UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU BANDAMENTO EM CROMOSSOMOS DE PEIXES: DISCUSSÃO SOBRE O CONCEITO DE COMPARTIMENTALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA LUIZ RICARDO DE SOUZA PAIVA Botucatu 011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU BANDAMENTO EM CROMOSSOMOS DE PEIXES: DISCUSSÃO SOBRE O CONCEITO DE COMPARTIMENTALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências de Botucatu, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor. Luiz Ricardo de Souza Paiva Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti Co-orientadora: Profa. Dra. Marta Svartmanm i Aos meus pais, meus irmãos e a Bheatriz (minha afilhada), um agradecimento especial por estarem presentes em minha vida, pela força e apoio, nestes vários anos de dedicação a minha formação. ii A minha esposa Greicy Paiva que sem seus conselhos, visão geral dos estudos cromossômicos, paciência e abdicação de minha presença por vários momentos, talvez eu não tivesse conseguido. Obrigado pela dedicação e seu Amor. iii A ignorância gera confiança com mais frequência do que o conhecimento: são aqueles que sabem pouco, e não aqueles que sabem muito, que tão positivamente afirmam que esse ou aquele problema jamais será resolvido pela ciência. - Charles Darwin. Não me desencorajo, porque cada tentativa errada descartada é outro passo à frente. Thomas Edison iv Agradecimentos A minha família, trabalho e amigos. Ao professor Fausto Foresti, pela orientação, pelo exemplo e pelo os momentos. A professora Marta Svartmamn pela orientação e auxílio no desenvolvimento, sugestões, correções deste trabalho. Ao técnico Renato Devidé, por estar sempre disposto a ajudar nas coletas e emprestar seus conhecimentos práticos em preparações cromossômicas. A todos os pesquisadores que de alguma forma em seus trabalhos me inspiraram e fortaleceram para continuar nesta caminhada. Aos meus amigos Igor Paiva Ramos e José Carlos Pansonato Alves. Ao amigo de laboratório Rodrigo Mezêncio Godinho por me ensinar a trabalhar com cultura celular. Aos amigos de laboratório pelos auxílios em coletas, discussões a cerca de citogenética e momentos de maior descontração. Aos funcionários do Departamento de Morfologia e da Seção de Pós-Graduação. Ao Laboratório Hermes Pardini (Belo Horizonte – MG), pela oportunidade de integração citogenética humana e animal através de seus recursos humanos, e pela captura e análise dos cromossomos G bandados. Resumo v Resumo O estudo da organização estrutural dos cromossomos é extremamente complexo e envolve a intrínseca relação entre as sequências de DNA e sua composição, proteínas histônicas e não histônicas, bem como processos extra-cromossomais. Em citogenética de peixes são utilizadas de forma sistemática técnicas clássicas (bandas C e NOR) e citomoleculares, com uso de sondas de DNAr. A análises para identificação de todos os cromossomos homólogos do complemento foi descrita para algumas espécies com a utilização da técnica de incorporação de análogos de base (BrdU) e alguns outros por bandas G. Porém, a aplicação desta metodologia não é realizada de modo rotineiro devido às dificuldades para obtenção do padrão de bandas de forma repetitiva. O padrão de bandas observado nos cromossomos é correlacionado à distribuição do conteúdo de sequências ricas em bases GC, identificados como isocores e reportado por alguns autores, de modo que quanto maior o conteúdo de bases G e C, maior a compartimentalização do genoma, enquanto o menor conteúdo destas bases seria determinante de menor grau de compartimentalização. O presente trabalho descreve a padronização de técnicas de obtenção cromossômica visando a aplicação de metodologias promotoras de bandamento cromossômico e a análise de um estudo de caso de obtenção de bandas G em Tilápia (Oreochromis niloticus). Abstract vi Abstract The study of the structural organization of chromosomes is extremely complex and involves the intrinsic relationship between sequences of DNA and its composition, histone and non-histone proteins as well as extra-chromosomal processes. Classical techniques as C-banding and Ag-NOR, and molecular techniques using fluorochromes and repetitive DNA probes are frequently used in fish cytogenetics. The technique of base analogues (BrdU) incorporation and G-bands has been used in the identification of all chromosomes of the complement in some species of this group of organisms. However, such techniques are not routinely performed due to difficulties in the obtention of good and repetitive banding patterns. The banding pattern of chromosomes is correlated to the distribution of GC-rich segments (isochores) reported by some authors, and higher content of GC-rich sites characterize a large degree of compartmentalization, while a less content in GC segments is identified as bas-degree of compartmentalization of the genome. This paper describes the standardization of techniques for the obtention of chromosome preparations looking for better conditions to the employment of G-banding technique in fish chromosomes and the analysis of a case study for the obtention of G-bands in tilapia (Oreochromis niloticus) chromosomes. Sumário vii Introdução Geral Materiais e Métodos Resultados Capítulo 1 ............................................................................................................................................. 9 Melhoramento técnico em preparações citogenéticas diretas para peixes de água doce ...................... 9 Capítulo 2 ........................................................................................................................................... 10 Cultura celular de sangue perifético para obtenção de cromossomos metafásicos em peixes ósseos neotropicais e aplicação de bandamento G ............................................................................. 10 Capítulo 3 ........................................................................................................................................... 10 Bandamento G em Cromossomos de Peixes ...................................................................................... 10 Capítulo 4 ........................................................................................................................................... 11 Caracterização Cromossômica de Pterodoras granulosus (Valenciennes, 1821), (Pisces, Siluriforme, Doradidae) e Bandamento G-11 Primeira Descrição Para Peixes ................................. 11 Capítulo 1 - Melhoramento técnico de preparações citogenéticas diretas de peixes de água doce .................................................................................................................................................... 12 Introdução Materiais e Métodos Resultados e Discussão Referências Capítulo 2 - Cultura celular de sangue periférico para obtenção de cromossomos metafásicos de peixes ósseos neotropicais com aplicação de bandamento G .............................. 27 Introdução Materiais e Métodos Resultados Discussão Referências Capítulo 3 - Bandamento G em Cromossomos de Peixes ............................................................. 43 Introdução Materiais e Métodos Resultados Discussão Referências Sumário viii Capítulo 4 - Chromosomal heteromorphism characterization by G-11 and R-HSS bands in Pterodoras granulosus (Siluriformes) with discussion about the karyotypic evolution in Doradidae family. ............................................................................................................................. 73 Introduction Material and Methods Results Discussion References Considerações Finais Referências Gerais Paiva, LRS Introdução Geral 1 Introdução Geral A ictiofauna Neotropical de água doce é uma das mais ricas e diversificadas do mundo, sendo que aproximadamente 24% da diversidade mundial de peixes é representada por peixes continentais da América do Sul (Vari e Malabarba, 1998). Desta revisão constam 71 famílias e 4.475 espécies de peixes neotropicais, com cerca de 2.587 espécies já descritas no Brasil (Buckup et al, 2007). O uso das técnicas de bandamento cromossômico clássico em peixes é centralizado em algumas técnicas, apesar dos estudos citogenéticos no grupo terem tido um grande impulso a partir da década de 70, principalmente após a publicação do trabalho de Mcphail e Jones (1966), formulando a técnica de suspensão celular para obtenção de cromossomos mitóticos em peixes. Stewart e Levin (1968) descreveram que a aplicação da técnica proposta apresentava algumas desvantagens, com referência a visualização dos cromossomos (possível somente sob observação em contraste-de-fase) e à conservação do material, o qual deveria ser mantido em baixas temperaturas. Dessa forma propuseram que o material deveria ser fixado em etanol/ácido acético e corado com Giemsa. Kligerman e Bloom (1976) descreveram um método para obtenção de cromossomos mitóticos discordando dos autores anteriores e empregando pela primeira vez com eficiência a solução hipotônica (KCl), possibilitando maior dispersão dos cromossomos e, em conseqüência, obtendo definição mais precisa do cariótipo. No Brasil, entre a as décades de 60 e 70, os estudos genéticos em peixes iniciaram- se com o pesquisador Silvio de Almeida Toledo Filho no Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (Foresti, 2008), que teve um papel fundamental na introdução e desenvolvimento dos estudos nesta área. Mais tarde, outros autores como Bertollo et al. Paiva, LRS Introdução Geral 2 (1978) e Foresti et al. (1981; 1993) adaptaram e descreveram metodologias para obtenção de cromossomos mitóticos para este grupo de organismos, que foram incorporadas aos protocolos usados nos laboratórios de citogenética. Os bons resultados obtidos e a melhora na qualidade das preparações cromossômicas determinaram a crescente expansão nos estudos nesta área, sendo empregadas como rotina até o presente momento. Estes pesquisadores impulsionaram a realização de muitos trabalhos de citotaxonomia em peixes neotropicais (Foresti, 2008). Vários autores relatam que são conhecidos os números diplóides e/ou haplóides em cerca de 706 espécies de peixes, distribuídas em 207 gêneros e 38 famílias, o que representa aproximadamente 22% das espécies da região Neotropical (Almeida-Toledo et al, 2000; Nirchio e Oliveira et al, 2006, 2007). Segundo Almeida-Toledo et al (2000), a variabilidade em peixes neotropicais é extraordinária quanto ao número e fórmula cromossômica, sendo encontrados números números diplóides de 20 cromossomos em Pterolebias longipinnis a 134 cromossomos em Corydoras aeneus, presença de cromossomos supranumerários. Dentro desta diversidade, pode ser constatada a ocorrência de grupos com pouca variação no número diplóide, sendo por isso denominados conservados, como os Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidade, que possuem o número diplóide modal de 54 cromossomos, do mesmo modo que outros como os Characidae, que apresentam extensa variação de números diplóides e de fórmulas carioptípicas. Outras variações envolvem a ocorrência formas poliplóides ou derivadas de poliploidia (Corydoras cf. simulatus), híbridos naturais, misturando características cromossômicas (Eigenmannia) e polimorfismos de diferentes tipos, sendo o mais comum aqueles relacionados ao tamanho e número das regiões organizadoras de nucléolos nos cromossomos. Neste grupo animal, no qual a os estudos citogenéticos efetuados de forma estruturada no país tiveram início à cerca de apenas 40 anos (Foresti, 2008), são ainda Paiva, LRS Introdução Geral 3 escassos os trabalhos com bandamentos cromossômicos que possibilitam caracterizar de forma inequívoca os pares de cromossomos homólogos (Bertollo et al., 1997; Maistro et al., 1999; Maistro et al., 2000; Almeida-Toledo et al., 2000; Vicente et al., 2003 e Carvalho e Dias, 2005), ao contrário do que ocorre para a maioria dos grupos de vertebrados, principalmente mamíferos e aves, onde diferentes técnicas como bandamentos G, R, Q, T e RE têm sido aplicadas (Verma e Babu, 1995). A incorporação de BrdU nos cromossomos de duas espécies de Astyanax realizada por Daniel-Silva e Almeida-Toledo (2005), possibilitou o estabelecimento de um marco divisório na citogenética de peixes, permitindo a avaliação das relações cromossômicas entre espécies, a partir da aplicação desta metodologia de bandamento. Outros trabalhos com a utilização de incorporação por análogos de base em vertebrados de sangue frio reportam a aplicabilidade desta técnica, que permite um padrão de banda mais resolutivo quando comparado, por exemplo, à clássica banda C (Venere et al, 1995, Luo, 1998, Maistro et al, 1999, Maistro et al, 2000, Silva et al, 2006; Salvadori et al, 2003; Daniel- Silva e Almeida-Toledo, 2005; Fugiwara et al, 2007; Portela-Castro et al, 2008, Kasahara, 2009). Além de bandamento por incorporação de análogo de base há também o bandamento por digestão enzimática, técnica conhecida por banda G descrita por Seabright (1972). Esta técnica determinou expressivas modificações e avanços na citogenética, sendo responsável pelo desenvolvimento dos estudos citoevolutivos em vertebrados de sangue quente, bem como o entendimento de aberrações cromossômicas identificadas nos cromossomos humanos. Para os vertebrados de sangue frio, grupo no qual estão incluídos os peixes, a técnica de banda G por digestão enzimática foi pouco utilizada (Gold et al, 1990; Bertollo e Mestriner, 1998; Bertollo et al, 1997; Medrano et al, 1998, Maistro et al, 1999; Wang et al, 2004; Zhuang et al, 2006; Swarça et al, 2006; Portela-Castro et al, Paiva, LRS Introdução Geral 4 2008). Justificando esta lacuna de informações relacionadas à aplicação desta técnica, Medrano et al (1998) apontam que, pelo fato do bandamento G ser dependente da existência de segmentos cromossômicos de conteúdo rico em bases GC e também da dispersão dispersão destas sequências, genomas menos compartimentalizados (GC pobres) como os de vertebrados de sangue frio não possibilitariam bandamento mais resolutivo, diferentemente de vertebrados de sangue quente, que apresentaria seriam ricos em sequências contendo estas bases. Esta hipótese foi sustentada mais fortemente com o trabalho de Bernadi (2005), que relaciona o conteúdo de bases G e C no genoma. Assim, em vertebrados ectotérmicos de mesma ordem, porém presentes em regiões com diferentes temperaturas, diferentes composições de conteúdo GC foram cinstatadas. Esta hipótese foi chamada então de “hipótese da estabilidade termodinâmica”. O presente trabalho traz como proposta a discussão sobre a organização cromossômica em peixes Neotropicais, com a aplicação dos protocolos de bandamento G em diferentes espécies, com cariótipos distintos em forma e tamanho. Para tal, foram recuperadaos protocolos de técnicas de obtenção de preparações cromossômica que pudessem auxiliar na obtenção de melhores células metafásicas para a aplicação da técnica de bandamento. De modo direcionado, foi realizado um estudo de caso utilizando preparações obtidas de machos de tilápia (Oreochromis niloticus – linhagem chitralada) utilizando o bandamento G para avaliação de um heteromorfismo cromossômico no par 1, com implicações na discussão do estabelecimento de heteromorfismo dos cromossomos sexuais do tipo XY. Paiva, LRS Materiais e Métodos 5 Materiais e Métodos Na realização das preparações cromossômicas visando a aplicação dos protocolos de bandamento cromossômico, foram utilizados exemplares de 28 espécies de peixes pertencentes a seis diferentes ordens, sendo elas Astyanax altiparane, A. bockmani, A. fasciatus, A. paranae, Characidium gomesi, C. zebra, Hoplias malabaricus, Piaractus mesopotamicus, Serrapinnus notomelas, Rhamdia sp, Pimelodela sp, Cetorpsorhamdia sp, Imparfinis sp, Hypostomus sp, Gymnotus carapo, G. sylvius, G. inaequilabeatus, G. pantherhinus, Eigeinmania virescens, Eigeimamnia sp, Brachypopomus caudimaculatus, Creniciclha sp, Tilapia rendalli, Oreochromis niloticus, Cichlasoma sp, Synbranchus marmoratus, Rivulus sp e Poecilia sp. Na análise citogenética convencional realizada por métodos diretos e indiretos, foram utilizados procedimentos de estimulação da taxa de mitoses conforme proposto por Oliveira et al, 1988. O protocolo utilizado consiste em preparar uma solução de fermento biológico, diluindo 0,5 g de fermento e 0,5 g de açúcar em 15 ml de água destilada; incubar a solução em uma estufa (37°C) por cerca de 10 minutos e proceder à injeção de alíquota na região dorso-lateral dos exemplares, na proporção de 1 ml por 100 g de peso do animal, que é, então, mantido em aquário em condições normais por cerca de 48 horas. A técnica utilizada para obtenção direta de cromossomos metafásicos seguiu as descrições propostas por Bertollo et al, 1979 e Foresti et al. (1981). Essa metodologia envolve basicamente a inibição da polimerização dos microtúbulos pela colchicina, a hipotonização das células em suspensão e a fixação celular pela mistura de metanol/ácido acético. Consiste em injetar na região intra-abdominal dos animais, solução aquosa de colchicina (0,01%) 1 ml / 100 g de peso do animal, que deve ser mantido em aquário Paiva, LRS Materiais e Métodos 6 aerado por um período de 30 minutos. Para iniciar o procedimento de coleta de tecidos, os exemplares foram anestesiados em solução de benzocaína (metilmetanosulfonato) 0,01 % (Gontijo et al, 2003) até a cessação de movimentos operculares. Após a dissecção, fragmentos de tecido da porção anterior do rim são transferidos para uma placa de Petri contendo 6 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M) e dissociados com o auxílio de pinças de dissecção até a obtenção de uma solução homogênea. Transferir a suspensão obtida para um tubo de centrífuga de fundo cônico e manter em estufa a 37°C por 21 min. Para fixação das células, adicionar 10 gotas de fixador (metanol e ácido acético/ 3:1) mantido à temperatura ambiente e homogeneizar com pipeta Pasteur. Deixar descansar por 5 minutos e em seguida completar com fixador para o volume de 15ml, homogeneizar novamente e centrifugar por 10 min a 900 rpm. Descartar o sobrenadante, ressuspender o precipitado em 10 ml de fixador, centrifugar novamente por 10 minutos a 900 rpm, descartar o sobrenadante e ressuspender em 1ml de fixador, para obtenção da suspensão final. Proceder ao preparao das lâminas. Para a obtenção de preparações cromossômicas pelo método indireto, foram utilizados os procedimentos propostos por Foresti et al (1993) e Noleto et al (2007), que consistem em anestesiar os exemplares em solução de benzocaína (metilmetanosulfonato) 0,01 % (Gontijo et al, 2003) até a cessação de movimentos operculares, dissecar o animal e transferir os fragmentos de tecidos da porção anterior do rim para uma placa de Petri contendo 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 ou 199 Earle). Adicionar 40μ l de solução de colchicina 0,01%, dissociar o tecido e homogeneizar a solução com auxílio de pinças e seringa de vidro de 10ml, transferir para um tubo de centrífuga de fundo cônico de 15ml. Manter em estufa a 37°C por 35 minutos, centrifugar a 900rpm por 10minutos, descartar o sobrenadante e adicionar 10ml de solução KCl (0,075M) e manter em estufa a 37°C por 21 minutos. Para fixação adicionar 10 gotas de fixador (metanol e ácido acético/ 3:1) mantido Paiva, LRS Materiais e Métodos 7 à temperatura ambiente e homogeneizar com pipeta Pasteur. Deixar descansar por 5 minutos e, em seguida completar com fixador para o volume de 15ml; homogeneizar novamente e centrifugar por 10 min a 900 rpm. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 10 ml de fixador, centrifugar novamente por 10 minutos a 900 rpm, descartar o sobrenadante e ressuspender em 1ml de fixador, para obtenção da suspensão final. Proceder ao preparo das lâminas. A obtenção de cultura celular de linfócitos foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Fenocchio et al (1991) e Fugiwara et al, (2001). Nenhum exemplar foi sacrificado. Para proceder à coleta de sangue, os exemplares foram previamente anestesiados em benzocaína (metilmetanosulfato – MMS), segundo Gontijo et al. (2003). Foram utilizadas seringas heparinizadas (heparina sódica de 5000 U.I/ml – Blausiegel) de 5 ml (BD , Injex e SR) e agulhas 25X0,7 mm para punção cardíaca. O sangue coletado pode ser mantido refrigerado à temperatura de 40C a 80C por até três dias. Os meios de cultura utilizados continham 5ml de meio 199 Early com L-glutamina, 1ml de soro fetal bovino, 200μ l de fitohemaglutinina e 20μ l de antibiótico/antimicótico. Foram mantidos em estufa B.O.D. (Demanda Bioquimica de Oxigênio) por 96 horas a 270C. Após este período, adicionar 40μ l de solução de colchicina 0,01% e homogeneizar a solução com auxílio de pipeta Pasteur, mantendo em estufa B.O.D. a 27°C por 35 minutos. Em seguida, centrifugar a 900rpm por 10minutos, descartar o sobrenadante, adicionar 10ml de solução KCl (0,075M) e manter em estufa a 27°C por 35 minutos. Para fixação, adicionar 10 gotas de fixador (metanol e ácido acético/ 3:1) mantido à temperatura ambiente e homogeneizar com uma Pasteur. Deixar descansar por 5 minutos e, em seguida completar com fixador para o volume de 15ml, homogeneizar novamente e centrifugar por 10 min a 900 rpm. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 10 ml de fixador, centrifugar Paiva, LRS Materiais e Métodos 8 novamente por 10 minutos a 900 rpm, descartar o sobrenadante e ressuspender em 1ml de fixador. Proceder ao preparo das lâminas. As preparações cromossômicas convencionais foram analisadas em fotomicroscópio óptico (Olympus BX61) e as melhores metáfases foram capturadas com software Image Pro Plus, 6.0 (MediaCybernetics). Para as correções de captura das imagens e montagem dos cariótipos foi utilizado o software BandView –Applied Spectral Imagim. Os cromossomos foram recortados usando o software Adobe Photoshop versão 11.0 - Adobe System e organizados em pares de homólogos, sendo classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), com base no trabalho de Nirchio e Oliveira (2006) e organizados em classes, em ordem decrescente de tamanho para a montagem dos cariótipos. Paiva, LRS Resultados 9 Resultados Gerais O presente trabalho foi realizado visando a um melhor entendimento da composição e organização estrutural do material genômico em cromossomos de peixes ósseos neotropicais, com o desenvolvimento e aplicação de técnicas resolutivas para a obtenção de cromossomos mitóticos e de bandamento G. O item Resultados foi organizado em cinco capítulos, redigidos na forma de manuscritos de trabalhos, contendo resumo, introdução atualizada referente ao assunto específico, materiais e métodos utilizados, relacionando possíveis modificações realizadas nas técnicas, resultados sumarizados e discussão abrangente, compreendendo o assunto abordado, propostas e análises, bem como a apresentação de hipóteses sobre o estudo, em peixes e demais vertebrados. Capítulo 1 - Melhoramento técnico em preparações citogenéticas diretas para peixes de água doce Apresenta como proposta associar conhecimentos já descritos na literatura para obtenção de cromossomos mitóticos, comparados aos protocolos utilizados no nosso laboratório, visando à melhoria das preparações citogenéticas. Um dos objetivos buscado foi o de possibilitar a utilização de menos exemplares nas análises e, ao mesmo tempo, procurando obter melhor qualidade nas preparações. Paiva, LRS Resultados 10 Capítulo 2 - Cultura celular de sangue periférico para obtenção de cromossomos metafásicos em peixes ósseos neotropicais e aplicação de bandamento G Tem sido verificado que a obtenção de preparações cromossômicas para análises citogenéticas a partir de culturas de células tem resultado em boa quantidade de metáfases de boa qualidade, com os cromossomos geralmente distendidos e homogêneos. Dessa forma, o trabalho buscou identificar fatores envolvidos na obtenção de boas preparações cromossômicas por cultura celular de sangue periférico. O trabalho aborda também a utilização dos exemplares sem necessidade de seu sacrifício, uma vez que é possível a coleta do sangue por diferentes modos, seja por punção cardíaca ou da artéria caudal, de modo a minimizar os efeitos de manipulação dos exemplares. A obtenção de amostras utilizando tais critérios resultou em preparações adequadas à aplicação do bandamento G de forma repetitiva. Capítulo 3 - Bandamento G em Cromossomos de Peixes A obtenção de bandamento G em cromossomos de peixes é ainda constitui objeto de discussão, principalmente quanto à possibilidade efetiva de bandamento G em cromossomos de vertebrados de sangue-frio e se a reprodução dos resultados pode ser realizada de forma consistente. Neste sentido, foram aplicados protocolos de bandamento G em preparações cromossômicas de espécies de peixes Neotropicais pertencentes a quatro ordens, Characiformes, Siluriformes, Perciformes e Gymnotiformes, buscando resultados relacionados ao padrão das bandas e sua repetitividade com os tratamentos. Os resultados obtidos permitiram o reconhecimento específico dos cromossomos nos cariótipos, podendo ser aplicada também na identificação de rearranjos cromossômicos ocorridos. Paiva, LRS Resultados 11 Capítulo 5 - Caracterização Cromossômica de Pterodoras granulosus (Valenciennes, 1821), (Pisces, Siluriforme, Doradidae) e Bandamento G-11 Primeira Descrição Para Peixes A aplicação das técnicas de bandamento cromossômico pode proporcionar uma visão mais realista da estrutura e composição destes compartimentos genômicos, facilitando a interpretação das suas particularidades cariotípicas e o entendimento dos processos evolutivos envolvidos nas modificações morfológicas e numéricas destes elementos, que ocorrem nos organismos. Com o objetivo de identificar precisamente as regiões heteromórficas aparentes existentes nos pares 14 e 16 de cromossomos de Pterodoras granulosus, foi utilizada a técnica de bandamento G-11, específica para identificação de regiões ricas em heterocromatina. Os resultados obtidos permitiram evidenciar as alterações nestes cromossomos. Paiva,LRS Capítulo 1 12 Capítulo 1 - Melhoramento técnico de preparações citogenéticas diretas de peixes de água doce Resumo A obtenção de preparações cromossômicas numerosas e de boa qualidade são elementos essenciais nos trabalhos em citogenética, que devem possibilitar tanto a identificação morfológica e composição dos segmentos cromossômicos, como a aplicação de diferentes técnicas de bandamento, que permitam a identificação da sua estrutura e das alterações decorrentes de processo fisiológicos ou evolutivos. A proposição inicial das mudanças de metodologia para obtenção de grande número de células metáfásicas, com boa individualização dos cromossomos em peixes teve inicialmente por base a utilização de suspensões celulares, embora ainda sem aplicação da hipotonização celular. Esta modificação metodológica foi acrescentada posteriormente, associada a processos de fixação adequada do material, proporcinando melhor qualidade para as metáfases obtidas, constituindo a base da metodologia atualmente empregada. A aplicação da técnica de obtenção de cromossomos mitóticos in vivo em peixes Neotropicais proporcionou o grande desenvolvimento da citogenética por possibilitarem a obtenção de metáfases com formas cromossômicas preservadas e facilmente distinguíveis. Além disso, constantes modificações nos protocolos atuaram de modo a identificar material tissular adequado, a adequar a concentração do inibidor mitótico, a proceder adequada hipotonização das células e a fixar o material citogenético obtido. A dinâmica do processo investigativo nesta área levou também a utilizar células do tecido sanguíneo, proceder preparações in vitro de modo indireto, e até em condições de coleta de tecido “post morten” utilizando meio RPMI 1640 ou solução salina balanceada de Hank’s, como base para aplicação e manutenção da colchicina. Paiva,LRS Capítulo 1 13 O presente trabalho teve como objetivo identificar as implementações ocorridas nos protocolos das técnicas utilizadas em citogenética desenvolvidas nos últimos 40 anos, principalmente relacionadas aos peixes, visando estabelecer uma relação da metodologia de obtenção de preparações cromossômicas com vistas à aplicação de técnicas de bandamentos mais resolutivos, como o bandamento G. Assim, o trabalho buscou relacionar informações sobre a qualidade dos cromossomos e à quantidade de células mitótica disponíveis nas preparações. Introdução O uso das técnicas de bandamento cromossômico em cromossomos de peixes é ainda restrito e frequentemente não fornece resultados que permitem uma distinção efetiva de todos os cromossomos do cariótipo. Um grande salto de qualidade para o estudo cromossômico nos componentes deste grupo foi dado a partir da década de 60, principalmente após a publicação do trabalho de Mcphail e Jones (1966) que desenvolveram a técnica de suspensão celular para obtenção de cromossomos mitóticos em peixes. Stewart e Levin (1968) afirmaram que a aplicação da técnica proposta apresentava algumas desvantagens, como a difícil visualização dos cromossomos, possível somente em contraste-de-fase, e à conservação do material, que deveria ser mantido armazenado em baixas temperaturas. Assim, foi proposto que o material deveria ser fixado em metanol/ácido acético e corado com Giemsa. Kligerman e Bloom (1976) descreveram um método para a obtenção de cromossomos mitóticos diferente dos propostos anteriormente, empregando pela primeira vez com eficiência a solução hipotônica (KCl) para melhorar a dispersão dos cromossomos. Paiva,LRS Capítulo 1 14 No Brasil, Bertollo et al. (1978) e Foresti et al. (1981, 1993) adaptaram protocolos existentes e propuseram metodologias para obtenção de cromossomos mitóticos em peixes que, por resultarem na presentação de melhores resultados são empregadas rotineiramente até o presente. A utilização das técnicas descritas por estes autores permitiram a realização de numerosos trabalhos de citotaxonomia em peixes neotropicais. Atualmente, são conhecidos os números diplóides e/ou haplóides de 706 espécies distribuídas em 207 gêneros e 38 famílias, o que representa aproximadamente 22% das espécies identificadas para a região Neotropical (Almeida-Toledo et al, 2000, Oliveira et al, 2002, Nirchio e Oliveira, 2006). Segundo Almeida-Toledo et al (2000), esta região se caracteriza por uma extraordinária variabilidade quanto ao número e fórmula cromossômica em peixes. Há grupos com grande variação nos números diplóides, que apresentam valores extremos de 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis a 2n=134 em Corydoras aeneus, além da presença de cromossomos supranumerários em muitas espécies de peixes. Há também grupos com pouca variação no número diplóide, denominados como conservados devido a este fato, que incluem representantes das famílias Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidade, além de alguns Characidae, todos com 54 cromossomos. Outras variações envolvem a ocorrência de poliploidia (Rhamdia quelen – Tsuda et al, 2010), híbridos naturais (Colossoma – Almeida-Toledo et al, 1987) e polimorfismos extensivos nos segmentos das regiões organizadoras de nucléolos (Foresti et al., 1981). Entretanto, após cerca de 40 anos desde o início dos estudos sistematizados de citogenética de peixes, ainda há poucas referências expondo bandamentos cromossômicos resolutivos em espécies deste grupo, podendo ser citados os trabalhos de Bertollo et al., 1997; Maistro et al., 1999; Maistro et al., 2000; Almeida- Toledo et al., 2000; Vicente et al., 2003 e Carvalho e Dias, 2005, Portela-Castro et al, 2007). Tais resultados se tornam explicativos principalmente quando submetidos à Paiva,LRS Capítulo 1 15 comparação comaqueles existente para mamíferos em que rotineiramente se utilizam bandamentos dos tipos G e R (Verma e Babu, 1995). A técnica mais empregada para obtenção de preparações cromossômicas em peixe Neotropicais tem sido a preparação direta, que tem por base a injeção prévia de solução de colchicina nos exemplares vivos e utiliza os tecidos da porção anterior do rim para peixes ósseos e de baço para peixes cartilaginosos. Vários trabalhos demonstraram também a possibilidade de obtenção de preparações cromossômicas de peixes a partir de culturas de linfócitos (Fenocchio and Bertolo,1978; Fujiwara et al, 2001), de sangue periférico total (Ojima, 1978), e de fibroblastos (Amemiya and Gold, 1984). Entretanto, dois fatores principais restringem a utilização destas metodologias na rotina laboratorial: 1) as técnicas de obtenção cromossômica a partir de linfoblastos, seja sangue periférico total ou linfócitos, exigem uma quantidade significativa de sangue, o que inviabiliza sua utilização em exemplares de peixes de menor porte; 2) é necessário um ambiente estéril e isolado para a rotina de implantação de cultura celular, com a finalidade de reduzir as chances de contaminação. Para a análise do resultado das preparações cromossômicas são realizadas a cariotipagem e aplicadas as técnicas de bandamento, que incluem bandamento C, marcação das regiões organizadoras nucleolares pelo nitrato de Prata (Ag-RON), coloração com cromomicina A3 (CMA3) e, mais recentemente, o mapeamento cromossômico de segmentos genômicos específicos como DNAr 45S, 5S e histonas (Alves et al, 2010; Teruel et al, 2010). Nas preparações cromossômicas, a qualidade e quantidade das metáfases nas lâminas são de extrema importância para as análises citogenéticas. A melhoria nas preparações cromossômicas obtidas diminui a necessidade de coletas subsequentes e sacríficio excessivo de exemplares. Mas estas melhorias técnicas só foram possíveis graças a trabalhos desenvolvidos com o objetivo de melhorar as preparações Paiva,LRS Capítulo 1 16 citogenéticas, como o de Kligerman e Bloom (1977), Bertollo et al. (1979), Foresti et al. (1981, 1993), Oliveira et al. (1988) e Neto et al. (2007), entre outros. No presente trabalho, buscou-se utilizar as informações disponíveis e testar sua aplicabilidade para melhorar a qualidade das preparações citogenéticas em peixes de água doce. Materiais e Métodos Foram utilizados exemplares pertencentes a seis ordens de peixes ósseos Neotropicais, coletados em diferentes expedições realizadas ao longo de um ano (Tabela 1). Os exemplares variaram em tamanho de 3 a 35 cm e foram mantidos em aquários aerados com água do local de coleta. Com o intuito de aumentar o número de células em divisão, os peixes com escamas foram submetidos à descamação de uma porção da região dorsal ou no pedúnculo caudal de um lado do corpo, permitindo identificação futura, se necessário. Os peixes de couro (Siluriformes) foram lesionados com auxílio de uma agulha de insulina (0,3x13 mm) na mesma região dorsal, em apenas um dos lados. Todos os exemplares analisados no presente trabalho foram injetados com uma solução de levedura (fermento biológico:açúcar:água – 1:2:3), segundo protocolo de Oliveira et al (1988). Após 48 a 72 horas, os exemplares foram anestesiados em solução de benzocaína (metilmetanosulfonato) 0,01 % (Gontijo et al, 2003) até a cessação de movimentos operculares. Em seguida, a porção anterior do rim foi extraída e colocada em placas de Petri contendo 10 ml de meio RPMI 1640 ou 199 (Earle) (GIBCO, Cultilab e Nutricell) a 370C. Paiva,LRS Capítulo 1 17 Tabela 1 – Espécies de peixes usadas para a obtenção de preparações cromossômicas. Ordem Espécies analisadas Characiformes Astyanax altiparane, A. bockmani, A. fasciatus, A. paranae, Characidium gomesi, C. zebra, Hoplias malabaricus, Piaractus mesopotamicus Siluriformes Rhamdia sp, Pimelodela sp, Cetorpsorhamdia sp, Imparfinis sp, Hypostomus sp Gymnotiformes Gymnotus carapo, G. sylvius, G. inaequilabeatus, G. pantherhinus, Eigeinmania virescens, Eigeimamnia sp, Brachyhypopomus caudimaculatus Perciformes Creniciclha sp, Tilapia rendalli, Cichlasoma sp Synbranchyformes Synbranchus marmoratus Cyprinidontiformes Rivulus sp, Poecilia sp O tecido foi dissociado com auxílio de pinças e seringa de vidro, o sobrenadante foi transferido para tubos de centrífuga de fundo cônico (15 ml, de vidro) e foram adicionados 40 μ l de colchicina 0,01%. A solução foi então homogeneizada e mantida em estufa a 370C por 30 a 50 minutos, dependendo da espécie. Após este período, o tubo foi centrifugado a 9000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 10 ml de solução hipotônica (KCl 0,075M). O material foi homogeneizado e mantido em estufa a 370C por 21 minutos, após os quais foram então adicionadas dez gotas de fixador (3:1 metanol: ácido acético) e o material foi novamente homogeneizado de maneira suave com o auxílio de pipeta Pasteur (pré-fixação). Após 5 minutos, o volume foi completado com fixador para 15 ml, o material foi ressuspendido com pipeta Pasteur de forma vigorosa, Paiva,LRS Capítulo 1 18 porém evitando turbilhões e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi descartado, 10 ml de fixador foram adicionados e repetiu-se o passo anterior. O tubo foi fechado com parafilme e mantido a -40C overnight. No dia seguinte, foi repetida a lavagem com fixador novo, o sobrenadante foi descartado e foram preparadas lâminas para observaçõ da qualidade da suspensão. Para melhor conservação, o material foi mantido em metanol em geladeira (4ºC). As lâminas usadas para a confecção de preparações cromossômicas foram lavadas com sabão neutro, enxaguadas várias vezes com água destilada, mergulhadas rapidamente em álcool etílico 95% e secas ao ar. A lâmina seca era colocada sobre um suporte (placa de Petri) em um banho-maria a 550C, sem contato direto com a água (Figura 1), permitindo que o vapor formasse uma fina camada de água sobre a lâmina. Então, cerca de 20 μl da preparação cromossômica eram pingados sobre a lâmina com auxílio de micropipeta e, para diminuir a pressão sobre as células, cerca de 4 mm da ponta da ponteira eram retirados com auxílio de uma tesoura (Figura 1). A lâmina era retirada do banho-maria, seca ao ar e corada com Giemsa 2% por 7 minutos. Figura 1 – Representação de elementos da metodologia usada para pingar preparações cromossômicas em lâminas: a) micropipeta; b) material em tubo de 2ml; c) banho-maria com placa de Petri e lâmina. a) b) c) Paiva,LRS Capítulo 1 19 Resultados e Discussão Todas as etapas testadas e descritas no item anterior, desde a manutenção dos peixes até o pingar do material na lâmina, mostraram-se cruciais para a obtenção de preparações cromossômicas de boa qualidade. Foi possível observar que o armazenamento dos peixes em aquários maiores, com um número reduzido de indivíduos por aquário e a utilização de água do próprio local de coleta fez com que os indivíduos respondessem melhor ao estímulo por injeção de levedura. Uma vez que esta injeção estimula o sistema imune, indivíduos saudáveis produziram uma melhor resposta. É importante observar que sem este estímulo havia a necessidade de analisar um número maior de indivíduos para a obtenção de resultados semelhantes para análise. O estímulo com a injeção de levedura aumentou significantemente a quantidade de células metafásicas, melhorando as preparações cromossômicas e diminuindo significativamente o número de exemplares sacrificados e o número de expedições de coletas. Segundo Gontijo et al (2003), a solução de benzocaína não altera a estrutura do DNA, pois este não interage com o metilmetanosulfonato. Assim, após o período de 48 horas (somente S. marmoratus permaneceu por 72 horas para melhor resposta imune), os exemplares foram anestesiados para posterior sacrifício. É importante ressaltar que o período de estímulo completo deve ser respeitado porque com tempo inferior de incubação, poucas metáfases são obtidas e, com tempo superior, a maioria das células em divisão já está em estágios pós-metafásicos, como anáfase e telófase, conforme apontado por Kasahara (2009). Os trabalhos relacionados à obtenção cromossômica citados na introdução deste trabalho (Mcphail e Jones, 1966, Stewart e Levin, 1968, Kligerman e Bloom, 1976, Bertollo et al., 1978, e Foresti et al., 1981, 1993, Neto et al, 2007) descrevem a utilização Paiva,LRS Capítulo 1 20 de colchicina a 0,05%, 0,025%, 0,017% para injeção peritoneal tanto para as preparações diretas quanto “in vitro”. No presente trabalho, a concentração utilizada foi de 0,01% de colchicina (Sigma), que forneceu uma quantidade excelente de metáfases, com cromossomos adequadamente distendidos e morfologia mais definida quando o protocolo foi utilizado nas preparações in vitro. Também foram realizados testes com Colcemid (KaryoMax, Invitrogen), com a qual não obtivemos resultados satisfatórios. As preparações in vitro permitiram que um maior número de células entrassem em contato com o agente inibidor do fuso (colchicina), resultando num maior número de células metafásicas, diferentemente da técnica in vivo já estabelecida. A injeção intra- peritonial de colchicina muitas vezes leva à morte do indivíduo. Além disto, existe o risco da injeção da solução atingir algum órgão que não permita a circulação da colchicina, comprometendo todo o trabalho, gerando dúvidas sobre o motivo do insucesso. Com as células imersas e dissociadas em meio de cultura, a colchicina pode agir de forma mais homogênea em um maior número de células, permitindo um controle maior do tempo de exposição. A hipotonização foi realizada com solução de KCl 0,075M por tempo aproximado de 50 minutos a 37ºC, sendo seguida por pré-fixação das células com fixador à temperatura ambiente, para evitar choque térmico. Assim, com hipotonização e fixaão adequadas,as células não se apresentaram fragilizadas ao serem pingadas sobre a lâmina. A fixação por longo período (overnight) permitiu reduzir o número de lavagens sem a perda de qualidade do material fixado. Isto é importante principalmente quando se trabalha com peixes pequenos, uma vez que evita a perda do material, que já é reduzido. A manutenção de suspensões celulares em fixador por longos períodos geralmente leva à perda da qualidade das preparações cromossômicas. Este fato é frequentemente relatado por citogeneticistas que observam que o material estocado não apresenta Paiva,LRS Capítulo 1 21 metáfases de boa qualidade e que a quantidade destas diminui em relação ao material recém-preparado. Por este motivo recomendamos o armazenamento das preparações cromossômicas em metanol puro, o que garante melhor conservação, uma vez que o contato com o ácido acético por longos períodos pode resultar na degradação do DNA das amostras (Barnett et al, 1980). Antes da utilização do material após a sua estocagem, deve- se ressuspendê-lo em fixador novo e prosseguir com a confecção das lâminas. Outro fator essencial para a obtenção de bons resultados na confecção das lâminas com preparações cromossômicas é ter o material bem espalhado, com cromossomos esticados, sem sobreposições e propícios a aplicação de técnicas de bandamento cromossômico. O material citogenético gotejado em câmara úmida permite maior uniformidade no espalhamento das células, posterior secagem e envelhecimento. Segundo Barch et al (1997), a distribuição do material nas lâmina deve ser uniforme para que não haja diferença na morfologia dos cromossomos da “borda” e do interior da metáfase. Estes autores descreveram que o material pingado em lâmina seca não permite uma secagem uniforme dos cromossomos, levando à formação de cromossomos escuros e brilhantes quando observados em contraste de fase. Considera-se, pois, que estes cromossomos não sofreriam ação uniforme dos reagentes na realização de bandamentos cromossômicos, inviabilizando sua utilização. Sugeriram que o controle da umidade e temperatura ao se proceder o gotejamento do material em câmara úmida (controlada) permitiria uma maior uniformidade das metáfases e das preparações cromossômicas. Outro fator reportado por Barch et al (1997) que interfere na qualidade dos resultados é o tempo de envelhecimento das preparações cromossômicas antes da aplicação dos protocolos de bandamento cromossômico. O material novo é muito suscetível à ação de qualquer reagente usado para produzir padrões de bandamento cromossômico; por outro lado, quando envelhecido, não se apresenta mais adequado ao bandamento. Neste sentido, Paiva,LRS Capítulo 1 22 resultados interessantes Por exemplo, o bandamento C forneceu em nosso laboratório excelentes resultados após o envelhecimento do material pingado em lâmina por dois dias à temperatura ambiente (cerca de 25 a 300C). Com menos tempo de envelhecimento as bandas ficam claras, com aspecto de corrosão e, com mais tempo, parece não haver ação eficaz dos reagentes usados (dados não apresentados). Em conclusão, a aplicação das condições apresentadas resultou na melhoria qualitativa das preparaões cromossômicas quanto ao espalhamento, grau de condensação e morfologia dos cromossomos em diferentes espécies de peixes pertencentes às ordens Gymnotiformes, Symbranchyformes, Perciformes, Siluriformes e Characiformes. Com exceção desta última ordem, para a qual foram obtidos bons resultados com as técnicas previamente utilizadas, também observamos um aumento no número e na qualidade das metáfases nas preparações das espécies de todas as outras ordens amostradas (Figura 2). Deve ser ressaltado, finalmente, que a qualidade das preparações citogenéticas depende de muitos fatores, entre os quais a procedência e qualidade dos reagentes usados, com melhora expressiva quando são usadas soluções recém-preparadas; do tempo de armazenamento das preparações, dos procedimentos utilizados na confecção das lâminas e, não menos importante, do preparo, conhecimento e experiência do citogeneticista. Paiva,LRS Capítulo 1 23 Figura 2 - Metáfases de espécies representativas de quatro ordens de peixes Neotropicais obtidas a partir de culturas de linfócitos de: (a) Astyanax sp; b) Symbranchus marmoratus; c) Hoplias malabaricus; d) Gymnotus sp; e) Cichlasoma sp; f) Hypostomus sp. Paiva,LRS Capítulo 1 24 Referências Almeida-Toledo L.F.; Bernardino G.; Oliveira C.; Foresti F.; Toledo-Filho S.A. 1996. Gynogenetic fish produced by a backcross involving a male hybrid (female Colossoma macropomum x male Piaractus mesopotamicus) and a female Piaractus mesopotamicus. Bol. Téc. CEPTA, 9:31-37. Almeida-Toledo, L.F., Foresti, F. and Toledo-Filho, S.A. (2000) Karyotipic evolution in Neotropical freshwater fish – Chromosoma Today – vol. 13: 169-182. Alves JCP., Paiva LRS., Oliveira C., Foresti F. (2010) Interspecific chromosomal divergences in the genus Characidium (Teleostei: Characiformes: Crenuchidae). Neotropical Ichthyology, 8(1):77-86. Amemiya C.T., Bickham j.W., Gold J.R. (1984) A Cell Culture Technique for Chromosome Preparation in Cyprinid Fishes. Copeia, Vol. 1984, No. 1 pp. 232-235. Barch M.J. (Editor), Knutsen T. (Editor), Spurbeck J. (Editor). (1997) The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. Softcover, Spiral Bound 688 pages. 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Com o objetivo de melhorar qualitativamente e quantitativamente a análise citogenética de peixes, foi estabelecido um protocolo de obtenção cromossômica a partir de sangue periférico em peixes Neotropicais ósseos. Esta técnica possibilita utilizar exemplares sem a necessidade de sacrificá-los e resulta em preparações cromossômicas mais uniformes e de qualidade. Com uma pequena quantidade de sangue, cerca de 200μl, foi possível obter excelentes preparações citogenéticas, inclusive em exemplares de pequeno porte, como as apresentadas neste trabalho, no qual utilizamos como modelo Oreochromis niloticus linhagem chitralada. Palavras-chave: cultura celular, sangue, citogenética, cromossomo e bandamento G Paiva, LRS Capítulo 2 28 Introdução Nos últimos 15 anos, a metodologia utilizada na análise citogenética de peixes sofreu grandes modificações e avanços, passando a incluir a técnica de hibridação “in situ” fluorescente (FISH) e suas variantes. Enquanto as técnicas de análise cromossômica convencionais permitiam uma abordagem mais relacionada a variações numéricas e estruturais, a produção de sondas para segmentos cromossômicos específicos e sua hibridação nos cromossomos metafásicos possibilitou mapear genes, caracterizar a estrutura cromossômica e determinar o papel de diferentes seqüências na organização genômica dos mais diversos organismos, tanto animais quanto vegetais. Devido ao tamanho diminuto dos cromossomos em certas espécies de plantas, o mapeamento cromossômico com sondas de DNA tornou-se imprescindível, possibilitando identificar espécies antes consideradas crípticas e identificar linhagens de interesse econômico dentro de uma mesma espécie (Lagercrantz, 1998; Paterson et al, 2000; Gao et al, 2009, Figueroa et al, 2010). O mesmo vem acontecendo com grupos de animais com cromossomos pouco distinguíveis quanto ao tamanho e forma, como as abelhas (Meznar et al, 2010), o galo doméstico, que possui microcromossomos (Krasikova et al, 2010), a tilápia (Lee et al, 2010) e pequenos peixes como Characidium (Alves et al, 2010), dentre outros. Em peixes, os genes mais estudados com o uso da técnica de FISH são representantes de famílias de moderada repetitividade no genoma, como DNAr 5S e 45S, utilisados na maioria dos trabalhos recentes. Sua utilização já é considerada uma rotina estabelecida nesta área e é fundamental na maior parte dos trabalhos que utilizam peixes como modelos, tanto em estudos ecológicos populacionais, como de dispersão gênica, organização no genoma ou ainda para a análise de novas classes de DNAr (Martins et al, 2006; Noleto et al, 2007; Alves et al, 2010). Mais recentemente, o mapeamento com Paiva, LRS Capítulo 2 29 sondas de histonas tem ampliado os conhecimentos relacionados à organização genômica em insetos (Cabrero et al, 2009; Teruel et al, 2010, Hashimoto et al, 2011). O mapeamento cromossômico ainda é dificultado em peixes por problemas relacionados ao tamanho, semelhança e elevado número de cromossomos que caracterizam o cariótipo de grande numero de representantes deste grupo de organismos, conforme constatado em representantes das famílias Paradontidae, Curimatidae e Prochilodontidae. A cultura celular possibilita a obtenção de cromossomos longos e com morfologia distinta, com muitas metáfases de boa qualidade, enquanto preparações diretas (in vivo) têm limitações quanto a estes mesmos aspectos (Capítulo 1). As preparações cromossômicas obtidas através de cultura celular também apresentam a vantagem de fornecer melhores resultados após a aplicação das técnicas de bandamento cromossômico clássico e de FISH, resultando na identificação mais precisa dos cromossomos. Embora em número pouco expressivo, alguns trabalhos realizados na área da citogenética de peixes utilizaram protocolos de técnicas de obtenção de preparações cromossômicas com base na cultura de linfócitos (Fenocchio e Bertollo, 1988; Fugiwara et al, 2001; Eyo, 2005), cultura de tecido por curto período (Fenocchio et al, 1991) e cultura de fibroblastos (Amemya, 1984; Komura et al, 1988; Zhang et al, 1998). Entretanto, estas técnicas ainda são pouco utilizadas para estudos mais amplos, relacionados a aspectos ecológicos, populacionais e citosistemáticos. Neste trabalho procuramos adaptar protocolos existentes da técnica de cultura de linfócitos de peixes com o intuito de formular uma metodologia eficiente e adequada à obtenção de preparações cromossômicas com maior número de metáfases e com cromossomos alongados, de modo a permitir a utilização de exemplares de pequeno porte (com cerca de dez centímetros) e sem a necessidade de sacrifício ou de injeção de estimulantes mitóticos. Paiva, LRS Capítulo 2 30 Materiais e Métodos Para estabelecer a técnica de obtenção de cromossomos mitóticos por cultura de sangue periférico total, utilizamos como modelo a linhagem chitralada da tilápia Oreochromis niloticus. Os exemplares foram cedidos pelo Prof. Dr. Edgar Teixeira (Departamento de Zootecnia, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais). As culturas celulares foram realizadas no Laboratório de Citogenética Evolutiva do Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais. Foram utilizados 12 exemplares de O. niloticus mantidos em tanques aerados. Nenhum exemplar foi sacrificado. Para proceder à coleta de sangue, os exemplares foram previamente anestesiados em benzocaína (metilmetanosulfato – MMS), segundo Gontijo et al. (2003). Foram utilizadas seringas heparinizadas (heparina sódica de 5000 U.I/ml – Blausiegel) de 5 ml (BD , Injex e SR) e agulhas 25X0,7 mm para punção cardíaca. O sangue retirado dos exemplares foi mantido refrigerado entre 40C a 80C por até três dias. O meio de cultura completo era constituído de 5ml de meio de cultura RPMI 1640 com L-glutamina (Gibco; Embriolife; Cultilab; Nutricell) ou 199(Earle) com L-glutamina (Cultilab; Nutricell), 1 ml de soro fetal bovino (Embriolife; Cultilab; Nutricell), 20 μ l de solução de antimicótico/antibiótico 100X (Sigma) e 50 μ l a 300 μ l de fitohemaglutinina forma M (Gibco; Cultilab). O pH do plasma sanguíneo de um exemplar por espécie foi medido com tiras indicadoras de pH 0-14 (Merck), resultando em uma média de 8 a 8,5. O pH do meio de cultura foi ajustado para 8 com NaOH 1M. Para a semeadura foram adicionados de 100 μ l a 200 μ l de sangue periférico total (Tabela 1). Paiva, LRS Capítulo 2 31 Tabela 1 – Concentração de fitohemaglutinina (PHA), tipo e marca de meio de cultura e tempo de incubação usados nos experimetos. Legenda: 0 = sem resultado; 1= poucas metáfases (menos de três por lâmina); 2= quantidade insuficiente e qualidade ruim (cerca de dez metáfases por lâmina); 3= quantidade ótima de metáfases com qualidade irregular(cerca de 40 metáfases por lâmina); 4= quantidade ótima para análise (cerca 100 metáfases por lâmina); 5= quantidade elevada de metáfases com erros (aneuplóides ou poliploides). As células foram cultivadas em tubos estéreis de centrífuga de fundo cônico de 15 ml (Techno Plastic Products) mantidos em estufa incubadora B.O.D. (demanda bioquimica de oxigênio) de 72 a 144 horas (três a seis dias) a 270C. Os tubos permaneceram inclinados (450 em relação à base) e sem agitação (Figura 1). Os tempos de cultura testados estão indicados na Tabela 1. Todos os testes foram realizados duas ou três vezes. Após o período de incubação, foram adicionados 40 μl de colchicina 0,01% (Sigma) pelo período de 35 minutos. O material foi centrifugado por 10 minutos a 900 r.p.m.. O sobrenadante foi descartado e o material foi ressuspendido em 5 ml de solução hipotônica 0,075 M e mantido em estufa a 270C por 35 minutos. Foi realizada então a pré- fixação (fixador 3:1 ácido acético:metanol), na qual eram adicionadas 10 gotas de fixador à Amostras Concentração de Fitohemaglutini na Meio RPMI 1640 Meio 199 (Earle) Horas de Crescimento (72, 96, 120 e 144 horas pós semear, para cada meio) Gibco Cultilab Embriolife Nutricell Cultilab Nutricell 1 – 50 μ l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 - 100 μ l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 – 150 μ l 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 2 2 0 1 1 1 4 – 200 μ l 1 2 2 3 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 2 4 5 1 2 4 5 5 – 250 μ l 1 1 3 3 0 1 2 3 0 1 3 3 0 1 1 1 1 1 3 5 1 1 2 5 6 – 300 μ l 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 Paiva, LRS Capítulo 2 32 Figura 1 – Representação esquemática de uma estufa B.O.D. e a posição do tubo de centrifugação de fundo cônico. temperatura ambiente e o material era homogeneizado gentilmente com pipeta Pasteur. Após 5 minutos, foi adicionado fixador até o volume de 15 ml e o material foi resssupendido gentilmente com pipeta Pasteur por cerca de 50 vezes. O material foi centrifugado a 900 r.p.m por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e repetiu-se sua ressuspensão em 10 ml de fixador, pipetando gentilmente cerca de 50 vezes. O tubo foi vedado e mantido a -200C “overnight”. Após este período, o material foi retirado do freezer, ressuspendido e centrifugado a 900 r.p.m. por 10 minutos. Quando o pellet não estava totalmente branco, a lavagem com fixador era repetida. O sobrenadante era descartado e o material ressuspendido em 0,5 ml a 1 ml de fixador recém-preparado. As lâminas previamente limpas com detergente neutro e bucha macia, sempre esfregando num único sentido, foram então lavadas com água destilada e mantidas em etanol 95%, retiradas da solução e secas ao ar. As lâminas secas eram colocadas sobre um suporte dentro de um banho-maria a 550C, próximas à água, mas sem tocá-la, permitindo que o vapor formasse uma fina camada sobre a lâmina. O material era então pingado num ângulo de aproximadamente 45o. Após alguns segundos, quando o material já se espalhara Paiva, LRS Capítulo 2 33 bem sobre a lâmina, esta era retirada do banho-maria e o excesso de água era removido com papel absorvente. As lâminas eram então secas ao ar e mantidas por sete dias à temperatura ambiente, antes de serem usadas para análise. O bandamento G foi realizado segundo o protocolo proposto por Seabright (1971). As preparações cromossômicas foram analisadas em microscópio óptico Nikkon Eclipse E800 e as correções de captura foi utilizado o software BandView –Applied Spectral Imaging. Resultados Os testes realizados e seus resultados estão apresentados na Tabela 1. As amostras foram numeradas de 1 a 6, de acordo com a quantidade de fitohemaglutinina utilizada. Nas amostras 1, 2, 3 e 6, que continham respectivamente, 50 μ l, 100 μ l, 150 μ l e 300 μ l de fitohemaglutinina, não foi possível observar crescimento celular significativo. Portanto, o uso de 200 μ l e 250 μ l de fitohemaglutinina mostrou-se o mais adequado. Foram testados tempos de cultura de 72, 96, 120 e 144 horas. Com 72 e 96 horas, foram visualizadas poucas metáfases, menos de dez por lâmina. Períodos de crescimento superiores (120 e 144 horas) forneceram melhores resultados de crescimento celular. Os testes 4 e 5, com 200 μ l e 250 μ l de fitohemaglutinina, respectivamente, e cultivo de 72 e 96 horas, apresentaram baixa concentração de células metafásicas, porém com melhor qualidade, quando comparadas com os outros testes. Os períodos de cultivo de 120 e 144 horas forneceram um crescimento muito significativo, com o ótimo obtido com 120 horas. Após 144 horas de cultura, tanto com 200 μ l como com 250 μ l de fitohemaglutinina (testes 4 e 5), foram observadas metáfases aneuplóides e poliplóides, com predominância de tetraplóides (Figura 2). O teste 4 (200 μ l de fitohemaglutinina) forneceu, portanto, o melhor resultado, com muitas metáfases sem alterações do número diplóde. Também foi Paiva, LRS Capítulo 2 34 possível observar diferenças quanto à qualidade das preparações cultivadas nos meios RPMI 1640 e 199 (Earle). O último meio forneceu melhores resultados para O. niloticus. O uso do meio RPMI 1640 resultou num menor número de metáfases. Após a padronização da técnica de obtenção de cultura de sangue periférico utilizando a tilápia como modelo, foram realizados cultivos de sangue periférico de outras quatro espécies (Astyanax sp, Hoplias cf malabaricus, Gymnotus silvius, Cichlasoma sp) com as melhores condições obtidas em tilápia. Nestas, foram observadas variações na quantidade de metáfases obtidas, mas que sempre apresentavam boa qualidade quanto à forma e dispersão dos cromossomos (Figura 3). Foram obtidos os padrões de bandamento G nas preparações cromossômicas obtidas por cultura de linfócitos de Oreochromis niloticus (Figura 4). Paiva, LRS Capítulo 2 35 Figura 2 – Metáfases tetraplóides obtidas após 144 horas de cultura. Paiva, LRS Capítulo 2 36 Figura 3 – Metáfases obtidas por cultura de sangue periférico em: a) Astyanax; b) Hoplias; c) Gymnotus; d) Cichlasoma. Notar o bom padrão de dispersão dos cromossomos. Figura 4 – Bandamento G em metáfases de Oreochromis niloticus: a) metáfase obtida por cultura de sangue periférico; b) metáfase obtida pela técnica direta convencional. Paiva, LRS Capítulo 2 37 Discussão A cultura celular é uma ferramenta valiosa para os pesquisadores em diversos campos. Facilita a análise de propriedades e processos biológicos difíceis de estudar diretamente no organismo. Também permite desenvolver e manter linhagens celulares para as mais diversas aplicações, sem a necessidade de se manter o organismo como um todo para teste (Helgason e Miller, 2005, Kasahara, 2009). De acordo com Helgason e Miller (2005), quatro passos são necessários para o sucesso das culturas celulares. O primeiro passo está relacionado aos equipamentos que facilitam a implantação e manutenção da cultura celular, ou seja, deve-se ter uma estrutura laboratorial adequada, dependente do nível de segurança dos organismos estudados. O nível de biocontaminação (Níveis 1-4) é dependente do tipo de células em cultura e dos riscos que essas células podem ter de transmitir agentes infecciosos. O segundo passo é relacionado à esterilidade do local de trabalho (fluxo laminar, estufa, bancada de processamento) e de quem irá manipular o material. Tudo deve estar limpo, obedecendo às normas de esterilidade. O terceiro passo diz respeito ao controle de qualidade dos reagentes e suplementos, que devem ser testados a cada lote adquirido. A opção por uma determinada marca para cada reagente e suplemento diminui o erro entre os lotes utilizados. Uma vez que os três passos anteriores estejam bem estabelecidos, pode-se iniciar o quarto passo, que se relaciona às questões biológicas da cultura celular. Assim, é necessário determinar se o tecido a ser usado é ou não aderente e a identificação do tipo celular usado deve ser feita a fim de validar a linhagem utilizada. A obtenção de cromossomos mitóticos a partir de cultura de sangue periférico total em peixes contribui de forma significativa, permitindo realizar a análise citogenética em Paiva, LRS Capítulo 2 38 espécies nunca ou pouco estudadas cdevido a dificuldades na obtenção de material. Este é o caso de exemplares de grande porte, que não podem ser mantidos em aquários adequadamente, ou ainda, de coletas em regiões distantes e sem estrutura para a realização de preparações diretas de cromossomos. O uso de cultura celular permite também manipular exemplares que não podem ser sacrificados, como matrizes de piscicultura, exemplares de testes de cruzamento e espécies raras com número reduzido de indivíduos. A quantidade de sangue é outro fator importante, já que com 0,1 a 0,2 ml (100 μ l – 200 μ l) de sangue é possível obter excelentes culturas celulares, sem a necessidade de maiores quantidades, como descrito por Fugiwara et al (2001). É importante ressaltar que a coleta de sangue por punção cardíaca neste trabalho permitiu a manutenção de todos os indivíduos analisados, que foram previamente anestesiados com em solução de benzocaína (Gontijo et al, 2003). Segundo Gontijo et al. (2003), a solução de benzocaína diminui o sofrimento do exemplar, permitindo coletar amostras de sangue, aumentando a taxa de sobrevida e, mais importante, impedindo a interação do MMS com o DNA, mantendo assim a integridade cromossômica. Foram realizadas também coletas por punção através da veia dorsal, segundo Fenocchio e Bertollo (1988). Neste caso, nem sempre a coleta ocorria na primeira tentativa e havia a dificuldade de localizar a veia com precisão, bem como de avaliar seu calibre. Isso acarretava a necessidade de várias tentativas de coleta, aumentando o dano ao exemplar, com possível hemorragia local e, em muitos casos, a morte. Após a coleta, o material pode ser mantido em geladeira por até três dias, mas quanto maior o tempo de armazenamento, menor é o sucesso de crescimento celular, resultando em menos de metáfases. Os testes realizados demonstraram que o meio 199 (Earle) com L-glutamina forneceu um melhor resultado do que o meio RPMI 1640. Resultados similares foram relatados por Fugiwara et al. (2001), que testaram, além de diferentes meios de cultura, Paiva, LRS Capítulo 2 39 diferentes indutores mitóticos, métodos de separação da camada linfocitária e vários períodos de incubação. Diferentemente de Fugiwara et al. (2001), neste trabalho procuramos utilizar pequenas quantidades de sangue e, por isto, cultivamos sangue total, assim como fizeram também Fenocchio e Bertollo (1988). Entretanto, mesmo em pequenas quantidades de sangue, há eritrócitos e outros componentes da fase vermelha do sangue, o que dificulta consideravelmente o crescimento celular, já que a quantidade de eritrócitos é maior do que a de linfócitos. Estes elementos sangüíneos competem diretamente com os linfócitos pelos componentes do meio de cultura e pelo espaço, afetando os linfócitos em divisão. Além disto, são células nucleadas que não se dividem mais e, após o processamento do material, os núcleos densos dos eritrócitos ficam dispersos na lâmina, muitas vezes se sobrepondo aos cromossomos e impossibilitando a análise. Para reduzir estes problemas, não se deve utilizar mais do que 200 μ l de sangue total, mesmo aumentando a quantidade de meio de cultura, pois quanto mais meio maior a pressão interna no tubo sobre as células (Barch et al, 1997). Com a finalidade de reduzir esta pressão, utiliza-se o tubo inclinado, aumentando a superfície de contato (Figura 1). Para diminuir a quantidade de hemácias, pode-se utilizar 0,5 ml mais de fixador ao ressuspender o material, homogeneizar a solução, esperar 10 minutos sem agitar o material, retirar o sobrenadante e reservá-lo para preparar lâminas, descartando o pellet. Além de permitir a obtenção de boas preparações cromossômicas, o material obtido por cultura celular é mais indicado para a obtenção de padrões de bandamento cromossômico (Fugiwara et al , 2001), resultando na melhor qualidade nos resultados, como pode ser visto na Figura 4. Os fatores que afetam a obtenção de bons padrões de bandamento G ainda são desconhecidos, porém acredita-se que proteínas não-histônicas Paiva, LRS Capítulo 2 40 estariam diretamente ligadas ao bandamento (Homquist e Comings, 1976; Holmquist et al., 1982). Há vários relatos na literatura sobre a qualidade dos padrões de bandas G em cromossomos de mamíferos obtidos a partir de técnicas diretas e indiretas, bem como após diferentes formas de fixação (Takayama, 1974; Barnett, 1980; Ronne, 1988; Islam e Levan, 1987). Neste trabalho, foi possível observar esta diferença também em cinco espécies de peixes. Assim, é evidente que a obtenção de cromossomos metafásicos por cultura de sangue periférico é interessante, visto que fornece preparações cromossômicas de melhor qualidade, permitindo inclusive a obtenção de padrões de bandas G bastante resolutivos, raramente apresentados em trabalhos com peixes. Referências Alves JCP., Paiva LRS., Oliveira C., Foresti F. (2010) Interspecific chromosomal divergences in the genus Characidium (Teleostei: Characiformes: Crenuchidae). Neotropical Ichthyology, 8(1):77-86. Amemiya CT., Bickham JW., Gold JR. (1984). A Cell Culture Technique for Chromosome Preparation in Cyprinid Fishes. Copeia, Vol, 1984, No. 1, pp. 232-235. Barnett RI., Gray VA., Mackinnon EA. (1980) Effects of acetic acid-alcohol, trypsin, histone 1 and histone fragments on Giemsa staining patterns in chromosomes. Histochemistry. vol. 65, pp 207-215. Barch M.J. (Editor), Knutsen T. (Editor), Spurbeck J. (Editor). (1997) The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. 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Paiva, LRS Capítulo 3 43 Capítulo 3 - Bandamento G em Cromossomos de Peixes Resumo Se um primeiro marco na história evolutiva dos estudos em citogenética foi proporcionado por Karl Wilhelm von Nägeli in 1842, com a observação dos cromossomos em plantas, a década de 70 pode ser considerada como um segundo marco, em época recente, pelo surgimento de técnicas importantes de bandamento cromossômico, identificando novas ferramentas de estudo como a técnica Q (quinacrina) proposta por Carsperson et al (1970), o bandamento G (tripsina) formulado por Seabright (1971) e o bandamento C (hidróxido de bário) por Sumner (1972). A aplicação desta metodologia permitiu inicialmente identificar com maior precisão os pares de cromossomos homólogos, cromossomos relacionados às ploidias e aneuploidias, rearranjos cromossômicos como translocação, inversão, deleção, inserção, duplicação, fusão, fissão e, mais recentemente, com auxílio de sondas de DNA, a transposição de segmentos entre os cromossomos, antes identificada apenas pelo tamanho e forma dos cromossomos (fórmula cariotípica). Nos estudos de citogenética animal foi possível utilizar os bandamentos para identificar espécies e entender os eventos de rearranjos cromossômicos envolvidos na história evolutiva destes organismos, sendo o bandamento C a técnica estabelecida para o grupo de peixes (Nirchio e Oliveira, 2006). No presente trabalho são apresentados dados sobre a aplicação da técnica de bandamento G em cromossomos de peixes ósseos Neotropicais, que resultaram na visualização de 112 bandas cromossômicas em Serrapinnus notomelas, até 223 bandas em Eigeimmania virescens. Considera-se, pois, que esta metodologia, quando realizada considerando-se as particularidades de cada espécie, pode resultar em padrões adequados de bandamento em cromossomos de peixes, permitindo a identificação Paiva, LRS Capítulo 3 44 de regiões específicas dos braços cromossômicos e um pareamento mais preciso dos homólogos, além de possibilitar a identificação de rearranjos cromossômicos também em peixes. Introdução Bandamento cromossômico As análises citogenéticas passaram a ter expressiva importância a partir da década e 70 com os trabalhos de Carperson (1970) e Seabright (1971), possibilitando acessar a micro estrutura dos cromossomos. Dessa forma, foi possível realizar a identificação cromossômica das alterações estruturais em cromossomos humanos e mais tarde com outros grupos de vertebrados. Em 1972, Sumner descreveu a técnica de bandamento centromérico, podendo ser considerada hoje, ponto chave para a análise citogenética de peixes e para os mais diversos estudos cromossômicos em heterocromatina. A técnica de bandamento C revela regiões de heterocromatina constitutiva e seus polimorfismos, como demonstrado por Sumner (2003) para os cromossomos humanos 1, 9 e 16. Kasahara (2009) descreve que além da técnica de bandamento C, regiões heterocromáticas podem ser identificadas por outras técnicas como fluorocromos base-específicos, incorporação por análogos de bases como 5-bromodeoxiuridina e por sondas de DNA, pela técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), sendo o bandamento C o mais utilizado devido à aplicabilidade, simplicidade da técnica e baixo custo. A técnica de bandamento C é fundamental à citogenética clássica animal e quando aplicada nos cromossomos de peixes pode revelar marcações em posição centromérica, telomérica, intersticial; pode estar associada às regiões organizadoras de nucléolo; auxilia ainda na identificação de cromossomos extras (cromossomos B), cromossomos sexuais e em alguns casos, na Paiva, LRS Capítulo 3 45 identificação de espécies e possíveis híbridos (Almeida-Toledo et al, 1987, Sumner, 2003, Venere et al, 2004, Nirchio e Oliveira, 2006, Alves et al, 2010). Organização Cromossômica em Vertebrados O estudo da estrutura e organização cromossômica em vertebrados teve seu início mesmo antes do conhecimento da forma e comportamento dos cromossomos metafásicos, com análises do comportamento mitótico e meiótico realizado pelo zoólogo Alemão Anton Schneider em 1873 (Sumner, 2003). Desde então as discussões quanto ao comportamento cromossômico e sua composição são temas recorrentes e complexos. Supondo que Homo sapiens seja o organismo mais derivado evolutivamente, pressupõe-se que seu genoma, em toda a sua forma, também seja o mais derivado (Darwin, 1859). Assim, temos hoje como modelo e parâmetro as teorias, hipóteses e técnicas aplicáveis para os demais vertebrados previamente postulados para os estudos de genoma humano. O bandamento G proposto por Seabright (1971) tornou-se técnica indispensável em análises clinicas cromossômicas para humanos, podendo ser aplicadas outras técnicas apenas para solucionar problemas específicos decorrentes de análises prévias por bandamento G. O desenvolvimento dos estudos citogenéticos normalmente surge com resultado de análises em cromossomos humanos. Segundo Verma e Babu (1995), podem ser aplicadas cerca de dez tipos de técnicas clássicas (banda C, R, G, T, N e variantes destas) para bandamento em cromossomos humanos e cerca de onze para bandamento fluorescente (DAPI, DIPI, Hoechst, Cromomicina, Quinacrina, Olivomicina, Brometo de Etídio, dentre outros), com combinação de cinco ligantes não fluorescentes (Mitramicina, Distamicina, Actinomicina, Methyl green, Malachite green), seis tipos de enzima de restrição (AluI, DdeI, HaeIII, MboI, RsaI) e incontáveis sondas de DNA para a aplicação da técnica de FISH. Com esta gama de possibilidades de bandamento cromossômico ou identificação por Paiva, LRS Capítulo 3 46 sondas de DNA, vários pesquisadores vêm tentando aplicá-las a outros grupos animais e plantas, com o intuído de conhecer melhor a organização cromossômica destes organismos (Sight, 1993, Verma e Babu, 1995). Poucos trabalhos relatam a utilização de bandas G em cromossomos de peixes (Gold et al, 1990; Bertollo e Mestriner, 1998; Bertollo et al, 1997; Medrano et al, 1998, Maistro et al, 1999; Wang et al, 2004; Zhuang et al, 2006; Swarça et al, 2006; Portela- Castro et al, 2008), quase sempre ressaltando a dificuldade de se conseguir repetições do padrão de bandas G obtidas. Esta dificuldade foi inicialmente relatada por Medrano et al (1988) que discutem a inviabilidade da obtenção de bandas G para o grupo dos peixes. A dificuldade de obtenção de banda G em peixes poderia estar associada à organização genômica, onde tem sido postulado que o conteúdo GC em vertebrados de sangue-frio (répteis, anfíbio e peixes) seria mais disperso, quando comparado a vertebrados de sangue- quente (aves e mamíferos), não possibilitando a formação de isocores (Hudson et al, 1980, Bernardi, 1993, Jabbari et al, 2003, Bucciarelli et al, 2002, Jabbari e Bernardi, 2004, Duret et al, 2006, Federico et al, 2006, Constantini et al, 2007). Compartimentalização genômica é definida como o conteúdo de bases GC e sua distribuição ao longo dos cromossomos, podendo formar clusters bem definidos possibilitando a visualização de segmentos cromossômicos por bandamento G e R, segundo Medrano et al (1980). Bernardi (2005) descreve que o genoma humano se divide em compartimentos ricos em bases GC (H1, H2, H3) e GC pobres (L1, L2), com distribuição de 1:2 respectivamente, sugerindo que estas regiões estariam envolvidas com a localização das bandas R e G, 1:1 respectivamente. Bernardi (2005) descreveu as razões justificativas para tal hipótese: (i) bandas G corresponderiam a regiões AT ricas, sendo identificadas como bandas de replicação tardia e bandas R (bandas de replicação inicial), corresponderiam a regiões GC ricas; (ii) banda G seria visualizada em vertebrados de Paiva, LRS Capítulo 3 47 sangue quente, mas não em vertebrados de sangue frio, sendo uma característica correspondente à alta e baixa heterogeneidade da composição de conteúdo GC, respectivamente; (iii) os padrões de bandamento G seriam conservados nas aves e mamíferos, como são as quantidades relativas e os níveis dos principais componentes GC do DNA dessas espécies; (iv) a quantidade de DNA por banda cromossômica, como os altos níveis alcançados por Yunis em 1976, seria compatível com o tamanho do isocore; e (v) a amplificação gênica levaria à formação de regiões homogeneamente coradas, caso os segmentos genômicos fossem menores do que os isocores, como foi o caso. Outra técnica de bandamento longitudinal para identificação de cromossomos é a incorporação pelo análogo de base (timina) BrdU, aplicada a cromossomos humanos e a outros vertebrados (Jankun et al, 1998; Luo, 1998; Maistro et al, 1999; Maistro et al, 2000; Silva et al, 2006; Salvadori et al, 2003; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2005; Fugiwara et al, 2007; Portela-Castro et al, 2008, Kasahara, 2009), que possibilita a visualização reversa do bandamento G. É realizada em células vivas por meio de cultura ou in vivo no organismo a ser estudado (Verma e Babu, 1995, Kasahara, 2009). Para os estudos cromossômicos em vertebrados de sangue-frio, a incorporação por BrdU produz excelentes resultados em nível de identificação de espécies, polimorfismos e eventos de rearranjos cromossômicos, permitindo avaliar processos evolutivos da reorganização cariotípica. Assumindo que o genoma dos peixes apresenta um padrão disperso quanto ao conteúdo de bases GC, era de se esperar que a mesma dificuldade relatada por alguns autores quanto à obtenção de padrões de bandamento G também acontecesse ao bandamento por BrdU, já que a ação desta molécula ocorre por incorporação como análogos da base timina; porém, esta particularidade não foi relatada em nenhum trabalho. Segundo Czepulkowski (2001), os bandamentos são possíveis através de digestão enzimática e/ou denaturação, seguido de coloração com corante específico para Paiva, LRS Capítulo 3 48 proporcionar bandas claras e escuras variando de tonalidade. Estas bandas refletiriam o grau com o qual a cromatina dos cromossomos difere na composição de bases, tempo de replicação, conformação da cromatina e densidade de genes. Todos os bandeamentos cromossômicos podem ser aplicados à maioria dos tecidos, porém a diferente constituição dos tecidos exige algum tipo de adaptação da técnica, desde a preparação cromossômica até a obtenção de bandamentos cromossômicos. Isocores Um isocore caracteriza-se como uma extensa região do DNA (maior que 3 KB), com um elevado grau de uniformidade no conteúdo de bases GC e CG (coletivamente GC), que tende a ter mais genes, local com temperaturas de fusão ou desnaturação mais elevadas e de flexibilidade diferente. Em termos gerais, isocores são regiões altamente homogêneas em conteúdo de bases GC, em contraste com a heterogeneidade encontrada no genoma como um todo. Os estudos referentes à presença e organização dos isocores nos cromossomos de vertebrados iniciaram-se com o emprego da técnica de ultracentrifugação por gradiente de densidade, introduzida por Meselson, Stahl e Vinograd (1957). A técnica é aparentemente simples e consiste basicamente em adicionar uma solução salina de baixo peso molecular ao DNA extraído (de alto peso molecular) e ultracentrifugar até que seja atingido o equilíbrio de centrifugação em densidade de gradiente. No equilíbrio de sedimentação, a molécula de DNA de dupla hélice aparece como um gradiente ao longo do tubo, sendo chamado de flutuação na composição de bases (Li, 2002). Desse modo a ultracentrifugação do material genético em solução salina pode atingir o equilíbrio sobre um padrão de condições, sendo reproduzível (Clay et al., 2006). Paiva, LRS Capítulo 3 49 O emprego do método de ultracentrifugação tem sido de extrema importância para o entendimento da variação composicional do genoma em vertebrados (Hudson et al., 1980; Bernardi, 1993; Hughes et al., 1999; Perani et al., 2000; Bucciarelli et al., 2002; Clay et al., 2003; Jabbari e Bernardi, 2004; Federico et al., 2006; Fortes et al., 2006b, Clay et al., 2006). Alguns trabalhos reportam a existência de compartimentalização do genoma de vertebrados de sangue-quente com base no fracionamento do genoma total por ultracentrifugação (Bernardi, 1993; Perani et al., 2000; Saccone e Bernardi, 2001; Bernardi, 2001; Belle et al., 2002; Jabbari et al., 2003; Clay et al., 2003; Federico et al., 2005; Costantini et al., 2006). De acordo com a quantidade e composição de bases GC no genoma (mosaico de segmentos > 300 kb) é possível se obter diferentes classes para estas frações, denominadas de classes L1 e L2 as que correspondem respectivamente às menores concentrações de GC do produto fracionado e classes H1, H2 e H3, as classes com maior composição de conteúdo GC (Saccone e Bernardi, 2001; Cohen et al., 2005; Constantini et al., 2006). Tais classes compreendem o estudo da estrutura de isocores ao longo do genoma, podendo apresentar-se dispersa no genoma de vertebrados de sangue frio a altamente compartimentalizada, como no genoma dos vertebrados de sangue quente. Após o sequenciamento do genoma humano pelo “International Human Genome Consortium” (Human Genome, 2001), os estudos das classes de isocores passaram a ter um interesse considerável. Até então, as classes de isocores eram discutidas de forma mais suposicional, apenas como regiões ricas ou pobres em GC, mais ou menos compartimentalizadas e que estavam diretamente relacionadas à bandamentos cromossômicos dos tipos G, T e Q. Duret et al. (2006) e Costantini et al. (2006) demonstram que estas classes GC ricas possuem uma relação direta com a quantidade de genes no genoma humano, sendo que as classes H2 e H3 possuem mais da metade do total de genes e representam apenas 15% do genoma total. Paiva, LRS Capítulo 3 50 Associado aos estudos de isocores está o estudo de regiões repetitivas GC3, ligadas à alteração na composição da terceira base (Duret e Hurst, 2001; Jabbari et al., 2003; Cruveiller et al., 2004, Jabbari and Bernardi, 2004). Fortes et al. (2006a) demonstram uma relação muito intrínseca entre GC3 em vertebrados de sangue-frio e as classes de isocores identificadas em vertebrados de sangue-quente e de sangue-frio. Esta alteração na terceira base está ligada à estrutura e composição das classes de isocores apresentadas acima, pois ocorrendo nesta posição uma guanina ou uma citosina em um DNA de alta repetibilidade, o peso molecular na ultracentrifugação será alterado. Acredita-se que este diferença no peso molecular estaria ligada à quantidade de pontes de hidrogênio entre as bases que compõe a estrutura em dupla hélice do DNA (Sustada, 2001). Assim, a composição de GC3, sua repetibilidade e a distribuição ao longo do genoma influenciam diretamente a densidade de flutuação do DNA ao longo do gradiente do tubo em UCA (Clay et al., 2006). Isocores e o Genoma de Peixes Em discussão recente sobre a evolução cariotípica dos peixes Neotropicais e a estrutura de isocores parece persistir o entendimento de que o genoma de peixes seria não compartimentalizado (Oliveira et al., 2000), j