferin-luciferase HS II bioluminescence assay) and extracellular release/accumulation of adenosine (ADO) (ultraperformance liquid chromatography - UHPLC). We demonstrate that T3 plays an important role in reducing the expression of NTPDase1, NTPDase3 and ecto-5'-nucleotidase, resulting in increased extracellular ATP concentration. We also showed that the hormone increased the expression of the P2X7 receptor, accompanied by a greater release/accumulation of extracellular ATP, and these effects were abolished by blocking the MAPK/ERK and PI3K pathways. With this, we demonstrated that T3 modulates ATP/P2X7 signaling through the MAPK and PI3K pathways in human subcutaneous adipocytes. 21 1. Introdução estendida O tecido adiposo (TA) é regulado pela triiodotironina (T3), que modula a diferenciação, proliferação, termogênese, lipólise e produção de ATP intracelular do TA. Recentemente, o sistema purinérgico também tem se destacado como importante regulador das funções do TA, por meio dos receptores purinérgicos, que têm ganhado interesse como potenciais alvos terapêuticos em diferentes condições patológicas. Porém, é necessário maior avaliação da expressão funcional dos receptores purinérgicos, e das funções fisiológicas e patológicas do ATP extracelular e seus metabólitos nos adipócitos. Com isso, muitos trabalhos sustentam a relevante participação do T3 e sistema purinérgico no TA. Porém, há falta de dados na literatura que demonstrem a ação do T3, com envolvimento do sistema purinérgico, no funcionamento do tecido adiposo. Assim, nossos resultados contribuem para promover o entendimento de eventos fisiológicos não descritos em adipócitos subcutâneos humanos. 22 8. Discussão e Considerações finais Diversos estudos demonstram a ação dos hormônios tireoideanos no TA (Giammanco et al., 2020; Walczak & Sieminska, 2021). Porém, é recente o crescente interesse na investigação da cascata de sinalização purinérgica na função dos adipócitos humanos, obesidade e outros distúrbios metabólicos (M. de Oliveira, Mathias, de Sibio, et al., 2020). A presença de receptores purinérgicos funcionais em adipócitos humanos foram identificados (Rossato et al., 2022; Mathias et al., 2023). E, sabe-se que existe importante relação entre hormônios tireoideanos e a sinalização purinérgica em diferentes sistemas fisiológicos e patológicos (Silveira et al., 2013). Sendo que, o T3 pode modular a expressão dos componentes do sistema purinérgico (Mathias et al., 2023). Avaliamos a ação da T3, bem como a participação das vias citoplasmáticas PI3K e MAPK/ERK, na expressão diferencial dos componentes do sistema purinérgico, bem como na lipólise basal e estresse oxidativo. Demostramos que os adipócitos expressam receptores purinérgicos P2Y1, P2Y11, P2X7, além da NTPDase1, NTPDase3 e ecto-5’-nucleotidase. O tratamento com T3 não alterou a expressão dos receptores P2Y1 e P2Y11, e aumentou a expressão do receptor P2X7, acompanhado pela maior liberação/acúmulo de ATP extracelular, que foram abolidos pelo bloqueio das vias MAPK/ERK e PI3K, demonstrando importante participação das vias citoplasmáticas na ação do hormônio tireoidiano sobre a sinalização ATP/P2X7. O tratamento com T3 e com os inibidores das vias MAPK/ERK e PI3K, diminuíram o acúmulo lipídico, sem afetar a lipólise basal e as dosagens de malonaldeído e carbonilação proteica, demonstrando que os 103 tratamentos não geraram estresse oxidativo nas células. Os tratamentos não alteraram a lipólise basal, avaliada pela quantificação de ácidos graxos livres e glicerol. Embora, o tratamento com T3 (10 nM), mas também com os inibidores das vias de sinalização MAPK/ERK (PD98059) e PI3K (LY294002), reduziram significativamente o acúmulo lipídico. (M. de Oliveira, Mathias, Rodrigues, et al., 2020), observaram que o tratamento hormonal reduz os lipídios no interior dos adipócitos, mantém os triglicerídeos inalterados e diminui os níveis de glicerol. Além disso, estudos anteriores do grupo demonstram que o T3 direciona os adipócitos ao amarronamento, pelo aumento da expressão de UCP-1 (M. de Oliveira, Mathias, Rodrigues, et al., 2020; Mathias et al., 2023) e favoreceu a transcrição gênica de marcadores seletivos de adipócitos beges. Além disso, o tratamento com o hormônio aumentou a expressão gênica do receptor P2X5 (Mathias et al., 2023), que tem sido considerado como um possível novo marcador de browning (Tozzi & Novak, 2017). Isto justificaria a redução de acúmulo lipídico, sem alteração da lipólise basal. O tratamento com T3 aumentou a expressão proteica do receptor P2X7, corroborando com relatos anteriores do nosso grupo, que demonstraram que o tratamento com T3 elevou a expressão de mRNA do P2X7, utilizando os mesmos subconjuntos celulares submetidos a condições experimentais equivalentes (Mathias et al., 2023). O aumento da expressão dos receptor P2X7 causada pelo T3 foi prevenida pelo bloqueio das vias MAPK/ERK e PI3K pelo PD 98,059 e LY-294,002, respectivamente. Desta forma, acreditamos que as vias citoplasmáticas apresentam importante papel na modulação da expressão do P2X7 pela T3 nos adipócitos subcutâneos humanos. 104 Existem pesquisas que demonstram que o hormônio afeta o ATP extracelular em outras células e tecidos. Evidenciando que o status do hormônio tireoidiano pode influenciar as enzimas envolvidas no metabolismo do ATP (recentemente revisto por (Le et al., 2023). Nossos resultados indicam que o tratamento com T3 aumenta a liberação/acúmulo de ATP extracelular, porém não altera os níveis de ADO. Recentemente, nosso grupo demonstrou por RNA-Seq que os adipócitos subcutâneos humanos não expressam NTPDase2 e apresentam baixa expressão de NTPDase1, NTPDase3 e 5'-nucleotidase (NT5E), uma cascata enzimática crítica para o catabolismo extracelular de ATP em ADO (Mathias et al., 2023). Além disso, apresentamos, na respectiva tese, que o tratamento com T3 reduz a expressão proteica destas enzimas, NTPDase1, NTPDase3 e 5'-nucleotidase (NT5E). Estes resultados justificam o acúmulo de ATP no meio extracelular nestas culturas. Embora, o tratamento com T3 tenha aumentado a transcrição de genes que codificam para os recetores ADORA2A e ADORA2B, sensíveis a ADO, e também das enzimas responsáveis pelo metabolismo da ADO (ADA e ADK), nas mesmas células (Mathias et al., 2023). Com isso, neste trabalho evidenciamos que o T3 diminui significativamente a expressão proteica das enzimas, NTPDase1, NTPDase3 e ecto-5’-nucleotidase, resultando no acúmulo extracelular de ATP, que pode sustentar a ativação de receptores sensíveis ao ATP, como o P2X7 que foi superexpresso após tratamento com o hormônio. Sabe-se que existe importante participação dos componentes do sistema purinérgico no estado redox, sendo que o ATP está associado ao aumento dos níveis de citocinas, inflamação e estresse oxidativo. A sinalização ATP/P2X7 está relacionada com o estresse oxidativo (Arslan et al., 2019). Sabe-se que o ATP 105 pode ativar o receptor P2X7, regulando a expressão de genes inflamatórios, induzindo a geração de ROS em uma variedade de tipos de células (Munoz et al., 2017). Esta ação pode envolver as vias MAPK (Kim et al., 2015) e PI3K (Zhao et al., 2021). Nossos resultados demonstraram que o T3 ativa as vias MAPK e PI3K, para aumentar a liberação de ATP e a expressão do receptor P2X7, sem afetar o estresse oxidativo. Da mesma forma, (Yau et al., 2019) demonstraram que o tratamento com T3 (10 nM) no tecido adiposo marrom não induziu a formação de espécies reativas de oxigênio intracelular, apesar de ter aumentado a respiração mitocondrial. Além disso, essa dose também não alterou os níveis de TBARS no tecido adiposo subcutâneo humano (M. de Oliveira, Mathias, Rodrigues, et al., 2020). Apesar do hormônio aumentar a liberação de ATP extracelular, a quantidade foi baixa (~3nM), o que indica que as células não foram submetidas a estresse oxidativo. Visto que, sob condições fisiológicas, o ATP extracelular está presente em baixos níveis (faixa nanomolar), e células submetidas a estresse liberam altas concentrações de ATP (micromolares) no meio extracelular, que é capaz de ativar o receptor P2X7 favorecendo uma maior liberação do nucleotídeo (Savio et al., 2018). (Rossato et al., 2022) demonstram que o ATP estimulou a expressão de IL-6, a partir da concentração de 10 μM. Com isso, apesar do T3 aumentar a liberação de ATP e a expressão do receptor P2X7, que se correlacionam com o estresse oxidativo, nossos resultados indicam que essa dose do hormônio e a concentração de ATP extracelular não afetam esse parâmetro. Com isso, nossos resultados indicam que os adipócitos subcutâneos humanos expressam proteínas dos componentes do sistema purinérgico. O T3 106 modula a sinalização purinérgica com participação das vias extranucleares, MAPK/ERK e PI3K, em adipócitos subcutâneos humanos. O hormônio aumenta a expressão do receptor P2X7, acompanhado pela maior liberação/acúmulo de ATP extracelular, que foram abolidos pelo bloqueio das vias MAPK/ERK e PI3K. Com isso, o T3 modula a sinalização ATP/P2X7 por meio das vias MAPK e PI3K em adipócitos subcutâneos humanos não inflamados. Nosso trabalho demonstrou um evento fisiológico não descrito, da ação do T3 na via ATP/P2X7, com envolvimento das vias extranucleares MAPK e PI3K, em adipócitos subcutâneos humanos não inflamados. Os resultados podem contribuir para novas perspectivas fisiopatológicas da modulação do T3 na atividade dos adipócitos, visando o sistema purinérgico, sobretudo o receptor P2X7. Com o objetivo de combater a atividade inflamatória e estresse oxidativo nos adipócitos, que ocorrem em diversas fisiopatologias do tecido adiposo. A Figura 5 representa esquematicamente o principal resultado encontrado em nosso trabalho. 107 Figura 5. Esquema geral do mecanismo de ação do T3 na modulação da via ATP/P2X7 por meio das vias MAPK/ERK e PI3K em adipócitos subcutâneos humanos. O T3 ativa as vias extranucleares, estimulando a maior expressão do receptor P2X7. O hormônio reduz a expressão de NTPDase 1, NTPDase 3 e NT5E, favorecendo o acúmulo de ATP no espaço extracelular. (Imagem criada em BioRender.com) 108 9. Referências Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., & Zimmermann, H. (2009). Purinergic signalling in the nervous system: An overview. Trends in Neurosciences, 32(1), 19–29. https://doi.org/10.1016/j.tins.2008.10.001 Adamson, S. E., Meher, A. K., Chiu, Y., Sandilos, J. K., Oberholtzer, N. P., Walker, N. N., Hargett, S. R., Seaman, S. A., Peirce-Cottler, S. 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