1

 

 

 

 

 

 

CRISTINA WERKMAN 

 

 

 

 

 

CITOTOXICIDADE DA PUNICA GRANATUM L. (ROMÃ) 
SOBRE CULTURA DE FIBROBLASTOS E DE CÉLULAS DE 

LINHAGEM CANCERÍGENA 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2009 



2

CRISTINA WERKMAN 
 

 

 

 

 

 

CITOTOXICIDADE DA PUNICA GRANATUM L. (ROMÃ) 

SOBRE CULTURA DE FIBROBLASTOS E DE CÉLULAS DE 

LINHAGEM CANCERÍGENA 

 

 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São José dos 

Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como 

parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa 

de Pós- Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Patologia. 

 

 

 

 

Orientador: Prof. Adj. Sigmar de Mello Rode 

 

 

 

 

São José dos Campos 

2009



 

BANCA EXAMINADORA 
 

 

Prof. Adj. Sigmar de Mello Rode 

Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista – UNESP 

 

Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão 
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista – UNESP 

 

Profa. Dra. Ana Christina Claro Neves 

Faculdade de Odontologia 

Universidade de Taubaté 

 

Prof. Dr. José Benedito Oliveira Amorim 
 Faculdade de Odontologia de São José dos Campos 

Universidade Estadual Paulista – UNESP 

 

Prof. Dr. Ricardo Carneiro Borra
Faculdade de Odontologia 

Universidade Ibirapuera 

 

 

 

 

 

 

São José dos Campos, 22 de Julho de 2009. 



4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Cada um que passa em nossa vida passa sozinho... 

Porque cada pessoa é única para nós, e nenhuma substitui a outra. 

Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas não vai só... 

Levam um pouco de nós mesmos e nos deixam um pouco de si mesmos. 

Há os que levam muito, mas não há os que não levam nada. 

Há os que deixam muito, mas não há os que não deixam nada. 

 

Esta é a mais bela realidade da vida... 

A prova tremenda de que cada um é importante e que ninguém se 

aproxima do outro por acaso... 

(Saint Exupery) 



5

DEDICATÓRIA 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico esta etapa de vida aos meus pais Delmina e 

Jacob que acreditaram na minha capacidade mesmo nos 

momentos que eu mesma duvidei. 

 

Agradeço por fazerem do meu sonho o seu sonho e não 

medirem esforços para que eu o alcançasse.  



6

 
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS 

 

 

 

 

 

 

Ao Professor Sigmar agradeço a atenção e incentivo 

ao longo dos três anos de convivência. Obrigada pelas oportunidades de 

crescimento pessoal e profissional. 

Querida chefinha Adriana Aigotti Haberbeck Brandão 
e família, agradeço todos os dias por tê-los em minha vida; foram sete 

anos de uma convivência ímpar. Chefe, com todo o amor e carinho 

ensinou tantas coisas especiais sobre a vida, o mundo acadêmico e como 

procurar apaziguar os dois. Soube mostrar o quanto sou especial para mil 

funções e como posso buscar e compensar outras tantas que não sei 

fazer, mostrou como posso sempre trabalhar em equipe e ser feliz assim.  



7

AGRADECIMENTOS

À Deus por me guiar nesta estrada com saúde e vitalidade 

para trilhar cada dia do meu doutorado. 

 

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 

na pessoa do diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, 

Prof. Dr. José Roberto Rodrigues e do vice-diretor Prof. Dr. Carlos Augusto 
Pavanelli.

 

Às professoras. Rosilene Fernandes da Rocha e Cristiane 
Yumi Koga Ito pela competência e dedicação ao exercer o cargo de 

coordenador da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de São José dos 

Campos – UNESP. 

 

Às secretárias que estiveram no Departamento de 

Biopatologia Bucal da FOSJC ao longo deste curso; Silvia Scarpel, Ivoneide 
Ramos Leandro e Neide do Nascimento, sempre muito prestativas. 

 

Às bibliotecárias da FOSJC: Silvana Alvarez, Sônia Maria 
Reis, Maria das Dores Nogueira, Deise Cristina A. G. Coelho, Dezirée Alves 
de Souza, Glacy Silvério dos Santos, Renata Aparecida Couto, Ângela de 
Brito Bellini. 

 

Aos membros da equipe do pólo computacional André Luiz 

Goia de Araújo, Newton Guimarães Junior, Pedro Henrique Moraes 
Ananias, Luciano Muller Lima, que em todos os momentos dedicaram tempo e 

paciência para ajudar em resgates de dados, formatações e dúvidas sobre 

computadores.  

 



8

Às secretárias da Pós – Graduação; Rosemary, Erena e 

Cida pelo cuidado na orientação e esclarecimentos prestados durante este 

curso. 

 

Aos docentes do Programa de Graduação e Pós-graduação: 

Profa. Dra. Maria Nadir Gasparoto Mancini, Prof. Dr. Lúcio Murilo dos 
Santos, Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, Profa. Adj. Cristiane Yumi 
Koga Ito, Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira, Profa. Dra. Luciane Dias 
de Oliveira, Profa. Adj. Ana Sueli R. Cavalcante,  Prof. Tit. Horácio Faig 
Leite, Profa. Adj. Janete Dias Almeida, Prof. Dr. José Benedito Oliveira 
Amorim, Profa. Dra. Luana M. Reis de Vasconcellos, Profa. Dra. Maria 
Aparecida Neves Jardini, Profa. Adj. Mônica Fernandes Gomes, Prof. Adj. 
Walter Domingos Nicoli Filho, Profa. Adj. Yasmin Rodarte de Carvalho, 
Prof. Tit. José Roberto Sá Lima, Prof. Adj. Paulo Villela Santos Junior, Prof. 
Dr. Fernando Renó de Lima, Prof. Dr. Warley David Kerbauy, Prof. Dr. 
Carlos Rocha Gomes Torres, Prof Adj. Clóvis Pagani, Prof. Adj. Sergio 
Eduardo de P. Gonçalves, Profa. Dra. Alessandra Bühler Borges, Prof. Dr, 
Alexandre Luiz Souto Borges, Prof. Adj. Estevão Tomomitsu Kimpara, Prof. 
Dr. Rubens Nisie Tango, Prof. Dr. Lafayette Nogueira Junior, Prof. Dr. 
Tarcísio, Prof. Dr. Marcos Yasunóri Maekawa, Prof Dr. Miguel Angel Castillo 
Salgado, Prof Adj. Luiz Antonio Guimarães Cabral, Prof. Adj Ana Sueli 
Rodrigues Cavalcante, Prof. Adj. Janete Dias Almeida, Prof. Dr. Ivan 
Balducci, Profa. Dra. Suely Carvalho Mutti Naressi, Profa. Dra. Denise 
Nicodemo, Profa. Dra. Symone Cristina Teixeira, Prof. Adj. Silvio Issáo 
Myaki. Obrigada por todos os ensinamentos e convívio. 

 

Aos funcionários e técnicos do Departamento de 

Biopatologia Bucal: Ana Lourdes da Silva Machado, Antônio D.S.B.M. 
Vasconcellos, Domingos Gonçalves Pontes, Ivan Carlos Vanzella, Ivoneide 
Ramos Leandro, Lourival Jacobs, Marco Antonio Correa Alfredo, Maria
Salete Faria, Paulo Rogério Martins, Sergio Giovanny Alves, Walter Cruz e 

do Departamento de Prótese e Materiais Dentários: Fernando Carlos Fontes,

Maria Inês Moreira dos Santos, Miguel Lemes da Silva, Suzana Cristina de 
Oliveira por todo o suporte e atenção.  



9

Aos amigos que fiz na Universidade Ibirapuera agradeço a 

visão de equipe que me proporcionaram. Realmente foi um enorme prazer 

conviver e o trabalhar com pessoas tão competentes. Agradeço a Adriana
Fraga Costa e Sandra Regina da Silva Lascosck, pelo auxílio no laboratório 

sempre “cuidando de mim pelo vidro”. Aos professores Sonia Maria Gagioti, 
Ricardo Carneiro Borra, Marcelo Ferreira Witzel, Claudio Pannuti, Miriam
Rubio Faria, Cristiane Miranda França, Mônica Andrade Lotufo, Ricardo 
Raitz, obrigada pelas experiências compartilhadas. Aos alunos Fabiana
Mesquita Barros, Ludmilla Martinelli Elias, Fabiana Viviane Alves, obrigada 

por revezarem o fluxo laminar e as experiências de vida.  

 

A todos os alunos de pós-graduação que conviveram 

comigo nesta instituição durante os últimos sete anos. Nossa, são tantos, Ana 
Cristina Posh, Ana Paula Lima, Fernando A. C. G. de Sousa, Carlos 
Colombo, Paula Komori, Renata Prado, Samira Fonseca Camargo, Daniel 
Freitas Alves Pereira, Nívea Cristina Sena Costa, Ana Lourdes da Silva 
Machado, Fernanda Bertini Moreira, Edna A. F. de Araújo Navas, Celina 
Faig Lima, Fernando A. Perrella, Flávio Pires Molina, Graziella N. Back 
Brito, Lilibeth F. de Brito P. Forte, Luís FCS Carvalho, Márcia Hatakeyama, 
Marta Majewski, Rodrigo Dias Nascimento, Rogério Lima Romeiro, Rosilene 
B. de Aguiar Almeida, Vitor Hugo Farina, Breno Cherfên Peixoto, Carolina 
Porto, Laurene, Aleska Dias Vanderlei, Liliana Gressler May, Lucas Villaça 
Zogheib, Humberto Lago de Castro, Priscilla Cristoforides Pereira, Susana 
María Salazar Marocho, Rodrigo Othavio de A. e Souza, Silvia Masae de 
Araujo Michida, Eron, Tassiana Capelete. Sempre companheiros de longos 

papos, créditos e muitas boas risadas amigos especiais que acompanharam a 

caminhada de créditos, trabalhos, cirurgias e muitos finais de semana 

trabalhando na faculdade 

 

Aos amigos do curso de empreendedorismo Ana Paula T. 
Santos Moreira, Antônio Carlos Girelli Gómez, Fabio Santiago, por todos os 

momentos de convívio aos sábados. 

 



10

Aos amados amigos Juliana Madureira Alonso e Renato 
Barchetta Alonso por todos os momentos de estudo, papo e descontração, 

desde os dias e noites de estudo para a prova do doutorado, passando pelos 

créditos e horários loucos, alem das noites de terças feiras em minha casa, com 

Kaka, Hill e muitas gargalhadas... Obrigada por mostrar “a visão além do 

alcance” nas cirurgias de ligadura em camundongos... Seres miniatura que tanto 

nos fizeram rir. Nossa foram tantos mil papos e trocas e experiências. Juju, você 

fez o doutorado ser divertido do início ao fim!  

 

Ao casal Carolina Foot Gomes de Moura e André Luiz de 
Moura por toda a atenção, carinho e convivência por estes anos. Carol, você me 

proporcionou momentos únicos, obrigada por ser amiga e companheira para 

tantas coisas, tantos cafés com conversa e tantas correrias para pegar ônibus. 

 

Querida amiga Karina Bortolin Lodi (salve salve) que muito 

agregou no curto período de tempo que tivemos. Obrigada por toda 

consideração, carinho e papos farmacológicos. 

 

A amiga Giselle Segnini Senra e toda sua família. 

Agradeço por mostrar como uma mãe pode ser tão multifuncional e multifatorial 

e ainda assim não descuidar da família. Com um carinho especial para a grande

Lívia, uma mocinha doce com quem tive momentos muito agradáveis. 

 

Ao amigo Pietro Mainenti, que desde longa data é 

companheiro de cafés com conselhos. Obrigada por todos os momentos juntos. 

 

A amiga Angela Bolanho e as risadas mais deliciosas da 

faculdade. Sempre com comentários inteligentes que fizeram a diferença, 

ensinando como me expressar com ótimo humor em momentos difíceis de ser 

compreendida. 

 

Agradeço a todos os alunos da graduação da Unesp que 

fizeram companhia durante os almoços no Diretório Acadêmico ou em sala de 

aula, mostrando o quanto é bom trabalhar repassando conhecimento e 



11

experiência. Alguns são especiais, pois as amizades foram ampliadas com 

trabalhos e momentos únicos: Tais Moreira Leite, Priscila Ferreira Amslinger 
(e nossas idas e vindas da USP), Patrícia Rosa, Michelle Fernandes Fonseca, 

Junia de Oliveira Barbosa, Fabiana Frattes, Paula de Siqueira Barbosa, 
Megg Aparecida Ribeiro, Taeny Yumi. 

 

Aos queridos pacientes e amigos da equipe de prótese 

Bucomaxilofacial da Universidade do Vale do Paraíba: Elisabeth Maibrava, 

Viviane Regina Côas, Éderson, Priscila que muito me ensinaram sobre a vida 

e como ser mais feliz. Minha querida “chefona” Ana Christina Claro Neves com 

todo seu coração e carinho, me acolheu em todos os momentos, certamente me 

ensinou não apenas a ser uma profissional, mas também uma pessoa melhor.  

 

Aos queridos amigos Josephina Facciolli Contieri, Silvio 
Holleben, Teresinha Isabel Contieri Holleben, Priscila Holleben, Déborah 
Holleben, Daniela Holleben, agradeço pelo maravilhoso convívio, atenção e 

ensinamentos de vida e família.   

 

Carolina Werkman Tavares, Vinicius Tavares e minha 

amada afilhada Beatriz Werkman Tavares, agradeço pelos bons momentos. 

 

Madrinha Nair Siqueira por todo o carinho no período que 

permaneci em sua casa durante meu experimental. 

 

Aos amigos Leila Cristina Andrade e seu esposo Marcus e 

Edmilson Padovani que nas correrias de SP me receberam com carinho, em 

momentos de congestionamentos, aguardando a melhora para pegar estrada 

rumo casa. Obrigada pelo convívio durante meu experimental de doutorado com 

nossos “felinos” em comum. 

 

A querida amiga que sempre cuidou de mim, Salete Ramos 

e Francisco Rosa por todos os anos de apoio e alegria que trouxeram para meu 

mundo com cafés de final de tarde, muito amor e carinho. 

 



12

Aos amigos Eduardo Aoki, Fabiana Carneiro Aoki, 
Marcelo Aoki, Larissa Gonçales, Alessandro Nogueira, Daniela Moura, 
Fernando Augusto, Luciano, Gabriela, Nathalia Sapucahy, Larissa Pedrote, 
Lúcio Pedrote Alexandre Kikko, Mariana Delgado, Lincoln Delgado, 
Nathália Montuori, Marcos Pellegrino Giopatto e Fabio Borges pelos 

momentos de cafés, risadas e descontração, mostrando que ainda existe um 

“mundo fora de uma faculdade”. 

 

Ao amigo Daniel Junkes Neto, agradeço por todo o 

otimismo e alegria, mostrando que posso e devo sonhar mais alto, ir mais longe 

sempre. 

 

Camila Verde e Rodrigo pela deliciosa convivência nos 

domingos na praça. Obrigada pelo carinho e companhia em momentos tão 

agradáveis. 

 

À amiga Cristiane Carubelli e família agradeço por ser 

recebida por sua família sempre com sorrisos e sábios conselhos. 

 

As amigas Daniela Granato e Shirley Pereira, agradeço 

pela receptividade e atenção, sempre com muito bom humor e carinho. 

 

Ao Carlos Guedes por todos os momentos que ajudou a 

mim e a tantos outros sempre com tranqüilidade, sorrisos, bom humor e balinhas 

que tanto adoçaram minhas manhãs. 

 

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos que tornou 

possível minha permanência integral dentro do meio acadêmico no período do 

doutorado e consequente realização deste trabalho. 

 

A todos os funcionários da FOSJC que direta ou 

indiretamente muito contribuíram no convívio diário. 

 



13

À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – 

UNESP pelo incentivo durante o desenvolvimento do curso. 



14

SUMÁRIO

 RESUMO........................................................................... 16 

1 INTRODUÇÃO................................................................... 23 

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................ 26 

2.1   Fitoterapia ........................................................................ 26 

2.1.1   Histórico ............................................................................ 26 

2.1.2   Diferença entre a fitoterapia e o alimento a base de 

plantas ............................................................................... 30 

2.1.3   Legislação para os produtos fitoterápicos.......................... 32 

2.1.4   A liofilização conservando os princípios ativos das 

plantas................................................................................ 34 

2.2   Punica granatum L. ......................................................... 36 

2.2.1   Histórico............................................................................. 36 

2.2.2   Utilização e estudos já realizados...................................... 38 

2.3   Testes de Citotoxicidade................................................. 42 

2.3.1   Cultura celular.................................................................... 44 

2.3.2.  Cultura celular primária...................................................... 45 

2.3.3. Cultura celular secundária................................................. 47 

2.4   Testes de citotoxicidade com fitoterápicos.................. 49 

2.4.1   Testes com fitoterápicos e cultura celular.......................... 50 

3 PROPOSIÇÃO................................................................... 51 

4 MATERIAL E MÉTODO..................................................... 52 

4.1   Instituições envolvidas.................................................... 52 

4.2   Liofilização........................................................................ 53 

4.3   Obtenção das soluções padronizadas de PG................ 53 

4.4   Cultura de células............................................................. 54 



15

4.5 Grupos experimentais...................................................... 56 

4.6   Procedimentos para Cultura Celular.............................. 57 

4.7   Procedimentos para Descongelamento Celular............ 59 

4.8   Procedimentos prévios ao início dos ensaios de 
viabilidade e de citotoxicidade celular.......................... 61 

4.9   Contagem Celular pelo Método do Azul de Trypan...... 63 

4.10   Ensaio de viabilidade das células.................................. 65 

4.11   Ensaio de citotoxicidade das células............................. 70 

4.12   Análise Estatística........................................................... 72 

5 RESULTADOS.................................................................. 73 

5.1   Teste de viabilidade celular............................................ 73 

5.2   Teste de citotoxicidade celular....................................... 75 

5.3   Manchamento dos poços................................................ 83 

6 DISCUSSÃO...................................................................... 87 

7 CONCLUSÃO.................................................................... 95 

8 REFERÊNCIAS.................................................................. 96 

 ANEXO 1 – Comitê de Ética............................................ 108

 ANEXO 2 – Dados de leitura............................................ 109

 ABSTRACT....................................................................... 115
 



16

Werkman C. Citotoxicidade da Punica granatum L. (romã) sobre cultura de 
fibroblastos e de células de linhagem cancerígena [tese]. São José dos Campos: 
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual 
Paulista Julio de Mesquita Filho: 2009. 

 
 
 
 

RESUMO
 
 
 
 
Embora diversos estudos já tenham sido realizados sobre a Punica granatum L., 
seus possíveis efeitos citotóxicos não são bem conhecidos. No presente trabalho 
foi avaliada a toxicidade da Punica granatum L. (PG) por meio de cultura celular 
com duas linhagens: fibroblastos humanos de mucosa oral (FLM) e células de 
carcinoma epidermóide oral humano (KB). As células foram submetidas ao teste 
de viabilidade celular por 24 horas em placas de 96 poços nas concentrações da 
PG (1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,062% e 0,031%) e aos testes de citotoxicidade 
celular em placas de 24 poços, em cinco períodos diferentes (4 horas, 1, 3, 5 e 7 
dias) e com quatro diferentes concentrações (1%, 0,5%, 0,25%, 0,062%). Todos 
os testes foram realizados em triplicata e em três momentos diferentes. Foram 
adicionados dois grupos, um controle negativo (Tryton 10%) e um controle 
positivo constituído de meio de cultura acrescido de soro bovino fetal 10% e sem 
o extrato de PG. A quantificação celular foi realizada pelo método do Resazurin, 
com avaliação por espectrofotometria óptica (espectrofotômetro UVM340 - Asys 
Hitech GmbH) e leitura de absorbância dos comprimentos de onda de 570 nm a 
600 nm. Os dados obtidos foram submetidos à ANOVA (5%). Os resultados de 
viabilidade mostraram que nas concentrações de 0.031%; 0,062%; 0,125%; 
0,25% e 0,05% o extrato de PG inibiu a viabilidade celular (� 40%) 
principalmente das células KB. O teste de citotoxicidade mostrou que apenas as 
culturas tratadas com PG a 0,062% exibiram citotoxicidade para as linhagens 
celulares. A PG a 1% foi tóxica para as células FLM e KB. O extrato de PG inibiu 
a citotoxicidade celular nas demais concentrações testadas. Estes resultados 
podem ser relacionados a propriedade anticarcinogênica da Punica granatum L. 
 
 
 
 

 
Palavras chave: Punica granatum. Fitoterapia. Toxicidade. Técnicas de cultivo 
celular. Fibroblastos. Carcinoma. 
 
 



17

LISTA DE QUADROS E TABELAS 
 

 

 

 
Quadro 1 - Metodologia de análise fitoquímica segundo 

Sonaglio et al., 1999. ............................................ 33 

Tabela 1 - Concentrações e quantidade de Punica granatum 

L. com respectiva quantidade de polifenóis 

testados para definir as concentrações a serem 

utilizadas nos testes de viabilidade........................ 56 

Tabela 2 - Representação em porcentagem dos valores do 

teste de viabilidade realizado para as células 

FLM e KB em diferentes concentrações de 

PG......................................................................... 74 

Tabela 3 - Representação em porcentagem de 

sobrevivência dos valores de citotoxicidade das 

células FLM nos períodos de 4 horas, 1, 3, 5 e 7 

dias em diferentes concentrações de 

PG................................................................... 76 

Tabela 4 - Representação dos valores de citotoxicidade das 

células KB nos períodos de 4 horas, 1, 3, 5 e 7 

dias em diferentes concentrações de PG.............. 77 

Tabela 5 - Tabela representativa em porcentagem da 

sobrevivência celular após 4 horas para as 

células FLM e KB nas diferentes concentrações 

de PG.................................................................... 79 

Tabela 6 - Tabela representativa em porcentagem da 

sobrevivência celular em 1 dia para as células 

FLM e KB nas diferentes concentrações de 

PG......................................................................... 
 

 

 

 

80 



18

Tabela 7 - Tabela representativa em porcentagem da 

sobrevivência celular em 3 dias para as células 

FLM e KB nas diferentes concentrações de 

PG......................................................................... 

 

 

 

81 

Tabela 8 - Tabela representativa em porcentagem da 

sobrevivência celular em 5 dias das células FLM 

e KB nas diferentes concentrações de 

PG......................................................................... 82 

Tabela 9 - Tabela representativa em porcentagem da 

sobrevivência celular em 7 dias para as células 

FLM e KB nas diferentes concentrações de 

PG......................................................................... 82 



19

LISTA DE FIGURAS 
 

 

 

 

 
Figura 1 - Esquema para obtenção de uma cultura primária a 

partir de um explante. ............................................. 46 

Figura 2 - Desenho esquemático de obtenção e cultivo de 

células por cultura secundária. ............................... 49 

Figura 3 - Desenho esquemático com imagens das etapas 

para obtenção da cultura primária de fibroblastos 

humanos de mucosa oral (FLM). ............................ 55 

Figura 4 - Solução base e diluições preconizadas de PG 

para os testes de viabilidade. ................................. 57 

Figura 5 - Desenho esquemático da disposição dos criotubos 

durante o processo de congelamento em 

nitrogênio líquido. ................................................... 59 

Figura 6 - Desenho esquemático para descongelamento de 

células mantidas em nitrogênio líquido. .................. 60 

Figura 7 - Disposição das células colocadas na placa de 

cultivo 24 h antes do início dos testes de 

viabilidade. .............................................................. 62 

Figura 8 - Grupos experimentais, esquema de diluição por 

titulação ou a partir da concentração de 1% de 

PG, além dos grupos controle negativo e controle 

positivo. .................................................................. 64 

Figura 9 - Esquema de distribuição da placa de 96 poços 

com as células (FLM e KB) em diferentes 

concentrações de PG e o controle sem células. .... 

 

 

 

65 



20

Figura 10 - Fórmula para cálculo de volume de meio contendo 

células para ser colocado em cada poço para 

cultura. .................................................................... 65 

Figura 11 - Disposição das células colocadas na placa de 

cultivo 24 h antes do início dos testes de 

viabilidade. .............................................................. 66 

Figura 12 - Grupos experimentais, esquema de diluição por 

titulação ou a partir da concentração de 1% de 

PG, além dos grupos controle negativo e controle 

positivo. ................................................................... 67 

Figura 13 - Esquema de distribuição da placa de 96 poços 

com as células (FLM e KB) em diferentes 

concentrações de PG e o controle sem células. .... 68 

Figura 14 - Esquema de preparo para leitura por meio do 

espectrofotômetro: placa com grupos 

experimentais (1), remoção das soluções teste (2), 

lavagem e remoção do PBS (3) e preenchimento 

com RZ 2.100 μM (4). ............................................. 69 

Figura 15 - Exemplo de alteração de cor ocorrida durante a 

reação de RZ. ......................................................... 70 

Figura 16 - Esquema de disposição das células na placa para 

realizar os experimentos de citotoxicidade.............. 71 

Figura 17 - Desenho do experimento de citotoxicidade com as 

placas de cultivo e placas controle durante o 

período experimental de quatro horas a sete dias. 72 

Figura 18 - Gráfico demonstrativo da viabilidade para as 

células FLM e KB................................................... 74 

Figura 19 - Gráfico representativo dos valores de 

citotoxicidade das células FLM nos períodos de 4 

horas, 1, 3, 5 e 7 dias.............................................. 

 

 

 

75 



21

Figura 20 - Gráfico representativo dos valores de 

citotoxicidade das células KB nos períodos de 4 

horas, 1, 3, 5 e 7 dias. .......................................... 77 

Figura 21 - Representação gráfica do teste de citotoxicidade 

após 4 horas para as células FLM e KB nas 

diferentes concentrações de PG............................. 78 

Figura 22 - Representação gráfica do teste de citotoxicidade 

no dia 1 para as células FLM e KB nas diferentes 

concentrações de PG. ............................................ 79 

Figura 23 - Representação gráfica do teste de citotoxicidade 

em 3 dias para as células FLM e KB nas 

diferentes concentrações de PG. ........................... 80 

Figura 24 - Representação gráfica do teste de citotoxicidade 

em 5 dias das células FLM e KB nas diferentes 

concentrações de PG. ............................................ 81 

Figura 25 - Representação gráfica do teste de citotoxicidade 

em 7 dias para as células FLM e KB nas 

diferentes concentrações de PG............................. 82 

Figura 26 - Alteração colorimétrica nas placas para as células 

FLM na concentração de PG 0,062% e para as 

células KB na concentração PG 1%....................... 84 

Figura 27  Alteração colorimétrica nas placas onde as células 

estavam contidas, imagem mostrando a alteração 

de cor com o RZ e após a remoção do RZ. ........... 84 

Figura 28  Alteração colorimétrica das células em meio no 

sétimo dia (Microscópio de luz invertida 100x)........ 85 
 
 



22

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 

ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária 

COBEA = Colégio Brasileiro de Experimentação Animal 

DMEM = Meio Dubelco modificado por Eagle 

DMSO = Dimathyl sulfoxide 

EAGLE = Meio de cultura celular  

FLM = Célula de cultura de Fibroblastos de mucosa oral 

g = Grama 

h =  Hora  

KB = Célula de cultura de Carcinoma epidermóide oral humano 

mg =  Miligrama 

min = Minuto 

mL = Mililitros  

mmHg = Milímetros de mercúrio 

OMS = Organização Mundial de Saúde 

PG = Punica granatun L. 

RZ = Resazurina 2.100 μM 

SBF = Soro Bovino Fetal 

SUS =  Sistema Único de Saúde  

TRIP = Tripsina 

Trypan = Trypan blue 4% 

WHO =  World Health Organization 

μM =  Micromolar 

μL = Microlitros 

μg = Microgramas  



23

 1. INTRODUÇÃO

Atualmente, a grande disponibilidade de produtos 

naturais e a constante busca por uma melhor qualidade de vida têm 

colocado a "medicina alternativa" em posição de destaque. No cenário 

mundial, um grande esforço tem sido realizado pela comunidade científica 

objetivando identificar compostos derivados de produtos naturais e que 

apresentem propriedades benéficas para o homem. 

Dados divulgados pela Organização Mundial de Saúde 

(OMS) em 2005, mostraram que o uso de plantas medicinais tem 

aumentado nos últimos anos e que, cerca de 85% da população mundial 

utilizou algum tipo de planta na busca de alívio para uma sintomatologia 

dolorosa ou desagradável. Do total, pelo menos 30% ocorreu por 

indicação médica. A utilização de plantas medicinais tem recebido 

incentivo da OMS (Brasil, 2006 a).  

No Brasil se identifica a preocupação do Governo 

Federal com a ampliação das opções terapêuticas para os usuários do 

Sistema Único de Saúde (SUS), garantindo acesso a plantas medicinais e 

medicamentos fitoterápicos. O Ministério da Saúde (Portaria n.212 de 11 

de setembro de 1981) destacou o estudo de plantas medicinais como 

uma das prioridades de investigação em saúde (Brasil, 2006 b). 

Obedecendo a Política Nacional de Práticas Integrativas e 

Complementares, em dezembro de 2005 foi aprovado o uso de terapias 

alternativas na rede pública. Entre estas terapias, a utilização dos 

fitoterápicos, monitorados pela vigilância sanitária (Brasil, 2006 a).  

Muitos fatores, destacando-se os econômicos e sociais, 

têm colaborado com o desenvolvimento das práticas de saúde 



24

relacionadas com plantas medicinais. Assim, diversas plantas têm sido 

empregadas de forma medicinal pelo esperado poder curativo e 

preventivo a elas atribuído. Pesquisas com plantas medicinais, quase 

sempre, originam medicamentos em menor tempo e com custo inferior, 

consequentemente mais acessíveis à população. Desta forma, pesquisas 

devem ser realizadas, até que os mesmos possam ser disponibilizados 

comercialmente para consumo (Langley, 2000).  

As plantas sintetizam compostos químicos a partir dos 

nutrientes do solo, água e luz que recebem. Muitos desses compostos, ou 

grupos deles denominados “princípio ativo”, dependendo da dosagem 

administrada, podem provocar reações de toxicidade no organismo.  

A Punica granatum Linus utilizada como medicamento 

fitoterápico, apresenta propriedades antimicrobiana, anti-helmíntica, 

antiviral e resposta positiva no tratamento de diabetes mellitus (Pereira et 

al., 2005; Werkman et al., 2008). Embora diversos estudos já tenham sido 

realizados com este fitoterápico, seus possíveis efeitos citotóxicos nos 

tecidos humanos ainda não são bem conhecidos.  

As investigações relacionadas com fitoterápicos, quase 

sempre, objetivam avaliar as formas de assimilação pelo organismo e os 

possíveis efeitos nocivos dos mesmos. Entre os diversos testes pré-

clínicos comumente realizados, destaca-se o teste de citotoxicidade em 

cultura celular. Experimentos em cultura celular representam importante 

ferramenta para caracterizar eventos que possibilitam às células 

superarem o controle normal, identificando bases genéticas, processos 

fenotípicos envolvidos na transformação celular e a comparação do 

comportamento coletivo de linhagens celulares normais e cancerosas 

(Vilela et al., 2002).  

Técnicas de cultura celular possibilitam a manutenção 

de diversos tipos de células em diferentes meios de cultivo. A cultura 

celular é realizada em recipientes especializados e os testes feitos em 



25

placas com poços individualizados. Possibilita o estudo da citotoxicidade e 

da citotoxicidade, em diferentes tipos de tecidos.  

Testes de citotoxicidade por meio de cultura celular são 

utilizados com sucesso, pela sua reprodutibilidade, rapidez, sensibilidade 

e custo acessível. Avaliam os possíveis danos teciduais, mais 

especificamente nas membranas celulares (Rogero et al., 2003).  

Assim, o objetivo deste estudo foi verificar a 

citotoxicidade da Punica granatum L. sobre duas linhagens celulares, uma 

de fibroblastos humanos de mucosa oral e outra de células cancerígenas. 



26

2. REVISÃO DA LITERATURA 

Para melhor compreensão, este capítulo foi 

subdividido. Inicialmente foram revistos os estudos relacionados com 

fitoterapia, fitoterápicos e, principalmente com a Punica granatum L. Em 

um segundo momento foram abordados os testes de viabilidade e 

sobrevivência em cultura celular. 

 

 

 

 

2.1  Fitoterapia

2.1.1  Histórico 

Fitoterapia é o método terapêutico mais antigo de toda 

a medicina natural. Na pré-história o homem aprendeu a distinguir entre 

os diversos tipos de plantas, aquelas que podiam atenuar ou sanar suas 

moléstias. Estas informações foram transmitidas ao longo das gerações e 

conhecimentos foram adicionados à medida que o homem realizava 

novas experimentações. A difusão das informações se deu de forma oral, 



27

desenhos em cavernas e posteriormente em papiros, sendo assim 

disseminados por povoados e civilizações (Newal et al., 2002). 

Com o passar do tempo, as ervas com poder medicinal 

foram descritas e catalogadas, primeiro por curandeiros e posteriormente 

por botânicos. Estes por sua vez, organizaram e classificaram levando em 

conta diferentes critérios, desde a forma, cor, sabor, aroma até ligações 

com astros e atributos mágicos que apresentavam. Com a evolução da 

ciência, foram possíveis estudos e análises mais precisos de seus 

componentes químicos com finalidade de verificar o efeito destes sobre os 

organismos de animais e posteriormente em humanos (Newal et al., 

2002). 

As plantas medicinais colaboram nas práticas de saúde 

principalmente por motivos econômicos e sociais. Diversas pesquisas 

foram realizadas com base no conhecimento popular de plantas, que 

devem ser testadas antes de disponibilizadas como medicamento 

(Langley, 2000).  

No Brasil, o Ministério da Saúde, através da Secretaria 

de Ciência, Tecnologia e Insumos, elaborou Diretrizes e Linhas de Ação 

em diversas áreas. Publicados sob forma de Decreto Presidencial no5813 

em 22 de janeiro de 2006, com as diretrizes objetivando garantir à 

população o acesso seguro e uso racional de plantas e fitoterápicos, 

mantendo a biodiversidade sustentável, além de inová-la com base no 

desenvolvimento tecnológico (Brasil, 2006 b). 

Quando um fitoterápico é indicado, a idéia inicial não é 

a substituição dos medicamentos registrados e já comercializados, mas 

tornar mais abrangente a quantidade de opções terapêuticas. Os 

fitoterápicos podem oferecer aos pacientes medicamentos equivalentes 

com espectros de ação adequados, também registrados e muitas vezes 

mais baratos, atuando também de forma complementar as medicações 

existentes (Simões et al. 1999). 



28

Além do custo e opção terapêutica, outro objetivo do 

emprego destes medicamentos é a valorização da cultura popular e a 

possibilidade do desenvolvimento da indústria farmacêutica local (Simões 

et al., 1999). 

A partir de 1950 os medicamentos que continham os 

substâncias ativas extraídas de plantas, ou seus derivados sintéticos, 

começaram a ser desenvolvidos e comercializados com alguma 

normatização em farmácias. Poucas foram as plantas medicinais 

estudadas com base nos protocolos modernos, permitindo reunir 

informações necessárias para a utilização destas substâncias. Grande 

parte do conhecimento atual sobre a maioria das plantas é obsoleta 

quando comparada a grande capacidade de desenvolvimento técnico-

científico disponível (Simões et al., 1999).  

A prática exclusiva da medicina alternativa através da 

utilização de plantas medicinais é mais comum na população de baixa 

renda. Estes indivíduos acabam obtendo as plantas em mercados, no 

canteiro de suas residências e em alguns casos, na natureza. Grande 

parte dos usuários tem uma imagem errônea que fitoterápicos são 

remédios que, além de eficazes, são mais seguros e sem efeitos 

colaterais por serem naturalmente balanceados. Para este argumento, 

tomam como garantia o emprego prolongado na espécie humana sem 

relatos de possíveis malefícios causados pelos fitoterápicos (Simões et 

al., 1999). 

Segundo o Ministério da Saúde do Brasil, os trabalhos 

de pesquisa com plantas medicinais normalmente originam medicamentos 

em menor tempo, com custos inferiores e mais acessíveis à população 

(Brasil, 2006 b). Porém, para o uso destes medicamentos é essencial o 

estudo da farmacognosia de cada planta alem da avaliação dos indivíduo 

e sua reação aos farmacos. 

Farmacognosia é a área da farmácia que estuda os 

princípios ativos das plantas. O termo deriva de duas palavras gregas, 



29

pharmakon, ou droga, e gnosis ou conhecimento. Nesta ciência são 

realizadas todas as descrições e mensurações com identificação, 

extração e isolamento de substâncias e identificação dos componentes 

bioquímicos. São realizados os estudos nas áreas de fitoquímica, 

microbiologia, biossíntese e biotransformação das substâncias ativas, 

quimiotaxia entre outras ciências bioquímicas e farmacológicas (Simões et 

al., 1999). 

Apesar de os fitoterápicos serem originados a partir de 

plantas naturais as substâncias químicas contidas nestes, quando usados 

como medicamento, são reconhecidas pelo corpo humano como um 

elemento estranho ao organismo, chamada de um xenobiótico. A 

efetividade de um infuso, tintura, cápsula, ou mesmo um conjunto de 

plantas, pode também ser devido ao efeito placebo de substâncias 

eficientes no estresse, hipertensão, ansiedade, úlceras gástricas e nos 

diversos tipos de dores. Algumas vezes, estes medicamentos são 

considerados “curativos” para patologias como diarréias, cólicas 

intestinais, tosse, resfriado ou males mal definidos como indisposição 

geral. Também é importante avaliar até que ponto a auto-sugestão do 

paciente pode interferir minimizando os sintomas e postergando a busca 

por auxílio médico (Simões et al., 1999). 

Como qualquer medicamento, o mau uso de 

fitoterápicos pode ocasionar problemas à saúde, como alterações na 

pressão arterial, problemas no sistema nervoso central, fígado e rins, 

podendo levar a internações hospitalares e, dependendo da forma de uso, 

levar ao óbito (ANVISA, 2009). A toxicidade pode apresentar não apenas 

efeitos imediatos; mas também a longo prazo, muitos dos quais de 

maneira assintomática como os carcinogênicos, hepatotóxicos e 

nefrotóxicos (Simões et al., 1999).  

É fundamental conhecer os compostos químicos 

presentes nos fitoterápicos. Desta forma é possível ter cuidado para 

possíveis interações medicamentosas na associação de medicamentos 



30

com as plantas medicinais resultando em efeitos indesejados (ANVISA 

1999). 

O uso tradicional e popular de uma planta não faz com 

que seja considerada eficiente e segura para consumo. Este tipo de 

avaliação só é possível após diversos testes que apresentarão evidências 

comprobatórias que os benefícios gerados pela sua ingestão suplantam 

os riscos gerados, quando Órgãos Governamentais conferem a 

autorização para o consumo da mesma (Brasil, 2006 b).  

2.1.2  Diferença entre a fitoterapia e o alimento a base de plantas 

A busca pelo estilo de vida mais equilibrado e natural 

acarretou no aumento do interesse para o uso de plantas medicinais com 

finalidades preventivas ou terapêuticas. Ao consumir produtos naturais, 

procura-se elevar a qualidade de vida, promovendo saúde e bem-estar. 

Porém, muitos utilizam termos como fitoterápicos, homeopáticos, plantas 

medicinais de forma errônea e genérica. 

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária 

(ANVISA), existem diferenças entre as plantas medicinais e os 

fitoterápicos. As plantas medicinais são aquelas capazes de aliviar ou 

curar enfermidades tendo tradição de seu uso como remédio em uma 

população ou comunidade. Para usá-las, é preciso conhecer a planta, 

saber onde colher e como preparar (ANVISA, 1999). 

As plantas medicinais podem ser comercializadas no 

Brasil em farmácias e ervanarias (casas especializadas na 

comercialização de plantas), desde que não apresentem estrita indicação 

terapêutica definida. O acondicionamento deve ser adequado e sua 

classificação botânica declarada. Alimentos como chás e infusões à base 

de ervas são classificados no Brasil como alimentos, tendo suas 



31

normatizações através do Ministério da Agricultura e Fazenda (ANVISA, 

1999). 

Porém, quando a planta medicinal é trabalhada e 

industrializada para se obter um medicamento, o resultado é o 

fitoterápico. Este processo de industrialização evita contaminações 

(microorganismos, agrotóxicos entre outras substâncias estranhas), 

padroniza a quantidade e a forma certa a ser usada, permite maior 

segurança para pesquisa e posterior utilização (ANVISA, 1999). 

Os medicamentos fitoterápicos são obtidos 

empregando-se exclusivamente derivados de princípio vegetal (extrato, 

tintura, óleo, cera, exsudato, suco, entre outros). Devendo seguir padrões 

de qualidade da ANVISA como todos os medicamentos, apresentando 

efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança 

para consumo (ANVISA, 1999). 

Para garantir eficácia e segurança, estudos 

etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas em bibliografia e 

publicações indexadas além de estudos farmacológicos, toxicológicos, 

pré-clínicos (in vivo e in vitro) e clínicos devem ser realizados para 

validação (ANVISA, 1999).  

A qualidade deve ser alcançada adotando padrões 

como o controle de matéria-prima, produto acabado, embalagem, 

formulação farmacêutica manipulada e estudos de estabilidade final do 

fitoterápico. Quando industrializados, os fitoterápicos devem obter registro 

na ANVISA e no Ministério da Saúde antes da distribuição e venda 

comercial (ANVISA, 1999). 

Ainda é comum o comércio de plantas medicinais na 

forma de suplementos nutricionais. Assim a inscrição é realizada no 

Ministério da Agricultura, aonde são direcionados para suplementação 

nutricional e não são submetidos ao controle de qualidade realizado em 

produtos fitoterápicos. Não existe o controle rigoroso sobre substâncias e 

quantidades declaradas nos rótulos, bem como possíveis compenentes 



32

químicos presentes na formulação, os quais podem resultar em interações 

indesejáveis (Turolla, 2006). 

 2.1.3  Legislação para os produtos fitoterápicos 

“A Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 

é autarquia especial vinculada ao Ministério da Saúde, criada pela Lei 

no.9.782, de 26 de janeiro de 1999, regulamentada pelo Decreto no.3.029, 

de 16 de abril de 1999, e tem por finalidade institucional promover a 

proteção da saúde da população, por intermédio do controle sanitário da 

produção e da comercialização de produtos e serviços submetidos à 

vigilância sanitária, inclusive dos ambientes, dos processos, dos insumos 

e das tecnologias a eles relacionados” (ANVISA, 1999)  

A definição de produto fitoterápico segundo a 

Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde do Brasil 

(Portaria no.6) relata que a transformação de uma planta em medicamento 

deve preservar a integridade química e farmacológica do vegetal, 

assegurando constante ação biológica e segurança da sua utilização, 

valorizando seu potencial terapêutico. (Brasil, 1995 b) 

Para uma planta chegar a ser um medicamento 

fitoterápico, estudos prévios devem ser realizados. Nestes, são avaliados 

os aspectos botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, 

toxicológicos, de desenvolvimento de tecnologias analíticas e 

tecnológicas. (Brasil, 1995 b). Os objetivos destes estudos estão 

dispostos no quadro abaixo. 

 



33

 

Quadro 1 - Metodologia de análise fitoquímica segundo Sonaglio et al., 
1999. 

 

Estudo  Descrição 
Estudos 
Botânicos  

Objetivam a identificação da espécie vegetal. É realizado analisando 
características anatômicas e morfológicas, evidenciando suas 
peculiaridades da espécie e em última instância, que seja matéria prima 
vegetal. É importante detectar as características botânicas 
comparativas e, caso necessário, identificar a presença de um ou mais 
espécimes adulterantes. 

Estudos 
Agronômicos  

Objetivam a produção homogênea e abundante de matéria-prima 
vegetal, preservando a espécie e mantendo a biodiversidade. Estes 
estudos investigam a otimização da produção de biomassa e de 
constituintes bioativos através de estudos edafo-climáticos (estudos 
que avaliam a relação planta-solo-clima para plantio, influenciando o 
desenvolvimento das culturas e também definindo os sistemas de 
produção.), de micropropagação, inter-relações ecológicas, densidade 
de plantio, necessidades nutricionais, ocorrência de pragas, 
beneficiamento e armazenagem, além de possível melhoramento 
genético da espécie.  

Estudos 
Fitoquímicos  

Responsáveis pelo isolamento, elucidação estrutural e identificação dos 
constituintes mais importantes dos vegetais. São estudados diversos 
compostos, entre os quais, as substâncias originárias do metabolismo 
secundário, responsáveis ou não pela ação biológica. Dentre estes, o 
estabelecimento de marcadores químicos passíveis de serem 
monitorados, possibilitando estudos de estabilidade dos produtos 
intermediário e final (polifenóis e taninos, por exemplo).  

Estudos de  
Atividades 
Biológicas  

Incluem nesta etapa a avaliação de atividade farmacológica e 
toxicológica de substâncias isoladas, frações obtidas ou extratos totais 
do vegetal. Este é um aspecto fundamental a ser estudado para avaliar 
a transformação da planta em produto fitoterápico. 

Estudos de 
Desenvolvimento 
de Metodologias 
Analíticas 

Os métodos analíticos garantem a constância de ação terapêutica e a 
segurança de utilização do fitoterápico além de possibilitar a avaliar 
aspectos relativos à obtenção da homogeneidade dos lotes de 
produção. Podem ser avaliados sob duas formas: 
a) Avaliar a substância ativa (ou grupo destas) e o perfil qualitativo dos 
constituintes químicos de interesse, presentes estes na matéria-prima 
vegetal, produtos intermediários e produto final.  
b) avaliação das características físicas e físico-químicas dos produtos 
tecnologicamente transformados, podendo interferir sobre o perfil 
biofarmacêutico do produto fitoterápico. 



34

2.1.4  A liofilização conservando os princípios ativos das plantas 

“A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) 

aprova a liofilização como um método para conservação de alimentos. 

Esta regulamentação é determinada pela Comissão Nacional de Normas 

e Padrões para Alimentos, de acordo com o artigo nº 64, do Decreto Lei 

nº986, de 21 de outubro de 1969“ (Anvisa, 1978). 

A liofilização ou desidratação a frio é uma forma para 

remoção do líquido de diversos tipos de materiais. Possibilita o aumento 

da vida útil do produto uma vez que com a diminuição da atividade de 

líquidos há a redução do peso e do volume, permitindo a estocagem por 

longo período de tempo sem alterar as características físico-químicas do 

material (Harris, 2002; Tatini Junior, 2008). 

O processo de desidratação ocorre por meio da 

sublimação do solvente, geralmente água, transformada em gelo após o 

congelamento do produto a ser processado. Para que ocorra a 

sublimação do gelo e não a evaporação da água como ocorre nos 

processos tradicionais. O material deve permanecer no estado de 

congelamento e inerte durante quase toda a fase da secagem. A água irá 

sublimar do estado sólido (gelo) para o gasoso (vapor) quando as 

moléculas tiverem energia suficiente para ficarem livres, mas sem 

condições de formar líquidos (Harris, 2002; Tatini Junior, 2008).  

Neste processo, alguns cuidados devem ser 

observados. É fundamental a utilização de um equipamento com um 

condicionador de ambiente adequado e potência suficiente para manter 

as condições ideais de temperatura e pressão. As substâncias 

apresentam diferentes valores de temperatura e pressão máxima para 

que ocorra o processo de liofilização. A água pura apresenta o limite 

superior de temperatura ao qual pode ocorrer esta passagem com 0.ºC e 

pressão máxima de 4,58.mmHg. Normalmente deve-se operar em 



35

temperaturas inferiores a –20 ºC e em pressões inferiores a 0,25 mmHg. 

(Coelho Junior, 2008). Por exemplo, ser realizado o processo com a 

temperatura a 0.°C e mantendo a pressão abaixo de 0,06 Atm. Em 

câmara a vácuo, a água alcançará a temperatura suficiente para derreter, 

mas não terá a pressão para formar um líquido passando por sublimação 

para forma de gás (Harris, 2002; Tatini Junior, 2008). 

A temperatura de congelamento varia em função da 

natureza e concentração da substância dissolvida. O processo de 

congelamento deve ser rápido, para que sejam formados micro-cristais de 

gelo sem danificar a membrana celular. Quando o congelamento é lento 

os cristais formados são grandes levando ao rompimento da membrana 

celular, causando a perda do líquido citoplasmático. No congelamento 

rápido, a estrutura do produto mantém-se intacta, são conservadas 

características originais permitindo após a re-hidratação a recomposição 

normal (Harris, 2002; Coelho Junior, 2008; Tatini Junior, 2008) 

A liofilização é o processo que possibilita a remoção da 

água contida em um produto. As estruturas protéicas e o conteúdo de 

vitaminas, especialmente as termolábeis, são preservadas uma vez que o 

calor não é aplicado ao produto. Assim, características sensoriais como 

sabor, odor e aroma dos produtos não são alterados (Harris, 2002). 



36

2.2 Punica granatum L.

2.2.1  Histórico  

A Punica granatum L. é um arbusto lenhoso, 

ramificado, da família Punicaceae, nativa da região que abrange, desde o 

Irã até o Himalaia, ao noroeste da Índia. Tem sido cultivada desde há 

muito tempo por toda a região Mediterrânea da Ásia, África e Europa. 

Tem folhas pequenas, rijas, brilhantes e membranáceas, flor disposta nas 

extremidades dos ramos, de cor vermelha-alaranjada e frutos esféricos, 

com muitas sementes em camadas, as quais se acham envolvidas em 

arilo polposo, conhecido no Brasil pelo o nome de romã (Lorenzi; Souza, 

2001; Sheets et al., 2004; Werkman et al., 2008) 

Tem importância milenar, está presente nos textos da 

Bíblia sendo associada às paixões e à fecundidade humana. Na Grécia 

era considerada um símbolo do amor e fecundidade, representando vida, 

renascimento e indissolubilidade do casamento. Sua árvore é consagrada 

à deusa Afrodite, pois se acreditava em seus poderes afrodisíacos. Em 

Roma, a romã era considerada nas cerimônias e nos cultos como símbolo 

de ordem, riqueza e fecundidade (Morton, 1987). 

Na religião judaica a Punica granatum L. têm um 

profundo significado no ritual do ano novo, representando simbolicamente 

que, o ano que chega, sempre será melhor do que aquele que vai 

embora. Esta é originada pela história quando os judeus chegaram à terra 

prometida, após abandonarem o Egito, os 12 “espias” que foram enviados 

para aquele lugar voltaram carregando romãs e outros frutos como 



37

amostras da fertilidade da terra que Jeová (Deus) prometera (Morton, 

1987; Manica, 2007).  

Foi usada em rituais de Zoroastro na Pérsia antiga, 

onde a beleza de seu arbusto, flores e frutas simbolizam sanidade, 

fertilidade e abundância (Morton, 1987). 

No budismo, a Punica granatum L. representa a 

essência de influências favoráveis. No Japão, ela é conhecida como 

Kishimojin e é consumida por mulheres inférteis. Na China é representada 

na arte da cerâmica, também simbolizando fertilidade e abundância. No 

Cristianismo, representa ressurreição, vida eterna e fertilidade. No 

islamismo também tem um papel especial como símbolo de fertilidade e 

abundância (Langley, 2000). 

Na Idade Média era freqüentemente considerada como 

fruto cortês (a realeza consumia tornando-o um fruto da elite), aparecendo 

também nos contos e fábulas de muitos países. Os povos árabes 

salientavam os poderes medicinais dos seus frutos e como alimento 

(Manica, 2007). Além de aparecer citada em várias tradições primordiais, 

a Punica granatum L. é também utilizada em escudos de associações 

médicas (Morton, 1987). 

Tanto a planta como o fruto, são utilizados em 

residências ou em banquetes para efeito decorativo com a beleza de suas 

flores e seus frutos, além de utilizá-lo como cerca viva ornamental. 

Segundo uma antiga crença popular, se levadas na carteira três sementes 

de romã, "dinheiro nunca há de lhe faltar" (Manica, 2007). 

O seu cultivo é realizado em mais de 100 países do 

mundo. Dos países do Mediterrâneo, atravessou o Atlântico e acabou 

aportando no Brasil, onde encontrou condições favoráveis para um 

crescimento vegetativo, florescimento, frutificação e produção de frutos de 

primeira qualidade. O seu maior interesse no mundo está no seu cultivo 

para o consumo como fruta fresca. Também tem a sua aplicação em 



38

clínicas especializadas no campo da medicina moderna e para receitas 

especializadas (Manica, 2007). 

2.2.2  Utilização e estudos já realizados 

Preparos obtidos de diferentes partes da Punica 

granatum L. (flor, fruto e casca da árvore) têm sido popularmente usados 

para tratar vários problemas de saúde, predominantemente gastro-

intestinais (Ross et al., 2001). O suco da porção que envolve as sementes 

da Punica granatum L., é usado como terapia para úlceras bucais e 

genitais, alivia dores de ouvido e é utilizado no tratamento de dispepsia, 

diarréia e hanseníase. As flores são usadas para tratamento da doença 

periodontal, prevenindo a perda dentária; possuem atividade adstringente 

e hemostática e são utilizadas no tratamento do diabetes mellitus. Os 

brotos das flores, secos e pulverizados, são usados como remédio para a 

bronquite (Langley, 2000). No México, preparações de diferentes partes 

da fruta são usadas para tratamento de diarréia, aftas, parasitismo, 

abscessos, tosse, angina, inflamação urinária e injúrias da pele (Navarro 

et al., 1996).  

Embora muitos trabalhos científicos já tenham sido 

realizados, estudando as propriedades medicinais da Punica granatum L. 

obtemos informações mais precisas a respeito do potencial farmacológico 

dessa planta que vem sendo usada de forma indiscriminada ultimamente. 

Dentre os diversos componentes fitoquímicos da planta, destacam-se 

polifenóis, contendo os flavonóides e as antocianinas (punicalgina e ácido 

elágico). Estes componentes são responsáveis por potente ação 

antioxidante (diminuindo os valores sanguíneos de LDL), antiinflamatória 

e analgésica (Afaq et al., 2004; Pereira et al., 2005); e pela capacidade 

biológica anti-esclerosante (Seeran et al., 2004; Hidaka et al., 2005). A 



39

romã também é uma fonte rica em taninos, pectinas (Prashant et al., 

2001; Hidaka et al., 2005), glicosídeos e açúcares (Ross et al., 2001) e 

alcalóides que podem ser tóxicos em altas dosagem (Vidal et al., 2003). 

As diferentes concentrações dos componentes 

fitoquímicos dependem de como é realizada a extração (Seeran et al., 

2004). Prashant et al. (2001) comprovaram que, com diferentes 

processamentos para a extração, são obtidas além de concentrações 

diferentes, diferentes componentes ativos retirados das plantas. O 

processamento com petróleo-éter (60-80%) enfatiza a remoção de 

esteróis; com clorofórmio (CHCl3), metanol (MeOH), taninos e alcalóides, 

e com água (H2O), taninos. 

Encontramos na literatura diversos autores relatando 

propriedades de plantas como a Punica granatum L., Carthamus lanatus, 

Cirsium tenoreanum, Buchholzia coriacea entre outras. Relataram suas 

capacidades antimicrobianas e antivirais, sendo que, em alguns casos, foi 

estudada a citotoxicidade destas plantas (Taskova et al., 2002; Ajaiyeoba, 

2003; Loizzo, 2004).  

Katsube et al. (2003) estudando componentes 

fitoquímicos das frutas vermelhas, com ênfase nos pigmentos fenólicos 

observaram em maior abundância as antocianinas. A antocianina possui 

atividade antioxidante, participando como mediadora das funções 

fisiológicas relacionadas à supressão do câncer, uma vez que age como 

inibidora de crescimento celular. Os flavonóides, também encontrados em 

abundância nestas frutas vermelhas, com capacidade de induzir células 

cancerígenas à apoptose. Desta forma, a associação de flavonóides e 

antocianinas é importante na prevenção do câncer. 

Pereira et al. (2005) avaliaram, o potencial mutagênico 

e quimioprotetor do extrato alcoólico da Punica granatum L., por meio do 

teste de micronúcleo. Utilizando camundongos swiss machos. Os autores 

estudaram o efeito mutagênico da romã, administrando uma dose única 

de PG em diferentes concentrações (12,5; 25; 50; 75 mg/kg), vinte e 



40

quatro horas depois, a medula óssea foi removida e realizado o estudo do 

micronúcleo dos eritrócitos. Os autores concluíram que a Punica 

granatum L. produzia redução dose-dependente significativa (Tukey e 

ANOVA p<0,05) na freqüência de células micronucleadas, mostrando que 

a dose única não induziu a formação de micronúcleos. 

Pereira et al. (2005) avaliaram o efeito quimioprotetor 

do extrato alcoólico de Punica granatum L., em diferentes concentrações 

(12,5; 25; 50 e 75 mg/kg), através de dois protocolos que utilizaram a 

ciclofosfamida, potente imunosupressor utilizado no tratamento do câncer 

de alta capacidade proliferativa neoplásica (Garcia et al. 2004). O extrato 

alcoólico de Punica granatum L. foi administrado no grupo 1 por dez dias 

antes da administração de ciclofosfamida; no grupo 2, o extrato de Punica 

granatum L. foi ministrado por dez dias depois da ministração do 

medicamento. Foram retiradas as medulas ósseas e realizados os testes 

de micronúcleo nos diferentes grupos. Os dados obtidos indicaram o 

potencial quimioprotetor do extrato da Punica granatum L. na prevenção e 

reversão dos danos ao DNA. 

Afaq et al. (2004) relataram que, para a prevenção do 

câncer, agentes com capacidade de intervir em mais de um ponto crítico 

no processo da carcinogênese, têm vantagem sobre agentes de único-

alvo. Para avaliar o potencial antineoplásico da Punica granatum L., foi 

feito o extrato utilizando acetona como meio de depuração e esta solução 

foi aplicada em ratos CD-1. A aplicação tópica (2 mg/rato) foi realizada 30 

minutos antes da aplicação de TPA, potente indutor na formação de 

câncer de pele (3.2 nmole/rato). Foi verificada inibição significativa, de 

forma tempo-dependente. Os resultados evidenciaram os efeitos anti-

tumorais do extrato da Punica granatum L. em ratos CD-1, por meio da 

inibição dos biomarcadores da promoção do tumor, sugerindo que talvez 

exerça atividade quimio-preventiva, em outros modelos do tumor. Ainda 

são necessários novos estudos para avaliação do componente presente 

no extrato de Punica granatum L., que apresente estas funções. 



41

Adams et al. (2006) relataram que a Punica granatum 

L. em forma de suco pronto e comercializado (POM Wonderful – Los 

Angeles - CA), reduz de forma dose-dependente a expressão da proteína 

de COX-2. Os testes foram realizados em cultura de células de câncer de 

colon (HT-29) e normatizados para 50mg/L da punicalagina. Foi 

observada a supressão de 79% da expressão da proteína de COX-2. 

Comprovando sua ação antiinflamatória. 

Aviran et al. (2000) testaram o efeito antioxidativo do 

suco de Punica granatum L. (POM Wonderful – Los Angeles -CA), 

realizando testes em humanos. O estudo foi desenvolvido em duas 

etapas; na primeira, os voluntários (entre 20 e 35 anos, saudáveis, não 

estando sob tratamento médico) receberam 50 mL de suco de Punica 

granatum L. por dia (1.5 mol total de polifenóis), durante duas semanas. 

Em uma segunda etapa, os participantes ingeriram de 20 a 80 mL/dia 

(0.54–2.16 mol total de polifenóis/dia), durante 10 dias. Os autores por 

meio de exames sanguíneos verificaram que o suco de Punica granatum 

L. diminui a formação de placas ateromatosas nas artérias.  

Neurath et al. (2004), em estudo in vitro, verificou que o 

suco de Punica granatum L. possui inibidores para o envelope do vírus 

HIV-1, correspondendo a uma classe de drogas anti-retrovirais ainda 

escassas. Ele atuava bloqueando o sítio de ligação entre o vírus e o 

linfócito T CD4, porém, este mecanismo ainda não foi completamente 

esclarecido. 

A ação do suco de Punica granatum L. na diabetes foi 

estudada por Huang et al. (2004). Segundo os autores, o suco de Punica 

granatum L. apresenta um componente denominado GA (ácido 3,4,5-

trihidroxibenzoico), com propriedade de ativar PPAR-�, molécula 

importante no metabolismo, quando induzida sua expressão ocorre a 

melhora na sensibilidade dos receptores de insulina à glicose, atuando 

sobre o diabete tipo II. Este mesmo componente age diminuindo as 

citocinas pré-inflamatórias (minimizando desordens inflamatórias) e 



42

induzindo a contração e o relaxamento endotelial, prevenindo doenças 

vasculares. 

Ross et al. (2001) estudaram a ação da Punica 

granatum L. sobre a resposta imune, procurando enfatizar a resposta 

humoral. Para tanto, foi utilizado o extrato aquoso na dose de 100mg/kg, 

via oral, na água de beber dos animais. Para o experimento foi aplicado 

0,1mL do derivado puro de proteína subcutaneamente em coelhos e 

avaliada a migração leucocitária usando o teste de aglutinação, no tubo 

de Widal. Os resultados mostraram aumento, tanto para a resposta 

humoral, quanto para a mediada por células, nos animais que receberam 

a Punica granatum L., mas os autores enfatizaram a necessidade de 

avaliação dos métodos destas respostas. Pereira et al. (2005) também 

citaram a atividade imunomoduladora da Punica granatum L. 

Werkman et al. (2008) enfatizaram a 

multifuncionalidade desta fruta como fitoterápico, descrevendo a 

capacidade antimicrobiana e antiinflamatória, além de ações terapêuticas 

na odontologia e em especialidades médicas. 

Toi et al. em 2003 estudaram a inibição de 

angiogenese pelos constituintes do extrato de PG, os autores explicaram 

que esta ocorria devido a diminuição do fator de crescimento endotelial 

em células de câncer de mama MCF-7 e linhagem de células endoteliais 

de cordão umbilical.  

2.3  Testes de Citotoxicidade 

Os protocolos sugeridos para estudos de 

medicamentos, inclusive de medicamentos fitoterápicos, são extensos e 

repletos de questões éticas. A complexidade dos estudos tem o objetivo 

de garantir a ausência da toxicidade e a efetividade terapêutica dos 



43

medicamentos de acordo com o que é determinado na Declaração de 

Helsinki (Simões et al. 1999, Schmalz, 2002).  

Para os fitoterápicos, os processos de estudo são 

extensos até que uma planta tenha sua ação comprovada ou não. A 

planta é avaliada em diferentes etapas, na etapa botânica é feita a 

confirmação e identificação da planta recebendo esta uma certificação 

(exsicata). Na etapa farmacêutica, acontecerá o preparo da fórmula 

farmacêutica a ser administrada, tendo a qualidade, uniformidade e 

estabilidade garantidas para os testes pré-clínicos e clínicos (Simões et 

al., 1999; Rogero et al., 2003). 

Assim, ensaios farmacodinâmicos e toxicológicos 

devem ser realizados em diferentes níveis: pré-clínicos e clínicos, 

avaliando a relação risco/benefício. Na etapa de ensaios pré-clínicos 

temos ensaios biológicos de forma geral, testes laboratoriais in vitro e in 

vivo com células e animais respectivamente. Quando autorizados os 

testes que avaliam a citotoxicidade in vitro (primários) e quando obtidos 

resultados satisfatórios nos testes primários, os testes de 

biocompatibilidade in vivo (secundários) deverão ser realizados (Camps et 

al., 1992). 

Quando no organismo, o fitoterápico passará por 

diversos processos químicos de biotransformação que possivelmente 

originarão um ou mais produtos, sendo que alguns destes podem ser ou 

tornarem-se tóxicos. O estudo biológico do produto fitoterápico deve 

iniciar a partir da observação do mecanismo de ação dos componentes 

citotóxicos presentes no fitoterápico, os testes in vitro são os eleitos para 

iniciar este tipo de avaliação (Rogero et al., 2003;). 

De acordo com o Órgão Internacional de Padronização 

(International Standard Organization - ISO), ensaios in vitro são os 

primeiros testes para avaliar o quanto um material é biocompatível ou 

não. Para tanto, são publicados documentos normatizando as diversas 

etapas experimentais. Diversos são os testes de citotoxicidade descritos 



44

na ISO 10993, que padronizam e orientam as formas que estes devem 

ser conduzidos, entre eles os testes utilizando a cultura celular (ISO, 

1999). 

Muitas pesquisas são desenvolvidas utilizando os 

estudos de citotoxicidade para avaliar medicamentos in vitro. O modelo de 

eleição é o realizado com cultura de células que podem ser obtidas 

através de cultura primária (explante) ou compradas comercialmente 

(Camargo et al., 2008). Através destes estudos podem ser realizadas 

avaliações prévias do comportamento biológico dos fitoterápicos em 

diferentes tecidos (Schmalz, 2002; Cavalcanti et al., 2005; Wang et al., 

2006). 

Os estudos com cultura de células são passíveis de 

determinar efeitos citotóxicos dos materiais que permanecerão em contato 

com tecidos humanos e devem ser feitos através de técnicas rápidas, 

reprodutíveis e monitorados os efeitos ao longo do tempo experimental 

(Schmalz, 2002; Cavalcanti et al., 2006).  

2.3.1  Cultura celular 

A cultura celular consiste no conjunto de técnicas que 

permitem o cultivo e a manutenção de células fora do organismo do qual 

são provenientes. Estas são mantidas preservando características 

próprias como a capacidade de desagregação (mecânica ou enzimática) 

do tecido original. Existem culturas a partir de tecidos animais (incluindo 

tecidos humanos) e vegetais.  

Em diversas pesquisas (ViIela et al., 2002; Rogero et 

al., 2003; Daguano et al., 2007), testes in vitro são realizados em culturas 

de células por estas poderem ser armazenadas por um período bastante 

longo, permanecendo viáveis quando descongeladas. Entre as vantagens 



45

da cultura celular estão: a possibilidade de estudar fenômenos 

inacessíveis em tecidos intactos; e a obtenção de células com boa 

homogeneidade e bem caracterizadas (em nível fisiológico e funcional).  

Entretanto, faz-se necessário controle e constante 

observação das células cultivadas, avaliando possíveis instabilidades das 

características celulares e perda de características fenotípicas, o que 

pode inviabilizar a utilização desta. Assim, são necessários operadores 

experientes para a utilização da técnica de cultura celular, que apresenta 

limites para a extrapolação dos resultados obtidos do modelo para o 

organismo intacto (ViIela et al., 2002; Rogero et al., 2003; Daguano et al., 

2007). 

No entanto, as aplicações da cultura de células na 

produção de vacinas antivirais, na compreensão de fenômenos de 

neoplasia, no estudo da imunologia e em ensaios de fármacos e 

cosméticos in vitro, compensam largamente todo o investimento em 

recursos econômicos e humanos que exigem. São duas as formas de 

obtenção da cultura celular. A cultura primária e cultura secundária, 

classificadas a partir da forma que estas células são obtidas (ViIela et al., 

2002; Rogero et al., 2003; Daguano et al., 2007).  

2.3.2.  Cultura celular primária  

A cultura primária é preparada diretamente dos tecidos 

de um organismo. Quando obtido o fragmento de tecido, este é colocado 

em uma placa de petri com meio próprio para o início do cultivo celular 

acrescido de 10% de Soro Bovino Fetal (SBF). O tecido pode ser 

fragmentado após a biópsia ou colocado íntegro (inteiro) para os 

procedimentos subseqüentes de crescimento celular (Soriano, 2005). 



46

Uma vez na placa, com meio de cultura específico para 

a célula a ser cultivada e com nutrientes necessários para citotoxicidade, 

as células entram em mitose, tomando o fundo da placa onde estão. Um 

exemplo de cultura primária acontece na obtenção de fibroblastos de 

mucosa oral humana a partir de uma biópsia (Soriano, 2005) (Figura 1).  

 

 
Figura 1 - Esquema para obtenção de uma cultura primária a partir de um 

explante. 
 

Muggleton-Harris e Hayflick, em 1976, postularam que 

todo tipo de célula normal tem um potencial intrínseco limitado de 

citotoxicidade, sendo o núcleo responsável pelo controle do número de 

divisões que cada célula vai realizar.  

As células originadas de culturas primárias apresentam 

um período de vida limitado variando com o tipo de tecido e espécie. O 

número de divisões mitóticas, também chamadas “passagens”, são 



47

limitadas devido à pré-determinação genética, capaz de controlar o 

número de gerações celulares. Em um dado período de suas vidas, estas 

células entram em estado de senescência, entram em estágio Go (sem 

atividade metabólica) e posteriormente morrem (Maluf; Pompéia, 2005; 

Antonialli Junior, 2008).  

2.3.3.  Cultura celular secundária 

A cultura celular secundária compreende a obtenção de 

uma cultura imortalizada a partir de células retiradas de uma cultura 

primária, com alterações genéticas nucleares ou linhagens celulares 

obtidas (Martins et al., 2005). 

No processo de alteração molecular pode ocorrer a 

transformação de uma célula normal para célula neoplásica. Quando 

reportamos ao ciclo celular e suas fases (G1, S, G2, M), são observados 

diferentes conjuntos de genes expressos ou não (“ativados” ou 

“silenciados”) (Martins et al., 2005). 

Os genes estão envolvidos no controle do ciclo e da 

citotoxicidade celular. Caso existam alterações, a proteína resultante da 

síntese de seu produto poderá não ser constituída ou ter sua função 

alterada. Se esta proteína for importante para determinado passo do ciclo, 

a sequência de eventos programada pelo código genético será alterada. A 

célula poderá então ter três comportamentos distintos: a correção do erro 

através de mecanismos de reparo do DNA; apoptose; ou alteração 

permitindo sua perpetuação, sendo esta nova condição transmitida para 

as células filhas (Belizário, 2002). 

Esta última opção origina uma população de células 

com alterações no DNA e nos mecanismos de controle da divisão e da 



48

citotoxicidade celular, de forma irrestrita, contribuindo para transformação 

do fenótipo celular (Belizário, 2002). 

A obtenção de uma linhagem de células transformadas 

é possível a partir da coleta de células de um tumor maligno, colocando-

as em meio de cultura para crescimento. Em cultura, apresentarão padrão 

de crescimento diferente das células extraídas de tecidos normais, porém 

serão mantidas características como: crescimento independente de 

mecanismos de ancoragem, menor necessidade de fatores de 

crescimento para proliferarem e ausência de inibição por contato. Essas 

características conferem a condição de células transformadas. (Martins et 

al., 2005). 

Também é possível a obtenção de células 

transformadas a partir de alterações moleculares no núcleo de células 

originárias de uma cultura primária. Com a manipulação estas células não 

entrarão em Go, acarretando um comportamento anômalo, que 

compromete o ciclo de crescimento e citotoxicidade, sendo consideradas 

desta formas imortais. As linhagens celulares estabelecidas a partir de 

células imortalizadas passam a dividir indefinidamente. Elas permanecem 

com algumas características semelhantes às células normais em cultura 

como a adesão ao substrato, a necessidade de fatores de crescimento, 

característica de inibição por contato e manter um padrão de crescimento 

organizado em monocamadas. Apesar de imortalizadas, essas células 

ainda dependem do meio adequado para crescer e se dividir. (Martins et 

al., 2005). 

As células imortalizadas e transformadas apresentam 

características semelhantes às células cancerosas, mas não podem ser 

consideradas como tal, pois para esta classificação, precisam adquirir a 

propriedade de gerar metástase (Martins et al., 2005). 

Estas células podem ser obtidas comercialmente 

através de centros de pesquisa, laboratórios, empresas farmacêuticas, 

entre outros, sempre com certificação de procedência e qualidade. 



49

Quando é obtida uma linhagem de células (neoplásicas 

ou não), estas são enviadas ao laboratório ou comprador em frascos de 

cultura fechadas com meio de cultivo celular completando todo o volume 

interno e com as células aderidas ao fundo. No momento que chegam ao 

laboratório estas células são removidas da garrafa de origem e 

transferidas para novas garrafas para o crescimento (Figura 2). 

 

 
Figura 2 - Desenho esquemático de obtenção e cultivo de células por 

cultura secundária. 

2.4  Testes de citotoxicidade com fitoterápicos 

O teste de citotoxicidade de produtos fitoterápicos é de 

fundamental importância, pois o uso indiscriminado dos mesmos pode 

determinar reações adversas, intoxicações, lesões no organismo do 

paciente acarretando riscos à saúde humana (Taskova et al., 2002; 

Ajaiyeoba, 2003; Rogero et al., 2003; Garcia, 2004; Loizzo, 2004). 

Pesquisadores buscam medicamentos atuantes sobre 

células neoplásicas, seja suprimindo seu crescimento ou induzindo-as a 

morte. Porém, este medicamento não deve agredir células normais do 

organismo (Katsube et al. 2003; Yang  et al., 2006).



50

A partir destes estudos, é possível fazer uso das 

propriedades terapêuticas de cada planta, sem riscos para os tecidos 

humanos saudáveis (Garcia, 2004). Diferentes são os testes realizados 

para avaliar o efeito citotóxico de uma substância, seja por ação letal 

sobre animais ou sobre cultura de células.  

Vidal et al. (2003) estudaram a ação citotóxica da 

Punica granatum L. sobre embriões de ratos Wistar, constatando que, 

menos de 0,1mg por embrião, não foi na dose tóxica. Reportaram também 

que a DL50 administrada intraperitoneal, era de 731,1 mg/kg, com 

intervalo de confiança entre 565-945 mg/kg. Os autores relatam que a 

toxicidade provavelmente se devia à presença de alcalóides no extrato 

hidroalcoólico da Punica granatum L.  

2.4.1  Testes com fitoterápicos e cultura celular  

Normalmente os testes de citotoxicidade in vitro são 

realizados de diferentes formas. Colocando os produtos a serem testados 

em contato com os locais onde posteriormente serão colocadas as 

células, realizando assim um teste com contato indireto com a confecção 

de corpos de prova que serão colocados em contato com o recipiente e 

removidos antes das células serem colocadas (Camargo et al., 2008) ou 

colocando o produto a ser testado diretamente no meio de cultura celular 

(Ahmed et al., 2005). 

Ahmed et al. em 2005, mostrou em seus experimentos 

com células de linha condroblástica a ação da Punica granatum L. sobre 

condrócitos humanos, demonstrando que o frações separadas do extrato 

de Punica granatum L. com altas doses de antocianinas inibiram a 

expressão de IL-1Beta e Metaloproteínases (MMPs 1, 3 e 13), 

marcadoras clássicas de inflamação e degradação destas células. 



51

3  PROPOSIÇÃO

O objetivo deste trabalho foi investigar in vitro e 

utilizando análise quantitativa e qualitativa, os efeitos da Punica granatum 

L. em diferentes concentrações, sobre duas linhagens de células, 

fibroblastos de mucosa bucal humana e uma linhagem de célula 

cancerígena. 

 



52

4  MATERIAL E MÉTODO 

A toxicidade da Punica granatum L. (PG) foi avaliada, 

utilizando cultura de células, por meio da resposta de fibroblastos 

humanos (FLM) e de uma linhagem de células cancerígenas (KB). Os 

testes foram realizados levando-se em conta a viabilidade e a 

citotoxicidade das células quando em contato com a PG em diferentes 

concentrações. O controle positivo utilizado foi uma cultura sem PG e o 

controle negativo o meio de cultura adicionado de solução de Tryton a 

1%. A capacidade de resistência ou viabilidade celular foi observada no 

período de 24 h e a sobrevivência e citotoxicidade celular por sete dias. O 

projeto deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da 

Universidade Ibirapuera, com protocolo no. 298/07 (Anexo 1). 

4.1  Instituições envolvidas 

O projeto deste estudo foi idealizado e elaborado na 

Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual “Julio Mesquita 

Filho” - UNESP de São José dos Campos/SP. Para sua realização houve 

cooperação de diversos núcleos de estudo no Brasil. Desta forma, a 

Universidade Federal da Paraíba (UFPB) forneceu o extrato do 

fitoterápico, em forma de gel, utilizado nos experimentos e a Universidade 

Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) foi responsável pela identificação 

botânica da planta e pela quantificação bioquímica do extrato. No 



53

Laboratório de Bioodontologia da Universidade Ibirapuera (UNIB), foram 

realizados os testes de citotoxicidade em cultura celular. 

4.2  Liofilização

Para melhor conservação do extrato de PG, e para 

manter suas propriedades fitoterápicas por tempo prolongado, permitindo 

manipular de forma adequada as concentrações necessárias para o 

experimento, o gel foi submetido ao processo de liofilização no 

Laboratório de Química da Universidade de São Paulo. O produto 

desidratado obtido foi embalado em sacos de polietileno que foram, em 

seguida, hermeticamente fechados.  

4.3  Obtenção das soluções padronizadas de PG

No Laboratório de Bioodontologia da Universidade 

Ibirapuera, o material liofilizado foi acondicionado em tubos com 6 g cada 

um, os quais foram mantidos sob vácuo em dessecador (Vidrolabor – São 

Paulo/ SP - Brasil).  

Para obtenção das soluções padronizadas de PG 

utilizadas para os testes de citotoxicidade, 0,1.mg do material liofilizado foi 

colocado em 10.mL de meio de cultivo e homogeneizados em vórtex 

(Quimis Q-220-B – São Paulo/SP - Brasil) até a dissolução total do soluto. 

O meio de cultura foi selecionado de acordo com o tipo de célula a ser 

cultivada. Foram preparadas soluções contendo o equivalente a 12,5 mg 

de extrato de PG em cada 10 mL do meio de cultura. Em seguida, as 



54

soluções foram colocadas em seringas descartáveis estéreis (DB 

Plastipak – São Paulo - Brasil) e passadas em filtro com poros de 0,22 μm 

(Corning Inc.) objetivando a esterilização das mesmas, e conservadas em 

geladeira a 4o.C. 

A solução de Triton (Sigma Aldrich Co.) adotada como 

controle negativo foi preparada com a adição de 1 mL de Triton a 10% em 

9 ml de PBS e homogeneizada em vórtex, sendo igualmente reservada 

em geladeira.  

Os meios de cultura utilizados para controle positivo 

foram os próprios meios de cultura, que foram manipulados como 

preconizado pelos fabricantes. Todos os grupos experimentais foram 

suplementados com 10% de Soro Bovino Fetal no momento dos testes.  

4.4  Cultura de células

A avaliação da citotoxicidade da PG foi realizada em 

duas culturas celulares já estabelecidas e mantidas no Banco de Células 

do Laboratório de Bioodontologia da Universidade Ibirapuera.  

A cultura de fibroblastos humanos de mucosa oral 

(FLM) foi obtida por meio de cultura primária originada de material de 

explante de doador voluntário (Soriano, 2005). Foram realizados os 

procedimentos de cultivo conforme demonstrado no esquema a seguir 

(Figura 3).  

 



55

Figura 3 - Desenho esquemático com imagens das etapas para obtenção 
da cultura primária de fibroblastos humanos de mucosa oral 
(FLM). 

 

As células cancerígenas de Carcinoma Epidermóide 

Oral Humano ATCC CCL-17 (KB) pertencem a uma linhagem comercial 

adquirida através do Instituto Adolf Lutz e são mantidas no banco de 

células do Laboratório de Bioodontologia da Universidade Ibirapuera.  

Os procedimentos de cultivo celular e os ensaios de 

citotoxicidade do fitoterápico foram realizados no Laboratório de 

Bioodontologia da Universidade Ibirapuera, em câmara de fluxo laminar 

(Esco Biotech, São Paulo, Brasil) evitando contaminação e 

comprometimento do experimento.  

Diferentes meios de cultivo foram usados dependendo 

de cada tipo celular. Os fibroblastos de mucosa humana (FLM) foram 

mantidos em garrafas de 75 cm2 contendo meio Dulbecco modificado por 

Eagle (DMEM) (Cutilab Materiais para Cultura de Células Ltda. – São 

Paulo - Brasil) suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF) 

(Sigma Chem. Co., St Louis, MO, EUA). As células KB foram mantidas em 

garrafas de 75 cm2 contendo o meio Eagle (Sigma Aldrich Co., St Louis, 

MO, EUA) suplementado com 1% de aminoácidos (Sigma Aldrich Co., St 



56

Louis, MO, EUA), 1% de piruvato (Sigma Aldrich Co., St Louis, MO, EUA) 

e 10% de SBF (Sigma Chem. Co., St Louis, MO, EUA).  

4.5  Grupos experimentais 

Em uma primeira etapa, foram delineados como piloto, 

testes experimentais de viabilidade por 24 horas. Estes foram feitos com 

diferentes concentrações, com quantidade de polifenóis diferentes e 

avaliando em quais concentrações foi observada a morte das células as 

células (Tabela 1). 
 

Tabela 1 - Concentrações e quantidade de Punica granatum L. com 
respectiva quantidade de polifenóis testados para definir as 
concentrações a serem utilizadas nos testes de viabilidade. 

 

Concentrações 
testadas 

Volume (mL) 
de PG 

Quantidade 
Polifenóis (%) 

Morte celular no 
teste piloto 

50% 0.5 0,3 Sim 

25% 0.25 0,15 Sim 

12,5% 0.125 0,075 Sim 

10% 0.1 0,06 Sim 

7,5% 0.075 0,045 Sim 

5% 0.05 0,03 Sim 

2,5% 0.025 0,015 Sim 

1% 0.01 0,006 Não  

0,8% 0.008 0,0048 Não  

0,5% 0.005 0,005 Não  

0,25% 0.0025 0,003 Não  

0,125% 0.00125 0,0015 Não  

0,062% 0.00062 0,000372 Não  

0,031% 0.00031 0,000186 Não  



57

De acordo com as respostas obtidas, foram 

estabelecidas seis diferentes concentrações para a os testes de 

viabilidade em triplicata.  

A concentração de 1% foi escolhida, pois foi a primeira 

a ter células sobreviventes em 24 horas e as demais foram estabelecidas 

dependendo da titulação realizada com a solução inicial padronizadas de 

PG a 1%. 

Estas titulações foram realizadas com a diluição da 

solução inicial de PG a 1% no meio de cultura, sendo estabelecidos 

grupos experimentais com 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,062% e 0,031% 

(Figura 4). 

 

 
Figura 4 - Solução base e diluições preconizadas de PG para os testes de 

viabilidade. 

4.6  Procedimentos para Cultura Celular 

Para a realização da cultura de células foram 

realizados vários passos sequenciais que incluíram:  

a) preparo prévio do material a ser utilizado; 

b) descontaminação da área de trabalho e do material; 

c) realização da cultura propriamente dita.  



58

Antes do início do experimento alguns cuidados foram 

tomados para minimizar o risco de contaminação. A limpeza de todas as 

superfícies, materiais e suportes presentes no interior da câmara de fluxo 

laminar foi feita com álcool 700 GL. Os materiais a serem utilizados 

(pipetas, tubos e garrafas de cultivo celular) foram inseridos no fluxo após 

a descontaminação dos invólucros com álcool 700 GL. Após a distribuição 

e organização do material no interior da câmara a mesma foi submetida à 

luz ultravioleta durante 15 minutos. 

Os meios de cultura DMEN e EAGLE foram preparados 

previamente pelo Laboratório de Bioodontologia da Universidade 

Ibirapuera. Tanto os meios de cultura como o soro bovino fetal (SBF) 

foram separados em alíquotas e mantidos em geladeira (os meios) ou em 

freezer -20o.C (as alíquotas de SBF) até o momento de sua utilização. 

Quando removidos da geladeira ou freezer, estes foram levados ao 

banho-maria a 37o.C até atingirem temperatura equivalente.  

Os dois tipos celulares a serem testados estavam 

armazenados em nitrogênio líquido, identificados e separados em 

diferentes criotubos mantidos em canisters. Para que as células 

pudessem permanecer de forma adequada no nitrogênio líquido foi 

adicionada ao meio de cultura uma substância crioprotetora, o Dimetil 

sulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich Co.) acrescido de 10% de SBF. Os 

criotubos foram fechados com suas respectivas tampas (Figura 5).  

 



59

Figura 5 - Desenho esquemático da disposição dos criotubos durante o 
processo de congelamento em nitrogênio líquido. 

4.7  Procedimentos para Descongelamento Celular 

No momento da utilização, os criotubos foram retirados 

dos canisters para as células serem descongeladas em banho-maria a 

37o.C. Todo o processo de manipulação das células desde a remoção do 

invólucro de filme plástico até a colocação das mesmas em garrafas de 

cultivo foi realizado em fluxo laminar de forma rápida e cuidadosa para 

evitar contaminação e degradação celular.  

No fluxo laminar, os criotubos contendo um tipo ou 

outro de células tiveram todo o conteúdo coletado com micropipeta e 

colocado em tubos com 2 mL de DMEM ou de EAGLE acrescidos de SBF 

a 10%. Os tubos foram levados à centrífuga (Centrífuga Excelsa II - 

Modelo 206 BL- FANEN – São Paulo - Brasil) por 5 minutos a 1000 rpm 

para que ocorresse uma precipitação das células no fundo dos tubos, 

formando uma massa celular chamada “pellet”.  



60

Os meios de cultura foram então removidos e 

descartados a fim de eliminar o conteúdo de DMSO adicionado como 

crioprotetor antes do congelamento.  

As células foram ressuspendidas em 2.mL de meio de 

cultura novo (DMEM ou EAGLE) com 10% de SBF e colocadas em 

garrafas de cultura celular de 75 cm2. Foram acrescidos 8.mL de DMEM 

ou EAGLE com 10% de SBF para que o volume final nas garrafas fosse 

de 10.mL, constituindo quantidade suficiente de meio para suprir de 

nutrientes as células em crescimento (Figura 6). 

 

Figura 6 - Desenho esquemático do descongelamento de células mantidas 
em nitrogênio líquido. 

 

Os frascos foram fechados por completo e levados ao 

microscópio de luz invertida para observação das células no seu interior. 

Neste momento as células apresentavam-se arredondadas e bastante 



61

móveis. A tampa do frasco foi então parcialmente aberta e colocado em 

estufa a 37 °C e 5% de CO2 (Garcia et al., 2003, Fraser et al., 2004). 

O meio de cada garrafa de células foi parcialmente 

trocado a cada 2 dias, com substituição de 50% do volume a cada troca, 

até a formação de uma de monocamada preenchendo toda a superfície 

da garrafa. 

4.8  Procedimentos prévios ao início dos ensaios de viabilidade e de 
citotoxicidade celular 

As células tiveram seu cultivo em garrafas de 75.cm2, 

com 10.mL de meio acrescido de SBF 10%. Um dia antes do 

experimento, estas células foram transferidas para placas de 96 ou 24 

poços para a realização dos testes propostos. Independente do teste a 

ser realizado, os, com exceção do tempo de cultivo e número de células 

por poços, todos os procedimentos descritos foram iguais para os testes 

de viabilidade ou citotoxicidade celular. 

As garrafas foram completamente fechadas para a 

saída da estufa e imediatamente levadas ao fluxo laminar. O meio de 

cultura foi removido com pipetas sorológicas e 6.mL foram reservados em 

tubo cônico de 15.mL. Foram colocados 3.mL de tripsina 0,25% no interior 

da garrafa, estas novamente fechadas e devolvidas a estufa por 5.min. 

Neste período, a tripsina agiu sobre as células promovendo o 

desprendimento destas do fundo da garrafa e entre si. Após este período 

no interior da estufa, a garrafa foi removida e levada ao microscópio de 

luz invertida (Nikon Eclipse TS 100) para certificação do desprendimento 

celular e morfologia celular no meio de cultura. 

Em fluxo laminar, o meio reservado anteriormente 

(6.mL) foi recolocado nas garrafas para diluir e inativar a ação da tripsina, 



62

além de auxiliar na remoção das células. Posteriormente todo o conteúdo 

foi coletado com macropipeta e transferido para um tubo cônico de 15.mL, 

protegido com filme de laboratório (Parafilm – Pechiney Plastic 

Packaging) e levado à centrífuga 1000.RPM por 5.min. O meio com a 

tripsina foi cuidadosamente removido e as células ressuspendidas com 

1.mL de meio novo acrescido de SBF 10% e homogeneizadas. 

Após este procedimento, a solução contendo as células 

foi considerada pronta para ser utilizada para a contagem (Figura 7). 

 

 
Figura 7 - Esquema de procedimentos para remoção das células da garrafa 

e preparo da solução para contagem. 

4.9  Contagem Celular pelo Método do Azul de Trypan  

A partir da solução de células coletadas da garrafa, 

pode ser feita a contagem das células com auxílio da Câmara de 



63

Neubauer® (Laboroptik - EUA), pelo método de exclusão de células 

coradas pelo Azul de Trypan. 

Tomando como base a solução de 1.mL contendo as 

células que estavam na garrafa, foram retirados 10.μL desta solução de 

células e colocados em microtubo de 1,5.mL, no qual foi feita nova 

suspensão, acrescendo a esta 90.μL do respectivo meio de cultura 10.μL 

de Azul de Trypan a 0,4%. 

Após homogeneizadas as soluções no tubo de 1,5 mL, 

10.μL do conteúdo foram pipetados e imediatamente transferidos para um 

hemocitômetro também conhecido como Câmara de Neubauer 

previamente limpa com álcool 70o.GL e recoberta por uma lamínula limpa 

(Figura 8). Na Câmara, que contém duas grades de contagem, é colocado 

1 mm3 volume em cada grade. A difusão da solução contendo as células 

a serem visualizadas, ocorre por capilaridade. 

Após colocada a solução contendo as células (10.μL 

em cada grade de contagem), a Câmara foi levada ao microscópio de luz 

invertida e feita a contagem de células na objetiva com aumento de 10 

vezes. Nos 25 quadrados de cada grade, foram anotadas as células 

viáveis (não coradas pelo Azul de Trypan) em todo o campo de cada 

quadrado. Neste experimento não foram contabilizadas as células nas 

linhas superior e direita (Figura 8). 

 



64

 
Figura 8 - Câmara de Neubauer e esquema da grade de contagem 

exemplificando as células contabilizadas (rosadas e dentro da 
grade) e as excluídas da contagem (coradas pelo Azul de 
Trypan e localizadas nas linhas superior e direita). 

 

 

Para determinar a quantidade de células removidas da 

garrafa, foi realizada uma média da contagem celular presente nas duas 

grades da Câmara de Neubauer. Na fórmula demonstrada na figura 9, o 

volume da grade é representado por 104, o valor de diluição representado 

por 10 e a quantidade de grades contabilizadas foi igual a dois. 

 

 



65

 
Figura 9 - Fórmula para contagem das células presentes nas duas grades 

da Câmara de Neubauer. 
 

A partir do valor obtido, foi avaliado o número de 

células usado no experimento de viabilidade (6x104) ou de citotoxicidade 

(4x104), possibilitando calcular por meio de proporcionalidade a 

quantidade de volume necessário em cada poço como demonstrada na 

fórmula da Figura 10. 

 

 
Figura 10 - Fórmula para cálculo de volume de meio contendo células para 

ser colocado em cada poço para cultura. 

4.10  Ensaio de viabilidade das células 

Para este teste a placa de 96 poços com 6,4 mm de 

diâmetro foi escolhida. Para cada poço, foi preconizado um volume final 

de 200 μL do conjunto (células e meio) sendo estipulado por poço o 

número de 6x104 células. Foram usados 3 poços para cada grupo 



66

experimental além dos controles positivo e negativo. Os experimentos 

foram feitos em triplicata, em três momentos diferentes. 

Após contadas e dispostas nos poços, completando o 

espaço programado da placa, esta foi colocada por 24 h em estufa a 

37.oC com 5% de CO2. Após este período foi confirmada a presença das 

células para o teste com auxílio de microscópio de luz invertida (Figura 

11). 

 

 
Figura 11 - Disposição das células colocadas na placa de cultivo 24 h 

antes do início dos testes de viabilidade. 
 

No dia do teste de viabilidade as soluções a serem 

testadas foram preparadas. Então, a partir de uma solução-mãe 

padronizada de PG foi feita diluição serial no meio de cultura específico 

para cada tipo celular, sendo estabelecidos os grupos experimentais de 

acordo com as concentrações (Figura 12). Para controle positivo foi 

utilizado o meio de cultivo de cada tipo celular acrescido de SBF 10%. 



67

Para o controle negativo, foi utilizada uma solução de Triton 1% (Dinâmica 

– São Paulo - Brasil).  

 
Figura 12 - Grupos experimentais, esquema de diluição por titulação ou a 

partir da concentração de 1% de PG, além dos grupos controle 
negativo e controle positivo. 

Após todas as soluções teste estarem prontas, a placa 

foi removida da estufa e levada ao fluxo. Com auxílio de micro-pipeta, os 

meios contidos nos poços foram removidos. Em seguida as soluções de 

PG em diferentes concentrações foram colocadas nos poços com células, 

assim como as soluções para os grupos controle positivo (C+) e controle 

negativo (C-). Para controlar a qualidade dos meios, na mesma placa foi 

determinado o chamado “controle branco”, em que os meios de cultura 

utilizados foram colocados em poços sem células. (Figura 13). A placa foi 

então incubada em estufa por 24 h a 37.°C com 5% CO2. 

 

 



68

 
 
Figura 13 - Esquema de distribuição da placa de 96 poços com as células 

(FLM e KB) em diferentes concentrações de PG e o controle 
sem células. 

 

Após 24 h com a cultura em contato com o meio 

preparado com PG, foram realizados os seguintes procedimentos: 

O meio contendo ou não a PG foi removido 

completamente e cada poço foi lavado com 200 μL de solução de PBS 

(Sigma Aldrich Co.) para remoção completa do extrato e meio. Posterior a 

remoção do PBS, foi colocada em cada poço, uma solução contendo 90% 

de meio suplementado com SBF.10%, acrescido de 10% de Resazurina 

(RZ) a 2.100 μM (Figura 14). 

 



69

Figura 14 - Esquema de preparo para leitura por meio do 
espectrofotômetro: placa com grupos experimentais (1), 
remoção das soluções teste (2), lavagem e remoção do 
PBS (3) e preenchimento com RZ 2.100 μM (4) 

 

A quantificação celular foi realizada pelo método da 

Resazurina (RZ), avaliada por espectrofotometria óptica. Para o controle 

de cor, o mesmo meio de cultivo foi colocado com as diferentes 

concentrações em poços sem células (controle branco) e estes também 

foram submetidos ao teste de RZ.  

A placa foi levada à estufa 370C e 5% CO2 e após 3 

horas, período de tempo necessário para que ocorresse a reação de oxi-

redução do RZ e conseqüente alteração ou não de cor dos poços, o nível 

de redução foi quantificado usando o espectrofotômetro UVM 340 (Asys 

Hitech GmbH) para a leitura de absorbância dos comprimentos de onda 

de 560 nm (Figura 15). 

 

 



70

Figura 15 - Exemplo de alteração de cor ocorrida durante a reação de RZ. 

4.11  Ensaio de citotoxicidade das células 

Este experimento foi realizado em placas de 24 poços 

4×104 células por poço, em triplicata e em três tempos diferentes. A 

citotoxicidade celular foi analisada em cinco tempos diferentes (4h, 24h, 

3.dias, 5 dias e 7 dias). Foram testadas cinco concentrações diferentes de 

PG diluída no meio (1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% e 0,062%), além dos 

controles positivo (meio sem PG) e controle negativo (meio contendo 

Triton 1%).  

Antecedendo o início do experimento, as células foram 

colocadas nos poços com o meio de cultivo acrescido de SBF 10% 

(totalizando 1000 μL por poço), e as placas incubadas em estufa a 37°.C 

com 5% CO2. Após 24 h todas as placas foram retiradas da estufa e os 

meios removidos dos poços, permanecendo apenas as células. Foram 

então colocados 1000 μL das soluções teste e dos controles positivo e 

negativo sobre as células e no grupo branco (Figura 16). 



71

 

Figura 16 - Esquema de disposição das células na placa para realizar os 
experimentos de citotoxicidade. 

 

No dia em que foram colocados os meios, as cinco 

placas foram incubadas em estufa a 37.°C com 5% CO2. Quatro horas 

após, uma das placas denominada tempo quatro horas, foi preparada 

para a colocação do RZ. Todos os poços foram lavados com 500 μL de 

PBS e colocado 1000 μL de RZ 2100 μM a 10%. A placa foi novamente 

incubada em estufa por 4 h para a reação do RZ e após este período, 

retirada e levada ao espectrofotômetro para a leitura. 

As demais placas foram retiradas de acordo com os 

períodos programados (1, 3, 5 e 7 dias), removidas as substâncias teste 

dos poços, realizada a lavagem com PBS e subseqüente colocação de 

RZ 2100 μM a 10%. Para manutenção das células, foi realizada a troca de 

meio nos dias 3 e 5, conforme esquema a seguir (Figura 17). 



72

Figura 17 - Desenho do experimento de citotoxicidade com as placas de 
cultivo e placas controle durante o período experimental de 
quatro horas a sete dias. 

4.12  Análise Estatística 

Os dados, em triplicata, obtidos nos dois ensaios foram 

submetidos a tratamento estatístico utilizando Análise de Variância 

(p<0,05).  



73

5 RESULTADOS 

5.1  Teste de viabilidade celular 

O teste de viabilidade permitiu observar sobrevivência 

de mais de 70% das células FLM ou KB em baixas concentrações de PG 

(0.031%; 0,062%; 0,125%; 0,25%). Na concentração de 0,50% ocorreu 

uma redução significativa da quantidade de células, porém com desvio- 

padrão amplo, principalmente para as células FLM, dificultando o 

estabelecimento do padrão de vida e morte das mesmas. Na 

concentração de 1% de PG foi observada diminuição de cerca de 40% 

das células FLM e destruição importante das células KB. Os resultados 

estão expressos na Figura 18 e Tabela 2. 

 

 

 

 

 

 

 



74

 

Figura 18 - Gráfico demonstrativo da viabilidade para as células FLM e KB. 
 

 
Tabela 2 - Representação em porcentagem dos valores do teste de 

viabilidade realizado para as células FLM e KB em diferentes 
concentrações de PG. 

 

Concentração 

PG 

KB FLM  

Resultado ± Desvio-padrão Resultado ± Desvio-padrão. 

1,00 % 3,69 ± 2,9 % 43,34 ± 15,9 % 

0,50 % 42,04 ± 33,1 % 61,10 ± 10,1 % 

0,25 % 72,40 ± 11,1 % 78,24 ± 9,4 % 

0,125 % 91,33 ± 2,5 % 87,58 ± 10,5 % 

0,062 % 99,83 ± 0,5 % 85,59 ± 12,5 % 

0,031 % 96,19 ± 6,2 % 94,34 ± 12,2 % 

C+ 100,00 ± 1,8 % 92,94 ± 7,9 % 

C- 0,00 ± 0,5 % 1,05 ± 1,3 % 



75

5.2  Teste de citotoxicidade 

As concentrações utilizadas para esta etapa de 

pesquisa basearam-se em resultados previamente obtidos nos testes de 

viabilidade. O grupo 1% foi escolhido por apresentar elevada taxa de 

morte celular, o grupo 0,50% pela variação do desvio-padrão apresentado 

na viabilidade, o grupo 0,062% por ter apresentado a maior sobrevivência 

neste período e o grupo 0,25% por ser intermediário entre estes últimos.  

Os resultados estão graficamente representados de 

forma individual e por tipo celular nas Figuras 22 e 23 e posteriormente 

confrontados com o segundo período de experimental nas Tabelas 4 e 5. 

 

 

Figura 19 - Gráfico representativo dos valores do teste de citotoxicidade 
das células FLM nos períodos de 4 horas, 1, 3, 5 e 7 dias. 



76

Tabela 3 - Representação em porcentagem do teste de citotoxicidade 
das células FLM nos períodos de 4 horas, 1, 3, 5 e 7 dias em 
diferentes concentrações de PG. 

Concentração  
PG 

Citotoxicidade para células FLM 
4 horas 1 dia 3 dias 5 dias 7 dias 

 
1,00% 

 

48,59 
± 16,4 

5,94 
± 0,8 

2,06 
± 2,5 

-8,24 
± 12,4 

4,48 
± 5,0 

 
0,50% 

 

59,19 
± 4,3 

5,96 
± 0,7 

7,56 
± 1,2 

3,50 
± 0,4 

3,65 
± 1,8 

 
0,25% 

 

64,50 
± 1,5 

9,33 
± 5,3 

4,80 
± 3,1 

3,24 
± 1,0 

2,37 
± 1,8 

 
0,062% 

 

93,43 
± 1,7 

86,68 
± 0,8 

86,30 
± 4,9 

101,34 
± 2,9 

99,98 
± 5,4 

 
C + 

 

100,00 
± 2,4 

100,00 
± 1,1 

100,00 
± 5,4 

100,00 
± 2,7 

100,00 
± 0,7 

 
C - 

0,00 
± 1,0 

0,00 
± 0,4 

0,00 
± 0,9 

0,00 
± 0,5 

0,00 
± 0,7 

 

Foi observado, no período de 4 horas, redução do 

número de células FLM metabolicamente ativas nas concentrações de 

0,25%, 0,5% e 1%. A partir do primeiro dia de contato das células com o 

extrato, foi observada morte de todas as células nos grupos 0,25%, 0,5% 

e 1%. O grupo 0,062% mostrou nível de citotoxicidade muito próximo ao 

grupo controle positivo (C+) (Figura 19 e Tabela 3). 

 



77

Figura 20 - Gráfico representativo dos valores de citotoxicidade das células 
KB nos períodos de 4 horas, 1, 3, 5 e 7 d