UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 
 
 
 
 
 
 
 
 

Aline Ropelli Silva 
 

 

 

 

 

 

 

Identificação de biomoléculas no veneno de serpente 
Bothrops jararacussu com alta afinidade para 

receptores de serotonina 5-HT2c 

 

 

 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual 
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 
Câmpus de Botucatu, para obtenção 
do título de Doutora em Doenças 
Tropicais.  

 

 

 

 
 
 

Orientador: Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Junior 

 

 

 
 

 

 

 

Botucatu 
(2016) 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

2 

 

 

 

 

Aline Ropelli Silva 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
Identificação de biomoléculas no veneno de 

serpente Bothrops jararacussu com alta afinidade 
para receptores de serotonina 5-HT2c 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 

Medicina, Universidade Estadual Paulista 

“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 

Botucatu, para obtenção do título de 

Doutora em Doenças Tropicais.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

Orientador: Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Junior 
 

 
 
 
 

Botucatu 
(2016) 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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Nome do Autor: Aline Ropelli Silva 



Tese de Doutorado 

 

 

 

4 

 

 

 

 

Título: Identificação de biomoléculas no veneno de serpente Bothrops 
jararacussu com alta afinidade para receptores de serotonina 5-HT2c 

 
 

 
Comissão Examinadora 

 
 
 

 
Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Junior 
Orientador 
Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem – Faculdade de 
Medicina de Botucatu – UNESP e Centro de Estudos de Venenos e Animais 
Peçonhentos – CEVAP 
 
 
Profa. Dra. Lucilene Delazari dos Santos 
Membro 
Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem – Faculdade de 
Medicina de Botucatu – UNESP e Centro de Estudos de Venenos e Animais 
Peçonhentos – CEVAP 
 
 
Prof. Dr. André Sampaio Pupo 
Membro 
Departamento de Farmacologia do Instituto de Biociências – Botucatu, São 
Paulo.  Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” 
  
 
Prof. Dr. José Carlos Cogo 
Membro 
Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento – São José dos Campos, São Paulo, 
Universidade do Vale do Paraíba. 
 
 
Profa. Dra. Nanci Nascimento 
Membro 
Centro de Biotecnologia – São Paulo, São Paulo - Instituto de Pesquisas 
Energéticas e Nucleares.  
 
 
 

 
 

Data da defesa: 29 de junho de 2016. 
 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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“Não deixe a maldade do mundo tirar a doçura da sua alma”. 
 

Autor desconhecido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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Aos meus pais, pelo suporte incondicional. 
À minha avó Alice (in memoriam), pelo exemplo de vida. 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

7 

 

 

 

 

AGRADECIMENTOS 
 

 
Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade concedida e por todo suporte 

que me deu em forma de mestres, amigos e família. Tua mão me sustentou até aqui. 
 
Ao Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Junior, meu orientador, pela oportunidade 

dentro do CEVAP e fora do país, sou eternamente grata. Agradeço também toda ajuda, 
orientação, atenção e paciência. 

 
A Profa. Dra. Lucilene Delazari dos Santos, pela co-orientação , pelo auxilio, pela 

compreensão, pela orientação dentro e fora do CEVAP e pela paciência. 
 
Ao Prof. Dr. Benedito Barraviera, pelos conselhos e orientações, por ser um 

exemplo de dedicação e persistência profissional, e por carregar o CEVAP com tanto 
empenho proporcionando esta experiência.   

 
Agradeço aos técnicos Airton Lourenço Junior (in memoriam), Luciana Curtolo de 

Barros  e Elenize  Jamas por toda ajuda, auxílio e cuidado na hora de transferir o 
conhecimento.  

 
À Banca Examinadora pela disponibilidade e atenção.  
 
Ao Prof. Dr. Denis Servent, colaborador internacional, e Nicolas Gilles, técnico, 

ambos pertencentes ao CEA – França, pela oportunidade de estagiar por 3 meses, 
conhecer uma nova rotina e vivenciar essa experiência única. 

 
A Letícia Araújo Cunha e Jéssika de Oliveira Francisco pela eficiência, paciência, 

a prontidão em ajudar e pelos horários de almoço. 
 
Aos funcionários do CEVAP: Juliana, Selma, Wendel, Granieri, Marcos, Sheila, 

Sandra, Marília, Pâmela, Marli e Sérgio pelo trabalho tão bem feito que faz parte do 
bom funcionamento do CEVAP.  

 
A Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa 

de estudo concedida tornando possível a realização deste trabalho. 
 
Aos funcionários da Pós-Graduação: Janete, Bruna Quirino Jorgetto, Solange 

Sako Cagliari, Regina Célia Spadin e Diego C. B. de Oliveira pelo socorro, por sempre 
ajudar da melhor maneira (im) possível e pela prontidão exemplar. Muito Obrigada. 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

8 

 

 

 

 

Agradeço a todos do Departamento de Doenças Tropicais, que fizerem parte dessa 
caminhada. As meninas da MI pelo suporte, risadas e amizade em congressos, eventos e 
almoços na UNIPEX.   

 
Agradeço a todos que fizeram e fazem parte do Centro de Estudos de Venenos e 

Animais Peçonhentos (CEVAP) por compartilharem toda rotina, pelos conselhos, pela 
prontidão em ajudar, por tornar a rotina menos maçante e por proporcionarem uma 
amizade fora do ambiente de trabalho. Vou levar o melhor de cada um de vocês comigo, 
agradeço a todos, em especial, Airton, Luciana, Elenize, Patricia Orsi, Juliana Simon, 
Dani Fossato, Bel, Pricisila, Patricia Rocha, Denis, Aristóteles, Tauane, Claudia, 
Josias, Andre, Leonardo, Camila, Natalia, Leticia Dragone, Leticia Pontes, Mauricio, 
Fauto, Clara, Rafael, Vivian, Lucas, Gustavo, Laudiceia, Lidiane, Paty Lima.  VocÊs 
fazem parte dessa caminhada. Obrigada pelo apoio em forma de amizade, conselhos, 
ajuda acadêmica, risadas e os inúmeros coffees e lanches da tarde 

 
Agradeço as minhas grandes amigas Patricia Rocha, Leticia Dragone, Bel e Pri , 

pela amizade que com certeza levarei pelo resto da vida. Amizade iniciada no CEVAP 
mas que foi levada para fora. Por todo apoio, conversas, conselhos, por acalmarem meus 
ânimos em momentos de tensão e pelas infinitas risadas.  

 
Agradeço em especial meus pais, Valter e Sônia, pelo exemplo de dedicação e por 

sonharem este sonho comigo. Por se anularem tantas vezes em nome da minha educação. 
Agradeço os valores que me ensinaram que são minha essência e pela liberdade concedida 
que ajudou a me encontrar como pessoa. Por proporcionarem apoio financeiro e emocional 
durante todo esse processo. Por entenderem minha ausência de casa por mais de 8 anos. 
Sinto pelos almoços de domingo que perdi, pelas festas de aniversário que não estive, 
pelas noites fora de casa, por não estar lá para cuidar quando um de vocês esteve doente. 
Obrigada por serem meu porto seguro, sei que posso navegar o mais longe que for, mas 
meu lar é onde vocês estão. Amo Vocês. 

 
Agradeço em especial, a minha maior saudade, a minha avó, Alice Gallani Ropelli 

(in memoriam), pelos ensinamentos, pelos valores e pelos conselhos e por ser o exemplo de 
mulher que sempre esteve tão à frente do seu tempo. Espero ter herdado todo seu 
entusiasmo e doçura de coração. A senhora faz uma falta absurda vó, como eu gostaria 
que a senhora estivesse aqui, pois se cheguei aqui foi graças aos seus incentivos. Amo 
você.  

 
Agradeço ao Alan dos Passos Tamborim, pela parceira em tempo integral, mesmo 

com a distância esteve tão presente em forma de afeto, risadas, segurança, me deu 
serenidade em momentos de loucura, apoio e carinho nesta última etapa tão difícil e 



Tese de Doutorado 

 

 

 

9 

 

 

 

 

agradeço também a compreensão pela minha ausência. Obrigada por tudo. Você faz parte 
desta tese, pois também faz parte de mim. 

 
Agradeço aos meus amigos de longa data, Alzira Limeira, Lulis Ferradura, Marisa 

Gomes da Costa, Mifa Boboleto, Deusa Maria Barretos, Dre da Baixada, Crau 
Natascha, Daniboy Italia, Coruja do Dada, Jow jow do Ibis, e Mariana Z. Obrigada 
por sempre me receberem de braços abertos quando retornava para casa. Obrigada por 
compreenderem minha ausência e me presentearem com uma amizade tão verdadeira e 
honesta. Obrigado pelas férias, viagens, risadas, churrascos e conselhos. 

 
Agradeço aos meus amigos de Botucatu, amigos que fiz fora do ambiente de 

trabalho e me agraciaram com sua amizade, compreensão, brincadeiras, risadas e por 
tornar essa caminha mais leve. Minhas famílias botucatuenses, família Visconde 766 e 
família Crossfit Cuesta, vocês com certeza foram minha válvula de escape nos momentos 
mais tensos. Obrigado por me acolherem de maneira tão calorosa e me presentearem com 
a amizade de vocês.   

 
 

Aos que não mencionei diretamente, fica aqui meu agradecimento. Todos que passaram 
por minha vida neste período fazem parte deste processo também. Obrigada! 

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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RESUMO 

 

Venenos animais representam misturas complexas de substancias bioativas 
como proteínas e peptídeos com as mais diversas funções farmacológicas, 
bioquímicas e fisiológicas. A elucidação dos mecanismos de ação dessas 
moléculas pode proporcionar o desenvolvimento de fármacos mais específicos 
e/ou ferramentas biológicas. Diante disso, torna-se indispensável o seu 
conhecimento estrutural e bioquímico, principalmente aqueles que interagem 
com receptores responsáveis por intermediarem a maioria dos processos 
celulares, ora inibindo e/ou ativando diversos tipos de respostas biológicas. 
Recentemente, diversos estudo tem evidenciados que proteínas e peptídeos 
tornam-se importantes ferramentas nos estudos da neurotransmissão e/ou 
junção neuromuscular e para elucidação de mecanismos farmacológicos e 
bioquímicos. Além disso, biomoléculas podem interagir com uma importante 
classe de receptores acoplados de proteínas G, as quais constituem uma das 
importantes famílias conhecidas de receptores identificados em vertebrados 
atuantes em várias vias de sinalizações celulares. A serotonina, 5-
Hidroxitriptamina (5 –HT), é um dos mensageiros químicos mais estudados e 
liga-se a receptores específico, e está ligado a diferentes efeitos no corpo 
humano. Amplamente encontrados no sistema nervoso central estão envolvidos 
a processos como êmese, apetite, humor, memoria, respiração, cognição e 
outras funções. Os estudos desses receptores tornam-se de importância 
terapêutica, visto que aproximadamente 50% dos fármacos desenvolvidos 
atualmente atuam sobre esses receptores, além de auxiliar na elucidação de 
mecanismos e vias que estão relacionados a esses receptores e doenças 
neurodegenerativas, cardíacas, monogênicas e oncogênicas. Toxinas ativas em 
GCPRs tem sido descritos em venenos de caracóis marinhos e serpentes. O 
objetivo do nosso trabalho foi a identificação de biomoléculas presentes no 
veneno de Bothrops jararacussu com afinidade para GPCRs. Identificação e 
caracterização feita aplicada estratégia de proteômica, utilizando cromatografia 
liquida de alta resolução por fase reversa (HPLC-RP), a elucidação de suas 
estruturas primárias espectrometria de massas e sequenciamento por química 
degradativa de Edman. Toxinas animais possuem como alvos receptores 
acoplados a proteína G; entretanto há poucos estudos relacionados a esses 
receptores e toxinas de serpentes do gênero Bothrops. Desta forma, o estudo 
desses peptídeos em venenos animais representa um campo promissor para 
desenvolvimento de novos fármacos, auxiliando na compreensão de 
mecanismos de ação e das vias de sinalização de diversas doenças. 
 

 

 

 

Palavras-chave: Bothrops jararacussu; GPCR; Serotonina; Serpente; Veneno 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNOMOS 

 

3H – Trítio 
 
14 C – Carbono  
 
5-HT - Hidroxitriptamina 
 
µL - Microlitros 
 
Ach – Acetilcolina 
 
ACN - Acetonitrila 
 
DL – Dose letal 
 
ESI-TOF-MS/MS - Espectrometria de massas 
 
GTP – Guanina trifosfato  
 
GDP- Guanina difosfato 
 
GPCR – G protein-coupled receptor (receptor acoplado a proteína G)  
 
HPLC – Cromatografia Líquida de alta Eficiência 
 
Mg – Miligramas 
 
ML – Mililitros  
 
MTx – Toxina Muscarínica 
 
SDS – PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida 
 
SNC – Sistema Nervoso Central 
 
SNP – Sistema Nervoso Parassimpático  
 
TFA - Ácido trifluoroacético 
 
TM –transmembrane ( transmembrana) 
 
TSH – Hormônio estimulante da Tireóide 
 
WTx – Weak toxin (toxina fraca) 
 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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SUMÁRIO   

  

1 INTRODUÇÃO……………………………………….………………………................ 13 

2 OBJETIVOS........................................................................................................... 24 

3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 25 

 3.1 Veneno...................................................................................................... 25 

 3.2 Aprovação do projeto de pesquisa pela Comissão de Ética em 

Experimentação Animal.............................................................................. 25 

 3.3 Isolamento e Purificação................................................................................ 25 

 3.3.1 Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC-RP)........... 25 

 3.3.2 Análise Eletroforética SDS-PAGE............................................................... 26 

 3.3.3 Ultrafiltração................................................................................................. 27 

 3.3.4 Quantificação de proteínas e peptídeos ..................................................... 28 

 3.3.5 Digestão de proteínas in gel...................................................................... 28 

 3.3.6 Sequenciamento peptídico por Espectrometria de Massas ....................... 29 

 3.3.7 Análise dos dados de Espectrometria de Massas..................................... 30 

 3.4  Análise de ligações ................................................................................... 30 

4 RESULTADOS...................................................................................................... 32 

 4.1.1 Cromatografia Líquida – Fase Reversa....................................................... 32 

 4.1.2 Análise Eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)......................  34 

 4.1.3 Quantificação proteica e pesagem seca para compostos de baixa massa.. 35 

 4.1.5          Determinação da massa molecular de compostos de baixa massa.............. 35 

 4.2 Analise de ligações.......................................................................................... 41 

 4.2.1 Análise de ligações dos venenos brutos......................................................... 41 

 4.2.1 Análise de ligação do veneno de Bothrops jararacussu.................................. 44 

5 DISCUSSÃO.................................................................................................................. 48 

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................... 53 

7 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 54 

  

 

 

 

 

  



Tese de Doutorado 

 

 

 

13 

 

 

 

 

1. INTRODUÇÃO 

 

Os animais peçonhentos possuem estruturas específicas como dentes, ferrões, 

aguilhões, esporões, as quais são desenvolvidas para inoculação da secreção tóxica 

produzida (veneno), tendo um papel importante para defesa e alimentação.  No Brasil, 

a alta biodiversidade permite que animais peçonhentos de diferentes gêneros e 

espécies sejam encontrados, como serpentes dos gêneros Bothrops, Bothriopsis, 

Bothrocophias, Crotalus, Lachesis, Micrurus; escorpiões do gênero Tityus, aranhas do 

gênero Lactrodectus, Loxoceles e Phoneutria, e abelhas do gênero Apis1,2.  

As toxinas animais surgem da evolução necessária a adaptação ao ambiente, seja 

como mecanismo de defesa ou ferramenta para obtenção de alimento. A função do 

veneno pode alterar sua composição, como em venenos de defesa (abelhas e peixes) 

que são extremamente conservados e com a ação primária de dor local imediata. Os 

venenos com função predatória são mais complexos e de elevada variabilidade, tanto 

em sua composição e como em efeitos no organismo. A diversidade de toxicidade está 

relacionada a taxonomia, população de algumas espécies, diferenças entre macho e 

fêmea e variações ontogenéticas3,4 . 

O veneno das serpentes percorreu um longo processo evolutivo até o que 

conhecemos atualmente como glândula venenosa juntamente com músculos 

compressores e presas como canal interino, possibilitando a inoculação das secreções 

tóxicas produzidas cheguem ao interior do tecido das vítimas. Sendo uma das peçonhas 

mais complexas do reino animal, onde 90% do seu peso seco é de caráter proteico, 

compreendendo enzimas, toxinas não enzimáticas e proteínas não toxicas. As frações 

não proteicas são formadas por carboidratos, lipídeos e metais (glicoproteínas e 

enzimas metaloproteicas), aminas biogênicas, nucleotídeos e aminoácidos livres4.  



Tese de Doutorado 

 

 

 

14 

 

 

 

 

As serpentes representantes do gênero Bothrops, popularmente conhecidas por 

jararacas, são responsáveis por 90% do número de acidentes por serpentes ocorridos 

no Brasil5. A elevada complexidade do veneno do gênero Bothrops pode causar efeitos 

como proteolítico, atividade inflamatória local induzida por aminas biogênicas, 

peptídeos, fosfolipases do tipo A2 e lectinas6. Levando a uma atividade inflamatória 

através da formação de trombos, consequentemente a hipóxia, edema e necrose do 

tecido; efeito coagulante, onde os fatores de coagulação são ativados e consomem 

fibrinogênio e fibrina intravascular, dificultando a coagulação sanguínea7. As diferentes 

espécies de Bothrops podem ocasionar diferentes níveis da atividade anticoagulante; e 

por fim, efeito hemorrágico, que pode ser tanto local como sistêmico, são atribuídas as 

hemorraginas, metaloproteinases que contem zinco, conseguem romper o endotélio 

vascular e tem atividade desintegrina, degradando vários componentes da matriz 

extracelular, como colágeno tipo 4 e fibronectina. Além disso, inibem a agregação 

plaquetária8. 

Entre seus representantes, a espécie que se destaca dentro do gênero é a Bothrops 

jararacussu, que entre suas características pode medir até 1,8 metros de comprimento, 

possui uma cabeça grande, sendo a Bothrops com maior capacidade de inoculação de 

veneno, assim, sendo responsável por graves acidentes9. É predominantemente 

encontrada no Sudeste e Sul do Brasil. Sua alimentação é diversificada quando 

comparada as outras jararacas, alimentando-se de mamíferos, anfíbios e lagartos. 

Fazendo uma relação direta como a composição bioquímica do veneno com o tipo de 

alimentação, visto que o mesmo veneno precisa ser eficaz para presas fisiologicamente 

distinta10,11. Na tabela 1, é possível verificar a composição geral bioquímica do veneno 

botrópico. 

Venenos de serpentes de um mesmo gênero possuem atividade tóxica muito 

similar, mas perfis de eletroforese diferentes. Assim, o veneno de B. jararacussu 



Tese de Doutorado 

 

 

 

15 

 

 

 

 

apresenta atividade miotóxica mais intensa quando comparado ao veneno de outras 

espécies do gênero. Esta característica é dada pela atividade de Bothropstoxina I, uma 

Lys49 fosfolipase A2 (PLA2), composta por 121 aminoácidos e de massa molecular 

aproximada de 13kDa. Esta proteína está associada a complicações locais como 

necrose12,13. 

Além do problema de saúde pública causado pelos envenenamentos5, o estudo da 

composição do veneno auxilia na elucidação do papel bioquímico possibilitando a 

compreensão de mecanismos fisiológicos e assim, promovendo o desenvolvimento de 

drogas e ferramentas de diagnóstico baseadas nos princípios ativos das toxinas 14.15. 

 
Tabela 1- Resumo da composição Bioquímica do veneno Bothropico. Principais frações 

protéicas, não protéicas e peptídicas identificado no veneno de serpetes do gênero Bothrops, com 
base em (Iwaanaga &Suzuki, 1979 16; Markland, 1998 17). 

 
Principais componentes Bioativos do veneno Botropico 

P
ro

te
ic

o
s
 

Enzimáticos Não Enzimáticos 

P
e
p

tí
d

ic
o

s
 

Desintegrina 

Neurotóxico 

Citotóxico 

Miotóxico 

Potenciadores 

de Bradicinina 

Natriuréticos 

Cardiotóxico 

N
ã
o

 P
ro

te
ic

o
 

Orgânicos 
Não 

orgânicos 

Fosfolipases 

Fosfoesterases 

L- aminoácido oxiade 

Acetilcolinesterase 

Serinoprotease 

Metaloprotease 

Hialuronidases 

Catalases 

Aminotransferases 

Ativadores de fator X 

Lectinas 

 

 Ativadores de 

Proteína C 

 

Fatores de 

Crescimento  

 

Precursores de 

peptídeos bioativos 

Aminas  

Biogênicas 

 

Aminoácidos 

 

Citratos 

 

Nucleotídeos 

Cálcio 

Cobre 

Ferro 

Potássio 

Magnésio 

Manganês 

Sódio 

Fósforo 

Cobalto 

Zinco 

 

Um exemplo muito importante da área de desenvolvimento de fármacos a partir 

de toxinas animais foi a descoberta do inibidor da enzima de conversão da angiotensina 

(ECA), o qual foi estudado a partir da observação do quadro clínico hipotensor adquirido 

em pacientes envenenados por acidentes com a serpente jararaca (Bothrops jararaca), 

e possibilitando o desenvolvimento do medicamento mais utilizado no mundo no 

tratamento de hipertensão, o Captopril®18. Outros importantes fármacos também 



Tese de Doutorado 

 

 

 

16 

 

 

 

 

desenvolvidos a partir de toxinas animais são o de prevenção ao enfarto (Integrelin®) e 

o Selante de Fibrina desenvolvido pelo Centro de Estudo de Veneno e Animais 

Peçonhentos (CEVAP) - UNESP, sendo aplicado como cola biológica, estudos como de 

Sartoti-Filho e colaboradores (1998) constatou uma pesquisa in vivo em nervos ciáticos 

de ratos e pele de coelhos19 e scaffold para células tronco 20.  

   Venenos de escorpião, serpentes, aranhas e caracóis marinhos constituem um 

rico banco natural com mais de 10 milhões de peptídeos bioquimicamente estáveis e 

com propriedades farmacologias próprias21,22.  

A farmacologia reserva o termo “receptor” para interações do tipo reguladoras, 

onde uma pequena molécula pode atuar como agonista, liga-se ao sitio do receptor e o 

ativa, ou atuar como antagonista, liga-se ao sítio do receptor, mas não o ativa. A 

tendência de um ligante interagir com um receptor é denominada afinidade, enquanto a 

capacidade de ativar é chamada de eficácia23.24.   

Para medir a ligação das substâncias aos receptores utiliza-se moléculas 

radioativas (3H, 14C e 123I). O ligante (agonista ou antagonista) com alta afinidade e 

especificidade com possibilidade de ser marcado com radioatividade que permita a 

medida de diminuta quantidade de radiação, onde ocorre a incubação do tecido 

(fragmentos de membrana) com várias concentrações da substancia radioativa até 

atingir o equilíbrio (saturação), remove-se o tecido por lavagem ou filtração e adiciona-

se líquido de cintilação para leitura da radiação. Um ponto importante é a determinação 

de ligações não específicas, que é a capacidade da substância se ligar a outras 

estruturas que não sejam o receptor, então as ligações não específicas são calculadas 

na presença de uma concentração saturada de ligante (não radioativo) que inibe 

totalmente a ligação da substancia radioativa aos receptores, deixando para trás o 

componente não especifico23,25.  



Tese de Doutorado 

 

 

 

17 

 

 

 

 

Os receptores acoplados a proteína-G (GPCRs, G-protein coupled receptors) 

também são conhecidos como heptaelicoidais (com estruturas α-hélices 

transmembrana), e são tidos como receptores de membrana acoplados a sistemas 

efetores intracelulares através de uma proteína G 23,26,27. Estes receptores 

desempenham importantes papeis do ponto de vista médico, farmacológico e 

terapêutico. Em doenças monogênicas, variantes genéticas de GPCR, agonistas e 

antagonistas farmacológicos 28,29,30. 

Os GPCRs constituem uma abrangente família de proteínas de membrana 

possuindo até 1.100 resíduos em uma cadeia polipeptídica codificadas por mais de 800 

genes humanos. São classificados pela IUPHAR (Internacional Union of Basic and 

Clinical Pharmacology) ou GPCRDB (G-protein coupled receptors data base) em quatro 

famílias de acordo sua função e seus ligantes: família rodopsina-like, com 701 

representantes, secretina-like com 24 representantes, a família metabotropicos de 

glutamato/ferormonio com 15 representantes e a família vomeronasais e de paladar com 

24 representantes. Há também dois grupos (receptores de ferormônios e receptores de 

cAMP), porém não são encontrados em mamíferos. Aproximadamente 370 GPCRs 

humanos possuem ligantes endógenos como hormônios e neurotransmissores. Existem 

em torno de 150 GPCRs com funções desconhecidas, estes são denominados 

receptores órfãos 23,31.  

Apesar da variedade da quantidade de receptores dentro das subfamílias, todas 

compartilham da mesma característica de sete domínios hidrofóbicos - 7TM helicoidal -  

conectado com três loops extracelulares e três loops intracelulares. A região N-terminal 

dos receptores se localiza na região extracelular sendo responsável pela interação e 

reconhecimento e modulação dos ligantes. Já o C-terminal se localiza no domínio 

intracelular. As maiores diferenças são observadas especialmente no loop da região 

extracelular, onde as estruturas secundárias se diferenciam 24,32 . 



Tese de Doutorado 

 

 

 

18 

 

 

 

 

Os GPCRs compreendem variados receptores como muscarínicos de acetilcolina, os 

receptores adrenérgicos, receptores de dopamina, receptores de serotonina (5-HT), 

receptores de opiódes, receptores de vários peptídeos, receptores de purina e muitos 

outros, incluindo os quimiorreceptores envolvidos no sentido do olfato33. O primeiro 

receptor GPCR clonado foi o β-adrenérgico em 1986, que então iniciou o estudo, 

tornando-se um marco e início para elucidação e compreensão dos mecanismos desses 

receptores 32,33. 

Estes GPCRs podem ser ativados por uma grande variedade de ligantes, em sua 

maioria agonistas endógenos desde a lipídeos, açucares, componentes orgânicos 

voláteis, aminoácidos, íons inorgânicos, nucleosídeos e nucleotídeos, aminas 

biogênicas, peptídeos (secretina, gastrina, vasopressina, ocitocina) e proteínas 34.  

A ativação de receptores de superfície celular é responsável pela transdução de sinais 

extracelulares, tornando-se uma importante interface de comunicação. Alguns exemplos 

são receptores de GABA A (ansiolítico, antiepilético e anestésico), receptor de insulina 

(hipoglicemiantes), receptor do fator de crescimento vascularendotelial (antitumorais) e 

β1 – adrenoreceptor (anti-hipertensivo).  Os GPCRs estão relacionados a processo 

como neurotransmissao, crescimento, metabolismo e diferenciação celular, secreção e 

defesa imunológica 35. 

Sua expressão na membrana plasmática torna os GPCRs acessíveis, em 

especial para hormônios e drogas, incluindo agonistas e antagonistas, sua expressão 

em diferentes tecidos e células não é uniforme, o que confere seletividade, e em alguns 

casos especificidade36. 

As proteínas de membrana sofrem mudanças conformacionais quando recebem um 

ligante, iniciando uma grande variedade de efeitos fisiológicos e patológicos. Assim, os 

GPCRs são importantes alvos que podem conduzir ao desenvolvimento de fármacos 

para doenças, desde desordens do sistema nervoso central, doenças inflamatórias, 



Tese de Doutorado 

 

 

 

19 

 

 

 

 

doenças cardíacas, doenças monogênicas, câncer e outros. No ano de 2012, 

aproximadamente 40 a 50% dos fármacos comercializados atualmente e 25% dos mais 

vendidos possuem como alvo os GPCRs37,38.  

Os GPCRs estão associados a muitos aspectos da função celular, atuando por 

mecanismos de transdução de sinais, ou seja, a ativação de eventos intracelulares por 

estímulos externos 23. As proteínas G auxiliam no estabelecimento da ligação entre o 

receptor de membrana e a primeira etapa da cascata de transdução de sinais.  Estas 

são as proteínas intermediárias e recebem esse nome pois interagem com os 

nucleotídios de guanina, GTP (guanosina trifosfato) e GDP (guanílicos guanosina 

difosfato). São proteínas de alta massa molecular possuindo três subunidades α, β e ɣ.  

As diferenças entre as subunidades dão origem a sua classificação em treze tipos de 

proteínas G, divididas em quatro famílias, divisão essa dada pela semelhança da 

estrutura e propriedades funcionais. São divididas em:  Gα estimularia (Gαs);  Gα 

inibitória (G α i/o); G α ativadoras de fosfolipases (G α q/11) e Gα que interage com 

transportadores de íons (G α 12/13)35.  

A ativação do receptor inicia-se quando a guanina liga-se à subunidade Gα, e com 

atividade enzimática catalisa a conversão do GDP em GTP. O GPCR quando interage 

com uma molécula agonista sofre uma alteração na sua conformação, adquirindo uma 

afinidade pelo complexo α-β-ɣ , dissociando o GDP ligado e substituindo-o por GTP , 

separando o complexo β-ɣ e consequentemente a liberação α -proteína GTP e o 

complexo β-ɣ. A proteína G , então na sua forma ativa inicia as  cascatas de sinalização 

dentro da célula, tornando possível sua associação com enzimas e canais iônicos, 

levando a ativação ou inativação do processo.  A hidrólise do GTP a GDP da subunidade 

a ocorre através a enzima GTPase, finalizando o processo23,35.  

As toxinas ativas em GCPRs são encontradas em venenos de caracóis marinhos 

e serpentes. Conus produzem toxinas que agem em vasopressinas, neurotensinas e 



Tese de Doutorado 

 

 

 

20 

 

 

 

 

adrenoreceptores 39,40. Venenos de serpentes possuem sarafotoxinas, os quais são 

ativos em receptores endoteliais, toxinas muscarínicas que atuam sobre receptores 

muscarínicos ou β- cardiotoxinas que atuam em β- adrenoreceptores 41,42,43. Eles 

produzem uma ampla variedade de propriedades farmacológicas, atuando como 

agonistas, antagonistas e moduladores alostericos 44. Assim, venenos de animais 

representam uma fonte promissora de novos ligantes para GPCRs. 

 Rouget e colaboradores, 2010 45 encontraram no veneno de serpente Dendroaspis 

angusticeps (Mamba Verde) um GPCR adrenérgico, alvo das neurotoxinas dos 

responsáveis pelo bloqueio da neurotransmissão. As primeiras toxinas muscarínicas 

(MT1 e MT2) isoladas foram isoladas a partir do veneno da Mamba Verde e 

caracterizadas por sua capacidade de inibirem ligações antagonistas não especificas de 

receptores muscarínicos. As MT1 e MT3 foram utilizadas para quantificar receptores 

muscarínicos em cérebros de ratos. A MT1 bloqueou seletivamente 40% dos receptores 

muscarínicos do tipo 1, enquanto a MT3 bloqueou 88% dos receptores 45,47. 

A acetilcolina e os receptores muscarínicos desempenham um importante papel em 

circuitos neuronais da formação do hipocampo, região essa relaciona a aquisição de 

memória. Ensaios quantitativos do receptor muscarínico M4 com toxinas MT3 marcadas 

radioativamente no hipocampo pós-morte em cérebros de paciente com Alzheimer, 

mostraram que a seletividade diminui neste receptor em comparação com o resultado 

da progressão da doença. Em ratos, a MT3 injetada na região hipocampo causou 

amnésia 48. 

Um importante neurotransmissor que possui como alvo GPCRs é a Serotonina 

ou 5-Hidroxitriptamina (5 –HT) é um dos mensageiros químicos mais estudados, e está 

ligado a diferentes efeitos no corpo humano mediados por 14 tipos de receptores, onde 

13 deles estão associados a proteínas G e um receptor 5 HT3 associado a canais 

iônicos. Amplamente encontrados no sistema nervoso central estão envolvidos a 



Tese de Doutorado 

 

 

 

21 

 

 

 

 

processos como êmese, apetite, humor, memoria, respiração, cognição e outras 

funções 23,49,50. 

  Além do sistema nervoso central, a maioria da serotonina é encontrada no trato 

gastrointestinal (GI), sendo produzida por enterocromafins; células que revestem o 

lúmen do intestino, responsáveis por uma maior atividade peristáltica. A serotonina 

encontrada no sangue está envolvida na coagulação sanguínea e vasoconstrição, a 

função que nomeia “sero” (de serum) e “tonina” (tonin, que induz a contração)23.  

A maioria das pesquisas sobre serotonina são realizadas na área de neuropsiquiatria 

para o desenvolvimento de fármacos para diferentes desordens, onde a especificidade 

é extremamente importante para a eficácia farmacêutica. Como exemplo da importância 

da especificidade, o uso de medicamentos a base de pergolida e bromocriptina são 

utilizados no tratamento da doença de Parkinson, entretanto sua venda foi interrompida 

nos EUA devido aos efeitos secundários causados, como indução a hipertrofia da 

válvula cardíaca, relacionada a ação agonista fora do alvo no receptor 5-HT2B. Os 

fármacos que possuem como alvo os receptores de serotonina representam o top de 

vendas na década passada, como antidepressivos, que foram responsável por  onze 

bilhões de dólares nas vendas no ano de 2008 51.  

Os receptores 5-HT são classificados em sete subtipos nomeado de 5-HT 1-7, todos 

acoplados a proteínas G, exceto pelo 5-HT3, o qual tem ação através de canal iônico52. 

Nos receptores da família 5-HT2 podemos encontrar 3 subtipos: 5-HT2A, 5-HT2B e 5-

HT2c. Estes receptores têm sido considerados responsáveis por regularem funções no 

sistema nervoso central como ansiedade, depressão, sono, saciedade e esquizofrenia. 

Modelos animais e humanos tem sido estudado para compreensão do mecanismo de 

diversas doenças. Os ligantes específicos, principalmente agonistas, tem feito a 

identificação dos subtipos de receptores envolvidos em doenças 51,53.  



Tese de Doutorado 

 

 

 

22 

 

 

 

 

O receptor do tipo 5-HT2c se liga a neurotransmissores endógenos. É acoplado a 

proteína Gq/G11 e responsável pela neurotransmissão excitatória. O 5-HT2c em humanos 

é localizado no cromossomo X. Sendo o gênero masculino possuindo apenas uma cópia 

e o gênero feminino duas, o gene é represso, polimorfismo nesse receptor pode afetar 

os dois sexos de maneiras diferentes54. 

A ativação desse receptor por serotonina inibe dopamina e noraepinefrina em 

certas áreas do cérebro. São responsáveis por regularem o humor, ansiedade, 

alimentação e comportamento reprodutivo. Agindo sobre a liberação de dopamina no 

córtex pré-frontal, hipocampos, hipotálamo e amigdala55. Estudos correlatam o elevado 

número de receptores 5HT2C na região pré-frontal do córtex com casos de suicídio. 

Diferente dos receptores 5-HT2A e 5-HT2B, há poucas evidencias dos receptores 5-HT2C 

fora do Sistema nervoso central. Estudos autorradiográficos em camundongos, usando 

ligantes como [3H] -5-HT, [3H] mesulergina e [3H] -LSD, forneceram os locais de 

distribuição ligação de 5-HT2C para o rato e muitas outras espécies56. Locais de ligação 

de 5-HT2C são amplamente distribuídas e presente em áreas do córtex (núcleo olfativo, 

piriforme, cingulado e retroesplenial), sistema límbico (o hipocampo e a amígdala) e o 

gânglios da base (núcleo caudado)57. 

 A farmacologia do receptor 5-HT2C é bem próximo, mas distinguíveis dos outros 

membros da família dos receptores 5-HT2. A maioria dos ligantes de 5-HT2 (por exemplo, 

antagonistas-ritanserina, Mesulergina,) não discriminam suficientemente entre os 

receptores 58. 

A clonagem parcial do receptor 5-HT2C em camundongos por Lubbert 59 foi seguida pelo 

sequenciamento completo em ratos por Julius e colaboradores em 1988 60, e, 

posteriormente, de humanos 61. Um número de agentes antipsicóticos atípicos e típicos 

(incluindo a clozapina, loxapina,e clorpromazina) possuem elevada afinidade para 

receptores 5-HT2C (incluindo, 5-HT2A), alguns antidepressivos usuais convencionais e 



Tese de Doutorado 

 

 

 

23 

 

 

 

 

atípicos também possuem elevada afinidade com esse receptor (por exemplo, 

antidepressivos tricíclicos, doxepina, a mianserina e a trazadona)62. Os receptores 5-

HT2C estão relacionados a alguns comportamentos como hipolocomoção, hipofagia, 

ansiedade, ereções penianas e hipertermia. Receptores 5-HT são alvos indiretos de 

inibidores da reabsorção de serotonina, como a fluoxetina, ou seja, medicamentos 

disponibilizam a serotonina na fenda sináptica. Os medicamentos utilizados no 

tratamento de depressão atuam sobre os inibidores de reabsorção 63. 

Por fim, devido a importância destes receptores para a pesquisa de novos 

medicamente, aliada à alta especificidade e seletividade das toxinas e peptídeos 

derivados dos venenos de serpentes, a busca de novas moléculas com este objetivo faz 

justificar-se plenamente este estudo. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

24 

 

 

 

 

2. OBJETIVOS 

 

2.1. Objetivo Geral 

O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar uma biomolécula/toxina isolada 

do veneno de Bothrops jararacussu com elevada afinidade para receptor acoplados a 

proteína G (GPCR). 

 

2.2. Objetivos específicos 

• Padronizar a metodologia purificação por cromatografia líquida de fase reversa 

(HPLC-RP) do veneno de Bothrops jararacussu; 

• Avaliar as frações obtidas da HPLC-RP através de análises de ligações 

farmacológicas em receptores adrenérgicos β1- β2-; muscarínicos M2-, M3- e 

M5-; histamina H4; dopaminérgico D2; neurotensina NTS1; serotonina 5HT2C e µ-

opioid; 

• Isolar e purificar as frações ativas para o receptor de interesse por HPLC-RP; 

• Identificar a natureza das biomoléculas ativas para o receptor de interesse por 

meio de Espectrometria de Massas; 

• Sequenciar as biomoléculas ativas para os receptores por espectrometria de 

massas ESI-Q-ToF, para peptídeos e proteínas. 

 

 

 

 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

25 

 

 

 

 

3. MATERIAL E MÉTODOS 

 

3.1. Veneno 

O veneno da serpente Bothrops jararacussu foi obtido a partir do “pool” de 

venenos gentilmente cedidos pelo Centro de Estudo de Venenos e Animais 

Peçonhentos (CEVAP-UNESP). Todas as serpentes são microchipadas 

individualmente, criadas e mantidas no CEVAP, garantindo assim a rastreabilidade 

deste veneno.  

 

3.2. Aprovação do projeto de pesquisa pela Comissão de Ética em 

Experimentação Animal 

Esta pesquisa foi certificada e aprovada pela Comissão de Ética em 

Experimentação Animal (CEEA),no dia 02 de agosto de 2012, está registrado sob o 

número de protocolo 957/2012 , conforme anexo 1. 

 

3.3. Isolamento e Purificação 

 

3.3.1. Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC-RP) 

 

O fracionamento do veneno de B. jararacussu foi realizado segundo metodologia 

de Calvete et al, 2011, com modificações, utilizando-se um cromatógrafo líquido LC-

20AT (Shimadzu®). Todos os solventes orgânicos utilizados foram de grau HPLC e a 

água ultrapura do tipo Milli-Q (Milipore®).  

A separação das biomoléculas presentes no veneno de Bothrops jararacussu foi 

realizada sob fase reversa utilizando-se uma coluna C18 (20 X 250 mm) (Shimadzu®). 

Foram aplicadas 30 mg de veneno bruto liofilizado solubilizado em 1 mL de 0,1% (v/v) 



Tese de Doutorado 

 

 

 

26 

 

 

 

 

Ácido Trifluoroacético (TFA) e 5% (v/v) de Acetonitrila, sendo injetado manualmente no 

sistema com o auxílio de um loop de 1 mL. A eluição da amostra foi realizada por meio 

de dois tampões: (A) 0,1% TFA (v/v) e 5% Acetonitrila (v/v); (B) 0,1% TFA (v/v) e 60% 

Acetonitrila (v/v). A coluna foi equilibrada durante 15 minutos com o tampão A. Após o 

equilíbrio utilizou-se um gradiente de 2,5 a 100% do tampão B por 230 minutos, seguido 

de 50 minutos com 100% do tampão B. O fluxo utilizado foi de 1 mL/min, sendo que os 

picos foram coletados manualmente. A eluição foi monitorada na absorbância de 215 

nm. 

Após a análise de ligações descritas conforme o item 3.3.8., as frações que 

revelaram atividade positiva para o receptor, foram então avaliadas por SDS-PAGE 

(item 3.3.2 ) seguido de ultrafiltração (item 3.3.3) para a separação dos compostos de 

baixa massa molecular. Após estes procedimentos, um segundo passo cromatográfico 

por HPLC-RP foi realizado para a sua purificação.  

Assim, as frações positivas foram solubilizados em 1 mL de 0,1% (v/v) Ácido 

trifluoroacético (TFA) e 5% (v/v) de Acetonitrila e injetados manualmente para as etapas 

de refracionamento por meio da estratégia de cromatografia líquida de fase reversa no 

equipamento LC-20AT (Shimadzu®) com o auxílio de um loop de 1 mL. A eluição da 

amostra foi feita através de dois tampões: (A) 0,1% (v/v) TFA; e (B) 0,1%(v/v) TFA e 

100% (v/v) Acetonitrila. Utilizou-se para tanto um método isocrático de 0 -100% do 

solvente B por 35 minutos, tanto para as frações proteicas quanto daquelas de baixa 

massa separadas após a ultrafiltração.  O fluxo utilizado foi de 1 mL/min, sendo que os 

picos foram coletados manualmente. A eluição foi monitorada na absorbância de 215 

nm para peptídeos e 280nm para proteínas. 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

27 

 

 

 

 

3.3.2 Análise Eletroforética SDS-PAGE 

 

Para avaliar a pureza e integridade das amostras foram realizados géis de 

eletroforese SDS-PAGE das frações que revelaram atividade positiva para o receptor 

de serotonina 5HT2C). Foram adicionadas 20 µg das amostras e 20 µL de tampão de 

amostra (glicerol 20% (v/v), β-mercaptoetanol 5% (v/v), SDS 2,3%(v/v), Tris-HCl pH 6,8), 

desnaturadas em banho maria a 70ºC por 15 minutos. As amostras foram aplicadas em 

géis de poliacrilamida à 12% (m/v) com 1 mm de espessura, onde as proteínas foram 

isoladas por meio dos parâmetros: 1o step 100 mA, 150V por 12 minutos e 2o step para 

150 mA, 200 V por 50 minutos, utilizando-se um sistema Bio-Rad® Electrophoresis 

System. Posteriormente, os géis foram corados em um recipiente contendo solução 

composta por 46% (v/v) de etanol, 46% (v/v) de Água, 8% (v/v) de ácido acético e 

corante Coomassie Brilliant Blue. Esta solução foi trocada periodicamente conforme sua 

saturação até que as bandas pudessem ser visualizadas. A massa molecular foi 

estimada pelo padrão de massa molecular ColorBurst™ Electrophoresis Marker (Sigma 

Aldrich®, St. Louis, EUA), contemplando massas moleculares de 8 a 220kDa por meio 

do software Platinum v.7 (Ge Healthcare). 

 

3.3.3 Ultrafiltração 

 

Após a revelação de constituintes protéicos por SDS-PAGE das frações que 

revelaram atividade positiva para o receptor de serotonina 5HT2C, uma processo de 

ultrafiltração foi realizada para a separação das frações de baixa massa molecular e dos 

compostos proteicos por meio do filtro Ultra-4 Amicon® (Millipore® Corporation Belford, 

MA, USA) com auxílio de uma centrífuga a 40000xg  e a 4ºC. As frações foram diluídos 

em 3 mL de água Milli-Q e após a centrifugação, todos os compostos de baixa massa 



Tese de Doutorado 

 

 

 

28 

 

 

 

 

molecular contendo massa molecular de 3 kDa ou menos foram separados e estocados 

em micro tubos, assim como aquelas frações acima desta massa molecular. Após secos 

em SpeedVac® foram mantidas a -20ºC para utilização posterior em testes de ligação 

dos receptores e espectrometria de massas.  

 

3.3.4 Quantificação de proteínas e peptídeos 

 

A quantificação de proteínas foi realizada utilizando medição por UltraVioleta 

(NanoView® - GEHealthcare) a 280 nm . Para determinação da concentração 

aproximada de peptídeos e/ou compostos de baixa massas foi aplicada a metodologia 

de peso seco, onde os micro tubos foram pesados em uma balança de precisão e secos 

por SpeedVac antes e depois de receberem as frações. 

 

3.3.5.Digestão de proteínas in gel 

 

A digestão protéica in gel foi realizada segundo Shevchenko e colaboradores 

(2006). As bandas de proteínas de interesse foram recortados dos géis de eletroforese, 

descoloridos com solução 25 mM bicarbonato de amônio pH 8,0 e 50% (v/v) acetonitrila. 

Em seguida, as proteínas contidas nos spots foram submetidas às etapas de redução e 

alquilação das pontes de dissulfeto na presença de 10 mM DDT e 55 mM Iodoacetamida 

(IAA), respectivamente. Após esta etapa, os géis foram desidratados com 100% (v/v) 

acetonitrila, sendo então, submetidos à centrifugação a vácuo. Os géis desidratados 

foram incubados com uma solução 12,5 nmol/uL de tripsina (Promega) em tampão 25 

mM bicarbonato de amônio, pH 8,0 durante 18 horas a 37oC. A hidrólise foi interrompida 

com a adição de 1% (v/v) ácido fórmico  em relação ao volume da amostra e os 



Tese de Doutorado 

 

 

 

29 

 

 

 

 

sobrenadantes foram coletados e secos por centrifugação a vácuo e posteriormente 

mantidos –20ºC até sua analise por espectrometria de massas. 

 

3.3.6. Sequenciamento peptídico por Espectrometria de Massas  

As análises de espectrometria de massas foram realizadas em um equipamento 

do tipo electrospray (ESI) quadropolo, modelo MicrQ-TOF III (marca Bruker Daltonics), 

acoplado à um cromatógrafo líquido LC-20AT (marca Shimadzu). O cromátografo 

liquido foi equipado com um sistema binário de bombas e um aplicador de amostras 

automático. A fase móvel consistiu de água (A) e acetonitrila (B), contendo 0,1% (v/v) 

ácido fórmico. Em adição, a separação cromatográfica foi realizada por meio de um 

coluna de fase reversa C18 (4,5 mm x 100 mm, 1,8 um). As condições de eluição foi 

otimizada num gradiente linear de 0 a 85% do solvente B por 60 minutos, num fluxo de 

0,2 mL/min. A coluna e o aplicador automático de amostras foram mantidos a 25°C e 

10°C, respectivamente. O volume de injeção dos compostos de referência e das 

amostras foi de 10 uL. O espectrômetro de massas foi atuou com os seguintes 

parâmetros: voltagem do capilar 4.5 kV, temperatura de secagem de 180°C, fluxo de 

nitrogênio de 6 L/min e pressão de 0.8 bar. A calibração externa foi realizada utilizando-

se o kit Tunning MIX ESI (Agilent Tecnologies) antes das análises individuais. Os 

espectros de massas foram adquiridos no modo de ionização electrospray positiva (ESI) 

em um intervalo de ionização entre 100 m/z a 2500 m/z. Cada amostra submetida às 

análises de espectrometria em triplicada. Análises no modo de ionização electrospray 

negativa foram realizadas na presença do solvente metanol obedecendo as mesmas 

condições cromatográficas citadas anteriormente. 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

30 

 

 

 

 

3.3.7. Análise dos dados de Espectrometria de Massas 

Após a espectrometria de massas, os dados foram exportados e submetidos à 

análise automática com a ferramenta de bioinformática MASCOT v.2.1 

(www.matrixscience.com), utilizando os seguintes parâmetros: enzima tripsina; 

taxonomia Chordata; banco de dados SwissProt; modificação fixa carbamidometilação; 

modificação variável oxidação da metionina; uma clivagem perdida pela enzima; massa 

molecular do tipo monoisotópica; erro de tolerância de peptídeos (MS) ± 0,3 Da e erro 

de tolerância (MS/MS) ± 0,5 Da; protonação + 1 e tipo de instrumento ESI-Q-TOF.  

  

3.4. Análise de ligações 

Para análise das ligações entre os receptores e as frações do veneno, os testes 

foram realizados no “Institut de Biologie et Technologies de Saclay (iBiTecS) da 

Commissariat à l'Énergie Atomique (CEA)”, Paris, França, seguindo a metodologia de 

Quinton et al., 201064. 

Para tanto, foi verificada a afinidade entre a toxina de interesse e um radioligante 

específico do receptor. Para o screening (triagem) do veneno total foram avaliados os 

receptores: adrenérgicos β1- β2-; muscarínicos M2-, M3- e M5-; histamina H4; 

dopaminérgico D2; neurotensina NTS1; serotonina 5HT2C e µ-opioid.  

Foram avaliados os venenos de Bothrops jararacussu, Bothrops alternatus, 

Crotalus durissus terrificus e do escorpião Tityus serrulatus. Apenas o veneno de 

Bothrops jararacussu revelou-se positivo para o receptor serotonina 5HT2C, então suas 

frações foram separadas, conforme descrito anteriormente, e avaliadas isoladamente. 

Os experimentos foram realizados em placa de Elisa (96 poços). Foram 

utilizados tampões específicos para cada receptor.  

Para os receptores 5-HT2C utilizou-se o radioligante 3H – mesulergina. Em um 

volume final de 100 μL por poço. As placas foram incubadas por 24h em temperatura 



Tese de Doutorado 

 

 

 

31 

 

 

 

 

ambiente. As reações de ligação foram interrompidas através de filtração por filtros GF/C 

equilibradas com 0,5% de polietilenoimina (PEI) em um coletor de células 

(PerkinElmer®) e as placas foram secas. Foi adicionado Ultimagold O (25 mL; 

PerkinElmer®) em cada poço e as amostras foram contadas utilizando TopCount 

(PerkinElmer®).  

Uma curva de inibição foi ajustada aos dados de ligação utilizando Kaleidagraph 

(inibição Synergy® Software, Reading, PA, EUA). Os valores de IC50 foram convertidos 

em Ki para experiências de competição, utilizando a equação de Cheng-Prusoff. 

Experiências de saturação de equilíbrio foram realizados com várias 

concentrações de ligante radioativo e uma quantidade constante de receptor. Ensaios 

cinéticos foram realizados utilizando uma quantidade constante de ligante radioativo e 

receptor, com vários tempos de incubação. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

32 

 

 

 

 

4. RESULTADOS 

 

4.1 Isolamento e Purificação  

4.1.1. Cromatografia Líquida – Fase Reversa 

 

       Obtivemos 97 frações a partir do veneno total de Bothrops jararacussu 

(Figura 1), por cromatografia liquida de fase reversa. Todas frações foram coletados 

manualmente, separados em micro tubos e liofilizados. Cada fração foi testada 

individualmente por sua capacidade de inibir o ligante radioativo ao receptor alvo. 

Para obtenção de material necessário para os estudos, foram realizadas 10 

coletas cromatográficas com 30 mg de veneno cada. Os perfis cromatográficos foram 

semelhantes, onde 97 frações foram coletados constantemente, entretanto, algumas 

frações apareciam esporadicamente, levando a soma total de 106 frações coletados 

de todas aplicações. 

As frações 70 e 71, consideradas positivas nos testes de análise de 

ligação, foram ultrafiltradas para separar compostos (até 3KDa) e 

recromatografadas por fase reversa e coletadas manualmente (figura 2A e 2B; 

3A e 3B), as frações majoritárias foram nomeado com fração70_4, fração 70_5, 

fração 71_2 e fração 71_5. 

 

Figura 1 – Cromatografia de alto desempenho sob fase reversa do veneno total de Bothrops 
jararacussu, em uma coluna C18 (20 X 250 mm). Utilizando tampões (A) 0,1%(v/v)  TFA e 5% (v/v)  
Acetonitrila e (B) 0,1%(v/v)  TFA e 60% (v/v)  Acetonitrila e fluxo utilizado de 1 mL/min. Foram obtidas 
97 frações. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

33 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A

 

B

 
 A 

A 

 Figura 3 – Cromatografia de alto desempenho sob fase reversa da fração 71 de Bothrops jararacussu, em 
uma coluna C18 (20 X 250 mm). Utilizando tampões A: 0,1% (v/v)  TFA e B: 0,1% (v/v) TFA e 100% (v/v)  
Acetonitrila, com um gradiente de 80% do tampão B por 35 minutos. (A) perfil cromatográfico dos compostos 
até 3KDa da fração 71, onde as frações majoritárias 71_2 e 71_5 foram coletados. (B) Perfil cromatográfico 
da porção proteica ultrafiltrada da fração 71. 

B

 
 A 

70_4 

70_5 

 Figura 2 – Cromatografia de alto desempenho sob fase reversa da fração 70 de Bothrops jararacussu, em uma 
coluna C18 (20 X 250 mm). Utilizando tampões A: 0,1%(v/v)  TFA e B: 0,1%(v/v)  TFA e 100%(v/v)  Acetonitrila, 
com um gradiente de 75% do tampão B por 35 minutos. (A) perfil cromatográfico dos compostos até 3KDa da 
fração 70, onde as frações majoritárias 70_4 e 70_5 foram coletados. (B) Perfil cromatográfico da porção 
proteica ultrafiltrada da fração 70. 

71_2 

71_5 

A

 
 A 

B

 
 A 

71_4 

71_5 

A

 
 A 



Tese de Doutorado 

 

 

 

34 

 

 

 

 

4.1.2. Análise Eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 

 

A análise eletroforética realizada em gel de poliacrilamida a 12% (m/v), 

sob condições desnaturantes e reduzida das frações 70 e 71(figura 4), em 

duplicata, evidenciou que as frações apresentam perfis similares de bandas. 

 

O padrão sugere a presença de proteínas de 45 KDa e 20 KDa, não sendo 

possível identificar a presença de peptídeos por esse gel, visto que os 

peptídeos podem ser marcados somente abaixo de 4KDa. Conduzindo ao 

próximo passo de recomatografia das frações e ultrafiltração de proteínas e 

compostos de baixa massa.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4-  Análise eletroforética em gel de poliacrilamida 12% (m/v) 
evidenciando o padrão molecular (PMM) dos frações 70 e 71 obtidas a partir 
do veneno de Bothorps jararacussu. A constatação de três bandas por fração 
aproximadamente de 45kDa, 20kDa e 8kDa. 

Fr 70 Fr 71 

M
a

ss
a

 m
o

le
c
u

la
r
 

A A 

B B 

C C 



Tese de Doutorado 

 

 

 

35 

 

 

 

 

4.1.3 Quantificação proteica e pesagem seca para compostos de baixa 

massa 

 

Após a coleta das 97 frações, estas foram secas em SpeedVac, 

armazenadas em microtubos e solubilizadas em 1 mL de água MilliQ. Todas 

frações foram quantificadas em triplicata por UV280nm. 

A concentração de proteínas foi de 65,09 mg/mL para a fração 70 e 5,89 

mg/mL para a fração 71. 

Foram quantificados por peso seco as frações majoritárias dos compostos 

de baixa massa ultrafiltrados. Na fração 70 de compostos de baixa massa foram 

selecionadas frações majoritários da fração 70 (70_4 e 70_5) e na fração 71 

(71_2 e 70_5). A fração 70_4 com aproximadamente 0,5 mg e a fração 70_5 com 

0,5 mg, e as frações 71_2 e 71_5 ambos com aproximadamente 0,5 mg.  

 

4.1.4 Identificação de proteínas por Espectrometria de Massas (LC-MS/MS) 

 

Identificar as proteínas das frações 70 e 71 foram analisadas por um 

espectrômetro de massas híbrido do tipo ESI-Q-TOF (Bruker Daltonics, modelo 

micrOTOF-QIII). As seis bandas reveladas nas frações 70 e 71 do veneno de 

Bothrops jararacussu foram excisadas, digeridas e analisadas por 

espectrometria de massas em modo positivo (ESI+), Os resultados foram 

apresentados na tabela 1. Com auxílio da ferramenta MASCOT, as sequencias 

peptídicas encontradas. Os resultados das sequencias encontradas foram 

submetidas ao banco de dados SwissProt para verificação de proteínas 

homólogas. 

 

Tabela 1 – Relação das sequencias das frações do veneno de Bothrops jararacussu similares 

depositadas no banco de dados MASCOT. 

 
No da amostra 

 

 
Código de 

Acesso 

 
Nome da Proteína 

 
Mascot 
score 

 
Função  

Fração 70_A Q7T229 VSPH_BOTJR 154 Serino protease – Bothrops jararacussu 

Fração 70_B P83519 LECG_BOTJR  204   Lectina tipo C - Bothrops leucurus 

Fração 70_C P45881 PA2B2_BOTJR  39 Fosfolipase A2 – Botropstoxina-II 



Tese de Doutorado 

 

 

 

36 

 

 

 

 

Fração 71_A Q7T229 VSPH_BOTJR 166 Serino protease – Bothrops jararacussu 

Fração 71_B Q072L6 VSPL_BOTAS 192 Trombina-like Bothrops asper 

Fração 71_C P8697 PA2BD_BOTLC 131 Fosfolipase A2 – Bothrops leucurus 

 

 

As frações 70_A e 71_A apresentaram similaridade a serino protease 

isolada a partir do veneno de Bothrops jararacussu depositada sob o código de 

acesso Q7T229. A fração 70_B foi similar a lectina tipo C encontrada no veneno 

de Bothrops leucurus sob o código de acesso P83519. A fração 70_C, apesar do 

baixo score, apresentou similaridade com a PLA2 isolada a partir do veneno de 

Bothrops jararacussu, que é encontrada pelo código de acesso P45881.A fração 

71_B apresentou similaridade com a proteína de código Q072L6, uma trombina-

like isolada a partir do veneno de Bothrops asper. E a fração 71_C apresentou 

similaridade com a PLA2 do veneno de Bothrops leucurus depositada sob o 

código de acesso P8697. 

 

4.1.5 Determinação da massa molecular de compostos de baixa 

massa  

 

As frações majoritárias recromatografados (fração 70_4, fração 70_5, 

fração 71_2 e fração 71_5) dos compostos até 3 kDa foram analisados tanto em 

modo positivo (figuras 5,6,7 e 8) como negativo (resultados não apresentados). 

A integração das frações e o processamento manual dos cromatogramas 

revelam a presença apenas de composto de baixa massa como esperado para 

as porções ultrafiltradas até 3 kDa. Entretanto, os perfis apresentados não 

sugerem a fragmentação de compostos peptídicos. As frações de composto de 

baixa massa analisados por LC-MS foram ionizados tanto no modo negativo (ESI 

-) como no modo positivo (ESI+). Foram identificados composto até 400 Da. 

Na  tabela 2, os principais íons do pico 70_4, pico 70_5, pico 71_2 e pico 

71_5 analisados em modo positivo (ESI +) são apresentados. Todos íons 

apresentaram íon carga +1 como exemplificado na figura 9. 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

37 

 

 

 

 

Tabela 2 – Relação massa/carga [M+H]+  encontrada na espectrometria de 

massas. 
 

FRAÇÃO 70_4 DA 70_5 DA 71_2 DA 71_5 DA 

M/Z 

177.1028 
195.1123 
239.1350 
238.1604 
305.1407 
321.1103 
337.0242 
365.1611 
415.2340 
435.0947 
474.1046 

 

176.1028 
194.1123 
238.1350 
237.1604 
304.1407 
320.1103 
336.0242 
364.1611 
414.2340 
434.0947 
473.1046 

 

244.9794 
288.2718 
262.9877 
309.1146 
327.1841 
337.0214 
349.1670 
353.1396 
371.2109 
380.9473 
393.1922 
415.2340 

 

243.9794 
287.2718 
261.9877 
308.1146 
326.1841 
336.0214 
348.1670 
352.1396 
370.2109 
379.9473 
392.1922 
414.2340 

 

261.1171 
309.1160 
391.0704 
416.2058 

 

260.1171 
308.1160 
390.0704 
415.2058 

 

415.2432 
327.1883 
349.1710 

414.2432 
326.1883 
348.1710 

 

 

Figura 9 – Espectrometria de massas do tipo ESI-IT-TOF/MS da fração 71_2 em modo 
positivo. [M+H]+ 415.2340 e seus isótopos, [M+H]+ 416.2314 e [M+H]+ 417.2307. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

38 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 

Figura 5 –Espectrometria de massas do tipo ESI-IT-TOF/MS da fração 70_4 em modo 
positivo. 

A 

B 

C 

D 



Tese de Doutorado 

 

 

 

39 

 

 

 

 

 
 
 

 

Figura 8 – Espectrometria de massas do tipo ESI-IT-TOF/MS da fração 71_2 em modo positivo. [M+H]+ 415.2340 e seus isótopos, 
[M+H]+ 416.2314 e [M+H]+ 417.2307. 

Figura 6 – Espectrometria de massas do tipo ESI-IT-TOF/MS da fração 70_5 em modo 
positivo. 

A 

B 

C 

D 



Tese de Doutorado 

 

 

 

40 

 

 

 

 

 
 

4.2 Analise de ligações 

4.2.1 Análise de ligações dos venenos brutos 

 

Nesta primeira etapa as análises de ligações realizadas pelo “Institut de 

Biologie et Technologies de Saclay (iBiTecS) da Commissariat à l'Énergie 

Atomique (CEA)”, possuíram a função de verificar a afinidade do veneno total de 

Bothrops alternatus, Bothrops jararacussu, Crotalus durissus terrificus e Tityus 

serrulatus para os receptores adrenérgicos β1- β12-, receptores muscarínicos 

M2-, M3- e M5-, receptor de histamina H4, receptor dopaminérgico D2 , receptor 

neurotensina NTS1, receptor serotonina 5HT2C e receptor µ-opioid. As ligações 

foram medidas analisando a afinidade entre o veneno e o ligante radioativo (L*) 

Figura 8 – Espectrometria de massas do tipo ESI-IT-TOF/MS da fração 71_5 em modo 
positivo. 

C 

B 

A 



Tese de Doutorado 

 

 

 

41 

 

 

 

 

especifico do receptor. Ou seja, o veneno compete pelo sítio de ligação e ocupa-

o não permitindo que o ligante específico se ligue ao receptor. 

Os quatro venenos foram testados de acordo com o exemplo (figura 10) 

no esquema da placa de Elisa. 

 

 

 

Os venenos de Bothrops alternatus, Bothrops jararacussu, Crotalus 

durissus terrificus e Tityus serrulatus não apresentaram afinidade para os 

receptores do tipo β2, como mostra a figura 11. Tanto o veneno oxidadado como 

o reduzido apresentaram o mesmo perfil de ligações quando colocados na 

presença do receptor, não sendo considerados assim, ativos para este receptor. 

O radioligante específico utilizado foi o 3H - DHA (dihydroalprenolol).  

 

 

 

Figura 10 –  Esquema de uma placa de Elisa para o experimento da análise de 
ligação. Os venenos totais foram testados na sua forma oxidada e reduzida. NS 
(no specific bindings) representa teste de ligações não especificas e o BT 
(binding total) ligações totais. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

42 

 

 

 

 

 

 

 

As análises de ligações dos venenos de Bothrops alternatus, Bothrops 

jararacussu, Crotalus durissus terrificus e Tityus serrulatus para receptor 

muscarínicos M2 (figura 12A) e o radioligante 3H NMS.   Os venenos de Bothrops 

alternatus, Crotalus durissus terrificus e Tityus serrulatus não apresentaram 

atividade diante a presença do receptor M2, diferente do veneno de B 

jararacussu considerado ativo para o receptor. Foi refeita a análise de ligação 

apenas para o B jararacussu e o receptor muscarínicos M2 onde o resultado 

anteriormente alcançado não foi repetido, assim, o veneno de B jararacussu 

descartado como ativo para o receptor muscarínicos M2 (figura 12B). 

 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

0

500

1000

1500

2000

2500

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10
4

130702-3H DHA- CEVAP Cdt Bj- b2AR

Cdt OXY

Cdt RED

Bj OXY

Bj RED

B
T

 (
cp

m
)

vol nl

0

500

1000

1500

2000

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10
4

130702-3H DHA- CEVAP Ts Ba- b2AR

Ts OXY

Ts RED

Ba OXY

Ba RED

B
T

 (
cp

m
)

vol nl

Figura 11 –  Inibição da ligação do radioligante (3H- DHA ) pelo veneno total Crotalus durissus 
terrificus oxidado (Cdt OXY), Crolatus durissus terrificus reduzico (Cdt RED), Bothorps 
jararacussu oxidado, Bothrops jararacussu reduzido (BJ RED), Tityus serrulatus oxidado 
(TsOXY), Tityus serrulatus reduzido (TsRED), Bothrops alternatus oxidado (Ba OXY) e 
Bothrops alternatus reduzido (Ba RED). Não houve inibição significativa que indicasse que os 
componentes do veneno se ligaram ao receptor adrenérgico β2. 
 



Tese de Doutorado 

 

 

 

43 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

As análises de ligações dos venenos de Bothrops alternatus, Bothrops 

jararacussu, Crotalus durissus terrificus e Tityus serrulatus para receptor de 

serotonina 5HT2C (figura 14) e o radioligante 3H Mesulergina.               

Os venenos de Crotalus durissus terrificus e Tityus serrulatus também não 

apresentaram atividade diante a presença do receptor 5HT2C, diferente do 

veneno de B jararacussu e Bothrops alternatus,o qual foi considerado ativo para 

o receptor. 

Figura 13 –  (13A) Inibição da ligação do radioligante (3H- NMS ) pelo veneno total Crotalus durissus 
terrificus oxidado (Cdt OXY), Crolatus durissus terrificus reduzico (Cdt RED), Bothorps jararacussu oxidado, 
Bothrops jararacussu reduzido (BJ RED), Tityus serrulatus oxidado (TsOXY), Tityus serrulatus reduzido 
(TsRED), Bothrops alternatus oxidado (Ba OXY) e Bothrops alternatus reduzido (Ba RED). Não houve 
inibição significativa que indicasse que os componentes do veneno se ligaram ao receptor Muscarínico M2, 
exceto pelo veneno de Bothorps jararacussu.  O qual em um segundo ensaio (13B) não apresentou 
atividade, assim sendo descartado como possível candidato. 
 

B 
A 



Tese de Doutorado 

 

 

 

44 

 

 

 

 

 

 
 

O veneno total de Bothrops jararacussu e B alternatus foi então testado novamente 
(figura 15) para o receptor 5HT2C. Apenas o Bothrops jararacussu apresentou-se 
como candidato mais promissor aproxima etapa de cromatografia líquida – fase 
reversa para testes das 97 frações obtidas. 

Figura 14 –  Inibição da ligação do radioligante (3H- Mesulergina ) pelo veneno total Crotalus 
durissus terrificus oxidado (Cdt OXY), Crolatus durissus terrificus reduzico (Cdt RED), 
Bothorps jararacussu oxidado, Bothrops jararacussu reduzido (BJ RED), Tityus serrulatus 
oxidado (TsOXY), Tityus serrulatus reduzido (TsRED), Bothrops alternatus oxidado (Ba OXY) 
e Bothrops alternatus reduzido (Ba RED). Não houve inibição significativa que indicasse que 
os componentes do veneno se ligaram ao receptor de serotonina 5-HT2C, exceto pelo veneno 
de Bothorps jararacussu e Bothrops alternatus oxidado (Ba OXY) e Bothrops alternatus 
reduzido (Ba RED) ,os quais se demonstraram ativos onde o número de ligações do veneno 
oxidado foi superior ao do veneno na sua forma reduzida. 

Figura 15 –  Inibição da ligação do radioligante (3H- Mesulergina ) pelo veneno total de Bothorps 
jararacussu oxidado (BJ OXY) ,  Bothrops jararacussu reduzido (BJ RED), Bothrops alternatus 
oxidado (Ba OXY) e Bothrops alternatus reduzido (Ba RED) ao receptor de serotonina 5-HT2C, os 
quais apresentou atividade onde o número de ligações do veneno oxidado foi superior ao do veneno 
na sua forma reduzida. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

45 

 

 

 

 

4.2.2. Análise de ligação do veneno de Bothrops jararacussu 

 

Primeiramente o veneno total (não fracionado) foi testado nos receptores. Para 

evitar resultados falsos positivos, o veneno foi utilizado em duas formas, na  

forma 

total (natural/oxidada) e reduzida (tratamento por TCPE, que quebra as pontes 

de dissulfeto inativando o veneno). Novamente foi analisada a capacidade do 

veneno total (Figura 16) em inibir a ligação do radioligante, desta vez o 

raiologante utilizado foi - 3H N-methylscopolamine (3H- NMS) - com o receptor de 

serotonina (5HT2C). Houve queda no número de ligação total (BT- Binding total, 

eixo X) do veneno total oxidado (ativo) de maneira dose-dependente da 

concentração (eixo Y), enquanto o veneno total reduzido manteve o mesmo perfil 

de ligações.  O veneno demonstrou afinidade, sendo levado a próxima etapa de 

fracionamento para identificar a fração responsável pela afinidade.  

As 106 frações foram testadas também no receptor 5HT2c (Figura 17), 

onde a fração 70 e 71 reduziram significativamente a ligação do radioligante ao 

receptor. 

Figura 16- Inibição da ligação do radioligante (3H- NMS ) pelo veneno total de 
Bothrops jararacussu oxidado (BJ OXY) ,  Bothrops jararacussu reduzido (BJ RED). 
Onde o veneno oxidado apresentou-se ativo. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

46 

 

 

 

 

 

Figura 17- Resultado obtido da análise de ligações das 97 frações do veneno de 

Bothrops jararacussu. O poço G7 (destacado em vermelho) contém as frações 70 e 71. 

A afinidade é demonstrada pelo valor no número de ligações atingidas serem de 

aproximadamente a metade das ligações totais (BT). Indicando afinidade e 

competitividade com o radioligante utilizado, assim sugere-se que o peptídeo presente 

na fração possui alta afinidade com o receptor 5HT2C. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

A1  B1  C1  D1  E1  F1  G1   A2  B2  C2  D2  E2  F2  G2   A3  B3  C3  D3  E3  F3  G3   A4  B4  C4  D4  E4  F4  G4   A5  B5  C5  D5  E5  F5  G5   A6  B6  C6  D6  E6  F6  G6 BTBT NS

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

  A
7

  B
7

  C
7

  D
7

  E
7

  F
7

  G
7

  A
8

  B
8

  C
8

  D
8

  E
8

  F
8

  G
8

  A
9

  B
9

  C
9

  D
9

  E
9

  F
9

  G
9

  A
1

0
  B

1
0

  C
10

  D
1

0
  E

1
0

  F
1

0
  G

1
0

  A
1

1
  B

1
1

  C
11

  D
11

  E
1

1
  F

1
1

  G
1

1

  A
1

2
  B

1
2

  C
12

  D
1

2
  E

1
2

  F
1

2
  G

1
2 B
T

B
T

N
S



Tese de Doutorado 

 

 

 

47 

 

 

 

 

6. DISCUSSÃO 

As biomoléculas ativas isoladas a partir do veneno de animais têm 

demonstrado um grande potencial para elucidação de vias farmacológicas e 

fisiológicas, auxiliando assim, na caracterização identificação de novos 

receptores e melhor compreensão dos já existentes65. Este interesse é devido à 

alta especificidade e seletividade destas biomoléculas aos seus receptores e seu 

estudo é realizado através da análise de ligação (toxina-receptor) e das 

respostas desencadeadas. Um dos grandes grupos de receptores que tem 

despertado grande interesse da indústria farmacêutica são os Receptores 

acoplados a proteínas G (GPCRs), pois apesar de amplamente estudados pelo 

envolvimento em processos fisiológicos e doenças, ainda possuem uma grande 

quantidade de receptores órfãos, ou seja, que não são conhecidas suas funções 

66. Portanto, a compreensão das propriedades de ligação a GPCRs tornam os 

venenos animais promissoras fontes de estudo para identificação e elucidação 

destes mecanismos67. 

 Calvete et al, 200768 destacaram técnicas e estratégias importantes para 

venômica de serpentes, iniciando pelo fracionamento do veneno bruto por 

cromatografia liquida de alta eficiência em fase reversa (HPLC-RP), seguida das 

metodologias de sequenciamento do N-terminal, SDS-PAGE, eletroforese 

bidimentsional e espectrometria de massas para determinação da massa 

molecular e sequenciamento. Essas técnicas combinadas permitem a 

caracterização estrutural das frações obtidas a partir do veneno bruto.  

O fracionamento do veneno total de Bothrops jararacussu realizado por 

HPLC-RP utilizada neste estudo apresentou-se adequado como primeiro passo 

cromatográfico para a separação dos componentes do veneno permitindo assim 

a ampla visualização do perfil cromatográfico.  

Apesar de outros autores utilizarem, como primeiro processo de 

separação, a cromatografia líquida por troca iônica, para então, num segundo 

momento utilizar o HPLC-RP 69,70,71. Em nossos resultados um maior número de 

frações  foram obtidas. Além disso, autores como Calvete et al 201172 e 

Calgarotto et al 200817 que aplicaram o HPLC-RP como um primeiro passo de 



Tese de Doutorado 

 

 

 

48 

 

 

 

 

separação dos componentes proteicos do veneno de B atrox e B. moojeni 

obtiveram de 30-39 frações para veneno de B. atrox e 13 frações para o veneno 

de B. moojeni respectivamente. Através da metodologia utilizada neste estudo, 

obtivemos 97 frações. 

Esta estratégia de fracionamento permitiu, com apenas uma etapa 

cromatográfica, a realização de um screening inicial especificamente para os 

receptores já identificados através da análise do veneno total. Foram avaliados 

inicialmente o pool dos venenos de Bothrops jararacussu, B. alternatus, Crotalus 

durissus terrificus e de Tityus serrulatus. Destes, o único veneno a mostrar 

afinidade pelos receptores avaliados foi o de B. jararacussu, sendo que mostrou 

afinidade apenas para os receptores 5 HT2c, os quais correspondem a GPCRs 

de serotonina. As frações que apresentaram afinidade para este receptor foram 

as de número 70 e 71, tendo a sua eluição com o tempo de 200 minutos dentro 

da metodologia adotada. 

Os experimentos de ligação adotaram o modelo de saturação segundo 

Quinton et al, 201064, os quais possuem como objetivo medir a ligação do 

radioligante (ou algum ligante que possa ser lido posteriormente) ao receptor. 

Para isso, obter uma estimativa de equilíbrio da constante dissociação do 

complexo radioligante-receptor (Kd) e o máximo número de sítio de ligações 

(Bmax).  

A análise do gel de SDS-PAGE 12% evidenciou que as frações de 

interesse, ou seja, as de número 70 e 71, apresentaram duas bandas por fração, 

ambas com marcação em torno de 45 KDa e 20 KDa. Desta maneira, devido ao 

fato de que a ação sobre estes tipos de receptores serem mais comum entre os 

peptídeos e compostos de baixa massa, utilizamos a técnica de ultrafiltração 

para separação de compostos de até 3 KDa22.  A ultrafiltração mostrou-se 

eficiente, comprovado por SDS-PAGE sob as mesmas condições. O fato de 

estas frações apresentarem diferentes compostos ocorreu devido ao fato de que 

as características hidrofóbicas destes componentes serem muito próximas e 

apenas uma etapa cromatográfica não foi suficiente para separá-los73. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

49 

 

 

 

 

Através da análise eletroforética SDS-PAGE 12%, foram recortadas 3 

bandas tanto da fração 70 e 3 bandas da fração 71. A segunda etapa 

cromatográfica realizada apenas nas frações de baixa massa mostrou dois picos 

majoritários na fração 70 e apenas um pico na fração 71. Pela quantificação 

proteica realizada estimou-se 65,09 mg/mL para a fração total 70 e 5,89 mg/mL 

para a fração total 71.  

Moléculas bioativas como fosfolipase A2, metaloproteases, desintegrinas, 

serino proteases, L- amino oxidase e fatores de crescimento são encontrados 

em venenos e tem se apresentado como promissores candidatos a tratamentos 

de doenças, e assim, intensamente estudados para sua identificação, 

caracterização e elucidação de seus mecanismos. Em especial, venenos de 

serpentes do gênero Bothrops, os quais possuem proteínas como fosfolipases 

A2 (PLA2), serino proteases e metaloproteases em sua composição. Em estudos 

da glândula de veneno da serpente B. jararacussu foram encontrados oito 

sequencias de alta similaridade (93%) a serino proteases cDNA. Três enzimas 

coagulantes responsáveis pela indução da proteólise do fibrinogênio foram 

purificadas a partir do veneno B. jararacussu, entretanto apenas caracterizadas 

apenas em nível de proteína 74,75.    

 

As serino proteases possuem ação enzimática clivando ligações 

peptídicas. Possuem a denominada tríade catalítica composta por três 

aminoácidos His57, Asp102 e Ser195 (segundo numeração do 

quimotripsinogênio). Sua conformação permite a alta reatividade da serina. As 

serino proteases encontradas em venenos (SVSPs-Snakr Venom Serine 

Proteases) atuam sobre a homeostasia do organismo através das proteínas 

plasmáticas alterando a pressão sanguínea, fibrinólise, coagulação sanguínea, 

agregação plaquetária, sistema complemento e sistema nervoso. As SVSPs da 

família Viperidae estão presentes em até 20% das proteínas do veneno 76,77. A 

partir da análise das frações protéicas isoladas neste estudo, as frações 70A e 

71A apresentaram similaridade com a serino protease do veneno de Bothrops 

jararacussu nomeada VSPH_BOTJR. 



Tese de Doutorado 

 

 

 

50 

 

 

 

 

 

A fração 70B apresentou similaridade com a proteína denominada 

LECG_BOTJR. Esta é uma lectina tipo C isolada a partir do veneno de B 

jararacussu78. Sua capacidade de ligar de maneira reversa a carboidratos 

permite alta taxa de aglutinação de hemácias. Em especial, a lectina de tipo C 

(CLEC) é uma proteína que liga-se a carboidratos e depende de cálcio para 

efetuar a ligação. Estão relacionadas a adesão celular, a resposta imune a 

patógenos e também a apoptose. Quando injetada em patas de ratos79 provoca 

edema e aumenta a permeabilidade vascular. Já em experimentos realizados 

com ratos anestesiados, foi responsável pela diminuição a pressão arterial em 

cerca de 15%, com um rápido retorno ao nível de repouso. Em estudos a lectina 

BJcuL teve papel no combate a progressão tumoral inibindo o câncer e o 

crescimento de células endoteliais80. 

A fração 70C apresentou similaridade com a fosfolipase A2 nomeada 

PA2B2_BOTJR. As fosfolipases A2 em geral são encontradas em venenos de 

serpente, principalmente do gênero Bothrops. Em testes realizados em patas de 

rato in vivo, induziu necrose muscular juntamente com infiltração de células 

polimorfo nucleares. As fosfolipases A2 também tem sido descritas por suas 

atividades neurotóxicas, edematogênicas, agregação plaquetária, hipotensora e 

cardiotóxica81. 

As PLA2s miotóxicas descritas no veneno de Bothrops são Asp-49, 

variantes cataliticamente ativos ou Lys-49, homólogos enzimaticamente inativos. 

A brothropstoxina II (BthTX-II) isolada a partir do veneno de B. jararacussu 

desempenha efeito miotóxico e coagulante, induzindo também agregação 

plaquetária e secretando sinais de vias de transdução82.  

A similaridade encontrada na fração 71B foi relacionada a proteína 

VSPL_BOTAS, uma trombina-like da serpente B. asper. Essa trombina-like é 

uma serino protease com atividade coagulante em plasma humano e fibrinogênio 

bovino. Quando injetada de maneira intravenosa em ratos, é responsável pela 

atividade anticoagulante. Em ensaios realizados em ratos esta trombina-like 



Tese de Doutorado 

 

 

 

51 

 

 

 

 

exibiu atividade na homeostasia da cascata de coagulação tanto in vivo como in 

vitro83.  

 E finalmente, a fração 71C com similaridade para a proteína denominada 

PA2BD_BOTLC.  Uma PLA2 isolada a partir do veneno de B. leucurus. As PLsA2 

podem apresentar diferentes isoformas e pontos isoelétricos característicos, e 

são classificados como ácidos, básicos ou neutros. a sequência de aminoácidos 

descrita apresentou um elevado nível de homologia (75 - 93%) com fosfolipases 

A2 de diferentes espécies, sendo 100% homologa com a PLA2 do veneno de B 

jararacussu, sequencia esta deduzida de acordo com o banco de dados cDNA84. 

 As frações majoritárias de baixa massa 70_4, 70_5, 71_2 e 71_4 obtidos 

após ultrafiltração e recomatrografia por HPLC-RP quando analisados por 

espectrometria de massas apresentaram massa de até 400Da, não sendo este 

um perfil de peptídeos85. 

Os receptores de serotonina 5-HT estão acoplados a proteínas G e 

subsequentemente ativação da fosfolipase C, indução do fosfoinositol e aumento 

da concentração do cálcio no meio intracelular. Estes receptores geralmente são 

caracterizados tanto por teste de ligação radioativa86 como por estudos 

funcionais.  A seletividade dos ligantes, em particular os agonistas, tem auxiliado 

na identificação dos subtipos de receptores associados a doenças87,88. 

Estudos similares com venenos de Phoneutria nigriventer e GPCRs 

relataram que receptores de serotonina 5- HT4 desempenham um importante 

papel na ativação na de fibras nervosas sensoriais nociceptivos por veneno de 

e sugerem estar relacionada ao desenvolvimento da dor e da inflamação a 

picadas desta aranha 89. 

Segundo England L et al 199829, a toxina GVIIIA Sigma isolada a partir do 

veneno de Conus possui habilidade de inativar o 5-HT3, um canal iônico de 

serotonina excitatório dependente. A conotoxina possui um resíduo de triptofano, 

o qual provavelmente pode ser importante para a atividade do peptídeo, pois o 

ligante endógeno do 5 HT3 é um hidroxilado derivado do triptofano. A conotoxina 

inativou o receptor 5 HT3 por antagonismo competitivo e é um inibidor altamente 



Tese de Doutorado 

 

 

 

52 

 

 

 

 

seletivo para esse receptor. Assim, o receptor 5 HT3 passou a ser incluso entre 

os alvos de neurotoxinas naturais. 

Até o presente momento não foram encontrados estudos que relatem 

afinidade e especificidade de frações do veneno de Bothrops jararacussu para 

GPCRs. Desta maneira a identificação de um receptor de serotonina 5-HT2c, 

torna-se de extrema relevância. Outros estudos serão realizados a fim de 

identificar a toxina que interage com o receptor 5-HT2C. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

53 

 

 

 

 

6. CONCLUSÃO 

    Até o presente momento o veneno de Bothrops jararacussu apresentou 

promissoras biomoléculas com afinidade para receptor acoplados a proteínas 

G, em especial, receptores de serotonina 5-HT2C, por técnicas de proteômica 

e ensaio de ligações tem se mostrado eficiente. Não foram encontrados 

relatos na literatura trabalhos similares com o veneno de Bothorps 

jararacussu e receptores de serotonina.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



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Tese de Doutorado 

 

 

 

62 

 

 

 

 

 

 

 

 

ANEXO 

 



Tese de Doutorado 

 

 

 

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