UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Desenvolvimento de híbridos PMMA-(TiO2, ZrO2 e CeO2) multifuncionais SAMARAH VARGAS HARB Tese de Doutorado 2019 SAMARAH VARGAS HARB Desenvolvimento de híbridos PMMA-(TiO2, ZrO2 e CeO2) multifuncionais Tese apresentada ao Instituto de Química Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química Orientador: Prof. Dr. Peter Hammer Araraquara 2019 Elaboração: FICHA CATALOGRÁFICA Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Biblioteca do Instituto de Química, Unesp, câmpus de Araraquara H255d Harb, Samarah Vargas Desenvolvimento de híbridos PMMA-(TiO2, ZrO2 e CeO2) multifuncionais / Samarah Vargas Harb. – Araraquara : [s.n.], 2019 100 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Peter Hammer 1. Nanocompósitos (Materiais). 2. Revestimentos protetores. 3. Processo sol-gel. 4. Compostos bioativos. 5. Biocompatibilidade. I. Título. DADOS CURRICULARES 1. IDENTIFICAÇÃO Nome: Samarah Vargas Harb Nome em citações bibliográficas: Harb, S. V. Data de Nascimento: 20 de Dezembro de 1990 Nacionalidade: Brasileiro Naturalidade: Araraquara – SP Estado Civil: Solteiro Filiação: Saba José Harb e Maria Helena Vargas Harb Endereço: Avenida Duque de Caxias, 640, Araraquara – SP E-mail: samarah.v.h@hotmail.com 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2.1 Ensino Fundamental e Médio Colégio Objetivo, Araraquara – SP. Concluído em 2008. 2.2 Ensino Superior Bacharelado em Química, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Química, Araraquara - SP. Concluído em 2012. 2.3 Mestrado em Química Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Química, Araraquara - SP. Concluído em 2015. 3. ESTÁGIO NO EXTERIOR 08/2014-11/2014 – Mestranda visitante na University of Cambridge, Cambridge, Inglaterra, sob supervisão do professor Kevin Knowles 08/2017-09/2017 – Doutoranda visitante no Biomaterials Innovation Center da Harvard Medical School, Cambridge, Estados Unidos, sob supervisão do professor Ali Khademhosseini 10/2017-07/2018 – Doutoranda visitante no Webster Nanomedicine Laboratory, Northeastern University, Boston, Estados Unidos, sob supervisão do professor Thomas Jay Webster e Anderson de Oliveira Lobo 4. SUPERVISÃO CIENTÍFICA 02/2015-07/2015 – Aluna de iniciação científica: Elen Maria Feliciano 10/2015-07/2016 – Aluna de iniciação científica: Bruna Larissa Gama Cavalcante 02/2017-07/2018 – Aluno de iniciação científica: Thiago Augusto Carneiro de Souza 08/2018-04/2019 – Aluna de iniciação científica: Mariana Selvaggio 5. ESTÁGIO DOCÊNCIA 03/2015-07/2015 – Estágio docência na disciplina “Introdução a Química Quântica”. Oferecida pelo IQ/UNESP com supervisão da Prof. Sandra Helena Pulcinelli 6. PRODUÇÃO CIENTÍFICA 6.1 Artigos publicados em periódicos HARB, S. V.; CERRUTI, B. M.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER, P. Siloxane-PMMA hybrid anti-corrosion coatings reinforced by lignin. Surface & Coatings Technology, v. 275, p. 9-16, 2015. SANTOS, F. C. DOS; HARB, S. V.; MENU, M-J.; TURQ, V.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER, P. On the structure of high performance anticorrosive PMMA–siloxane–silica hybrid coatings, RSC Advances, v. 5, p. 106754–106763, 2015. HARB, S. V.; SANTOS, F. C. dos; CAETANO, B. L.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER, P. Structural properties of cerium doped siloxane-PMMA hybrid coatings with high anticorrosive performance. RSC Advances, v. 5, p. 15414-15424, 2015. HARB, S. V.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; KNOWLES, K.; HAMMER, P. A Comparative study on graphene oxide and carbon nanotube reinforcement of PMMA- siloxane-silica anticorrosive coatings. ACS Applied Materials & Interfaces, v. 8, p. 16339−16350, 2016. TORRICO, R. F. A. O.; HARB, S. V.; TRENTIN, A.; UVIDA, M. C.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER, P. Structure and properties of epoxy-siloxane-silica nanocomposite coatings for corrosion protection. Journal of Colloid and Interface Science, v. 513, p. 617–628, 2018. DE-PAULA, M. M. M.; BASSOUS, N. J.; AFEWERKI, S.; HARB, S. V; GHANNADIAN, P.; MARCIANO, F. R.; VIANA, B. C.; WEBSTER, T. J.; LOBO, A. O. Understanding the impact of crosslinked PCL/PEG/GelMA electrospun nanofibers on bactericidal activity. PLoS ONE 13(12): e0209386. 6.2 Artigos submetidos em periódicos TRENTIN, A.; GASPARINI, A. de L.; FARIA, F. A.; HARB, S. V.; dos SANTOS, F. C.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER P. Barrier properties of high performance PMMA-silica anticorrosive coatings. Submetido para Progress in Organic Coatings. HARB, S. V.; TRENTIN, A.; DE SOUZA, T. A. C.; MAGNANI, M.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER P. Efficient corrosion protection by eco-friendly self- healing PMMA-CeO2 coatings. Submetido para Chemical Engineering Journal. HARB, S. V.; TRENTIN, A.; UVIDA, M. C.; MAGNANI, M.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER P. A comparative study on PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 protective coatings. Submetido para Progress in Organic Coatings. HARB, S. V.; UVIDA, M. C.; TRENTIN, A.; LOBO, A. O.; WEBSTER, T. J.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER P. PMMA-SiO2 organic-inorganic hybrid coating for Ti6Al4V metallic alloy. Submetido para Journal of Materials Chemistry B. 6.3 Capítulos de livro HARB, S. V.; SANTOS, F. C. dos; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; KNOWLES, K.; HAMMER, P. Protective coatings based on PMMA-silica nanocomposites reinforced with carbon nanotubes. Carbon Nanotubes - Current Progress of their Polymer Composites. 1ed.: InTech, 2016, p. 195-225. HARB, S. V.; TRENTIN, A.; PULCINELLI, S. H.; SANTILLI, C. V.; HAMMER, P. Organic-inorganic hybrid coatings for corrosion protection of metallic surfaces. New Technologies in Protective Coatings. 1ed.: InTech, 2017, p. 19-51. AFEWERKI, S.; BASSOUS, N.; HARB, S. V.; PALO-NIETO, C.; MARCIANO, F. R.; WEBSTER, T. J.; LOBO, A. O. Advances in antimicrobial and osteoinductive biomaterials. Racing for the Surface: Advances in Antimicrobial and Osteoinductive Studies. 1ed.: Springer, 2019. SILVA, A. D. R.; STOCCO, T. D.; GRANATO, A. E. C.; HARB, S. V.; AFEWERKI, S.; BASSOUS, N. J.; HAMMER, P.; WEBSTER, T. J.; MARCIANO, F. R.; LOBO, A. O. Recent advances in nanostructured polymer composites for biomedical application. Nanostructured Polymer Composites for Biomedical Applications. 1ed.: Elsevier, 2019. 7. PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS 2015 - 4th International Conference on Multifunctional, Hybrid & Nanomaterials. Organic- inorganic hybrids coatings reinforced by addition of carbon nanotubes, reduced graphene oxide and lignin. 2015 - II Workshop: Ano Internacional da Luz. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP. 2016 - 1º Workshop de Inovação e Empreendedorismo do Instituto de Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP. 2016 - 3rd Brazilian Conference on Composite Materials (BCCM3). PMMA-(TiO2, ZrO2 and CeO2) hybrid coatings for corrosion protection. 2016. 2016 - Symposium on Advanced Materials and Surface Science. 2016 - XVEncontro da SBPMat. PMMA-TiO2 hybrid coatings for corrosion protection of carbon steel. 2017 - 5th International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomamaterials. PMMA-CeO2 hybrid coatings for corrosion protection. 2017 - 5th International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomamaterials. Structural properties of high performance anticorrosive silica-epoxy hybrid coatings. 2017 - Curso: Materiais biocompatíveis: preparação e aplicações. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR. 2017 - Curso: Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS). Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP. 2017 – 5th Nanotoday Conference. PMMA-TiO2 nanocomposite coatings for Ti6Al4V metallic implants. 2018 - International Conference on Biomaterials and Chemical Biology. PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 organic-inorganic hybrid nano-coatings for Ti6Al4V metallic implants. 2018 - XVIIEncontro da SBPMat. PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 coatings modified with hydroxyapatite and β-TCP for Ti6Al4V metallic implants. 2018 - XVIIEncontro da SBPMat. Self-healing PMMA-CeO2 coatings for anticorrosive protection of carbon steel. 2018 – The Longwood Seminars, Mini-med school program for a lay audience, Harvard Medical School. 2019 - Curso: Biomateriais poliméricos e medicina regenerativa. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR. AGRADECIMENTOS A minha família e amigos; A todos os membros do Grupo de Físico-Química de Materiais, especialmente para Marina Magnani pelo auxílio com o equipamento de microscopia de força atômica, Danubia Gava pelo auxílio com o equipamento de termogravimetria, e os alunos Andressa Trentin, Mayara Uvida, Mariana Selvaggio e Thiago Carneiro pela ajuda com os experimentos e discussões sobre o trabalho desenvolvido. Aos professores Celso Valentim Santilli e Sandra Helena Pulcinelli pela colaboração científica. Ao meu orientador Peter Hammer pelos ensinamentos, dedicação e orientação; Ao LMA-IQ pela disponibilidade de utilização do microscópio eletrônico de varredura; Ao Prof. Dr. Rodrigo Fernando Costa Marques pelo fornecimento do reagente βTCP; A toda comunidade do Instituto de Química da UNESP Araraquara pela assistência; Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pela utilização do equipamento de SAXS; Ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluídos Complexos (INCT-Fcx), Instituto de Física da Universidade de São Paulo, pela realização de medidas de SAXS; Ao Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Biomaterials Innovation Center, Department of Medicine, Brigham Women Hospital, Harvard Medical School, Cambridge, Estados Unidos, pelo estágio de pesquisa de 2 meses; Ao professor Ali Khademhosseini pela orientação durante o estágio de pesquisa no exterior; Ao Nanomedicine Laboratory, Department of Chemical Engineering, Northeastern University, Boston, Estados Unidos, pelo estágio de pesquisa de 10 meses; Ao professor Thomas Jay Webster e Anderson de Oliveira Lobo pela orientação durante o estágio de pesquisa no exterior; À agência de fomento no início do doutorado, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código de Financiamento 001, pelo período de 01/03/2015 a 30/11/2015. À agência de fomento na sequência do doutorado, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), período de 01/12/2015 a 30/04/2019, nos processos n° 2015/09342-7 e n° 2017/02899-1, pelo financiamento no país e no exterior. RESUMO Híbridos orgânico-inorgânicos constituídos de poli(metacrilato de metila) (PMMA) covalentemente ligado a diferentes fases inorgânicas (TiO2, ZrO2 e CeO2) foram sintetizados pelo processo sol-gel com objetivo de obter revestimentos multifuncionais que forneçam resistência contra corrosão para substratos metálicos, além de apresentar propriedades como estabilidade térmica, biocompatibilidade e self-healing (auto-cura). Para o desenvolvimento dos três híbridos estudados foram variados diversos parâmetros, como temperatura e tempo de síntese, parâmetros de deposição, tratamento térmico, quantidade do iniciador térmico peróxido de benzoíla (BPO), e proporção entre os precurssores (metacrilato de metila (MMA), isopropóxido de titânio, propóxido de zircônio, óxido de cério e 2-hidroxietil metacrilato (HEMA)). Híbridos PMMA-CeO2 depositados em aço carbono por dip-coating apresentaram forte adesão ao substrato, estabilidade térmica próxima a 220 ºC, superfície homogênea e lisa, ausência de rachaduras ou porosidade, excelentes resultados de resistência à corrosão, com módulo de impedância de até 290 GΩcm2 praticamente inalterado por aproximadamente 6 meses, e ainda exibiu propriedade de self-healing, evidenciada por espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS). Híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 depositados por dip- coating em substrato de aço carbono também apresentaram baixa rugosidade, forte adesão ao substrato, estabilidade térmica próxima a 220 ºC, e excelente proteção anticorrosiva. Os revestimentos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 com melhores desempenhoss anticorrosivos apresentaram módulo de impedância igual a 50 GΩcm2 e 10 GΩcm2, respectivamente, 7 ordens de gradeza maior que o aço carbono não revestido. Os híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 com condições de síntese otimizadas foram modificados com beta fosfato tricálcico (β-TCP) e hidroxiapatita (HA) e depositados sobre liga de titânio Ti6Al4V. Estes revestimentos apresentaram elevada resistência à corrosão, com módulo de impedância de até 500 GΩcm2, e excelente biocompatibilidade, explicado pelo aumento da rugosidade em nanoescala e pela maior energia livre da superfície, que levam a uma maior adsorção de proteínas, e consequentemente proliferação de osteoblastos na superfície dos revestimentos. ABSTRACT Organic-inorganic hybrids consisting of poly(methyl methacrylate) (PMMA) covalently bonded to different inorganic phases (TiO2, ZrO2 and CeO2) were synthesized by the sol-gel process in order to obtain multifunctional coatings that provide corrosion resistance to metallic substrates, besides presenting properties as thermal stability, biocompatibility and self-healing. For the development of the three studied hybrids several parameters have been varied, such as temperature and time of synthesis, deposition parameters, thermal treatment, amount of the thermal initiator benzoyl peroxide (BPO), and the proportion of precursors (methyl methacrylate (MMA) titanium isopropoxide, zirconium propoxide, cerium oxide and 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA)). PMMA-CeO2 hybrids deposited on carbon steel by dip-coating have showed strong adhesion to the substrate, thermal stability close to 220 ºC, homogeneous and smooth surface, absence of cracks or porosity, excellent corrosion resistance, with impedance modulus up to 290 GΩ cm2 practically unchanged by approximately 6 months, and self-healing property as evidenced by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 hybrids deposited by dip-coating on carbon steel substrate have also showed low roughness, strong adhesion to the substrate, thermal stability close to 220 °C, and excellent anticorrosive protection. The PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 coatings with the best anticorrosive performance showed impedance modulus of 50 GΩcm2 and 10 GΩcm2, respectively, 7 orders of magnitude higher than uncoated carbon steel. PMMA-TiO2 and PMMA-ZrO2 hybrids with optimized synthesis conditions were modified with beta- tricalcium phosphate (β-TCP) and hydroxyapatite (HA) and deposited on Ti6Al4V titanium alloy. These coatings have presented elevated corrosion resistance, with impedance modulus up to 500 GΩcm2, and excellent biocompatibility, explained by the increase of the nanoscale roughness and by the higher surface free energy, which lead to a higher adsorption of proteins, and consequently proliferation of osteoblasts on the coatings surfaces. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estruturas representativas de híbridos orgânico-inorgânicos de classe I e II, e exemplos de moléculas acopladoras utilizadas para ligação covalente entre fases orgânicas e inorgânicas. ....................................................................................................................... 20 Figura 2. Reações de hidrólise e condensação do processo sol-gel, adaptado de [8]. ........ 21 Figura 3. Reação de polimerização radicalar para formação do PMMA, a partir de peróxido de benzoíla (BPO) e metacrilado de metila (MMA). .......................................................... 22 Figura 4. Reação entre a molécula de HEMA e o alcóxido metálico hidrolisado, liberando água e produzindo ligação covalente entre o metal (M) e a parte orgânica. Adaptado de [26]. ............................................................................................................................................. 23 Figura 5. Regeneração intrínseca e extrínseca de revestimentos anticorrosivos. ............... 27 Figura 6. Exemplos de implantes metálicos utilizados no corpo humano. Adaptado de [56]. ............................................................................................................................................. 28 Figura 7. Procedimento de síntese dos revestimentos híbridos e estruturas moleculares dos reagentes utilizados na síntese. ............................................................................................ 32 Figura 8. Síntese de nanopartículas de óxido de cério. ...................................................... 33 Figura 9. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-CeO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes...................................................................................................... 34 Figura 10. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-TiO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes...................................................................................................... 35 Figura 11. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-ZrO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes...................................................................................................... 36 Figura 12. Fotos dos substratos metálicos revestidos com os híbridos estudados. ............ 37 Figura 13. Célula eletroquímica utilizada para as medidas de EIS. ................................... 42 Figura 14. Representação esquemática das placas de 48 poços para cultura de células contendo as amostras: PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 depositados sobre liga Ti6Al4V, e substrato não revestido. ....................................................................................................... 45 Figura 15. Estrutura molecular dos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2. ............................................................................................................................................. 49 Figura 16. Gráficos de EIS (a) do aço carbono não revestido, PMMA e 1Ce2HEMA20MMA, (b) 1Ce2HEMA25MMA e (c) 1Ce2HEMA30MMA, imerso em solução 3,5% NaCl. O circuito elétrico equivalente usado para ajustar os dados de EIS e os parâmetros extraídos do ajuste estão apresentados na Figura 17. ....................................... 51 Figura 17. (a) Circuito elétrico equivalente usado para ajustar os dados de EIS. Dependência da (b) resistência e (c) capacitância em função do tempo de imersão para as amostras 1Ce2HEMA25MMA e 1Ce2HEMA30MMA. .................................................................... 53 Figura 18. (a) MEV e (b) imagens de AFM dos revestimentos híbridos de PMMA-CeO2 depositados em aço carbono. (c) MEV-EDS da seção transversal dos revestimentos 1Ce2HEMA25MMA (lado esquerdo) e 1Ce2HEMA30MMA (lado direito). .................... 56 Figura 19. Espectros XPS do carbono C1s, oxigênio O1s e Ce 3d dos híbridos (a) 1Ce2HEMA20MMA, (b) 1Ce2HEMA25MMA e (c) 1Ce2HEMA30MMA. ..................... 58 Figura 20. Relação entre coeficientes de Porod e geometria. Adaptado de [77]. ............... 59 Figura 21. SAXS das amostras de PMMA-CeO2. .............................................................. 60 Figura 22. (a) STEM, (b) histograma e (c) EDS do híbrido 1Ce2HEMA25MMA............ 60 Figura 23. TGA dos híbridos de PMMA-CeO2 obtidos em atmosfera de nitrogênio. ....... 61 Figura 24. Análise da propriedade de self-healing da amostra 1Ce2HEMA25MMA, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). ................................................................................................................................... 62 Figura 25. Análise da propriedade de self-healing da amostra 1Ce2HEMA30MMA, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). ................................................................................................................................... 63 Figura 26. Espectros deconvoluídos de XPS O 1s dos revestimentos (a) 1Ce2HEMA25MMA e (b) 1Ce2HEMA30MMA intactos, após risco e após risco e EIS. file:///C:/Users/samar/Desktop/Peter%20-%20novos/Tese%20Doutorado/Versão%20final/TeseDoutoradoSamarah.docx%23_Toc7365190 Desvio padrão residual menor que 1,1; largura a meia altura (FWHM - full width at half maximum) entre 1 e 2; linha base tipo Shirley. ................................................................... 63 Figura 27. Reações da corrosão e da formação de óxido e hidróxido de Ce. ..................... 64 Figura 28. Gráficos EIS dos revestimentos híbridos PMMA-TiO2 depositados em aço carbono e medidos após 1 h imersos em solução de NaCl 3,5%. ....................................... 67 Figura 29. (a) Micrografias ópticas e (b) imagens de AFM dos revestimentos PMMA-TiO2 depositados em aço carbono. ............................................................................................... 68 Figura 30. Gráficos EIS em função do tempo de imersão em solução de NaCl 3,5% do revestimento híbrido 2Ti_12MMA (BPO0.1) depositado em aço carbono. ....................... 68 Figura 31. Espectros XPS do carbono C1s, oxigênio O1s e titânio Ti 2p do híbrido 2Ti_12MMA(BPO0.1). ....................................................................................................... 70 Figura 32. Espectros de FTIR do HEMA, MMA e PMMA-TiO2 (2Ti_12MMA (BPO0.1)) na faixa de (a) 4000-2400 cm-1 e (b) 2000-400 cm-1. .......................................................... 71 Figura 33. Curvas TG dos híbridos PMMA-TiO2, sob atmosfera de nitrogênio. .............. 71 Figura 34. (a) Curvas de SAXS dos híbridos PMMA-TiO2. (b) Micrografias TEM e (c) micrografia e correspondentes mapas STEM-EDS do híbrido 2Ti_12MMA(BPO0.1). As linhas contínuas nas curvas de SAXS são ajustes obtidos pelo modelo de Guinier-Porod [90]. ............................................................................................................................................. 72 Figura 35. Gráficos EIS dos revestimentos híbridos PMMA-ZrO2 depositados em aço carbono e medidos após 1 h imersos em solução de NaCl 3,5%. ....................................... 76 Figura 36. (a) Micrografias ópticas e (b) imagens de AFM dos revestimentos PMMA-ZrO2 depositados em aço carbono. ............................................................................................... 76 Figura 37. Gráficos EIS em função do tempo de imersão em solução de NaCl 3,5% do revestimento híbrido 2Zr_16MMA (BPO0.1) depositado em aço carbono. ....................... 77 Figura 38. Espectros XPS do carbono C1s, oxigênio O1s e zircônio Zr 3d do híbrido 2Zr_16MMA (BPO0.1). ...................................................................................................... 78 Figura 39. Espectros de FTIR do HEMA, MMA e PMMA-ZrO2 na faixa de (a) 4000-2400 cm-1 e (b) 2000-400 cm-1. .................................................................................................... 79 Figura 40. Curvas TG dos híbridos PMMA-ZrO2, sob atmosfera de nitrogênio. .............. 79 Figura 41. (a) Curvas de SAXS dos híbridos PMMA-ZrO2 e (b) micrografias TEM da amostra 2Zr_16MMA(BPO0.1). As linhas contínuas nas curvas de SAXS são ajustes obtidos pelo modelo de Guinier-Porod [90]. .................................................................................... 80 Figura 42. Viabilidade celular (ensaio MTS) após (a) 1 dia e (b) 7 dias de cultura de osteoblastos sobre os híbridos PMMA-TiO2 e PMM-ZrO2 depositados em liga Ti6Al4V. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A análise estatística foi expressa em comparação com a liga Ti6Al4V não revestida no mesmo período (N = 5; *: p <0,05; **: p <0,01; ***: p <0,005). ......................................................................................................... 82 Figura 43. Micrografias de fluorescência após 1 dia de cultura de osteoblastos. Alexa FluorTM 488 Phalloidim foi utilizado para marcar o citoesqueleto de actina (verde) e o reagente Hoechst 33258 para marcar o núcleo das células (azul). ...................................... 82 Figura 44. (a) Ensaio de ALP e (b) ensaio de deposição de Ca2+ após 7, 14 e 21 dias de cultura de osteoblastos. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A análise estatística foi expressa em comparação com a liga Ti6Al4V não revestida no mesmo período (N = 5; *: p <0,05; **: p <0,01; ***: p <0,005). ................................................................. 83 Figura 45. (a) Imagens AFM, (b) rugosidade RMS e (c) rugosidade Ra, obtida por medidas de AFM dos revestimentos PMMA-TiO2 e PMM-ZrO2 depositados em liga Ti6Al4V. .... 84 Figura 46. Revestimentos híbridos PMMA-TiO2 e PMM-ZrO2 depositados em liga Ti6Al4V: (a) ângulo de contato entre as amostras e os líquidos (água e diiodometano), e (b) energia livre de superfície calculada a partir dos valores de ângulo de contato. ................. 85 Figura 47. Adsorção de (a) vitronectina e (b) albumina do soro bovino (BSA) após 24 h em contato com as amostras. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. A análise estatística foi expressa em comparação com a liga Ti6Al4V não revestida (N = 3; *: p <0,05; **: p <0,01; ***: p <0,005). ................................................................................................ 86 Figura 48. Gráficos EIS dos híbridos PMMA-TiO2 e PMM-ZrO2 depositados em Ti6Al4V e imersos em solução SBF a 37 ºC. ..................................................................................... 87 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Condições experimentais para síntese dos híbridos estudados. .......................... 31 Tabela 2. Reagentes utilizados para produção de 1 L de solução de SBF, com pH 7,4. .... 43 Tabela 3. Propriedades de revestimentos anticorrosivos híbridos orgânicos-inorgânicos. 52 Tabela 4. Propriedades dos híbridos de PMMA-CeO2: rugosidade RMS, RRMS, extraída de imagens de AFM; adesão medida pelo teste pull-off; coeficiente de Porod, α, e raio de giro, Rg, obtidos por SAXS; estabilidade térmica, T0, e resíduo a 800 ºC, obtido por TGA sob atmosfera de N2. .................................................................................................................. 55 Tabela 5. Porcentagem de área das componentes CeOH, Ce2O3 e CeO2 nos espectros XPS O 1s dos revestimentos PMMA-CeO2 intactos, após risco e após risco e EIS.................... 64 Tabela 6. Propriedades dos híbridos PMMA-TiO2: espessura do filme obtida por interferometria óptica; adesão ao substrato de aço-carbono medido pelo teste pull-off; rugosidade da superfície RMS (RRMS) extraída por AFM; módulo de impedânica (|Z|50mHz) após 1 h de imersão em solução de NaCl 3,5%, obtido por EIS; coeficiente de Porod (α) e variável dimensional (s), determinados por SAXS; estabilidade térmica (T0) e resíduo, extraídos por termogravimetria. .......................................................................................... 67 Tabela 7. Propriedades dos híbridos PMMA-ZrO2: espessura do filme obtida por interferometria óptica; adesão medida pelo teste pull-off; rugosidade da superfície RMS (RRMS) extraída por AFM; módulo de impedânica (|Z|50mHz) após 1 h de imersão em solução de NaCl 3,5%, obtido por EIS; coeficiente de Porod (α), raio de giro (Rg) e variável dimensional (s), determinados por SAXS; estabilidade térmica (T0) e resíduo, extraídos por termogravimetria. ................................................................................................................ 74 Tabela 8. Revestimentos anticorrosivos reportados na literatura para liga de Ti6Al4V. ... 87 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AFM Microscopia de força atômica Ag Prata AgCl Cloreto de prata at.% β-TCP Porcentagem atômica Beta fosfato tricálcico BPO Peróxido de benzoíla C Carbono Ce Cério Cl- Cloreto cm Centímetro Cr Crômio EDS Espectroscopia de raios-X por energia dispersiva EIS Espectroscopia de impedância eletroquímica eV Elétron volt g Grama FTIR  Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier Ângulo de fase h Hora H2O Água HA Hidroxiapatita HEMA 2-hidroxietil metacrilato Hz Hertz KCl Cloreto de potássio L Litro MEV Microscopia eletrônica de varredura MEV-EDS Microscopia eletrônica de varredura acoplada à espectroscopia de raios-X por energia dispersiva min Minutos mm Milímetro MMA Metacrilato de metila NaCl Cloreto de sódio nm Nanômetro O Oxigênio PMMA Poli(metacrilato de metila) Ra Rugosidade média RMS Root mean square RRMS Rugosidade RMS SAXS Espalhamento de raios-X a baixo ângulo STEM-EDS Microscopia eletrônica de transmissão de varredura acoplada à espectroscopia de raios-X por energia dispersiva TEM Microscopia eletrônica de transmissão TGA Análise termogravimétrica Ti Titânio U.A. Unidade arbitrária XPS Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X wt% Porcentagem em massa Z Impedância Zr Zircônio μF Microfarad µm Micrômetro Ω Ohm θ Ângulo de contato ºC Graus Celsius SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 19 1.1 Híbridos orgânico-inorgânicos...................................................................... 19 1.2 Híbridos PMMA-TiO2, PMMA-CeO2 e PMMA-ZrO2................................. 21 1.3 Revestimentos anticorrosivos para ligas metálicas....................................... 24 1.4 Revestimentos com propriedade self-healing............................................... 26 1.5 Revestimentos para implantes metálicos...................................................... 28 2 OBJETIVOS................................................................................................... 30 2.1 Objetivo geral................................................................................................. 30 2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 30 3 METODOLOGIA.......................................................................................... 30 3.1 Síntese dos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2.............. 30 3.2 Técnicas de caracterização............................................................................ 38 3.2.1 Análise estrutural, morfológica e térmica..................................................... 38 3.2.2 Eficiência anticorrosiva dos revestimentos................................................... 42 3.2.3 Propriedade de self-healing do híbrido PMMA-CeO2 sobre aço carbono..... 44 3.2.4 Caracterização biológica dos híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 sobre Ti6Al4V......................................................................................................... 44 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 48 4.1 PMMA-CeO2 ............................................................................................... 49 4.1.1 Conclusões parciais....................................................................................... 65 4.2 PMMA-TiO2................................................................................................. 66 4.2.1 Conclusões parciais...................................................................................... 73 4.3 PMMA-ZrO2................................................................................................. 74 4.3.1 Conclusões parciais...................................................................................... 80 4.4 PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 modificados com hidroxiapatita e β-TCP..... 81 4.4.1 Conclusões parciais....................................................................................... 88 5 CONCLUSÕES.............................................................................................. 88 6 PERSPECTIVAS........................................................................................... 90 REFERÊNCIAS............................................................................................. 90 19 1 INTRODUÇÃO 1.1 Híbridos orgânico-inorgânicos Materiais híbridos orgânico-inorgânicos são constituídos de uma fase orgânica (epóxi, poli(metacrilato de metila), polietilenoglicol, poliuretana, etc.) e uma fase inorgânica (SiO2, TiO2, ZrO2, ZnO, CeO2, Al2O3, etc.) dispersas em nível molecular ou nanométrico [1]. Os híbridos orgânico-inorgânicos constituem uma classe de materiais multifuncionais com uma larga faixa de aplicações, devido as suas interessantes propriedades que combinam a alta estabilidade mecânica, térmica e química dos compostos cerâmicos, com a processabilidade e flexibilidade dos polímeros. O grande número de combinações e proporções possíveis entre os componentes inorgânicos e orgânicos possibilita modelar as propriedades do material resultante, e essa versatilidade propicia um grande potencial em diferentes aplicações, como em (bio)sensores, dispositivos fotocrômicos, fotocatalisadores, biomateriais, sistemas de liberação de fármacos, células a combustível, isolante térmico e revestimentos protetores para diferentes substratos [2]. Os híbridos podem ser classificados em duas categorias, de acordo com o tipo de interação entre as fases: classe I, quando as fases orgânica e inorgânica possuem ligações do tipo hidrogênio, Van der Waals ou iônicas e classe II, quando existem ligações covalentes entre as fases orgânica e inorgânica (Figura 1) [1,3]. As moléculas acopladoras usadas como blocos de construção para formar híbridos de classe II possuem pelo menos duas funcionalidades distintas as quais permitem ligações covalentes entre a fase orgância e inorgânica através de grupos acrilato, amina, epóxi, siloxano, hidroxila, entre outros (Figura 1). As propriedades de nanocompósitos híbridos dependem de muitos fatores, como a proporção dos constituintes, a natureza da ligação, as propriedades intrínsecas de cada material e o sinergismo resultante da combinação dos componentes [1,3]. A obtenção de dispersões homogêneas entre as fases orgânica e inorgânica é o fator chave na preparação de nanocompósitos, porém nanopartículas têm tendência de interagir e formar agregados [4]. A funcionalização covalente das nanopartículas inorgânicas com moléculas acopladoras melhora a dispersão e diminui a formação de agregados na solução coloidal [5]. Partículas com dimensões menores que 100 nm são capazes de reforçar a matriz polimérica sem mudar a transparência do filme [6]. Dependendo das propriedades inerentes, concentração, tamanho, forma e grau de dispersão das nanopartículas inorgânicas na matriz polimérica, podem-se formar materiais impermeáveis, com alta resistência mecânica, térmica e à radiação UV [6]. 20 Figura 1. Estruturas representativas de híbridos orgânico-inorgânicos de classe I e II, e exemplos de moléculas acopladoras utilizadas para ligação covalente entre fases orgânicas e inorgânicas. Vários aspectos têm favorecido a utilização dos materiais híbridos, dentre os quais podem ser destacados as condições brandas de síntese proporcionadas pela metodologia sol- gel, os baixos custos da preparação, a versatilidade de seu processamento, a compatibilidade ambiental e também as condições de tratamento térmico aplicado para cura destes revestimentos, as quais não exigem temperaturas elevadas [2]. Além disso, o processo sol- gel fornece um material homogêneo e com composição e microestrutura controláveis. O sol constitui-se de partículas coloidais suspensas em um líquido (solvente) e o gel é formado por estruturas rígidas que se formam após as reações de hidrólise e condensação do precursor, como por exemplo alcóxidos metálicos [7]. Os materiais sintetizados pelo método sol-gel são versáteis, podendo ser obtidos na forma de monolitos, pós, fibras, filmes e poros ordenados [8]. Os precursores de materiais sintetizados pelo método sol-gel consistem de um elemento metálico (Ti, Zr, Fe) ou semi-metálico (B, Si, Ge) cercado por vários ligantes, 21 podendo ser sais inorgânicos (cloreto, nitrato, sulfeto, etc) ou alcóxidos. Um alcóxido é um ligante formado pela remoção de um próton de uma hidroxila de um álcool, como um metóxi (·OCH3) ou etóxi (·OC2H5). Alcóxidos metálicos são membros de uma família de compostos metalorgânicos, a qual tem um ligante orgânico ligado a um átomo metálico ou metalóide. Os alcóxidos metálicos são os precursores mais utilizados na pesquisa de sol-gel devido a sua alta reatividade com água, que encadeia reações de hidrólise e condensação, como exemplificado na Figura 2, onde M é o metal e R é um grupo alquil (CxH2x+1) [8,9,10]. Figura 2. Reações de hidrólise e condensação do processo sol-gel, adaptado de [8]. 1.2 Híbridos PMMA-TiO2, PMMA-CeO2 e PMMA-ZrO2 O polímero poli(metacrilato de metila) (PMMA), também conhecido como acrílico e Pexiglas, é um polímero termoplástico, rígido, transparente, incolor e amplamente utilizado como lentes ópticas, tintas e revestimentos protetores, aplicações médicas e dentárias, fibras ópticas, e como alternativa ao vidro em janelas e objetos em geral como mesas, cadeiras, telas de computador e televisão, entre outros [11]. Este polímero pode ser obtido pela polimerização radicalar do metacrilato de metila (MMA), utilizando por exemplo o iniciador térmico peróxido de benzoíla (BPO) (Figura 3). Inicialmente o aquecimento da solução contendo monômero e BPO leva a decomposição térmica do iniciador térmico e formação de radicais, que por sua vez iniciam a polimerização do MMA através do ataque ao carbono da ligação dupla. A quebra da ligação dupla leva à formação de um radical e com isso a reação se propaga pela ligação sucessiva de monômeros, e termina principalmente pela combinação de dois radicais [12]. 22 Figura 3. Reação de polimerização radicalar para formação do PMMA, a partir de peróxido de benzoíla (BPO) e metacrilado de metila (MMA). O PMMA é um polímero de baixo custo, com alta resistência às condições ambientais e não tóxico [11]. Porém, quando comparado a materiais cerâmicos e metálicos, a estabilidade térmica, a resistência mecânica e a estabilidade à radiação UV do PMMA são relativamente pobres [13] e, portanto, a introdução de componentes inorgânicos, como ZrO2, TiO2 e CeO2 melhoram substancialmente estas propriedades [14], além de possivelmente proporcionar novas caracterísiticas interessantes como bioatividade, atividade fotocatalítica e efeito self-healing (auto-cura). Híbridos de classe I contendo poli(metacrilato de metila), como PMMA-TiO2 [15- 17], PMMA-CeO2 [18,19] e PMMA-ZrO2 [20-22], já foram bastante estudados, entretanto a ligação covalente entre as fases orgânicas e inorgânicas em materiais híbridos é essencial para obtenção de compostos homogêneos e com propriedades como baixa porosidade, estabilidade mecânica e térmica, além de alta resistência à corrosão. Embora já tenham sido desenvolvidos alguns híbridos de classe II contendo PMMA-(TiO2 [23], CeO2 [24] e ZrO2 [25]) algumas propriedades, como por exemplo a eficiência anticorrosiva, ainda não foram exploradas. O monômero 2-hidroxietil metacrilato (HEMA) é especialmente interessante como acoplador entre o PMMA e diferentes fases inorgânicas, por possuir um grupo metacrilato apto a polimerizar com o monômero MMA e uma hidroxila que pode reagir rapidamente com diferentes fases inorgânicas através do processo sol-gel (Figura 4). 23 Figura 4. Reação entre a molécula de HEMA e o alcóxido metálico hidrolisado, liberando água e produzindo ligação covalente entre o metal (M) e a parte orgânica. Adaptado de [26]. Dióxido de titânio, TiO2, é um material semicondutor (band gap igual a 3,2 eV), possui baixo custo de produção, alta estabilidade química, mecânica e térmica, não é tóxico, além de ser biocompatível, fotocatalítico e bactericida fotoinduzido [14,27,28]. Desde Fujishima e Honda [29] quando relatada a reação de eletrólise por fotocatálise da água em eletrodos de TiO2 iluminados, propriedades fotoeletroquímicas dos revestimentos de TiO2 têm sido aplicadas a uma grande variedade de áreas, tais como células solares, pigmentos, catálise, cosméticos, implantes médicos, degradação de poluentes, revestimentos anticorrosivos e superfícies auto-limpantes [30]. Especificamente as propriedades fotocataliticas do dióxido de titânio na presença de radiação ultravioleta têm sido utilizadas para descontaminação de águas, eliminação de microorganismos, degradação de corantes, preparação de superfícies que se mantêm limpas ao longo do tempo, denominadas autolimpantes, e na proteção anticorrosiva, devido à fotogeração de elétrons sob radiação UV, que resulta em uma proteção catódica adicional [31]. A incorporação de óxido de titânio em PMMA tem sido utilizada para elevar o índice de refração [32], aumentar a estabilidade térmica e a estabilidade à radiação UV [15,23]. Em geral, híbridos PMMA-TiO2 têm potencial aplicação como: (i) revestimentos anticorrosivos para superfícies metálicas, (ii) filmes anti-reflexo para células solares, lentes e telas de computador, (iii) revestimentos auto-limpantes, (iv) revestimento antimicrobiano, (v) sistemas para degradação de corante e descontaminação de água e (vi) revestimentos com propriedade de self-healing pela fotogeração de corrente de proteção catódica sob radiação UV [31]. Zircônia, ZrO2, possui elevada resistência à fratura e ao desgaste, elevada dureza, biocompatibilidade, excelente resistência química e em forma de filmes boa adesão à superfície metálica, propriedades que tornam um nanocompósito PMMA-ZrO2 promissor para várias aplicações, especialmente revestimentos anticorrosivos para implantes metálicos [4,14,33]. Revestimentos de ZrO2 preparados pelo processo sol-gel e depositados sobre aço inoxidável apresentam uma proteção contra corrosão um pouco superior à liga metálica, 24 porém com potencial de corrosão ainda negativo devido à presença de poros que permitem a difusão de espécies corrosivas até o metal [22,33]. A introdução de uma matriz polimérica de PMMA sem a presença de uma molécula acopladora (híbrido de classe I) e deposição sobre aço inoxidável resulta em uma maior proteção anticorrosiva se comparada a apenas ZrO2, porém ainda com potencial de corrosão negativo [20-22]. O potencial de camadas protetoras à base do nanocompósito PMMA-ZrO2 ligado covalentemente (classe II) ainda não havia sido explorado, e, portanto, foi um dos focos deste trabalho. Materiais à base de óxido de cério são interessantes por suas propriedades redox, devido â fácil conversão entre os estados de valência Ce (III) a Ce (IV) em condições de oxidação e redução [34]. Nanopartículas de CeO2 têm sido o objeto de vários estudos recentes para aplicações como filtros UV inorgânicos devido ao seu elevado coeficiente de absorção na região UV e à sua baixa atividade fotocatalítica. Além das suas interessantes propriedades ópticas, nanopartículas de CeO2 possuem alta bioatividade, devido às suas propriedades redox e antioxidantes [35]. Revestimentos de CeO2 foram reportados por melhorar a resistência à oxidação de ligas metálicas [36], porém a utilização de cério é mais explorada em revestimentos anticorrosivos como inibidor de corrosão devido a seu efeito self-healing, habilidade do cério de formar óxidos e hidróxidos insolúveis em defeitos induzidos pela corrosão [14,37]. Os efeitos de íons cério na estrutura de híbridos já foram investigados por vários autores, inclusive em nosso grupo [37,38], que a partir de resultados de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS), mostrou o papel ativo do Ce (IV) no aumento da conectividade da rede siloxano e também no aumento do grau de polimerização da fase orgânica do filme de PMMA-SiO2, resultando assim em filmes com maior proteção contra a corrosão. Além disso, CeO2 tem sido adicionado ao PMMA para proteção contra radiação ultravioleta, prevenindo contra a foto-degradação, uma vez que é um semicondutor com banda proibida (band gap) igual a 3,15 eV, garantindo uma efetiva absorção da luz UV abaixo de 370 nm [39]. 1.3 Revestimentos anticorrosivos para ligas metálicas Desde a descoberta do cobre em tempos pré-históricos, uma extensa diversidade de materiais metálicos emergiu, como metais puros ou ligas metálicas [40]. Latão, bronze, aço, titânio e ligas de alumínio são atualmente os materiais metálicos mais aplicados, porém a tendência a sofrer corrosão em ambientes agressivos tem causado grande número de 25 acidentes, perdas econômicas devido à necessidade de reposição das peças, além do prejuízo ambiental causado pela exploração dos metais e pela geração de lixo [40]. Vários métodos de proteção foram desenvolvidos, incluindo o uso de: (i) novas ligas com maior resistência à corrosão, mas além do alto custo associado com sua fabricação, a utilização de novas ligas requer a substituição dos componentes instalados [40]; (ii) inibidores de corrosão, substâncias como por exemplo fosfatos, silicatos, hidróxidos, carbonatos, entre outros, que reduzem ou até mesmo eliminam a corrosão, por um ou uma combinação de vários mecanismos, como a adsorção, formação de precipitados volumosos visíveis, ou outros métodos comuns que consistem na combinação de adsorção, conversão e processos de oxidação para formar uma camada passiva [41]; (iii) proteção catódica, que usa um metal de sacrificío para proteger a estrutura metálica de interesse; (iv) camada de conversão, produzida pela conversão da superfície do metal em uma forma resistente à corrosão, como por exemplo anodização, fosfatização e cromatização [41]; e (v) revestimentos anticorrosivos, que resultam em uma barreira física entre o metal e o meio corrosivo, evitando ou minimizando o processo de corrosão. Entre os métodos citados a passivação de superfícies metálicas usando revestimentos de conversão de cromato, ainda amplamente usada na indústria aeroespacial, forcene um dos melhores resultados, devido à formação de uma proteção ativa. Esse revestimento é formado pela redução de espécies de Cr (VI) para Cr2O3, no entanto, o processo de conversão, bem como o revestimento final, mantém uma pequena quantidade de Cr (VI) não reagido, uma espécie altamente tóxica que pode ser liberada para o ambiente [40]. Legislações cada vez mais rigorosas vêm proibindo o uso desta metodologia e, portanto, o desenvolvimento de novas alternativas ecologicamente corretas e que apresentem alta performance anticorrosiva é de extrema necessidade para proteção de materiais metálicos contra corrosão [42]. Neste contexto, o uso de revestimentos anticorrosivos tem várias vantagens, como custos relativamente baixos, compatibilidade ambiental e a possibilidade de aplicação em componentes metálicos em uso [40]. Consequentemente, diferentes tipos de revestimentos de proteção foram desenvolvidos, compreendendo materiais metálicos, inorgânicos, orgânicos ou orgânicos-inorgânicos [40]. A aplicação de revestimentos metálicos, como cromo, zinco, níquel, alumínio e cobre, geralmente envolve poluição inerente e problemas relacionados com a toxicidade [41]. Revestimentos inorgânicos compreendem cerâmicas (sílica, titânia, zircônia, alumina), vidro, carbono, entre outros, e embora apresentem maior resistência à corrosão em comparação com substratos não revestidos, eles geralmente 26 exibem porosidade residual e presença de rachaduras devido a tensões internas, limitando seu uso como barreira de corrosão eficiente [22,41,43]. Materiais orgânicos, como epóxi, PMMA, poliuretano, poliésteres e fluoropolímeros, são amplamente aplicados como revestimentos de proteção, devido à simplicidade da aplicação, alta densidade e homogeneidade da estrutura e, consequentemente, alta resistência à corrosão em ambientes agressivos. No entanto, a falta de estabilidade térmica, resistência mecânica e principalmente de aderência a superfícies metálicas resultam em uma baixa durabilidade [40]. Entre a diversidade de revestimentos orgânicos e inorgânicos, a combinação de ambas as fases na forma de híbridos orgânico-inorgânicos tem se mostrado o método mais promissor para uma proteção eficiente e duradoura contra corrosão de superfícies metálicas [40,44]. Isso se deve à combinação de diversas propriedades essenciais proporcionadas pela fase inorgânica, como excelente aderência à superfície metálica, resistência mecânica e estabilidade térmica, combinadas com baixo estresse intrínseco e ausência de poros e fissuras fornecidos pela fase polimérica. 1.4 Revestimentos com propriedade self-healing Inspirado em sistemas biológicos, o desenvolvimento de revestimentos com capacidade de auto-cura (self-healing) envolve a recuperação das propriedades originais do material após sofrer lesões induzidas por processos mecânicos ou químicos [45,46]. Para preparar materiais com propriedade de self-healing duas estratégias vêm sendo utilizadas: regeneração extrínseca e intrínseca. A regeneração intrínseca ocorre quando o próprio material se regenera, como por exemplo polímeros com memória de forma, enquanto a regeneração extrínseca pode ser fornecida pela adição de aditivos no revestimento na forma de inibidores de corrosão, cápsulas, fibras ou redes vasculares, que podem ser ativados por aumento de temperatura, UV, gradiente de pH, quebra de cápsulas ou alterações no ambiente químico (Figura 5) [45-49]. Considerando a abordagem extrínseca, a restauração sob demanda do revestimento é uma alternativa interessante para a substituição de cromatos. Diversos estudos relataram os benefícios e a eficiência de inibidores incorporados em várias classes de revestimentos que fornecem proteção ativa contra ataques corrosivos [50,51]. 27 Figura 5. Regeneração intrínseca e extrínseca de revestimentos anticorrosivos. Inibidores de corrosão armazenados no revestimento são capazes de desencadear reações secundárias após danos externos, sem prejudicar sua estrutura e adesão ao substrato. Entre os inibidores inorgânicos, os sais de cério não tóxicos têm sido relatados como o inibidor mais ativo [38,52,53]. Os compostos de cério apresentaram resultados promissores para os revestimentos híbridos orgânico-inorgânicos sol-gel, devido à proteção catódica proporcionada pelos íons Ce (III) e Ce (IV). Após a liberação de íons OH durante a reação de redução de oxigênio, a restauração dos sítios de corrosão pode ser alcançada pela formação de espécies insolúveis, como óxidos e hidróxidos, bloqueando o progresso das reações redox [37,40,42,51]. Vários estudos têm investigado os efeitos benéficos dos sais de cério (cloreto e nitratos) em revestimentos híbridos, no entanto, poucos investigaram o efeito de nanopartículas de óxido de cério, que permite maiores taxas de liberação de íons cério em regiões corrosivas. Portanto, um dos focos deste trabalho foi o desenvolvimento de revestimentos PMMA covalentemente ligado a nanopartículas de óxido de cério (PMMA- CeO2) com propriedade de self-healing para estender a vida útil de substratos de aço carbono. 28 1.5 Revestimentos para implantes metálicos Materiais metálios são largamente aplicados no corpo humano devido a lesões ou doenças, como por exemplo em implantes dentários, próteses de ombro, joelho e quadril (Figura 6). Várias ligas metálicas têm sido desenvolvidas para fabrição de implantes, porém os materiais consolidados são o aço inoxidável (316 L) e o titânio, seja puro ou na forma de ligas. O aço inoxidável 316 L é composto por Fe, <0,03% C, 16-18% Cr, 10-14% Ni, 2-3% Mo, <2% Mn, <0,75% Si, <0,01% N, <0,045% P, e <0,03% S, possui um custo relativamente baixo, e por isso vem sendo utilizado no SUS (Sistema Único de Saúde), porém apresenta problemas quanto à corrosão e liberação de íons tóxicos. O titânio puro e suas ligas, embora apresentem um custo mais alto, vêm substituindo o uso de aço inoxidável no sistema particular de saúde, sendo a liga Ti6Al4V o material mais utilizado para implantes atualmente. Embora a liga Ti6Al4V seja mais resistente à corrosão em comparação com o aço inoxidável, altos níveis de detritos de titânio, vanádio e alumínio foram encontrados em tecidos circundantes após exposição por longos períodos e sob condições de desgaste. A constante preocupação com a liberação de íons tóxicos, causada pela corrosão das diferentes ligas metálicas usadas como implantes, levou ao desenvolvimento de revestimentos que prolonguem a duração destes materiais [54,55]. Figura 6. Exemplos de implantes metálicos utilizados no corpo humano. Adaptado de [56]. 29 A aplicação de revestimentos protetores biocompatíveis é uma maneira promissora de superar as desvantagens relacionadas com eventos iniciais de corrosão, evitando assim a necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica. A concepção de revestimentos protetores de corrosão para implantes metálicos, oferecendo uma ampla gama de funcionalidades ganhou relevância significativa nos últimos anos. Estes revestimentos multifuncionais apresentam um elevado potencial de aplicação, porque podem ser adaptados para a proteção contra a corrosão, estimulação da adesão e proliferação de osteoblastos, entrega de medicamentos e atividade anti-bacteriana. Entretanto, a obtenção de multifuncionalidades é uma tarefa complexa e, embora muitos revestimentos tenham sido relatados, poucos apresentam eficiência em mais de uma funcionalidade [57]. Após a incorporação de um implante ao corpo humano é necessário que ocorra a osseointegração, processo de ancoragem no nível histológico entre o osso vivo e um implante, sem a formação de tecido fibroso. A metodologia mais comum para melhorar a osseointegração é aumentar a rugosidade da superfície para melhorar a adesão celular, utilizando por exemplo anodização, jateamento, usinagem, laser, aspersão térmica e ataque químico, porém a aplicação de revestimentos bioativos é a via mais promissora para melhorar a adesão celular devido à interação química com as células, por exemplo através do uso de fosfatos de cálcio. Hidroxiapatita (HA: Ca(PO4)6(OH)2) e beta fosfato tricálcico (β-TCP: Ca3(PO4)2) vêm sendo vastamente aplicados para aumentar a osseointegração de materiais para implantes ortopédicos, devido à sua similaridade com a composição inorgânica do osso que leva a uma exelente biocompatibilidade e osteocondutividade, capacidade do biomaterial em conduzir o crescimento ósseo [58]. A utilização de revestimentos híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 sobre materiais metálicos utilizados para implantes pode ser uma alternativa eficiente para proteção contra corrosão em meio corporal. Componentes inorgânicos como TiO2 e ZrO2 podem fornecer estabilidade mecânica para o revestimento, além de se ligar covalentemente à superfície metálica do implante aumentando a aderência e durabilidade, enquanto a presença de PMMA nesses revestimentos é importante para promover a formação de um filme com ausência de poros e trincas, levando a revestimentos com alta eficiência anticorrosiva. A adição de fosfatos de cálcio como HA e β-TCP em revestimentos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 pode levar à obtenção de revestimentos bioativos, que além de protegerem contra corrosão e serem biocompatíveis, ainda melhoram a osseointegração. 30 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Desenvolvimento de nanocompósitos híbridos PMMA-(TiO2, ZrO2 e CeO2) de classe II sintetizados pelo processo sol-gel, com foco na aplicação como revestimentos anticorrosivos para superfícies metálicas de aço carbono e liga de titânio Ti6Al4V. 2.2 Objetivos específicos • Avaliação dos efeitos dos parâmetros de síntese como temperatura, tempo e proporção molar dos reagentes nas propriedades estruturais e na estabilidade térmica dos nanocompósitos. • Deposição do híbrido PMMA-CeO2 sobre substrato de aço carbono para estudo da eficiência anticorrosiva e análise da propriedade de self-healing. • Deposição dos híbridos PMMA-(TiO2 e ZrO2) sobre substrato de aço carbono para estudo da eficiência anticorrosiva dos revestimentos. • Modificação de revestimentos híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 com hidroxiapatita e β-TCP, deposição em liga Ti6Al4V, e caracterização estrutural, biológica e eletroquímica. 3 METODOLOGIA 3.1 Síntese dos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2 Os seguintes reagentes foram utilizados como recebidos e estão disponíveis comercialmente: isopropóxido de titânio (IV) (Sigma-Aldrich), propóxido de zircônio (IV) (Sigma-Aldrich), nitrato de cério (III) hexahidratado (Ce(NO3)3.6H2O, Sigma-Aldrich), hidróxido de lítio (LiOH, Sigma-Aldrich), 2-hidroxietil metacrilato (HEMA, Sigma- Aldrich), metacrilato de metila (MMA, Sigma-Aldrich), etanol anidro (Sigma-Aldrich), isopropanol anidro (Sigma-Aldrich), peróxido de benzoíla (BPO, Sigma-Aldrich) e hidroxiapatita (Sigma-Aldrich). O MMA foi previamente destilado para remoção do inibidor de polimerização (hidroquinona) e possíveis impurezas. O HEMA foi utilizado como agente acoplador entre a fase orgânica (MMA polimerizado) e as fases inorgânicas. Os três híbridos estudados neste trabalho não haviam sido reportados anteriormente e, portanto, diversos parâmetros foram variados, como tempo e temperatura de síntese, proporção entre precurssores, quantidade e tipo de solvente, método e parâmetros de deposição, entre outros. Após cada síntese e caracterização do revestimento, dependendo do 31 resultado obtido um determinado parâmetro foi escolhido para ser variado, porém apenas as amostras que apresentaram melhores resultados serão apresentadas (Tabela 1). Tabela 1. Condições experimentais para síntese dos híbridos estudados. Nome da amostra Proporção molar Tempo de síntese Razão BPO/MMA Tratamento térmico 1Ce2HEMA20MMA 1Ce:2HEMA:20MMA 90 min 0.05 60 ºC/24 h, 80 ºC/24 h, 100 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 1Ce2HEMA25MMA 1Ce:2HEMA:25MMA 90 min 0.05 60 ºC/24 h, 80 ºC/24 h, 100 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 1Ce2HEMA30MMA 1Ce:2HEMA:30MMA 90 min 0.05 60 ºC/24 h, 80 ºC/24 h, 100 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Ti_8MMA(BPO0.01) 2Ti:1HEMA:8MMA 4 h 0.01 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Ti_8MMA(BPO0.05) 2Ti:1HEMA:8MMA 4 h 0.05 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Ti_12MMA(BPO0.05) 2Ti:1HEMA:12MMA 4 h 0.05 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Ti_12MMA(BPO0.1) 2Ti:1HEMA:12MMA 4 h 0.1 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Zr_12MMA(BPO0.1) 2Zr:1HEMA:12MMA 30 min 0.1 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Zr_14MMA(BPO0.1) 2Zr:1HEMA:14MMA 30 min 0.1 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h 2Zr_16MMA(BPO0.1) 2Zr:1HEMA:16MMA 30 min 0.1 60 ºC/24 h, 160 ºC/3 h A síntese dos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2 está resumida na Figura 7. A primeira etapa é referente à síntese das nanopartículas inorgânicas e reação com a molécula acopladora (HEMA), em seguida é realizada a mistura das nanopartículas inorgânicas com o MMA (monômero) e BPO (iniciador térmico), e por fim os revestimentos são obtidos por dip-coating (imersão) e os substratos revestidos são tratados termicamente. 32 Figura 7. Procedimento de síntese dos revestimentos híbridos e estruturas moleculares dos reagentes utilizados na síntese. Para síntese do híbrido PMMA-CeO2, inicialmente 1,086g de Ce(NO3)3·6H2O e 0,03 g de LiOH foram dissolvidos em 5 ml de etanol cada por auxílio do banho de ultrassom (~10 min). Posteriormente, a solução etanólica contendo Ce foi colocada para agitar a 25 ºC, a solução de Li foi adicionada gota a gota, e então deixado reagir por 20 min (Figua 8). A adição de LiOH levou a uma cor laranja da solução, indicando a oxidação de Ce3+ a Ce4+ [35]. Após este tempo, o reagente HEMA foi adicionado ao recipiente contedo as nanopartículas de CeO2 e a solução foi deixada agitar por 60 min a 25 °C. Em um balão de fundo redondo, foi misturado MMA, BPO e a solução inorgânica, e por fim deixado agitar por 1 h e 30 min a 80 ºC em refluxo. 33 Figura 8. Síntese de nanopartículas de óxido de cério. Vários parâmetros foram variados a fim de se obter revestimentos híbridos de alta eficiência anticorrosiva (Figura 9), como proporção entre Ce:HEMA:MMA (1Ce:4HEMA:30MMA, 1Ce:2HEMA:30MMA, 1Ce:2HEMA:25MMA e 1Ce:2HEMA:20MMA), tempo de acoplamento entre fase orgânica e inorgânica (1 h e 24 h), tratamento térmico (24 h/60 °C e 3 h/160 °C; 90°C/24h e 160°C/3h; 24 h/25 °C, 1 semana/60 °C e 3 h/160 °C; 24 h/25 °C, 24 h/60 °C e 3 h/160 °C; 1 semana/60 °C e 3 h/160 °C; 24 h/60 °C, 24 h/80 °C, 24 h/100 °C e 3 h/160 °C; e 8 h/60 °C, 8 h/80 °C, 8 h/100 °C, 3 h/130 °C e 3 h/160 °C), método de deposição do filme (spin-coating e dip-coating), e parâmetros de deposição (3 imersões de 1 min com velocidade de 14 cm min-1 e tempo de secagem de 10 min; e 3 imersões de 30 s com velocidade de 30 cm min-1 e tempo de secagem de 5 min). Os revestimentos que forneceram os melhores resultados em termos de resistência à corrosão foram escolhidos para serem apresentados. Estes filmes foram preparados com proporção molar 1Ce:2HEMA:20MMA, 1Ce:2HEMA:25MMA e 1Ce:2HEMA:30MMA, tempo de acoplamento de 1 h, depositados por dip-coating (com tempo de imersão de 30 s, tempo de secagem de 5 min, velocidade de imersão de 30 cm min-1 e 3 imersões), e tratamento térmico prolongado (60 ºC/24 h, 80 ºC/24 h, 100 ºC/24 h e 160 ºC/3 h) que favoreceu a eliminação lenta dos solventes e monômeros não polimerizados e assim levou à formação de uma estrutura mais densa e ausente de poros. 34 Figura 9. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-CeO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes. A síntese do híbrido PMMA-TiO2 partiu da mistura do isopropóxido de titânio com o reagente HEMA, por 15 min a 25 °C em frasco aberto, permitindo que a água do ambiente hidrolisasse o alcóxido. Posteriormente, esta solução foi misturada com o MMA e isopropanol e reagida por 4 h a 80 ºC sob refluxo. Para o híbrido PMMA-TiO2 os parâmetros variados incluíram a proporção entre Ti:HEMA:MMA (2Ti:1HEMA:8MMA, 2Ti:1HEMA:10MMA, 2Ti:1HEMA:12MMA, 2Ti:1HEMA:14MMA e 2Ti:1HEMA:16MMA), razão BPO/MMA (0,01, 0,04, 0,05 e 0,1), tratamento térmico (60°C/24h e 160°C/3h; e 90°C/24h e 160°C/3h), e tempo de acoplamento entre fase orgânica e inorgânica (15 min e 3 h) (Figura 10). As amostras que serão apresentadas possuem a proporção molar entre os reagentes igual a 2Ti:1HEMA:8MMA com razão molar BPO/MMA = 0.01 (2Ti_8MMA(B0.01)); 2Ti:1HEMA:8MMA, BPO/MMA = 0.05 (2Ti_8MMA(B0.05)); 2Ti:1HEMA:12MMA BPO/MMA = 0.05 (2Ti_12MMA(B0.05)); e 2Ti:1HEMA:12MMA, BPO/MMA = 0.1 (2Ti_12MMA(B0.1)). Essas amostras foram 35 sintetizadas com 15 min de tempo de acoplamento, tempo de reação de 4 h e submetidas a um tratamento térmico de 60 °C/24 h e 160 °C/3 h. Figura 10. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-TiO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes. A síntese do híbrido PMMA-ZrO2 foi muito semelhante a do híbrido PMMA-TiO2, iniciando com a mistura do propóxido de zircônio e HEMA, por 15 min a 25 °C em frasco aberto. Porém como o propóxido de zircônio apresenta alta reatividade química e, portanto, é extremamente sensível à presença de água [8], o tempo de reação entre o alcóxido e o acoplador (HEMA) foi diminuído para 1 min. Posteriormente, a fase inorgânica foi misturada com o MMA e isopropanol e reagida por 30 min a 80 ºC sob refluxo. Para o híbrido PMMA-ZrO2 os parâmetros variados foram proporção Zr:HEMA:MMA (2Zr:1HEMA:12MMA, 2Zr:1HEMA:14MMA, 2Zr:1HEMA:16MMA, 1Zr:1HEMA:14MMA, 1Zr:4HEMA:16MMA e 1Zr:2HEMA:12MMA), razão BPO/MMA (0,03, 0,04, 0,05 e 0,1), tempo e temperatura de reação (60 °C/2 h, 80 °C/30 min e 80 °C/1 hora) e tempo de acoplamento (1 min e 15 min) (Figura 11). As amostras que serão apresentadas possuem razão molar BPO/MMA constante e igual a 0.1, e proporção entre os reagentes igual a 2Zr:1HEMA:12MMA (2Zr_12MMA(BPO0.1)), 2Zr:1HEMA:14MMA 36 (2Zr_14MMA(BPO0.1)), e 2Zr:1HEMA:16MMA (2Zr_16MMA(BPO0.1)). Todas as amostras foram sintetizadas a 80 °C por 30 min, 1 min de tempo de acoplamento e submetidas a um tratamento térmico de 60 °C por 24 h, e posteriormente, 160 °C por 3 h. Figura 11. Parâmetros de síntese variados para o híbrido PMMA-ZrO2. As amostras em verde são referentes aos resultados detalhados neste trabalho, as amostras em vermelho representam as amostras que produziram revestimentos homogêneos sobre aço carbono, mas devido a baixa resistência contra corrosão não foram apresentadas, e as amostras em preto são referentes as proporções entre precursores que não forneceram materiais homogêneos para deposição de filmes. Para a modificação dos híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 com fosfato de cálcio, foram utilizadas as amostras com melhores resultados em termos de eficiência anticorrosiva: 2Ti_12MMA(B0.1) e 2Zr_16MMA(BPO0.1). Tanto a hidroxiapatita quanto o β-TCP foram adicionados na segunda etapa da síntese, junto com o MMA, BPO e isopropanol, na razão 37 molar HA ou βTCP/Ti = 0.1. Para os testes biológicos, as amostras foram cortadas em pedaços de 0,5 x 0,5 cm2, limpas com etanol e esterilizadas em autoclave a 121 °C por 30 min. Os materiais obtidos foram utilizados para deposição de filmes sobre aço carbono A1020 e liga de titânio Ti6Al4V pelo processo de dip-coating, com velocidade de emersão de 30 cm min-1, tempo de imersão de 30 s e tempo de secagem entre as 3 imersões de 5 min. As soluções restantes dos híbridos foram colocadas em suportes de Teflon e então levado junto com os substratos revestidos para tratamento térmico. A cura térmica aplicada para todas as amostras garante um alto grau de policondensação e polimerização da estrutura formada. Fotos dos substratos revestidos com os diferentes híbridos estudados podem ser observadas na Figura 12. Figura 12. Fotos dos substratos metálicos revestidos com os híbridos estudados. Barras quadradas (1000 mm x 25 mm x 25mm) de aço carbono A1020 e liga de titânio Ti6Al4V foram adquiridas comercialmente da empresa GGD Metals e Acnis, respectivamente, cortadas em pastilhas (3 mm x 25 mm x 25mm), retificadas, colocadas em sacos plásticos contendo óleo, e armazenadas em dessecador até o dia da síntese. No dia de síntese dos materiais híbridos, os substratos de aço carbono e liga de titânio Ti6Al4V foram lavados com detergente e água em abundância para remoção do óleo, lavados com acetona, lixados com lixas d’água 100, 320, 600 e 1500, lavados com isopropanol em banho de ultrassom por 10 min e secos sob fluxo de nitrogênio, minutos antes da deposição dos filmes. 38 O aço carbono A1020, com composição nominal (em wt%) igual a C = 0,210%, Mn = 0,480%, Si = 0,140%, P = 0,013% e S = 0,015%, com o balanço de Fe, foi escolhido como substrato por ser uma liga que combina propriedades como alta dureza, tenacidade, resistência e flexibilidade, além de sua fabricação ser de baixo custo e possuir inúmeras aplicações funcionais, como chapas automobilísticas, perfis estruturais, placas para produção de tubos, construção civil, etc. Embora possua uma vasta gama de aplicabilidade, o aço carbono é rapidamente corroído quando em contato com ambientes úmidos e salinos, sendo portanto de extrema importância a sua proteção contra corrosão. A liga de titânio Ti6Al4V (ASTM F 136) contém 6% de alumínio e 4% de vanádio, e é vastamente utilizada para implantes ortopédicos e dentais, porém a liberação de íons tóxicos devido à corrosão em fluido corporal leva a necessidade de aplicação de revestimentos que aumentem o tempo de vida desses implantes. 3.2 Técnicas de caracterização A caracterização estrutural e morfológica dos híbridos PMMA-(TiO2, ZrO2 e CeO2) foi realizada por XPS, AFM, SAXS, TEM, FTIR, microscopia óptica, medidas de espessura e medidas de adesão; para análise da estabilidade térmica foi utilizada a técnica de termogravimetria; e para avaliar a eficiência anticorrosiva dos revestimentos depositados em aço carbono e liga de titânio foi aplicada a técnica de EIS. Para análise da propriedade de self-healing, revestimentos PMMA-CeO2 foram riscados artificialmente e caracterizados por XPS, EIS e MEV. A análise dos revestimentos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 contendo HA e β-TCP depositados sobre Ti6Al4V foi realizada em um estágio de pesquisa no exterior, por várias técnicas estruturais, biológicas e eletroquímicas. 3.2.1 Análise estrutural, morfológica e térmica As espessuras dos revestimentos depositados sobre substrato de aço carbono e liga Ti6Al4V foram medidas por um sistema de interferência óptica (Filmetrics F3-CS), instalado no GFQM do IQ/UNESP. Neste método a luz refletida e/ou transmitida das interfaces do filme, em um determinado intervalo de comprimento de onda (380 – 1050 nm), possui diferentes fases, resultando em sinal de interferência (oscilação da intensidade) que depende das propriedades ópticas (índice de refração, n, e extinção, k) e da espessura do filme. 39 Medidas de adesão foram realizadas pelo teste de pull-off, utilizando-se um testador de aderência (Elcometer F510-20T), instalado no GFQM do IQ/UNESP, a uma taxa de tração de 0,8 MPa s-1. Para a medida de adesão entre os revestimentos e os substrates metálicos, um pino de alumínio com 10 mm de diâmetro é colado sobre a superfície do filme, utilizando cola Araldite, e então o equipamento faz uma força constante até o descolamento do filme. Para cada amostra foi considerado o valor médio de 2 medições. Para avaliar a uniformidade dos revestimentos depositados sobre os substratos metálicos foi realizada microscopia óptica, utilizando um microscópio óptico Kozo, modelo XJM900, instalado no GFQM (IQ/UNESP). Microscopia de força atômica (AFM) foi utilizada para avaliar a morfologia da superfície dos revestimentos depositados sobre aço carbono e Ti6Al4V. Foi utilizado um microscópio de força atômica, Keysight, modelo 5500 (instalado no GFQM do IQ/UNESP), no modo contato intermitente (tapping mode). A partir da imagem de topografia de 1 µm2 foi obtida a rugosidade RMS (root means square) e rugosidade média (Ra) da superfície, medida com o software Gwyddion. Espectroscopia de fotoelétrons induzidos por raios-X (XPS) foi utilizada para determinar a composição elementar e para monitorar as mudanças do ambiente das ligações químicas do carbono (C 1s), oxigênio (O 1s), titânio (Ti 2p), zircônio (Zr 3d) e cério (Ce 3d), presentes nos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2, depositados sobre aço carbono. As análises foram realizadas usando o equipamento UNI-SPECS UHV Surface Analysis System, instalado no GFQM do IQ/UNESP. A excitação dos fotoelétrons foi realizada com a radiação Al Kα (hν = 1486,6 eV), focalizada na amostra com uma área de medida de 1 mm2, e para obtenção dos espectros de alta resolução foi utilizada uma energia de passagem de 10 eV. A composição atômica da região superficial (< 5 nm) foi determinada a partir da razão das intensidades dos picos corrigidos pelos fatores de sensibilidade de orbitais dos elementos correspondentes. Na análise da estrutura local foi utilizado o software CasaXPS para deconvolução dos espectros utilizando funções de combinações Gaussianas e Lorentzianas (Voigt) e linha base tipo Shirley. A espectroscopia na região do infravermelho fornece informações estruturais que são essenciais para caracterização de materiais, como presença de grupos funcionais, ligações simples, duplas e triplas. Esta técnica foi utilizada para monitorar a polimerização do PMMA, formação das fases inorgânicas e também para análise da ligação covalente entre as fases orgânica e inorgânica. As medidas foram realizadas em um espectrofotômetro na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), VERTEX 70 da BRUKER, 40 instalado no IQ/UNESP, no intervalo de 4000-400 cm-1, utilizando o acessório de reflexão total atenuada (ATR- attenuated total reflectance) que permite análise de amostras sólidas e líquidas sem necessidade de preparação. As medidas de FTIR foram obtidas dos revestimentos depositados sobre substrato de aço carbono, e as amostras líquidas de MMA e HEMA foram obtidas diretamente do reagente líquido. A técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) permite o estudo da nanoestrutura de materiais, podendo ser obtido o tamanho, distribução e forma de nanopartículas espalhadoras. Em experimentos de SAXS, um feixe de raios-X é incidido perpendicularmente na amostra e o espalhamento elástico de baixo ângulo produzido pela amostra, que possui variações locais em sua densidade eletrônica, é gravado pelo detector. O perfil da intensidade de radiação espalhada pela amostra, I(q), é então obtido em função do vetor de espalhamento, q, relacionado com o ângulo de espalhamento, θ, pela expressão q = (4π/λ)sen(θ/2). As medidas de SAXS dos monolitos sólidos não suportados de PMMA- TiO2 e PMMA-ZrO2 foram realizadas no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas), utilizando radiação síncrotron monocromatizada com comprimento de onda (λ) de 1,548 Å, e detector 2D, Dectris Pilatus 300k. Os espectros de SAXS foram obtidos com tempo de exposição de 60 s, e cada perfil da intesidade foi normalizado para levar em consideração a variação da intensidade da radiação síncrotron com o tempo. Os híbridos PMMA-CeO2 não formaram monolitos homogêneos e, portanto, este híbrido foi estudado depositado na forma de filme sobre substrato de mica, que é transparente a raios-X. As medidas de SAXS dos híbridos PMMA-CeO2 foram realizadas em um equipamento Xenocs XEUSSTM, localizado no Instituto de Física da Universidade de São Paulo. A radiação foi gerada por uma fonte GENIXTM (borda Cu Kα, I = 1,54 Å), focalizada perpendicularmente à amostra, e a luz espalhada foi medida por um detector 2D, Dectris PilatusTM 300k. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi utilizada para confirmar as nanoestruturas dos híbridos propostas pelos dados de SAXS. Os monolitos não suportados de PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 foram cortados em pequenos pedaços, colocados em um molde, neste molde foi adicionado resina Spurrs/Quetol, e após a cura da resina (65 °C/24 h), as amostras embutidas foram cortadas com um ultramicrótomo Reichert/Leica UltraCut E, usando faca de diamante. As amostras foram transferidas para grades de cobre (200 mesh hexagonal, Electron Microscopy Sciences) e analisadas por um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-1010 a 80 kV (instalado na Northeastern University, Estados Unidos). Para os monolitos não suportados híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-CeO2 foi 41 realizada microscopia eletrônica de transmissão de varredura acoplada a espectroscopia de raios-X por energia dispersiva (STEM-EDS) em um microscópio eletrônico de transmissão (JEOL, JEM 2100F) operando a 200 kV e usando um suporte refrigerado com nitrogênio líquido (modelo 636-Gata) no Laboratório de Microscopia Eletrônica (LME/LNNano) do CNPEM (Campinas, Brasil). Para este propósito as amostras foram embebidas e curadas em resina Eponate (Tedpella 18012) a 60 °C durante 12 h, posteriormente cortadas em fatias ultrafinas com ultramicrótomo (RMC PT-XL) e então colocadas em uma grade de cobre (PELCO Center-Marked Grids, 200 mesh). O tamanho das nanopartículas de óxido de cério, exibidos na forma de histograma, foi adquirido da imagem STEM usando o software ImageJ. Para a análise da seção transversal dos revestimentos PMMA-CeO2 depositados em aço carbono por microscopia eletrônica de varredura acoplada à espectroscopia de raios-X por energia dispersiva (MEV-EDS), as amostras foram cortadas, embebidas em resina condutora, polidas e revestidas com carbono (~ 10 nm) para evitar carregamento. Um microscópio eletrônico de varredura (JEOL JSM-IT300) foi empregado para obter as imagens de perfil da seção transversal dos revestimentos a 10 kV de tensão de aceleração. Os perfis elementares da composição química foram obtidos por varreduras de linhas integradas gravadas ao longo do eixo z, usando um detector EDS Oxford Instruments SDD X-MaxN para análise de raios-X. Medidas de ângulo de contato dos revestimentos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 modificados com hidroxiapatita e β-TCP, e depositados em Ti6Al4V, foram realizadas para estimar a energia livre de superfície e a energia livre interfacial de adesão. Água deionizada e diiodometano foram colocados em seringas e gotejados sobre os revestimentos usando um equipamento Phoenix 150 (localizado na Northeastern University, Estados Unidos), e o valor do ângulo de contato (θ) de cada gota foi medido através do software SCA20.2.0. Para cada amostra e líquido foram realizadas 5 medidas e então calculado um valor médio de ângulo de contato. A partir dos valores de θ com água e diiodometano foi possível calcular a energia livre de superfície (γ) dos materiais, assim como sua componente dispersiva (γd) e polar (γp) usando a equação de Owens-Wendt [56]: 1 + cos 𝜃 = 2√𝛾𝑠 𝑑 ( √𝛾𝑙 𝑑 𝛾𝑙 ) + 2√𝛾𝑠 𝑝 ( √𝛾𝑙 𝑝 𝛾𝑙 ) Eq. (1) onde θ é o ângulo de contato medido entre o sólido e o líquido (diiodometano ou água), 𝛾𝑠 𝑑 é a componente dispersiva e 𝛾𝑠 𝑝 é a componente polar da energia livre de superfície dos 42 materiais analisados, 𝛾𝑙 é a energia livre de superfície do líquido (diiodometano igual a 50.8 mJ/m2 ou água igual a 72.8 mJ/m2), 𝛾𝑙 𝑑 é a componente dispersiva do líquido (diiodometano igual a 50.8 mJ/m2 ou água igual a 21.8 mJ/m2) e 𝛾𝑙 𝑝 é a componente polar do líquido (diiodometano igual a 0 mJ/m2 ou água igual a 51 mJ/m2). A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada para obtenção da estabilidade térmica dos híbridos desenvolvidos, e análise da proporção entre fase orgânica e inorgânica. As análises de TGA dos monolitos híbridos não suportados foram realizadas em um equipamento TA Instruments SDT Q600, localizado no GFQM (IQ/UNESP), com as seguintes condições: atmosfera de nitrogênio com fluxo contínuo de 100 mL min-1, massa da amostra de aproximadamente 7 mg em cadinho de alumina, variação da temperatura entre 25 e 800 °C com taxa de aquecimento de 5 °C min-1. 3.2.2 Eficiência anticorrosiva dos revestimentos Medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) em função do tempo foram utilizadas para verificar a eficiência anticorrosiva dos revestimentos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2, depositados sobre substrato metálico. A célula eletroquímica utilizada para medidas de EIS foi constituída por três eletrodos: (1) substrato metálico revestido com filme híbrido como eletrodo de trabalho, (2) rede de platina como contra- eletrodo, e (3) um eletrodo Ag|AgCl| KClsat como referência, conectado a um fio de platina por um capacitor de 0,1 μF (Figura 13). A frequência de varredura foi de 1 MHz a 5 mHz, utilizando-se o potenciostato Gamry Reference 600, instalado no GFQM (IQ/UNESP). Para a realização das medidas de EIS, foi aplicado uma perturbação senoidal de potencial de 10 mVrms após verificar o valor do potencial de circuito aberto por 5 minutos. Eletrodo de trabalho: substrato metálico revestido com área exposta igual a 1 cm2 Eletrodo de referência: Ag|AgCl| KClsat Contra-eletrodo: rede de platina Capacitor de 0,1 μF entre fio de platina e referência Solução: NaCl 3,5% Figura 13. Célula eletroquímica utilizada para as medidas de EIS. 43 Para os revestimentos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2 depositados sobre aço carbono, utilizou-se 80 mL de uma solução aquosa de NaCl 3,5% a 25 °C. Para os revestimentos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 modificados com hidroxiapatita e β-TCP, depositados sobre Ti6Al4V, utilizou-se 80 mL de uma solução de fluido de corpo simulado (simulated body fluid – SBF) a 37 ºC. O fluido de corpo simulado, ou plasma humano sintético, é uma solução com concentração iônica semelhante à do plasma sanguíneo humano, mantida sob as mesmas condições fisiológocas de pH e temperatura. A Tabela 2 apresenta os reagentes adicionados para produção da solução de SBF, seguindo a norma ISO 23317:2007. Kokubo e seus colaboradores desenvolveram esse fluido a fim de reproduzir a formação de apatita em materiais bioativos in vitro [60]. Este fluido pode ser utilizado não apenas para a avaliação da bioatividade de materiais artificiais in vitro, mas também para análise da eficiência contra corrosão dos revestimentos. Tabela 2. Reagentes utilizados para produção de 1 L de solução de SBF, com pH 7,4. Ordem Reagente Massa/Volume 1 NaCl 8,035 g 2 NaHCO3 0,355 g 3 KCl 0,225 g 4 K2HPO4.3H2O 0,231 g 5 MgCl2.6H2O 0,311 g 6 HCl (1 mol/L) 39 ml 7 CaCl2 0,292 g 8 Na2SO4 0,072 g 9 (CH2OH)3CNH2 6,057 g 10 HCl (1 mol/L) 0 – 5 ml Para obter maiores informações sobre as propriedades eletroquímicas dos revestimentos de PMMA-CeO2, as curvas EIS registradas para diferentes períodos de imersão foram modeladas com um circuito elétrico equivalente. A capacitância foi substituída por elementos de fase constante (CPE) para levar em conta sua não idealidade. A capacitância efetiva do revestimento foi calculada usando a seguinte equação [61]: C = Q1/n R(1−n)/n Eq. (2) https://pt.wikipedia.org/wiki/Plasma 44 onde Q e n são parâmetros do CPE, e R é a resistência do filme, obtidos como parâmetros do ajuste usando o software Zview. Todos os ajustes de EIS foram considerados confiaveis para χ2 menor que 10-3. 3.2.3 Propriedade de self-healing do híbrido PMMA-CeO2 sobre aço carbono Revestimentos PMMA-CeO2 foram riscados artificialmente através de um indentador com ponta de diamante para estudo da propriedade de self-healing. Os filmes riscados foram analisados antes e após imersão em meio salino por microscopia óptica, EIS, XPS e microsopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de MEV foram realizadas no IQ/UNESP com um microscópio da marca JEOL 71500F. Os riscos foram aplicados com um indentador mecânico Nanovea PB1000, localizado no Departamento de Engenharia de Materiais (USP-São Carlos), em forma de cruz com 4 mm de comprimento, utilizando ponta de diamante com geometria cônica (raio de 200 µm) e carga constante de 15 N. 3.2.4 Caracterização biológica dos híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 sobre Ti6Al4V Anteriormente aos ensaios biológicos, células osteoblásticas fetais humanas (hFOB 1.19, ATCC® CRL-11372TM) foram cultivadas em um meio contendo 89% de DMEM/F- 12 (1:1) (1x) (Gibco), 10% de soro bovino fetal (FBS, ATCC) e 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), em uma incubadora (Thermo Scientific) a 34 °C, umidificada e com 5% de CO2. As células foram usadas em números de passagem entre 5- 10. O DMEM é um fluido acelular que contem glicose, aminoácidos e vitaminas, enquanto o FBS fornece ácidos graxos, fatores de crescimento, aminoácidos e vitaminas, essenciais para o crescimento das células. Os revestimentos de PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 com melhores resultados em relação a eficiência contra corrosão foram modificados com fosfatos de cálcio e depositados em substratos de Ti6Al4V (3 mm x 25mm x 25 mm). Após o tratamento térmico, essas amostras foram cortadas com serra em pedaços de 3 mm x 5 mm x 5 mm, limpas com etanol e esterilizadas em autoclave a 121 °C por 30 min. Para a realização das medidas biológicas, os substratos com e sem revestimento foram colocados em placas de 48 poços para cultura de células (Figura 14). 45 Figura 14. Representação esquemática das placas de 48 poços para cultura de células contendo as amostras: PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 depositados sobre liga Ti6Al4V, e substrato não revestido. Ensaios de MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazólio) foram realizados para determinar a citotoxicidade dos revestimentos híbridos depositados sobre Ti6Al4V. As amostras foram colocadas em duas placas para cultura de células (cultura por 24 h e 7 dias), e enxaguadas duas vezes com 0,5 ml de tampão fosfato-salino (phosphate buffered saline - PBS) para remover quaisquer detritos possíveis. 400 µl de uma solução de células osteoblásticas com concentração de 50000 células/ml foi adicionado a cada poço, o que levou a uma densidade de 2×104 células por poço. Como controle foram utilizados poços contendo apenas a solução de células, sem a presença de amostra. As placas foram incubadas por 1 e 7 dias a 34 °C, e o meio foi trocado a cada 48 horas. Após o tempo de incubação, o meio foi aspirado e 400 µl de uma solução contendo uma mistura de 2 ml de MTS e 10 ml de meio, a 37 oC, foi adicionado a cada poço e incubado por 3 h/34 °C. Em seguida, 200 μL destas soluções foram transferidos para uma placa de 96 poços e a absorbância foi lida no comprimento de onda de 490 nm no espectrofotômetro SpectraMax® M3, Molecular Devices, localizado na Northeastern University, Estados Unidos. 46 Semelhante ao ensaio de MTS, as células osteoblásticas foram cultivadas por 24 h a 34 °C em uma placa de 48 poços contendo as amostras e uma densidade de 2×104 células por poço. Após 24 h, o meio foi removido e 0,5 ml de PBS (2x) foram usados para lavar as amostras de modo a remover as células não aderentes. Em seguida, as amostras foram fixadas quimicamente em 0,5 ml de paraformaldeído (solução 4% em PBS, Alfa Aesar) à temperatura ambiente por 10 min e lavadas duas vezes com 0,5 ml de PBS. Posteriormente, 0,5 ml de Triton X-100 (Sigma) a 0,1% em PBS foram adicionados a cada poço e deixados durante 10 min à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, 0,5 ml de solução tampão de bloqueio contendo 0,1% de albumina de soro bovino (Sigma) em PBS foi deixado a 4 °C. No dia seguinte, a solução tampão de bloqueio foi removida e 0,5 ml de solução de FluorTM 488 Phalloidim (Thermo Fisher Scientific) (10 µl de Alexa Fluor para cada 10 ml de solução tampão de bloqueio) foram adicionados e a placa foi incubada no escuro por 20 min à temperatura ambiente. As amostras foram lavadas duas vezes com PBS, 5 min por lavagem, e depois foi adicionado 0,5 ml de penta-hidrato Hoechst 33258 (bis-benzimida) (Thermo Fisher Scientific) (a 1 µg por 1 ml de água desionizada) durante 10 min no escuro. Finalmente, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS e visualizadas com um microscópio de fluorescência (Zeiss), localizado na Northeastern University, Estados Unidos. Ensaio de deposição de Ca2+ foi realizado com um kit QuantiChromTM (DICA- 500, Bioassay Systems) para medir a concentração de cálcio presente nas amostras após 7, 14 e 21 dias de cultura de osteoblastos. Primeiramente, as amostras esterilizadas foram colocadas em uma placa de 48 poços e enxaguadas duas vezes com 0,5 ml de PBS. Após a remoção do PBS, foram adicionados 500 µl de uma solução de células osteoblásticas com concentração de 50000 células/ml em cada poço, o que levou a uma densidade de 2,5 x 104 células por poço. As placas foram incubadas a 34 °C durante 7, 14 e 21 dias, renovando o meio a cada 48 h. Após o tempo de incubação, o meio foi aspirado e as amostras foram lavadas duas vezes com 0,5 ml de água deionizada esterilizada para remover os íons Ca2+ no meio. Depois da lavagem, adicionou-se 0,5 ml de HC1 0,6 M a cada poço e a placa foi colocada em agitação durante 4 h à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de 500 µl foi transferida para um tubo de centrífuga e centrifugada a 11000 rpm por 3 min. Enquanto isso, a solução de trabalho do kit QuantiChromTM foi preparada, misturando os reagentes A e B pré-aquecido a 37 °C a relação 1: 1. Utilizando uma placa de 96 poços, adicionou-se 5 µl de cada amostra aos poços e misturou-se com 200 µl de solução de trabalho. A placa 47 foi incubada durante 3 min à temperatura ambiente e a densidade óptica foi medida a 612 nm, utilizando um espectrofotômetro (SpectraMax® M3, Molecular Devices), localizado na Northeastern University, Estados Unidos. A intensidade da cor medida a 612 nm foi correlacionada com a concentração de cálcio através de uma curva de calibração. A atividade da fosfatase alcalina (ALP) foi medida por um kit comercial (QuantiChromTM Alkaline Phosphatase Assay Kit, DALP-250, Bioassay Sistems) após 7, 14 e 21 dias de cultura de osteoblastos nas amostras. Este kit usa p-nitrofenil fosfato (pNPP) na solução de trabalho, que se torna amarelo (ODmax = 405 nm) quando desfosforilado pela enzima fosfatase alcalina presente na amostra. As amostras esterilizadas foram adicionadas a uma placa de 48 poços e enxaguadas duas vezes com 0,5 ml de PBS. Após a remoção do PBS, foram adicionados 500 µl de uma solução de células osteoblásticas com concentração de 50000 células/ml em cada poço, o que levou a uma densidade de 2,5x104 células por poço. As placas foram incubadas a 34 °C durante 7, 14 e 21 dias, mudando o meio a cada 48 h. Após o tempo de incubação, o meio foi aspirado e as amostras foram lavadas duas vezes com 0,5 ml de PBS. Após lavagem, adicionou-se 0,5 ml de Triton X-100 a 0,2% em água deionizada em cada poço e a placa foi colocada em agitação durante 20 min à temperatura ambiente. Enquanto isso, foi preparada a solução de trabalho do kit de ensaio, misturando para cada ensaio de 96 poços os seguintes reagentes a temperatura ambiente: 200 µl de tampão, 5 µl de acetato de Mg e 2 µl de pNPP. Para prosseguir com o ensaio, adicionou-se 50 µl de cada amostra aos poços de uma placa de 96 poços e misturou-se com 150 µl de solução de trabalho. A densidade óptica foi medida a 405 nm, a 0 min e novamente após 4 min, usando um espectrofotômetro (SpectraMax® M3, Molecular Devices), localizado na Northeastern University, Estados Unidos. Para o cálculo da atividade da ALP (UI/L - µmol/(L.min)) foi utilizada a seguinte equação: 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝐴𝐿𝑃 = (𝑂𝐷𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡−𝑂𝐷𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 0) .1000 .𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑟𝑒𝑎çã𝑜 𝑡 .ԑ .𝑙 . 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 Eq. (3) 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝐴𝐿𝑃 = (𝑂𝐷𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡−𝑂𝐷𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 0) (𝑂𝐷𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒−𝑂𝐷á𝑔𝑢𝑎) 𝑥 35.3 Eq. (4) Onde, ODamostra t e ODamostra 0 são as densidades ópticas medidas a 405 nm no tempo 4 e 0 min, respectivamente. O fator 1000 converte mmol/L em µmol/L. t é o tempo de incubação em min (t = 4 min). Para p-nitrofenol, ԑ = 18.75 mM-1 cm-1. O caminho óptico, l (cm), é calculado para um prato de 96 poços a partir do calibrante, l = (ODcalibrante – 48 ODágua)/(ԑ c). O volume de reação foi igual a 200 µl e o volume de amostra foi igual a 50 µl. A adsorção de proteínas (vitronectina e albumina de soro bovino-BSA) nos revestimentos híbridos foi quantificada pelo ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA). Para o teste de adesão de proteínas utilizando vitronectina, as amostras foram colocadas em uma placa de 48 poços, foi adicionado 0,4 ml de solução de vitronectina (5 µg/ml) e a placa foi mantida dentro de uma incubadora a 34 °C durante 1 dia. Após este tempo, as amostras foram transferidas para uma nova placa, lavadas duas vezes com PBS e 0,4 ml de tampão RIPA (Thermo Fisher Scientific) foi adicionado a cada poço para a solubilização das proteínas. Após 10 min em contato com o tampão, a solução dentro dos poços foi misturada com a pipeta para garantir a homogeneidade. Utilizando uma placa de 96 poços, foi misturado 25 µl das amostras com 200 µl de reagente de trabalho do kit PierceTM BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). A placa foi colocada em um agitador por 30 s e incubada a 37 ºC por 2 h. Após a incubação, a placa foi deixada esfriar até à temperatura ambiente e a absorbância foi medida a 562 nm utilizando um espectrofotômetro (SpectraMax® M3, Molecular Devices), localizado na Northeastern University, Estados Unidos. Para o teste de adesão de proteínas utilizando BSA, o mesmo protocolo foi realizado, mas a concentração inicial de proteína foi de 2 mg/ml e o tempo de incubação a 37 °C foi de 30 min. Para ambas as proteínas, foi utilizada uma curva de calibração para obter a concentração de proteína a partir dos valores medidos de absorbância. Todos os dados biológicos estão expressos como média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada com o software GraphPad Prism usando one-way ANOVA, seguido pelo teste de Tukey. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significantes quando p <0,05. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Como os híbridos estudados neste trabalho são materiais nunca reportados, vários parâmetros de síntese foram variados para obtenção de materiais homogêneos e estáveis para deposição de filmes. Após cada síntese os híbridos foram caracterizados, e levando em consideração os resultados obtidos, os parâmetros foram variados visando a otimização do material. Os resultados obtidos para os híbridos PMMA-CeO2, PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 (Figura 15) estão divididos em três seções, e na quarta seção os resultados para os híbridos PMMA-TiO2 e PMMA-ZrO2 modificados com hidroxiapatita e β-TCP são apresentados. 49 Figura 15. Estrutura molecular dos híbridos PMMA-TiO2, PMMA-ZrO2 e PMMA-CeO2. 4.1 PMMA-CeO2 Inicialmente foram realizadas sínteses de PMMA-CeO2 com baixa proporção molar de monômero (1Ce:8MMA), baseado em híbridos PMMA-SiO2 reportados na literatura com alto desempenho anticorrosivo [62,63], mas os híbridos resultantes não formaram um filme homogêneo sobre o aço carbono e, portanto, foi aumentada significativamente a quantidade de MMA. Além da proporção molar entre os reagentes (Ce:HEMA:MMA), a quantidade de iniciador térmico, o tempo de síntese, o método e parâmetros de deposição, e o tratamento térmico foram variados. As amostras que apresentaram melhores resultados em termos de eficiência anticorrosiva são 1Ce2HEMA20MMA, 1Ce2HEMA25MMA e 1Ce2HEMA30MMA, depositadas por dip-coating sobre aço carbono e com tratamento térmico prolongado (60 ºC/24 h, 80 ºC/24 h, 100 ºC/24 h e 160 ºC/3 h). Estes revestimentos apresentaram espessuras em torno de 10 µm, medidas por interferência óptica. Para caracterização inicial dos revestimentos híbridos foi utilizada a técnica de EIS, que fornece a resistência à corrosão de materiais; quanto maior o módulo da impedância para frequência f → 0, maior a eficiência, e quanto maior o tempo de vida do revestimento com valores de impedância altos, melhor a durabilidade. A impedância medida, Z(ω), é composta de uma parte real e uma imaginária, e pode ser representada como um vetor de comprimento |Z|, onde |Z| = (Z2 real + Z2 imag) 1/2. Medidas de EIS dos revestimentos PMMA-CeO2 depositados sobre aço carbono foram realizadas em solução de NaCl 3,5 wt.% para diferentes tempos de imersão (Figura 16). As medidas de EIS do substrato de aço carbono não revestido e do PMMA puro 50 depositado sobre aço carbono foram realizadas para fins de comparação (Figura 16a). Após 1 dia imerso em solução salina, o aço carbono não revestido é completamente corroído e apresenta um módulo de impedância de 5 kΩ cm2 (Figura 16a). O revestimento de PMMA puro depositado sobre aço carbono apresentou módulo de impedância de 6 kΩ cm2 após 1 dia imerso em solução salina, praticamente igual ao substrato não revestido, consequência da falta de aderência e baixa conectividade da estrutura quando apenas a fase orgânica está presente (Figura 16a). A amostra 1Ce2HEMA20MMA (Figura 16a), contendo a menor quantidade de fase orgânica, apresentou baixa resistência à corrosão, com módulo de impedância de 13 kΩ cm2 após 1 dia de imersão em solução salina, apenas uma ordem de gradeza maior que o aço carbono não revestido. No entanto, para a amostra 1