Hermano Martins Bellato 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Análise do envolvimento do Fator de Início de Tradução de Eucariotos 5A (eIF5A) na 

translocação de proteínas para o Retículo Endoplasmático em Saccharomyces cerevisiae. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

2013 



	
  

Hermano Martins Bellato 

 

 

 

 

Análise do envolvimento do Fator de Início de Tradução de Eucariotos 5A (eIF5A) na 

translocação de proteínas para o Retículo Endoplasmático em Saccharomyces cerevisiae. 

 

 

Trabalho de Conclusão de 

Curso apresentado ao Curso de 

Graduação em Farmácia-Bioquímica da 

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de 

Araraquara, da Universidade Estadual 

Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para 

obtenção do grau de Farmacêutico - 

Bioquímico. 

 

 

 

Orientador: Prof. Dr. Sandro Roberto Valentini 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

2013 



	
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dizem que amamos verdadeiramente alguém pela tormenta que essa pessoa nos causa ou 

pela tranquilidade e segurança que gera em nossos corações... Dedico esse trabalho a única 

pessoa que amo pelos dois caminhos: minha mãe! 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
  

AGRADECIMENTOS 

 

Sem Deus jamais teria o equilíbrio necessário para nunca ter desistido... 

 

Aos meus pais, pelo apoio financeiro... A minha mãe, por termos aprendido tanto nos últimos 

anos. 

 

Aos professores Dr. Sandro Roberto Valentini e Dr. Cleslei Fernando Zanelli pela 

oportunidade singular, fundamental para o meu desenvolvimento acadêmico. 

 

A Danuza Rossi, que ao longo dos anos se tornou uma irmã para a vida toda. 

 

Aos amigos: 

Larissa Loyolla e Priscila Malaguti... O apoio de vocês foi essencial antes de entrar na 

faculdade e durante toda essa jornada.  

Laura e Diana... tornaram o caminho mais suave e mais seguro e nos tornamos um grupo. 

Alice Haddad e Amanda Saraiva... me proporcionaram o conforto de serem sempre 

constantes e sempre lembraram de mim.  

Camila e Polyanna... foram uma surpresa no final da minha graduação.  

Alexandre... por me ajudar prontamente sempre que necessário, não somente profissional, 

como também pessoalmente.  

Carol Viana... por grandes conselhos.  

Julia, Isabel e Amanda... por sempre me mostrarem que boas risadas tornam a pesquisa mais 

gostosa.  

 

A todo o grupo BiomolVZ, por terem me recebido por tanto tempo e  contribuído de forma 

significativa com o meu amadurecimento como pessoa e como futuro pesquisador.  

 

A FCFAr, ao CNPq e a FAPESP, pelo apoio institucional e financeiro para o 

desenvolvimento deste trabalho.  

 

 

 

 



	
  

 

Nada é mais belo em uma vida toda do que ter conhecido um grande amor, mesmo que não 

seja para sempre... 

 

"Quando encontrar alguém e esse alguém fizer seu coração parar de funcionar por alguns 

segundos, preste atenção. Pode ser a pessoa mais importante da sua vida. Se os olhares se 

cruzarem e neste momento houver o mesmo brilho intenso entre eles, fique alerta: pode ser a 

pessoa que você está esperando desde o dia em que nasceu. Se o toque dos lábios for intenso, 

se o beijo for apaixonante e os olhos encherem d’água neste momento, perceba: existe algo 

mágico entre vocês. Se o primeiro e o último pensamento do dia for essa pessoa, se a vontade 

de ficar juntos chegar a apertar o coração, agradeça: Deus te mandou um presente divino: o 

amor. Se um dia tiver que pedir perdão um ao outro por algum motivo e em troca receber um 

abraço, um sorriso, um afago nos cabelos e os gestos valerem mais que mil palavras, 

entregue-se: vocês foram feitos um pro outro. Se por algum motivo você estiver triste, se a 

vida te deu uma rasteira e a outra pessoa sofrer o seu sofrimento, chorar as suas lágrimas e 

enxugá-las com ternura, que coisa maravilhosa: você poderá contar com ela em qualquer 

momento de sua vida. Se você conseguir em pensamento sentir o cheiro da pessoa como se 

ela estivesse ali do seu lado… se você achar a pessoa maravilhosamente linda, mesmo ela 

estando de pijamas velhos, chinelos de dedo e cabelos emaranhados… Se você não consegue 

trabalhar direito o dia todo, ansioso pelo encontro que está marcado para a noite… se você 

não consegue imaginar, de maneira nenhuma, um futuro sem a pessoa ao seu lado…Se você 

tiver a certeza que vai ver a pessoa envelhecendo e, mesmo assim, tiver a convicção que vai 

continuar sendo louco por ela… se você preferir morrer antes de ver a outra partindo: é o 

amor que chegou na sua vida. É uma dádiva. Muitas pessoas apaixonam-se muitas vezes na 

vida, mas poucas amam ou encontram um amor verdadeiro. Ou às vezes encontram e por não 

prestarem atenção nesses sinais, deixam o amor passar, sem deixá-lo acontecer 

verdadeiramente. É o livre-arbítrio. Por isso preste atenção nos sinais, não deixe que as 

loucuras do dia a dia o deixem cego para a melhor coisa da vida: o amor." – É, eu encontrei 

o amor…  

 

- Carlos Drummond de Andrade  

 

 

 



	
  

 

SUMÁRIO 

 

	
  

1. INTRODUÇÃO 14 

2. OBJETIVO 22 

3. MATERIAIS E MÉTODOS 23 

3.1. Transformação bacteriana pelo método físico 24 

3.1.1. Preparo de E. coli competente 24 

3.1.2. Transformação 25 

3.2. Transformação bacteriana por corrente elétrica 25 

3.2.1.Preparo de E. coli eletrocompetente 25 

3.2.2. Eletroporação 25 

3.3. Preparo de plasmídeos a partir de E. coli em pequena escala – Miniprep (lise 

alcalina) 26 

3.4. Transformação de leveduras 26 

3.5. Cruzamento e esporulação de leveduras 27 

3.5.1. Cruzamento  27 

3.5.2. Esporulação  27 

3.5.3. Dissecção de tétrades e caracterização de haplóides 28 

3.6. Teste de sensibilidade a temperatura 28 

3.7. Extração de DNA genômico de levedura 29 

3.8. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 30 

3.9. Western Blot 

 30 



	
  

4. RESULTADOS 31 

4.1. Interações genéticas entre TIF51A e genes que codificam diferentes proteínas da via 

secretória. 31 

4.2. Avaliação de possíveis defeitos na translocação de proteínas pela via pós-traducional 

em mutantes de eIF5A. 39 

4.3. Avaliação do impacto de mutantes de eIF5A na via co-traducional. 44 

4.4. Análise genética entre o mutante srp102K51I e TIF51A. 48 

4.5. Análises genéticas entre o mutante tif51A-3 e fatores do translocon de via co-

traducional 51 

5. CONCLUSÕES 57 

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58 

7. ANEXO I  60 

	
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
  

RESUMO 

 

O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e em 

eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. 

Este fator já foi relacionado com início de tradução, transporte nucleocitoplasmático, 

decaimento de mRNA e proliferação celular. Entretanto, resultados recentes colocam essa 

proteína novamente no cenário da síntese proteica, mais especificamente na etapa de 

elongação da tradução. Estudos que relacionam eIF5A com proliferação celular e transição 

G1/S do ciclo celular sugerem seu envolvimento com tradução específica de proteínas que 

atuam na progressão do ciclo celular. Interessantemente, resultados em nosso laboratório 

demonstram, por letalidade sintética, uma interação entre eIF5A e Ypt1 (Yeast Protein 

Transport 1). Isso sugere uma possível atividade na secreção, mais precisamente na 

translocação de proteínas para o Retículo Endoplasmático (RE), que representa a etapa em 

que tradução e via secretória se conectam.  No intuito de avaliar a hipótese da participação de 

eIF5A na tradução de um subgrupo específico de mRNAs, envolvidos na via secretória e 

proliferação celular, este trabalho estudou o envolvimento deste fator na translocação de 

proteínas para o RE, usando a levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo. 

Os resultados revelam que eIF5A interage, de uma forma inespecífica, em diferentes etapas da 

via secretória. Também que eIF5A não atua na via pós- traducional, porém sugere que 

desempenhe um papel na translocação pela via co-traducional. Com esse estudo será possível 

um melhor entendimento sobre o papel de eIF5A e os processos proliferativos da célula. 

 

 

 



	
  

LISTA DE FIGURAS 

 

 

Figura 1. Esquema da biossíntese do resíduo de hipusina no precursor de eIF5A. 18 

Figura 2. Representação esquemática da translocação de proteínas para o retículo 

endoplasmático (RE) pela via pós-traducional.  19 

Figura 3. Esquema representativo do complexo Signal Recognition Particle (SRP) de S. 

Cerevisiae.  20 

Figura 4. Representação esquemática da translocação de proteínas para o retículo 

endoplasmático (RE) pela via co-traducional.  21 

Figura 5. Interações genéticas entre eIF5A e proteínas de diversas etapas da via-

secretória. 35 

Figura 6. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e o Δsnc2 na presença 

de SSD1. 36 

Figura 7. Supressão do fenótipo de defeito de crescimento do mutante sec2-41. 37 

Figura 8. Supressão do fenótipo de defeito de crescimento do mutante tif51A-3 por 

superexpressão de MSB3 e MSB4. 38 

Figura 9. Avaliação de defeitos na via pós-traducional através do acúmulo da forma 

precursora de CPY. 41 

Figura 10. Esquema de funcionamento do repórter SS-ura3. 42 

Figura 11. Ensaio evidenciando o não envolvimento de eIF5A na via pós-traducional. 43 

Figura 12. Esquema do funcionamento do repórter DAP2. 46 

Figura 13. Ensaio de translocação de DPAP B em mutantes de eIF5A. 47 

Figura 14. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e o mutante   

srp102K51I. 49 

Figura 15. Alinhamento das sequências primárias de Sec61 e Ssh1. 53 



	
  

Figura 16. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e Δssh1. 54 

Figura 17. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e Δsbh1. 55 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
  

LISTA DE TABELAS  

 

 

Tabela 1. Linhagens utilizadas nos experimentos deste trabalho. 23 

Tabela 2. Plasmídeos utilizados nos experimentos deste trabalho. 23 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
  

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 

 

 

ng nanograma 

µg micrograma 

mg 

g 

miligrama 

grama 

µL microlitro 

mL mililitro 

nm nanômetro 

mM milimolar 

M molar 

U unidade de atividade enzimática 

DNA ácido desoxirribonucléico 

RNA ácido ribonucléico 

mRNA RNA mensageiro 

dNTP desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) 

D.O.600nm densidade óptica a 600nm 

EDTA ácido etilenodiaminotetracético 

kDa quilodalton 

LB meio Luria-Bertani 

YPD “yeast extract, peptone, dextrose” (meio rico para levedura) 

SC meio sintético completo para levedura 

PEG polietilenoglicol 

pH potencial hidrogeniônico 



	
  

SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS 

SDS dodecil sulfato de sódio 

S-SPO “super-sporulation media” (meio para esporulação de levedura) 

TE tampão Tris-EDTA 

Tris tris-hidroximetilaminometano 

Triton X-100 polietilenoglicol-terc-octilfenil eter 

Tween 20 monolaurato de polietilenoglicol-sorbitana 

xg aceleração gravitacional 

kb kilobase 

pb pares de base 

h hora 

min minuto 

UV ultravioleta 

PBS “phosfate buffered saline” (solução salina tamponada com fosfato) 

PBST PBS com Tween 20 

V volt 

v/v relação volume/volume 

rpm rotações por minuto 

kV quilovolt 

Ω ohm 

µF microfaraday 

 

 

 

 

 



	
   14	
  

1. INTRODUÇÃO 
 

O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína pequena, de 

aproximadamente 17 kDa, e presente tanto em eucariotos quanto em arqueas, mas não em 

bactérias (PARK et al. 1993a; PARK et al. 1997; KLIER et al. 1993). É uma proteína essencial 

em todos os organismos testados e altamente conservada evolutivamente (PARK et al. 1993a; 

PARK et al. 1997). Em Saccharomyces cerevisiae, eIF5A é codificado por dois genes 

homólogos TIF51A (HYP2) e TIF51B (ANB1), gerando proteínas com 90% de identidade. 

Estes genes são regulados transcricionalmente pelos níveis de oxigênio, sendo expressos em 

condições aeróbicas e anaeróbicas, respectivamente (SCHNIER et al. 1991; WOHL et al. 1993; 

VALENTINI et al. 2002). eIF5A sofre uma modificação pós-traducional única chamada de 

hipusinação em um resíduo de lisina (Chen e Liu, 1997; Park et al., 1997). A formação do 

aminoácido hipusina ocorre através da transferência, catalisada pela enzima desoxi-hipusina 

sintase (Dys1), do grupo aminobutil de uma molécula de espermidina para o amino grupo 

livre de uma lisina específica no precursor de eIF5A (K51 em S. cerevisiae), seguido por 

hidroxilação do mesmo pela enzima desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1) (Park et al., 1993; 

Park et al., 1998), porém essa última etapa não é essencial no organismo modelo utilizado 

neste trabalho. A reação pode ser melhor visualizada na Figura 1. O alto grau de conservação, 

nas diferentes espécies, dos resíduos flanqueadores do sítio de hipusinação revela a grande 

importância deste aminoácido único (Chen e Liu, 1997; Magdolen et al., 1994). 

eIF5A foi originalmente purificado a partir de ribossomos extraídos de lisados de 

reticulócitos de coelho e envolvido com o início da tradução devido à sua capacidade de 

estimular a síntese in vitro de metionil-puromicina, um ensaio clássico da formação da 

primeira ligação peptídica (Benne e Hershey, 1978). Entretanto, o seu papel como um 

possível fator de início de tradução foi repensado, pois a depleção deste fator em leveduras 



	
   15	
  

causou uma redução de apenas 30% nos níveis de síntese proteica total (Kang e Hershey, 

1994). 

Porém, num cenário mais recente, foi observado, por nosso laboratório e outros grupos, 

que mutantes de eIF5A sensíveis a temperatura, quando cultivados na temperatura não 

permissiva apresentam defeitos que sugerem um papel na elongação da tradução por 

mostrarem uma síntese proteica prejudicada não somente em termos quantitativos (DIAS et al. 

2008) como também um aumento nas frações polissomais em relação às frações de 80S 

(GREGIO et al. 2009; SAINI et al. 2009), semelhante ao que ocorre para um mutante dominante 

negativo do eElongation Factor 2 (eEF2) (GREGIO et al. 2009). Ainda, foi verificado que os 

mesmos mutantes apresentam um atraso significativo no tempo de trânsito ribossomal 

(GREGIO et al. 2009; SAINI et al. 2009). Adicionalmente, mutantes de eIF5A não 

apresentaram formação de P-bodies (agregados de mRNA e proteínas, onde ocorre a 

degradação do mRNA) na temperatura não permissiva, característica semelhante à observada 

para células tratadas com ciclo-heximida, um inibidor de novos ciclos da elongação da 

tradução. Além desses resultados, um mutante condicional de eIF5A (tif51AK56A) tem seus 

defeitos de crescimento, síntese proteica e perfil polissomal suprimidos pela super expressão 

de eEF2, revelando uma relação funcional próxima entre esses dois fatores (DIAS et al. 2012).  

Concomitantemente, foi visto que após a depleção de eIF5A ocorreu um aumento no 

número de células paradas na fase G1 do ciclo celular (Kang e Hershey, 1994). A correlação 

entre formação de hipusina e proliferação celular também foi evidenciada por outros estudos 

(Chen et al., 1996; Hanauske- Abel et al., 1994; Park et al., 1994; Shi et al., 1996) e ainda, a 

expressão de eIF5A é aumentada em linfócitos T ativados (Bevec et al., 1994). Tendo por 

base esses dados, foi proposto que eIF5A poderia ser um fator envolvido na tradução de um 

grupo específico de mensageiros, como mRNAs envolvidos na transição G1/S do ciclo 

celular. 



	
   16	
  

Ainda, reforçando os dados de correlação funcional de eIF5A com a proliferação 

celular, foi descoberto, em nosso laboratório, o envolvimento de eIF5A com via secretória 

(FRIGIERI et al. 2007). Em um rastreamento de letalidade sintética com um mutante de eIF5A 

(tif51A-3), foi isolado um mutante do gene YPT1, cujo produto Ypt1 (yeast protein transport 

1) é essencial para a fusão de vesículas do retículo endoplasmático (RE) no Complexo de 

Golgi (SEGEV 2001), sendo conhecida como “Ras-Like GTPase”, devido à sua homologia 

com proteínas Ras de mamífero (Segev 2001; Segev and Botstein 1987). A identificação da 

letalidade sintética entre TIF51A e YPT1 revela uma conexão entre tradução e crescimento 

polarizado, sugerindo que o trabalho em conjunto dessas proteínas garanta a síntese e 

secreção proteica para a correta formação do broto durante o ciclo celular (FRIGIERI et al. 

2008).  

Muitas proteínas que sofrem modificações pós-traducionais, como as que residem em 

organelas, outros compartimentos celulares (RE, Golgi, vacúolo, vesículas, etc), membranas e 

as endereçadas para o broto, precisam ser direcionadas ao RE para diversas finalidades, como 

aquisição de uma correta conformação tridimensional que confira atividade, modificações 

pós-traducionais ou remoção de peptídeos. O direcionamento, por sua vez, pode ocorrer após 

o término da síntese da cadeia polipeptídica (via pós-traducional) ou concomitantemente à 

tradução (via co-traducional) (RAPOPORT et al. 1999; KEENAN et al. 2001). Na via pós-

traducional, mais proeminente em eucariotos inferiores (MATHEUS et al 2007), o 

direcionamento de proteínas para o RE ocorre sem o auxílio de SRP (Signal Recognition 

Particle) (DESHAIES and SCHEKMAN 1989; ROTHBLATT et al. 1989; RAPOPORT et al. 1999). 

Neste caso, chaperonas são requeridas para manter o peptídeo nascente em estado desnaturado 

no citoplasma, para que este possa passar através do translocon, formado pelos complexos 

multiproteicos Sec61 e Sec62/Sec63, para atingir o lúmen do RE (CHIRICO et al. 1988; 

CAPLAN et al. 1992). Um esquema do funcionamento desta via é ilustrado pela Figura 2. 



	
   17	
  

Por outro lado, a translocação da proteína para o RE mediado pelo complexo SRP, cujo 

receptor está localizado na membrana do RE (NG et al. 1996), ocorre assim que o peptídeo 

nascente emerge do ribossomo. Assim, SRP liga-se a uma sequência específica de 

aminoácidos no próprio peptídeo nascente, conhecida como sequência sinal. O complexo 

ribonucleoproteico de S. cerevisiae pode ser visto esquematicamente na Figura 3. Essa 

sequência sinal é caracterizada por um conjunto de aminoácidos hidrofóbicos. A ligação 

através de um domínio rico em metionina de uma das subunidades de SRP (Srp54) e a 

sequência sinal promove uma parada na elongação até que o complexo de SRP ligado ao 

ribossomo/mRNA/peptídeo nascente (RNC – Ribosome-Nascent Chain Complex) seja 

direcionado ao RE e ocorra ligação ao translocon, conhecido como complexo Sec61/Sec63 

(NG et al. 1996). Essa parada ocorre devido a ligação do domínio Alu de SRP, de forma 

competitiva, com a região onde eEF2 se liga no ribossomo e o fenômeno é chamado de 

“elongation arrest”. A via co-traducional está retratada de forma esquemática na Figura 4. 

Levando em consideração o envolvimento de eIF5A na tradução e o reflexo de seu 

papel na correlação com via secretória e ciclo celular, é possível que eIF5A tenha uma 

atuação essencial no encontro entre síntese proteica e via secretória, no RE, isto é, reforça a 

hipótese de um possível papel na tradução específica, envolvendo proteínas que necessitam da 

via secretória, como os componentes de membrana e parede e, principalmente, as que são 

direcionadas ao broto, o que poderia justificar a associação entre eIF5A e crescimento 

polarizado. 

Com o objetivo de elucidar estas questões e colaborar com a hipótese de tradução 

específica, este trabalho buscou melhorar a compreensão do papel de eIF5A na translocação 

de proteínas para o RE. 



	
   18	
  

 

Figura 1. Esquema da biossíntese do resíduo de hipusina no precursor de eIF5A. A 

porção 4-aminobutil proveniente da poliamina espermidina está sombreada e é transferida ao 

resíduo de lisina do precursor inativo de eIF5A por meio da ação da enzima desoxi-hipusina 

sintase (Dys1). O intermediário resultante, agora contendo desoxi-hipusina, é posteriormente 

hidroxilado pela enzima desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1) o que resulta na ativação de 

eIF5A. As cadeias laterais da lisina, desoxi- hipusina e hipusina são apresentados (Modificado 

de Park, 2006). 

 

 

 

 

 

 



	
   19	
  

 

Figura 2. Representação esquemática da translocação de proteínas para o Retículo 

Endoplasmático (RE) pela via pós-traducional. Chaperonas ligam-se à cadeia polipeptídica 

enquanto está sendo sintetizada. Após o término da tradução, o polipeptídeo é direcionado 

para o RE e, através do translocon (complexo Sec61 associado ao complexo Sec62/63), a 

proteína passa para o lúmem do RE onde é corretamente enovelada, com gasto energético. 

 

 

 

 

 



	
   20	
  

 

Figura 3. Esquema representativo do complexo Signal Recognition Particle (SRP) 

de S. cerevisiae. Esquema ilustrando as 6 proteínas constitutivas do complexo SRP de S. 

cerevisiae sendo organizadas com o auxilio de um RNA estrutural. Destaque para a proteína 

essencial Srp54 que, através de um domínio rico em metionina, se liga na sequência sinal 

hidrofóbica da cadeia polipeptídica nascente e para o heterodímero Srp14 e Srp21 que são 

responsáveis pelo fenômeno de “elongation arrest”, através da ligação competitiva no sítio de 

eEF2.    

 

 

 

 



	
   21	
  

 

 

Figura 4. Representação esquemática da translocação de proteínas para o Retículo 

Endoplasmático (RE) pela via co-traducional. Sequência sinal sintetizada sinaliza para 

ligação com o complexo SRP, que executa uma parada temporária na elongação da tradução 

até que o complexo RNC (ribosome-nascent-chain) seja direcionado ao RE. SRP promove a 

interação ribossomo-translocon, composto por complexo Sec61, por interagir com seu 

receptor, adjacente ao translocon. Uma vez ligado ao translocon, o ribossomo reinicia a 

elongação da tradução e a proteína recém sintetizada é direcionada ao lúmen do RE. 

 

 

 

 



	
   22	
  

2. OBJETIVO 

 

• Objetivo geral: 

O presente trabalho teve como objetivo o estudo do papel de eIF5A na translocação de 

proteínas para o Retículo Endoplasmático, a fim de compreender o melhor funcionamento da 

conexão entre via secretória e um possível fenômeno de tradução específica.  

 

• Objetivos específicos: 

a) Identificar interações genéticas entre eIF5A e proteínas de diferentes etapas da via-

secretória; 

b) Avaliar possíveis defeitos na translocação de proteínas pela via pós-traducional em 

mutantes de eIF5A; 

c) Avaliar o impacto de mutantes de eIF5A na translocação de proteínas pela via co-

traducional; 

d) Análise genética entre o mutante srp102K51I e tif51A-3; 

e) Identificar interações genéticas entre o mutante tif51A-3 e fatores do translocon de via 

co-traducional. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   23	
  

3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 

As leveduras e plasmídeos utilizados neste trabalho estão descritos nas tabelas 1 e 2 

respectivamente.  

Tabela 1. Linhagens utilizadas nos experimentos deste trabalho.  

Linhagem Descrição Origem 

SVL14 MAT a, ade2, his3, leu2, 

ura3, trp1, tif51A-1 

Coleção do laboratório 

SVL32 MAT a, ade2, his3, leu2, 

ura3, trp1, tif51A-3 

Coleção do laboratório 

SVL82 

 

SVL102 

MAT a, ade2, his3, leu2, 

ura3, trp1, TIF51A 

MAT α, ade2, his3, leu2, 

ura3, trp1, tif51A-3 

Coleção do laboratório 

 

Coleção do laboratório 

SVL447 MAT α, ade2, his3, leu2, 

lys2, ura3, trp1, tif51A-

3::URA3, Δssd1::LEU2 

Coleção do laboratório 

VZL825 MAT a, ura3, sec2-41 Finger & Novick, 2000 

VZL838 

 

VZL1019 

 

VZL1021 

 

VZL1181 

 

VZL1233 

 

VZL1235 

 

VZL1236 

MAT α, leu2, ura3, 

TIF51A 

MAT α, ura3, leu2, trp1, 

ade2, sec63-201 

MAT α, ura3, leu2, trp1, 

ade2, sec61-201 

MAT a, ade2, leu2, 

srp102K51I 

MAT a, his3, leu2, ura3, 

Δsnc2::KanMX4 

MAT a, his3, leu2, ura3, 

Δssh1::KanMX4 

MAT a, his3, leu2, ura3, 

Δsbh1::KanMX4 

Coleção do laboratório 

 

Coleção do laboratório 

 

Coleção do laboratório 

 

Mutka & Walter, 2001 

 

Coleção do laboratório 

 

Coleção do laboratório 

 

Coleção do laboratório 

 



	
   24	
  

Tabela 2. Plasmídeos utilizados nos experimentos deste trabalho. 

Plasmídeo Descrição Origem 

pSV65 (pRS426) 

pSV107  

pSV369 

pSV370 

pVZ1064 (pDN106) 

pVZ1110 (BG1805-ura3- 

DAP2) 

2µ, URA3  

TIF51A, 2µ, URA3  

MSB3, 2µ, URA3 

MSB4, 2µ, URA3 
1SSCPY-URA3, HIS3,CEN 

GAL1p-DAP2-6xHis-HA-

Protease C site-ProtA, 2µ, 

URA3 

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Coleção do laboratório 

Davis Ng 

Open Biosystem  

1 SSCPY - sequência sinal de CPY (gene PRC1) em fase com URA3. 

Os procedimentos básicos de preparação de soluções e meios de cultivo, preparação de 

Escherichia coli competente, transformação de E. coli, preparação de plasmídeos a partir de 

E. coli em pequena escala, bem como outras metodologias utilizadas neste trabalho foram 

baseadas nos seguintes manuais de laboratório: (GUTHRIE; FINK, 1991;SAMBROOK; 

RUSSELL, 2001; AUSUBEL et al., 2004). 

 

3.1. Transformação bacteriana pelo método físico 

3.1.1. Preparo de E. coli competente 

Crescer uma colônia da cepa de E. coli desejada em 25 mL de meio LB a 37°C, durante 

a noite e sob agitação. No outro dia, diluir (1:100) a cultura em 200 mL de meio fresco e 

crescer a 37ºC até D.O.600nm = 0.375, sob agitação. Manter as células em gelo por 10 minutos 

e centrifugar a 3.000 rpm, a 4ºC, por 7 minutos; suspendê-las em 40 mL de solução de cloreto 

cálcio (CaCl2 60 mM; PIPES 10 mM pH 7,0; glicerol 15%) gelado e centrifugar por 5 

minutos a 2.500 rpm, a 4ºC. Suspender as células novamente em 40 mL de solução de cloreto 

de cálcio e manter em gelo por 30 minutos. Centrifugar novamente (5 minutos, 2.500 rpm, 

4ºC), suspender em 8 mL da mesma solução e manter em gelo por 1 hora e 30 minutos. 



	
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Aliquotar 125 µL em microtubos gelados e congelar imediatamente em nitrogênio líquido. 

Manter congelado a -80ºC. 

 

3.1.2. Transformação 

Uma alíquota de E. coli competente foi descongelada em gelo. O DNA plasmidial de 

interesse (50 a 200 ng) foi adicionado ao tubo, que foi mantido em gelo por 30 minutos e 

depois foi colocado a 42ºC por 2 minutos. A seguir, as células foram suspensas em 1 mL de 

meio LB e incubadas a 37ºC por 1 hora, sob agitação. Após esse período, as células foram 

plaqueadas em meio LB sólido contendo antibiótico adequado à seleção plasmidial e 

incubadas a 37ºC por no máximo 16 horas.  

 

3.2. Transformação bacteriana por corrente elétrica  

3.2.1.Preparo de E. coli eletrocompetente 

Crescer uma colônia da cepa de E. coli desejada em 50 mL de meio LB a 37ºC, durante 

uma noite e sob agitação. A seguir, diluir a pré-cultura em 100 mL de meio fresco (DO600nm = 

0,3) e incubar novamente a 37ºC até atingir uma DO600nm=1,0–1,2. Centrifugar a cultura a 

6.000 xg por 20 minutos a 4ºC. Lavar as células três vezes com 250-500 mL de água gelada e 

uma vez com 30 mL de glicerol 20% gelado. Após a lavagem, suspender as células em 3 mL 

de glicerol 20% e congelá-las em alíquotas de 40 µL a -80ºC. 

 

3.2.2. Eletroporação 

Uma alíquota da linhagem eletrocompetente foi descongelada em gelo e o DNA 

plasmidial de interesse foi adicionado às células (5 µL). Estas foram transferidas para cubeta 

de eletroporação (0,1 cm) e submetidas a um pulso elétrico com as seguintes constantes 

elétricas: voltagem 1,7 kV, resistência 200 Ω e capacitância 25 µF. Em seguida, as células 

foram removidas da cubeta com 1 mL de meio LB e incubadas a 37ºC por 1 hora, sob 



	
   26	
  

agitação. Finalmente, as células foram plaqueadas em meio seletivo e incubadas a 37ºC por no 

máximo 16 horas.  

 

3.3. Preparo de plasmídeos a partir de E. coli em pequena escala – Miniprep (lise 

alcalina) 

Linhagens de E. coli contendo os plasmídeos de interesse foram inoculadas em 3 mL de 

meio LB contendo antibiótico adequado à seleção plasmidial e incubadas a 37ºC por 

aproximadamente 16 horas, sob agitação constante. A cultura foi centrifugada por 1 minuto a 

12.000 xg. As células foram suspensas em 200 µL de TE (Tris 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM 

pH 8,0) e então adicionadas de 200 µL de solução II (NaOH 0,2 M; SDS1%) e 150 µL de 

solução acetato de sódio 3 M pH 4,8. O tubo foi invertido delicadamente por várias vezes e 

centrifugado por 6 minutos a 12.000 xg. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e 1 

mL de isopropanol foi adicionado. Após centrifugação a 12.000 xg por 10 minutos, o 

sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado duas vezes com 1 mL de etanol 75% 

gelado. Depois de seco, o DNA foi ressuspendido em 50 µL de água. 

 

3.4. Transformação de leveduras 

Inicialmente, a linhagem de interesse foi inoculada em 10 mL de meio adequado e 

incubada a 30ºC sob agitação por toda a noite. Após centrifugação, as células foram suspensas 

em 1 mL de solução de acetato de lítio (LiAc) 100 mM e incubadas por 15 minutos a 30ºC. 

Após nova centrifugação e remoção do sobrenadante, os seguintes reagentes foram 

adicionados, na ordem: 240 µL de PEG 50% (m/v), 36 µL de LiAc 1 M, 50 µL de DNA de 

esperma de salmão (10 mg/mL), 5 µL do plasmídeo desejado e 20 µL de água. O tubo 

contendo a mistura de transformação foi vigorosamente agitado (vortex) por 1 minuto e 

incubado a 30ºC por 20 minutos. O choque térmico foi dado incubando-se o tubo a 42ºC por 



	
   27	
  

20 minutos. As células foram então centrifugadas (12.000 xg, 30 segundos), suspensas em 

100 µL de água, plaqueadas em meio seletivo e incubadas a 25ºC até o aparecimento de 

colônias. 

 

3.5. Cruzamento e esporulação de leveduras 

3.5.1. Cruzamento  

As linhagnes haplóides de S. cerevisiae de interesse foram cruzadas na superfície de 

ágar YPD e incubadas por uma noite a 25ºC. A seleção dos diplóides foi realizada pela 

transferência, com veludo estéril, do crescimento obtido na placa de YPD para uma placa de 

meio seletivo duplo, de acordo com as marcas auxotróficas dos haplóides de partida. As 

placas foram incubadas a 25ºC. Após o crescimento, os diplóides foram isolados em meio 

seletivo. 

 

3.5.2. Esporulação  

Os diplóides foram crescidos em meio S-SPO líquido (2,5 g de extrato de levedura; 15 g 

acetato de potássio; 40 mg de adenina, uracil e tirosina; 20 mg de histidina, leucina, lisina, 

triptofano, metionina e arginina; 100 mg de fenilalanina e 350 mg de treonina em 1 litro de 

água destilada) a 25ºC, sob agitação até a formação de ascos. 

Como alternativa aos diplóides que não cresciam em meio S-SPO líquido, foram 

utilizados os meios PSP2 (YNB 0,67%, extrato de levedura 0,1%, acetato de potássio 1%, 

ftalato de potássio pH 5,0 50 mM) e SPO (acetato de potássio 0,3%, rafinose 0,02%). Os 

diplóides foram crescidos em meio PSP2 líquido suplementado com aminoácidos (adenina, 

uracila, triptofano, histidina, leucina) sob agitação e temperatura adequada até atingir 0,8-

1,2x107 células/mL. O inóculo foi centrifugado por 5 minutos a 1.300xg e as células foram 

lavadas com água estéril. O sobrenadante foi desprezado e as células suspendidas em meio 

SPO líquido. Incubou-se à 25°C até a formação de ascos. 



	
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3.5.3. Dissecção de tétrades e caracterização de haplóides 

Foram centrifugados momentaneamente 200 µL da cultura submetida à esporulação. 

Após a remoção do sobrenadante, as células foram suspensas em 100 µL de sorbitol 20%. 

Então, foram adicionados 3 µL de zimoliase (10 mg/mL) e a reação foi incubada à 

temperatura ambiente por 15 minutos. A seguir, foi adicionado 1 mL de sorbitol 20% e as 

células foram mantidas em gelo até a dissecção. Os ascos foram dissecados em microscópio 

de dissecção, utilizando placa de meio YPD, a qual foi incubada a 25ºC até a obtenção de 

colônias. O genótipo das células haplóides obtidas foi caracterizado utilizando diferentes 

meios de cultura seletivos. O “mating type” foi definido através do cruzamento dos haplóides 

com linhagens de “mating type” conhecido e seleção dos diplóides em meio seletivo 

adequado. O fenótipo de sensibilidade a temperatura foi checado pelo crescimento em meio 

YPD em diferentes temperaturas de incubação. 

 

3.6. Teste de sensibilidade a temperatura 

As linhagens de interesse foram inoculadas em 10 mL de meio apropriado e crescidas 

até atingir a concentração de 1-2x107 células/mL (DO600 nm = 0,6 a 0,9). Em seguida, as 

células foram coletadas por centrifugação (600 xg por 7 minutos) e suspendidas para uma 

concentração final de 2,5x108 células/mL para todas as amostras testadas. Transferiu-se 200 

µL da suspensão de células para o primeiro poço da microplaca (de 96 poços). Colocou-se 

180 µL de meio de cultura líquido nos 5 poços seguintes. Fez-se 5 diluições seriadas 

utilizando um micropipetador multicanal para pipetar 20 µL da cultura do primeiro poço, 

transferir para o segundo poço, homogeneizou-se bem e repetiu-se o procedimento para os 

próximos poços. Aplicou-se 3 µL de cada diluição nas placas com os meios a serem testados e 

incubou-as por 1 a 3 dias na(s) temperatura(s) adequada(s). 

 



	
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3.7. Extração de DNA genômico de levedura 

As linhagens foram crescidas até a saturação em 10 mL de meio YPD líquido a 30ºC, 

sob agitação. O volume total de cultura foi submetido à centrifugação a 3.000 xg por 15 

minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células suspensas em 500 µL de água 

Milli-Q e transferidas para um tubo de microcentrífuga. O tubo foi submetido à centrifugação 

a 13.000 xg por 1 minuto, o sobrenadante foi descartado e as células suspensas no líquido 

residual. A esse tubo foram adicionados 200 µL de tampão de lise (Triton X-100 2%, SDS 

1%, NaCl 100 mM, Tris-HCl pH 8,0 10 mM, EDTA 1 mM), 200 µL de PCI 

(Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico–25:24:1) e aproximadamente 300 mg de contas de 

vidro. A mistura foi agitada em vórtex por 3 minutos. Posteriormente, foram adicionados 200 

µL de TE pH 8,0. O tubo foi agitado em vórtex e submetido à centrifugação a 13.000 xg por 5 

minutos. Após esse procedimento, a fase aquosa foi transferida para um tubo de 

microcentrífuga ao qual foram adicionados 200 µL de PCI. A mistura foi agitada novamente e 

submetida à centrifugação 13.000 xg por 5 minutos e a fase aquosa transferida para um novo 

tubo de microcentrífuga. Esse procedimento de extração foi repetido duas vezes. A seguir, foi 

adicionado ao tubo 1 mL de etanol absoluto gelado e o conteúdo homogeneizado por 

inversão. O tubo foi centrifugado a 13.000 xg por 2 minutos a 4ºC e o sobrenadante 

descartado. O precipitado foi suspenso em 400 µL de TE pH 8,0 e foram adicionados 3 µL de 

RNase 10mg/mL. A suspensão foi incubada por 30 minutos a 37ºC. Em seguida, foram 

adicionados 200 µL de PCI e o tubo foi agitado brevemente em vórtex. A mistura foi 

submetida à centrifugação a 13.000 xg por 5 minutos a 4ºC e a fase aquosa foi transferida para 

um novo tubo de microcentrífuga. Ao tubo foram adicionados 10 µL de acetato de amônio 4 

M e 1 mL de etanol absoluto gelado. O conteúdo dos tubos foi misturado por inversão e os 

tubos foram centrifugados a 13.000 xg por 2 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o 



	
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precipitado lavado com 400 µL de etanol 75% gelado. Após a secagem, o precipitado foi 

suspenso em 50 µL de TE pH 8,0. O DNA genômico foi armazenado em freezer a -20ºC. 

 

3.8. Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) 

As reações de PCR foram realizadas em microtubos com 1 mM de cada 

oligonucleotídeo iniciador, 1 µL de DNA molde, 1 UI de enzima DNA polimerase e 200 mM 

de uma mistura de desoxi-ribonucleotídeos, num volume final de reação de 50 µL. As 

condições dos ciclos das reações foram estabelecidas de acordo com a temperatura de 

hibridização dos oligonucleotídeos utilizados e o tamanho do fragmento esperado. A última 

fase da PCR foi incubada a 72ºC por 5 minutos, e em seguida mantida a 4ºC. Os produtos da 

reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 0,8%. 

 

3.9. Western Blot 

As amostras proteicas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na 

presença de SDS (SDS-PAGE) e transferidas para membrana de nitrocelulose utilizando 

tampão de transferência (24,8 mM Tris-HCl, 192 mM glicina) e tensão de 100 V por uma 

hora. 

A transferência foi avaliada por coloração com Ponceau-S. A membrana foi bloqueada 

sob agitação durante uma noite a 4ºC em tampão PBST (PBS 1X, Tween-20 0,05%) contendo 

5% de leite desnatado. A membrana foi então incubada por duas horas à temperatura ambiente 

com uma diluição adequada de soro imune em PBST. Posteriormente, a membrana foi lavada 

três vezes por cinco minutos com PBST. A seguir, a membrana foi incubada por uma hora 

com anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (Sigma) em PBST. Após três novas 

lavagens de cinco minutos com PBST, a membrana foi tratada com reagentes 

quimioluminescentes (ECL – Amershan Biosciences) e exposta a filme auto-radiográfico. 



	
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4. RESULTADOS  

4.1. Interações genéticas entre TIF51A e genes que codificam diferentes proteínas 

da via secretória. 

A via secretória é um processo fisiológico e essencial para a célula, visto que existem 

uma grande quantidade de proteínas e processos envolvidos no correto funcionamento deste 

evento. Esta via tem por finalidade a modificação pós-traducional e o endereçamento de 

proteínas para uma série de constituintes celulares. 

Inicialmente a proteína é translocada para o Retículo Endoplasmático (RE), onde irá 

sofrer modificações pós-traducionais específicas relacionadas diretamente com sequências 

sinais presente em sua estrutura primária. Tais modificações são diversas como glicosilações, 

formação de pontes dissulfeto para uma nova conformação tridimensional, sulfatação ou 

metilações. Após esses processos, as proteínas são envesiculadas com a própria membrana do 

RE com ligantes, cujos receptores estão presentes no próximo destino: o Complexo de Golgi. 

Nesta outra organela novas modificações pós-traducionais ocorrem e, por fim, as proteínas 

são envesiculadas novamente e direcionadas para locais e funções específicos na célula, como 

formação do broto celular (no caso de S. cerevisiae), secreção polarizada, formação de 

vacúolos ou lisossomos, composição de membranas celulares ou exocitose e secreção 

proteica.  

É importante a compreensão que todo esse processo é comandado por sequencias sinais 

presentes na estrutura primária da proteína. As enzimas residentes de cada organela envolvida 

reconhecem onde devem atuar por meio de sequencias que sinalizam não somente onde, como 

também o que deve ser feito naquele ponto.  

Dessa forma foi dado início ao desenvolvimento de algumas análises genéticas entre 

TIF51A e genes que codificam proteínas que atuam em diferentes passos da via secretória na 



	
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tentativa de rastrear um possível envolvimento de eIF5A nesta via. A localização destas 

proteínas pode ser melhor visualizado no esquema mostrado na Figura 5.  

Inicialmente foi realizado ensaio de interação genética entre TIF51A e SNC2, gene que 

codifica para o receptor v-SNARE atuando no correto ancoramento das vesículas que saem do 

Golgi em direção à membrana citoplasmática (Grote E. 2000, Paumet F. 2004).  

Assim, foi feito o cruzamento da linhagem VZL447 (tif51A-3::URA3, ssd1::LEU2) com 

VZL1233 (snc2::KanMX4, SSD1) para obtenção do diplóide contendo o alelo mutante de 

TIF51A e deleção de SNC2. As sete tétrades informativas derivadas deste diplóide foram 

submetidas ao ensaio de sensibilidade a temperatura, e uma das seis que apresentaram o 

mesmo fenótipo de crescimento pode ser visto na Figura 6. As linhagens de partida foram 

utilizadas como controle de crescimento, isto é, mostrando o defeito de crescimento do alelo 

tif51A-3 e o crescimento do Δsnc2 à 36°C. A figura mostra piora de crescimento do mutante 

tif51A-3 na ausência do gene SNC2, já a 30°C, quando comparado como o haplóide 

carregando tif51A-3 e cópia selvagem de SNC2. Os haplóides carregando TIF51A apresentam 

resistência as temperaturas testadas, como esperado. Esta análise foi realizada na presença de 

SSD1 selvagem, uma vez que o fenótipo dos alelos de TIF51A é mais pronunciado na 

ausência de SSD1 (Zanelli e cols., 2005). Com essa estratégia é possível afirmar que a 

interação genética entre TIF51A e SNC2 é do tipo sintética doente, independentemente da 

ausência de SSD1, uma vez que o acúmulo dos defeitos causados por TIF51A mutante na 

ausência de SNC2I acarreta em um fenótipo doente mais severo em relação à mutação e a 

deleção separadamente. 

Posteriormente, foi avaliada a interação genética sintética entre SEC2 e TIF51A.  Sec2 é 

uma “guanyl-nucleotide exchange factor” (GEF) da proteína G Sec4 que, por sua vez, é uma 

proteína essencial para o transporte vesicular, também atuando na fusão das vesículas que 

saem do Golgi e são endereçadas para a membrana citoplasmática (Walch-Solimena C. 1997). 



	
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Sec2 é essencial para o transporte vesicular pós-Golgi, por essa razão foi utilizado o mutante 

condicional sec2-41, que apresenta sensibilidade a partir de 36°C. Para realização deste 

ensaio, foi testada a supressão do fenótipo ts (termo sensibilidade) do mutante sec2-41 

(VZL825) por TIF51A. O mutante foi então transformado com um plasmídeo de alto número 

de cópias contendo TIF51A (pSV107) ou o vetor vazio correspondente (pSV65). Dois 

transformantes com cada um dos plasmídeos foram então submetidos ao ensaio de 

sensibilidade a temperatura a 36°C e 38°C. Como mostrado na Figura 7, é possível ver uma 

supressão do defeito de crescimento do mutante sec2-41, nas temperaturas testadas, pela 

superexpressão de TIF51A na célula. O resultado revela novamente interação de eIF5A com 

transporte vesicular, ao mostrar que o defeito de crescimento causado pelo defeito no 

ancoramento de vesículas na membrana é recuperado quando na superexpressão de TIF51A.  

Por fim, a última análise genética realizada com proteínas envolvidas no transporte 

vesicular, foi a verificação de supressão do fenótipo doente de tif51A-3 quando na 

superexpressão de MSB3 e MSB4. Msb3 e 4 são proteínas denominadas “GTPase-activating 

protein” (GAP) que atuam preferencialmente no broto formado durante a divisão da levedura, 

sendo muito importantes para secreção polarizada, organização do citoesqueleto de actina e 

ativação de Sec4 (Bach S. 2000). Para tanto, o mutante tif51A-3 (SVL32) e a linhagem 

selvagem (SVL82) foram transformados com os vetores contendo MSB3 e MSB4 em alto 

número de cópias (pSV369 e pSV370, respectivamente) e submetidos a teste de sensibilidade 

a temperatura. Foi possível observar que a superexpressão desses genes não apresentou 

nenhum fenômeno de toxicidade na linhagem selvagem, entretanto, foi capaz de suprimir o 

fenótipo ts do mutante de eIF5A a 36°C, em comparação com o vetor vazio, como pode ser 

visto na Figura 8. 



	
   34	
  

Portanto, é possível concluir que eIF5A interage de uma maneira geral na via secretória, 

por mostrar interação genética com diferentes componentes de etapas do transporte vesicular, 

visto por diferentes técnicas de análises genéticas.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
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Figura 5. Interações genéticas entre eIF5A e proteínas de diversas etapas da via 

secretória. 1) eIF5A atuando na etapa de elongação da tradução; 2) eIF5A interagindo com a 

translocação de proteínas para o RE. Ypt1 (amarelo) é essencial para o tráfego vesicular e foi 

identificado como letal sintético com eIF5A (Frigieri et al,. 2008); Snc2 (verde) é uma v-

SNARE envolvida na fusão de vesículas secretórias com a membrana plasmática e mutantes 

de eIF5A são sintéticos doentes com Δsnc2 (Figura 6); Sec2 (azul) é uma GEF (guanyl-

nucleotide exchange factor) para Sec4, que é essencial para a exocitose e TIF51A em alto 

número de cópias suprime o fenótipo de defeito de crescimento do mutante sec2-41 (Figura 

7); Msb3 e Msb4 (vermelho) são GTPase ativadoras para Sec4 e necessárias para a correta 

organização do citoesqueleto de actina e MSB3 e MSB4 em alto número de cópias suprime o 

defeito de crescimento de mutantes de eIF5A (Figura 8).   



	
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Figura 6. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e o Δsnc2 na 

presença de SSD1. Diluições seriadas de 4 haplóides de uma tétrade obtida do diplóide duplo 

mutante, foram aplicadas em meio YPD e incubadas por 2 dias nas temperaturas indicadas. 

As linhagens parentais SVL447 (tif51A-3::URA3, ssd1::LEU2) e VZL1233 (snc2::KanMX4, 

SSD1) foram usadas como controle de crescimento. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
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Figura 7. Supressão do fenótipo de defeito crescimento do mutante sec2-41. A 

linhagem VZL825 (sec2-41) foi transformada com o vetor vazio (pSV65 - 2µ, URA3) e o 

vetor contendo o gene TIF51A (pSV107 - TIF51A, 2µ, URA3). Diluições seriadas de 2 

colônias de cada transformação foram aplicadas em SC-ura e incubadas nas temperaturas 

semi-permissiva (36°C) e não permissiva (38°C)  para o mutante sec2-41 por 2 dias. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
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Figura 8. Supressão do fenótipo de defeito de crescimento do mutante tif51A-3 por 

superexpressão de MSB3 e MSB4. O mutante tif51A-3 foi transformado com o vetor vazio 

(pSV65 - 2µ, URA3), MSB3 (pSV369 - MSB3, 2µ,URA3) e MSB4 (pSV370 - MSB4, 2µ, 

URA3). Diluições seriadas de cada transformação foram aplicadas em SC-ura e incubadas na 

temperatura semi-permissiva para o mutante (36°C) por 2 dias. 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
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4.2. Avaliação de possíveis defeitos na translocação de proteínas pela via pós-

traducional em mutantes de eIF5A. 

É descrito que, em S. cerevisiae, muitas proteínas são translocadas por uma via 

preferencial (co ou pós-traducional), porém na presença de algum defeito que comprometa 

uma dessas vias, tais proteínas sofrem uma adaptação para a via íntegra, de modo a não 

comprometer o crescimento de forma letal até o restabelecimento da homeostase celular. 

Entretanto, algumas proteínas tem seu direcionamento de forma não adaptativa, ou seja, de 

forma exclusiva por uma das vias.  

Esse fenômeno foi abordado na continuação dos estudos iniciais que correlacionaram 

eIF5A com via secretória (FRIGIERI et al. 2008), mostrando que essa proteína possivelmente 

não teria alguma função na translocação de proteínas pela via pós-traducional, uma vez que 

mutantes de eIF5A não apresentem defeitos de translocação da protease vacuolar 

carboxipeptidase (CPY), uma proteína translocada de forma não adaptativa pela via pós-

traducional. O ensaio que confirma esse dado é mostrado na Figura 9. 

No intuito de confirmar o não envolvimento de eIF5A com a via pós-traducional, foi 

utilizado uma nova metodologia, a fim de revelar se mutantes de eIF5A apresentavam algum 

defeito nesta via. Para isso, foi utilizado um gene repórter que codifica para uma forma 

modificada da enzima Ura3, que está fusionada a sequência sinal (SS) de CPY. (NG et al. 

1996). A enzima Ura3 tem sua atividade catalítica no citoplasma da célula para a via de 

biossíntese da uracila, permitindo, assim, o crescimento celular em meio desprovido desta 

base nitrogenada (prototrofia). Entretanto, quando fusionada a uma sequência sinal que a 

direcione para ser internalizada no RE pela via pós-traducional, a enzima passa a não exercer 

mais sua função, inviabilizando o crescimento celular em meio sem uracila (auxotrofia). 

Portanto, essa metodologia permite avaliar se determinadas mutações acarretam em algum 

defeito na via pós-traducional pela presença ou ausência de crescimento em SC-Ura. A Figura 



	
   40	
  

10 mostra, esquematicamente, o funcionamento do repórter.  

Para avaliar a participação de eIF5A na via secretória através da translocação pela via 

pós-traducional, ensaios utilizando o repórter discutido acima foram realizados com dois 

mutantes condicionais de eIF5A, tif51A-1 e tif51A-3, uma linhagem selvagem como controle 

negativo de crescimento e uma linhagem mutante (sec61-201) com defeito na translocação do 

repórter SS-Ura3 como controle positivo. As linhagens foram transformadas com o vetor 

vazio e o repórter SS-Ura3. Os transformantes foram cultivados em meio seletivo para o vetor 

e para o repórter (SC-his e SC-his,-ura, respectivamente), nas temperaturas permissiva e semi-

permissivas para os alelos mutantes de TIF51A. Apesar das diferenças entre translocons das 

duas vias de translocação, como apresentado na Introdução, a proteína Sec61 é o componente 

majoritário de ambos (CORSI and SCHEKMAN 1996). Portanto, o mutante sec61-201 

apresenta defeito na translocação de proteínas ao RE pelas duas vias (NG et al. 1996). Assim, 

a Figura 11 mostra que o controle positivo apresenta crescimento em meio SC-his,-ura, nas 

temperaturas testadas, comprovando que o defeito na translocação pela via pós- traducional 

leva ao acúmulo de SS-Ura3 no citoplasma. 

Ainda na Figura 11, as linhagens contendo os alelos tif51A-1 e tif51A-3, transformadas 

com o repórter SS-Ura3, apresentaram crescimento no meio SC-his, como esperado, 

entretanto, não apresentaram crescimento em meio SC-his,-ura, semelhantemente ao 

comportamento da linhagem selvagem. Assim, pode-se concluir que a proteína SS-Ura3 é 

direcionada integralmente para o RE, não indicando defeito na translocação pela via pós-

traducional nos mutantes de eIF5A. 

 



	
   41	
  

 

 

Figura 9. Avaliação de defeitos na via pós-traducional através do acúmulo da 

forma precursora de CPY. Defeitos no processamento da proteína CPY podem ser 

revelados por meio da avaliação do acúmulo da forma precursora (67 kDa) e diminuição dos 

níveis da sua forma madura (61 kDa). Dessa forma, mutantes de eIF5A, assim como a 

linhagem selvagem, não apresentam esse acúmulo, o que acontece com o mutante ypt1A136D, 

que tem descrito um defeito no processamento de CPY.  

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   42	
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 10. Esquema de funcionamento do repórter SS-Ura3. Defeitos na via pós- 

traducional levam ao acúmulo citoplasmático de Ura3, local onde a enzima é ativa, 

conferindo prototrofia para uracila. A linhagem selvagem promove a completa translocação 

da proteína repórter e, assim, gera um fenótipo auxotrófico para uracila. 

 

 

 

 

 

 

 



	
   43	
  

 

 

Figura 11. Ensaio evidenciando o não envolvimento de eIF5A na via pós-

traducional. Diluições seriadas das linhagens contendo os alelos tif51A-1 (SVL14), tif51A-3 

(SVL32), TIF51A (SVL82) e sec61-201 (VZL1021), transformadas com vetor vazio (pSV57) 

ou SS-Ura3 (pVZ1064), foram aplicadas nos meios seletivos SC-his e SC-his,-ura e 

incubadas nas temperaturas permissiva e semi-permissivas por 3 dias. A ausência de 

crescimento dos mutantes de eIF5A no meio desprovido de uracila não revela algum defeito 

na via pós-traducional.  

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   44	
  

4.3. Avaliação do impacto de mutantes de eIF5A na via co-traducional. 

Com base nas suspeitas da participação de eIF5A na via co-traducional, mesmo que de 

forma dependente da maquinaria de tradução, foram realizados experimentos de análise de 

translocação pela via co-traducional utilizando como repórter a proteína DPAP B (dipeptidil 

aminopeptidase B). Esse objetivo foi realizado em colaboração com a pós-doc de nosso 

laboratório Dra. Danuza Rossi. DPAP B é uma protease vacuolar codificada pelo gene DAP2, 

que sofre direcionamento para o RE exclusivamente pela via co-traducional. Para o 

desenvolvimento deste ensaio, foi adquirido um plasmídeo contendo DAP2 clonado em fusão 

com a sequência de “tags” HA, 6xHis e ProtA (Open Biosystem), pVZ1110. Esse gene em 

fusão está sob controle transcricional do promotor de GAL1 (induzível por galactose), ou seja, 

sempre que cultivado na presença de galactose como única fonte de carbono, o repórter 

DAP2-“tag” será expresso. Com este reagente é possível desenvolver os ensaios específicos 

de translocação pela via co-traducional, visto que DPAP B fusionado a “tag” HA é 

igualmente funcional ao DPAP B selvagem (NG et al. 1996). 

A Figura 12 mostra esquematicamente o mecanismo do repórter DAP2-“tag”. 

Naturalmente, o mRNA de DAP2 é direcionado para o RE dependente da ligação a SRP, ou 

seja, totalmente direcionado pela via co-traducional, portanto, não existe conteúdo de DPAP 

B livre no citoplasma. No RE a proteína DPAP B sofre sucessivas glicosilações, alterando 

drasticamente seu peso molecular de 93 kDa para 120 kDa. Pela técnica de western blot, 

utilizando anticorpo anti-“tag”, é possível avaliar a forma predominante de DPAP B. 

Enquanto uma linhagem selvagem apresenta apenas a forma madura de DPAP B (120 kDa – 

mDPAB B), mutantes com defeitos específicos na via co-traducional acumulam seu precursor 

no citoplasma (93 kDa – pDPAP B) (NG et al. 1996; ROBERTS et al. 1989).  

As linhagens SVL14 (tif51A-1), SVL32 (tif51A-3), SVL82 (TIF51A – controle 

negativo), VZL1019 (sec63-201 – controle positivo) e VZL1021 (sec61-201 – controle 



	
   45	
  

positivo) foram transformadas com o plasmídeo pVZ1110 (repórter DAP2-“tag”), cultivados 

em meio SC-ura, seletivo para o vetor, e submetidas à indução da expressão de DPAP B com 

adição de galactose 2% durante 3 horas. Para os mutantes de TIF51A e a linhagem selvagem, 

a mesma indução foi também realizada na temperatura não permissiva para cada mutante 

(37°C), de forma a analisar o defeito na modificação de DPAP B concomitante ao defeito em 

eIF5A.  

Para realização do ensaio os extratos proteicos foram gerados e submetidos a 

eletroforese em SDS-PAGE. A Figura 13 mostra o resultado do western blot utilizando 

anticorpo anti-poliHis (Sigma) para detecção de DPAP B, tanto da forma precursora (pDPAP 

B ≈ 90 kDa) quanto da forma madura (mDPAP B ≈ 120 kDa). A proteína Dys1 foi utilizada 

como controle de carregamento da amostra. Como pode ser visto, a linhagem selvagem 

apresenta predominantemente a forma madura de DPAP B, provando que linhagens sem 

defeito na via co-traducional modificam DPAP B normalmente. Diferentemente da linhagem 

selvagem, os mutantes de TIF51A quando cultivados na temperatura não permissiva, 

apresentam uma redução na forma mDPAP B e um aumento relativo da forma pDPAP B, 

semelhantemente ao que ocorre nas linhagens controle, que apresentam defeito na 

translocação de proteínas pela via co-traducional. A presença de pDPAP B no alelo tif51A-3 

mesmo na temperatura permissiva pode ser explicado pela maior severidade deste alelo em 

comparação com o mutante tif51A-1 (DIAS et al. 2008). 

 

 

 

 

 



	
   46	
  

 

 

Figura 12. Esquema do funcionamento do repórter DAP2. Defeitos de translocação 

pela via co-traducional levam ao acúmulo no citoplasma da forma precursora da proteína 

DPAP B, codificada por DAP2, com tamanho de aproximadamente 93 kDa. Entretanto, em 

linhagens selvagens ou que não apresentem defeito na via co-traducional a proteína é 

corretamente direcionada para o RE, onde sofre uma série de glicosilações chegando a forma 

madura, aumentando seu tamanho para aproximadamente 120 kDa. 

 

 

 

 

 

 



	
   47	
  

 

Figura 13. Ensaio de translocação de DPAP B em mutantes de eIF5A. Ensaio com 

as linhagens SVL14 (tif51A-1), SVL32 (tif51A-3), SVL82 (TIF51A – controle negativo), 

VZL1019 (sec63-201 – controle positivo) e VZL1021 (sec61-201 – controle positivo). Essas 

linhagens foram transformadas com pVZ1110 (pGAL1-DAP2-6xHis) e cultivadas em meio 

seletivo contendo galactose, tanto na temperatura permissiva (30°C), quanto na não 

permissiva aos alelos (37°C) durante 3 horas. Após lise celular, 15 µg de proteína total foram 

utilizadas em ensaio de western blot utilizando o anticorpo anti-poliHis (Sigma), para 

detecção de pDPAP B (93 kDa) e mDPAP B (120 kDa). A proteína Dys1 foi utilizada como 

controle de carregamento das amostras (45 kDa). 

 

 

 

 



	
   48	
  

4.4. Análise genética entre o mutante srp102K51I e tif51A-3. 

O direcionamento de proteínas pela via co-traducional é mediado pelo complexo SRP 

(Signal Recognition Particle), cujo receptor está localizado na membrana do RE (Ng et al. 

1996). Assim que o peptídeo nascente emerge do ribossomo, SRP liga-se a uma sequência 

específica de aminoácidos no próprio peptídeo nascente, conhecida como sequência sinal ou 

peptídeo sinal, e induz a parada na elongação da tradução até que o complexo 

ribossomo/peptídeo nascente/mRNA/SRP seja direcionado ao RE e ocorra ligação ao 

translocon (Johhnson and Van Waves 1999). 

Em Saccharomyces cerevisiae, o receptor de SRP (SRP Receptor – SR) é composto por 

um heterodímero formado por Srp101 (SRα) e Srp102 (SRβ), codificadas respectivamente por 

SRP101 e SRP102 (Ogg SC, et al. 1992). SRβ contém um domínio transmembrana e é 

responsável por se ligar em SRα e mantê-la próxima da membrana do RE, sendo uma proteína 

com papel exclusivo na via co-traducional. Por ser um gene essencial, foi obtido o mutante 

condicional srp102K51I, que apresenta defeito de crescimento a partir de 34°C, para a 

realização de uma análise de interação genética sintética com o mutante tif51A-3. 

Foi feito o cruzamento das linhagens SVL102 (tif51A-3) e VZL1181 (srp102K51I) para 

obtenção de haplóides contendo ambos alelos mutantes e, em seguida, submetidos a teste de 

sensibilidade a temperatura. A Figura 14 mostra os controles das linhagens parentais, isto é, o 

controle de crescimento do mutante tif51A-3 e do mutante srp102K51I na temperatura de 33°C. 

Ainda, pode ser observada uma piora do fenótipo ts do mutante tif51A-3 quando na presença 

do mutante srp102K51I, quando comparado com o haplóide carregando somente tif51A-3, 

indicando que os genes são sintético doentes. Esta análise genética foi realizada com seis 

tétrades tetratipos, ou seja, tétrades interessantes por apresentarem um haploide contendo as 

duas mutações, dois haploides que correspondem as células parentais e um haploide contendo 



	
   49	
  

as duas cópias selvagens dos genes de interesse. O resultado mostrado na Figura 14 foi 

revelado em cinco dessas tétrades. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   50	
  

 

 

Figura 14. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e o mutante 

srp102K51I. Diluições seriadas de 4 haplóides de 1 única tétrade obtida do mutante duplo 

foram aplicadas em meio YPD e incubadas por 2 dias nas temperaturas indicadas. As 

linhagens parentais SVL102 (tif51A-3) e VZL1181 (srp102K51I) foram usadas como controle 

de crescimento. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   51	
  

4.5. Análises genéticas entre o mutante tif51A-3 e fatores do translocon da via co-

traducional 

O translocon é um complexo proteico necessário na membrana do RE para que as 

proteínas sejam internalizadas no lúmen desta organela e sejam corretamente modificadas 

e/ou direcionadas para a via secretória (Shao S. 2011). Atualmente, este complexo é bem 

caracterizado, sendo composto por vários componentes essenciais (Sec61, Sec63 e Sss1) e 

não essenciais (Sbh1, Sec71 e Sec72) (Falcone D. 2011). 

A importância evolutiva da via co-traducional pode ser identificada pela sua 

complexidade e função em cada um dos domínios da natureza, isto é, praticamente ausente 

nos procariotos, menos importante nos eucariotos primitivos e majoritária nos eucariotos 

superiores (Connolly  et al., 1989, Crowley et al., 1993). Em levedura, as proteínas Ssh1 

(homólogo não essencial de Sec61), Sbh2 (homólogo não essencial de Sbh1) e Sss1 

(subunidade essencial comum) forma um translocon alternativo, acessório  ao translocon 

principal (Finke K, et al.  1996), composto principalmente por Sec61 (Robb A and Brown 

JD.  2001). 

Sec61 possui 10 domínios transmembrana que são separados por “loops”, alças não 

estruturadas, sendo denominados com números pares os que ficam voltando para fora do 

lúmen do RE (L2, L4, L6 e L8) (Cheng Z. et al., 2005). Especialmente, as “loops” 6 e 8 são 

responsáveis pelas ligações eletrostáticas entre translocon e proteínas ribossomais da 

subunidade maior do ribossomo e, assim, estabilizar o ribossomo ativo no translocon, 

enquanto novos ciclos de elongação da tradução acontecem. Um alinhamento das sequências 

primárias de Sec61 e Ssh1 de S. cerevisiae revela que essas regiões essenciais para ligação no 

ribossomo são conservadas, como mostrado em destaque na Figura 15. Dada a importância do 

translocon acessório na translocação foram realizadas algumas análises de interação genética 

entre mutantes de TIF51A e componentes deste translocon. 



	
   52	
  

Inicialmente, foi realizada a análise de interação genética sintética entre o mutante 

tif51A-3 e Δssh1. Para isso, foi feito o cruzamento da linhagem VZL447 (tif51A-3::URA3, 

ssd1::LEU2) com VZL1235 (ssh1::KanMX4, SSD1) para obtenção de diplóide duplo 

mutante. A análise foi realizada na presença de SSD1, pela razão explicada anteriormente. As 

tétrades obtidas deste diplóide foram submetidas a ensaio de sensibilidade a temperatura, 

juntamente com as linhagens de partida. A Figura 16 mostra uma das sete tétrades 

informativas analisadas que apresentaram o mesmo fenótipo, as quais revelam piora do 

defeito de crescimento do mutante tif51A-3, na ausência de SSH1 já em 32°C, quando 

comparado com o haplóide carregando somente tif51A-3 e alelo selvagem de SSH1. Ambos 

haplóides carregando cópia selvagem de TIF51A apresentam resistência na temperatura 

testada, como esperado. Portanto, o resultado revela que TIF51A e SSH1 são sinteticamente 

doentes, também de maneira independente de SSD1. 

Posteriormente, a análise de interação genética sintética entre o mutante tif51A-3 e 

Δsbh1 foi realizada. Assim, foi feito o cruzamento da linhagem VZL447 (tif51A-3::URA3, 

ssd1::LEU2) com VZL1236 (sbh1::KanMX4, SSD1) para obtenção de diplóide duplo 

mutante. A análise também foi realizada na presença de SSD1. As tétrades com segregação 

gênica de interesse de tipo ditipo não parental, obtidas deste diplóide foram submetidas a 

ensaio de sensibilidade a temperatura, juntamente com as linhagens de partida. A Figura 17 

mostra apenas uma das seis tétrades informativas analisadas com o mesmo fenótipo, a qual 

não evidencia qualquer alteração no crescimento do mutante tif51A-3 quando na ausência de 

SBH1, em comparação com a linhagem de partida tif51A-3. Ambos haplóides carregando 

cópia selvagem de TIF51A apresentaram crescimento nas temperaturas testadas, como 

esperado. Dessa forma, o resultado mostra que não existe interação genética entre TIF51A e 

SBH1. 



	
   53	
  

Com os resultados obtidos é possível sugerir que uma possível relação genética entre 

eIF5A e o translocon não se dá de maneira inespecífica e geral, por apresentar interação 

apenas com um dos dois componentes testados (Ssh1). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   54	
  

 

Figura 15. Alinhamento das sequências primárias de Sec61 e Ssh1. O alinhamento 

realizado com auxílio do programa ClustalW mostra com asterisco os aminoácidos 

conservados e quadrado os aminoácidos de mesmo grupo funcional. Os trechos de sequência 

referentes às “loops” 6 (azul) e 8 (verde) de Sec61 estão em destaque. 

 

 

 

 

 



	
   55	
  

 

Figura 16. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e Δssh1. 

Diluições seriadas de 4 haplóides de 1 única tétrade a partir do diplóide mutante duplo, foram 

aplicadas em meio YPD e incubadas por 2 dias nas temperaturas indicadas. As linhagens 

parentais SVL447 (tif51A-3::URA3, ssd1::LEU2) e VZL1235 (ssh1::KanMX4) foram usadas 

como controle de crescimento. 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
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Figura 17. Análise da interação genética entre o mutante tif51A-3 e Δsbh1. 

Diluições seriadas de 4 haplóides de 1 única tétrade a partir do diplóide mutante duplo, foram 

aplicadas em meio YPD e incubadas por 2 dias nas temperaturas indicadas. As linhagens 

parentais SVL447 (tif51A-3::URA3, ssd1::LEU2) e VZL1236 (sbh1::KanMX4) foram usadas 

como controle de crescimento. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



	
   57	
  

5. CONCLUSÕES  

√ Através das interações genéticas com Snc2, Sec2, Msb3 e Msb4, é possível sugerir 

que eIF5A atue de forma indireta em diferentes etapas da via secretória; 

 

√ eIF5A tem um papel mais específico na translocação de proteínas para o RE; 

 

√ Mutantes de eIF5A não apresentam defeito na translocação de CPY, o que sugere 

que eIF5A não atue na via pós-traducional; 

 

√ Mutantes de eIF5A apresentam defeito na translocação de DPAP B, o que, 

juntamente com a interações genéticas entre eIF5A e componentes específicos da via co-

traducional (Srp102 e Ssh1), sugerem um papel para eIF5A nesta via. 

	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  



	
   58	
  

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  

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7. ANEXO I 

O presente trabalho pode auxiliar, juntamente com a colaboração dos demais autores, na 

confecção do manuscrito apresentado a seguir, publicado na revista Amino Acids aceito em 

01 de novembro de 2013. DOI 10.1007/s00726-013-1618-6. 	
  

	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  



	
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ORIGINAL ARTICLE

eIF5A has a function in the cotranslational translocation
of proteins into the ER

Danuza Rossi • Fabio Carrilho Galvão • Hermano Martins Bellato •

Paulo E. G. Boldrin • Brenda J. Andrews • Sandro Roberto Valentini •

Cleslei Fernando Zanelli

Received: 6 May 2013 / Accepted: 1 November 2013
! Springer-Verlag Wien 2013

Abstract The putative eukaryotic translation initiation
factor 5A (eIF5A) is a highly conserved and essential

protein present in all organisms except bacteria. To be

activated, eIF5A requires the conversion of a specific res-
idue of lysine into hypusine. This hypusine modification

occurs posttranslationally in two enzymatic steps, and the

polyamine spermidine is the substrate. Despite having an
essential function in translation elongation, the critical role

played by eIF5A remains unclear. In addition to demon-

strating genetic interactions with translation factors, eIF5A
mutants genetically interact with mutations in YPT1, which

encodes an essential protein involved in endoplasmic

reticulum (ER)-to-Golgi vesicle transport. In this study, we
investigated the correlation between the function of eIF5A

in translation and secretion in yeast. The results of in vivo

translocation assays and genetic interaction analyses sug-
gest a specific role for eIF5A in the cotranslational trans-

location of proteins into the ER, but not in the

posttranslational pathway. Additionally, we observed that a
block in eIF5A activation up-regulates stress-induced

chaperones, which also occurs when SRP function is lost.
Finally, loss of eIF5A function affects binding of the

ribosome-nascent chain complex to SRP. These results link

eIF5A function in translation with a role of SRP in the cell

and may help explain the dual effects of eIF5A in differ-
ential and general translation.

Keywords Translation elongation ! Hypusine !
eIF5A ! Cotranslational translocation ! Endoplasmic

reticulum

Abbreviations
eIF5A Eukaryotic translation initiation factor 5A

TIF51A Gene encoding eIF5A in yeast
eEF2 Eukaryotic translation elongation factor 2

EFT2 Gene encoding eEF2 in yeast

eEF1A Eukaryotic translation elongation factor 1A
EF-P Elongation factor P

SRP Signal recognition particle

ER Endoplasmic reticulum
RNC Ribosome-nascent chain

CPY Carboxypeptidase Y

DPAP B Dipeptidyl aminopeptidase B

Introduction

The putative eukaryotic translation initiation factor 5A

(eIF5A) is a highly conserved and essential protein that is

present in archaea and eukaryotes but not in bacteria
(Schnier et al. 1991; Chen and Liu 1997). It was initially

purified from the ribosomes of reticulocyte lysates, and

eIF5A was also shown to stimulate the synthesis of me-
thionyl-puromycin in vitro (Benne and Hershey 1978).

However, a controversy has existed for years about whe-

ther eIF5A plays a direct role in translation. Meanwhile,
several other functions have been attributed to eIF5A,

D. Rossi ! F. C. Galvão ! H. M. Bellato !
P. E. G. Boldrin ! S. R. Valentini ! C. F. Zanelli (&)
Department of Biological Sciences, School of Pharmaceutical
Sciences, Univ Estadual Paulista, UNESP, Araraquara, SP,
Brazil
e-mail: zanellicf@fcfar.unesp.br

F. C. Galvão ! B. J. Andrews
Departament of Molecular Genetics, Donnelly Center for
Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto,
Toronto, Canada

123

Amino Acids

DOI 10.1007/s00726-013-1618-6



	
   62	
  

 

 

including roles in cell cycle progression, nucleocytoplas-

mic transport, mRNA degradation and apoptosis (Zanelli
and Valentini 2007; Park et al. 2010; Marra et al. 2007).

Nevertheless, it was recently demonstrated that eIF5A

physically interacts with the 80S ribosome, as well as with
translation elongation factors eEF1A and eEF2. In addi-

tion, eIF5A co-fractionates with monosomes and poly-

somes in a translation-dependent manner (Jao and Chen
2006; Zanelli et al. 2006). Mutants of eIF5A show an

accumulation of polysomes instead of polysome run-off,
and they cause an increase in the average time required for

ribosomes to transit along mRNAs (Gregio et al. 2009;

Saini et al. 2009). Moreover, eIF5A interacts functionally
with elongation factor eEF2 (Dias et al. 2012). These

results not only support the notion that eIF5A plays a direct

role in translation but also suggest that its role is specifi-
cally in translation elongation rather than translation

initiation.

eIF5A is activated by a unique posttranslational modi-
fication, in which a specific lysine residue (K51 in yeast) is

converted into hypusine over two steps: first, the enzyme

deoxyhypusine synthase (Dys1 in yeast) transfers an am-
inobutyl moiety from the polyamine spermidine to the

amino group of the specific lysine residue, forming de-

oxyhypusine; then, addition of a hydroxyl group is cata-
lyzed by the deoxyhypusine hydroxylase (Lia1 in yeast)

(Park et al. 2010).

Although bacteria do not have an eIF5A orthologue,
they have instead the elongation factor P (EF-P), which

shares important structural features with eIF5A (Park et al.

2010; Dias et al. 2013). EF-P does not contain a hypusine
residue; however, in a subset of bacterial species, EF-P

does undergo a posttranslational modification which

involves the addition of a b-lysine to a specific lysine
residue, corresponding to the hypusine modification site in

eIF5A (Navarre et al. 2010; Yanagisawa et al. 2010; Bailly

and de Crécy-Lagard 2010; Roy et al. 2011; Park et al.
2012). This EF-P modification, called b-lysylation, is

analogous to the hypusine modification of eIF5A and is

important for the function of EF-P in the translation and
cell growth of E. coli (Yanagisawa et al. 2010; Park et al.

2012).

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been
used as a model system to study eIF5A, and several genetic

interactions have already been identified (Valentini et al.

2002; Zanelli and Valentini 2005; Frigieri et al. 2007,
2008; Dias et al. 2012). One interesting genetic interaction

is synthetic lethality caused by mutation of both eIF5A and

Ypt1 (Frigieri et al. 2008), a protein essential for the fusion
of endoplasmic reticulum (ER) vesicles to the Golgi (Segev

2001). Although we demonstrated that eIF5A does not

work directly in the vesicle trafficking, this factor is
associated to ribosomes bound to membranes, implying a

function for eIF5A in translation at the ER (Frigieri et al.

2008).
To better understand the link between eIF5A and the

secretory pathway, in this study, we analyzed the

involvement of eIF5A in the translocation of proteins into
the ER. We demonstrate that eIF5A is important for the

cotranslational translocation of proteins into the ER, but

not for the posttranslational translocation pathway. Addi-
tionally, genetic analyses revealed that interactions only

occur between eIF5A and factors essential for the
cotranslational translocation pathway. Interestingly, when

hypusine formation and eIF5A activation are blocked, we

observed up-regulation of the expression of stress-induced
chaperones, a phenotype also seen in mutants with loss of

function of the cotranslational translocation pathway and

the consequent accumulation of unfolded proteins in the
cytosol. Finally, we show that eIF5A function is important

for the ribosome-nascent chain (RNC) complex to bind the

signal recognition particle (SRP). Collectively, these

Table 1 The yeast strains used in this study

Strain Genotype Source

SVL14 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3
can1 tif51A-1 (P83S)

Lab collection
(Valentini et al.
2002)

SVL82 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3
can1

Lab collection

SVL613 MATa leu2 trp1 ura3 his3
dys1::HIS3 [DYS1/TRP1/CEN]
(pSV520)

Lab collection

SVL614 MATa leu2 trp1 ura3 his3
dys1::HIS3 [dys1-1 (W75R,
T118A, A147T)/TRP1/CEN]
(pSV730)

Lab collection
(Galvão et al.
2013)

VZL1021 MATa ura3 leu2 his3 trp1 ade2
sec61-101

Davis Ng

VZL1246 MATa ura3 leu2 his3 trp1 ade2
can1 rpl25::HIS3 [RPL25-GFP/
LEU2/CEN]

Martin Pool

VZL1248 MATa ura3 ade2 trp1 leu2 his3
sec65-1

Martin Pool

VZL1257 MATa his3 leu2 ura3 tif51A-
1::natMX4 can1 lyp1

Lab collection

VZL1292 MATa ade2 his3 leu2 trp1 ura3
can1 [eft2H699K/2l/TRP1]
(pVZ1370)

Lab collection

Y07842a MATa his3 leu2 ura3 sec61-
2::kanMX4

Brenda Andrews

Y07900a MATa his3 leu2 ura3 sec62-
ts::kanMX4

Brenda Andrews

Y11000a MATa his3 leu2 ura3 sec65-
1::kanMX4

Brenda Andrews

1623a MATa his3 leu2 ura3 Brenda Andrews

a Li et al. (2011)

D. Rossi et al.

123



	
   63	
  

 

 

results reveal a close connection and specific interaction
between eIF5A and the translocation of proteins into the

ER via the cotranslational pathway.

Materials and methods

Yeast strains, plasmids and standard procedures

The yeast strains and plasmids used in this study are listed

in Tables 1 and 2, respectively. The procedures for cell

growth and genetic manipulations were performed
according to standard protocols (Guthrie and Fink 1991).

Western blot analysis

Yeast strains were grown to mid-log phase and were sub-

sequently lysed in protein extraction buffer (20 mM Tris–
HCl, at pH 7.5, 2 mM dithiothreitol, 2 mM EDTA and

5 lg/mL each of pepstatin, leupeptin, aprotinin and chy-

mostatin). Total protein extracts were resolved by SDS-
PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. The

proteins of interest were detected through immunoblotting,

using specific antibodies and the chemiluminescence
detection system.

Growth analysis and temperature sensitivity assay

Yeast strains were grown under permissive conditions, and

equal amounts of the cultures were subsequently harvested.
Tenfold serial dilutions were plated onto specific media

and grown at the indicated temperatures for 3 days.

Synthetic genetic interactions

Strains carrying double knockout alleles or mutations were
generated by standard crossing and sporulation methods.

Spores of interest were grown in the presence of nour-

seothricin (tif51A-1::natMX4) and geneticin to select for
other mutant genes (kanMX4 marker). The strains were

then transformed with a plasmid encoding TIF51A or an

empty vector. Briefly, the plasmid shuffle assay (Lorsch
2007) was used to select the strains that, due to natural

plasmid loss, did not harbor the TIF51A/URA3 plasmid

after being grown in media containing uracil. This selec-
tion allows for an analysis of the gene interactions both

with and without a copy of the wild-type gene in an iso-

genic background.

Subcellular fractionation

The subcellular fractionation of the lysed cells was based

on previously described protocols (Frey et al. 2001; Dalley

et al. 2008). The pellet of cells was prepared according to
the western blot protocol, including a treatment with

0.1 mg/mL cycloheximide for 5 min just before lysis. The

lysates were cleared of cellular debris by centrifugation at
1,2009g for 10 min, and the membranes were pelleted by

centrifugation at 18,0009g for 20 min. The pellet was

solubilized by the addition of 1.5 % (weight/volume)
CHAPS in the presence of 500 mM KOAc. Insoluble

materials were removed by high-speed centrifugation. The

resulting supernatant was centrifuged for 1 h at
256,0009g to generate a ribosome-enriched pellet and a

postribosomal supernatant. The total protein extract (T),

postribosomal supernatant (S) and ribosomal-enriched
pellet (P) were each analyzed by western blot. The western

blot signals of the samples were quantified using ImageS-

canner III and IQ Tools (GE Healthcare Life Sciences).
The values of the pellet fractions, normalized by their

respective total fractions, were plotted in percentages rel-

ative to the wild type (assuming wild type = 1.0) using
Microsoft Excel software (Microsoft, Redmond, Wash-

ington, USA).

Results and discussion

A mutant of eIF5A shows a cotranslational

translocation defect, which is not due to impaired

general translation elongation

Considering the involvement of eIF5A in elongation and its

functional connection to the secretory pathway (Frigieri
et al. 2008; Gregio et al. 2009), we hypothesized that

eIF5A might act during ER-associated protein synthesis.

Table 2 The plasmids used in this study

Plasmid Description Source

pSV59 CEN, LEU2 Lab collection

pSV60 CEN, URA3 Lab collection

pSV65 2l, URA3 Lab collection

pSV107 TIF51A, 2l, URA3 Lab collection

pSV138 TIF51A, CEN, URA3 Lab collection

pSV146 TIF51A, CEN, LEU2 Lab collection

pSV364 2l, URA3 Lab collection

pSV374 2l, LEU2 Lab collection

pVZ1064 SSCPY-URA3, HIS3, CEN Davis Ng

pVZ1110 GAL1-DAP2-6xHis, 2l,
URA3

Open biosystems/Lab
collection

pVZ1359 SEC65, SRP21, SRP72, 2l,
URA3

Colin J. Stirling

pVZ1360 SCR1, SRP14, SRP54,
SRP68, 2l, LEU2

Colin J. Stirling

pVZ1370 eft2H699K, 2l, TRP1 Lab collection

eIF5A has a function in the cotranslational translocation

123



	
   64	
  

 

 

To test this possibility, we used a tif51A-1 mutant strain,

which has depleted eIF5A (Valentini et al. 2002), and
reporters of protein translocation into the ER (Ng et al.

1996). Because the mechanisms governing the cotransla-

tional and posttranslational pathways of protein transloca-
tion into the ER differ significantly, in particular the factors

associated with the translational machinery, we tested

reporters specific to both pathways (Ng et al. 1996).
We first investigated the posttranslational pathway using

the vacuolar carboxypeptidase Y (CPY) as a reporter. The

targeting of CPY to the ER occurs in a SRP-independent
manner (Ng et al. 1996). CPY maturation occurs normally

in wild-type cells but is abnormal in cells that exhibit a

general translocation defect, such as sec61 mutants (Stir-
ling et al. 1992; Ng et al. 1996). As shown in Fig. 1a, the

wild-type strain showed correct sorting of CPY, which

undergoes proteolysis to yield its vacuolar mature form
(61 kDa), consequently decreasing its molecular weight.

As in the wild type, the tif51A-1 mutant also exhibits only

the mature form of CPY. On the other hand, the sec61-101
mutant exhibits an accumulation of the precursor form of

CPY (69 kDa). These results agree with previous evidence,

which indicated that different eIF5A mutants did not dis-
play defects in CPY maturation (Frigieri et al. 2008).

To extend our analysis of the potential link between

eIF5A and ER-associated protein synthesis, we used a
second reporter. The signal sequence of CPY was fused to

the N-terminus of the entire URA3 ORF (SSCPY-Ura3),

leading to the production of the fusion protein SSCPY-
Ura3, which is artificially targeted to the ER exclusively

via the posttranslational pathway (Ng et al. 1996). In a

wild-type strain, SSCPY-Ura3 is efficiently targeted to the
ER and this fusion protein cannot complement an ura3

strain because it lacks access to its natural cytosolic sub-

strate. In contrast, cells with a defect in the posttransla-
tional pathway accumulate SSCPY-Ura3 in the cytoplasm

and can grow in medium without uracil. The results gen-
erated using this reporter are shown in Fig. 1b. In contrast

to the sec61-101 mutant, the eIF5A mutant tif51A-1

expressing an SSCPY-Ura3 reporter cannot grow in the
absence of uracil, indicating that the posttranslational

translocation pathway is intact in these cells. These results

demonstrate that eIF5A does not play a role in the post-
translational translocation of proteins into the ER.

Next, we asked whether eIF5A is necessary for the

cotranslational translocation pathway. We used the vacu-
olar dipeptidyl aminopeptidase B (DPAP B) as a reporter

because this protein is exclusively translocated via the

cotranslational SRP-dependent pathway (Ng et al. 1996). In
the wild-type strain, DPAP B is targeted to the ER and

undergoes several N-glycosylations, which increase its

molecular weight from 93 to 120 kDa (Fig. 2). In contrast,

Fig. 1 eIF5A does not play a role in the posttranslational translo-
cation of proteins into the ER. a The in vivo translocation of the
endogenous CPY protein. The wild-type (SVL82), sec61-101
(VZL1021) and tif51A-1 (SVL14) strains were grown to mid-log
phase at 25 !C and then shifted to the restrictive temperature (37 !C)
during 3 h. Ten micrograms of total protein extract from each strain
were immunoblotted with anti-CPY to detect the precursor
(pCPY = 69 kDa) and the mature (mCPY = 61 kDa) forms of the
protein. Anti-Rpl5 was used as a loading control. Anti-eIF5A was
used to detect the protein mutant depletion under restrictive growth
conditions. b Tenfold serial dilutions of the same strains harboring the
reporter SSCPY-Ura3 (pVZ1064) were plated onto SC-histidine
(growth control) and SC-uracil to test the ability to grow due to the
cytoplasmic accumulation of SSCPY-Ura3. Both plates were incu-
bated at semi-permissive temperature (35 !C) for 3 days

Fig. 2 eIF5A, but not eEF2, plays a role in the cotranslational
translocation of proteins into the ER. The wild-type (SVL82), sec61-
101 (VZL1021), tif51A-1 (SVL14) and eft2H699K (SVL1292) strains,
all carrying the reporter DPAP B plasmid (pVZ1110), were grown to
mid-log phase at the permissive temperature (25 !C). The expression
of the reporter DPAP B was induced by the addition of 2 % galactose
for 3 h. For SVL14, SVL82 and VZL1021, DPAP B induction time
was coincident to the shift time at the restrictive temperature, 3 h at
37 !C. The dominant-negative eft2H699K was grown at 25 !C as
translation elongation defect already occurs at this condition (Ortiz
and Kinzy 2005). The total protein extract was immunoblotted using
anti-69His (DPAP B) to detect both the precursor (pDPAP
B = 93 kDa) and the mature (mDPAP B = 120 kDa) forms of
DPAP B. Dys1 was used as a loading control

D. Rossi et al.

123



	
   65	
  

 

 

in the sec61-101 mutant, the targeting of DPAP B to the

ER is inefficient, and no mature form of the protein is

observed (Fig. 2). The eIF5A mutant tif51A-1 showed a
defect in maturation of DPAP B, comparable to that seen in

the sec61-101 mutant (Fig. 2). Considering that the CPY

targeting is correct in the tif51A-1 mutant, these results
suggest that eIF5A function is necessary specifically for the

cotranslational translocation of proteins into the ER.
Since cotranslational translocation is coordinated with

the elongation step of protein synthesis (Mason et al. 2000;

Brodsky 1998) and because eIF5A mutants show a general

defect in translation elongation, we next tested whether

another translation elongation mutant might also display a

defect in the cotranslational translocation pathway. We
used DPAP B to assess the translocation abilities of a strain

harboring the elongation factor 2 (eEF2) dominant-nega-

tive mutant eft2H699K. The protein eEF2 is a canonical
translation elongation factor, and the eft2H699K mutant

strain exhibits impaired elongation of polypeptides during
protein synthesis, a phenotype shared with eIF5A mutants

(Dias et al. 2008, 2012; Gregio et al. 2009). As observed in

the right-most lane of Fig. 2, similarly to wild-type cell,

Fig. 3 Genetic interactions
occur specifically between
eIF5A and cotranslational
translocation factors. a A
simplified scheme for protein
translocation into the ER via the
cotranslational (SRP-dependent)
and the posttranslational (SRP-
independent) pathways. The
proteins in the black boxes,
Sec65, Sec61 and Sec62, were
assayed. b The genetic
interactions between tif51A-1
and either sec65-1, sec61-2 or
sec62-ts. The indicated double
mutant strains harboring
TIF51A (pSV138 or pSV146) or
the empty vector (pSV59 or
pSV60) were plated onto SC-
leu,-ura (growth control) and
SC?5-FOA media and grown at
the permissive temperature
(25 !C) for 3 days. c Rescue of
the temperature-sensitive
phenotype of the tif51A-1 by
overexpression of the SRP
complex. Tenfold serial
dilutions of the wild-type
(SVL82) and tif51A-1 (SVL14)
strains, either harboring all of
the SRP complex components
(pVZ1359?pVZ1360) or
harboring empty vectors
(pSV364?pSV374), were
plated onto SC-leu,-ura and
grown at both the permissive
(25 !C) and the restrictive
temperatures (37 !C) for 3 days

eIF5A has a function in the cotranslational translocation

123



	
   66	
  

 

 

DPAP B is correctly targeted to the ER in the eft2H699K

mutant. This result strongly suggests that the involvement
of eIF5A in the cotranslational translocation pathway is

specific and not merely a consequence of a general block in

the elongation step of protein synthesis.

eIF5A interacts genetically only with factors

in the cotranslational translocation pathway

To confirm the functional relevance of eIF5A for the cel-
lular secretory pathway, we searched for genetic interac-

tions between eIF5A and translocation factors. As depicted

in Fig. 3a, we chose the genes of factors that are essential
for the cotranslational translocation pathway (SEC65) or

for the posttranslational pathway (SEC62) and the primary

translocon component (SEC61), which is essential for both
pathways.

We first tested the effect of combining mutants of the

translocation factors described above and the eIF5A mutant
tif51A-1 in a single haploid strain. Interestingly, we

observed a growth defect at the permissive temperature

(25 !C) in the double mutant strains carrying tif51A-1 and
either sec65-1 or sec61-2 (empty vector), but no defect was

noticed in the double mutant tif51A-1 sec62-ts (empty

vector), when compared to the wild type (TIF51A). This
genetic assay shows a synthetic sick genetic interaction

only between tif51A-1 and the mutants affecting the

cotranslational pathway, sec65-1 and sec61-2 (Fig. 3b).
In cotranslational targeting, binding of SRP to the signal

peptide is a limiting step. Because of this fact, and because

of the greater quantity of ribosomes in a cell than SRPs
(Ogg and Walter 1995), we next tested whether an over-

expression of genes coding for all SRP components would

rescue the growth defect of the tif51A-1 mutant at the
restrictive temperature. As shown in Fig. 3c, the overex-

pression of SRP does cause a partial rescue of the growth

defect.
Together, these results further support the idea that the

function of eIF5A is important for the cotranslational tar-

geting of proteins to the ER.

Blocking eIF5A activation increases the levels

of stress-induced chaperones

The functional correlations between eIF5A and the

cotranslational pathway described herein are very similar
to those reported for Rpl25-GFP. The ribosomal protein

L25 (Rpl25) is an important mediator of the ribosome

interaction with SRP (Halic et al. 2004, 2006), and a strain
expressing an Rpl25-GFP fusion protein has defects in the

cotranslational translocation but not in the posttranslational

pathway (Dalley et al. 2008). In addition, some stress-
induced chaperones are up-regulated in the Rpl25-GFP

strain (Dalley et al. 2008), a phenotype reminiscent of SRP

dysfunction in the cell (Arnold and Wittrup 1994; Mutka

and Walter 2001). To verify if the loss of function of eIF5A
also triggers an up-regulation of stress-induced chaperones,

we looked for these proteins in 2D gel-based proteomic

maps of eIF5A-defective mutants (data not shown). How-
ever, the eIF5A mutants described so far need a tempera-

ture shift to exhibit the defect in eIF5A function, which

also induces heat-shock responses and alters the expression
of chaperones, compromising this analysis. Instead, we

used the deoxyhypusine synthase mutant dys1-1, which

shows a 60 % reduction in hypusine-containing eIF5A at
permissive temperature. Besides, even under permissive

growth condition (25 !C), the dys1-1 mutant shows defects

of translation (total protein synthesis and polysome profile)
that are identical to the eIF5A mutants at their restrictive

temperature (Galvão et al. 2013).

Among the five chaperones identified in our 2D-DIGE
experiments, we found that the stress-induced chaperones

Hsp31, Sse1, Ssb2 and Ssa1 were up-regulated in the dys1-

1 mutant when compared to the wild type (Fig. 4a). Stress-
induced chaperones become up-regulated in response to the

accumulation of unfolded proteins in the cytosol, and the
Hsf1 transcription factor is determinant for their induction

(Sorger 1991; Albanèse et al. 2006). Figure 4b shows the

information on Hsf1 regulation as well as the Hsf1-binding

Fig. 4 Loss of eIF5A function causes the up-regulation of stress-
induced chaperones. a Differentially expressed chaperones identified
by mass spectrometry in 2D-DIGE proteomic maps of dys1-1 mutant
(SVL614) compared to its isogenic wild-type strain (SVL613) after
growth at 25 !C. Each bar represents relative staining intensities of
chaperones Hsp31, Sse1, Ssb2 and Ssa1 from 2D-gels of biological
triplicates (data not shown). b The genes encoding the same up-
regulated chaperones are transcriptionally regulated by the transcrip-
tion factor Hsf1, according to the confirmed or potential motifs
indicated (YEASTRACT Database)

D. Rossi et al.

123



	
   67	
  

 

 

motifs that are present in the promoters of the genes coding

for Hsp31, Sse1, Ssb2 and Ssa1. Therefore, our results

examining stress-induced chaperones in the eIF5A mutant
are also very similar to those observed for the Rpl25-GFP

strain (Dalley et al. 2008) and SRP mutants (Arnold and

Wittrup 1994; Mutka and Walter 2001), and they again
support the concept that eIF5A functions during the

cotranslational targeting of proteins to the ER.

eIF5A is important for the binding of SRP

to the ribosome-nascent chain complex

Because eIF5A binds to ribosomes and has an essential

function during translation elongation (Zanelli et al. 2006;

Jao and Chen 2006; Gregio et al. 2009; Saini et al. 2009),
we also tested whether eIF5A depletion interferes with the

binding of ribosome to SRP. We used a strategy of ultra-

centrifugation to purify the ribosomes, which allows for the
co-purification of bound SRP (Frey et al. 2001; Dalley

et al. 2008). For this experiment, we also included Rpl25-

GFP, which has decreased association of ribosomes with
SRPs (Dalley et al. 2008). Therefore, the total cell extracts

(T) were separated into postribosomal supernatants (S) and

ribosomal pellet fractions (P) by ultracentrifugation. The
quantity of purified complexes was detected by blotting the

ribosomal protein L5 (Rpl5) and the SRP subunit Sec65.

Samples were also blotted for the cytosolic hexokinase

Hxk1 and eIF5A. As shown in Fig. 5a, all pellet fractions

(P) contained ribosomes (Rpl5) and SRP (Sec65) com-

plexes, which were absent in the supernatant fractions (S).
On the other hand, Hxk1 was present only in the S frac-

tions, as expected. The depletion of eIF5A in the tif51A-1

mutant was also seen in all fractions, compared to the wild-
type strain (Fig. 5a). Because the presence of Sec65 in the

P fractions is dependent on ribosome precipitation, we

quantified and normalized the amount of Sec65 relative to
Rpl5 (Fig. 5b). In comparison to the wild-type strain, we

observed the known defect in the Rpl25-GFP strain in the

binding of RNCs to SRPs (Dalley et al. 2008). Similarly,
the eIF5A mutant tif51A-1 demonstrated a decreased

association between ribosomes and SRPs.

These results are consistent with the defects observed in
the cotranslational translocation pathway of eIF5A mutants

and with the genetic interactions between eIF5A and

cotranslational translocation factors. Furthermore, our data
suggest that the primary function of eIF5A in the translo-

cation of proteins during translation is the efficiency of

binding of SRP to elongating ribosomes.
To our knowledge, this is the first study showing that a

translation factor has been directly linked with the function

of SRP in targeting the RNC to the ER. Additionally, this
discovered link between the function of eIF5A in the

ribosome and SRP binding to the RNC supports the

hypothesis that eIF5A acts differentially in the translation

Fig. 5 eIF5A is important to
the binding of the ribosome-
nascent chain complex to SRP.
a The wild-type (SVL82),
Rpl25-GFP (VZL1246) and
tif51A-1 (SVL14) strains were
grown to mid-log phase at the
permissive temperature (25 !C)
and then shifted to 37 !C for
3 h. The total extract (T),
supernatant (S) and pellet
(P) from a
256,0009g centrifugation were
immunoblotted against Hxk1,
Rpl5, Sec65 and eIF5A using
specific polyclonal antibodies.
b The quantification of the
Sec65 present in the ribosome-
enriched fraction (P) normalized
by the ribosomal protein Rpl5.
The graph represents the
relative values of Sec65/Rpl5
obtained from independent
replicates, assuming the wild-
type strain to have a value of 1

eIF5A has a function in the cotranslational translocation

123



	
   68	
  

of a specific subset of mRNAs, although the loss of eIF5A

function ultimately induces general defects in translation
elongation (Zanelli and Valentini 2007; Park et al. 2010).

It is important to note that the eIF5A structural homolog

EF-P has recently been shown to function preferentially in
the translation of proteins containing poly-proline tracts

and other amino acid motifs, such as YIRYIR (Ude et al.

2013; Doerfel et al. 2013; Hersch et al. 2013). However,
not all of the proteins containing these motifs are decreased

in a Salmonella strain deficient in EF-P, suggesting that the
role EF-P plays in the translation of specific proteins is

more complex than was initially determined by an analysis

of poly-proline tracts (Hersch et al. 2013). Interestingly,
several proteins identified as more dependent on EF-P for

their translation are related to membrane integrity and

motility (Bullwinkle et al. 2012; Hersch et al. 2013), which
require a number of proteins that are translocated in an

SRP-dependent manner (Zhang et al. 2012). It remains to

be determined whether eIF5A also affects translation in an
amino acid tract-dependent manner similarly to EF-P and

whether this is correlated with SRP-dependent translation.

Acknowledgments We are grateful to Colin Stirling (University of
Newcastle, Newcastle, United Kingdom), Martin Pool (Faculty of
Life Sciences, University of Manchester, Manchester, United King-
dom) and Davis Ng (Biological Science, National University of
Singapore, Singapore) for their generous gifts of strains, plasmids,
and antibodies. This work was supported by grants to S R V and C F Z
from the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP), the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientı́fico e
Tecnológico (CNPq) and PADC from the Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, UNESP. We also thank the FAPESP for fellowships
awarded to most of the authors.

Conflict of interest We declare that we have no conflict of interest.

References

Albanèse V, Yam AY, Baughman J, Parnot C, Frydman J (2006)
Systems analyses reveal two chaperone networks with distinct
functions in eukaryotic cells. Cell 124(1):75–88. doi:10.1016