UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade De Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Efeitos da co-administração de metformina e licopeno sobre as alterações metabólicas e estresse glico-oxidativo no diabetes mellitus Ingrid Delbone Figueiredo Orientadora: Profa. Dra. Amanda Martins Baviera Araraquara - SP 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Ingrid Delbone Figueiredo Efeitos da co-administração de metformina e licopeno sobre as alterações metabólicas e estresse glico-oxidativo no diabetes mellitus Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Amanda Martins Baviera Araraquara - SP 2019 AGRADECIMENTOS À Deus, primeiramente, por toda força que colocou em meu coração permitindo minha chegada até aqui. Aos meus pais Fabiana e Humberto que me criaram e com todas as dificuldades existentes, conseguiram financiar meus estudos que me ajudaram chegar até aqui. O amor incondicional e o exemplo de vocês me inspiram dia após dia. Ao meu irmão Cairê, meu exemplo de vida, obrigada pelos conselhos e palavras de carinho que me confortaram nos momentos difíceis. Aos meus avós, primos, tios e toda minha família pelo apoio incondicional. À minha orientadora Profa. Dra. Amanda Martins Baviera, pela paciência, dedicação e incentivo. Com sua orientação, consegui realizar esta dissertação e seus conhecimentos me fizeram ter vontade de sempre me dedicar aos estudos. Obrigada pelas palavras de incentivo, pelos ensinamentos que me guiaram ao longo destes dois anos e me tornaram o que sou hoje. Graças à professora, tive a oportunidade de realizar o Curso de Mestrado na UNESP. Meus sinceros agradecimentos pela confiança que me foi depositada e que me permitiu chegar até aqui. Ao professor Dr. Iguatemy Lourenço Brunetti, pelos inúmeros ensinamentos, palavras de sabedoria, motivação que me guiaram ao longo destes anos. Suas palavras certamente estão guardadas em meu coração e serão levadas comigo para sempre. À minha amiga e colega de trabalho Tayra Ferreira, essencial para realização deste trabalho. Obrigada pela parceria, ensinamentos e por me ajudar tanto com a execução desta dissertação. Agradeço pelas palavras de apoio e pela amizade que certamente será carregada comigo por todo sempre. Sentirei saudades! Aos colegas do laboratório de Bioquímica e Enzimologia: Renata, Anderson, Marcel, Maiara, Mariana, Maíra, Juliana, Camila e Bruno, meus sinceros agradecimentos. Cada um de vocês, de alguma forma, contribuíram para realização deste trabalho. Vocês me ensinaram muito nestes anos e certamente me lembrarei de vocês e deste período da minha vida com muita alegria. Sentirei saudades da convivência, das risadas e parceria. Obrigada por tudo! À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES), pelo apoio financeiro. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro. À Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo incentivo financeiro que permitiu a realização deste trabalho. RESUMO O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica crônica caracterizada por deficiência na produção pancreática de insulina e/ou prejuízos em suas ações teciduais, culminando principalmente em hiperglicemia. A manutenção da hiperglicemia por longos períodos é um dos principais fatores envolvidos no estabelecimento e manutenção do estresse glico- oxidativo, o qual está implicado no desenvolvimento das complicações micro e macrovasculares do DM, resultando em morbidade e mortalidade significativas. A metformina tem sido um dos principais agentes antidiabéticos orais utilizados para o tratamento do DM; entretanto, é crescente o interesse no uso de produtos naturais como terapia complementar, seja por seus benefícios aditivos aos efeitos da terapia clássica, seja pelo potencial antioxidante. O licopeno é um carotenoide encontrado em diversos vegetais, em especial tomates frescos e seus derivados. Diversos estudos vêm demonstrando vários benefícios atribuídos ao licopeno: redução da glicemia, dislipidemia, inflamação e em biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo. Diante do exposto, o licopeno surge como uma opção terapêutica complementar interessante aos fármacos já utilizados no tratamento do DM. O objetivo deste estudo é investigar o potencial antidiabético do iogurte enriquecido com metformina ou licopeno, isolados ou co-administrados, em ratos diabéticos, avaliando parâmetros fisiológicos, bioquímicos, marcadores do estresse glico-oxidativo e potencial antioxidante. Ratos Wistar machos, normais ou diabéticos (indução com 40 mg/kg de estreptozotocina) foram tratados com iogurte, insulina (4U/animal, subcutânea), 250 mg/kg de metformina em iogurte, 45 mg/kg de licopeno em iogurte, 250 mg/kg de metformina + 45 mg/kg de licopeno em iogurte. Os tratamentos foram realizados durante 30 dias. Foram analisados: (i) parâmetros fisiológicos: peso corporal, ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário; massas de tecidos adiposos (retroperitoneal e epididimal); massas de tecidos musculares (EDL e soleus) (ii) parâmetros bioquímicos: glicemia, colesterol, HDL-colesterol, triacilgliceróis, alanina aminotransferase (ALT), teste de tolerância à glicose oral (TTGO); (iii) biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo no plasma, fígado e rim: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteínas carboniladas (PCO), produtos finais de glicação avançada (AGEs fluorescentes); (iv) atividades de enzimas antioxidantes: paraoxonase 1 (PON 1; plasma), superóxido dismutase (SOD; fígado e rim), catalase (CAT; fígado e rim), glutationa peroxidase (GSH-Px; fígado e rim), glutationa redutase (GSH-Rd; fígado e rim), níveis dos grupos tióis não proteicos (fígado e rim). Animais diabéticos controles, tratados com iogurte, apresentaram piora em todos os parâmetros analisados, bem como estabelecimento de estresse glico-oxidativo e intolerância à glicose. Porém, observou-se a instalação de um mecanismo compensatório ao estresse oxidativo em fígado e rim destes animais, com aumentos nas atividades das enzimas GSH-Px e GSH-Rd. O tratamento de ratos diabéticos com insulina foi eficaz na melhoria de todos os parâmetros analisados. Os tratamentos de ratos diabéticos com metformina ou com licopeno incorporados em iogurte, isoladamente, promoveram melhoras significativas em quase todos os parâmetros alterados no DM experimental. O tratamento com a associação metformina + licopeno em iogurte também foi benéfico frente aos parâmetros analisados, com destaque para a promoção de redução aditiva na glicemia, triacilgliceróis, colesterol total, ALT, TBARS (rim e plasma), PCO (rim e fígado), AGEs fluorescentes (plasma e fígado), e aumento nas atividades de SOD (fígado e rim), CAT (fígado e rim) e PON 1 (plasma). O tratamento de ratos diabéticos com a terapia combinada metformina + licopeno em iogurte promove uma diversidade de efeitos benéficos em biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo, surgindo como uma opção promissora não somente no controle da glicemia mas também na atenuação ou até mesmo prevenção das complicações do DM, especialmente em fígado e rins. Palavras-chave: diabetes mellitus, licopeno, metformina, estresse glico-oxidativo ABSTRACT Diabetes mellitus (DM) is a chronic metabolic syndrome characterized by pancreatic deficiency in the insulin production and/or impairments in its actions, culminating in hyperglycemia. The maintenance of hyperglycemia for long periods is one main factor involved in the onset and maintenance of glycoxidative stress, and it is implicated in the development of micro and macrovascular complications of DM, which result in significant morbidity and mortality. Metformin has been the main oral antidiabetic agent used for the treatment of DM; however, there is a growing interest in the use of natural products as complementary therapy, either because of its additive benefits to the effects of classical therapy or for its antioxidant potential. Lycopene is a carotenoid found in many vegetables, especially fresh tomatoes and their derivatives. Many studies have shown the several benefits attributed to lycopene: reduction of glycemia, dyslipidemia, inflammation, and biomarkers related to glycoxidative stress. In view of this, lycopene has appearing as an interesting complementary therapeutic option to drugs already used for the treatment of DM. The objective of this study was to investigate the antidiabetic potential of yoghurt enriched with metformin or lycopene, isolated or co-administered, in diabetic rats, evaluating physiological, biochemical parameters, biomarkers of oxidative damage, and antioxidant defenses. Male Wistar, normal or diabetic rats (induction with 40 mg/kg streptozotocin) were treated with yoghurt, insulin (4U/animal, subcutaneous), 250 mg/kg metformin in yoghurt, 45 mg/kg lycopene in yoghurt, 250 mg/kg metformin + 45 mg/kg lycopene in yoghurt. The treatments were performed for 30 days. The following parameters were analyzed: (i) physiological parameters: body weight, food intake, water intake, and urinary volume; weights of adipose tissues (retroperitoneal and epididymal) and skeletal muscles (EDL and soleus); (ii) biochemical parameters: glycemia, cholesterol, HDL-cholesterol, triacylglycerols, alanine aminotransferase (ALT), oral glucose tolerance test (OGTT); (iii) biomarkers related to glycoxidative stress in plasma, liver and kidney: thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonyl proteins groups (PCO), advanced glycation end products (fluorescent AGEs); (iv) activities of antioxidant enzymes: paraoxonase 1 (PON 1; plasma), superoxide dismutase (SOD; liver and kidney), catalase (CAT; liver and kidney), glutathione peroxidase (GSH-Px; liver and kidney), glutathione reductase (GSH-Rd; liver and kidney), non protein thiol groups (liver and kidney). Control, diabetic animals treated with yoghurt presented a worsening in all parameters analyzed, as well as establishment of glycoxidative stress and glucose intolerance. However, it was observed the onset of a compensatory mechanism against oxidative in liver and kidney of these animals, with increases in the activities of GSH- Px and GSH-Rd. The treatment of diabetic rats with insulin was effective in promoting improvements in all studied parameters. The treatments of diabetic rats with metformin or with lycopene incorporated into yoghurt, alone, promoted significant improvements in almost all altered parameters in the experimental DM. The treatment with the combination of metformin + lycopene into yoghurt had beneficial effects in various parameters, mainly promoting further effects on the reduction of glycemia, triacylglycerols, total cholesterol, ALT, TBARS (kidney and plasma), PCO (kidney and liver), fluorescent AGEs (plasma and liver), and increased the activities of antioxidant enzymes SOD (liver and kidney), CAT (liver and kidney) and PON 1 (plasma). The treatment of diabetic rats with the combined therapy metformin + lycopene into yoghurt promoted a wide range of beneficial effects on biomarkers related to glycoxidative stress, therefore appearing as a promising option not only for the glycemic control but also for the attenuation or even prevention of DM complications, mainly in liver and kidneys. Keywords: diabetes mellitus, lycopene, metformin, glycoxidative stress LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Vias pelo qual a hiperglicemia exacerba o estresse glico-oxidativo no DM.......22 FIGURA 2: Mecanismos que promovem o aumento na produção de AGEs..........................23 FIGURA 3: Sistemas de defesas antioxidantes do organismo................................................28 FIGURA 4: Estrutura da metformina......................................................................................29 FIGURA 5: Estrutura do licopeno...........................................................................................33 FIGURA 6: Massas dos músculos esqueléticos de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias............................................................................................................................................47 Massas dos tecidos adiposos brancos, epididimal e retroperitoneal de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias.................................................................................................................48 FIGURA 8: Níveis plasmáticos de glicose e área sob a curva (AUC) da glicemia de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias......................................................................................49 FIGURA 9: Teste de tolerância oral à glicose, área sob a curva (AUC) da glicemia no TTGO e glicemia após 12 horas de jejum de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 28 dias.............................50 FIGURA 10: Níveis plasmáticos de triglicerídeos (mg/dL), colesterol (mg/dL) e colesterol- HDL (mg/dL) de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias...........................................52 FIGURA 11: Níveis de alanina aminotransferase (ALT) em plasma de ratos não diabéticos e ratos diabéticos tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias.....................53 FIGURA 12: Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, proteínas carboniladas e AGEs fluorescentes no plasma de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias.....................................................................56 FIGURA 13: Atividade de PON 1 em plasma de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias............................................................................................................................................57 FIGURA 14: Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, proteínas carboniladas e de AGEs florescentes no fígado de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias.............................................................58 FIGURA 15: Atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase no fígado de ratos não diabéticos e ratos diabéticos tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias............................................................................................................................................60 FIGURA 16: Níveis de grupos tióis não proteicos e atividades das enzimas glutationa redutase e glutationa peroxidase no fígado de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias...............................................61 FIGURA 17: Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, proteínas carboniladas e AGEs fluorescentes no rim de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias.....................................................................63 FIGURA 18: Atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase no rim de ratos não diabéticos e ratos diabéticos tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias............................................................................................................................................65 FIGURA 19: Níveis de grupos tióis não proteicos e atividades das enzimas glutationa redutase e glutationa peroxidase no rim de ratos normais e ratos diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno, após 30 dias...............................................66 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Parâmetros fisiológicos (peso corporal, ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário) de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, no início (dia 0), meio (dia 15) e fim (dia 30) do experimento...................................................................................................................46 TABELA 2: Alterações relativas (% em relação ao DIOG) no biomarcadores do metabolismo de carboidratos e lipídeos, estresse glico-oxidativo e defesas antioxidantes no plasma, fígado e rim de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias de tratamento........................................67 e 68 LISTA DE ABREVIATURAS 4-HNE 4-Hidroxinonenal ACC Acetil-CoA carboxilase ADA Associação Americana de Diabetes ADP Adenosina difosfato AGEs Advanced glycation end products AGE-R AGE-receptors AGL Ácidos graxos livres AkT Proteína quinase B ALP Fosfatase alcalina ALT Alanina aminotransferase ALX Aloxana AMP Adenosina monofosfato AMPc 3´5´-adenosina-monofosfato cíclico AMPK Proteína quinase dependente de AMP Apo B Apolipoproteína B AST Aspartato aminotransferase ATP Adenosina trifosfato AUC Área sob a curva CaCl2 Cloreto de cálcio CAT Catalase CEL Nε(carboxietil) lisina CML Nε-(carboximetil) lisina CRTC2 CREB-regulated transcriptional coactivator-2 DAG Diacilglicerol DHGNA Doenças hepática gordurosa não alcóolica DINS Ratos diabéticos tratados com 4U/dia de insulina DIOG Ratos diabéticos tratados com iogurte DLIC Ratos diabéticos tratados com 45 mg/kg de licopeno em iogurte DLICMET Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de metformina + 45 mg/kg de licopeno em iogurte DM Diabetes mellitus DMET Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de metformina em iogurte DNA Ácido desoxirribonucleico DNPH 2,4-Dinitrofenilhidrazina DTNB 5,5-Ditio-2-nitrobenzoico EASD Associação Européia dos Estudos em Diabetes EDL Extensor digitorum longus EPM Erro padrão da média ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio G6Pase Glicose-6-fosfatase GADPH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GFAT Glutamina frutose-6-fosfato aminotransferase γ-GT γ-glutamil transpeptidase GLP-1 Peptídeo semelhante ao glucagon-1 GLUT 2 Transportador de glicose do tipo 2 GLUT 4 Transportador de glicose do tipo 4 GOLD Dímero de lisina derivado de glioxal GSH Glutationa reduzida GSH-Px Glutationa peroxidase GSH-Rd Glutationa redutase GSSG GST Glutationa oxidada Glutationa-S-transferase H2O2 Peróxido de hidrogênio HCl Ácido clorídrico HDL Lipoproteína de alta densidade HMG-CoA 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA HOCl Ácido hipocloroso IDL Lipoproteína de densidade intermediária IKK Inibidor de fator nuclear kappa IL-1 Interleucina 1 IL-6 Interleucina 6 LDL Lipoproteína de baixa densidade LDL-ox Lipoproteína de baixa densidade oxidada LOOH Hidroperóxidos lipídicos LpL Lipase lipoproteica LPO Lipoperoxidação ou peroxidação lipídica LSH Lipase hormônio sensível MDA Malondialdeído MMP-2 Metaloproteinase de matriz 2 MOLD Dímero de lisina derivado de metilglioxal MPO Mieloperoxidase MTP Proteína microssomal de transferência de triacilglicerol NaCl Cloreto de sódio NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida NaOH Hidróxido de sódio NBT Nitroblue tetrazolium NF-kB Fator nuclear kappa B NIOG Ratos normais, não diabéticos, tratados com iogurte NO Óxido nítrico O2 •− Radical anion superóxido OH• Radical hidroxila OONO- Peroxinitrito PCO Proteínas carboniladas PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase PI3K Fosfatidilinositol-3-quinase PKA Proteína quinase A PKC Proteína quinase C PON 1 Paraoxonase 1 RAGE Receptor for AGEs SOD Superóxido dismutase STZ Estreptozotocina TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TNF-α Fator de necrose tumoral α TTGO Teste oral de tolerância à glicose TZP Triazepnona UCP Uncopling protein UKPDS Estudos Clínicos Prospectivos em Diabetes do Reino Unido VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELA LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 18 2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 21 2.1 Diabetes Mellitus ................................................................................................... 21 2.2 Estresse glico-oxidativo no DM ............................................................................. 23 2.3 Metformina ............................................................................................................ 31 2.4 Licopeno ................................................................................................................ 34 3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 37 3.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 37 3.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 37 4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 38 4.1 Animais ................................................................................................................. 38 4.2 Indução do diabetes mellitus experimental ............................................................. 38 4.3 Desenho experimental ............................................................................................ 39 4.4 Determinações bioquímicas ................................................................................... 40 4.4.1 Glicemia, método da glicose oxidase .................................................................. 40 4.4.2 Colesterol total, método da colesterol oxidase .................................................... 41 4.4.3 Triacilglicerol, método enzimático de reações acopladas .................................... 41 4.4.4 Colesterol-HDL, método indireto por inibição seletiva ....................................... 41 4.4.5 Determinação dos níveis de alanina aminotransferase (ALT) .............................. 41 4.4.6 Avaliação da peroxidação lipídica ...................................................................... 42 4.4.7 Quantificação de grupos carbonilas de proteínas ................................................. 42 4.4.8 Atividade de paraoxonase 1 ................................................................................ 43 4.4.9 Determinação da concentração de grupos tióis não proteicos .............................. 43 4.4.10 Atividades de enzimas antioxidantes em fígado e rim ..................................... 43 4.4.11 Estimativa dos produtos finais de glicação avançada ....................................... 44 4.4.12 Dosagem de proteínas totais ............................................................................ 45 4.4.13 Análise dos resultados..................................................................................... 45 5. RESULTADOS ........................................................................................................... 46 5.1 Parâmetros fisiológicos e bioquímicos de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte....................................................................................................................................46 5.2 Biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo no plasma de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte............................................................................... 57 5.3 Biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo no fígado de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte............................................................................... 60 5.4 Biomarcadores dos sistemas antioxidantes no fígado de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte .......................................................................................................... 62 5.5 Biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo no rim de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte ........................................................................................... 65 6. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 71 7. CONCLUSÕES ......................................................................................................... 100 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 101 ANEXO 1: CEUA/FCF/CAr nº 23/2017 .......................................................................... 121 18 1. INTRODUÇÃO O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica caracterizada por hiperglicemia, resultante de defeitos na secreção e/ou ação da insulina (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2018). Em longo prazo, a manutenção da hiperglicemia está associada ao desenvolvimento de complicações microvasculares do DM, dentre elas nefropatia, retinopatia e neuropatia diabéticas, bem como das complicações macrovasculares, incluindo as doenças cardiovasculares e acidente vascular cerebral. Tais complicações são as principais causas das elevadas taxas de morbidade e mortalidade associadas ao DM (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2018; RAINS; JAIN, 2011). O aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) bem como dos produtos finais de glicação avançada (AGEs), devido à hiperglicemia crônica participam do estabelecimento de um quadro de estresse glico-oxidativo nos diversos tecidos, o qual contribui para patogênese das complicações micro e macrovasculares (CHILELLI et al. 2013; ROCHETTE et al., 2014). Outro caminho através do qual os AGEs podem contribuir para o desenvolvimento das complicações diabéticas ocorre via a ativação de receptores específicos presentes nas membranas plasmáticas, os receptores de AGEs (RAGE) (SINGH et al., 2014). A interação AGE-RAGE está relacionada à indução de estresse oxidativo, via ativação de diversas cascatas de sinalização que aumentam a expressão de citocinas e outros mediadores pró- inflamatórios, resultando em danos celulares e contribuindo, portanto, para o estabelecimento das complicações do DM (HO et al., 2010; OTT et al., 2014; OU; HUANG et al., 2017). Além disto, a hiperglicemia crônica pode ocasionar alterações em longo prazo nas células, fenômeno este conhecido como “memória metabólica”, caracterizada pela persistência das complicações relacionadas ao DM mesmo após o alcance de um efetivo controle glicêmico (CERIELLO et al., 2012). Uma vez que a hiperglicemia é um dos principais fatores envolvidos no estabelecimento das complicações do DM, o tratamento da doença tem como principal objetivo a manutenção dos níveis glicêmicos próximos à normalidade. A metformina tem sido um dos principais agentes antidiabéticos orais utilizados para o tratamento do DM. Os mecanismos da ação relacionados ao potencial antihiperglicêmico incluem principalmente redução na produção hepática de glicose via inibição da gliconeogênese e aumento da sensibilidade periférica à insulina nos tecidos periféricos. Também tem sido atribuída à 19 metformina a capacidade de redução da ingestão alimentar e do peso corporal, bem como promoção de melhora no perfil lipídico e na esteatose hepática, e também modula marcadores inflamatórios como NF-kB e IL-6 (PERNICOVA; KORBONITS, 2014). No entanto, cerca de 20% dos pacientes que fazem uso contínuo da metformina apresentam alguns distúrbios gastrointestinais, tais como diarréia, dispepsia, náuseas e vômitos, em intensidade proporcional à dose do fármaco (500 / 750 mg); tais distúrbios são citados pelos pacientes como a principal causa de descontinuidade do uso da metformina (OKAYASU et al., 2012; HOWLETT; BAILEY, 1999). Portanto, estratégias terapêuticas que diminuam a dose da metformina, sem afetar a resposta antihiperglicêmica, são extremamente interessantes para a redução dos efeitos adversos do fármaco. Uma destas estratégias é baseada na associação de metformina com preparações ou produtos de origem natural com atividade antidiabética. Revisão de Prabhakar e Kumar (2014) reúne uma série de estudos que demonstram os benefícios associados ao uso combinado de fármacos comerciais (metformina, glimepiride, piaglitazona, gliclazida, entre outros) com ativos naturais (ácido ferúlico, ácido cafeico, ácido cumárico, eugenol, entre outros), reduzindo os efeitos adversos dos fármacos comerciais. Outro benefício atribuído aos ativos naturais é o seu potencial antioxidante, o que torna a associação com a metformina ainda mais vantajosa. A presença de compostos biologicamente ativos nos fitoterápicos e alimentos funcionais explicam o seu potencial na prevenção, redução de riscos e/ou tratamento de doenças. Esteroides vegetais, carotenóides, fibras, alcaloides e polifenois são exemplos de compostos bioativos que possuem um amplo espectro de atividades biológicas importantes no combate a doenças (PERERA; LI, 2012; PAZ et al., 2015). Vários estudos têm sido realizados com extratos, frações e/ou compostos derivados de alimentos ou plantas medicinais com o objetivo de esclarecer seu potencial antihiperglicêmico e/ou anti-glicação, permitindo que seu uso possa ter um papel importante como terapia adjuvante no DM (KARTHIKESAN; MENON., 2010; ABBAS et al., 2016). Nosso laboratório tem se dedicado ao estudo do potencial antidiabético e antioxidante do iogurte enriquecido com compostos presentes em alimentos funcionais e/ou fitoquímicos (GUTIERRES et al., 2012; ARCARO et al., 2014; GUTIERRES et al., 2015; GUTIERRES et al., 2019), incluindo o licopeno (ASSIS et al., 2017). O iogurte é um dos alimentos lácteos mais consumidos em todo o mundo; o enriquecimento/fortificação do iogurte tem sido 20 considerado uma opção prática como veículo de compostos bioativos de outros alimentos funcionais, de plantas medicinais e antioxidantes (GAHRUIE et al., 2015). O licopeno é um carotenóide isômero acíclico do β-caroteno, altamente insaturado, responsável pela coloração vermelha de tomates frescos e seus produtos processados. É também encontrado em alguns microrganismos e outros vegetais, tais como melancia, mamão e goiaba. Após sua absorção, o licopeno é transportado via lipoproteína de baixa densidade (LDL), onde pode atuar como um potente antioxidante in vivo (RAO et al., 1998). Estudos têm demonstrado que o consumo de suco de tomate promove diversos benefícios à saúde, reduzindo os níveis de biomarcadores relacionados ao estresse oxidativo, inflamação e dislipidemia (JACOB et al., 2008; GHAVIPOUR et al., 2015). Muitos dos benefícios relacionados à ingestão de tomate e seus derivados têm sido atribuídos à presença do licopeno. Diante ao exposto, e sabendo-se que muitas das complicações observadas no DM estão relacionadas com a manutenção do estresse glico-oxidativo, torna-se extremamente interessante o estudo dos benefícios que podem ser alcançados no tratamento de animais em modelo de DM com a combinação metformina e licopeno. 21 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Diabetes Mellitus O DM é uma síndrome metabólica caracterizada por deficiência na secreção de insulina pelas células beta pancreáticas e/ou da resistência dos tecidos alvo às ações deste hormônio, culminando em diversos prejuízos no controle do metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas. Além da hiperglicemia, outras alterações são observadas no DM, tais como: elevados níveis circulantes de triglicerídeos, aumento dos ácidos graxos, colesterol e da lipoproteína de baixa densidade (LDL), e diminuição dos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2018; ROCHETTE et al., 2014). Dentre as principais manifestações clínicas descritas, estão: glicosúria, poliúria, perda de peso, polidipsia, polifagia e visão turva (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2018). O DM é classificado principalmente em: (i) DM tipo 1, que tem como característica a destruição das células beta do pâncreas, em geral mediada por autoimunidade, culminando em deficiência absoluta de insulina; (ii) DM tipo 2, onde observa-se predominância de resistência insulínica com disfunção pancreática e deficiência relativa de insulina; (iii) outros tipos específicos de DM, tais como defeito genético das células beta do pâncreas, endocrinopatias, dentre outras causas; (iv) DM gestacional, quando a intolerância à glicose tem início na gravidez ou primeiramente detectada durante a gestação (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2018). No DM tipo 1, a hiperglicemia se desenvolve rapidamente e independe da presença de resistência à insulina; no entanto, após longos períodos de hiperglicemia, a resistência à insulina pode surgir e aumentar gradualmente. Já no DM tipo 2, a resistência à insulina está presente por vários anos antes que a hiperglicemia crônica se desenvolva. Na resistência à insulina, ocorre uma diminuição da sensibilidade tecidual às ações da insulina, nos principais tecidos-alvo, incluindo músculo esquelético, tecido adiposo, fígado e pâncreas (LAAKSO; KUUSISTO, 2014). No fígado, a resistência à insulina culmina em aumento na produção hepática de glicose, uma vez que não ocorre inibição nos processos de glicogenólise e gliconeogênese (SALTIEL, 2001). Vários mecanismos podem ocasionar a resistência à insulina, ao interferirem com a capacidade de ativação de componentes da cascata de sinalização deste hormônio, incluindo a exposição crônica aos elevados níveis de glicose, lipídeos, estresse oxidativo, inflamação, entre outros (KAUL et al, 2015). 22 A insulina é um hormônio cujas ações são essencialmente anabólicas, e participa da regulação do metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas. No metabolismo de carboidratos, a insulina é responsável pelos seguintes eventos: aumentar a translocação de vesículas contendo os transportadores de glicose, GLUT 4, para a membrana plasmática das células, aumentando a captação da glicose; aumenta a oxidação da glicose para geração de energia, estimula a glicogênese, ou seja, a síntese de glicogênio (KAHN; SALTIEL, 2005). Estes mecanismos que promovem estimulação da captação e utilização da glicose, em combinação com a inibição na produção hepática de glicose, contribuem para a manutenção da glicemia em valores de normalidade. No metabolismo lipídico, a insulina é responsável pelos seguintes eventos: estimular a atividade da lipase lipoproteica (LpL), enzima presente nos capilares sanguíneos que banham os tecidos adiposos e musculares, e assim promove a hidrólise dos triglicerídeos das lipoproteínas circulantes e aumenta a captação de ácidos graxos; inibir a lipase hormônio sensível (LHS), presente nos tecidos adiposos, enzima responsável pela hidrólise de triglicerídeos, disponibilizando assim menos ácidos graxos livres (AGL) (KAH; SALTIEL, 2005). Já no metabolismo de proteínas, a insulina é responsável pelos seguintes eventos: inibir a degradação de proteínas, liberando menos aminoácidos pelos tecidos; aumentar a captação de aminoácidos pelos tecidos; aumentar a velocidade da síntese proteica (STAMP; NAIR, 2005). Diversos modelos animais têm sido amplamente utilizados em pesquisas acerca do DM. Estudos iniciais utilizavam cães pancreatectomizados para confirmar o papel central do pâncreas na homeostase da glicose, culminando na descoberta e purificação da insulina. Atualmente, a maioria dos experimentos são realizados com roedores (REES; ALCOLADO, 2005). Para induzir o DM experimental em animais, podem ser utilizadas estratégias farmacológicas, especialmente via administração dos compostos diabetogênicos estreptozotocina (STZ) e aloxana (ALX). A STZ é captada pelas células beta pancreáticas, via transportador de glicose GLUT 2, e ocasiona a alquilação do ácido desoxirribonucleico (DNA), culminando em danos ao DNA que induzem a ativação de poli-ADP ribosilação, cuja consequência é a apoptose da células β-pancreáticas. Além disso, ocorre liberação tóxica de óxido nítrico (NO) e a formação de espécies reativas de oxigênio, incluindo radical ânion superóxido (O2 •−), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH•) e peroxinitrito (OONO-), que também participam de promoção dos danos ao DNA. Como resultado, as 23 células β pancreáticas são destruídas também por necrose (SZKUDELSKI, 2001). Como ocorre uma destruição maciça e significativa das células beta pancreáticas, a administração de STZ leva ao desenvolvimento de modelo de DM que mimetiza as alterações do DM tipo 1, onde a hiperglicemia é elevada e consequentemente as complicações da doença aparecem rapidamente, tornando-se um modelo interessante para o estudo do potencial de compostos que previnem e/ou atenuam as complicações do DM relacionadas à hiperglicemia. 2.2 Estresse glico-oxidativo no DM A manutenção da hiperglicemia, em longo prazo, é responsável por ocasionar alterações nos tecidos através de cinco mecanismos: (i) aumento do fluxo de glicose e de outros açúcares pela via dos polióis; (ii) aumento na formação intracelular de AGEs; (iii) aumento na expressão dos receptores de AGE (RAGE) na superfície das células; (iv) ativação proteína quinase C (PKC); (v) aumento da via da hexosamina. Todos estes eventos são exacerbados pelo estresse oxidativo, especialmente pelo aumento na geração de ERO na cadeia transportadora de elétrons, na mitocôndria (BROWNLEE, 2005). A via dos polióis é composta por enzimas que pertencem a família das aldo-ceto- redutases, e podem utilizar como substratos uma ampla variedade de compostos carbonílicos, e reduzi-los aos seus respectivos álcoois de açúcar (polióis), com a oferta de poder redutor da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH). A glicose é convertida em sorbitol por ação da enzima aldose redutase e para isso acontecer, há oxidação de NADPH. Posteriormente, ocorre formação de frutose por ação da sorbitol desidrogenase que, por sua vez, utiliza o NAD+ como cofator. Uma das principais consequências de aumento no fluxo desta via é a menor disponibilidade da NADPH, molécula necessária para a regeneração da glutationa em sua forma reduzida (GSH), culminando na diminuição drástica deste antioxidante endógeno e aumentando assim o estresse oxidativo induzido por hiperglicemia (CHUNG et al., 2003). 24 Figura 1: Vias pelo qual a hiperglicemia exacerba o estresse glico-oxidativo no DM A hiperglicemia promove o aumento da produção mitocondrial de radical ânion superóxido através da ativação de quatro mecanismos que induzem a inibição da gliceraldeído-3-P desidrogenase (GADPH). O aumento da oferta de glicose exacerba a produção de sorbitol com utilização de NADPH, no qual promove um esgotamento dos níveis de GSH; o aumento da oferta de frutose 6-P, através da ação da glicosamina-6- fofato aminotransferase (GFAT), é convertido em glicosamina-6P que pode ser transformado em UDP-N- GLcNAc ocasionando danos às proteínas citoplasmáticas e nucleares; o aumento do gliceraldeído 3P pode promover o aumento da produção do diacilglicerol (DAG), no qual pode ativar a PKC e também promove o aumento da formação de metilglioxal. Fonte: Adaptado Brownlee, 2005. O aumento na formação dos produtos finais de glicação avançada, os AGEs é o segundo mecanismo pelo qual a hiperglicemia é responsável pelo aumento do estresse glico-oxidativo (NOWOTNY et al., 2015). A produção de AGEs ocorre inicialmente com o processo de glicação de proteínas, via reação de Maillard, quando grupos carbonilas de monossacarídeos reagem com grupos amino de proteínas, gerando bases de Schiff, que se rearranjam em produtos de Amadori (BIERHAUS et al., 1998). Os produtos de Amadori são convertidos em dicarbonilas altamente reativas (glioxal, metilglioxal, 3-deoxiglicosona). Estas dicarbonilas, após desidratação e rearranjos, levam à formação de diversos AGEs, sendo os mais conhecidos Nε-(carboximetil) lisina (CML), Nε-(carboxietil) lisina (CEL), dímero de lisina derivado de glioxal (GOLD) e metilglioxal (MOLD), arg-pirimidina, pirralina, pentosidina e vesperlisinas (NOWOTNY et al., 2015). 25 Figura 2: Mecanismos que promovem o aumento da produção de AGEs A produção exacerbada de AGEs pode ser devido a cinco mecanismos: (i) reação espontânea não enzimática de açúcares redutores com grupos animo de proteínas, via reação de Maillard; (ii) auto-oxidação da glicose; (iii) produtos da peroxidação lipídica; (iv) aumento do gliceraldeído-3P pela inibição da gliceraldeído-3P desidrogenase (GADPH) e (v) aumento da via dos polióis. Todos estes mecanismos são responsáveis pelo aumento da formação das dicarbonilas reativas que podem, através de rearranjos, aumentar a produção de AGEs. Fonte: adaptado NOWOTNY et al., 2015. No DM não controlado, há produção exacerbada de AGEs nas matrizes intra e extracelulares; o aumento de AGEs na matriz intracelular pode ocasionar danos via os seguintes mecanismos: (i) perda da função das proteínas que são modificadas pelos AGEs; (ii) ligação dos AGEs aos receptores RAGE, presentes nas superfícies celulares de macrófagos, células do endotélio vascular, células musculares lisas, dentre outras. A ligação dos AGEs aos seus receptores RAGE é responsável por aumentar ainda mais a produção de ERO que, por sua vez, ativa o fator nuclear kappa B (NF-kB), culminando em aumento na produção de citocinas inflamatórias, tais como IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-α) (SINGH et al., 2014; SANAJOU et al., 2018). O receptor RAGE é encontrado em uma variedade de células, tais como células endoteliais, neuronais, fibroblastos, macrófagos, entre outras. No rim, os RAGE são encontrados em células epiteliais tubulares, glomerulares e mesangiais (OTT et al., 2014; 26 PASUPULATI et al., 2016). Já no fígado, os RAGE são encontrados nos hepatócitos e células perissinusoidais (YAMAGISHI; MATSUI., 2015). Em condições fisiológicas normais, a expressão de receptores RAGE é baixa, mas pode ser regulada em resposta ao estresse e/ou inflamação (HYOGO et al., 2008; YAMAGISHI; MATSUI, 2015). A interação AGE-RAGE de forma exacerbada regula diversos eventos intracelulares via ativação de vários componentes sinalizatórios, resultando em disfunção celular. Em condições patológicas, receptores RAGE quando ativados estimulam a cascata sinalizatória PI3K-Akt-IKK com ativação de NF-kB, culminando em sua translocação para o núcleo. Também promove um aumento na produção de ERO, apoptose e a autofagia. O NF-kB, além de mediar a inflamação, também aumenta a expressão de RAGE e inibe a expressão de glioxalase I (OTT et al., 2014; PASUPULATI et al., 2016; EMEL’YANOV, 2017). Os sistemas enzimáticos dependentes de glioxalase e aldeído desidrogenase são responsáveis por detoxificar adutos de açúcares precoces (produtos de Amadori) e compostos carbonílicos reativos, tais como glioxal e metilglioxal (OTT et al., 2014; PASUPULATI et al., 2016; EMEL’YANOV, 2017). Além dos sistemas que eliminam os precursores de AGEs, existe também o complexo AGE-R, que consiste em três receptores distintos: AGE-R1/OST-48, AGE-R2/80K-H e AGE- R3/galectin-3, que está envolvido na sinalização de AGE e na endocitose de proteínas modificadas por AGEs. O receptor AGE-R1/OST-48 é encontrado nas células mesangiais, endoteliais, neuronais, fibroblastos, macrófagos, entre outras. No rim, sua expressão está diminuída em patologias, incluindo o DM (OTT et al., 2014; PASUPULATI et al., 2016). No fígado também há expressão de AGE-R1/OST-48, AGE-R2/80K-H e AGE-R3/galectin-3, sendo destacado o AGE-R3, e estes encontram-se diminuídos em patologias como o DM e cirrose, por exemplo (BUTSCHEID et al., 2007). Este receptor, quando ativado, aumenta a velocidade de remoção dos AGEs, uma vez que promove a endocitose e degradação de proteínas modificadas, portanto também possui um papel protetor contra agressões mediadas pelo estresse oxidativo, e assim previne lesões celulares e teciduais (OTT et al., 2014; PASUPULATI et al., 2016). O quarto mecanismo pelo qual a hiperglicemia ocasiona o aumento no estresse oxidativo é através da ativação da via da PKC. Trata-se de uma enzima que apresenta 11 isoformas e é amplamente distribuída em todos os tecidos. É responsável pela fosforilação de resíduos de treonina/serina de diversos alvos proteicos; sua função depende de cálcio. Diversos mecanismos são citados como ativadores da atividade desta enzima: (i) aumento da produção de ERO; (ii) aumento na disponibilidade de NADH devido a maior velocidade da 27 via dos polióis; (iii) aumento da ligação AGE-RAGE (INOGUCHI et al., 1992; KOYA; KING, 1998; GIACCO; BROWNLEE, 2010). Tanto o aumento na disponibilidade de NADH quanto a produção exacerbada de O2 •− durante o estresse oxidativo ocasionam a inibição de uma enzima chamada gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), a qual é responsável por catalisar a oxidação do glicerol-3- fosfato em dihidroxicetona-fosfato. Assim, uma vez que a enzima é inibida, ocorre o acúmulo de seu substrato, o gliceraldeído-3-fosfato, podendo assim favorecer a formação de metilglioxal (precursor de AGEs) e/ou o aumento na produção de diacilglicerol (DAG). A regulação da via DAG-PKC é importante na manutenção da permeabilidade vascular, contratilidade, proliferação celular, angiogênese, ação de citocinas e adesão leucocitária (KOYA; KING, 1998). O aumento de DAG culmina na ativação da PKC que, uma vez ativada, é responsável pelo aumento da expressão de fatores pró-trombóticos e pró- inflamatórios (BROWNLEE, 2001; MADONNA; DE CATERINA, 2011; ROCHETTE et al., 2014). A última via, não menos importante, pelo qual a hiperglicemia é responsável pelo aumento do estresse glico-oxidativo é pelo aumento da via da hexosamina. Em um quadro de hiperglicemia crônica e resistência à insulina, há um excesso da oferta de glicose e ácidos graxos para as vias oxidativas, e isto contribui para a patogênese das complicações relacionadas ao DM via aumento do fluxo da frutose-6-fosfato para a via da hexosamina. (KOLM-LITTY et al., 1998; GIACCO; BROWNLEE, 2010). Nesta via, a frutose-6-fosfato é deslocada da via glicolítica e se torna substrato de uma enzima chamada glutamina frutose-6- fosfato aminotransferase (GFAT), que converte a frutose-6-fostato em glicosamina-6-fosfato, utilizando a glutamina como fonte de amina (GIACCO; BROWNLEE, 2010; COSTANTINO et al., 2017). O excesso de frutose-6-fosfato no DM pode ser explicado tanto pelo aumento na oferta de glicose para a via glicolítica, como também pela inibição da GAPDH. Assim, as concentrações de frutose-6-fosfato aumentam dentro da célula e aumenta, consequentemente, a ação da enzima GFAT. O excesso de glicosamina-6-fosfato é convertido em UDP-N- GlcNAc, causando orto-glico-n-acilação em resíduos de serina e treonina de proteínas citoplasmáticas e nucleares, alterando suas funções (GIACCO; BROWNLEE, 2010). Além disto, a glicosamina-6-fosfato pode interagir com diversas biomoléculas, alterando suas funções biológicas, incluindo o DNA (GIACCO; BROWNLEE, 2010; COSTANTINO et al., 2017). 28 O estresse oxidativo é caracterizado pelo aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) e/ou pela redução nas defesas antioxidantes. O estresse oxidativo no DM participa do estabelecimento das complicações crônicas microvasculares (retinopatias, neuropatias, nefropatias) e macrovasculares (doenças cardiovasculares e cerebrovasculares) (MADONNA; DE CATERINA, 2011). Já o estresse glicativo culmina na geração de AGEs e também tem papel crucial nas complicações diabéticas (EMEL’YANOV et al., 2010; TITOV et al., 2013). Vale destacar que galactose, frutose, ribose, triose e monossacarídeos fosforilados possuem maior reatividade no processo de glicação em comparação à glicose; no entanto, devido às altas concentrações de glicose no sangue e matriz extracelular no DM, o papel da glicose no processo de glicação de biomoléculas se torna importante (EMEL’YANOV, 2017). A formação de ligações cruzadas em proteínas é uma das principais características atribuídas aos AGEs; tais ligações modificam as estruturas das proteínas e prejudicam sua funcionalidade, contribuindo para a perda de função das biomoléculas, e precede o estabelecimento das complicações diabéticas, além de participar no processo de estabelecimento de resistência à insulina (LAPOLLA et al, 2005; VAN BUREN; LE WINTER, 2011; SOMPONG et al., 2013; SINGH et al., 2014). Além dos danos causados em proteínas, as ERO e ERN encontram-se associadas com a oxidação de lipídeos, tanto circulantes, como àqueles presentes em LDL. ERO e ERN também oxidam lipídeos encontrados em membranas plasmáticas; este processo é chamado de peroxidação lipídica (LPO) e um dos produtos formados é o malondialdeído (MDA), utilizado como um importante biomarcador da peroxidação lipídica. Os lipídeos são particularmente vulneráveis à oxidação por ERO, e isto pode resultar na lipoperoxidação. A LPO é um processo no qual ERO atacam lipídeos, especialmente aqueles que possuem ligações duplas carbono-carbono, incluindo os ácidos graxos poli-insaturados, resultando em uma variedade de produtos. Os principais produtos primários da LPO são os hidroperóxidos lipídicos (LOOH) e alguns dos produtos secundários são o malondialdeído (MDA), mais mutagênico, e o 4-hidroxinonenal (4-HNE), mais tóxico (MARNETT, 1999; AYALA et al., 2014). As células respondem à LPO de acordo com as condições metabólicas específicas e capacidade de reparo, podendo assim promover a sobrevivência ou induzir a morte celular. Sob condições fisiológicas ou baixas taxas de LPO, as células estimulam sua manutenção e sobrevivência por meio de defesas antioxidantes, porém sob altas taxas de LPO as células não conseguem reparar os danos, e assim ocorre a indução da apoptose ou necrose (AYALA et al., 2014). 29 As proteínas são importantes alvos de ERO e/ou de subprodutos secundários do estresse glico-oxidativo, e dão origem as proteínas carboniladas (PCO). PCO é um marcador geral de dano oxidativo às proteínas e reflete o dano celular induzido por diversos ERO (DALLE-DONNE et al., 2006; SUZUKI et al., 2010). As PCO podem ser formadas pelos seguintes processos: (i) oxidação direta de cadeias laterais de aminoácidos (lisina, arginina, prolina e treonina); (ii) clivagem oxidativa de proteínas; (iii) via ataque dos produtos originados na LPO; (iv) via ação de açúcares redutores ou seus produtos de oxidação, via glico-oxidação (DALLE-DONNE et al., 2006). A prevalência de vias aeróbicas para a obtenção de energia (metabolismo oxidativo) favorece a produção de ERO, o que o levou ao desenvolvimento dos mecanismos de defesa na forma de agentes ou sistemas antioxidantes. Tem-se como conceito que o antioxidante é capaz de diminuir a velocidade, impedir ou eliminar os danos oxidativos em moléculas alvo. No DM, além do aumento na produção de ERO, também ocorre uma diminuição nas atividades de algumas enzimas antioxidantes, tais como a superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px) e catalase (CAT), atribuída às alterações observadas nestas proteínas por ação das ERO ou após eventos glicativos (SINDHU et al. 2014; RAJENDRAN et al., 2014; ARCARO et al. 2014). As enzimas antioxidantes geralmente convertem ERO em moléculas de O2 não reativas, e/ou formam H2O. Durante o processo de geração de ERO, o O2 •− é o principal intermediário reativo de O2, o qual é rapidamente dismutado a H2O2 espontaneamente e/ou por ação catalítica da SOD. O H2O2 sofre ação da CAT e/ou da GSH-Px, originando H2O. O O2 •− e o H2O2 podem originar outras ERO muito reativas, incluindo o ácido hipocloroso (HOCl) por ação da mieloperoxidase (MPO); OH• pela reação de Fenton; OONO- pela reação com o NO (JHA et al., 2016). Portanto, o efeito antioxidante é de extrema importância para o controle do estresse glico-oxidativo. São conhecidas as ações antioxidantes endógenas da molécula de glutationa. Sabe-se que níveis diminuídos deste antioxidante estão relacionados com a exacerbação do estresse glico-oxidativo no DM. A molécula de glutationa reduzida (GSH) é oxidada (GSSG) pela ação da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px), esta utiliza como substrato H2O2 bem como hidroperóxidos lipídicos. A regeneração da glutationa em sua forma reduzida ocorre via ação da glutationa redutase (GSH-Rd), a qual utiliza como poder redutor o NADPH, para reduzir GSSG em GSH (BHABAK; MUGESH, 2010). 30 Figura 3: Sistemas de defesas antioxidantes do organismo. O oxigênio, através da cadeia transportadora de elétrons (CTE), promove o aumento da geração de radical ânion superóxido (O2 •) que é dismutado pela ação da superóxido dismutase (SOD) em peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 pode ser eliminado sob a forma de água através da ação de duas enzimas antioxidantes: (i) catalase (CAT) e (ii) glutationa peroxidase (GSH-Px). Para GSH-Px exercer sua atividade é necessária a oxidação da molécula de GSH em GSSG. O ciclo é restaurado pela ação da glutationa redutase (GSH-Rd), no qual promove a redução da GSH com concomitante oxidação do NADPH à NADP+. Por fim, o excesso de H2O2 pode reagir com o ferro, através da reação de Fenton, originando o radical hidroxila (OH•). Fonte: Do autor, 2019. Quando as ERO e ERN atacam componentes na LDL, ocorre a formação da LDL- oxidada, que é fagocitada pelos macrófagos, iniciando o processo de geração das células espumosas e formação da placa aterosclerótica. A paraoxonase 1 (PON 1) é uma enzima plasmática que circula associada à HDL; é responsável por proteger as lipoproteínas (especialmente a LDL) contra o ataque das ERO, sendo sua principal função a hidrólise de peróxidos lipídicos, tais como ésteres de colesteril e fosfolipídeos (AVIRAM et al., 2000). Portanto, a atividade da PON 1 é de extrema importância e contribui para o potencial antiaterogênico da HDL (ROZENBERG et al., 2003). Mazur (1946) e Aldridge (1953) desempenharam um papel fundamental na identificação e classificação da PON 1. Inicialmente ela foi identificada como A-esterase, mas depois se tornou conhecida como paraoxonase devido à sua capacidade de desintoxicar o composto organofosforado paraoxon, um metabólito tóxico do Paration (pesticida agrícola). A PON 1 pertence a uma família de três tipos de paraoxonase, PON 1, PON 2 e PON 3. PON 1 31 e PON 3 são sintetizadas principalmente no fígado e encontradas principalmente no plasma em associação à HDL. Atualmente, a PON 1 é considerada a paraoxonase mais importante, pois possui a capacidade de hidrolisar vários intermediários oxidados, bem como a homocisteína tiolactona, um aminoácido sulfurado que participa do metabolismo da metionina, e tem sido considerado um fator de risco para aterosclerose cerebral, coronariana e periférica. Desta forma, a PON 1 tem papel protetor via atenuação do estresse oxidativo e proteção das membranas celulares contra a peroxidação lipídica, atenuando a aterosclerose (CHISTIAKOV et al., 2017; SHUNMOOGAM et al, 2018). 2.3 Metformina A metformina (dimetilbiguanida) é um derivado da guanidina, o composto ativo hipoglicemiante da Galega officinalis. É o medicamento mais prescrito para o tratamento da hiperglicemia crônica em pacientes com DM tipo 2, em conjunto com as medidas para promoção de mudanças no estilo de vida, e que incluem dietas específicas, controle do peso corporal, prática de exercícios físicos. Trata-se de um antidiabético oral utilizado como fármaco de primeira linha de tratamento do DM nos protocolos desenvolvidos pela Associação Americana de Diabetes (ADA) e Associação Europeia dos Estudos em Diabetes (EASD), os quais foram baseados em estudos clínicos prospectivos em diabetes realizados no Reino Unido (UKPDS) ( NATHAN et al., 2009; VIOLLET et al., 2012). Figura 4: Estrutura da metformina. Fonte: Adaptado Beissweiger e Ruggiero, 2003. Dentre os benefícios alcançados no tratamento do DM tipo 2 com a metformina, destaca-se sua ação antihiperglicêmica sem ocasionar episódios de hipoglicemia; amenização dos quadros de resistência à insulina, diminuindo assim as complicações do DM; atua como 32 sensibilizador à insulina, reduzindo os níveis plasmáticos da insulina de jejum (GUNTON et al., 2003; VIOLLET et al., 2012). Também é descrita a ação benéfica da metformina na modulação de componentes do eixo das incretinas, aumentando os níveis plasmáticos do peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) e induzindo a expressão gênica do receptor da incretina nas ilhotas pancreáticas (MAIDA et al., 2011; VIOLLET et al., 2012). Sabe-se que as incretinas são hormônios produzidos pelo trato gastrointestinal e liberados quando os alimentos ingeridos alcançam o trato gastrointestinal. Uma vez liberadas, as incretinas estimulam a secreção de insulina, contribuindo assim, no controle glicêmico. O hormônio incretina predominante é o GLP-1 que além de estimular a secreção de insulina, suprime a liberação do glucagon, desacelera o esvaziamento gástrico, melhora a sensibilidade à insulina e reduz o consumo de alimentos, através do aumento da saciedade (CHACRA, 2006). Uma vez que a hiperglicemia é um dos principais fatores envolvidos no estabelecimento das complicações do DM, o tratamento da doença tem como principal objetivo a manutenção dos níveis glicêmicos próximos à normalidade. Recente revisão de Rena et al (2017) reúne os principais mecanismos através dos quais a metformina tem ação antihiperglicêmica. Uma vez nos hepatócitos, e após atravessar a membrana plasmática e a membrana mitocondrial interna, a metformina inibe o complexo I da cadeia transportadora de elétrons, diminuindo a produção mitocondrial de ATP. Assim, ocorre aumento na razão ADP:ATP e AMP:ATP, e consequentemente há ativação da enzima AMPK (proteína quinase dependente de AMP). O aumento na razão AMP:ATP também inibe a enzima frutose-1,6- bifosfatase, culminando em inibição aguda da gliconeogênese. Em relação à AMPK, uma vez ativada, esta fosforila a enzima ACC (acetil-CoA carboxilase), inibindo assim a lipogênese, e consequentemente ocorre aumento na oxidação de ácidos graxos, reduzindo assim os estoques de lipídeos no fígado, e em última instância tais eventos culminam em aumento na sensibilidade hepática à insulina. A AMPK também fosforila e ativa a enzima fosfodiesterase do tipo 4B (PDE 4B), levando à redução nos níveis de AMPc, não havendo, portanto, ativação da proteína quinase dependente de AMPc (PKA, induzida por glucagon) e assim também ocorre inibição da gliconeogênese. Por fim, AMPK também fosforila CRTC2 (CREB-regulated transcriptional coactivator-2), um fator de transcrição que, quando fosforilado, é inibido (retido no citoplasma) e assim não haverá a transcrição de genes que codificam para PEPCK (fosfoenolpiruvato carboxiquinase) e G6Pase (glicose-6-fosfatase), enzimas chave da gliconeogênese. 33 Também são descritas as ações da metformina no aumento da sensibilidade à insulina nos tecidos periféricos e estas ações ocorrem via alguns mecanismos: (i) aumento da atividade tirosina quinase do receptor de insulina; (ii) aumento da translocação dos GLUT 4 para a membrana plasmática celular; (iii) aumento da expressão dos receptores de insulina; (iv) aumento da capacidade de restauração de componentes envolvidos na sinalização de insulina (PERNICOVA; KORBONITS, 2014). Além dos benefícios já descritos da metformina na promoção de redução da glicemia no DM, ainda merecem destaque as suas ações inibitórias sobre os níveis de AGEs e no aumento das defesas antioxidantes (TANAKA et al., 1997; RAHBAR et al., 2000; BONNEFONT-ROUSSELOT et al, 2001; BONNEFONT-ROUSSELOT et al., 2003; ALDINI et al., 2007). Em relação as suas ações relacionadas à diminuição dos níveis de AGEs, a metformina é capaz de reagir com alguns precursores de AGEs, em especial glioxal e metilglioxal. Estudos cinéticos bem como espectros de fragmentação em massa dos produtos gerados pela reação da metformina com o glioxal e metilglioxal demonstraram a formação de um composto denominado triazepinona. A reação inicia-se com a condensação do glioxal com o grupo amino primário da metformina e após uma desidratação ocorre a formação do derivado de triazepinona. Dados experimentais e clínicos sustentam a hipótese de que a ação da metformina em reduzir as complicações relacionadas ao DM tem relação, pelo menos em parte, com a sua capacidade em diminuir os níveis de compostos dicarbonílicos e consequentemente dos AGEs (BEISSWENGER; RUGGIERO, 2001; ALDINI et al., 2007). Mamputu et al. (2003) descreveram a capacidade da metformina em inibir a adesão e a migração de monócitos para o endotélio vascular, e assim inibe a formação de células espumosas. Estes resultados sugerem outros mecanismos pelos quais a metformina pode reduzir o risco de complicações vasculares em pacientes com DM tipo 2. Chukwunonso et al. (2016) observaram que ratos diabéticos (indução com 130 mg/kg i.v de aloxana) tratados com 25 mg/kg de metformina, durante 14 dias apresentaram aumento nos níveis séricos dos antioxidantes endógenos, incluindo SOD, CAT e GSH, bem como diminuição nos níveis séricos dos produtos de peroxidação, atenuando as complicações relacionadas ao DM. A associação de metformina com produtos naturais parece ser uma opção promissora para a atenuação das complicações diabéticas. Em estudo recente de nosso laboratório, foi observado que o tratamento de ratos diabéticos durante 30 dias com a associação de metformina (250 mg/kg) e curcumina (90 mg/kg) em iogurte promoveu diminuição da dislipidemia e de marcadores do estresse glico-oxidativo, bem como promoveu aumento na 34 atividade da enzima antioxidante PON 1, sugerindo assim que a associação da metformina com este antioxidante de origem natural pode trazer benefícios no combate às complicações do DM, neste caso as complicações cardiovasculares (ROXO et al., 2019). É crescente no número de estudos com resultados promissores no desenvolvimento de terapias combinadas de antidiabéticos orais (metformina) com bioativos naturais ou mesmo combinações de diferentes antioxidantes naturais entre si para suplementação em indivíduos diabéticos (BOLIGNANO et al., 2017) ou modelos experimentais da doença. A presença de compostos biologicamente ativos nos fitoterápicos e alimentos funcionais explicam o seu potencial na prevenção, redução de riscos e/ou tratamento de doenças. Esteroides vegetais, carotenóides, fibras, alcaloides e polifenois são exemplos de compostos bioativos que possuem um amplo espectro de atividades biológicas importantes no combate a doenças (PERERA; LI, 2012; PAZ et al., 2015). 2.4 Licopeno Algumas substâncias de origem natural podem atuar de forma sinérgica com fármacos já utilizados clinicamente, permitindo a redução das doses necessárias para produzir o efeito desejado e, consequentemente, minimizando os efeitos adversos (CASANOVA; COSTA, 2017). O licopeno é um carotenoide isômero acíclico do β-caroteno com onze duplas ligações conjugadas e duas ligações não conjugadas, portanto é altamente insaturado. É responsável pela coloração vermelha de tomates frescos e seus produtos processados (CEFALI et al., 2009). É também encontrado em alguns microrganismos e outros vegetais, tais como melancia, mamão e goiaba. Após sua absorção, o licopeno é transportado via LDL, onde pode atuar como um potente antioxidante in vivo (YANG et al., 2012). Sabe-se que a LDL contém uma grande quantidade de ácidos graxos insaturados (em fosfolipídeos), os quais podem ser alvos das espécies reativas produzidas em excesso no DM. Assim, quando estas espécies reativas oxidam componentes estruturais da LDL, geram inúmeros aldeídos ativos que, por sua vez, reagem com resíduos de lisina das apolipoproteínas (apo B) presentes na LDL, modificando-as, formando a LDL oxidada. Portanto, a formação de LDL oxidada tem correlação direta com o aumento nos níveis de colesterol e de LDL, bem como com a produção aumentada das espécies reativas. No entanto, a HDL é capaz de reverter/atenuar este quadro via remoção dos fosfolipídeos oxidados na membrana da LDL, tornando-a menos “prejudicial”. Assim, o licopeno, sendo um potente 35 antioxidante, atua tanto diretamente na captura de espécies reativas formadas, como também aumentando as atividades das enzimas antioxidantes (PON 1, SOD, CAT, GSH-Px), o carotenoide promove uma ação benéfica na diminuição da oxidação da LDL, diminuindo assim a chance de eventos cardiovasculares, tal como a aterosclerose (FAN et al., 2019). Figura 5: Estrutura do licopeno. Fonte: Adaptado Cefali et al., 2009. Os aditivos alimentares na dieta estão ganhando popularidade com os passar dos anos. Diversos estudos demonstraram a capacidade antioxidante de vitaminas de origem natural na promoção da saude e bem-estar. A suplementação dietética regular com frutas e vegetais tem sido associada com um aumento nos níveis de vitaminas antioxidantes no plasma (JOHN; ZIEBLAND, 2004; OZMEN et al., 2016). Estudos também têm demonstrado que o consumo de suco de tomate promove diversos benefícios à saúde, reduzindo os níveis de biomarcadores relacionados ao estresse oxidativo, inflamação e dislipidemia (JACOB et al., 2008; GHAVIPOUR et al., 2015). Seu potencial em promover redução nos níveis de colesterol parece estar relacionado às seguintes ações: (i) capacidade de inibição de HMG-CoA redutase, enzima importante na síntese do colesterol; (ii) inibição da enzima colesterol aciltransferase (ACAT), que catalisa a formação de ésteres de colesterol no fígado; (iii) inibição da síntese de receptores da LDL, protegendo as células do acúmulo de colesterol (PALOZZA et al., 2012). Muitos dos benefícios relacionados à ingestão de tomate e seus derivados têm sido atribuídos à presença do licopeno. Bernal et al. (2013) observou que a administração de licopeno a ratos alimentados com dieta hiperlipídica/hipercolesterolêmica reduziu o desenvolvimento de esteatose hepática; tal benefício foi associado à redução nos níveis circulantes de triacilgliceróis e dos níveis urinários de isoprostano (marcador de estresse oxidativo). 36 Em relação aos benefícios do licopeno no DM, tem sido demonstrado que o carotenoide atenua a disfunção endotelial e o estresse oxidativo, reduzindo os níveis de LDL- ox, portanto contribui para a redução do risco cardiovascular (ZHU et al., 2011). O licopeno também é capaz de proteger os rins contra a nefropatia diabética, via redução do estresse oxidativo, promovendo aumento nas enzimas antioxidantes SOD, CAT (ALI e ACHA, 2009) e GSH-Px, e redução nos níveis de malondialdeído (MDA), marcador de peroxidação lipídica (GUO et al., 2015). Ainda, foram descritas as ações protetoras do licopeno contra o dano oxidativo no DNA, proteínas e lipídeos e também na modulação da comunicação intercelular, inibindo a proliferação de células tumorais no endométrio e pulmões (ZHANG et al., 1991; LEVY et al., 1995; RAO et al., 1998.; ALI; AGHA, 2009). Estudo realizado por Ozmen et al. (2016) demonstrou que o licopeno é capaz de atuar sobre as células β pancreáticas, prevenindo sua destruição e consequentemente atenuando os prejuízos na secreção de insulina. O licopeno também foi capaz de diminuir a vacuolização das ilhotas de Langerhans, ou seja, reduziu a degeneração celular pancreática. Estudo de nosso laboratório observou os diversos benefícios alcançados após os tratamentos de ratos diabéticos durante 50 dias com iogurte enriquecido com combinações de fitoquímicos: curcumina (extrato dos rizomas de Curcuma longa, contendo 65% de curcumina), licopeno (extrato de tomate, contendo 10,13% de licopeno) ou bixina (extrato das sementes de Bixa orellana, contendo 60% de bixina). Os tratamentos com as misturas curcumina + bixina ou curcumina + licopeno apresentaram efeitos combinados, que preservaram os benefícios alcançados com os tratamentos isolados: nos tratamentos combinados, houve redução em biomarcadores de distúrbios do metabolismo de carboidratos e lipídeos (efeitos da curcumina), aumento nos níveis de HDL (efeitos dos carotenoides, licopeno ou bixina) e redução no estresse oxidativo (efeitos da curcumina e dos carotenoides). Os efeitos combinados das misturas curcumina + licopeno ou curcumina + bixina também preveniram a oxidação de LDL, sugerindo que a suplementação com misturas de fitoquímicos tenha potencial para prevenir ou atenuar complicações cardiovasculares no DM (ASSIS et al., 2017). 37 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Investigar as alterações em biomarcadores fisio-metabólicos, do estresse glico- oxidativo e potencial antioxidante em ratos diabéticos tratados, durante 30 dias, com iogurte enriquecido com metformina ou licopeno, isolados ou co-administrados. 3.2 Objetivos específicos Em ratos diabéticos induzidos com STZ (mimetizando as alterações observadas no DM tipo 1) e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina, 45 mg/kg de licopeno ou com metformina + licopeno em iogurte, durante ou após 30 dias, avaliar: • Parâmetros fisiológicos (peso corporal, ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário) bem como as massas dos tecidos corporais (músculos esqueléticos soleus e extensor digitorum longus, EDL, e tecidos adiposos brancos retroperitoneal e epididimal); • Níveis de biomarcadores plasmáticos relacionados ao metabolismo de carboidratos e lipídeos (glicose, triglicerídeos, colesterol total e colesterol-HDL) e marcador de integridade hepática (ALT); • Tolerância à glicose, via teste de tolerância à glicose oral (TTGO); • Níveis de TBARS no plasma e sobrenadantes de fígado e rim; • Níveis de PCO no plasma e sobrenadantes de fígado e rim; • Atividade de PON 1 no plasma; • Atividades das enzimas antioxidantes SOD e CAT nos sobrenadantes de fígado e rim, bem como componentes do sistema da glutationa [níveis de GSH (representada pela análise de grupos tiois não proteicos), atividades de GSH-Rd e GSH-Px]; • Níveis de AGEs fluorescentes no plasma e sobrenadantes de fígado e rim. 38 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Animais Foram utilizados ratos machos Wistar, com peso de 150 ± 10 g, provenientes do Biotério Central do Câmpus de Botucatu, UNESP. Os animais permaneceram no Biotério do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara, UNESP. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UNESP, Câmpus de Araraquara/SP (CEUA/FCF/CAr nº 23/2017, Anexo I). 4.2 Indução do diabetes mellitus experimental O DM foi induzido via administração intravenosa (veia jugular) de 40 mg de estreptozotocina (STZ)/kg de peso corporal. Para realização deste procedimento, os animais foram submetidos à jejum prévio de 12 horas para administração de 40 mg de STZ) por kg de peso corporal, e após a administração do fármaco diabetogênico, os animais permaneceram em jejum por mais 90 minutos. Em paralelo aos animais que receberam STZ, foi conduzido um grupo de animais normais, não diabéticos, que foram submetidos aos mesmos procedimentos, porém, recebendo somente tampão citrato. Três dias após a administração de STZ, os animais foram distribuídos nos diferentes grupos experimentais realizando-se um pareamento, utilizando-se a glicemia e o peso corporal, cujos valores médios iniciais apresentaram a maior proximidade. 39 4.3 Desenho experimental Os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais (10 animais/grupo): ✓ Ratos normais, não diabéticos, tratados com iogurte (NIOG); ✓ Ratos diabéticos tratados com iogurte (DIOG); ✓ Ratos diabéticos tratados com 4U/dia de insulina (DINS); ✓ Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de metformina em iogurte (DMET); ✓ Ratos diabéticos tratados com 45 mg/kg de licopeno em iogurte (DLIC); ✓ Ratos diabéticos tratados com 250 mg/kg de metformina + 45 mg/kg de licopeno em iogurte (DLICMET). Licopeno e/ou metformina foram incorporados ao iogurte natural (Nestle®) em ambiente termostatizado (25oC) durante 90 segundos, sob rotação de 27000 rpm em homogeneizador Metabo®. As doses utilizadas de metformina e licopeno foram selecionadas de acordo com estudos previamente realizados em nosso laboratório, sendo as doses que promoveram as respostas mais efetivas de melhoria nas alterações fisiológicas e bioquímicas no diabetes experimental (ROXO et al., 2019; ASSIS et al., 2017). Os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas individuais, em tempos determinados (0, 15 e 30 dias), recebendo água e ração “ad libitum”, onde permaneceram durante três dias, para adaptação. O biotério encontrava-se nas seguintes condições ambientais: ciclo de luz de 12 horas (luzes acessas às 6:00 e desligadas às 18:00 horas), temperatura constante de 23°C ± 1°C e umidade de 55 ± 5%. A leitura da gaiola metabólica de 24 horas foi realizada a cada 15 dias. Para tal procedimento, foram oferecidos aos animais, em cada gaiola, massa de ração (50 g) e volume de água (200 mL) conhecidos, foi colocado frasco coletor de urina limpo, seco e contendo tolueno para a coleta da urina, e posterior determinação do volume urinário. Os parâmetros analisados foram: peso corporal, ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário. Após a análise dos parâmetros referentes à gaiola metabólica, os animais eram colocados em caixas de polietileno, onde permaneciam durante os demais dias de experimento. Os animais foram tratados, durante 30 dias, com os compostos incorporados em iogurte por via orogástrica duas vezes ao dia (8:00 e 18:00 horas), em volume de 0,5 mL de 40 iogurte/animal/administração; cada administração continha 50% da dose diária dos compostos. Animais dos grupos NIOG e DIOG receberam somente iogurte duas vezes ao dia. Animais do grupo DINS receberam insulina (Humolin®) preparada em solução de NaCl 0,85% por via subcutânea, em duas doses diárias de 2U cada. O sangue para determinação da glicemia foi coletado a cada 10 dias. A coleta foi realizada via caudal, após vasodilatação, em tubos Eppendorf contendo heparina sódica, após centrifugação a 664 g durante 10 minutos, o plasma foi obtido e a análise da glicemia foi realizada. Após 28 dias de tratamento, os animais foram jejuados por 12 horas (com início às 21:00 horas) e submetidos ao teste tolerância à glicose oral (TTGO) às 09:00 horas da manhã do dia seguinte (2,5 g/kg glicose, via oral). A glicemia foi determinada antes (0 min) e depois (15, 30, 60, 90, 120 minutos) da sobrecarga de glicose, tal como descrito por Xu et al. (2009), com modificações, através do método da glicose oxidase (TRINDER, 1969). Após 30 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados, via decapitação (guilhotina para roedores), para retirada do sangue total e obtenção do plasma para determinação dos níveis de glicose, triglicerídeos, colesterol total, colesterol-HDL, AGEs fluorescentes, proteínas carboniladas (PCO), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), enzima paraoxonase 1 (PON 1) e ALT. Também foram retirados os rins e fígado, armazenados à -80oC para posterior determinação de PCO, TBARS e AGEs, bem como enzimas antioxidantes (SOD, CAT, GSH-Px, GSH-Rd) e também concentração de GSH (representados por tióis não proteicos). Tecidos adiposos brancos epididimal e retroperitoneal e os músculos soleus e extensor digitorum longus (EDL) foram retirados e pesados. 4.4 Determinações bioquímicas 4.4.1 Glicemia, método da glicose oxidase A glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose à ácido glucônico e H2O2. O H2O2 reage com 4-aminoantipirina, sob a ação de peroxidase, formando uma antipirilquinonimina, monitorada em 505 nm, e cuja intensidade de absorção é proporcional à concentração da glicose na amostra (TRINDER, 1969). 41 4.4.2 Colesterol total, método da colesterol oxidase A concentração de colesterol total foi determinada utilizando sistema de reações enzimáticas acopladas, com colesterol esterase, colesterol oxidase e peroxidase. O produto final formado é a antipirilquinonimina, monitorada em 505 nm, e cuja intensidade de absorção é proporcional à concentração de colesterol na amostra (MROZ, 2003). 4.4.3 Triacilglicerol, método enzimático de reações acopladas A concentração de triacilgliceróis foi determinada via reações enzimáticas acopladas; os triacilgliceróis são hidrolisados pela lipase, produzindo glicerol e ácidos graxos livres. O glicerol é fosforilado pela gliceroquinase, produzindo glicerol-3-fosfato, o qual é oxidado à dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio sob ação da glicerol-3-fosfato oxidase. O H₂O₂ participa da oxidação de 4-aminoantipirina, pela ação catalizadora da peroxidase, gerando quinoneimina, monitorada a 505 nm, sendo diretamente proporcional à concentração dos triacilgliceróis na amostra (RIFAI; WARNICK, 2006). 4.4.4 Colesterol-HDL, método indireto por inibição seletiva O poliânion composto por fosfotungstato de sódio e íons de magnésio forma complexos estáveis com a superfície de VLDL, LDL e quilomicra. Os complexos formados com as partículas do colesterol-HDL presentes no soro não se estabilizam, ficando sujeitos à ação detergente do polioxietileno lauril éter, solubilizando-se. Em seguida, ocorre a ação de colesterol esterase, colesterol oxidase e peroxidase, resultando na formação de um cromóforo que é diretamente proporcional à concentração de colesterol presente no colesterol-HDL da amostra (RIFAI; WARNICK, 2006). 4.4.5 Determinação dos níveis de alanina aminotransferase (ALT) As concentrações plasmáticas de ALT foram realizadas utilizando kits comerciais da Vitros Chemistry Products (Ortho Clinical Diagnostics). A camada de difusão dos slides contém os substratos alanina e α-cetoglutarato de sódio. A ALT catalisa a transferência do grupo amino da alanina para o α-cetoglutarato, na presença do piridoxal-5-fosfato, produzindo 42 piruvato e oxaloacetato; o piruvato é oxidado à acetilfosfato e é gerado peróxido de hidrogênio via uma oxidase de piruvato. A reação final consiste na oxidação de corante leuco pelo peróxido de hidrogênio, na presença de uma peroxidase, com a formação de cromóforo. A alteração da densidade da reflectância é proporcional à atividade de ALT na amostra. 4.4.6 Avaliação da peroxidação lipídica Amostras de rim (0,25 g) foram homogeneizadas em 1 mL de cloreto de potássio 1,15%. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 g por 10 min a 4º e os sobrenadantes utilizados para as análises. As amostras (plasma e sobrenadantes de fígado e rim) foram desproteinizadas com ácido perclórico 10%, de acordo com Pilz et al. (2000). Os dienos, produtos finais de peroxidação lipídica, incluindo malondialdeído (MDA), foram determinados usando a reação com o ácido tiobarbitúrico (TBA) (KOHN; LIVERSEDGE, 1944). Os níveis de TBARS foram medidos espectrofotometricamente a 535 nm (fígado e rim) ou fluorimetricamente (plasma) nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 510 nm e 553 nm, respectivamente. Foi realizada uma curva analítica e o 1,1’3,3’- tetrametoxipropano foi utilizado como padrão. Os resultados foram expressos em μmol/L (plasma) e em nmol /g de tecido (fígado e rim). 4.4.7 Quantificação de grupos carbonilas de proteínas Os níveis PCO no plasma, fígado e rim foram determinados de acordo com o método descrito por Levine et al. (1994). As amostras de fígado e rim (0,2 g) foram homogeneizadas em 1 mL de tampão fosfato 50 mM, pH 6,7. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 g por 10 min a 4º e os sobrenadantes utilizados para as análises. Os grupos carbonilas presentes nas proteínas reagem com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) formando 2,4- dinitrofenilhidrazona, que absorve luz em 370 nm. A concentração de PCO foi obtida utilizando o coeficiente de extinção molar da hidrazona (22.000 M-1cm-1) e expressa em nmol de PCO/mg de proteína. 43 4.4.8 Atividade de paraoxonase 1 A atividade de PON 1 foi determinada no plasma via hidrólise de paraoxon e liberação de p-nitrofenol, de acordo com Costa et al. (1990) e modificações segundo Assis et al. (2017). O ensaio consiste de plasma em tampão Tris-HCl (15 mM), pH 8,5, contendo 0,15 mM de CaCl2, 0,3 M de NaCl e 1,2 mM de paraoxon. O ensaio foi realizado a 37°C e iniciado pela adição de paraoxon. A atividade foi monitorada medindo-se a absorbância a 405 nm por 5 min. Os resultados foram calculados assumindo o coeficiente de extinção molar de p- nitrofenol (18.000 M-1.cm-1) (RICHTER et al, 2008). A atividade da PON 1 foi expressa em unidades/litro (unidade = μmoL paraoxon hidrolisado/min). 4.4.9 Determinação da concentração de grupos tióis não proteicos As concentrações de grupos tióis não proteicos são uma medida indireta dos níveis de GSH, e foram determinados de acordo com Sedlak e Lindsay (1968), em função da redução do ácido 5,5-ditio-2-nitrobenzoico (DTNB), medido espectrofotometricamente em 412 nm. Os resultados foram expressos em mmol de grupos tióis não proteicos/mg de tecido (fígado e rim). 4.4.10 Atividades de enzimas antioxidantes em fígado e rim 4.4.10.1 Preparo das amostras Amostras de fígado e rim (0,1 g) foram homogeneizadas em 1 mL de tampão fosfato de sódio (10 mmol /L; pH 7,4). Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 g por 10 min a 4º e os sobrenadantes utilizados para as análises descritas a seguir. 4.4.10.2 Atividade da enzima superóxido dismutase A atividade de SOD foi determinada de acordo com Beauchamp e Fridovich (1971), onde a oxidação da xantina gera o O2 •− pela ação catalítica da xantina oxidase, o qual reduz o nitroblue tetrazolium (NBT) a uma formazana. Na presença de SOD ocorre inibição da 44 redução do NBT, monitorada em 550 nm. Os resultados foram expressos como U/mg de proteína. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para inibir a redução do NBT em 50 %. 4.4.10.3 Atividade da enzima catalase A atividade de CAT foi monitorada pelo consumo do H2O2 monitorado em 230 nm (BEERS; SIZER, 1952). Os resultados foram expressos como mmol de H2O2 consumido/min/mg de proteína. 4.4.10.4 Atividade da enzima glutationa peroxidase Determinou-se a atividade da GSH-Px de acordo com o método descrito por Rush e Scandiford (2003). A GSH-Px catalisa a oxidação de GSH na presença de H2O2. Na presença de glutationa redutase (GSH-Rd), a glutationa oxidada (GSSG) é reduzida à GSH com oxidação concomitante do NADPH à NADP+. A oxidação do NADPH é monitorada pela diminuição da absorbância em 340 nm. Os resultados foram expressos em mmol de NADPH consumido/min/mg de proteína. 4.4.10.5 Atividade da enzima glutationa redutase A atividade da GSH-Rd foi avaliada de acordo com Carlberg e Mannervik (1985) via mensuração da velocidade de oxidação do NADPH com a concomitante redução da glutationa oxidada (GSSG) a 25°C acompanhada por 3 minutos espectrofotometricamente a 340 nm. Os resultados foram expressos em mmol de NADPH consumido/min/mg de proteína. 4.4.11 Estimativa dos produtos finais de glicação avançada Os AGEs totais foram estimados por fluorometria tal como descrito por Zilin et al. (2001) e Pokupec et al. (2003), com modificações. Os homogenatos de fígado e rim foram preparados conforme item 4.4.10.1. No plasma e nos sobrenadantes dos homogenatos de 45 fígado foram adicionados 1,21 M (plasma) e 2,42 M (fígado) de clorofórmio, 0,12 M de ácido tricloracético e 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH); os tubos foram homogeneizados em vórtex e mantidos a 8-10ºC durante 30 minutos e posteriormente centrifugados à 10.000 g durante 10 minutos a 10ºC. Nos sobrenadantes dos homogenatos de rim foi adicionado 0,1 M de NaOH; os tubos foram homogeneizados em vórtex e centrifugados à 10.000 g durante 10 minutos a 10ºC. Em seguida as amostras foram lidas em espectrofluorímetro (comprimentos de onda de excitação 370 nm e de emissão 440 nm). Os resultados foram expressos em Unidades Arbitrárias de fluorescência/mg de proteína (UA/mg proteína). 4.4.12 Dosagem de proteínas totais As proteínas foram quantificadas no plasma e nos sobrenadantes dos homogenatos dos tecidos (fígado e rim) de acordo com o método de Lowry et al. (1951). 4.4.13 Análise dos resultados Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Os dados foram analisados via avaliação da variância One way (ANOVA) seguida da análise de diferença pelo teste Student-Newman-Keuls, para comparações intergrupos. O teste t- Student’s foi utilizado para comparações intragrupo nos parâmetros relativos ao dia 0. Foram consideradas diferenças significativas quando p<0,05. As análises supracitadas, foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 6.0. 46 5. RESULTADOS 5.1 Parâmetros fisiológicos e bioquímicos de animais diabéticos não tratados e tratados com 4U/animal de insulina, 250 mg/kg de metformina e/ou 45 mg/kg de licopeno em iogurte Animais do grupo DIOG apresentaram menor ganho de peso corporal quando comparado ao grupo NIOG, a partir do 15º dia de experimento. Também é possível observar que animais do grupo DINS apresentaram maior ganho de peso corporal em relação aos demais animais diabéticos (DIOG, DMET, DLIC e DLICMET) a partir do 15º dia de experimento, alcançando valores de peso corporal semelhantes aos animais normais (NIOG). Não foram observadas diferenças significativas no ganho de peso corporal de animais dos grupos DMET, DLIC e DLICMET, em relação aos animais DIOG, durante todo o período experimental, sugerindo que os tratamentos com metformina ou licopeno, isolados ou combinados, não influenciaram no ganho de peso corporal em animais diabéticos (Tabela 1). Na Tabela 1, além dos valores de peso corporal, também estão apresentados os resultados referentes à ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário de ratos normais e diabéticos, tratados com iogurte ou tratados com insulina, metformina, licopeno ou metformina + licopeno em iogurte, após 0, 15 e 30 dias. Animais DIOG apresentaram um aumento significativo na ingestão alimentar, quando comparados aos animais NIOG, desde o início do experimento (dia 0). Vale destacar que houve um aumento da ingestão alimentar nos animais pertencentes ao grupo diabético DIOG após 30 dias, quando em comparação com o início (dia 0) e meio (dia 15) do experimento. Os tratamentos dos ratos diabéticos com insulina, metformina ou licopeno foram capazes de promover redução na ingestão alimentar, quando comparados aos animais DIOG, a partir do 15º dia de tratamento (Tabela 1). Todos os animais diabéticos apresentaram um aumento na ingestão hídrica no dia 0, isto é, antes dos inícios dos tratamentos, quando comparados aos animais NIOG. Os ratos diabéticos que receberam insulina (DINS), a partir do 15º dia de tratamento, apresentaram uma diminuição significativa de valores relacionados à ingestão hídrica quando comparados aos animais tratados somente com iogurte (DIOG). Animais tratados com metformina ou licopeno apresentaram um aumento na ingestão hídrica a partir do dia 0, quando comparados aos animais NIOG. No entanto, os animais diabéticos tratados com licopeno apresentaram 47 uma redução significativa da ingestão hídrica, após 30 dias de tratamento, quando comparados aos animais DIOG. Interessantemente, animais tratados com a associação metformina + licopeno apresentaram uma diminuição na ingestão hídrica a partir do 15º dia de tratamento, quando comparados aos animais DIOG (Tabela 1). Todos os animais diabéticos também apresentaram um aumento significativo no volume urinário em relação aos animais NIOG, no dia 0 (antes do início dos tratamentos). Os ratos diabéticos que receberam insulina (DINS), a partir do 15º dia de tratamento, apresentaram menores valores de volume urinário em relação aos ratos diabéticos DIOG. Os animais tratados com metformina apresentaram um aumento do volume urinário quando comparado aos animais normais a partir do início do experimento (dia 0) e, ao longo do período experimental, não foram observadas diferenças estatísticas quando comparado aos animais diabéticos DIOG. Já animais tratados com licopeno, após 30 dias, apresentaram uma diminuição do volume urinário quando comparado aos animais DIOG. Animais diabéticos tratados com metformina + licopeno apresentaram redução significativa do volume urinário, quando comparados aos animais diabéticos DIOG, a partir do 15º dia de tratamento (Tabela 1). 48 Tabela 1: Parâmetros fisiológicos (peso corporal, ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário) de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, no início (dia 0), meio (dia 15) e final (dia 30) do experimento. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As diferenças entre os grupos foram consideradas com p<0,05. a, diferenças com NIOG; b, diferenças com DIOG; c, diferenças com DINS; d, diferenças com DMET; e, diferenças com DLIC; #, diferença com o dia 0. 49 Ratos diabéticos DIOG apresentaram uma redução significativa nas massas dos músculos esqueléticos, em relação às massas encontradas em músculos de animais NIOG (Figura 6A e 6B). Os tratamentos de animais diabéticos com metformina ou licopeno em iogurte não foram eficazes na promoção de ganho de massa muscular (ou prevenção de perda de massa muscular), quando comparados aos animais DIOG (Figura 6A). Em relação ao tratamento de animais diabéticos com metformina + licopeno em iogurte, pode-se notar que este foi eficaz na prevenção da perda de massa de músculos EDL, enquanto que em músculos soleus não foram observadas diferenças nas massas, quando comparados os animais DLICMET versus DIOG (Figura 6A e 6B). Figura 6: Massas dos músculos esqueléticos de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias. (A) Músculos soleus (g) e (B) Músculos EDL (g). Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As diferenças entre os grupos foram consideradas com p<0,05. A, diferenças com NIOG; b, diferenças com DIOG; c, diferenças com DINS; d, diferenças com DMET; e, diferenças com DLIC. Em todos os grupos de animais diabéticos, exceto aqueles tratados com insulina (DINS), houve uma redução nas massas de tecidos adiposos. Animais diabéticos tratados com insulina (DINS) apresentaram valores de massas de tecidos adiposos próximos aos valores observados em animais do grupo normal (NIOG) (Figura 7A e 7B). Os animais diabéticos tratados com metformina ou licopeno em iogurte não apresentaram diferenças nas massas de tecidos adiposos quando comparados aos animais DIOG. Surpreendentemente, os animais diabéticos tratados com metformina + licopeno em iogurte apresentaram maiores massas de tecidos adiposos brancos, quando comparados com os animais diabéticos tratados com iogurte (DIOG) ou tratados com metformina ou licopeno isoladamente (DMET e DLIC) (Figura 7A e 7B). 50 Figura 7: Massas dos tecidos adiposos brancos, epididimal e retroperitoneal de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias. (A) Tecido adiposo branco epididimal (g) e (B) Tecido adiposo branco retroperitoneal (g). Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As diferenças entre os grupos foram consideradas com p<0,05. a, diferenças com NIOG; b, diferenças com DIOG; c, diferenças com DINS; d, diferenças com DMET; e, diferenças com DLIC. Animais diabéticos apresentaram valores de glicemia de aproximadamente 400 mg/dL no pareamento (tempo 0, antes do início dos tratamentos), o que nos permite confirmar a instalação do DM experimental (Figura 8A). No decorrer do período experimental, animais DIOG apresentaram níveis glicêmicos progressivamente maiores, alcançando valores médios de 550 mg/dL ao final dos 30 dias de experimento, culminando assim em um maior valor de AUC da glicemia, o que sugere a maior vulnerabilidade destes animais às complicações do DM relacionadas ao estresse glico-oxidativo (Figura 8B). Pode ser observado na figura 8A e 8B que a glicemia dos animais do grupo NIOG manteve-se constante e em valores dentro da normalidade, desde o pareamento até o final do período experimental. Os ratos diabéticos que receberam insulina (DINS) apresentaram uma redução significativa da glicemia, bem como menor AUC da glicemia, apresentando valores médios de glicemia e de AUC da glicemia semelhantes aos encontrados em animais não diabéticos (NIOG). Os animais diabéticos tratados com metformina em iogurte apresentaram uma melhora nos níveis glicêmicos quando comparados aos valores encontrados em animais DIOG, a partir do 10º dia de tratamento (Figura 8A). Também foi possível observar valores maiores da AUC da glicemia de animais DMET, quando comparados aos grupos NIOG e DINS, porém menores em relação aos valores do grupo DIOG (Figura 8B). O tratamento com licopeno em iogurte também foi capaz de melhorar os níveis glicêmicos de animais diabéticos, quando 51 comparados aos animais DIOG (Figura 8A). Analisando a AUC da glicemia do grupo DLIC, assim como a AUC do grupo DMET, é possível observar valores maiores quando comparados aos grupos NIOG e DINS, porém a AUC da glicemia do grupo DLIC também foi menor que aquela observada no grupo DIOG (Figura 8B). Animais DLICMET apresentaram uma redução significativa na glicemia, em comparação tanto aos animais DIOG quanto aos animais tratados com metformina ou licopeno isoladamente, demonstrando um efeito combinado/aditivo desta terapia combinada no controle glicêmico (Figura 8A). Em relação a AUC da glicemia, o grupo DLICMET apresentou valores menores quando comparados aos grupos DIOG, DMET e DLIC (Figura 8B). Figura 8: Níveis plasmáticos de glicose e área sob a curva (AUC) da glicemia de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 30 dias. (A) Niveis plasmáticos de glicose (mg/dL); (B) AUC da glicemia (mg/dL). Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM), n = 10. As diferenças entre os grupos foram consideradas com p<0,05. #, diferenças com o dia 0. a, diferenças com NIOG; b, diferenças com DIOG; c, diferenças com DINS; d, diferenças com DMET; e, diferenças com DLIC. 52 Figura 9: Teste de tolerância oral à glicose, área sob a curva (AUC) da glicemia no TTGO e glicemia após 12 horas de jejum de animais normais, diabéticos não tratados e tratados com insulina, metformina e/ou licopeno incorporados em iogurte, após 28 dias. (A) Teste de tolerância à glicose oral (mg/dL); (B) AUC da glicemia no TTGO (mg/dL); (C) Glicemia de jejum 12 horas (mg/dL). Os valores estão expressos