NADJA NARA PEREIRA DA SILVA INFLUÊNCIA DE SIMBIONTES NA APTIDÃO DE Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) E Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) E POTENCIAL DE PRODUTOS ANTIMICROBIANOS NA REDUÇÃO DA INFECÇÃO DE Nosema sp. Botucatu 2021 NADJA NARA PEREIRA DA SILVA INFLUÊNCIA DE SIMBIONTES NA APTIDÃO DE Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) E Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) E POTENCIAL DE PRODUTOS ANTIMICROBIANOS NA REDUÇÃO DA INFECÇÃO DE Nosema sp. Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). Orientadora: Regiane Cristina de Oliveira Botucatu 2021 A minha mãe, Maria da Cruz A minha irmã, Wanessa Aos meus avós, Floriza e José (in memoriam), dedico AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida. A toda minha família por sempre estarem presentes em todos os momentos de minha vida, motivando e torcendo por mim. A Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA/UNESP), Campus de Botucatu, em especial ao Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas e todos os professores pelos valorosos ensinamentos repassados, os quais permitiram o mesmo crescimento profissional. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. A minha orientadora profa. Dra. Regiane Cristina de Oliveira, pela confiança depositada em mim, pela orientação, ensinamentos, conselhos e pelo grande exemplo profissional. A todos os integrantes do AGRIMIP pela amizade, momentos de descontração e apoio durante minha trajetória acadêmica. A meus queridos amigos que Botucatu, em especial a Carolane, João Pedro, Bruna, Leticia, Ana Beatriz. A Vanessa Rafaela de Carvalho pela amizade, ensinamentos e pelo auxilio na execução das análises moleculares. Ao professor Carlos Frederico Wilcken pela disponibilização dos laboratórios do LCBPF, para execução dos experimentos de morfometria. A professora Silvia Renata Siciliano Wilcken pela disponibilização dos laboratórios de Biologia Molecular, para execução dos experimentos de morfometria. A todos que direta e indiretamente fizeram parte desta conquista, os meus sinceros agradecimentos! RESUMO A utilização de Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) na regulação populacional da broca-da-cana, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) está entre os programas de controle biológico aplicado mais eficiente e reconhecido mundialmente. Entretanto, a qualidade deste parasitoide pode ser comprometida devido a contaminações pelo microsporídio Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) em produções massais de D. saccharalis, o que compromete a eficiência de C. flavipes. Exemplos como este, demonstram a relevância de compreender as interações simbióticas e o efeito de tais associações em populações de D. saccharalis e C. flavipes, a fim de detectar possíveis alterações biológicas e morfológicas mediadas pela ação desses microrganismos, bem como alternativas que mitiguem os efeitos deletérios de tal associação. Com isso, este trabalho objetivou detectar a presença dos simbiontes facultativos do gênero Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis e Nosema em D. saccharalis e C. flavipes, bem como, avaliar o efeito da infecção por esses microrganismos no desenvolvimento do seu hospedeiro; avaliar as alterações morfológicas em C. flavipes ocasionadas pela infecção de Nosema sp. e o potencial de óleos essenciais e produtos antimicrobianos na redução da infecção de Nosema sp. em D. saccharalis. Para isso, foi realizado PCR diagnóstico por meio de primers específicos para a detecção dos organismos simbiontes e as características biológicas e morfológicas do hospedeiro infectado e não infectado foram comparadas. Foram analisadas a atividade de voo e as deformações de C. flavipes mantidas em lagartas de D. saccharalis não contaminadas e contaminadas com 1x10¹; 1x10²; 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta e foram avaliados o potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de: Cymbopogon citratus, Schinus terebinthifolius, Baccharis dracunculifolia, Origanum vulgare e Syzygium aromaticum e dos antibióticos: Albendy® (Albendazol), Flagimax® (Metronidazol) e Pletil® (Tinidazol) na redução da infecção de Nosema sp. em D. saccharalis, bem como, avaliados os efeitos do tratamento na biologia deste lepidóptero e de C. flavipes. Nas amostras de D. saccharalis analisadas não foi detectada a presença das espécies de simbiontes estudadas. Em C. flavipes foi detectada a presença do endossimbionte Wolbachia, sendo que, tal associação resultou em alterações biológicas neste parasitoide. Nosema sp. compromete a capacidade de voo de C. flavipes e, isso se deve principalmente pelas alterações em medidas morfológicas e deformações nas asas ocasionadas pela infecção desse patógeno no parasitoide. Nas avaliações sobre o efeito de produtos antimicrobianos no desenvolvimento de Nosema sp. os antibióticos albendazol (0,5 mg/mL) e metronidazol (1 mg/mL) e os óleos essenciais de S.aromaticum (0,01%), O. vulgare (0,01%) e de S. terebinthifolius (0,02 e 0,05%) demostraram maior redução na infecção deste microsporídio em D. saccharalis, os quais apresentaram pouco ou nenhum efeito deletério em parâmetros biológicos deste lepidóptero e em C. flavipes. Os resultados apresentados neste estudo evidenciam a importância do controle de qualidade durante o processo de produção massal de inimigos naturais, bem como, fornecem informações que servirão como base para o aprimoramento e manutenção da qualidade de C. flavipes. Palavras-chave: controle biológico; broca-da-cana; parasitoide larval; microsporídio; controle de qualidade. ABSTRACT The use of Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) in the population regulation of sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) is among the most efficient and recognized biological control programs applied worldwide. However, the quality of this parasitoid may be compromised due to contamination by the intracellular parasite Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) in mass productions of D. saccharalis, which compromises the efficiency of C. flavipes. Examples such as this demonstrate the relevance of understanding the symbiotic interactions and the effect of such associations on populations of D. saccharalis and C. flavipes, in order to detect possible biological and morphological changes mediated by the action of these microorganisms, as well as alternatives that reduce the deleterious effects of such association. With this, this work aimed to detect the presence of facultative symbionts of the genus Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis and Nosema in D. saccharalis and C. flavipes, as well as to evaluate the effect of infection by these microorganisms on the fitness of their host; to evaluate morphological changes in C. flavipes caused by Nosema sp. infection and the potential of antimicrobial products in reducing Nosema sp. infection in D. saccharalis. For this, diagnostic PCR was performed by means of specific primers for the detection of symbiont organisms and the biological and morphological characteristics of the infected and non-infected host were compared. Flight activity and deformations of C. flavipes maintained in caterpillars of D. saccharalis not contaminated and contaminated with 1x10¹ were analyzed; 1x10²; 1x10³ spores of Nosema sp./caterpillar and the antimicrobial potential of essential oils of: Cymbopogon citratus, Schinus terebinthifolius, Baccharis dracunculifolia, Origanum vulgare and Syzygium aromaticum and antibiotics were evaluated: Albendy® (Albendazole), Flagimax® (Metronidazole) and Pletil® (Tinidazole) in reducing Nosema sp. in D. saccharalis, as well as, evaluated the effects of treatment on the biology of this lepidopteran and C. flavipes. In the samples of D. saccharalis analyzed, the presence of the species of symbionts studied was not detected. In C. flavipes, the presence of the endosymbiont Wolbachia was detected, and this association resulted in biological changes in this parasitoid. Nosema sp. compromises the flight capacity of C. flavipes and, this is mainly due to changes in morphological measurements and deformations in the wings caused by infection of this pathogen in the parasitoid. In the evaluations on the effect of antimicrobial products on the development of Nosema sp. albendazole (0.5 mg/mL) and metronidazole (1 mg/mL) and essential oils of S.aromaticum (0.01%), O. vulgare (0.01%) and S. terebinthifolius (0.02 and 0.05%) showed a greater reduction in infection of this microsporidium in D. saccharalis, which showed little or no deleterious effect on biological parameters of this lepidopterum and in C. flavipes. The results presented in this study show the importance of quality control during the mass production process of natural enemies, as well as provide information that will serve as a basis for the improvement and maintenance of the quality of C. flavipes. Keywords: biological control; sugarcane borer; larval parasitoid; microsporidium; quality control. LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO 1 - ASSOCIAÇÃO E INFLUÊNCIA DE SIMBIONTES NA APTIDÃO DE Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) E Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) Figura 1 - Características biológicas de Cotesia flavipes infectada (W+) e não (W-) infectada por Wolbachia. Desenvolvimento (dias) ovo-pupa (A) e pupa-adulto (B), viabilidade de pupas (C) e razão sexual (D). As letras diferentes dentro de cada gráfico são significativamente diferentes entre si (Teste de Wilcoxon Mann-Whitney p <0,05) ........................ 39 Figura 2 - Sobrevivência de Cotesia flavipes infectada (W+) e não infectada (W-) por Wolbachia. Fêmeas (W+ e W-) (A) e machos (W+ e W-) (B). Teste de LogRank (p < 0,05)....................................................................... 40 Figura 3 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento da asa direita (B), largura da asa anterior direita (C) e comprimento da tíbia direita (D) de fêmeas e machos de Cotesia flavipes infectada (W+) (caixas pretas) e não infectada (W-) (caixas brancas) por Wolbachia (W-). Os gráficos de caixas representam a mediana e os quartis médios de 75 e 25%, os bigodes representam os limites superior e inferior e os pontos representam os valores discrepantes. As letras diferentes dentro de cada gráfico são significativamente diferentes entre si (Teste t p <0,05) .................................................................. 41 Figura 4 - Porcentagem de adultos voadores, caminhadores e não voadores de Cotesia flavipes previamente infectados (W+) e não (W-) infectados por Wolbachia. Os gráficos de caixas representam a mediana e os quartis médios de 75 e 25%, os bigodes representam os limites superior e inferior e os pontos representam os valores discrepantes. Colunas com a mesma letra minúscula (entre as populações) e maiúscula (dentre a população) não são significativamente diferentes entre si pelos teste de Wilcoxon Mann- Whitney e de Kruskal-Wallis p < 0,05, respectivamente ................... 42 CAPÍTULO 2 - ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS DE Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) EM DECORRÊNCIA DA INFECÇÃO DE Nosema sp. (MICROSPORA: NOSEMATIDAE) Figura 1 – Unidade para teste de voo de Cotesia flavipes. Fonte: Adaptado de Prezotti et al. (2002) .................................................................... 57 Figura 2 - Adultos voadores (%), caminhadores (%) e não voadores (%) de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula (entre as populações) e maiúscula (dentre a população) não são significativamente diferentes entre si (Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) .................................................................................................. 60 Figura 3 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento do tórax (B), largura do tórax (C), comprimento do abdome (D), largura do abdome (E), comprimento da tíbia (F), comprimento da asa anterior direita (G) e da largura da asa anterior direita (H) de fêmeas de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes entre si (¹Teste de Tuckey ou ²Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) .................................................................... 62 Figura 4 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento do tórax (B), largura do tórax (C), comprimento do abdome (D), largura do abdome (E), comprimento da tíbia (F), comprimento da asa anterior direita (G) e da largura da asa anterior direita (H) de machos de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes entre si (¹Teste de Tuckey ou ²Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) .................................................................... 64 Figura 5 - Deformações em Cotesia flavipes (Hymenoptera: Braconidae) em decorrência da infecção por Nosema sp. ...................................... 65 Figura 6 - Porcentagem de fêmeas (A) e machos (B) de Cotesia flavipes com deformações em asas em decorrência da infecção da infecção por Nosema sp. em lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula (dentro de cada população) e maiúscula [entre as populações dentro de cada categoria (asas não deformadas e deformadas)] não são significativamente diferentes entre si pelos testes teste- t (p < 0,05) e de Kruskal-Wallis (p < 0,05), respectivamente ....................................................................................................... 66 Figura 7 - Porcentagem de fêmeas e machos de Cotesia flavipes com asas não deformadas (A) e deformadas (B) em decorrência da infecção da infecção por Nosema sp. em lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com letras diferentes são significativamente diferentes entre si pelos testes teste- t (p < 0,05) ......................... 67 CAPÍTULO 3 - POTENCIAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS E PRODUTOS ANTIMICROBIANOS NA REDUÇÃO DA INFECÇÃO DE Nosema sp. (MICROSPORA: NOSEMATIDAE) EM Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) Figura 1 – Mortalidade (%) de Diatraea saccharalis alimentada com dieta artificial contendo óleos essências de Cymbopogon citratus (A), Syzygium aromaticum (B), Origanum vulgare (C), Schinus terebinthifolius (D) e Baccharis dracunculifolia (E). Colunas sem e com mesma letra não diferiram estatisticamente entre si (Teste de Kruskal-Wallis p<0,05) .......................................................................................................... 86 Figura 2 – Período de desenvolvimento (dias ±EP) das fases de ovo (A), larva (B) e pupa (C) e a viabilidade (%) dos ovos (D) de Diatraea saccharalis mantidas em dietas artificiais sem e com óleos essenciais e produtos antimicrobianos. Colunas sem e com a mesma letra não diferem entre si (Teste de Kruskal-Wallis p<0,05) ............................ 89 Figura 3 – Sobrevivência de fêmeas (A) e machos (B) adultos de Diatraea saccharalis mantidas em dietas artificiais com e sem óleos essenciais e produtos antimicrobianos ............................................................... 91 Figura 4 – Período de desenvolvimento (dias) de ovo-adulto (A), viabilidade (%) de pupas (B) e razão sexual (C) de adultos de Cotesia flavipes mantidas em Diatraea saccharalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos. Colunas sem letra não diferem entre si (Teste de Kruskal-Wallis p<0,05) ............................ 92 Figura 5 – Sobrevivência de fêmeas (A) e machos (B) adultos de Cotesia flavipes mantidas em Diatraea saccharalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos .................................... 93 Figura 6 - Cromatograma do óleo essencial de Origanum vulgare obtido por meio de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas ........................................................................................................... 94 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 - ASSOCIAÇÃO E INFLUÊNCIA DE SIMBIONTES NA APTIDÃO DE Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) E Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) Tabela 1 - Lista de primers utilizados na detecção de simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes ........................................................... 32 CAPÍTULO 3 - POTENCIAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS E PRODUTOS ANTIMICROBIANOS NA REDUÇÃO DA INFECÇÃO DE Nosema sp. (MICROSPORA: NOSEMATIDAE) EM Diatraea saccharalis (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) Tabela 1 – Média (±EP) do número de esporos de Nosema sp. em lagartas de 2° instar de Diatraea saccharalis submetidas a tratamento com óleos essenciais e produtos antimicrobiano ............................................. 88 Tabela 2 – Razão sexual e peso (g) de pupas (± EP) de Diatraea saccharalis mantidas em dietas artificiais sem e com óleos essenciais e produtos antimicrobiano ................................................................ 90 SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................... 23 CAPÍTULO 1 - Associação e influência de simbiontes na aptidão de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) e Cotesia flavipes (Hymenoptera: Braconidae) ................................................ 26 1.1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 28 1.2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 29 1.2.1 Obtenção e multiplicação dos insetos .................................................... 30 1.2.3 Detecção de simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes ..... 30 1.2.3.1 Extração do DNA genômico ................................................................... 30 1.2.3.2 Reação em cadeia de polimerase (PCR) e sequenciamento ................. 31 1.2.4 Produção de linhagens de Cotesia flavipes apossimbiontes .................. 34 1.2.5 Alterações no desenvolvimento de Cotesia flavipes associada à infecção de Wolbachia ........................................................................... 35 1.2.5.1 Características biológicas ..................................................................... 35 1.2.5.2 Morfometria ............................................................................................ 36 1.2.5.3 Capacidade de voo ................................................................................ 36 1.2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................ 37 1.3 RESULTADOS ....................................................................................... 37 1.3.1 Simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes .......................... 37 1.3. Alterações no desenvolvimento de Cotesia flavipes associada à infecção de Wolbachia ........................................................................... 38 1.3.2.1 Características biológicas ..................................................................... 38 1.3.2.2 Morfometria ........................................................................................... 40 1.3.2.3 Capacidade de voo ............................................................................... 41 1.4 DISCUSSÃO .......................................................................................... 43 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 45 CAPITULO 2 - Alterações morfológicas de Cotesia flavipes (Hymenoptera: Braconidae) em decorrência da infecção de Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) ............................................ 49 RESUMO ............................................................................................... 49 2.1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 51 2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 52 2.1 Obtenção e multiplicação dos insetos .......................................................... 52 2.2 Identificação da infecção de Nosema sp. em Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes ............................................................................................ 52 2.3 Infecções de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes com esporos de Nosema sp. ............................................................................................. 54 2.3.1 Preparação do inóculo de Nosema sp. ......................................................... 54 2.3.2 Infecção das lagartas de Diatraea saccharalis ............................................. 54 2.3.3 Parasitismo de Cotesia flavipes em lagartas de Diatraea saccharalis infectadas por Nosema sp. ........................................................ 55 2.3. Efeito de Nosema sp. na capacidade de voo de Cotesia flavipes ................ 56 2.4 Alterações em medidas morfológicas de C. flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. ......................................................................... 57 2.5 Deformações em Cotesia flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. .................................................................................................. 57 2.4 Análise estatística ......................................................................................... 58 2.3 RESULTADOS ...................................................................................... 58 2.3.1 Efeito de Nosema sp. na capacidade de voo de Cotesia flavipes ........... .. 58 2.3.2 Alterações em medidas morfológicas de C. flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. ......................................................................... .. 61 2.3.3 Deformações em Cotesia flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. ............................................................................................. .. 65 2.4 DISCUSSÃO ......................................................................................... 68 REFERÊNCIAS ..................................................................................... 71 CAPÍTULO 3 - Potencial de óleos essenciais e produtos antimicrobianos na redução da infecção de Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) em Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) ................................................................... 73 RESUMO ............................................................................................... 73 ABSTRACT ........................................................................................... 74 3.1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 75 3.2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 76 3.2.1 Obtenção e multiplicação dos insetos ..................................................... .. 76 3.2.2 Obtenção e extração dos óleos essenciais ............................................. .. 77 3.2.3 Efeito dos óleos essenciais em dieta artificial sobre Diatraea saccharalis 78 3.2.4 Avaliação de óleos essências e produtos antimicrobianos no desenvolvimento da infecção de Nosema sp. em Diatraea saccharalis 79 3.2.4.1 Confirmação da infecção de Nosema sp. em Diatraea saccharalis ...... 79 3.2.4.2 Preparação do inóculo de Nosema sp. ................................................. 80 3.2.4.3 Infecção das lagartas de Diatraea saccharalis ...................................... 81 3.2.4.4 Tratamento das lagartas de Diatraea saccharalis com óleos essenciais e produtos antimicrobianos ...................................................................... 81 3.2.5 Aspectos biológicos de Diatraea saccharalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos ........................ 82 3.2.6 Aspectos biológicos de Cotesia flavipes mantidas em Diatraea sacchaalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos ..................................................................................... 83 3.2.7 Determinação do perfil químico dos óleos essenciais ........................... 84 3.2.8 Análise estatística ................................................................................. 85 3.3 RESULTADOS ....................................................................................... 85 3.3.1 Efeito dos óleos essenciais em dieta artificial sobre Diatraea saccharalis 85 3.3.2 Avaliação de óleos essenciais e produtos antimicrobianos no desenvolvimento da infecção de Nosema sp. em Diatraea saccharalis 87 3.3.3 Aspectos biológicos de Diatraea saccharalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos ........................ 89 3.3.4 Aspectos biológicos de Cotesia flavipes mantidas em Diatraea saccharalis criadas em dieta artificial contendo óleos essenciais e produtos antimicrobianos ...................................................................... 91 3.3.5 Determinação do perfil químico dos óleos essenciais ........................... 93 3.4 DISCUSSÃO .......................................................................................... 94 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 98 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................... 102 REFERÊNCIAS ..................................................................................... 103 23 INTRODUÇÃO GERAL A broca-da-cana, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) é uma importante praga da cana-de-açúcar em todo o continente americano, principalmente no Brasil, o principal produtor mundial desta cultura. Infestações desta praga em canaviais acarretam em perdas econômicas, devido aos danos diretos ocasionados pela alimentação das lagartas e pelos danos indiretos, os quais são acarretados pela presença de fungos oportunistas, que desenvolvem podridões e, com isso, diminuem o rendimento e a qualidade do açúcar e do etanol (VARGAS et al., 2015; FERREIRA et al., 2018). As larvas deste lepidóptero se desenvolvem quase que completamente dentro do colmo da planta e devido a esse comportamento o controle mais eficaz para esta praga tem sido por meio da utilização de agentes de controle biológico, com ênfase aos parasitoides. No Brasil, é utilizado o parasitoide de ovos Trichogramma galloi Zucchi (Hymenoptera: Trichogrammatidae), o parasitoide larval Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) e o parasitoide de pupa Trichospilus diatraeae (Cherian & Margabandhu) (Hymenoptera: Eulophidae) (AGROFIT, 2021). Cotesia flavipes é o agente de controle biológico mais utilizado para a regulação populacional de D. saccharalis. No Brasil, este parasitoide é amplamente produzido, sendo liberado em aproximadamente 3,5 milhões de hectares de cana-de-açúcar para o controle deste inseto, representando um dos maiores programas de controle biológico do mundo (PARRA; COELHO, 2019; FONTES et al., 2020). Apesar da eficiência e ampla utilização de C. flavipes como agente de controle de D. saccharalis, existe uma preocupação com a qualidade dos parasitoides produzidos massalmente e, isso se deve principalmente a diminuição significativa na capacidade de voo e dispersão deste parasitoide em campo nos últimos anos no Brasil (BOTELHO et al., 1980; VOLPE et al., 2014; DINARDO-MIRANDA et al., 2014). Tal ocorrência demonstra a importância do controle de qualidade durante o processo de produção massal deste parasitoide, a fim de se obter indivíduos com eficiência para controlar a praga alvo em campo. Dentre os fatores que podem está relacionado com as alterações na 24 aptidão de C. flavipes é a associação com organismos simbiontes, os quais são responsáveis por uma ampla consequência ecológica e evolutiva para as espécies hospedeiras (HARRIS et al., 2010; DICKE; POELMAN, 2020). A simbiose é um termo amplo usado para definir a associação entre duas ou mais espécies diferentes e o efeito que o simbionte tem sobre o hospedeiro, sejam benéfico (mutualismo), neutro (comensalismo) ou prejudicial (parasitismo) é utilizado para definir a forma de simbiose observada (DE BARY, 1879). Os insetos são hospedeiros naturais de inúmeros microrganismos simbiontes, os quais podem ser obrigatórios, desempenhando funções ecológicas e biológicas essenciais para a sobrevivência e facultativos, os quais muitas vezes infectam apenas uma parte da população, e são mantidos por meio do fornecimento de benefícios condicionais ou por manipulação da reprodução do hospedeiro. A eliminação desses simbiontes facultativos frequentemente resulta em pouco ou nenhum custo ou benefício aparente para o inseto hospedeiro (DOUGLAS, 1989; DURON et al., 2008; BROWNLIE; JOHNSON, 2009). Interações simbióticas mutualísticas entre polidnavírus (PDVs) e Cotesia spp. são comumente relatadas, e tal simbionte permite o desenvolvimento do parasitoide imaturo dentro do hospedeiro (STOLTZ; VINSON, 1979; HERNIOU et al., 2013; CÔNSOLI; KITAJIMA, 2017; TAN et al., 2018). São relatadas também a infecção de Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) em criações de D. saccharalis e C. flavipes, entretanto, tal associação acarreta em efeitos deletérios para estes hospedeiros (SIMÕES et al., 2012; 2015). Tais microsporídios são parasitas intracelulares obrigatórios, com aproximadamente 1400 espécies descritas representando 200 gêneros, dentre os quais estão associados a muitas espécies de invertebrados e vertebrados, incluindo os insetos (HAN; WEISS, 2017). Infecções por este microrganismo em insetos são geralmente crônicas, ocasionando patologias no hospedeiro, tais como fecundidade e longevidade reduzida (BJORNSON; OI, 2014). Infecções por Nosema sp. em criações de D. saccharalis são comuns em biofábricas brasileiras, desencadeando diversos efeitos deletérios neste lepidóptero e em C. flavipes, visto que, alterações em parâmetros biológicos e no comportamento de busca destes hospedeiros são afetados devido a contaminação pelo microsporídio (SIMÕES et al., 2012; 2015). Aliado a isto, 25 indícios que populações de C. flavipes infectadas por este patógeno apresentam capacidade de voo reduzida, com uma porcentagem maior de indivíduos caminhadores, entretanto, tais evidencias necessitam ser investigadas, a fim de associar a infecção pelo microsporídio com a redução na atividade de voo e dispersão do parasitoide (PAES, 2018). Evidências como estas, apontam a necessidade de estudos que abordem os impactos desse microsporídio em aspectos morfológicos de C. flavipes, bem como, alternativas que eliminem ou reduzam a infecção de Nosema sp. em criações de D. saccharalis e de C. flavipes. Além disso, a prospecção de novos simbiontes desses insetos deve ser investigada, a fim de detectar possíveis alterações biológicas e morfológicas mediadas pela ação desses microrganismos. Partindo disso, neste estudo serão investigados: (1) detecção de simbiontes do gênero Arsenhoponus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis e Nosema em D. saccharalis e C. flavipes mantidos em laboratório; (2) Alterações morfológicas e na capacidade de voo de C. flavipes ocasionadas pela infecção por Nosema sp. e (3) avaliar os efeitos in vivo dos antibióticos Albendy® (Albendazol) Flagimax® (Metronidazol) e Pletil® (Tinidazol) e dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus, Schinus terebinthifolius, Baccharis dracunculifolia, Origanum vulgare e Syzygium aromaticum no desenvolvimento da infecção de Nosema sp. em D. saccharalis, bem como, avaliar os efeitos de tais produtos em parâmetros biológicos deste lepidóptero e de C. flavipes. 26 CAPÍTULO 1 ASSOCIAÇÃO E INFLUÊNCIA DE SIMBIONTES NA APTIDÃO DE DIATRAEA SACCHARALIS (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) E COTESIA FLAVIPES (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) RESUMO Interações simbiônticas entre microrganismos e artrópodes podem ocasionar alterações biológicas, fisiológicas e reprodutivas na população hospedeira. Com isso, o presente estudo teve como objetivo a prospecção de simbiontes facultativos do gênero: Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis e Nosema em Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) e Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) mantidos em laboratório, bem como, avaliar a influência da infecção na aptidão destes hospedeiros. Para tanto, foram utilizados pimers 16S rDNA para a detecção destes simbiontes facultativos em D. saccharalis e C. flavipes e, após a confirmação da associação foram realizadas avaliações biológicas e morfológicas no hospedeiro a fim de verificar possíveis alterações ocasionadas pela infecção por esses microrganismos. Nas amostras de D. saccharalis analisadas não foi detectada a presença das espécies de simbiontes estudadas. Em C. flavipes foi detectada a presença do endossimbionte Wolbachia, sendo que, tal associação resultou em alterações em características biológicas deste parasitoide. Os resultados apresentados neste estudo fornecem informações que servirão de base para o entendimento sobre o papel de Wolbachia na manutenção da qualidade de populações/linhagens de C. flavipes. Palavras-chave: controle biológico; controle de qualidade; endossimbionte; Wolbachia. 27 ABSTRACT Symbiosis between microorganisms and host arthropods can cause biological, physiological, and reproductive changes in the host population. The present study aimed to survey facultative symbionts of the genera Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis and Nosema in Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) and Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) in laboratory, and evaluate the influence of the infection on the fitness of these hosts. For this purpose, 16S rDNA primers were used to detect these facultative symbionts in the host species, and hosts’ biological and morphological features were evaluated for changes resulting from the infection caused by these microorganisms. The bacterium symbiont species herein studied were not detected in the D. saccharalis samples analyzed, but the endosymbiont Wolbachia was detected in C. flavipes and altered biological aspects of this parasitoid insect. The results of this study provide information that can serve as a basis for understanding the role of Wolbachia in maintaining the quality of populations/lineages of C. flavipes. Key words: biological control; quality control; endosymbionts; Wolbachia. 28 1.1 INTRODUÇÃO A broca-da-cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae), é uma praga polífaga, tendo como plantas hospedeiras diversas espécies da família Poaceae. O ataque é comumente evidenciado em lavouras de cana-de-açúcar em todo o continente americano, principalmente no Brasil, maior produtor mundial desta cultura (ROSSATO et al., 2013; FERREIRA et al., 2018). Os impactos econômicos ocasionados por esta praga em cultivos agrícolas se devem pelos danos diretos, causados pela alimentação das lagartas e pelos danos indiretos, os quais são acarretados pela presença de fungos oportunistas, que desenvolvem podridões. Em cana-de-açúcar, tais danos interferem na qualidade da matéria prima e reduzem o rendimento e a qualidade do açúcar e do etanol (FERREIRA et al., 2018). O principal método de controle empregado para a regulação populacional de D. saccharalis é por meio da utilização do parasitoide larval, Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae), utilizado em liberações inundativas em cerca de 3,5 milhões de hectares em cana-de-açúcar no Brasil, representando um dos maiores programas de controle biológico do mundo (PARRA; COELHO, 2019; FONTES et al., 2020). Devido ao sucesso no controle de D. saccharalis, por meio da utilização de C. flavipes, medidas que visam à qualidade deste agente de controle biológico e do hospedeiro durante o processo de produção são imprescindíveis. Vários fatores estão relacionados com alterações na aptidão de insetos, dentre esses, a associação com organismos simbiontes são responsáveis por uma ampla consequência ecológica e evolutiva para as espécies hospedeiras (HARRIS et al., 2010; DICKE; POELMAN, 2020). A simbiose é um termo amplo usado para definir a associação entre duas ou mais espécies diferentes e o efeito que o simbionte tem sobre o hospedeiro, sejam benéfico (mutualismo), neutro (comensalismo) ou prejudicial (parasitismo) é utilizado para definir a forma de simbiose observada (DE BARY, 1879). Os insetos são hospedeiros naturais de inúmeros microrganismos simbiontes, os quais podem ser obrigatórios, desempenhando funções 29 ecológicas e biológicas essenciais para a sobrevivência e facultativos, os quais muitas vezes infectam apenas uma parte da população, e são mantidos por meio da provisão de benefícios condicionais ou por manipulação da reprodução do hospedeiro. A eliminação desses simbiontes facultativos frequentemente resulta em pouco ou nenhum custo ou benefício aparente para o inseto hospedeiro (DOUGLAS, 1989; DURON et al., 2008; BROWNLIE; JOHNSON, 2009). Interações simbióticas mutualísticas entre polydnavírus (PDVs) e Cotesia spp. são comumente relatadas, os quais desempenham papel importante no desenvolvimento do parasitoide imaturo dentro do hospedeiro (STOLTZ; VINSON, 1979; HERNIOU et al., 2013; CÔNSOLI; KITAJIMA, 2017; TAN et al., 2018). São relatadas também a infecção de Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) em criações de D. saccharalis, o que compromete a produção de C. flavipes, e sua consequente utilização em programas de controle biológico, visto que, infecções por este microrganismo causam alterações em parâmetros biológicos e no comportamento de busca deste agente de controle (SIMÕES et al., 2012). Evidências como essas demonstram a relevância de compreender as interações simbióticas e o efeito de tais associações em populações de D. saccharalis e C. flavipes, a fim de detectar possíveis alterações biológicas e morfológicas mediadas pela ação desses microrganismos. Com isso, o presente estudo teve como objetivo a prospecção de simbiontes facultativos do gênero: Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis e Nosema em D. saccharalis e C. flavipes mantidos em laboratório, bem como, avaliar a influência da infecção na aptidão destes hospedeiros. 1.2 MATERIAL E MÉTODOS As criações e bioensaios foram realizados nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura (AGRIMIP), as análises moleculares foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular e as medições morfológicas no Laboratório de Controle Biológico de Pragas Florestais (LCBPF) do Departamento de Proteção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA), Universidade Estadual Paulista ―Júlio de Mesquita 30 Filho‖ (UNESP), Botucatu, São Paulo. As criações e ensaios foram realizados sob condições controladas a uma temperatura de 25 ± 1° C, umidade relativa (UR) de 60 ± 10% e fotofase de 12 h. 1.2.1 Obtenção e multiplicação dos insetos Os exemplares de D. saccharalis e C. flavipes foram obtidos em biofábrica do Estado de São Paulo, Brasil. Para a multiplicação de D. saccharalis foi utilizada a dieta artificial proposta por Hensley e Hammond (1968) adaptada (ágar substituído pela carragenina) e as metodologias de criação para este inseto hospedeiro e para o parasitoide larval C. flavipes seguiram recomendações descritas por Garcia et al. (2009). 1.2.3 Detecção de simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes 1.2.3.1 Extração do DNA genômico Foram selecionadas aleatoriamente uma lagarta de D. saccharalis (4° ínstar) e 50 exemplares de C. flavipes para extração do DNA genômico e padronização da reação de polimerase em cadeia (PCR), provenientes da criação estoque mantidas no laboratório do AGRIMIP (FCA/UNESP). A lagarta de D. saccharalis foi submetida a um processo de lavagem com solução salina (0,85% NaCl) seguida de álcool 70%, sendo posteriormente macerada em Becker de vidro estéril (10 mL), sendo removido partes do corpo do inseto. O conteúdo corporal resultante foi dissolvido em solução de 80 μl de resina Chelex100 (Bio-Rad Laboratories) a 10%, diluído em água estéril e 8μl de proteinase K (20 microgramas/mL) em microtubos de 200μl. Para a extração do DNA dos parasitoides foi realizado um procedimento semelhante, diferindo apenas no processo de maceração, onde os exemplares dos parasitoides (50 indivíduos) foram macerados diretamente no microtubo de 200μl utilizando os mesmos reagentes descritos acima. Posteriormente, os tubos foram agitados por cinco segundos em Vortex Biomixer MOD QL901 e Mini centrífuga de bancada Ministar a 6200 rpm e 31 depois transferidos para termociclador Infinigen (modelo TC-96CG) a 95ºC durante 20 minutos. 1.2.3.2 Reação em cadeia de polimerase (PCR) e sequenciamento A partir do DNA extraído, foi realizada a metodologia de reação em cadeia de polimerase (PCR) para a detecção molecular dos simbiontes do gênero: Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia, Sodalis e Nosema utilizando os iniciadores (primers) específicos (Tabela 1) que amplificam a região small subunit (SSU) do RNA ribossômico. 32 Tabela 1 - Lista de primers utilizados na detecção de simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes Simbionte Gene alvo Sequência do Primer 5’>3’ (pb) Referência Arsenophonus 16S rRNA F-CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA 600 THAO; BAUMANN, 2004 R-GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC Cardinium 16S rRNA F-TACTGTAAGAATAAGCACCGGC 900 ZCHORI-FEIN; PEARLMAN, 2004 R-GTGGATCACTTAACGCTTTCG Hamiltonella 16S rRNA F-TGAGTAAAAGTCTGGAATCTGG 700 ZCHORI-FEIN; BROWN, 2002 R-AGTTCAAGACCGCAACCTC Rickettsia 16S rRNA F-GCTCAGAACGAACGCTATC 900 GOTTLIEB et al., 2006 R-GAAGGAAAGCATCTCTGC Serratia 16S rRNA F-CGCAGGCGGTTTGTTAAGTC 268 RIBEIRO et al., 2019 R-CTTCAAGGGCACAACCTCCA Sodalis 16S rRNA F-ACCGCATAACGTCGCAAGACC 100 0 NOVÁKOVÁ; HYPŠA, 2007 R-CTTAACCCAACATTTCTCAACACGAG Spiroplasma 16S rRNA F-GCTTAACTCCAGTTCGCC 800 MONTENEGRO et al., 2005 R-CCTGTCTCAATGTTAACCTC Wolbachia 16S rRNA F-CGGGGGAAAAATTTATTGCT 700 HEDDI et al., 1999 R-AGCTGTAATACAGAAAAGTAAA Carsonela 16S rRNA F-CACGTGCTACAATGAGTAAAACAA 279 THAO et al., 2000 R-GGTTCCCCTACAGCTACCTTG Nosema 16S rRNA F-CACCAGGTTGATTCTGCC 222 VOSSBRINCK et al., 1993 R-TTATGATCCTGCTAATGGTTC Para a detecção dos simbiontes do gênero: Arsenophonus, Hamiltonella, Cardinium, Spiroplasma, Rickettsia, Serratia, Wolbachia e Sodalis foi realizada em um mix de PCR contendo 12,5μl de Taq DNA Polimerase (NeoBio); 7,5μl água miliQ; 1,0μl de cada primer e 3,0μl de DNA da amostra, totalizando um volume de 25μl. Para detecção de Nosema sp. foi utilizado um mix contendo 12,5μl de Taq DNA Polimerase (NeoBio); 5μl água miliQ; 1,25μl de cada primer e 5,0μl de DNA da amostra, totalizando um volume de 25μl. As reações de PCR foram realizadas em termociclador INFINIGEN (modelo TC-96CG), executadas seguindo as seguintes condições: 33 Arsenophonus e Hamiltonella: temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 min., seguido de 30 ciclos de 95ºC a 30 seg., 58ºC a 30 seg., 72ºC a 1 min. e extensão final de 72ºC por 5 min.; Cardinium: temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 min., seguido de 30 ciclos de 92ºC a 30 seg., 57ºC a 30 seg., 72ºC a 30 seg. e extensão final de 72ºC por 5 min; Regiella e Spiroplasma: temperatura de desnaturação inicial a 94ºC por 5 min., seguido de 30 ciclos de 94ºC a 1 min., 52ºC a 1 min., 72ºC a 2 min. e extensão final de 72ºC por 5 min; Rickettsia: temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 min., seguido de 30 ciclos de 92ºC a 30 seg., 58ºC a 30 seg., 72ºC a 30 seg. e extensão final de 72ºC por 5 min.; Serratia: temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 10 min., seguido de 35 ciclos de 95ºC a 1 min., 62ºC a 1 min., 72ºC a 1 min. e extensão final de 72ºC por 1 min; Sodalis: temperatura de desnaturação inicial a 94ºC por 5 min., seguido de 30 ciclos de 94ºC a 1 min., 62ºC a 1 min., 72ºC a 2 min. e extensão final de 72ºC por 5 min; Wolbachia: temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 3 min., seguido de 30 ciclos de 95ºC a 30 seg., 55ºC a 30 seg., 72ºC a 30 seg. e extensão final de 72ºC por 5 min; Nosema: temperatura de desnaturação inicial a 95 ºC por 4 minutos, seguida por 45 ciclos com desnaturação a 95 ºC por 1 minuto, seguida pela fase de anelamento a 48 ºC por 1 minuto e extensão a 72 ºC por 1 minuto e com uma fase final de polimento por 4 minutos a 72 ºC. Para leitura dos produtos resultantes das PCRs foi empregado marcador molecular 100pb (Norgen) e gel de agarose 1%, contendo 80 ml de solução tampão TBE; 0,8g de agarose (Neo3Bio) e 0,4μl de intercalante de DNA GelRed (NeoBio), sendo visualizados em transiluminador de luz UV (Major Science). Foi realizada a purificação dos produtos das PCRs que detectaram a presença de simbiontes, a qual foi realizada por kit de purificação Cellco, de acordo com as recomendações do fabricante. As análises quantitativas foram feitas por densidade ótica e espectrofotômetro (NanoDrop MD-1000 UV-Vis). Os fragmentos amplificados foram sequenciados por meio do sequenciador automático de DNA Sanger (Modelo: ABI 3500 – Applied Biosystems), no Instituto de Biotecnologia (IBTEC) da Universidade Estadual Paulista ―Júlio de Mesquita Filho‖ (UNESP), Botucatu, São Paulo. As sequências de DNA obtidas foram comparadas às depositadas no GenBank (NCBI – National Center for Biotechnology Information) por meio do programa BLAST 34 (Basic Local Alignment Search Tool) e a identificação especifica dos simbiontes foi realizada a partir de escores de similaridade de sequências e porcentagem de similaridade. 1.2.4 Produção de linhagens de Cotesia flavipes apossimbiontes Após a confirmação da infecção por Wolbachia) foram selecionados indivíduos para a produção de linhagens irmãs apossimbiontes. Para isso, partes dos indivíduos foram alimentadas com mel puro mantendo a associação com Wolbachia (W+), enquanto outra parte da população foi submetida à alimentação de mel puro com a adição de antibiótico (0,25% de tetraciclina) para a eliminação do simbionte (W-) (LI et al., 2014). O processo de eliminação de Wolbachia em C. flavipes foi realizado por quatro gerações consecutivas, sendo posteriormente, selecionados aleatoriamente indivíduos das duas populações para a confirmação da eliminação do simbionte por meio de PCR de acordo com as metodologias descritas anteriormente. Após o processo de descontaminação, a população submetida à ingestão de antibióticos foi alimentada por dez gerações com mel puro sem adição de produtos para a completa restauração da microbiota intestinal e consequentemente eliminar possíveis efeitos colaterais do tratamento. 35 1.2.5 Alterações no desenvolvimento de Cotesia flavipes associada à infecção de Wolbachia 1.2.5.1 Características biológicas Foram utilizadas lagartas de D. saccharalis aptas para o parasitismo (entre 15 a 23 mm), provenientes da criação estoque do AGRIMIP (FCA/UNESP), as quais foram ofertadas individualmente 20 para fêmeas adultas de C. flavipes W+ e W- com até 48 horas de desenvolvimento para o processo de parasitismo. Em seguida, tais lagartas foram mantidas individualmente em cápsulas de plástico (3 cm de diâmetro x 7 cm de altura), contendo no interior dieta de realimentação, sendo replicadas 20 lagartas para cada população do parasitoide. Para avaliação das características biológicas de C. flavipes, após a saída das larvas do parasitoide do corpo da lagarta e a pupação, as massas de pupas foram retiradas e acondicionadas em tubos de vidro (2,5 cm de diâmetro e 1cm de altura), sendo observadas diariamente para a determinação do período de desenvolvimento (dias) ovo-pupa e pupa-adulto; a viabilidade pupal (equação 1); a razão sexual (equação 2) e a sobrevivência dos adultos. ( ) Eq. 1 Eq. 2 Para a avaliação da sobrevivência dos machos e fêmeas adultos, vinte indivíduos de ambos os sexos foram selecionados aleatoriamente e individualizados em tubos de vidro (2,5 cm de diâmetro x 8 cm de altura) e observados diariamente até a constatação da mortalidade. Na parte interior desses tubos eram aplicadas finas fileiras de mel puro com o auxilio de alfinete entomológico para a alimentação dos adultos. 36 1.2.5.2 Morfometria Foram realizadas as medições morfológicas de dez fêmeas e dez machos adultos de C. flavipes com W+ e W-. Os parasitoides foram colocados em lâminas contendo álcool em gel, posicionados em vista lateral direita. As lâminas com os parasitoides foram fotografadas em microscópio óptico Leica EZ4 D acoplado a uma câmera. Posteriormente, as fotografias foram medidas usando o software ImageJ – Version 2.00. As estruturas morfológicas medidas foram: 1 - comprimento total (tórax + abdômen); 2 - comprimento da asa anterior direita; 3 - largura da asa anterior direita e 4 - comprimento da tíbia posterior, medindo da junção da tíbia com o tarso. 1.2.5.3 Capacidade de voo Para a avaliação da capacidade de voo de C. flavipes W+ e W- foi utilizada a metodologia proposta por Dutton e Bigler, (1995) e adaptada por Prezotti et al. (2002). Para tanto, foram utilizadas unidades-teste, as quais consistem em um cilindro de PVC, com o interior recoberto com papel cartão preto e, com o fundo vedado com papel preto ajustado sobre um disco de isopor de 1 cm de espessura e de mesmo diâmetro do cilindro. Na parte interna da unidade-teste foi pincelado um anel de cola entomológica sobre uma faixa de acetato (1cm de espessura) a 3,5 cm da extremidade inferior do cilindro, utilizado como barreira para os parasitoides caminhadores. A parte superior da unidade-teste foi vedada com uma placa de Petri transparente coberta internamente com cola entomológica, servindo como armadilha para os parasitoides em voo. O tubo de ensaio (2,5 cm de diâmetro x 8 cm de altura) contendo uma massa de pupa, com aproximadamente 100 pupas de C. flavipes prestes à emergência foi fixado no centro da região inferior da unidade-teste, sobre o disco de isopor. No interior do tubo foi fornecido gotículas de mel puro para servirem de alimento para os parasitoides. Foram utilizadas vinte unidades- testes para cada população do parasitoide, as quais foram mantidas em câmara de fluxo laminar vertical sob luz fluorescente, onde permaneceram por três dias. 37 Posteriormente avaliou-se o número de espécimes de C. flavipes presentes no anel de cola (caminhadores), na placa de Petri (voadores) e no fundo do cilindro (não voadores). 1.2.7 Análise Estatística Os dados resultantes dos bioensaios foram analisados por análises exploratórias para avaliar as premissas de normalidade e homogeneidade de variâncias pelos testes de Shapiro-Wilk (p < 0,05) e Bartlett (p < 0,05). Os dados de morfometria foram submetidos à análise pelo teste t (p < 0,05) para comparar as diferenças entre as médias. Os dados que não apresentaram normalidade e homogeneidade de variâncias (período de desenvolvimento ovo-pupa e pupa- adulto, viabilidade, razão sexual e teste de voo) foram submetidos à análise não paramétrica. O teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (p <0,05) foi utilizado para comparar dois tratamentos e o de Kruskal-Wallis (p < 0,05) para comparações múltiplas. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram construídas com dados de sobrevida em idades específicas e comparadas pelo teste de LogRank (p < 0,05). Todas as análises foram realizadas no software InfoStat (DI RIENZO et al., 2011). 1.3 RESULTADOS 1.3.1 Simbiontes de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes Não foi detectada a associação entre as espécies de simbiontes prospectadas e a população de D. saccharalis estudada. No entanto, em C. flavipes foi detectada a presença da α – proteobacterium Wolbachia (Rickettsiales: Anaplasmataceae) (98% de identidade com o acesso: CP037426.1 no GenBank). Dentre as detecções de simbiontes realizadas em C. flavipes foi observado que os indivíduos que receberam o tratamento com antibiótico apresentaram resultados negativos na PCR para infecção por Wolbachia após quatro gerações sucessivas da ingestão da tetraciclina. Assim como, também foi 38 observada a ausência desse simbionte na população W+ após dezessete gerações da primeira detecção de Wolbachia mesmo sem a adição de tratamento na sua alimentação. 1.3.2 Alterações no desenvolvimento de Cotesia flavipes associada à infecção de Wolbachia 1.3.2.1 Características biológicas Alterações biológicas em C. flavipes ocasionadas pela associação com Wolbachia foram observadas na duração do período de desenvolvimento (dias) de ovo-pupa (p = 0,010) e na sobrevivência de fêmeas adultas das duas populações (p <0,001). O período de desenvolvimento (dias) ovo-pupa de C. flavipes W+ foi superior ao observado para populações W-. Entretanto, no desenvolvimento pupa-adulto não foram observadas diferenças estatísticas entre as duas populações (p= 0,935) (Figura 1). 39 Figura 1 - Características biológicas de Cotesia flavipes infectada (W+) e não (W-) infectada por Wolbachia. Desenvolvimento (dias) ovo- pupa (A) e pupa-adulto (B), viabilidade de pupas (C) e razão sexual (D). As letras diferentes dentro de cada gráfico são significativamente diferentes entre si (Teste de Wilcoxon Mann- Whitney p <0,05) Não foram observadas diferenças entre as populações de C. flavipes em relação aos parâmetros biológicos viabilidade de pupas (p = 0,234) e razão sexual (p = 0,958) (Figura 1). A análise de sobrevivência não demonstrou diferenças na longevidade entre machos das duas populações (p = 0,663), os quais apresentaram sobrevivência média de 48 horas (Figura 2). Entretanto, ao comparar a sobrevivência de fêmeas W+ e W-, foram observadas diferenças estatísticas (p <0,001). Fêmeas de C. flavipes sem a presença de Wolbachia apresentam em média 72 horas de sobrevivência, as quais são mais longevas que fêmeas com a presença deste simbionte (Figura 2). 40 Figura 2 - Sobrevivência de Cotesia flavipes infectada (W+) e não infectada (W-) por Wolbachia. Fêmeas (W+ e W-) (A) e machos (W+ e W-) (B). Teste de LogRank (p < 0,05) 1.3.2.2 Morfometria Somente foram observadas diferenças estatísticas entre fêmeas de C. flavipes infectadas e não infectadas por Wolbachia no comprimento (p = 0,025) e largura (mm) (p = 0,013) da asa anterior direita, onde, tais medidas foram superiores em fêmeas W+ (Figura 3). Os machos de C. flavipes W+ e W- diferiram entre si somente no comprimento (mm) da tíbia (p = 0,015), sendo que, quando não infectados por Wolbachia tais indivíduos apresentam em média tamanho de tíbia maior que os com a presença deste simbionte. 41 Figura 3 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento da asa direita (B), largura da asa anterior direita (C) e comprimento da tíbia direita (D) de fêmeas e machos de Cotesia flavipes infectada (W+) (caixas pretas) e não infectada (W-) (caixas brancas) por Wolbachia (W-). Os gráficos de caixas representam a mediana e os quartis médios de 75 e 25%, os bigodes representam os limites superior e inferior e os pontos representam os valores discrepantes. As letras diferentes dentro de cada gráfico são significativamente diferentes entre si (Teste t p <0,05) 1.3.2.3 Capacidade de voo Não foram observadas diferenças estatísticas na porcentagem de adultos voadores (p = 0,570), caminhadores (p = 0,551) e não voadores (p = 0,703) entre as populações de C. flavipes (W+ e W-) (Figura 5). Entretanto, ao comparar a 42 capacidade de voo de indivíduos da mesma população foi observada a presença de um número maior de indivíduos voadores (p <0,0001) (Figura 3). Figura 4 - Porcentagem de adultos voadores, caminhadores e não voadores de Cotesia flavipes previamente infectados (W+) e não (W-) infectados por Wolbachia. Os gráficos de caixas representam a mediana e os quartis médios de 75 e 25%, os bigodes representam os limites superior e inferior e os pontos representam os valores discrepantes. Colunas com a mesma letra minúscula (entre as populações) e maiúscula (dentre a população) não são significativamente diferentes entre si pelos teste de Wilcoxon Mann-Whitney e de Kruskal-Wallis p < 0,05, respectivamente. 43 1.4 DISCUSSÃO Associações simbióticas entre Wolbachia e Cotesia spp. são relatadas na literatura, entretanto, a associação entre Wolbachia e C. flavipes é apresentada pela primeira vez neste estudo (MOCHIAH et al., 2002; RATTAN et al., 2011; SRINIVASA et al., 2011; BRANCA et al., 2011; 2019; MURTHY et al., 2015). Wolbachia é uma bactéria simbionte intracelular obrigatório, encontrada infectando uma grande diversidade de artrópodes, é transmitida verticalmente pela fêmea através do óvulo, estando presente principalmente nos tecidos reprodutivos do hospedeiro (O'NEILL et al., 1997; DURON et al., 2008). Evidências remotas também relatam a transferência horizontal entre Wolbachia e o hospedeiro (O'NEILL et al., 1992; WERREN et al., 1995). Contudo, não foram observadas infecções desse simbionte em D. saccharalis, demonstrando que a transmissão de Wolbachia em C. flavipes é realizada verticalmente. Infecções por Wolbachia são responsáveis principalmente por manipulações na sexualidade ou alterações na ecologia reprodutiva do hospedeiro, induzindo a incompatibilidade citoplasmática, partenogênese, feminização e aniquilação de machos. Tais manipulações garantem o isolamento reprodutivo da população infectada e consequentemente o sucesso no estabelecimento desse simbionte na população hospedeira (STOUTHAMER et al., 1999; MOCHIAH et al., 2002). Embora algumas cepas de Wolbachia infectem com sucesso as populações hospedeiras, outras não apresentam a capacidade de parasitar os sistemas reprodutivos de seu hospedeiro ou fazê-lo de maneira adequada (HOFFMANN et al., 1996). Tal afirmação elucida o ocorrido neste estudo, o qual não foi observado feminização e aniquilações de machos de C. flavipes infectado por Wolbachia, sugerindo que esse simbionte não apresenta a capacidade de induzir partenogênese telítoca nesta população e/ ou não consigam se replicar a níveis altos no organismo deste parasitoide. Outro fato observado que pode firmar tal observação foi a descontaminação de Wolbachia em populações de C. flavipes mantidas sem a ingestão de antibióticos após algumas gerações mantidas em laboratório. Embora que, não tenha sido observada à indução de partenogênese em C. flavipes devido à infecção por Wolbachia, investigações futuras devem avaliar 44 o efeito da infecção deste simbionte na incompatibilidade citoplasmática intraespecífica deste parasitoide, visto que, a provável mistura de populações infectadas e não infectadas que apresentam tal alteração reprodutiva ocasiona um redução na taxa de crescimento populacional do parasitoide e com consequente implicações em programas de controle biológico. Com relação às alterações no desenvolvimento de C. flavipes ocasionadas pela infecção por Wolbachia, foi observado que tal associação manifestou alterações em características biológicas e morfológicas deste parasitoide. Os resultados apresentados neste estudo são apoiados por diversos estudos que demonstram alterações na aptidão de artrópodes infectados por Wolbachia (MCGRAW; O’NEILL, 2004; FRY et al., 2004; SERGA et al., 2014; STEVANOVIC et al., 2015). Tais efeitos sobre a aptidão de artrópodes podem ser revertidos com o tratamento da população infectada por meio de antibióticos, assim como foi registrado em C. flavipes, contudo, Dedeine et al (2001; 2005) constataram a participação dessa bactéria na oogênese de Asobara tabida Nees (Hymenoptera: Braconidae), em que fêmeas apossimbiontes foram incapazes de produzir oócitos maduros e, portanto, não conseguiam se reproduzir, se tratando do primeiro registro da transição da simbiose facultativa para a obrigatória em associações artrópodes- Wolbachia. Em C. flavipes não foi constatado tal efeito, uma vez que as populações apossimbiontes não apresentaram alterações reprodutivas. Os resultados inéditos fornecidos em nosso estudo fornecem informações que servirão de base para o entendimento sobre o papel de Wolbachia na manutenção da qualidade de C. flavipes, além de demonstrar a importância de estudos voltados para esses microrganismos, uma vez, que é evidente a sua influencia no desenvolvimento dos hospedeiros associados. 45 REFERÊNCIAS BRANCA, A. et al. Relative influence of host, Wolbachia, geography and climate on the genetic structure of the Sub-Saharan parasitic wasp Cotesia sesamiae. Frontiers in Ecology and Evolution, 7: 309, 2019. BRANCA, A. et al. Intraspecific specialization of the generalist parasitoid Cotesia sesamiae revealed by polyDNAvirus polymorphism and associated with different Wolbachia infection. Molecular Ecology, 20: 959-971, 2011. BROWNLIE, J. C.; JOHNSON, K. N. Symbiont-mediated protection in insect hosts. Trends in microbiology, 17: 348-354, 2009 CÔNSOLI, F. L.; KITAJIMA, E. W. 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Molecular ecology, 13: 2009-2016, 2004. 49 CAPITULO 2 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS DE Cotesia flavipes (HYMENOPTERA: BRACONIDAE) EM DECORRÊNCIA DA INFECÇÃO DE Nosema sp. (MICROSPORA: NOSEMATIDAE) RESUMO Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) é o principal agente de controle utilizado na regulação populacional da broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae). Entretanto, a qualidade dos parasitoides multiplicados em grande escala vem sendo comprometida devido a contaminações pelo patógeno Nosema sp. (Microspora: Nosematidae), a qual afeta parâmetros biológicos e a capacidade de busca desse parasitoide. Aliado a isso, estudos apontam redução na capacidade de voo de C. flavipes ao longo dos anos. Assim, objetivou-se associar a diminuição na capacidade de voo deste parasitoide a infecções por Nosema sp. Para tanto, neste estudo foram avaliados a capacidade de voo e morfometria de C. flavipes, bem como, foram caracterizadas e analisadas as deformações decorrentes da infecção do patógeno no parasitoide provenientes de lagartas de D. saccharalis não infectadas e infectadas com 1x10¹; 1x10²; 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta. Houve redução significativa na capacidade de voo e em medidas morfológicas de C. flavipes, principalmente quando estas foram mantidas em lagartas infectadas com dose ≥ 100 esporos de Nosema sp. Também foram constatados deformações em asas e aumento do abdome dos parasitoides infectados pelo microsporídio. Assim, destaca-se a importância das medidas que visam avaliar a qualidade dos parasitoides multiplicados, considerando a importância de C. flavipes em programas de controle biológico. Palavras-chave: controle biológico; broca-da-cana; vespa parasítica; microsporídio; controle de qualidade. 50 ABSTRACT Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) is the main control agent used in the population regulation of the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae). However, the quality of parasitoids multiplied on a large scale has been compromised due to contamination by the pathogen Nosema sp. (Microspora: Nosematidae), which affects biological parameters and the search ability of this parasitoid. In addition, studies indicate a reduction in the flight capacity of C. flavipes over the years. Thus, the objective was to associate the decrease in flight capacity of this parasitoid to Nosema sp. infections. For this reason, this study evaluated the flight capacity and morphometry of C. flavipes, as well as the deformations resulting from infection of the pathogen in the parasitoid from caterpillars of D. saccharalis not infected and infected with 1x10¹; 1x10²; 1x10³ spores Nosema sp./caterpillar. There was a significant reduction in flight capacity and morphological measurements of C. flavipes, especially when they were kept in caterpillars infected with a dose ≥ 100 spores of Nosema sp. Deformations in the wings and increased abdomen of parasitoids infected by microsporide were also observed. Thus, the importance of measures aimed at evaluating the quality of multiplied parasitoids is highlighted, considering the importance of C. flavipes in biological control programs. Key words: biological control; sugarcane borer; parasitic wasp; microsporidium; quality control. 51 2.1 INTRODUÇÃO Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) é uma importante praga da cana-de-açúcar em todo o continente americano. Infestações desta praga em canaviais acarretam em perdas econômicas, devido aos danos diretos e indiretos ocasionados respectivamente pela alimentação das lagartas e pela presença de fungos oportunistas, os quais diminuem o rendimento e a qualidade do açúcar e do etanol (FERREIRA et al., 2018). As larvas desse lepidóptero se desenvolvem quase que completamente dentro do colmo da planta e devido a esse comportamento o controle mais eficaz para esta praga tem sido por meio da utilização de agentes de controle biológico. O parasitoide larval, Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) é o agente de controle mais eficaz e utilizado para a regulação populacional de D. saccharalis. No Brasil, este parasitoide é amplamente produzido, sendo liberado em aproximadamente 3,5 milhões de hectares de cana-de-açúcar para o controle deste inseto (PARRA; COELHO, 2019; FONTES et al., 2020). Apesar da eficiência e ampla utilização de C. flavipes como agente de controle de D. saccharalis, questionamentos sobre a qualidade dos parasitoides liberados em campo são frequentes. Isso se deve principalmente a estudos que comprovam uma diminuição significativa na capacidade de voo e dispersão deste parasitoide em campo nos últimos anos, bem como, pelas infecções do patógeno intracelular Nosema sp. (Microspora: Nosematidae) em produção massal de D. saccharalis e C. flavipes no Brasil (BOTELHO et al., 1980; SIMÕES et al., 2012; VOLPE et al., 2014; DINARDO-MIRANDA et al., 2014; PAES, 2018). Infecções de Nosema sp. em populações de C. flavipes compromete a utilização deste parasitoide em programas de controle biológico integrado, visto que, ocasionam alterações em parâmetros biológicos e no comportamento de busca deste agente de controle (SIMÕES et al., 2012). Aliado a isto, a indícios que populações de C. flavipes infectadas por este patógeno apresentam capacidade de voo reduzida, com uma porcentagem maior de indivíduos caminhadores (PAES, 2018). Diante do exposto, o presente estudo objetivou avaliar a capacidade de voo de C. flavipes provenientes de lagartas de D. saccharalis não contaminadas 52 e contaminadas com 1x10¹, 1x10² e 1x10³ esporos de Nosema sp./ lagarta, analisar medidas morfológicas de C. flavipes provenientes das mesmas condições descritas anteriormente e caracterizar as deformações morfológicas do parasitoide contaminado por Nosema sp. a fim de associar a redução da capacidade de voo e dispersão de C. flavipes a infecções por Nosema sp. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos e as criações dos insetos foram conduzidos sob condições controladas a uma temperatura de 25 ± 1° C, umidade relativa (UR) de 60 ± 10% e fotofase de 12 h, nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura (AGRIMIP), do Departamento de Proteção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA), Universidade Estadual Paulista ―Júlio de Mesquita Filho‖ (UNESP), Botucatu, São Paulo. 2.1 Obtenção e multiplicação dos insetos Foram multiplicadas em laboratório duas populações de D. saccharalis, que se diferenciaram pela presença e ausência de infecção por Nosema sp., e uma população de C. flavipes não infectada, obtidas em biofábrica do Estado de São Paulo, Brasil. Para a multiplicação das populações de D. saccharalis foi utilizada a dieta artificial proposta por Hensley e Hammond (1968) adaptada (ágar substituído pela carragenina) e as metodologias de criação para este inseto hospedeiro e para o parasitoide larval C. flavipes seguiram recomendações descritas por Garcia et al. (2009). Os parasitoides foram multiplicados em lagartas de D. saccharalis não infectadas por Nosema sp. 2.2 Identificação da infecção de Nosema sp. em Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes Antes da realização dos experimentos foi realizado análises moleculares por meio da extração do DNA genômico e padronização da reação de 53 polimerase em cadeia (PCR) para a confirmação da infecção de Nosema sp. em populações de C. flavipes e D. saccharalis mantidas em laboratório. Para a avaliação da presença e identidade dos esporos, foram selecionadas aleatoriamente 50 indivíduos de C. flavipes e uma lagarta de D. saccharalis para extração do DNA genômico e padronização da reação de polimerase em cadeia (PCR). A lagarta de D. saccharalis foi submetida a um processo de lavagem com solução salina (0,85% NaCl) seguida de álcool 70%, sendo posteriormente macerada em Becker de vidro estéril (10 mL), sendo removido partes do corpo do inseto. O conteúdo corporal resultante foi dissolvido em solução de 80 μl de resina Chelex100 (Bio-Rad Laboratories) a 10%, diluído em água estéril e 8μl de proteinase K (20 microgramas/mL) em microtubos de 200μl. Para a extração do DNA dos parasitoides foi realizado um procedimento semelhante, diferindo apenas no processo de maceração, onde os exemplares dos parasitoides (50 indivíduos) foram macerados diretamente no microtubo de 200μl utilizando os mesmos reagentes descritos acima. Posteriormente, os tubos foram agitados por cinco segundos em Vortex Biomixer MOD QL901 e Mini centrífuga de bancada Ministar a 6200 rpm e depois transferidos para termociclador Infinigen (modelo TC-96CG) a 95ºC durante 20 minutos. A região small subunit (SSU) do RNA ribossômico foi amplificada utilizando-se iniciadores (primers) universais para microsporídeos de Nosema sp., (F) CACCAGGTTGATTCTGCC e (R) TTATGATCCTGCTAATGGTTC, tamanho esperado de 222pb (VOSSBRINCK et al.,1993). A reação de cadeia de polimerase (PCR) para detecção de Nosema sp. foi realizada com um mix contendo 12,5μl de Taq DNA Polimerase (NeoBio); 5μl água miliQ; 1,25μl de cada primer e 5,0μl de DNA da amostra, totalizando um volume de 25μl. As reações de PCR foram realizadas em termociclador INFINIGEN (modelo TC-96CG), executadas seguindo as seguintes condições: temperatura de desnaturação inicial a 95 ºC por 4 minutos, seguida por 45 ciclos com desnaturação a 95 ºC por 1 minuto, seguida pela fase de anelamento a 48 ºC por 1 minuto e extensão a 72 ºC por 1 minuto e com uma fase final de polimento por 4 minutos a 72 ºC. 54 Para leitura dos produtos resultantes da PCR foi empregado marcador molecular 100pb (Norgen) e gel de agarose 1%, contendo 80 ml de solução tampão TBE; 0,8g de agarose (Neo3Bio) e 0,4μl de intercalante de DNA GelRed (NeoBio), sendo visualizados em transiluminador de luz ultravioleta (Major Science). Com base nos resultados obtidos nas analises moleculares e pela confirmação da infecção por Nosema sp. em lagartas de D. saccharalis, estas foram utilizadas para a preparação do inóculo e posterior contaminação de lagartas não contaminadas, as quais também foram analisadas quanto à infecção pelo microsporídio. 2.3 Infecções de Diatraea saccharalis e Cotesia flavipes com esporos de Nosema sp. 2.3.1 Preparação do inóculo de Nosema sp. Para a obtenção dos esporos de Nosema sp. foram utilizadas lagartas de D. saccharalis sintomáticas, as quais foram maceradas em solução salina (NaCl 0,85%). A suspensão resultante foi submetida a um processo de filtragem sucessiva através de algodão hidrófilo (2 mm) com o auxilio de uma seringa, sendo posteriormente submetida a três séries de centrifugação: 2 000 rpm a 10 minutos, seguida de 2 séries a 12 000 rpm a 1 minuto. Após cada centrifugação o sobrenadante era descartado e ao final os esporos acumulados no final do tubo formando um ―pellet‖ foram suspensos em solução salina estéril (NaCl 0,85%) (LACEY, 2012). Os esporos obtidos foram quantificados em câmara de Neubauer e armazenados a 4°C até a instalação dos experimentos. 2.3.2 Infecção das lagartas de Diatraea saccharalis Foram utilizadas lagartas de D. saccharalis de 4° ínstar não infectadas pelo microsporídio, provenientes da criação estoque do laboratório do AGRIMIP. As lagartas foram acondicionadas individualmente em placas de plástico (3 cm de diâmetro e 7 cm de altura), juntamente com um disco de dieta artificial (0,2 cm³) preparada sem metilparabeno (Nipagin®) e sem formaldeído, 55 contaminadas em sua superfície com 5 µL de suspensões de 1x10¹; 1x10²; 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta, sendo que para cada suspensão de esporos foram utilizadas 100 lagartas de D. saccharalis. Tais doses foram determinadas com base em estudos realizados anteriormente, onde foram avaliados parâmetros biológicos e comportamentais do parasitoide sob diferentes níveis de infecção (SIMÕES et al., 2012). No tratamento controle foram utilizadas lagartas não infectadas, as quais receberam dieta artificial sem adição de esporos. As lagartas foram mantidas em condições controladas por 48 horas, período em que as lagartas D. saccharalis realizaram o consumo do disco de dieta artificial contaminada. Posteriormente, foram escolhidas aleatoriamente 10 lagartas de cada tratamento (controle e contaminadas com as dosagens de esporos) para a avaliação da infecção por Nosema sp. em microscópio (1000x). 2.3.3 Parasitismo de Cotesia flavipes em lagartas de Diatraea saccharalis infectadas por Nosema sp. Para o parasitismo, foram selecionadas lagartas de D. saccharalis não infectadas (controle) e infectadas com 1x10¹; 1x10²; 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta, as quais foram ofertadas manualmente e individualmente para a fêmea adulta de C. flavipes. Após o processo de parasitismo, as lagartas de D. saccharalis recém-parasitadas foram transferidas para cápsulas de material plástico (3 cm de diâmetro e 7 cm de altura) contendo em seu interior dieta artificial de realimentação (HENSLEY; HAMMOND, 1968), sendo colocadas 5 lagartas/cápsula, mantidas em condições controladas. Após a formação das massas de pupa dos parasitoides, as mesmas foram retiradas das cápsulas e individualizadas em tubos de ensaio (2,5 cm de diâmetro x 8 cm de altura) para a realização dos ensaios. Para a confirmação da infecção de C. flavipes por Nosema sp. foram escolhidos aleatoriamente 10 indivíduos adultos do parasitoide de cada tratamento, sendo posteriormente avaliados em microscópio (1000x). 56 2.3. Efeito de Nosema sp. na capacidade de voo de Cotesia flavipes Para a avaliação da capacidade de voo de C. flavipes não infectada e infectada através da lagarta de D. saccharalis contaminada com 1x10¹; 1x10² e 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta foi utilizada a metodologia proposta por Prezotti et al. (2002). Para tanto, foram utilizadas unidades-teste, as quais consistem em um cilindro de PVC (18 cm de altura e 11 cm de diâmetro), com o seu interior recoberto com papel cartão preto e, com o fundo vedado com papel preto ajustado sobre um disco de isopor de 1 cm de espessura e de mesmo diâmetro do cilindro. Na parte interna da unidade-teste foi pincelado um anel de cola entomológica sobre uma faixa de acetato (1cm de espessura) a 3,5 cm da extremidade inferior do cilindro, utilizado como barreira para os parasitoides caminhadores. A parte superior da unidade-teste foi vedada com uma placa de Petri transparente (2,5 cm de diâmetro e 1 cm de altura) coberta internamente com cola entomológica, servindo como armadilha para os parasitoides em voo (Figura 1). Figura 1 – Unidade para teste de voo de Cotesia flavipes. Fonte: Adaptado de Prezotti et al. (2002) O tubo de vidro (2,5 cm de diâmetro x 8 cm de altura) contendo uma massa de pupa com aproximadamente 100 indivíduos de C. flavipes prestes à 57 emergência foi fixado no centro da região inferior da unidade-teste, sobre o disco de isopor. No interior do tubo foi fornecido gotículas de mel puro para servirem de alimento para os parasitoides. Para cada tratamento (populações de C. flavipes não infectadas e infectadas em diferentes graus de infecção por Nosema sp.) foram utilizados 15 unidades-testes, as quais foram mantidas em câmara de fluxo laminar vertical sob luz fluorescente, onde permaneceram por três dias. Posteriormente avaliou-se o número de espécimes de C. flavipes presentes no anel de cola (caminhadores), na placa de Petri (voadores) e no fundo do cilindro ESALQ (não voadores). 2.4 Alterações em medidas morfológicas de C. flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. Foram realizadas as medições morfológicas de quinze fêmeas e quinze machos adultos de C. flavipes provenientes de lagartas de D. saccharalis contaminadas com 0; 1x10¹; 1x10² e 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta. Os parasitoides foram colocados em lâminas contendo álcool em gel, posicionados em vista lateral direita. As lâminas com os parasitoides foram fotografadas em microscópio óptico Leica EZ4 D acoplado a câmera. Posteriormente, as fotografias foram medidas usando o software Image J – Version 2.00. Os caracteres morfológicos mensurados foram: 1 - comprimento total (tórax + abdômen); 2 - comprimento do tórax, 3 - largura do tórax; 4 - comprimento do abdômen; 5 - largura do abdômen; 6 - comprimento da tíbia posterior, medindo da junção da tíbia com o tarso; 7 - comprimento da asa anterior direita e 8 - largura da asa anterior direita. 2.5 Deformações em Cotesia flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. Foram avaliadas as deformações em asas de C. flavipes não infectadas e infectadas através do desenvolvimento em lagartas de D. saccharalis contaminadas com 1x10¹; 1x10² e 1x10³ esporos de Nosema sp./lagarta. Para tanto, foram selecionadas aleatoriamente 15 massas de pupas provenientes de cada tratamento, as quais foram individualizadas em tubos de vidro (2,5 cm de 58 diâmetro x 8 cm de altura) até a emergência dos adultos, sendo posteriormente realizada as avaliações de deformações em asas em microscópio óptico Leica EZ4 D, bem como, foram analisadas a presença anomalias resultantes da infecção por Nosema sp. 2.4 Análise estatística Os dados resultantes dos ensaios foram analisados por análises exploratórias para avaliar as premissas de normalidade e homogeneidade de variâncias pelos testes de Shapiro-Wilk (p < 0,05) e Bartlett (p < 0,05), respectivamente. Os dados que atenderam as premissas foram submetidos à análise de variância (ANOVA), sendo aplicado o teste t (p < 0,05) quando havia dois tratamentos e o teste de Tuckey (p < 0,05) para comparações que apresentavam mais de dois tratamentos. Os dados que não apresentaram normalidade e homogeneidade de variância foram submetidos à análise não paramétrica, onde as médias foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis (p < 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas no software Infostat. 2.3 RESULTADOS 2.3.1 Efeito de Nosema sp. na capacidade de voo de Cotesia flavipes O teste de voo demonstrou que a infecção de Nosema sp. em C. flavipes resulta em alterações na capacidade de voo deste parasitoide (Figura 2). Quando comparadas entre si, as populações de C. flavipes diferiram estatisticamente quanto à porcentagem de insetos dentro de cada categoria, insetos voadores (p <0,0001), caminhadores (p <0,0001) e não voadores (p <0,0001). As populações do parasitoide que se desenvolveram em lagartas de D. saccharalis inoculadas com ≥ 100 esporos de Nosema sp. apresentaram menor porcentagem de insetos voadores e maior percentual de indivíduos não voadores (Figura 2). Resultado contrastante foi observado em populações C. flavipes não infectadas e infectadas com 10 esporos do microsporídio, as quais apresentaram índices maiores de indivíduos voadores e menor porcentagem de 59 insetos não voadores, indicando a influência dos níveis de infecção de Nosema sp. na atividade de voo deste parasitoide (Figura 2). 60 Figura 2 - Adultos voadores (%), caminhadores (%) e não voadores (%) de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula (entre as populações) e maiúscula (dentre a população) não são significativamente diferentes entre si (Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) A população de C. flavipes não infectada apresentou 30,73% de indivíduos caminhadores, sendo o menor percentual observado dentre as quatro populações nesta categoria. Em contrapartida, a população 3, a qual se desenvolveu em lagartas de D. saccharalis inoculadas com 100 esporos de Nosema sp. foi a que apresentou maior porcentagem de indivíduos caminhadores, seguida das populações 2 e 4 (Figura 2). As alterações em decorrência da infecção por Nosema sp. também foram observadas quando as populações de C. flavipes foram comparados estatisticamente entre si, entre as categorias (insetos voadores, caminhadores e não voadores), onde indivíduos das populações 3 e 4 apresentaram percentual maior de indivíduos caminhadores e/ou não voadores (População: 3 p <0,0001; População 4: p = 0,0003) (Figura 2). Dentro da população não infectada foi 61 observada uma porcentagem maior de indivíduos voadores (p <0,0001). Resultado semelhante foi obtido na população 2, a qual apresentou percentual maior de parasitoides voadores e caminhadores (p = 0,0004) (Figura 2). 2.3.2 Alterações em medidas morfológicas de C. flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. Assim como observado na capacidade de voo, fêmeas e machos de C. flavipes são afetados negativamente pela infecção por Nosema sp. (Figuras 3 e 4). As fêmeas do parasitoide que se desenvolveram em lagartas de D. saccharalis infectadas com dose ≥ 100 esporos de Nosema sp. diminuíram consideravelmente o seu comprimento (mm) total do corpo (p <0,0001) (Figura 3; A). Efeitos negativos também foram observados na população 4 quanto ao seu comprimento (mm) (p = 0,0023) e largura (mm) de tórax (p <0,0001) e no comprimento (mm) da asa anterior direita (p = 0,0001), os quais foram estatisticamente diferentes das demais populações de C. flavipes (Figura 3; B, C e G). O comprimento (mm) do abdome das fêmeas não infectadas foi maior que as que estavam infectadas com o microsporídio (p = 0,0004) (Figura 3; D). Ao contrário do que foi obtido na largura (mm) desta estrutura morfológica, onde foi observada uma diminuição de tamanho da população não infectada em comparação as populações 3 e 4 (p = 0,0019), enquanto que, a população 2 não foi estatisticamente diferente das demais populações (Figura 3; E). O comprimento (mm) da tíbia da população de C. flavipes infectada com a maior dose de esporos de Nosema sp. foi reduzida em comparação à população não infectada pelo microsporídio (p = 0,0015) (Figura 3; F). Assim como observado na largura (mm) da asa anterior direita (p <0,0001) (Figura 3; H). 62 Figura 3 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento do tórax (B), largura do tórax (C), comprimento do abdome (D), largura do abdome (E), comprimento da tíbia (F), comprimento da asa anterior direita (G) e da largura da asa anterior direita (H) de fêmeas de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes entre si (¹Teste de Tuckey ou ²Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) Quando comparados entre si, os machos de C. flavipes não infectados e os provenientes de lagartas de D saccharalis infectadas com cerca de 1.000 63 esporos de Nosema sp. foram estatisticamente diferentes entre si no comprimento (mm) do corpo (p = 0,0019), tórax (p = 0,0049), abdome (p = 0,0130), tíbia (p = 0,0029) e asa anterior direita (p = 0,0002), assim como, na largura (mm) do abdome (p = 0,0005) e da asa anterior direita (p <0,0001), sendo que, foi observada uma redução em todos estes caracteres morfológicos na população infectada pelo microsporídio (Figura 4; A, B, D, E, F, G e H). A população 3 apresentou redução no comprimento (mm) do tórax e asa anterior direita e na largura (mm) do tórax (p = 0,0267) e da asa anterior direita em comparação à população não infectada (Figura 4; B, C, G e H), entretanto, ao compara-la com as demais populações de C. flavipes infectadas pelo microsporídio nota-se que tais indivíduos em sua maioria não se distingue estatisticamente entre si (Figura 4). Resultado contrastante ao observado na população 4 foi obtido nas medidas morfológicas dos machos da população infectada com cerca de 10 esporos de Nosema sp., o qual foi semelhante à população não infectada na maioria dos caracteres morfológicos. Diferenças estatísticas entre essas duas populações somente foram constatadas no comprimento (mm) da tíbia e na largura (mm) do abdome (Figura 4; E e F). Um fato interessante é que, diferente ao que foi observado na largura (mm) do abdome das fêmeas, os indivíduos machos de C. flavipes não infectados não apresentaram redução de tamanho nesta estrutura morfológica em comparação às populações mais infectadas, somente foi superior estatisticamente à população 2, a qual foi semelhante à média apresentada pela população 4 (Figuras 3 e 4; E). 64 Figura 4 - Tamanho (mm) do comprimento do corpo (A), comprimento do tórax (B), largura do tórax (C), comprimento do abdome (D), largura do abdome (E), comprimento da tíbia (F), comprimento da asa anterior direita (G) e da largura da asa anterior direita (H) de machos de Cotesia flavipes provenientes de lagartas de Diatraea saccharalis não infectadas (população 1) e infectadas com 1x10¹ (população 2), 1x10² (população 3) e 1x10³ (população 4) esporos de Nosema sp./lagarta. Colunas com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes entre si (¹Teste de Tuckey ou ²Teste de Kruskal-Wallis p < 0,05) 65 2.3.3 Deformações em Cotesia flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. Deformações em populações de C. flavipes infectadas por Nosema sp. foram observadas nas asas deste parasitoide. Além disso, assim como observado na morfometria, alguns indivíduos infectados pelo microsporídio apresentavam o abdome mais volumoso em relação aos indivíduos não infectados (Figura 5). Figura 5 - Deformações em Cotesia flavipes em decorrência da infecção por Nosema sp. As deformações em asas de C. flavipes foram analisadas e comparadas entre as populações não infectadas e infectadas por Nosema sp., bem como, dentre cada população. Ao comparar as populações de C. flavipes entre si, observou-se que a porcentagem de fêmeas com as asas não deformadas foi superior às que apresentavam asas deformadas nas populações 1 e 2. Na população 3, o número de fêmeas com e sem deformações nas asas foram semelhantes e, na população 4 foi constatado um percentual maior de indivíduos com as asas deformadas (Figura 6 A). 66 Figura 6 - Porcentagem de fêmeas (A) e machos (B) de Cotesia flavipes com deformações