Universidade Estadual Paulista - “Júlio de 

Mesquita Filho” - Faculdade de 
Odontologia de Araçatuba - Departamento 

de Ciências Básicas 
Programa Multicêntrico de Pós-Graduação 

em Ciências Fisiológicas 
 

 
 
 
 
 
 
 
 

LUIS CEZAR FARIAS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 

STEM CELL FACTOR ESTIMULA CÉLULAS DA 
MUSCULATURA LISA DA TRAQUEIA A PRODUZIR  

TGF-β, FGF-2 E CCL3/MIP-1α. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 
ARAÇATUBA-SP 

2012 
 



 

 

LUIS CEZAR FARIAS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

STEM CELL FACTOR ESTIMULA CÉLULAS DA MUSCULATURA 
LISA DA TRAQUEIA A PRODUZIR TGF-β, FGF-2 E CCL3/MIP-1α. 

 
 
 
 
 
 
 
 

Dissertação apresentada à 
Universidade Estadual Paulista “Júlio 
de Mesquita Filho” – UNESP, como 
parte parcial dos requisitos para a 
obtenção do título de “Mestre em 
Ciências Fisiológicas”. 
 
Orientadora: Prof. Adj. Sandra Helena 
Penha de Oliveira 

 
 
 
 
 
 
 

 
 

ARAÇATUBA - SP 
2012



 

 

LUIS CEZAR FARIAS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
 
 
Nascimento: 25 de julho de 1959 
 
 
 
 
 
 
Localidade: Araçatuba – São Paulo 
 
 
 
 
 
 
Filiação: Ladislau de Oliveira Noce e Dalva Maria de Farias Oliveira 
 
 
 
 
 
 
 
1977 – 1980: Graduação em Farmácia e Bioquímica 

                      Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara 

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” UNESP 

 

 

 

 

2003 – 2004: Pós-Graduação em Biotecnologia  

                      Universidade Federal de Lavras-MG (UFLA) 

 

 

 



DEDICATÓRIAS 

 

DEDICATÓRIAS 
 
 
 

À minha estrela... Dalva, luz eterna do meu caminho. 
 
 
 
Ao meu pai, Ladislau, modelo de sabedoria, honestidade e amor incondicional. 
 
 
 
À minha esposa, Mara, minha cúmplice, meu porto seguro... meu amor. 
 
 
 
Aos meus netos, Luiza e João Pedro, aos meus filhos, Vivian e Daniel, inspiração 
e principais destinatários de mais esta conquista.



AGRADECIMENTOS 

 

AGRADECIMENTOS 
 

À Profª Sandra Helena, pela orientação efetiva, dedicação, perseverança, garra, 

responsabilidade e competência na realização de seu trabalho. 
 

À família, pelo suporte, paciência e admiração que alimenta minha vaidade, me 

enche de orgulho e me motiva a enfrentar grandes desafios como o que estou 

prestes a superar. 
 

Aos meus amigos de laboratório, Taís, Antonio, Daniel, Ariane, Caril, Tamine, Grazi, 

Jéssica... pela cooperação e companheirismo que facilitaram por demais meu 

percurso na pós. 
 

Aos demais amigos de departamento e programa, que não influenciados pela 

enorme diferença de idade, me trataram como um deles, de maneira respeitosa e 

companheira, me fazendo sentir bem à vontade em seu meio. 
 

Aos professores do departamento de Ciências Fisiológicas, que não influenciados 

pela minha idade, me trataram como um aluno, de modo respeitoso e companheiro, 

me fazendo sentir à vontade durante o curso. 
 

À Profª Ana Cláudia, pelos 12 anos de confiança, motivação, incentivo e amizade. 
 

Às Profªs Ana Paula Campanelli e Tereza Cristina Cardoso da Silva, pela 

receptividade e colaboração com a realização do trabalho. 
 

À diretoria, colegas coordenadores, funcionários e alunos da UNIP-Araçatuba, pelo 

apoio e constante incentivo, que me ajudaram a superar os desafios do tempo. 
 

À todos os funcionários da UNESP pelo empenho e cooperação. 
 

À FAPESP pelo apoio financeiro  

 



EPÍGRAFE 

 

 
 
 
 
 
 

"Agir, eis a inteligência verdadeira. Serei o que quiser. 
Mas tenho que querer o que for. O êxito está em ter 
êxito, e não em ter condições de êxito. Condições de 

palácio tem qualquer terra larga, mas onde estará o 
palácio se não o fizerem ali?" 

 
 

Fernando Pessoa 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



RESUMO 

 

OLIVEIRA, L.C.F. STEM CELL FACTOR ESTIMULA CÉLULAS DA 
MUSCULATURA LISA DA TRAQUÉIA A PRODUZIR TGF-β, FGF-2 E CCL3/MIP-
1α. 2012. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia, Departamento de 
Ciências Básicas, Laboratório de Farmacologia – Programa Multicêntrico de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas, UNESP Araçatuba – 2012. 

 
RESUMO 

 
O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo envolvido na produção de TGF-β, 

FGF-2 e CCL3/MIP-1α induzida por Stem cell factor (SCF) em células da 

musculatura lisa de traqueia (CMLT) e as vias de transdução de sinalização 

ativadas. Traqueias de camundongos normais foram coletadas, fragmentadas e 

colocadas em garrafas contendo meio de cultura DMEM com 10% de Soro Fetal 

Bovino. CMLT foram estimuladas com SCF (1, 10 and 100 ng/mL) e avaliadas após 

1, 6 e 24 horas. Características fenotípicas das CMLT foram analisadas por 

imunofluorescência para α-actina de músculo liso (α-AML), α-citoqueratina e α-

proteína de ativação de fibroblastos (α-FAP). Ativação de c-kit em CMLT 

estimuladas por SCF foi avaliada por citometria de fluxo. A expressão de RNAm para 

TGF-β foi observada pela reação de polimerase em cadeia-transcriptase reversa 

(RT-PCR) e a produção da proteína, por ensaio de imunoabsorção enzimática 

(ELISA). A produção de FGF-2 foi avaliada por immunoblot e a produção de 

CCL3/MIP-1α por ELISA. Em outro conjunto de experimentos, CMLT foram pré-

tratadas com inibidores de MAPK p42/44(PD 98059 [PD]), p38(SB 202190[SB]), e 

JNK (SP 600125 [SP]) por 30 minutos seguidos de estimulação com SCF (10 ng/mL) 

por 24 horas. Células pré-tratadas com anticorpos específicos não revelaram 

qualquer marcação para citoqueratina nem para α-FAP, contudo, ocorrendo a 

marcação para α-AML, indicando a pureza da linhagem celular primária. SCF induziu 

a expressão de receptores c-kit em CMLT. CMLT estimuladas por 10 ng/mL de SCF 

expressaram TGF-β mRNA e produziram TGF- β proteína, FGF-2 e CCL3/MIP-1α 

após 24 horas. O pré-tratamento com SB, PD e SP inibiu estas produções. Estas 

produções foram mediadas pela ativação das vias p42/44, p38, e JNK. CMLT 

parecem ser importantes células residentes envolvidas na ativação e reparo tecidual, 

visto que são capazes de produzir fatores de crescimentos e quimiocinas, 

adicionando novas informações sobre o papel da musculatura lisa de traqueia na 

inflamação alérgica. 
  
Palavras-chave: SCF, asma, TGF-β, FGF-2, CCL3, traqueia. 



ABSTRACT 

 

OLIVEIRA, L.C.F. STEM CELL FACTOR STIMULATES TRACHEAL SMOOTH 
MUSCLE CELLS TO PRODUCE TGF-Β, FGF-2 AND CCL3/MIP-1α.  2012.  
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, 
Departamento de Ciências Básicas, Laboratório de Farmacologia – Programa 
Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas. Araçatuba – 2012. 
 
 

ABSTRACT 
 

The aim of this study was to evaluate the mechanism involved in SCF-induced TGF-

β, FGF-2 and CCL3/MIP-1α production in tracheal smooth muscle cells (tSMC) and 

the activated signaling transduction pathway. Normal mouse tracheas were collected, 

fragmented and placed in bottles containing the culture medium DMEM with 10% 

Fetal Bovine Serum. tSMC primary cultures were stimulated with SCF (1, 10 and 100 

ng/mL) and evaluated at 1, 6 and 24 hours. The phenotypic characteristic of tSMC in 

primary culture was analyzed using immunofluorescence staining for α-smooth 

muscle actin (α-SMA), α-cytokeratin and α-Fibroblast Activation Protein (α-FAP).       

c-Kit activation in SCF-stimulated tSMC was evaluated by flow cytometric. The TGF-

β mRNA expression was observed by reverse-transcriptase polymerase chain 

reaction (RT-PCR) and protein production by enzyme-linked immunosorbent assay 

(ELISA). FGF-2 production was evaluated by immunoblot and CCL3/MIP-1α 

production by ELISA. In other set of experiment, tSMC were pretreated p42/44 

inhibitor (PD 98059 [PD]), p38 inhibitor (SB 202190[SB]), or JNK inhibitor (SP 

600125 [SP]) for 30 minutes followed by stimulation with SCF (10 ng/mL) for 24 hour. 

Cells treated with specific antibodies, showing neither labeling for cytokeratin nor 

either FAP, however, labeling for α-SMA indicating purity of the primary cell line. SCF 

induces c-Kit expression on tSMC. SCF-stimulated tSMC express TGF-β mRNA 

expression and FGF-2 and CCL3/MIP-1α production at 10 ng/mL after 24 hours. SB, 

PD and SP pre-treatment inhibited these productions. These productions were 

mediated by activation pathways p42/44, p38, and JNK. tSMC seems to be important 

resident cells involved in the cell activation and tissue repair, since they are capable 

of producing growth factors and chemokines and added new information about the 

role of tracheal smooth muscle cells in the allergic inflammation. 

 
 
Keywords: Key words: SCF, asthma, TGF-β, FGF-2, CCL3, trachea.



LISTA DE FIGURAS 

 

 
 
 

LISTA DE FIGURAS 
 
 

Figura 1 – Procedimentos para explante de traqueia de camundongo BalbC macho 

saudável...........................................................................................................          22 

 

 

Figura 2 – Células da musculatura lisa de traqueia de camundongos em estágios de 

proliferação em meio DMEM completo, coradas por Hematoxilina/Eosina e após 

análise por Imunofluorescência para pesquisa de marcadores de α-citoqueratina, α-

proteína de ativação de fibroblastos e α-actina de músculo liso......................          30 

 

 

Figura 3 – Histograma duplo obtido após análise das CMLT por Citometria de Fluxo, 

marcadas com anticorpo para receptor c-Kit...................................................           32 

 

 

Figura 4 – Ensaio dose-resposta, através da técnica de PCR-RT demonstrando a 

expressão gênica de TGF-β em CMLT estimuladas por concentrações de 1, 10 e 

100 ng/mL de SCF, nos tempos de 1, 6 e 24 horas após estimulação.............         34 

 

 

Figura 5 - Ensaio dose-resposta, através da técnica de ELISA demonstrando a 

produção de TGF-β proteina em CMLT estimuladas por concentrações de 1, 10 e 

100 ng/mL de SCF, nos tempos de 1, 6 e 24 horas após estimulação.............         35 
 
 

Figura 6 - Ensaio dose-resposta, através da técnica de Western Blott demonstrando 
a produção de FGF-2 em CMLT estimuladas por concentrações de 1, 10 e 100 

ng/mL de SCF, nos tempos de 1, 6 e 24 horas após estimulação..................           37 
 
 



LISTA DE FIGURAS 

 

Figura 7 - Ensaio dose-resposta, através da técnica de ELISA demonstrando a 

produção de CCL3/MIP-1α em CMLT estimuladas por concentrações de 1, 10 e 100 

ng/mL de SCF, nos tempos de 1, 6 e 24 horas após estimulação......................       39 
 
 

Figura 8 – Expressão gênica e produção proteica de TGF-β em CMLT pré-tratadas 

com inibidores de MAP quinases SB 202190 (SB), PD98059 (PD) e SP 600125 (SP) 

e estimuladas com SCF 10 ng/mL por 24 h........................................................       41 

 
 

Figura 9 - Produção de FGF-2 e CCL3/MIP-1α em CMLT pré-tratadas com 

inibidores de MAP quinases SB 202190 (SB), PD98059 (PD) e SP 600125 (SP) e 

estimuladas com SCF 10 ng/mL por 24 h..........................................................        42 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 



LISTA DE ABREVIATURAS 

 

LISTA DE ABREVIATURAS 
 

α-AML = α-actina de músculo liso  

ACh - acetylcholine 

BSA = bovine serum albumin 

bp =  base pairs – pares de base 

CCL3 = Chemokine(C-C motif) ligand 3 

cDNA = complementary DNA – DNA complementar 

CMLT = Células da musculatura lisa de traqueia 

CMLVA = Células da musculatura lisa das vias aéreas 

DA = Dalton  

DAPI = 4,6-diamidino-2-fenilindol 

DEPC = Dimetil pirocarbonato 

DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle Medium 

DNAse = Nuclease que catalisa a degradação do DNA 

dNTP = 2’ – deoxynucleoside 5’- thriphosphate  

DTT = DL-Dithiothreitol  

EDTA = etilenodiaminotetracético 

EGTA = ethylene glycol tetraacetic acid 

ELISA = Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay 

ERK = extracellular-signal-regulated kinases 

α-FAP = Fibroblast activation Protein alpha   

FGF-2 = Fibroblast growth fator 2 – Fator de crescimento de fibroblastos 2 

FITC = fluoresceína 

H&E = Hematoxilina & eosina 

IFN-δ = Interferon-δ 

IgE = Imunoglobulina E 

IgG = Imunoglobulina G 

IL- = Interleucina  

JNK = c-Jun N-terminal kinases 

LTC = Cisteinil Leucotrienos  

MAPK = Mitogen Activated Protein Kinases – Proteina quinases ativadas por 

mitógeno 



LISTA DE ABREVIATURAS 

 

MIP-1α = Macrophage inflammatory protein-1α – Proteina inflamatória de 

macrófagos 1α 

Oligo-DT = sequência curta de deoxi-thymine nucleotids 

PBS = Tampão fosfato salino 

PBS+BSA 1% = Tampão fosfato salino + Albumina sérica bovina 1% 

PCR = Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da polimerase 

PMSF = phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride 

PVDF = polyvinylidene difluoride 

RNAm = RNA messenger – RNA mensageiro  

RNAse = Nuclease que catalisa a degradação do RNA 

RPE – R-ficoeritrina 

RT-PCR = Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction – Transcriptase 

reversa seguida de reação em cadeia de polimerase 

SCF = Stem cell factor – Fator de células tronco 

SDS = sulfato dodecil de sódio 

SFB = soro fetal bovino 

α-SMA – alpha smooth muscle actin – alfa-actina de músculo liso 

TAE 50x = Tampão (TRIS – Acetato – EDTA).  

TGF-β = Transforming growth fator -  Fator transformador de crescimento β 

TMB 0,5% = 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine 

TNF-α = Tumor necrosis factor-α  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



SUMÁRIO 

 

SUMÁRIO 
 

1. Introdução          13 

2. Proposição          20 
3.  Materiais e Métodos        21 
3.1 Animais e aspectos éticos        21 

3.2 Isolamento e cultura primária de CMLT de camundongos   21 

3.3 Análise e caracterização por imunofluorescência da cultura primária de  

células da musculatura lisa da traqueia.      22 

3.4 Análise histológica de CMLT por coloração H&E    23 

3.5 Estimulação das CMLT        23 

3.6 Análise da expressão de c-Kit em CMLT por Citometria de Fluxo  24 

3.7  RT-PCR e análise da expressão de TGF-β em CMLT    24 

3.8 Western Blot e análise de detecção imunológica de FGF-2 em CMLT 26 

3.9 Determinação de TGF-β e CCL3/MIP-1α por ELISA    27 

3.10 Efeito de SB 202190, PD 98059 e SP 600125 sobre a produção de FGF-2  

‘ e CCL3/MIP-1α e expressão de TGF-β por CMLT estimuladas por SCF 28 

3.11 Análise estatística         28 

4. Resultados          29 
4.1 Caracterização de células da musculatura lisa de traqueia.   29 

4.2 CMLT estimuladas por SCF expressam receptores c-Kit   31 

4.3 SCF induz expressão de RNAm para TGF-β  e produção proteica  

de TGF-β em CMLT        33 

4.4 SCF induz produção de FGF-2 proteína em CMLT    36 

4.5 SCF induz produção de CCL3/MIP-1α em CMLT    38 

4.6 SB, PD e SP inibem a expressão de RNAm para TGF-β e produção  

das proteína TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α em CMLT   40 

5 Discussão          43 
6 Conclusão          52 
 Referências          53 

 Anexos          69 
 



INTRODUÇÃO

 

13 

1 Introdução  
 

Asma é uma patologia que promove alterações nas vias aéreas, sendo 

responsável pelos processos de inflamação, hiper-reatividade e remodelamento 

que acometem essas estruturas (PAGE et al., 2001), além de ser caracterizada 

pela contração espástica da musculatura lisa dos bronquíolos, decorrente da 

hipersensibilidade contrátil dos mesmos, em resposta a uma variedade de 

alergenos presente no meio ambiente (BOUSQUET et al., 2000; VIGNOLA et al., 

2000; ELIAS et al., 2000; STEWART et al., 2001). Etiologicamente, a asma é 

uma doença heterogênea, aparecendo muitas vezes como uma forma de 

hipersensibilidade imediata (RENAULD et al., 2001), envolvendo episódios 

recorrentes de obstrução das vias aéreas e respiração ofegante, processos 

decorrentes da presença nas vias aéreas de resposta inflamatória alérgica que 

envolve extensa infiltração leucocitária, superprodução de muco e contração da 

musculatura lisa (SHUM et al., 2008).  

De acordo com a ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE (OMS), 300 

milhões de pessoas são afetadas pela asma no mundo (MASOLI et al., 2004), 

enquanto que nos países ocidentais, seus índices têm alcançado um platô 

desde os anos de 1990, especialmente em adultos (VON HERTZEN et al., 

2006), incidência significante que representa um grande problema sob o ponto 

de vista socioeconômico (WEISS, et al., 2001).   

É clara a sobreposição das manifestações clínicas da asma com outras 

afecções alérgicas, em especial aos da rinite alérgica e anafilaxia. No entanto, 

talvez o paradigma mais aceito para sua patogênese é baseado na inflamação 

das vias aéreas, por mecanismos que foram sendo investigados ao longo do 

tempo, fornecendo subsídios para esta proposta e desenvolvendo o conceito de 

que a inflamação era causa importante no fenótipo da asma (WALTER et al., 

2005). Além da associação com a alergia, em função da elevação da IgE 

plasmática, a presença de proteínas liberadas pelos eosinófilos na reação 

inflamatória, pode danificar o epitélio das vias aéreas e contribuir para a hiper-

reatividade (GANONG, 2006).  

O remodelamento das vias aéreas na asma é delimitado por variações na 

estrutura de sua parede, incluindo hiperplasia e hipertrofia da musculatura lisa, 



INTRODUÇÃO

 

14 

as quais crescem com a severidade da doença e, portanto, são associadas com 

a obstrução do fluxo de ar (SAUNDERS et al., 2009). Apesar de significativos 

avanços na compreensão da patologia, as abordagens terapêuticas, apesar de 

existirem, são limitadas. Alguns pacientes não respondem bem ou param de 

responder ao uso de corticosteroides (ANTONICELLI et al., 2004) e mesmo 

diante de adequada terapia anti-inflamatória, observa-se a perda em longo prazo 

da função pulmonar em pacientes asmáticos (LANGE et al., 1998), o que 

aumenta a relevância na pesquisa visando obter novas drogas e terapias 

adequadas a esta morbidade. 

Muitos doentes com asma têm outras manifestações associadas, como 

rinite e eczema, aonde a fisiologia da constrição das vias aéreas é semelhante, 

levantando a hipótese de que a degranulação dos mastócitos pode ser a base 

da doença (RENAULD, 2001). No entanto, é improvável que apenas uma célula 

seja responsável pela iniciação e perpetuação desta doença, sendo que os 

mastócitos humanos libertam mediadores responsáveis por gerarem intensa 

broncoconstrição, induzindo a proliferação de células da musculatura lisa, 

recrutamento e ativação de células inflamatórias, contribuindo desta maneira 

para os aspectos característicos da asma (PAGE, 2001). 

Diversas células do interior dos pulmões estão implicadas na doença, as 

quais são responsáveis pelo início e perpetuação do processo inflamatório, 

incluindo mastócitos, eosinófilos, linfócitos T e B, fibroblastos e células da 

musculatura lisa das vias aéreas (PAGE, 2001). A densidade de mastócitos é 

alta no músculo liso das vias aéreas e nas glândulas mucosas e sua 

degranulação é aumentada na asma fatal (ALRASHDAN et al., 2012) e essa 

densidade, associada às mudanças em sua distribuição nos tecidos pulmonares, 

contribuem significantemente para a fisiopatologia da asma (VAN DER VELDEN 

et al., 2012).  Linfócitos estão envolvidos com a asma alérgica atópica, bem 

como com a não atópica e profissional, com potencial para modular a inflamação 

das vias aéreas, através da liberação de IL-13 e outras citocinas, induzindo a 

hiper-responsividade das vias aéreas independentemente do IgE e eosinofilia 

em modelos animais (KAY A., 2006).  Fibroblastos bronquiais de pacientes com 

asma induzem maior expressão de proteínas da matriz extracelular, sendo que 

mais de 50% foram definidos como miofibroblastos, com maior potencial para 

fibrose tecidual (NAM et al., 2012) A atividade mastocítica na asma, levando ao 



INTRODUÇÃO

 

15 

recrutamento de eosinófilos, torna relevante a análise de seu papel durante a 

inflamação, relacionado com a expressão de várias citocinas, quimiocinas e seus 

receptores, importantes durante o processo inflamatório alérgico associado, bem 

como para a compreensão dos determinantes da severidade desta patologia e o 

desenvolvimento de novas terapias (OLIVEIRA, et al, 2003). As descobertas 

relativamente recentes do papel central das células da musculatura lisa das vias 

aéreas (CMLVA) na síntese desses mediadores, bem como de moléculas de 

adesão (JOHNSON et al., 1995), permitem atribuir a essas substâncias, ampla 

capacidade de promover e perpetuar os mecanismos inflamatórios presentes na 

patologia (CHUNG, 2000). 

Novos estudos revelam que CMLVA são fontes importantes de inúmeras 

citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento biologicamente ativos, 

demonstrando que a liberação de mediadores pró-inflamatórios por elas, pode 

estimular eosinófilos, células epiteliais, linfócitos, mastócitos, macrófagos, 

neutrófilos e plaquetas, auxiliando no recrutamento e ativação dessas células da 

inflamação, aumentando, portanto, a cascata inflamatória (McKAY et al., 2001).  

As células recrutadas ou residentes presentes nas vias aéreas 

respondem, portanto, pela iniciação ou perpetuação da doença, por secretarem 

mediadores inflamatórios ou por expressarem moléculas de adesão celular 

sendo que, a interação célula-célula contribui para a hiper-reatividade das vias 

aéreas no distúrbio, evidenciando supor que a células T, mastócitos e as células 

do músculo liso, interagem diretamente, via estas moléculas de adesão celular 

(DAMERA et al., 2009). Estes processos permitem evidenciar que as células da 

musculatura lisa das vias aéreas (CMLT) são também uma potencial fonte de 

produção de fatores de crescimento implicados no espessamento da parede das 

vias aéreas (MCKAY et al., 2001). 

O envolvimento da traqueia nos processos inflamatórios alérgicos 

relacionados às vias aéreas, especialmente na asma, foi objeto de estudos 

envolvendo proliferação celular (MALAVIA et al., 2009); hipertrofia, hiperplasia e 

deposição da matriz extracelular (JAMES et al., 2012); relaxamento induzido por 

Óxido Nítrico (PEREZ-ZOGHBI et al., 2010); fenômenos fisiopatológicos 

envolvidos na remodelação das vias aéreas na asma (BARA et al, 2010) e

expressão de IL-8 (MULLAN et al., 2008). Todos esses estudos foram realizados 

com células epiteliais ou musculares lisas de traqueia humana. Outros trabalhos 



INTRODUÇÃO

 

16 

mostram o papel de células musculares lisas de traqueia de porcos em modelo 

experimental de asma simulada in vitro, avaliando mecanismos de resistência e 

adaptação (MCPARLAND et al 2005); expressão gênica em ratos de Pré-

protaquinina-A derivada de nervo e receptores de Neurokinin-1 (MAGHNI et al, 

2003); e aumento de IL-13 na contratilidade do músculo liso traqueal de 

camundongos (FARGHALY et al, 2008).  

Um dos fatores de crescimento relevantes na compreensão dos 

fenômenos que envolvem a participação e aumento dos mastócitos nas vias 

aéreas asmáticas é o Fator de Crescimento de Mastócitos, conhecido como 

Stem cell factor (SCF) ou c-Kit ligante (HUANG et al., 1990; MARTIN et al., 

1990), uma glicoproteína com interação por receptores tirosina-quinase 

denominados c-Kit, protooncogenes expressos em células-tronco primitivas 

hematopoiéticas (GEISSLER et al., 1988), melanócitos (NOCKA et al., 1989), 

células germinativas (MANOVA et al., 1990) eosinófilos do sangue periférico 

(YUAN et al., 1997) e mastócitos (GALLI et al., 1995). SCF é expresso in vitro 

por várias células das vias aéreas, incluindo aquelas do epitélio brônquico (WEN 

et al., 1996), fibroblastos pulmonares (KASSEL et al., 1998), células da 

musculatura lisa brônquica (KASSEL et al., 1999), dentre outras. O SCF é 

importante na manutenção e sobrevivência dos mastócitos por inibir sua 

apoptose, induzindo quimiotaxia e tendo papel essencial em sua adesão à 

matriz extracelular (MEININGER et al., 1992; DASTYCH et al., 1994).  

A ativação dos mastócitos pelo SCF faz com que muitos mediadores pré-

formados sejam liberados, induzindo interação entre leucócitos circulantes e o 

endotélio das vênulas pós-capilares (KUBES, 1996). Desta forma, SCF pode 

estar relacionado com muitas doenças associadas com aumento local do 

número e/ou ativação de mastócitos e interação com outras células, como ocorre 

na asma (KASSEL et al., 2001). Estudos prévios (OLIVEIRA et al., 2001) 

demonstraram que o SCF está diretamente envolvido na produção de 

leucotrienos e na indução de hiper-reatividade das vias aéreas, via ativação de 

mastócitos. O Fator de Crescimento de Fibroblastos básico (FGF-2) e o Fator 

transformador do crescimento beta (TGF-β), também são mediadores 

sintetizados pelas células da musculatura lisa das vias aéreas, com atividades

relacionadas à promoção, diferenciação e ativação de eosinófilos; produção e 



INTRODUÇÃO

 

17 

liberação de IgE e expressão de receptores de IgE em mastócitos e eosinófilos 

(COKER et al., 1996; CHU et al., 2004, YUM et al., 2011). 

TGF-β é uma citocina caracterizada como uma superfamília de vias de 

sinalização (CHIBA et al., 2003; BERGHORN et al., 2006) que incluem activinas, 

proteínas morfogenéticas ósseas, fator de diferenciação de crescimento e 

proteínas TGF-β, mediadores secretados que regulam uma série de funções 

biológicas em vários tipos celulares (SHI et al., 2003; DERYNCK et al., 2003; 

MASSAGUE et al., 2005). O TGF-β está relacionado à importante papel na 

regulação da inflamação e remodelação das vias aéreas na asma (BOTTOMS et 

al., 2010), sendo caracterizados como fatores de crescimento pleiotrópicos com 

relevante função na manutenção da homeostase dos tecidos (MASSAGUE, 

2000). Possui todas as isoformas conhecidas em mamíferos, TGF-β, TGF-β1 e 

TGF-β3 expressas nas vias aéreas e TGF-β e TGF-β2 com sua síntese 

aumentada na asma (BOTTOMS et al., 2010). No pulmão humano normal, todas 

as três isoformas são expressas no epitélio bronquial, sendo TGF-β1 e TGF-β3 

expressas por macrófagos e o TGF-β1 também expresso pelo endotélio 

vascular, músculo liso e fibroblastos (AUBERT et al.,1994; COKER et al., 1996; 

CHU et al., 2004). No entanto, os mecanismos envolvidos na expressão deste 

mediador em CMLT induzida pelo SCF necessitam ser mais bem estudados.  

O FGF-2 é membro de uma família de proteínas reguladoras de função, 

da proliferação e da diferenciação celular, possuindo 17.000 DA de peso 

molecular e que tem sido reconhecido como potente fator angiogênico 

(FOLKMAN et al., 1987), mitogênico e quimiotático para fibroblastos e células 

endoteliais (TERRANOVA et al., 1985). O FGF-2 possui também importante 

papel na inflamação e na cicatrização de feridas (MOHAN et al., 2010), sendo 

que sua expressão ocorre em rins humanos, células da musculatura lisa 

vascular, fibroblastos, cérebro e retina (CHOTANI et al., 2000), estando ainda 

relacionado com a resposta imune modulada pelos odontoblastos, 

principalmente no processo de reparo tecidual envolvendo a polpa dental 

(OLIVEIRA et al, 2011). 

Alguns estudos relacionados à atividade do TGF-β e do FGF-2 na 

inflamação e remodelação das vias aéreas (YUM et al., 2011)  ainda são 

incipientes e o papel específico destas citocinas dentro da cascata de células e 

mediadores presentes na asma ainda é pouco conhecido.  



INTRODUÇÃO

 

18 

Outra proteína investigada nos processos fisiopatológicos relacionados às 

doenças inflamatórias alérgicas das vias aéreas é CCL3/MIP-1α, quimiocina 

associada com atividade quimiotática para células mononucleares in vitro e in 

vivo (OPPENHEIM et al., 1991; SCHALL et al., 1991), sendo envolvida de modo 

crítico na patogênese de inflamações pulmonares em camundongos infectados 

experimentalmente com o Vírus sincicial respiratório (HAEBERLE et al., 2001). 

Sua produção pode ser significantemente up-regulada em resposta à produção 

de citocinas inflamatórias como IL-1, IFN-δ e IL-10 em processos patológicos 

como granulomas fibroblásticos (LUKACS et al., 1994), contribuindo na 

exacerbação da injúria pulmonar (TOKUDA et al., 2000; ISHIDA et al., 2007) e 

sendo relacionada também com a capacidade de estimular macrófagos e 

fibroblastos para produzir IL-1, IL-6 e TNF (OPPENHEIM et al., 1991). Halwani et 

al. (2011) propõe que CCL3/MIP-1α, dentre outras citocinas e quimiocinas, pode 

influenciar diretamente o aumento da taxa de proliferação de células da 

musculatura lisa das vias aéreas e de sua sobrevivência, no processo de 

mudanças estruturais associadas à asma, sugerindo ainda ocorrer uma redução 

na distância entre essas células e o epitélio, através de um possível processo de 

migração celular. 

A ativação de células residentes, linfócitos e a produção destas citocinas, 

quimiocinas e fatores de crescimento variados, promovem a diferenciação e 

ativação de eosinófilos; produção e liberação de IgE; expressão de receptores 

de IgE em mastócitos e eosinófilos. O papel das células da musculatura lisa das 

vias aéreas sobre a sua síntese é descrito em alguns trabalhos recentes, já 

citados acima não sendo, porém, encontrados estudos sobre a possível relação 

entre o SCF, TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α nestas estruturas. Avaliar o papel do 

SCF sobre a expressão destas proteínas nas células da musculatura lisa das 

vias aéreas, bem como elucidar as possíveis vias de transdução de sinal 

relacionadas a esse processo, pode ser uma importante ferramenta no controle 

da resposta inflamatória alérgica na asma, principalmente tendo em vista a 

possibilidade de utilização de fármacos mais seletivos no tratamento desta 

patologia.  

O processo de injúria tecidual em relação a processos inflamatórios 

alérgicos como, por exemplo, a asma, é complexo e requer uma inter-relação 

entre infiltração de leucócitos, endotélio, epitélio residente, macrófagos 



INTRODUÇÃO

 

19 

alveolares e células da musculatura lisa da traqueia. Estes processos, isolados 

ou conjuntamente, requerem uma série de sinais orquestrados. Uma das 

principais vias de sinalização utilizadas é a via das proteínas quinases ativadas 

por mitógenos (MAPK) (HERLAAR et al., 1999), um dos maiores sistemas 

sinalizadores utilizados pelos organismos eucarióticos, para transdução de sinais 

extracelulares gerando respostas intracelulares (HUANG et al., 2004).  

Os receptores ligados a quinases medeiam às ações de uma ampla 

variedade de proteínas mediadoras, incluindo fatores de crescimento e citocinas, 

além de hormônios como a Insulina e a Leptina, cujos efeitos são exercidos 

principalmente ao nível da transcrição gênica, possuindo importante papel no 

controle da divisão, crescimento e diferenciação celulares, assim como na 

inflamação, reparação tecidual, apoptose e respostas imunológicas (RANG et 

al., 2007). 

Aspectos comuns a todas as isoformas de MAPKs é a fosforilação de 

resíduos de Treonina (Thr) e Tirosina (TyR) e apresentarem a sequência de 

aminoácidos Thr-Xxx-Tyr, na qual X difere de acordo com a isoforma, podendo 

ser Ácido Glutâmico (Glu) na MAPK tipo ERK (p44/42), prolina (Pro) na MAPK 

tipo JNK e glicina (Gly) na MAPK p38, os três maiores grupos de MAPK 

conhecidos (HERLAAR et al., 1999). Uma vez ativadas, as MAPKs podem 

fosforilar e ativar outras quinases ou proteínas nucleares e como tal, fatores de 

transcrição no citoplasma ou no núcleo, sendo que estas substâncias atuam via 

MAPK p38 e o aumento ou decréscimo na expressão de determinados genes-

alvo, resultam na resposta biológica específica (HERLAAR et al., 1999). 

TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α regulam importantes respostas endógenas 

em vários tecidos, e os mecanismos de sua expressão e produção nos músculos 

lisos das vias aéreas em processos inflamatórios como a asma, ainda carecem 

de estudos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de TGF-β, FGF-2 e 

CCL3/MIP-1α por CMLT de camundongos saudáveis estimuladas por SCF e os 

mecanismos envolvidos na expressão destes mediadores.  

 

 



PROPOSIÇÃO

 

20 

2 PROPOSIÇÃO: 
 

O objetivo do presente estudo foi avaliar os mecanismos envolvidos na 

expressão e produção de FGF-2, TGF-β e CCL3/MIP-1α em CMLT de 

camundongos estimuladas pelo SCF, além de avaliar as possíveis vias de 

sinalização intracelular relacionadas às MAPKs ativadas no processo.  

 

Assim sendo, as estratégias utilizadas no presente estudo foram: 

 

1- Avaliar a presença do receptor c-Kit, ligante do SCF em CMLT; 

2- Investigar se CMLT de camundongos estimuladas por SCF produzem TGF-β, 

FGF-2 e CCL3/MIP-1α; 

3- Investigar qual a via de sinalização intracelular (p42/44, p38 ou JNK) 

envolvida na expressão de TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α em CMLT 

estimuladas por SCF. 

 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

21 

3 Materiais e Métodos 
 

3.1 Animais e aspectos éticos 
 

Todos os procedimentos experimentais que envolveram o uso de animais 

foram revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Bem-estar animal da 

Faculdade de Odontologia da Universidade Paulista, Araçatuba, SP (protocolo nº 

2010-003463). Um total de 5 camundongos Balb/c machos saudáveis, pesando 

entre 20 e 25g foram utilizados, sendo mantidos em sala com temperatura 

controlada, com livre acesso à água e ração. Com o propósito de obter todos os 

explantes das amostras de traqueia utilizadas neste estudo, os camundongos 

foram sacrificados com uma overdose de Halotano (Tanohalo, Cristália, 

Campinas, SP, Brasil).  

         

3.2 Isolamento e cultura primária de células da musculatura lisa da traquéia 

de camundongos 

 

Células da musculatura lisa da traqueia (CMLT) foram obtidas usando 

técnica de explante (Fig. 1). Após excisão, as traqueias foram transferidas para 

capela de fluxo laminar, onde o tecido conectivo e o epitélio das vias aéreas 

foram removidos por cuidadosa raspagem da superfície luminal. As estruturas 

foram picadas com uma lâmina de bisturi em fragmentos pequenos em placas 

de petri, centrifugadas e adicionadas em garrafas pequenas de cultura contendo 

meio Dulbecco’s eagle modificado (GIBCO, Life Technologies, USA), 

suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil), 4 mM L-glutamina 

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL 

de estreptomicina (GIBCO, Life Technologies, USA), e 0,25 mg/mL de 

anfotericina (GIBCO, Life Technologies, USA). As culturas foram mantidas a 

37ºC em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 até a densidade celular 

adequada aos repiques necessários para a realização dos experimentos. As 

garrafas com os fragmentos foram mantidas nas condições citadas por cerca de 

uma semana, tempo suficiente para que as células possam migrar dos mesmos 

e aderirem no fundo das garrafas. Após, os fragmentos foram retirados, 

permitindo uma livre proliferação das células, com trocas do meio de cultura a 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

22 

cada 48 horas. A cada passagem, as células em confluência foram repicadas, 

sendo descoladas das garrafas com 0,25% de tripsina e 0,05% de EDTA (Sigma 

Chemical Co., St. Louis, MO, USA) por 5 minutos. CMLT foram utilizadas entre a 

4ª e 6ª passagens para todos os experimentos. 

 

Fig.1 – Traqueia exposta de camundongo Balb/c macho para explante. 
 

3.3 Análise e caracterização por imunofluorescência da cultura primária de 
CMLT. 
 

CMLT foram preparadas em cultura e semeadas sobre lamínulas 

circulares (20 mm de diâmetro), colocadas em placa de cultura com 24 poços, 

até a adesão em sua superfície, o que ocorreu após cerca de 18h. As lamínulas 

foram removidas dos poços e pré-fixadas em acetona gelada, sendo 

armazenadas a -20ºC. No momento da marcação, as células foram fixadas com 

acetona gelada por 2 minutos, sendo, em seguida, lavadas com tampão PBS. As 

lamínulas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente com PBS/soro 

de coelho para o bloqueio de ligações inespecíficas. Os anticorpos primários 

Anti-α-Smooth muscle actin mouse monoclonal (αSMA; 1:200; A5228 Sigma-

aldrich, St. Louis, MO, USA); Anti-Cytokeratin 10/13 mouse monoclonal antibody 

(1:100; MMS-157S Covance Inc. Dallas, TX, USA) and anti-FAP–α goat 

polyclonal antibody (anti-FAP-α; 1:100; sc-54538 Santa Cruz, SC, CA, USA) 

foram incubados por 18h a 4ºC. Após nova lavagem, as células foram incubadas 

com os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG H+L 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

23 

antibody (1:200; A11001 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and rabbit anti-goat 

IgG-FITC antibody (1:200; sc- 2777 Santa Cruz, SC, CA, USA), sendo, em 

seguida, montadas em lâminas para microscopia imersas em meio de montagem 

contendo DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) (H-1200- Vector Labs, California, 

USA). A análise e captura das imagens foram realizadas em microscópio 

confocal invertido sistema a laser LEICA TCS-SPE (Leica Microsystems, 

Mannheim, Alemanha), equipado com objetiva para óleo de imersão em plano 

apocromático (1.3 CS) com contraste de interferência diferencial. O software 

LAS AF 2.5.1 foi utilizado para captação das imagens. 
 

3.4 Análise histológica de CMLT 

 

Para o experimento, CMLT (3x106células/mL) foram semeadas em placas 

com 6 poços até alcançar aderência, o que ocorreu após cerca de 12h . Em 

seguida, as células foram coradas pela técnica de Hematoxilina/Eosina 

(Panóptico rápido – Laborclin, Pinhais, PR, Brasil) e analisadas por microscopia 

ótica com captura de imagens por Câmera Digital Olympus acoplada ao 

microscópio. 
 

3.5 Estimulação das CMLT 

           
Para os experimentos, CMLT entre 4 a 6 passagens (3 a 4 semanas de 

incubação), foram plaqueadas até a densidade de 3x106 células/mL células em 

meio DMEM com 10% de Soro fetal bovino. As células foram tripsinizadas e 

subcultivadas em placas de 24 poços para preparo dos ensaios para avaliação 

por Western blot, Citometria de fluxo, ELISA e extração de RNA. Após a 

obtenção da confluência, as células foram estimuladas em presença ou 

ausência de SCF nas concentrações de 1, 10 e 100 ng/mL (Recombinant mouse 

SCF 250-03 PEPROTECH, Colônia Narvarte, México, DF) e examinadas após 

1h, 6h e 24h. As células e os sobrenadantes livres de células foram coletados e 

armazenados em freezer a -800C até sua utilização. 
 

 

 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

24 

3.6 Análise da expressão de c-Kit em CMLT por Citometria de Fluxo. 
 

A expressão do receptor para SCF foi avaliada em CMLT obtidas após 

metodologia descrita anteriormente. CMLT foram estimuladas com SCF (10 

ng/mL) por 24h. As células foram coletadas em tampão PBS, contendo 0.1% de 

BSA em água deionizada. O total de 10 × 106 células foram coletadas após 

desprendimento da placa com Tripsina (Sigma-Aldrich®) 0,25%, lavadas em 

PBS e incubadas por 18 h a 4°C com 10 mg/mL de anticorpo monoclonal c-Kit 

Rato anti-camundongo CD117:RPE (MCA1365PE AbD Serotec, Kidlington, 

Oxford, OX5 1 GE, UK). Em seguida, as células foram lavadas três vezes com 

PBS mais Triton X-100 0,1%. Uma diluição a 1:50 de anticorpo policlonal 

secundário Coelho F(ab’)2 anti-rato IgG:RPE (STAR20A AbD Serotec, 

Kidlington, Oxford, OX5 1 GE, UK) foi adicionada a 100 μL de suspensão celular 

e incubada a 37°C por 30 min. A suspensão celular foi lavada com PBS como 

previamente descrito, e após a lavagem final, as células foram fixadas com 4 % 

de paraformaldeído. Os dados foram obtidos com Attune™ sistema fotométrico 

de foco acústico (Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA). O padrão 

negativo foi examinado por aplicação da mesma suspensão celular com a 

primeira incubação, sendo o resultado incluído na compensação global para 

excluir a autofluorescência. Um filtro A BL1-A (488 nm) foi usado em cada 

análise. 
 

3.7 RT-PCR e análise da expressão de TGF-β em CMLT 
 

O RNA total foi obtido das CMLT, com o uso do reagente Trizol 

(Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) de acordo com as instruções 

do fabricante. À suspensão foi adicionado 200 μL de clorofórmio em cada tubo 

de amostra, e em seguida centrifugadas a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. 

Após a centrifugação, a solução aquosa foi transferida para novos tubos e 500 

μL de álcool isopropílico foi adicionado a cada tubo da amostra e armazenado a 

-20°C até o dia seguinte. Após, as amostras foram retiradas do freezer e 

centrifugadas a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Em seguida, o 

sobrenadante foi removido e 500 μL de etanol 75% foi adicionado à cada 

amostra que foram centrifugadas novamente a 13.000 rpm durante 10 minutos a 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

25 

4°C. Em seguida, todo o sobrenadante foi descartado e os tubos foram vertidos 

para baixo até o pellet estar completamente seco. Após esta etapa, o pellet foi 

ressuspendido em 20 μL de água de DEPC a 0,1% por amostra, e em seguida 

armazenados a -80°C. A concentração do RNA foi determinada em 

espectrofotômetro com a leitura sendo realizada utilizando absorbância de 

260/280nm (OD260 equivalente a cada unidade). As amostras de RNA foram 

armazenadas a -80°C e usadas subsequentemente em procedimentos de 

transcriptase reversa. A síntese de cDNA foi realizada pelo método do RT-PCR 

e subsequente eletroforese em gel de agarose para avaliar a expressão do gene 

constitutivo de β-actina e de TGF-β. Para a realização da transcriptase reversa, 

1 μg de RNA total foi utilizado em uma reação contendo 1 μL de oligo-DT (0,5 

μg/μL, Invitrogen), 4 μL de dNTP (2,5 μM, Invitrogen), 2 μL de DTT (0,1m/500 μl, 

Invitrogen), 4 μL de 5x first-standard buffer (250 mM, Invitrogen) e 1 μL de 

transcriptase reversa (Super Script II, 200 U/μL, Invitrogen). A reação de 

transcriptase reversa foi realizada de acordo com o seguinte perfil de 

amplificação: pré-desnaturação a 70°C durante 10 minutos, amplificação 

(desnaturação a 4 °C durante 5 minutos; anelamento a 42 °C durante 60 

minutos; e extensão a 90°C durante 5 minutos). Após a termociclagem as 

amostras foram armazenadas a 4°C para posteriores análises. Para a realização 

do PCR, 1 μL de cDNA foi usado em uma reação contendo 4 μL de água de 

DEPC, 2 μL de dNTP (2,5 μM, Invitrogen), 2,5 μL de 10x PCR Rxn Buffer (-

MgCl2, Invitrogen), 1,5 μL de MgCl2 (50 nM, Invitrogen), 1 μL de primer 10 nM, 

12,8 μL de água ultrapura (Invitrogen) e 0,1 μL de Taq DNA polymerase (5 U/μL, 

Invitrogen). A condição padrão para PCR de β-actina foi 94°C (10 min.), 30 

ciclos a 94°C (1 min.), 56°C (1 min.) e 72°C (1 min.) seguida de curva de 

desnaturação. A condição padrão para PCR de TGF-β foram 94°C (4 min.), 35 

ciclos a 94°C (1min.), 58°C (1 min.) e 72°C (1 min.) seguida de curva de 

desnaturação. O conjunto de primers (camundongos) utilizados foram: β-actina 

(sense: 5' TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C - 3'; antisense: 5' TAA 

AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G – 3’, 445 bp) e TGF-β (5' CGG AAG 

CGC GCC ATC GAA ATC C - 3'; antisense: 5' GCA GCA GCT CTG AGC CAC 

GG - 3', 350 bp). A detecção de mRNA para β-actina foi usada como controle 

interno. Para detecção dos produtos amplificados, uma alíquota de 13 µL de 

cada amostra foi analisada por eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, Life 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

26 

Technologies, Grand Island, NY, USA): 196 mL de água ultrapura (livre de 

DNAse e RNAse), 3,6 gramas de agarose e 4 mL de tampão TAE (50X), corado 

com brometo de etídio 10 mg/mL(Sigma, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA). 

A eletroforese foi realizada a 90 volts, por 150 minutos, em uma cuba horizontal, 

e o cDNA foi visualizado através de luz ultravioleta em um transiluminador (GE 

Healthcare - ImageQuant 100). O peso molecular dos produtos da RT-PCR foi 

determinado pela comparação com marcador de peso molecular conhecido 

(DNA ladder, 100-1500 bp, Invitrogen). A fotodocumentação dos géis de agarose 

foi realizada com a utilização de uma máquina fotográfica acoplada ao 

transiluminador (Olympus SP-500 UZ). O Gel de agarose foi escaneado e 

analisado utilizando-se o programa Scion Image (Scion Corp., Frederick, MD, 

USA), para obter um valor numérico que permitiu uma comparação semi-

quantitativa entre o alvo TGF-β e o controle constitutivo β-actina. 
 

3.8 Western Blotting e análise de detecção imunológica de FGF-2 em CMLT 
 

Neste conjunto de experimentos, após 1h, 6h, e 24 h, os sobrenadantes 

livres de células foram coletados para quantificação de FGF-2 usando a técnica 

de Western blotting. CMLT foram cultivadas e preparadas sob as mesmas 

condições experimentais descritas anteriormente. Após os respectivos 

tratamentos e períodos experimentais, as células cultivadas foram lisadas para 

pesquisa da expressão constitutiva de β-actina e FGF-2, após estimulação. 

Lisados celulares foram obtidos com tampão de lise Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), 

Tween 20 1%, deoxicolato de sódio 0,25%, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, O-

Vanadato 1 mM, NaF 1 mM e inibidores de proteases (aprotinina 1 µg/ml, 

leupeptina 10 µg/ml e PMSF 1 mM), sendo deixados em banho de gelo por 2h. 

Em seguida o extrato foi clarificado por centrifugação a 14.000 rpm por 5 

minutos e a concentração de proteína determinada pelo Método de Lowry 

modificado. O precipitado foi descartado e ao sobrenadante foi adicionado 

tampão de amostra na proporção de 1:1 [Tris-HCl 100 mM (pH 6,8), DTT 200 

mM, SDS 4%, azul de bromofenol 0,1 % e glicerol 20%]. As amostras foram 

fervidas por 5 min e aplicadas em gel de poliacrilamida (10-12%) contendo SDS 

(SDS-PAGE). Após a corrida, realizou-se a transferência para membranas de 

PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite (1%) ou com BSA (1%) 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

27 

preparados em tampão Tris contendo tween 20 (0,05%-TBST) e incubadas 

"overnight" com anticorpos primários FGF-2 Goat polyclonal (1:1000 sc-1360  

Santa Cruz, SC, CA, USA), β-actin Mouse monoclonal (1:1000 sc-81178 Santa 

Cruz, SC, CA, USA). Em seguida, foram lavadas com TBST e incubadas com 

anticorpos secundários Rabbitt anti-goat (1:3000 sc-2768 Santa Cruz, SC, CA, 

USA) and Goat anti-mouse (1:3000; sc-2005 Santa Cruz, SC, CA, USA) por 1 

hora. Após lavagem das membranas com TBS, as bandas foram detectadas por 

quimiluminescência (ECL). Para a análise densitométrica das bandas obtidas, foi 

utilizado o software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA), 

apropriado para esse fim. O nível de expressão foi determinado através da razão 

da intensidade do sinal da proteína em relação à β-actina. Os dados são 

expressos como média ±  desvio padrão da média. Em subsequente 

experimento usando inibidores de MAP quinases, e após estimulação com SCF, 

o mesmo protocolo foi realizado.  
 

3.9 Determinação de TGF-β e CCL3/MIP-1α por ELISA em CMLT 

 

A detecção das proteínas analisadas no sobrenadante das CMLT foi 

realizada O sobrenadante foi coletado e armazenado a -80oC até o momento do 

uso. Uma placa de 96 poços para cada proteína analisada (CCL3/MIP-1α e 

TGF-β (kit R&D Systems – TGF-β1 controle) foi revestida com anticorpo 

monoclonal de captura (50 µL por poço), sendo em seguida armazenada a 4°C 

(geladeira) durante 18 horas. No dia seguinte, a placa foi lavada com solução de 

lavagem. Em seguida foram adicionados 100 µL de PBS+BSA 1% em cada 

poço, e as placas foram mantidas em incubação por 2 horas em temperatura 

ambiente. Após, as placas foram lavadas novamente e adicionado 50 µL 

proteína recombinante diluída em PBS+BSA 1% no primeiro poço nas seguintes 

concentrações: (CCL3/MIP-1α (4000pg) e TGF-β (2000 pg/mL, kit R&D Systems 

– TGF-β1 padrão), do segundo poço até o décimo primeiro as concentrações 

foram diluídas à metade e mantidas incubando por 2 horas a temperatura 

ambiente. Após 2 horas, as placas foram lavadas, sendo adicionado 50 µL de 

anticorpo biotinilado diluído em PBS+BSA 1% para CCL3/MIP-1α e TGF-β (kit 

R&D Systems – TGF-β conjugado) e mantidas em incubação durante 1 hora. 

Após, as placas foram lavadas, adicionado 50 µL do reagente TMB (Sigma, CA, 



MATERIAIS E MÉTODOS

 

28 

USA) em cada poço e incubadas durante 30 minutos em ambiente livre de luz a 

temperatura ambiente. Após os 30 minutos, 100 µL de solução de H2SO4 4N foi 

adicionado a cada poço para a paralisação da reação enzimática. A 

quantificação dos resultados foi feita pela leitura da densidade óptica das 

amostras usando um espectrofotômetro com absorbância de 450nm. A 

concentração do CCL3/MIP-1α e TGF-β foi calculada a partir de uma curva 

padrão em pg/mL. 
 

3.10 Efeito de SB 202190, PD 98059 e SP 600125 sobre a produção de FGF-2 
e CCL3/MIP-1α e expressão de TGF-β por CMLT estimuladas por SCF. 
 

Neste grupo de experimentos, CMLT foram pré-tratadas com os inibidores 

de MAP quinases p38 SB202190 (SB, 25 mmol/L; Calbiochem) (OLIVEIRA et al., 

2011), p42/44 (ERK1/2) PD98059 (PD, 30mmol/L; Calbiochem) (OLIVEIRA et 

al., 2011)  e JNK SP600125 (SP, 10 mmol/L; Calbiochem) (MARCHAND-ADAM 

et al., 2005) por 30 minutos seguidos por estimulação com SCF (10 ng/mL) por 

24 horas. O sobrenadante livre de células foi armazenado para avaliação de 

CCL3/MIP-1α e TGF-β por ELISA, e as células foram coletadas para a detecção 

da produção de FGF-2 usando a técnica de Western blotting e expressão de 

RNA mensageiro para TGF-β usando  RT-PCR. 
 
3.11 Análise estatística 

Os dados foram obtidos a partir de, pelo menos, três séries 

independentes de experimentos e as análises foram realizadas usando o 

programa estatístico GraphPad Prism (versão 5.0). Os dados foram expressos 

como média ± SEM e as comparações entre os grupos foram feitas usando o 

teste ANOVA com correção de Bonferroni. Valores de p < 0.05 foram 

considerados estatisticamente significantes. 

 



RESULTADOS

 

29 

4 RESULTADOS 
 

4.1 Caracterização de células da musculatura lisa de traqueia. 
 

CMLT começaram a migrar dos fragmentos da traqueia após uma 

semana, iniciando o processo de aderência à superfície das placas e 

proliferação no meio de cultura. Suas características foram identificadas por 

microscopia ótica e coloração pela técnica de Hematoxilina/Eosina (H&E). As 

células apresentaram aspecto fusiforme com núcleo central oval, e quando em 

confluência, assumindo o aspecto denominado “montanha & vale”, característico 

de células musculares lisas em cultura, identificadas por microscopia ótica (Fig. 

2A e 2B) e coloração por H&E (Fig. 2C). Para confirmar as características 

fenotípicas das CMLT em cultura primária in vitro, e excluir possível 

contaminação com fibroblastos e células epiteliais, coloração por 

imunofluorescência para α-actina de músculo liso, α-citoqueratina e α-FAP foram 

realizadas. Células tratadas com anticorpos específicos, não apresentaram 

marcação para citoqueratina (Fig. 2D) nem para FAP (Fig. 2E) e marcação para 

α-actina de músculo liso (Fig. 2F). Estes resultados demonstraram que CMLT 

expressam marcadores para α-actina de músculo liso, indicando pureza da 

linhagem celular primária produzida. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



RESULTADOS

 

30 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig. 2 - CMLT de camundongos cultivadas em DMEM completo. Imagens de cultura de 
célula com aumento de 100x(A) e 200x(B), e cultura de célula após coloração com 
Hematoxilina/Eosina com aumento de 200x (C) obtidas por Microscópio de Contraste de 
Fase acoplado com Câmera digital Olympus. Imagens obtidas por Imunofluorescência 
revelando ausência de células marcadas para anticorpos anti-citoqueratina com aumento de 
400x(D) e anti-FAP com aumento de 400x(E), e presença de células marcadas para 
anticorpos Anti-α-actina de músculo liso com aumento de 800x(F).    

 

 

 



RESULTADOS

 

31 

4.2 CMLT estimuladas por SCF expressam receptores c-Kit 
 

CMLT foram estimuladas com 10 ng/mL de SCF e a expressão de c-Kit 

em sua superfície foi avaliada pela técnica de Citometria de Fluxo. Após 

tratamento com anticorpo monoclonal CD117-RPE para receptor de SCF (c-Kit), 

50000 eventos foram computados com número de células acima de 10³, 

considerado o ponto de corte para positividade.  A análise do controle de IgG 

Isotípico com o anticorpo policlonal coelho F(ab’)2 anti-rato IgG-RPE mostrou 

ausência de marcação, não demonstrando autofluorescência com relação às 

amostras examinadas. 23,45% das células não estimuladas com SCF são 

imunorreativas (Fig 3A). As CMLT estimuladas com 10 ng/mL de SCF por 24 h. 

demonstraram alta reatividade ao marcador utilizado (Fig. 3B) e a proporção real 

para o CD117-RPE positivo corresponde à 95,74% dos 50.000 eventos positivos 

analisados, conforme demonstrado no histograma duplo derivado da 

sobreposição das imagens A e B, com resultados incluídos na compensação 

global para excluir a autofluorescência (Fig. 3C). A fig. 3D apresenta a proporção 

relativa das CMLT que apresentaram imunorreatividade ao anticorpo anti-c-Kit 

CD-117RPE. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



RESULTADOS

 

32 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3 – Caracterização da expressão do receptor c-kit em células da musculatura lisa da 
traquéia. Células foram incubadas com anticorpos específicos controle e anti-c-Kit para 
marcadores de superfície. Células não estimuladas (fig.A) e estimuladas com 10ng/mL de 
SCF por 24h (fig. B) apresentaram-se imunorreativas ao anticorpo CD117-RPE. Histograma 
duplo mostra a proporção verdadeiramente positiva para CD117-RPE em células 
estimuladas e não estimuladas (fig.C). Do total de 50.000 eventos positivos, 23,45% 
corresponde à imunorreatividade das CMLT não estimuladas com SCF, enquanto 95,74% 
das células estimuladas com SCF apresentaram-se imunorreativas (fig.D). Dados foram 
obtidos com Attune™ sistema fotométrico de foco acústico (Applied Biosystems®).  

 

 

 

  

 

 



RESULTADOS

 

33 

4.3 SCF induz expressão de RNAm para TGF-β e produção proteica de TGF-
β em CMLT. 
 

Para examinar os efeitos do SCF sobre a expressão e produção de TGF-

β, CMLT foram estimuladas com concentrações crescentes de SCF (1, 10 e 100 

ng/mL) e a avaliação da expressão de RNAm para TGF-β e produção desta 

proteína foram observados em 1h, 6h e 24h. Como mostrado na figura 4, 

observamos expressão constitutiva de TGF-β no grupo controle, 1h e 6h após 

estimulação, sendo reduzida após estimulação com SCF 1, 10 e 100 ng/mL (Fig. 

4A e 4B). Notamos que, contrariamente ao ocorrido nos tempos de 1h e 6h, com 

24h, a expressão de TGF-β aumentou com SCF10 ng/mL, chegando ao nível do 

controle com SCF100 ng/mL (Fig. 4C). A produção de TGF-β proteína mostra 

aumento significativo já com 6h após a estimulação com SCF na concentração 

de 100ng/mL (Fig. 5B), alcançando o pico após 24h com 10 e 100 ng/mL de 

SCF (Fig. 5C). 



RESULTADOS

 

34 

 
Fig. 4 - Expressão gênica de TGF-β por CMLT estimuladas com SCF. CMLT de 
camundongos em confluência e aderidas em placas de 24 poços, foram incubadas com 
SCF por 1h (A), 6h (B) e 24h (C) após estímulo com concentrações de 1, 10 e 100 
ng/mL. Níveis de TGF-β mRNA foram mensurados por RT-PCR. O gel é representativo 
de três experimentos com resultados similares. A representação da relação TGF-β/ β-
actina foi determinada por meio de análise de densitometria. Os resultados representam 
a média + EPM obtida em três experimentos independentes, com resultados similares 
obtidos em cada vez. (ANOVA com teste de múltipla comparação de Bonferroni), * p 
<0,001 comparado com controle não tratado. 



RESULTADOS

 

35 

 

Fig. 5 - Concentração proteica de TGF-β por CMLT estimuladas com SCF. CMLT de 
camundongos em confluência e aderidas em placas de 24 poços, foram incubadas com 
SCF por 1h (A), 6h (B) e 24h (C) após estímulo com concentrações de 1, 10 e 100 
ng/mL. A produção de TGF-β em pg/mL no sobrenadante livre de células estimuladas 
pg/mL foi avaliada por ELISA. Os resultados representam a média + EPM obtida em 
três experimentos independentes, com resultados similares obtidos em cada vez. 
(ANOVA com teste de múltipla comparação de Bonferroni), ** p <0,05 e *** p <0,01 
comparados com controle não tratado. 
 
 
 
 
 



RESULTADOS

 

36 

4.4 SCF induz produção de FGF-2 proteína em CMLT. 
 

Nossos resultados demonstram produção constitutiva de FGF-2 no grupo 

controle de 1h após estimulação, sendo reduzida após estimulação com SCF (1, 

10 e 100 ng/mL) (Fig. 6A). A produção constitutiva de FGF-2 decresce após 6h e 

nós já observamos que a produção após o estímulo por SCF (1, 10 e 100 ng/mL) 

aumenta significantemente em modo dose-resposta, quando comparada com o 

grupo controle, sendo mais significante na concentração de 100 ng/mL (Fig. 6B). 

É notado finalmente que a produção de FGF-2, embora seja significante no 

grupo estimulado de 24h, decresce em comparação ao grupo de 6 h após 

estimulação (Fig. 6C). 

 

 



RESULTADOS

 

37 

 

Fig. 6 - Produção proteica de FGF-2 induzida por SCF. CMLT foram incubadas em 
placas de 24 poços e tratadas com 1, 10 e 100 ng/mL, em 1h (A), 6h (B) e 24h (C). 
Proteínas extraídas do lisado celular foram analisadas para FGF-2 e β-actina Western 
blott. A representação da relação FGF-2/β-actina foi determinada por meio de análise 
densitométrica. Os resultados representam a média + EPM obtida em três experimentos 
independentes, com resultados similares obtidos em cada vez. (ANOVA com teste de 
múltipla comparação de Bonferroni) * p <0,05 comparado com o controle não tratado. 
 



RESULTADOS

 

38 

4.5 SCF induz produção de CCL3/MIP-1α em CMLT. 
 

Nossos dados demonstram que 1h estimulação por SCF, não houve 

aumento significante na produção de CCL3/MIP-1α por CMLT (Fig. 7A). O pico 

da produção de CCL3/MIP-1α ocorreu 6h após estimulação com 10 ng/mL de 

SCF, diminuindo no grupo de 24h, no entanto, no entanto, SCF (1 e 10 ng/mL) 

foram capazes de estimular de modo significativo CMLT a produzir CCL3/MIP-1α 

quando comparados ao grupo controle (Fig. 7B e 7C). 

 



RESULTADOS

 

39 

 
 

Fig. 7 - Produção de CCL3/MIP-1α em sobrenadante de CMLT estimuladas por SCF 
para 1h (A), 6h (B) e 24h (C) nas concentrações de 1, 10 e 100 ng/mL. A concentração 
de CCL3/MIP-1α em pg/mL foi avaliada por ELISA. Os resultados representam a a 
média + EPM obtida em três experimentos independentes, com resultados similares 
obtidos em cada vez. (ANOVA com teste de múltipla comparação de Bonferroni) ** p 
<0,01 e * p <0,05 comparadas com o controle não tratado 
 



RESULTADOS

 

40 

4.6 SB, PD e SP inibem a expressão de RNAm para TGF-β e produção das 
proteína TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α em CMLT 
 

Para determinar se as vias de sinalização intracelular p38, ERK1/2 e JNK 

estavam envolvidas na expressão gênica e proteica de TGF-β, produção de 

FGF-2 e CCL3/MIP-1α, células em incubação no mesmo meio utilizado nos 

experimentos anteriores, foram pré-tratadas com os inibidores de MAP quinases 

PD (30 μM), SB (10 μM) ou SP (10 μM) por 30 minutos seguidos por estimulação 

com 10 ng/mL de SCF. Nós podemos observar que a inibição da fosforilação das 

três vias reduziu significantemente a expressão gênica de TGF-β (Fig. 8A) e sua 

produção proteica (Fig. 8B) nas CMLT estimuladas com SCF. Em relação à 

produção proteica de FGF-2, nós observamos uma inibição parcial na 

fosforilação das vias p38 e JNK, e completa inibição da fosforilação da via 

ERK1/2 com relação ao grupo controle, nas CMLT estimuladas com SCF (Fig. 

9A). A produção de CCL3/MIP-1α foi completamente inibida por SB, PD e SP 

(Fig. 9B).  

 

 

 



RESULTADOS

 

41 

 
Fig. 8 – Drogas SB 202190, PD98059, SP 600125 inibem a produção proteica e 
expressão de TGF-β mRNA em CMLT estimuladas por SCF. CMLT em confluência 
foram pré-tratadas por 30 minutos com SB 202190 (SB), PD98059 (PD) e SP 600125 
(SP) e estimuladas com SCF 10 ng/mL por 24 h. A expressão gênica de TGF-β 
analisada por Western Blott. A representação da relação TGF-β/β-actina foi 
determinada por meio de análise densitométrica (A). O nível da concentração proteica 
de TGF-β foi avaliado por ELISA (B). Os resultados representam a média + EPM obtida 
em três experimentos independentes, com resultados similares obtidos em cada vez. 
(ANOVA com teste de múltipla comparação de Bonferroni). ## p< 0,01 e # p <0,001 
comparadas com controle não tratado; ** p <0,01 e * p <0,001 comparados com grupo 
tratado somente com SCF. 
 
 



RESULTADOS

 

42 

 
 
Fig. 9 – Drogas SB 202190, PD98059, SP 600125 inibem a produção de FGF-2 e 
CCL3/MIP-1α em CMLT estimuladas com SCF. CMLT em confluência foram pré-
tratadas por 30 minutes com SB 202190 (SB), PD98059 (PD) e SP 600125 (SP) e 
estimuladas com SCF 10 ng/mL for 24 h. A expressão proteica de FGF-2 foi analisada 
por Western Blott. A representação da relação FGF-2/β-actina foi determinada por meio 
de análise densitométrica (A). O nível de concentração de CCL3/MIP-1α foi mensurado 
por ELISA (B). Os resultados representam a média + EPM obtida em três experimentos 
independentes, com resultados similares obtidos em cada vez. (ANOVA com teste de 
múltipla comparação de Bonferroni). # p <0,001 comparado com o controle não tratado; 
* p <0,001 comparado com o grupo tratado somente com SCF. 
 

 



DISCUSSÃO

 

43 

5 Discussão 
 

Nossos estudos mostram que células da musculatura lisa da traqueia 

estimuladas por SCF, produzem FGF-2, TGFβ e CCL3/MIP-1α, via ativação das 

MAP quinases p38, ERK1/2 e JNK. Além disso, demonstramos pela primeira vez 

que estas células expressam o receptor de tirosina-quinase c-Kit, ligante do 

SCF. 

A caracterização da cultura das células primárias obtidas da traqueia de 

camundongos foi determinada, sendo observadas células do tipo fusiforme com 

núcleo central ovalado (CHAMLEY-CAMPBELL ET AL., 1979; CAMPBELL & 

CAMPBELL, 1993), que, em alta densidade, tendem a assumir a disposição 

morfológica denominada “montanha & vale”, característica de células 

musculares lisas em cultura, aspecto demonstrado em resultados de prévios 

estudos (WONG et al., 1998; PANG et al., 1997 e AN et al., 2006). Células 

epiteliais da traqueia de camundongos, avaliadas no processo de transição para 

células mesenquimais, em doenças envolvendo remodelamento de vias aéreas 

(KUROISHI et al., 2009), por análise de imunofluorescência, revelaram a 

presença de α-actina de músculo liso imunorreativa, após diferenciação por 

estímulo fibrogênico. WONG et al. (1998) demonstrou que esse marcador e 

outros filamentos de proteínas, também são imunorreativos na musculatura lisa 

traqueal e que este processo é regulado por condições apropriadas de cultura. 

Em nossos estudos, utilizamos a técnica de coloração por imunofluorescência 

para detecção de α-actina de músculo liso, para nos certificarmos da ausência 

de células epiteliais e fibroblastos e, deste modo, confirmar a pureza da 

linhagem celular obtida em cultura primária.  

CMLT tem revelado, em vários estudos, ser importante como origem de 

mediadores tais como citocinas, quimiocinas e derivados lipídicos (JOHNSON et, 

1995), com habilidade para promover e perpetuar os mecanismos inflamatórios 

presentes em patologias como o asma (CHUNG, 2000). Nosso trabalho 

apresenta alguns possíveis mecanismos relacionados à ativação das CMLT por 

SCF em produzir substâncias envolvidas no processo inflamatório alérgico das 

vias aéreas. Os mediadores secretados podem estimular vários tipos celulares, 

induzindo ao recrutamento celular e à ativação da cascata inflamatória (MCKAY 



DISCUSSÃO

 

44 

et al, 2001). As células recrutadas ou as células residentes podem ser, portanto, 

responsáveis por iniciar e perpetuar os processos patológicos e, a interação 

célula-célula contribui para a hiper-reatividade nos distúrbios das vias aéreas, 

demonstrando que os linfócitos T, mastócitos e células da musculatura lisa 

interagem diretamente, via moléculas de adesão celular (DAMERA et al., 2009). 

Esta inter-relação parece evidenciar que CMLT também são potenciais fontes da 

produção de fatores de crescimento envolvidos no espessamento da parede das 

vias aéreas (MCKAY et al., 2001).  

Em nossos estudos, utilizamos o SCF como um fator ativador para as 

células da musculatura lisa da traqueia. 

SCF está envolvido nas condições inflamatórias e não inflamatórias na 

asma (DA SILVA et al, 2005), sendo produzido por vários tipos celulares 

incluindo CMLT, em resposta a variados estímulos, tendo um papel importante 

como fator quimiotático para mastócitos durante a inflamação alérgica (KASSEL 

et al, 1999). Dados da literatura demonstram que a expressão de SCF está 

aumentada em experimentos prévios realizados in vitro com CMLT em 

condições inflamatórias induzidas com Interleucinas, associadas ao aumento no 

número e na ativação de mastócitos no processo asmático (DA SILVA et al, 

2006).  

A produção de SCF durante a inflamação alérgica pode contribuir 

significantemente para indução da resposta inflamatória eosinofílica e hiper-

reatividade, via ativação da população local de mastócitos, sendo identificado 

que os mediadores primários liberados durante este processo são os metabólitos 

de Cisteinil-leucotrienos LTC4 e LTE4 (OLIVEIRA et al., 2001). Linhagens 

primárias de mastócitos foram submetidas a cultivo, crescimento, manutenção e 

incubação com IL-3 e SCF, mostrando positividade para receptores c-Kit por 

Citometria de Fluxo, apresentando proliferação em resposta à simples estímulos 

com SCF, IL-3, IL-4, ou IL-10 (LUKACS et al., 1996). Estes estudos demonstram 

a atividade importante de participação do SCF dentro do processo inflamatório 

alérgico das vias aéreas e, portanto, justifica-se sua utilização em nosso estudo, 

demonstrando o papel ativador do SCF sobre as CMLT, induzindo a produção 

de outros mediadores, bem como a identificação de seu receptor nessas células.

 



DISCUSSÃO

 

45 

Numerosos estudos têm detectado a expressão de receptor c-Kit em 

vários tipos celulares que respondem ao SCF, como melanócitos (NOCKA et al., 

1989), células germinativas (MAYRHOFER et al., 1987), células progenitoras 

hematopoiéticas e linhagens linfoides (GEISSLER et al., 1988; AYE et al., 1992; 

BROUDY et al., 1992; GODFREY et al., 1992; NOCKA et al., 1989; OGAWA et 

al., 1991), eosinófilos (YUAN et al., 1997), basófilos (COLUMBO et al., 1992) e 

mastócitos (NOCKA et al., 1989; MAYRHOFER et al., 1987), aonde são 

caracterizados como receptores com domínio transmembrânico e com atividade 

de tirosina-quinase intrínseca (JIANG et al., 2000). Nossos estudos identificaram 

a presença de c-Kit em CMLT com aumento de sua expressão após estimulação 

com SCF, em análises realizadas por Citometria de fluxo, entretanto este padrão 

de resposta difere da observada em células megacarioblásticas humanas 

(CMK), onde a estimulação com SCF regula negativamente a expressão do c-Kit 

através do sistema de degradação endolisossomal (TANAKA et al., 2012). 

Nosso resultado demonstrou, pela primeira vez, que CMLT podem responder 

diretamente ao estímulo do SCF e, possivelmente, pela ativação do receptor c-

Kit. 

Foi observado em nossos estudos que CMLT estimuladas por SCF, 

expressam o gene e produzem a proteína TGF-β, produzindo também a proteína 

FGF-2. Tanto a expressão do RNAm quanto a produção da proteína, foram 

analisadas 1, 6 e 24h após o estímulo com concentrações de 1, 10 e 100 ng/mL 

do SCF. 

Estudos relacionando a atividade do TGF-β e FGF-2 na inflamação e 

remodelamento das vias aéreas ainda são incipientes (YUM et al., 2011) e o 

papel específico destas citocinas na cascata de células e mediadores presentes 

na asma permanece pouco conhecido. O papel das CMLT sobre a síntese 

destes mediadores é descrito em alguns estudos recentes, não sendo, no 

entanto, encontrados estudos sobre a possível relação entre o SCF, TGF-β e 

FGF-2 nestas estruturas, especialmente em células da musculatura lisa isoladas 

de traqueia, no entanto, vários estudos mostraram ser a musculatura lisa da 

traqueia, importante estrutura orgânica vinculada aos eventos inflamatórios 

alérgicos relacionados à asma. 

 

 



DISCUSSÃO

 

46 

CMLT de porcos em modelos experimentais de asma simulada in vitro, 

foram utilizadas para avaliar os mecanismos de resistência e adaptação ao 

processo inflamatório (MCPARLAND et al., 2005). A expressão gênica de 

receptores de neuroquinina-1 em músculo liso traqueal de ratos aumenta a 

resposta alérgica relacionada às vias aéreas (MAGHNI et al., 2003). A IL-13 

aumenta a contratilidade de músculo liso de traqueia em camundongos 

(FARGHALY et al., 2008). Outros estudos demonstrando a relação da traqueia 

com a asma revelam envolvimento desta estrutura, envolvida na proliferação 

celular (MALAVIA et al., 2009); na hipertrofia, hiperplasia e deposição da matriz 

extra-celular (JAMES et al., 2012); no relaxamento induzido por óxido nítrico 

(PEREZ-ZOGHBI et al., 2010); no remodelamento das vias aéreas (BARA et al., 

2010);  e na expressão de IL-8 (MULLAN et al., 2008). Todos estes estudos 

foram realizados com células epiteliais ou de musculatura lisa traqueal humana.  

Nossos estudos buscaram avaliar o papel de CMLT de camundongos 

obtidas em cultivo primário, com o objetivo de examinar, inicialmente, os efeitos 

do SCF na expressão gênica e proteica de TGF-β. A expressão de RNAm para 

TGF-β ocorreu constitutivamente nos grupos controle de 1h e 6 h após o 

estímulo, ficando reduzido nas amostras estimuladas com SCF. Estes dados 

sugerem que, por razões ainda não bem esclarecidas, a expressão constitutiva 

de RNAm para TGF-β pode ser devido à possível interação entre fatores 

inibitórios produzidos pelas células ou após acesso ao estado excitado das 

células, que precisam de um tempo maior para retornarem ao estado basal após 

aderência aos poços da placa com o meio de cultura.  

Estudos realizados por outros autores revelam também ocorrer 

expressão constitutiva de TGF-β em células musculares lisas das vias aéreas, 

com aumento significativo em processos fisiopatológicos como a asma. COKER 

et al. (1996) demonstra a expressão de RNAm para TGF-β em pulmão de 

humanos e camundongos normais, sugerindo que estes peptídeos tem 

importante papel na homeostase das vias aéreas, resultados corroborados por 

BOTTOMS et al. (2010) que relacionou a importância do TGF-β na remodelação 

das vias aéreas por meio de ensaios imunohistoquímicos. AUBERT et al. (1994) 

já demonstrou a expressão constitutiva de RNAm para TGF-β, bem como de seu 

nível proteico e, além disso, sugere que nesta proteína, aparentemente, não tem 

sua expressão muito aumentada em pacientes com asma ou doença pulmonar 



DISCUSSÃO

 

47 

obstrutiva crônica, em ensaios realizados com tecidos pulmonares. No entanto, 

nenhum dado relacionado à diminuição da expressão constitutiva do TGF-β, em 

função do tempo, em CMLT foi encontrado. Portanto, novos estudos podem ser 

necessários para explicar este fenômeno. No período experimental de 24 horas, 

o grupo controle mostrou mínima expressão do RNAm para TGF-β mas, no 

grupo estimulado com 10 ng/mL de SCF, a expressão mostrou significante 

aumento. Esta relação entre os níveis de TGF-β e a via SCF/c-Kit foi também 

observada no modelo de remodelamento das vias aéreas superiores em 

camundongos sensibilizados com ovalbumina, onde o inibidor tirosina-quinase 

imatinibe diminuiu os níveis de TGF-β1 e SCF (RHEE et al., 2011). 

O aumento da expressão de RNAm para TGF-β foi acompanhado pelo 

aumento na produção desta proteína, particularmente durante o período de 6h 

após a estimulação com 100 ng/ml e 24 h após estimulação com 10 e 100 ng/mL 

de SCF. O fenômeno da expressão constitutiva do RNAm para TGF-β, 

observada nos grupos controle de 1h e 6h, não se repetiu com relação à 

produção da proteína. Diferenças observadas entre a expressão gênica e 

proteica de um mesmo mediador, podem ser devidas a atividade das proteínas 

reguladoras que podem inibir ou ativar a transcrição do RNAm, bem como o 

sequente processo de sua tradução a nível citoplasmático. Não encontramos na 

literatura, estudos que demonstrem a relação do SCF no aumento da expressão 

gênica e proteica de TGF-β em CMLT.  

Estudos prévios relacionados ao tema revelam que a infiltração de 

neutrófilos e mastócitos no músculo liso das vias aéreas tem sido observada em 

pacientes sensíveis a alergias comuns e asma e que esse fenômeno pode ser 

devido à liberação de TGF-β pela musculatura lisa de brônquios humanos (LEE 

et al, 2006). CHAKIR et al. (2003) sugere que a atividade do TGF-β e de outros 

mediadores estão relacionadas com a severidade dos processo patológico 

relacionado à asma, em análise de biópsias bronquiais de humanos. MINSHALL 

et al. (1997) mostra que pode ser atribuído ao TGF-β1, importante papel não 

alterações fibróticas que ocorrem nas vias aéreas asmáticas também em 

ensaios com biópsias bronquiais humanas. Células da musculatura lisa das vias 

aéreas de modelos humanos e de camundongos estimuladas in vitro, induzem 

significante atividade quimiotática para mastócitos e produção de TGF-β e SCF 

(BERGER et al., 2003), e o número de mastócitos infiltrados tardiamente no 



DISCUSSÃO

 

48 

músculo liso em pacientes asmáticos é correlacionado com a expressão de 

TGF-β nestes tecidos (BERGER et al., 2005). CMLT bovina em cultura teve sua 

proliferação aumentada após estimulação por TGF-β na ausência de soro fetal 

bovino (CHEN et al., 2006). WONG et al., (2006) utilizou o SCF como estímulo 

para ativação de linhagem de mastócitos em experimentos in vitro, 

demonstrando a liberação de TNF-α, MCP-1, RANTES, regulada pelas MAPK 

p38 e ERK. Estudos que mostram a modulação da expressão e secreção de 

TGF-β em CMLT após estímulo por SCF são inéditos, contudo células da 

musculatura lisa das vias aéreas superiores provenientes de biópsias 

brônquicas, quando devidamente estimuladas, podem aumentar a secreção de 

TGF-β1, a expressão da α-actina em células musculares lisa e a contração 

agonista provocada, contribuindo para a desordem fisiológica das vias aéreas 

que caracteriza a asma (WOODMAN et al., 2008) 

Nosso estudo também procurou investigar a produção de FGF-2 por 

CMLT estimuladas com SCF. Demonstramos que a produção de FGF-2 por 

CMLT foi significantemente aumentada nos períodos de 6h e 24h após estímulo 

com SCF. YUM et al. (2011), investigando aspectos da remodelação das vias 

aéreas usando camundongos desafiados de forma crônica com OVA, revelou 

aumento da co-expressão de FGF-2 e TGF-β por macrófagos no fluido bronco-

alveolar. ZOU et al. (2008) demonstraram que FGF-2 pode estimular diretamente 

a proliferação e migração de células da musculatura lisa brônquica e, apesar 

disto, a expressão do fenótipo de células contráteis diminuiu. FOLKMAN et al. 

(1987), em ensaio de proliferação e diferenciação celular atribuiu importante 

papel angiogênico, mitogênico e quimiotático para fibroblastos ao FGF-2, 

enquanto MOHAN et al. (2010) o relaciona à inflamação e cicatrização de 

feridas. CHOTANI et al. (2000) relaciona ao FGF-2 um papel fundamental na 

divisão, proliferação e migração celulares em células renais, células da 

musculatura lisa e fibroblastos pulmonares, cérebro e retina. KRANENBURG et 

al. (2002), em experimentos "in vivo" e "in vitro", reporta o FGF-2, como um 

importante participante no processo de remodelamento vascular em doenças 

pulmonares obstrutivas crônicas. Em complemento, BOSSÉ et al. (2005) 

estabeleceu possíveis efeitos sinérgicos "in vitro" entre FGF-2 e TGF-β na 

atividade fibrogênica em processos patológicos e hiperplásicos das vias aéreas, 

enquanto SONG et al. (2002) sugere que, apesar da atividade do TGF- β no 



DISCUSSÃO

 

49 

processo de remodelamento ocorrer mais rapidamente do que o FGF-2, a 

resposta sinérgica de ambos os fatores contribuem para uma reparação mais 

tardia associada com a migração das células.  

Os resultados deste nosso estudo sugerem que a expressão gênica e a 

produção proteica de TGF-β e FGF-2 e sua atividade coordenada, depende 

dentre outros fenômenos, da mediação do SCF em CMLT.  

Nosso estudo investigou a possibilidade do SCF estimular CMLT a 

produzir CCL3/MIP-1α. Os efeitos dessa quimiocina parecem diferir de acordo 

com o tipo celular e a espécie testada. Estudos prévios já citados demonstraram 

que esta quimiocina pode contribuir para a remodelação das vias aéreas na 

asma, por aumento no número e sobrevivência de células musculares lisas 

traqueais humanas (HALWANI et al., 2011). Primariamente, o CCL3/MIP-1α é 

associado com atividade quimiotática atribuída às células mononucleares 

(OPPENHEIM et al., 1991), mas também pode ser localizado em granulomas 

fibroblásticos (LUKACS et al., 1994), células epiteliais bronquiolares e alveolares 

de camundongos infectados com o Vírus sincicial respiratório (HAEBERLE et al., 

2001) e fibrose pulmonar (RUSSO et al, 2011).  

Nossos dados demonstram que CMLT estimuladas com SCF produzem 

CCL3/MIP-1α, nos tempos de 6h e 24h após o estímulo, sugerindo um possível 

papel desta quimiocina no processo de migração destas células até o epitélio, 

como previamente proposto para células de musculatura lisa bronquial 

(HALWANI et al., 2011). Novos estudos devem ser realizados para avaliar se o 

aumento da produção de TGF-β e FGF-2 em CMLT estimuladas com SCF, 

como previamente citado, pode ser influenciado pela síntese de CCL3/MIP-1α 

por essas células, assim como se CCL3/MIP-1α poderia contribuir para o 

remodelamento das vias aéreas característico da asma na região da traqueia. 

Em conjunto, nossos dados mostram um aumento na produção de 

FGF-2, TGF-β e CCL3/MIP-1α por CMLT estimuladas por SCF e que esse 

processo é possivelmente regulado pela ativação dos receptores c-Kit presentes 

nas mesmas.  

Diante destes resultados, foi objetivo de nossa pesquisa científica, 

avaliar algumas das possíveis vias de sinalização intracelulares envolvidas na 

interação do SCF com seu receptor na resposta de incremento da expressão de 



DISCUSSÃO

 

50 

TGF-β, FGF-2 e MIP-1α por CMLT. As células foram pré-tratadas com inibidores 

das vias de MAPK p38, ERK1/2 e JNK e estimuladas com SCF.  

Nós observamos que houve uma significante diminuição na expressão 

de RNAm para TGF-β, com respeito às três vias analisadas. O mesmo ocorreu 

com relação à expressão proteica deste alvo, processos em que parece ter 

ocorrido uma maior tendência para inibição da JNK, não sendo estatisticamente 

significante, via principalmente ativada por estresse celular e estímulos 

inflamatórios em vários tipos celulares, como já demonstrado na literatura 

(DAVIS et al., 2000; KYRIAKIS & AVRUCH, 2001), bem como em experimentos 

envolvendo músculo liso das vias aéreas de pacientes asmáticos com aumento 

da produção de CXCL10 (ALRASHDAN et al., 2012).   

Com relação à produção de FGF-2, detectamos significante redução na 

expressão desta proteína com relação às três vias de sinalização investigadas, 

entretanto, os dados sugerem que em relação à rota da ERK1/2 parece ocorrer 

uma maior inibição nesse processo, contrário aos conceitos já estabelecidos por 

outros autores (MIYAZAWA et al., 1991; DAVIS et al., 2000; KYRIAKIS & 

AVRUCH et al., 2001). ZHOU et al. (2002), relaciona a ativação desta via a 

estímulos mitogênicos, característicos da atividade fibrogênica atribuída ao FGF-

2, com um aumento na diferenciação de fibroblastos e fosforilação  de 

numerosas citocinas e fatores de crescimento, o que pode, por analogia, 

corroborar nossos resultados, em função do papel fibrogênico desta proteína no 

processo de remodelamento relacionado às inflamações alérgicas das vias 

aéreas.  

No que diz respeito à produção de CCL3/MIP-1α, nossos dados 

demonstraram uma significante inibição das três vias analisadas, especialmente 

com relação à da MAPK p38, também relacionada ao estímulo estressante e 

produção de citocinas inflamatórias, como já demonstrado com relação à 

expressão de VEGF em doenças alérgicas das vias (KIM et al., 2012) . A 

atividade quimioatraente desta proteína sugere que talvez ela possa ser 

expressa anteriormente e, deste modo, participar da cascata que promove a 

ativação de outros fatores. Mais estudos serão necessários para determinar 

essa possível relação.

Nossos resultados sugerem que as três vias de sinalização analisadas, 

são importantes na ativação das CMLT estimuladas por SCF e sua interação 



DISCUSSÃO

 

51 

com os receptores c-Kit, para produzir TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α, não sendo 

encontrados na literatura, dados que demonstrem processos semelhantes. No 

entanto, dados análogos a esse aspecto de nossa investigação, foram citados 

em trabalhos prévios de alguns autores demonstrando que SCF induz a 

dimerização os receptores c-Kit produzidos em células intactas do endotélio 

aórtico de porcos via atividade de proteínas-quinase (BLUME-JENSEN et al., 

1991), enquanto ROTTAPEL et al. (1991) mostra que ocorre atividade tirosina-

quinase intrínseca em domínios catalíticos que levam à fosforilação de 

receptores c-Kit de mastócitos murinos. Estas interações promovem a ativação 

da proteína RAS com posterior estimulação de várias proteínas-quinases 

citoplasmáticas, dentre elas a ERK1/2, p38 e JNK, o que, por sua vez, migram 

para o núcleo celular, onde fosforilam um número de moléculas responsáveis 

pela transcrição gênica, assim iniciando a proliferação celular (SEGER et al., 

1995; ISHIZUKA, 1998; ISHIZUKA, 1999; SEGER et al., 1995). RONNSTRAND 

et al. (2004) afirma que, a compreensão dos mecanismos de sinergia entre SCF 

e várias citocinas também é um campo desafiador para futuras pesquisas. 

Outros estudos foram direcionados a esta linha de investigação, mostrando que 

a via p38 MAPK regula a resposta de IL-1β em culturas de células de músculo 

liso traqueal humano (LAPORTE et al., 2000). SAKAI et al. (2004) sugere o 

envolvimento da via ERK1/2, que fosforilada promoveu aumento da proteína 

RhoA na contração em tecido liso bronquial induzido por TNF-α em ratos. 

Estudo com fibroblastos pulmonares sugerem que sua proliferação é mediada 

por TGF-β1, induzindo a liberação de FGF-2 extracelular e fosforilação da via 

p38 e JNK (KHALIL et al., 2005). CHEN et al. (2006) demonstra que TGF-β1 

aumenta a proliferação de CMLT bovina por fosforilação de MAPK e XIE et al. 

(2007), mostra que a via ERK1/2 modula o fenótipo de células da musculatura 

lisa bronquial em modelo de asma crônica em rato. 

Tomados em conjuntos, nossos dados mostram que as células da 

musculatura lisa da traqueia estimuladas por SCF produzem TGF-β, FGF-2 e 

CCL3/MIP-1α e aumentam o receptor c-kit. Além disso, as vias das MAP 

quinases podem ser importantes alvos terapêuticos para o controle da 

inflamação das vias aéreas mediadas pela ativação das células da musculatura 

lisa da traqueia. 

 



REFERÊNCIAS

 

52 

Resumo dos Resultados 
 

� Células da musculatura lisa da traqueia estimuladas com SCF induzem a 

presença de receptores c-Kit;  

‘ 

� As células da musculatura lisa da traqueia de camundongos Balb/c estimuladas 

com SCF produzem TGF-β, FGF-2 e CCL3/MIP-1α; 

 

� Os mecanismos envolvidos nesta expressão, provavelmente são mediados pela 

ativação das vias de sinalização intracelular p38, ERK1/2 e JNK; 

 

 

 

Conclusão Final 
 

� Células da musculatura lisa da traquéia estimuladas por SCF produzem TGF-β, 

FGF-2 e CCL3 via ativação das vias de sinalização p38, ERK1/2 e JNK. 

 
 

� Receptores c-Kit e MAPK podem ser importantes alvos farmacológicos para 

novas formas de tratamento das inflamações alérgicas das vias aéreas.  

 
 

� Novas informações foram adicionadas com relação ao papel do músculo liso 

traqueal na inflamação alérgica. 

 
 
 



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