UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS, BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA FERNANDA DE OLIVEIRA PRODUÇÃO DE COLORANTES NATURAIS POR Talaromyces amestolkiae PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL ARARAQUARA – SP 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS, BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA FERNANDA DE OLIVEIRA PRODUÇÃO DE COLORANTES NATURAIS POR Talaromyces amestolkiae PARA APLICAÇÃO INDUSTRIAL ARARAQUARA – SP 2020 Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Ciências. Orientadora: Profª. Drª. Valéria de Carvalho Santos Ebinuma Agradecimentos Dedico a todos que me apoiaram e auxiliaram durante todo o processo! Em especial, aos meus pais Soeli e Sebastião, que mesmo longe, me incentivaram e me apoiaram. Agradecimentos Aos meus pais SOELI e SEBASTIÃO por serem exemplos de coragem, por todo apoio incondicional e esforço para que meus sonhos fossem alcançados e principalmente à paciência e amizade durante este trajeto. À orientadora Profª. Drª. VALÉRIA DE CARVALHO SANTOS EBINUMA, por ter me dado a oportunidade de continuar trilhando meu caminho como cientista e por ter acreditado no meu potencial. Aos professores JOÃO A.P. COUTINHO e SÓNIA VENTURA, por terem aberto seus laboratórios e me orientado em pontos cruciais do projeto durante o Doutorado Sanduíche na Universidade de Aveiro, Portugal. Aos amigos de laboratório: vocês foram ótimos companheiros nesta jornada! Aos docentes e funcionários do DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA pelo carinho e paciência durante o período de realização do trabalho. À FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS por ter oportunizado essa conquista! Ao CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO (CNPq), pela importante contribuição financeira para a realização deste projeto. À CORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR (CAPES) pelo apoio financeiro durante o Doutorado Sanduíche na Universidade de Aveiro, Portugal. Epígrafe “A satisfação está no esforço e não apenas na realização final” (Mahatma Gandhi) Resumo Os colorantes naturais tornaram-se comercialmente importantes devido à menor toxicidade quando comparados aos colorantes sintéticos, à forte demanda dos consumidores por produtos mais naturais e à possível atividade biológica. Um dos requisitos cruciais para a introdução de colorantes naturais produzidos por microrganismos no mercado envolve a melhoria na produção, incluindo o desenvolvimento de cultivos reprodutíveis em biorreator. Diante disso, este trabalho objetivou produzir colorantes naturais por cultivo submerso de Talaromyces amestolkiae, em agitador rotativo e em biorreator tanque agitado em escala de bancada, e estudar a estabilidade desses compostos frente a diferentes valores de pH e presença de sais. Os estudos iniciais mostraram que em substituição às fontes complexas de nitrogênio (peptona de carne e extrato de carne), o glutamato monossódico (GMS) promoveu a produção de colorante vermelho solúvel sob baixo crescimento celular. Visando o aumento da produção, foram realizados ensaios em agitador rotativo avaliando diferentes variáveis (concentração de glicose, GMS, micronutrientes, pH e tamanho do inóculo). Verificou-se que o GMS e o pH desempenharam um papel importante na geração de condições de estresse, afetando o crescimento celular e a produção de colorantes, visto que a síntese de colorante parece ser desencadeada sob condições de estresse metabólico. Em condições ideais (gL- 1): glicose (10), GMS (25), MgSO4 (0,012), FeSO4 (0,01), CaCl2 (0,015) e pH 5,0, um aumento de 30 vezes na produção em agitador rotativo foi alcançado, atingindo uma produção de colorante vermelho de 13,44 UA500nm. A suplementação do meio GMS-glicose com diversas fontes de amina também foi estudada, porém não teve efeito significativo na produção. Assim, a passagem do cultivo em agitador rotativo para o biorreator tanque agitado foi avaliada. Na primeira etapa dos cultivos em biorreator variou-se a composição do meio do inóculo e a vazão de ar. Em seguida, o tipo de impelidor foi avaliado empregando uma estratégia de controle de vazão de ar. O melhor resultado de produção de colorante vermelho (28,7 UA500nm) foi obtido sob aeração constante (4,0 Lmin-1) na frequência de agitação de 100 rpm pelos impelidores do tipo orelha de elefante, que representou um aumento de 2,05 vezes em relação às condições definidas em agitador rotativo. Nessa etapa foi verificado que a quantidade de biomassa inoculada, a morfologia do fungo, o tipo de impelidor empregado e o nível de oxigênio dissolvido são parâmetros fundamentais para que ocorra aumento na produção do colorante. O coeficiente de transferência de oxigênio volumétrico (kLa) do caldo de cultivo foi correlacionado com a morfologia celular, que variou de acordo com a geometria do impelidor e devido às condições de cisalhamento impostas às células do fungo. Paralelamente aos estudos de produção, avaliou-se a estabilidade dos colorantes vermelhos presentes no meio fermentado nos valores de pH entre 1,0 e 13 e na presença dos sais K3PO4 e MnSO4. Os colorantes vermelhos apresentaram estabilidade da cor na faixa de pH de 3,0 a 9,0 e não foram estáveis na presença dos sais K3PO4 e MnSO4. Ademais, os colorantes apresentaram instabilidade em termos de fluorescência após adição de ambos os sais. Esses resultados demonstram que a espécie T. amestolkiae tem grande potencial para produção de colorante em larga escala. Palavras-chave: Talaromyces amestolkiae, colorantes naturais, bioprocesso, biorreatores. Abstract Natural colorants have become commercially important due to their lower toxicity when compared to synthetic colorants, the strong consumer demand for more natural products and their possible biological activity. One of the crucial requirements for the introduction of natural colorants produced by microorganisms into the market involves improvements in production, including the development of reproducible bioreactor cultivations. Therefore, this work aimed to produce natural colorants by submerged cultivation of Talaromyces amestolkiae, in rotary agitator and in stirred tank bioreactor, and to study the stability of these compounds in different pH values and in the presence of salts. Initial studies have shown that in replacement of complex sources of nitrogen (meat peptone and meat extract), monosodium glutamate (MSG) promoted the production of soluble red colorant under low cell growth. In order to increase the red colorant production, tests were carried out on a rotary agitator evaluating different variables (glucose, MSG and micronutrients concentration, pH and inoculum size). It was found that MSG and pH played an important role in the generation of stress conditions, affecting cell growth and the production of colorants, since the colorant synthesis seems to be triggered under conditions of metabolic stress. Under ideal conditions (gL-1): glucose (10), MSG (25), MgSO4 (0.012), FeSO4 (0.01), CaCl2 (0.015) and pH 5.0, a 30-fold increase in rotary agitator production was achieved, reaching a red colorant production of 13.44 UA500nm. Supplementation of the MSG-glucose medium with several amine sources has also been studied, however it had no significant effect on production. Thus, the scaling-up of the process, from rotary agitator to stirred tank bioreactor, was evaluated. In the first stage of cultivation in bioreactor, the composition of the inoculum medium and the air flow were evaluated. Then, the type of impeller was evaluated using an air flow control strategy. The best result of the production of red colorant (28.7 UA500nm) was obtained under constant aeration (4.0 Lmin-1) at the agitation frequency of 100 rpm by the elephant ear impeller type, which represented an increase of 2.05-fold in relation to the conditions defined in rotary agitator. In this stage it was verified that the quantity of inoculated biomass, the morphology of the fungus, the type of impeller employed, and the level of dissolved oxygen are fundamental parameters for an increase in the colorant production. The volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) of the cultivation broth was correlated with cell morphology, which varied according to the impeller geometry and due to the shear conditions imposed to the fungus cells. Parallel to the production studies, the stability of the red colorants present in the fermented medium was evaluated at pH values between 1.0 and 13 and in the presence of the K3PO4 and MnSO4 salts. The red colorants showed color stability in the pH range of 3.0 to 9.0 and were not stable in the presence of K3PO4 and MnSO4 salts. In addition, the colorants showed instability in terms of fluorescence after addition of both salts. These results demonstrate that the species T. amestolkiae has great potential for large-scale color production. Keywords: Talaromyces amestolkiae, natural colorants, bioprocess, bioreactor. Lista de Figuras Lista de Figuras Figura 1. Diagrama de representação do espaço de cores CIELAB ou CIELCH (coordenadas colorimétricas L*, C* e H*): disposição tridimensional, mostrando as coordenadas L*, a*, b* e C* e H°. Croma (C*) = [(a*)2+(b*)2]1/2 e ângulo de matiz (H°) = tan-1(b*/a*). (Adaptado de Konica Minolta, 2019 em Autocad 2013)................................................................................................................. 32 Figura 2. Estrutura química e classificação de alguns colorantes naturais disponíveis para comercialização. (Adaptado de Sigurdson; Tang; Giusti, 2017)................................................................................................................. 36 Figura 3. Colorantes produzidos por fungos dos gêneros Monascus, Talaromyces, Penicillium e Aspergillus. (A) Estrutura das azafilonas evidenciando o núcleo bicíclico altamente oxigenado, que constitui o cromóforo dos colorantes de Monascus. (B) Resumo da rota de biossíntese do β-cetoácido pela FAS (Ácido graxo sintase). (C) Possível rota biossintética das azafilonas coloridas envolvendo a ação da PKS (Policetídeo sintase) e FAS na esterificação de um cromóforo de azafilona e um β-cetoácido (Adaptado de Hajjaj et al., 1997) ........................................................................................................................ 40 Figura 4. Aspecto morfológico de T. amestolkiae. (A) e (B) Aspecto macroscópico de T. amestolkiae em placa de Petri contendo BDA-YE (frente e verso) e apresentando excreção dos colorantes para o meio. (C) e (D) Microscopia de campo claro do T. amestolkiae caracterizando os conidióforos e as hifas. Colônias incubadas em placas de Petri contendo meio de cultura BDA- YE a 30 °C por 7 dias (Ampliação de 100X). (Fonte: Autoria própria).......................................... .................................................................. 44 Figura 5. Representação esquemática da reação aminofílica entre os colorantes laranjas (monascorubrina ou rubropunctatina, R = C5H11 ou C7H15) de Monascus anka e o GMS, a qual pode ocorrer no interior das células durante o cultivo submerso e desencadeia a excreção no meio de cultivo dos colorantes vermelhos (N-gutarilmonascorubramina ou N-glutarilrubropunctamina, R = C28H33NO8 ou C26H29NO8) solúveis em água, apresentando o resíduo GMS (seta pontilhada). (Adaptado de Xiong et al., 2015). ................................................ 48 Figura 6. (A) Linhas de corrente para escoamento radial produzidas por impelidor do tipo turbina Rushton. (B) Linhas de corrente mistas para escoamento radial e axial produzidas por impelidor do tipo orelha de elefante. (Adaptado de Holland; Bragg, 1995). .............................................................. 55 Lista de Figuras Figura 7. Fluxograma representando a condução dos experimentos para a produção de colorantes naturais por T. amestolkiae ....................................... 60 Figura 8. Biorreator Minifors II (INFORS, New Jersey/USA) e impelidores empregados nos cultivos de aumento de escala para produção de colorantes naturais por T. amestolkiae. ............................................................................ 66 Figura 9. Diagrama esquemático dos ensaios de avaliação da produção de colorantes naturais por T. amestolkiae em biorreator tanque agitado ............. 67 Figura 10. Produção de colorante vermelho (▲), biomassa (■) e consumo de glicose (●) durante a fermentação de T. amestolkiae em agitador rotativo utilizando glicose e GMS. Os ensaios foram realizados em triplicata. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança ....................................... 78 Figura 11. (A) Gráfico de Pareto do planejamento fatorial 23, (B) planejamento fatorial 22, (C) planejamento Plackett-Burman para o estudo da produção de colorante vermelho por T. amestolkiae em agitador rotativo. A linha no gráfico representa uma linha de referência, qualquer fator que ultrapasse essa linha tem efeito significativo no valor de p < 0,05. .......................................................... 82 Figura 12. Apresentação esquemática da condição experimental empregada e da respectiva produção de colorantes naturais vermelhos obtidos por cultivo submerso de T. amestolkiae. .......................................................................... 89 Figura 13. Classificação das cores no espaço CIELAB para as melhores condições testadas, em termos de produção de colorante vermelho por T. amestolkiae. Os ângulos de matiz e croma estão associados aos valores L* variando de 13 a 87 ......................................................................................... 91 Figura 14. Espectros 3D de excitação e emissão de fluorescência do meio fermentado na (A) ausência de MgSO4, FeSO4, KCl, CuSO4, CaCl2 e (B) presença dos sais. Três regiões distintas de fluorescência foram identificadas (A) I (λex 258 nm, λem 434 nm, Intensidade de fluorescência = 313920 UF), II (λex 316 nm, λem 432 nm, I = 150000 UF) and III (λex 476 nm, λem 520 nm, I = 133400 UF); (B) I (λex 258 nm, λem 434 nm, I = 94800 UF), II (λex 314 nm, λem 426 nm, I = 54600 UF) e III (λex 480 nm, λem 520 nm, I = 258360 UF) ............................... 93 Figura 15. Mudança qualitativa de cor no espaço de cor CIELAB para os colorantes produzidos por T. amestolkiae em todas as condições de suplementação estudadas. Croma C*) = √(a2/b2). Ângulo de matiz (H°) = tan- 1(b*/a*). L* indica luminosidade para 0 (preto) a 100 (branco). O valor positivo a* Lista de Figuras indica a cor vermelha, enquanto o valor negativo a* representa a cor verde. Da mesma forma, os valores b* positivos e negativos indicam as cores amarela e azul, respectivamente. Os valores de croma denotam a saturação ou pureza da cor. Os valores do ângulo de matiz representam o grau de vermelhidão, amarelo, verde e azul; o máximo é 0, 90, 180 e 270, respectivamente ....................... 100 Figura 16. (A) Crescimento do fungo T. amestolkiae em meio GMS-glicose e (B) meio complexo, e suas respectivas estruturas macromorfológicas. Observação por microscopia de campo claro em ampliação de 100X. Todos os cultivos foram realizados a 30 °C e 150 rpm em agitador rotativo. Os ensaios foram realizados em triplicata. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança. .... 103 Figura 17. Cultivos do fungo T. amestolkiae em biorreator tanque agitado empregando (A) inóculo de composição GMS-glicose para vazão de ar de 2,0 Lmin-1 e (B) 8,0 Lmin-1; e (C) inóculo de composição complexa e taxa de aeração de 8,0 Lmin-1 e suas respectivas estruturas macromorfológicas. Observação por microscopia de campo claro e ampliação de 100X. Todos os cultivos foram realizados a 30 °C e frequência de agitação de 100 rpm. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança...................................... .......................... 109 Figura 18. Determinação da saturação do oxigênio dissolvido para os dois tipos de impelidores: (A) orelha de elefante e (B) turbina Rushton a 100 rpm, 30 °C em diferentes vazões de ar empregando o meio de cultivo GMS-glicose sem o microrganismo. (C) Coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) do meio GMS-glicose sem o microrganismo (kLa referência) em função da vazão de ar, calculado a partir dos dados obtidos pelo método dinâmico .................... 114 Figura 19. Cultivos em biorreator tanque agitado para os experimentos de controle de aeração em cascata empregando as turbinas Rushton. (A) Nível de OD definido em 20 % de saturação de ar; (B) nível de OD definido em 50 % de saturação de ar; (C) nível de OD definido em 100 % de saturação de ar. Todos os cultivos foram realizados a 30 °C e 100 rpm. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança...................................... ......................................... 119 Figura 20. Cultivo em biorreator tanque agitado empregando os impelidores tipo orelha de elefante em controle de aeração em cascata com nível OD definido em 100 % de saturação de ar. O experimento foi realizado a 30 °C e frequência de Lista de Figuras agitação de 100 rpm. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança ...................................................................................................................... 122 Figura 21. Cultivos em biorreator tanque agitado para aeração constante a 4,0 Lmin-1; (A) experimentos empregando as turbinas Rushton e (B) impelidores tipo orelha de elefante, e sua observação de estruturas macromorfológicas por microscopia de campo claro, respectivamente. Ampliação de 100x. Todos os cultivos foram realizados a 30 °C e uma frequência de agitação de 100 rpm. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança .............................. 125 Figura 22. Estabilidade do colorante vermelho do meio fermentado ao longo do tempo. O pH foi alterado pela adição de HCl (1,0 M) ou NaOH (1,0 M). As amostras foram retiradas após 0, 1, 2, 3, 12 e 24 h de incubação a 25 ºC. O meio fermentado, pH 5,0, foi considerado como controle dos ensaios e representa 100 % de absorbância em 500 nm ao longo do tempo. As barras de erro representam limites de confiança de 95 % para cada medida. .......................................... 131 Figura 23. Propriedades espectroscópicas do meio fermentado de T. amestolkiae sob adição de HCl (1,0 M) e NaOH (1,0 M) após 24 h de incubação a 25 ºC. O fator de diluição foi levado em consideração ............................... 132 Figura 24. Mudança de cor no espaço de cores CIELAB para os colorantes produzidos por T. amestolkiae de todas as condições testadas após 24 h de incubação a 25 ºC, mostrando os ângulos de matiz e croma nos valores L* de 0,13 a 50,47 .................................................................................................. 135 Figura 25. Propriedades espectroscópicas do meio fermentado de T. amestolkiae sob adição de K3PO4 e MnSO4 (ambos 15 e 30 % m/m) após 24 h de incubação a 25 ºC. O fator de diluição foi levado em consideração ......... 139 Figura 26. Representação do possível ataque do sal K3PO4 à molécula do colorante vermelho produzido por T. amestolkiae, e mudança de cor no espaço de cores CIELAB para os colorantes produzidos por T. amestolkiae após adição de sais ao meio fermentado após 24 h de incubação a 25 ºC ..................... 140 Lista de Tabelas Lista de Tabelas Tabela 1. Variáveis e níveis dos fatores usados nos planejamentos experimentais empregados para o estudo da produção de colorante vermelho por cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo a 30 °C, 150 rpm por 168 h .......................................................................................................... 63 Tabela 2. Variáveis e níveis dos fatores usados no planejamento Plackett- Burman empregado para o estudo da produção de colorante vermelho por cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo a 30 °C, 150 rpm por 168 h......................................................................................................................... 64 Tabela 3. Avaliação da fonte de nitrogênio para o estudo da produção de colorantes amarelo, laranja e vermelho por T. amestolkiae, consumo de glicose, biomassa e pH final. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo............................................................................................................... 76 Tabela 4. Matriz do planejamento fatorial 23 para o estudo da produção de colorante vermelho por cultivo submerso de T. amestolkiae. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo ...................................................... 80 Tabela 5. Matriz do planejamento central composto 22 para o estudo da produção de colorante vermelho por T. amestolkiae. A concentração de glicose utilizada para estes cultivos foi de 10,0 gL-1 e variou-se o pH inicial e a concentração de GMS. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo. ............................................................................................................ 83 Tabela 6. Avaliação do tamanho do inóculo na produção de colorante vermelho por T. amestolkiae. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo......................................................................................................... ..... 85 Tabela 7. Planejamento Plackett-Burman empregado na produção de colorante vermelho por T. amestolkiae. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo........................................................................................... ..... 87 Tabela 8. Avaliação da concentração de MgSO4 na produção de colorante vermelho por T. amestolkiae. Os cultivos foram conduzidos por 168 h em agitador rotativo............................................................................................... . 88 Tabela 9. Influência dos aditivos na suplementação do meio GMS-glicose na produção do colorante vermelho por T. amestolkiae em 30 °C e 150 rpm em agitador rotativo por 168 h.............................. .................................................. 96 Lista de Tabelas Tabela 10. Cultivos em biorreator tanque agitado para produção de colorante vermelho por T. amestolkiae a 30 °C e 100 rpm. Valores obtidos ao final do cultivo (120 h)............................... ............................................................................. 107 Tabela 11. Cultivos em biorreator tanque agitado para produção de colorante vermelho por T. amestolkiae a 30 °C e 100 rpm. Valores obtidos ao final do cultivo (168 h)............................... ............................................................................. 117 Lista de Material Suplementar Lista de Material Suplementar Figuras Figura S1. Espectro de absorbância dos colorantes produzidos por T. amestolkiae em agitador rotativo utilizando o meio GMS-glicose e 15 discos de micélio......................................................................................................... .... 161 Figura S2. Cultivo em biorreator tanque agitado empregando as turbinas Rushton em modo de aeração em cascata com nível OD fixado em 100 % de saturação de ar. O experimento foi realizado a 30 °C e uma velocidade de agitação de 100 rpm. O erro representa 95 % do limite de intervalo de confiança......................................................................................................... 162 Tabelas Tabela S1. Valores colorimétricos para todas as condições testadas na produção de colorantes por T. amestolkiae em agitador rotativo a 30 °C e 150 rpm de agitação .......................................................................................................... 163 Tabela S2. Cultivo em biorreator tanque agitado empregando as turbinas Rushton para produção de colorante vermelho por T. amestolkiae a 30 °C e 100 rpm. Valores obtidos ao final do cultivo (168 h).................................................................... ................................................. 164 Tabela S3. Estabilidade do colorante vermelho de T. amestolkiae, pH inicial de 5,0, em diferentes valores de pH e na presença de sais ................................ 165 Abreviatura e Siglas Abreviatura e Siglas Abs – Absorbância ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária BDA – Batata Dextrose Ágar BDA-YE – Batata Dextrose Ágar suplementado com extrato de levedura CIE – Comission Internacionale de L’Eclairage CIELAB – Coordenadas colorimétricas L*, a* e b* CIELCH – Coordenadas colorimétricas L*, C* e H* CYA – Agar Czapeck C5H11 – Monascorubrina C7H15 – Rubropunctatina C28H33NO8 – N-gutarilmonascorubramina C26H29NO8 – N-glutarilrubropunctamina CaCl2 – Cloreto de cálcio CuSO4 – Sulfato de cobre EFSA – European Food Standards Authority FAS – Ácido graxo sintase FDA – Food and Drug Administration FeSO4 – Sulfato de ferro (II) GABA – 4-aminobutirato GMS – Glutamato monossódico H2SO4 – Ácido sulfúrico HPLC – High Performance Liquid Chromatography K3PO4 – Fosfato tripotássico KCl – Cloreto de potássio MgSO4 – Sulfato de magnésio MnSO4 – Sulfato de manganês NaOH – Hidróxido de sódio NH3 + – Íon amônia NMI – Natural Marketing Institute OD – Oxigênio dissolvido OMS – Organização Mundial da Saúde O2 – Oxigênio PKS – Policetídeo sintase TCA – Ciclo do ácido tricarboxílico Abreviatura e Siglas UA – Unidades de absorbância UFAM – Universidade Federal do Amazonas V – Volume V/A – Relação colorante vermelho e amarelo V/L – Relação colorante vermelho e laranja RID – Detector de índice refrativo diferencial ZnSO4 – Sulfato de zinco Símbolos Símbolos % – Porcentagem % (m/m) – Porcentagem massa por massa % (m/v) – Porcentagem massa por volume % (v/v) – Porcentagem volume por volume K – Índice de consistência n – Índice de comportamento de escoamento ηa – Viscosidade aparente λex – Comprimento de onda de excitação λem – Comprimento de onda de emissão µL – Microlitros μm – Micrometro Ƭ – Tensão de cisalhamento γ – Taxa de cisalhamento A – Amperes a* – Vermelho e verde arctan – Arco tangente b* – Amarelo e azul C – Concentração de oxigênio dissolvido na fase líquida C* – Croma ºC – Graus Celsius celL-1 – Células por litro cm – Centímetros cP – Centipoise Cs – Concentração de oxigênio no líquido que está em equilíbrio com o teor de oxigênio na fase gasosa F – Teste Fisher g – Gramas gL-1 – Gramas por litro gm2 – Gramas por metro ao quadrado h – Horas H* – Ângulo de matiz kL – Coeficiente de transferência de massa kLa – Coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio L – Litros Símbolos L* – Luminosidade Lmin-1 – Litros por minuto M – Molar mg – Miligramas mgL-1 – Miligramas por litro min – Minuto mL – Mililitro mLmin-1 – Mililitros por minuto mm – Milímetro mmol – Milimolar molL-1 – Molar por litro mmolL-1 – Milimolar por litro nm – Nanômetro p – Probabilidade de significância R2 – Coeficiente de determinação rpm – Rotações por minuto s – Segundos t – Teste Tukey tan-1 – Função inversa da tangente UA – Unidades de absorbância UF – Unidades de fluorescência vvm – Volume de ar por volume de meio, por minuto X – Concentração celular Xi – Variável independente Sumário Sumário 1.Introdução .................................................................................................... 27 2. Revisão da Literatura ................................................................................. 31 2.1 Cor ................................................................................................... 32 2.2 Colorantes naturais .......................................................................... 33 2.3 Colorantes naturais de origem microbiológica ................................. 38 2.4 Talaromyces amestolkiae ................................................................ 42 2.5 Cultivo submerso ............................................................................. 45 2.5.1 Parâmetros que afetam a produção de colorantes ............. 45 2.5.2 Aumento de escala ............................................................. 50 2.5.2.1 Agitação e aeração em cultivo submerso ............. 51 3. Objetivos ..................................................................................................... 57 3.1 Objetivo Geral ................................................................................. 58 3.2 Objetivos Específicos ....................................................................... 58 4. Materiais e Métodos ................................................................................... 59 4.1 Materiais .......................................................................................... 61 4.2 Microrganismos e preparação do inóculo ........................................ 61 4.3 Produção de colorantes em agitador rotativo .................................. 62 4.3.1 Avaliação da fonte de nitrogênio ........................................ 62 4.3.2 Planejamentos estatísticos ................................................. 62 4.3.3 Suplementação do meio GMS-glicose ............................... 64 4.3.4 Avaliação do crescimento do microrganismo e reologia do caldo de cultivo ................................................................................................. 65 4.4 Cultivos em biorreator tanque agitado ............................................. 65 4.5 Estudo de estabilidade da cor em diferentes valores de pH e na presença de sais .............................................................................................. 69 4.6 Métodos analíticos ........................................................................... 70 4.6.1 Análise colorimétrica .......................................................... 71 4.6.2 Análise de fluorescência .................................................... 71 4.6.3 Estudo da reologia do caldo de fermentação e microscopia ......................................................................................................................... 72 4.6.4 Estudo hidrodinâmico ......................................................... 72 5. Resultados e Discussão ............................................................................ 74 5.1 Produção de colorantes em agitador rotativo .................................. 75 5.1.1 Avaliação da fonte de nitrogênio ........................................ 75 Sumário 5.1.2 Planejamentos fatoriais ...................................................... 79 5.1.3 Efeito do número de discos de micélio inoculados ............. 85 5.1.4 Efeito da adição de micronutrientes ................................... 86 5.2 Análise colorimétrica ....................................................................... 89 5.3 Análise de fluorescência .................................................................. 92 5.4 Suplementação do meio GMS-glicose ............................................. 94 5.4.1 Características dos colorantes derivados da suplementação do meio GMS-glicose ....................................................................................... 99 5.5 Estudo do crescimento do microrganismo em diferente fontes nutricionais.. ................................................................................................... 101 5.6 Cultivos em biorreator tanque agitado ........................................... 106 5.6.1 Avaliação da composição do meio do inóculo .................. 106 5.6.2 Caracterização da capacidade de transferência de oxigênio dos impelidores .............................................................................................. 114 5.6.3 Experimentos em aeração em cascata ............................ 116 5.6.4 Experimentos em aeração constante ............................... 124 5.7 Estudos de estabilidade ................................................................. 130 5.7.1 Mudança de cor por ação de ácido e base ...................... 130 5.7.2 Mudança de cor por ação de sais .................................... 138 7. Conclusões ............................................................................................... 142 8. Bibliografia ................................................................................................ 145 9. Material Suplementar ............................................................................... 160 10. Artigos ..................................................................................................... 166 Introdução Introdução 29 Considerada atributo essencial da estética de um produto, a cor é frequentemente modificada ou ressaltada pela adição de aditivos, contribuindo com a sua receptividade pelo consumidor (BOO et al., 2012; VINHA et al., 2018). Tais aditivos, denominados colorantes, podem ser classificados de acordo com a sua origem como sintéticos ou naturais. Em relação aos colorantes sintéticos, um número crescente de publicações científicas tem relacionado o uso de colorantes sintéticos à toxicidade ambiental e preocupações com a saúde (AMCHOVA; KOTOLOVA; RUDA-KUCEROVA, 2015; VENDRUSCOLO et al., 2016a). Em contrapartida, os colorantes naturais têm sido cada vez mais utilizados pela indústria farmacêutica e de alimentos devido às suas propriedades menos tóxicas e possível valor medicinal (NARSING RAO; XIAO; LI, 2017; WROLSTAD; CULVER, 2012). Entre esses, os tons vermelhos são amplamente empregados na indústria de alimentos, devido, principalmente, à sua distribuição predominante em frutas e vegetais e sua capacidade de estimular o apetite (SINGH, 2006). Os colorantes vermelhos estão presentes em muitos alimentos, incluindo bebidas, confeitos, laticínios, carnes, salgadinhos e cereais. No entanto, obter um aditivo que transmita aos alimentos um tom vermelho vibrante é um desafio (SIGURDSON; TANG; GIUSTI, 2017). Entre as fontes naturais de produção de colorantes, pode-se citar as fontes convencionais (plantas e insetos) e os colorantes obtidos por via biotecnológica (microrganismos) (BOO et al., 2012). A maioria dos colorantes naturais atualmente disponíveis no mercado são obtidos de fontes vegetais e animais. Porém, esses aditivos têm inúmeros inconvenientes, tais como instabilidade, alto custo e muitas vezes não estão disponíveis durante todo o ano (GHIDOUCHE et al., 2013). Além disso, geralmente, os colorantes oriundos de plantas e insetos são mais sensíveis ao calor, luz e oxigênio que os colorantes sintéticos, resultando em perda de cor ou alterações na tonalidade. Outros podem ser sensíveis às condições da matriz de aplicação, como pH, presença de proteínas, íons metálicos e outros compostos orgânicos (LAKSHMI, 2014; RODRIGUEZ-AMAYA, 2016). Para os colorantes naturais serem comercializados deve-se conhecer a estabilidade da molécula na matriz de aplicação, o rendimento e o preço final após a purificação da mesma (WISSGOTT; BORTLIK, 1996). Além disso, os Introdução 30 colorantes usados na indústria alimentícia são regulamentados. Os requisitos de segurança e regulamentação variam entre os diferentes países e áreas geográficas (TORREGROSA-CRESPO et al., 2018). Organizações como a FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos, a EFSA (European Food Standards Authority) e a OMS (Organização Mundial da Saúde) têm defendido dosagens seguras para o uso desses compostos em alimentos, medicamentos e itens cosméticos (AMCHOVA; KOTOLOVA; RUDA-KUCEROVA, 2015; GALAFFU; BORTLIK; MICHEL, 2015). As substâncias de origem microbiana, sobretudo as fúngicas, sobressaem-se sobre as oriundas de outras fontes naturais pelas facilidades em termos de produtividade e melhor compatibilidade com processos industriais, pois não estão sujeitas à sazonalidade e podem ser produzidas ininterruptamente, com rendimentos previsíveis e otimizáveis (ABEROUMAND, 2011). O fungo Monascus tem sido alvo de muitos estudos para a produção de colorantes. No entanto, juntamente com o colorante o microrganismo produz micotoxinas que impedem sua aplicação como colorante na indústria alimentícia em diversos países devido à legislação vigente (CARO et al., 2012; YANG et al., 2015a). Linhagens do gênero Talaromyces produzem colorantes estruturalmente semelhantes aos de Monascus e têm sido cada vez mais estudadas (ISBRANDT et al., 2019; ZACCARIM et al., 2018). A produção de colorantes por microrganismos ocorre durante o processo fermentativo e é influenciada pela composição do meio de cultivo, pH, oxigenação do caldo de cultivo, frequência de agitação e outros fatores (KANG et al., 2014; LIN; DEMAIN, 1991). As vantagens da produção de colorantes via microrganismos incluem maior facilidade de extração e maiores rendimentos, além da possibilidade de produção em pequenos espaços e em larga escala (ABEROUMAND, 2011). Um dos desafios de se trabalhar com microrganismos filamentosos, como o Talaromyces amestolkiae, em cultivo submerso em biorreator é o controle do crescimento e morfologia do microrganismo, que podem gerar problemas de transferência de massa e energia dentro do biorreator (CORRÊIA GOMES; TAKAHASHI, 2016). As propriedades reológicas (particularmente a viscosidade aparente) do caldo de cultivo dependem tanto da concentração celular quanto da morfologia do microrganismo (CAIRNS et al., 2019; VEITER; RAJAMANICKAM; HERWIG, Introdução 31 2018). Quando os fungos crescem na forma de pellets, o caldo de cultivo apresenta baixa viscosidade (LIN; SCHOLZ; KRULL, 2010; PAPAGIANNI, 2004). Por outro lado, quando o crescimento é de micélio filamentoso, a viscosidade do caldo é elevada, o que pode reduzir drasticamente a capacidade de transferência de oxigênio e mistura de nutrientes dentro do biorreator (GIBBS; SEVIOUR; SCHMID, 2000). Portanto, o controle do crescimento e da morfologia do micélio na fermentação submersa é muitas vezes um pré-requisito para a aplicação industrial (CORRÊIA GOMES; TAKAHASHI, 2016; LV et al., 2017). Devido às variadas morfologias que os fungos podem apresentar em cultivos submersos, as variáveis hidrodinâmicas afetam significativamente a morfologia celular através das condições de cisalhamento impostas às células fúngicas (LIN; SCHOLZ; KRULL, 2010; YU et al., 2012). Dessa maneira, a seleção de um impelidor eficiente pode determinar as condições de cisalhamento impostas ao microrganismo, influenciando assim na eficiência de crescimento ou formação de produtos e possivelmente alterando a morfologia fúngica (ZHONG, 2010). Encontrar a melhor forma de condução do processo e definir as concentrações dos nutrientes são fatores que contribuem para a redução do custo de produção e aumento da produtividade da molécula de interesse. Além disso, as possíveis propriedades terapêuticas e estabilidade em relação ao pH são características interessantes que promovem o uso de colorantes provenientes de T. amestolkiae como substitutos para colorantes sintéticos (SANTOS-EBINUMA; TEIXEIRA; PESSOA, 2013; ZACCARIM et al., 2018). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção de colorante vermelho por T. amestolkiae em cultivo submerso (em agitador rotativo e em biorreator tanque agitado) e analisar as propriedades halocrômicas dos colorantes produzidos, que é a capacidade de mudar de coloração em função do pH. O efeito do pH no perfil dos colorantes foi examinado com base nas suas características de cor e fluorescência. Revisão da Literatura Revisão da Literatura 33 2.1 Cor Considerando alimentos e bebidas, a cor é um dos atributos sensoriais mais importantes do produto às nossas expectativas de sabor e aroma (VINHA et al., 2018). A cor é o resultado produzido no cérebro pelo estímulo recebido quando a energia radiante penetra nos olhos, permitindo a distinção do verde, do azul, do vermelho e de outras cores. As cores são muito empregadas na indústria alimentícia pela inserção de aditivos, os chamados colorantes, para restituir a aparência original, tornar o alimento visualmente mais atraente, conferir coloração aos desprovidos de cor e reforçar as cores presentes nos alimentos (BOO et al., 2012; WIBOWO et al., 2015). Vários sistemas são utilizados para expressar numericamente a cor. A Comissão Internacional de Iluminação (CIE – Comission Internacionale de L’Eclairage) desenvolveu padrões que permitem definir a cor de acordo com o espaço psicométrico CIELAB (coordenadas colorimétricas L*, a* e b*). Na Figura 1 está representado o diagrama CIELAB. Figura 1. Diagrama de representação do espaço de cores CIELAB ou CIELCH (coordenadas colorimétricas L*, C* e H*): disposição tridimensional, mostrando as coordenadas L*, a*, b* e C* e H°. Croma (C*) = [(a*)2+(b*)2]1/2 e ângulo de matiz (H°) = arctan(b*/a*). (Adaptado de Konica Minolta, 2019 em Autocad 2013). Neste espaço de cores uma cor específica é descrita como um ponto no espaço tridimensional matiz-luminosidade-croma, o que é compreendido de forma mais intuitiva pelo cérebro. L* indica luminosidade de 0 (preto) a 100 (branco). Positivos e negativos em a* representam vermelho e verde, respectivamente, enquanto positivos e negativos em b* representam amarelo e Revisão da Literatura 34 azul, respectivamente. Valores de croma (C*) denotam a saturação ou pureza da cor. Valores próximos ao centro com o mesmo valor L* indicam cores opacas ou cinza, enquanto valores próximos ao raio da circunferência representam cores vivas ou brilhantes. Os valores do ângulo de matiz (H°) é o ângulo formado entre a* e b* e representa 0 para vermelho, 90 para amarelo, 180 para verde e 270 para azul (KONICA MINOLTA, 2020). Essa análise de cor é fundamental para estabelecer as características de cor de um colorante seja esse sintético ou natural. 2.2 Colorantes naturais As substâncias usadas para mudar a cor de um material, uma superfície ou uma solução são chamadas de colorantes e podem ser classificados como pigmentos ou corantes. Os colorantes podem ser classificados quanto à sua origem – sintéticos ou naturais ou quanto à sua solubilidade – pigmentos ou corantes. Em geral, os corantes apresentam solubilidade no meio aplicado, ao passo que pigmentos são moléculas insolúveis. Enquanto os corantes não acarretam modificações físico-químicas na matriz a qual são aplicados, os pigmentos geram modificações (SARON; FELISBERTI, 2006). Além disso, os pigmentos e corantes diferem apenas por características físicas e não por características químicas. Assim, um colorante pode ser um corante ou um pigmento dependendo da matriz a qual é aplicado, ou seja, carotenoides são corantes em óleo e pigmentos em água (DELGADO-VARGAS; PAREDES- LÓPEZ, 2003). O mercado de colorantes industriais é composto majoritariamente por colorantes sintéticos/ não renováveis. Os colorantes azóicos, uma classe de cores sintéticas comuns, são derivados de produtos petroquímicos e têm a vantagem de proporcionar uma elevada intensidade de coloração, tonalidades atraentes e boa estabilidade (DOWNHAM; COLLINS, 2000; SCOTTER, 2011). No entanto, um número crescente de publicações científicas tem relacionado os colorantes sintéticos com efeitos adversos, tais como toxicidade ambiental, carcinogenicidade e alergenicidade, além de serem derivados do petróleo e causadores do efeito estufa (AMCHOVA; KOTOLOVA; RUDA-KUCEROVA, 2015; VENDRUSCOLO et al., 2016a). No Brasil, o controle do uso de colorantes sintéticos como aditivos alimentares é regulamentado pela Agência Nacional de Revisão da Literatura 35 Vigilância Sanitária (ANVISA), resoluções nº 382 e 388 de 9 de agosto de 1999, e apenas 11 colorantes sintéticos são permitidos (amarelo crepúsculo, amarelo tartrazina, vermelho de eritrosina, vermelho 40, amaranto, ponceau 4R, azul indigotina, azul brilhante, azul patente V, azorrubina, verde rápido), sendo que as normas brasileiras para colorantes e aditivos são baseadas nas normas americanas especificadas pelo FDA e normas européias do EFSA (PRADO; GODOY, 2003). Nesse sentido, os colorantes naturais representam uma alternativa emergente para a indústria. As fontes naturais de colorantes são geralmente plantas, insetos e microrganismos, sendo esse último de grande interesse (DE MEJIA et al., 2020). Os colorantes naturais são reconhecidos como mais seguros ao ser humano e biodegradáveis, por não oferecerem riscos à saúde humana e ao meio ambiente (WROLSTAD; CULVER, 2012). Os colorantes naturais podem ser usados como aditivos, antioxidantes ou intensificadores de cor em diversos segmentos industriais, incluindo cosméticos, fármacos, têxteis e como ingredientes funcionais de alimentos e bebidas (NARSING RAO; XIAO; LI, 2017). Entre essas aplicações, alimentos e bebidas respondem pela maior participação de uso de colorantes naturais (MARKET INSIGHTS, 2020). A substituição de compostos sintéticos em produtos alimentícios por alternativas naturais tem sido impulsionada por consumidores dispostos a pagar mais por produtos mais saudáveis. Nos Estados Unidos da América, o instituto Natural Marketing Institute (NMI) fez um estudo (2017 Health & Wellness Trends in America) descrevendo a abordagem dos consumidores modernos para a saúde e bem-estar (MARKET RESEARCH, 2020). Os dados mostraram que nos tempos atuais, a preocupação dos consumidores com ingredientes artificiais em alimentos e bebidas mais que dobrou. Além disso, nos últimos dez anos o interesse de compra aumentou em cerca de 30 % para marcas que utilizam colorantes naturais. Segundo estimativa da Grand View Research de 2020, o mercado mundial de cores para 2023 pode atingir US$ 1620 milhões. Especificamente, para o mercado de alimentos, o consumo de colorantes naturais pode registrar nos próximos cinco anos um crescimento anual de 5,4 % (GLOBAL INFO RESEARCH, 2020). A substituição de colorantes sintéticos por seus análogos naturais é um grande desafio para as indústrias alimentícia e farmacêutica, tanto do ponto de Revisão da Literatura 36 vista técnico quanto por razões de custo dos ingredientes. Para um colorante ser comercializado como aditivo alimentar, ele deve ter as seguintes qualidades: (i) inocuidade, (ii) estabilidade, (iii) compatibilidade e solubilidade, e (iv) aplicabilidade. Os colorantes alimentares devem ser atóxicos e biodegradáveis, não rendendo riscos aos seres humanos, aos animais ou ao meio ambiente (WROLSTAD; CULVER, 2012). Ou seja, não devem ter efeitos adversos e devem apresentar estabilidade química e alta tolerância ao pH, ao calor e à luz. Para que os colorantes sejam aplicáveis, eles devem ser capazes de melhorar a aparência e outras características organolépticas dos alimentos, ser inativos com outros componentes dos alimentos e demonstrarem aceitabilidade geral, pois devem ser insípidos e inodoros (MAPARI et al., 2005). Some-se a isso o fato de que para competir com os colorantes sintéticos, os naturais devem ter um impacto mínimo no preço final do produto. Dentre as estruturas diversificadas e variedade de fontes, os colorantes naturais podem ser agrupados em algumas classes: flavonoides, derivados de isoprenóides, derivados de pirroles e derivados de indol. Na Figura 2 é apresentada a estrutura química dos principais grupos de colorantes naturais. Revisão da Literatura 37 Figura 2. Estrutura química e classificação de alguns colorantes naturais disponíveis para comercialização. (Adaptado de Sigurdson; Tang; Giusti, 2017). Os colorantes naturais constituem um grupo de moléculas quimicamente heterogêneas e biossinteticamente não relacionadas que são unidas por uma característica comum: sua estrutura eletrônica contém um cromóforo que é responsável pelas cores características desses compostos (TORRES et al., 2016). A maioria dos colorantes naturais de plantas apresentam coloração de vermelho a azul, de acordo com o pH após extração e ocorrem em todos os tecidos de plantas superiores que possuem cor como as folhas, caules, raízes, flores e frutos. Os flavonoides são um grupo de metabólitos secundários vegetais Revisão da Literatura 38 caracterizados por um esqueleto de carbono C6C3C6. Desses compostos polifenólicos, as antocianinas são uma importante subclasse de colorantes solúveis em água que conferem cores vivas às plantas, que varia do vermelho ao azul (OBÓN et al., 2009). Os carotenoides tetraterpenóides variam entre as cores vermelha, laranja e amarela e são conhecidos como caroteno (colorante laranja), luteína (colorante amarelo) e licopeno (colorante vermelho) (GALAFFU; BORTLIK; MICHEL, 2015). A clorofila é um colorante primário que dá cor verde às plantas e é constituída de muitos anéis heteroaromáticos e polipirroles lineares. As betalaínas são colorantes amarelos ou vermelhos como as antocianinas e são solúveis em água, mas ao contrário das antocianinas, são compostos derivados de indol (compostos aromáticos N-heterocíclicos) sintetizados a partir da tirosina. As betalaínas são responsáveis pela cor vermelha da beterraba e são usadas comercialmente como alimento e/ou como agente colorante (BOO et al., 2012). Entre a diversidade de cores oriundas de colorantes naturais, os tons vermelhos são de particular interesse, porque essa cor é a mais popular dos alimentos e os colorantes naturais vermelhos adequados para uso alimentar são difíceis de obter (CHEN; JOHNS, 1993; VENTURA et al., 2013). No caso da indústria alimentícia, existem pouquíssimas alternativas de colorantes vermelhos naturais, como as antocianinas de origem vegetal e o ácido carmínico do extrato de cochonilha (Figura 2). No entanto, esses colorantes não podem ser usados em toda a faixa de pH devido à mudança de coloração e instabilidade da molécula (GHIDOUCHE et al., 2013). Em vários setores industriais, a cor vermelha natural foi considerada a tonalidade mais tecnicamente desafiadora para o desenvolvimento de novos produtos (39 %), seguida por verde (19 %) e azul (13 %), particularmente nas indústrias alimentícias de laticínios, carnes e panificação (DDW, 2013). Essas limitações resultam em restrições de aplicação em várias fases dos sistemas de coloração. Dentro desse contexto, a produção de colorantes naturais por microrganismos constitui-se uma alternativa em relação às fontes vegetais e animais, existindo um grande potencial para produção de colorantes nas tonalidades de amarelo a vermelho. Revisão da Literatura 39 2.3 Colorantes naturais de origem microbiológica Os microrganismos constituem uma das fontes biotecnológicas mais versáteis na produção de uma variedade de moléculas, entre elas os colorantes. Isso se deve às vantagens de produção que os microrganismos apresentam sobre as plantas em termos de disponibilidade, por não haver necessidade de grandes áreas terrestres para crescimento, independência de variação sazonal ou localização geográfica, estabilidade, eficiência de produção, rendimentos previsíveis e otimizáveis e fácil processamento pós produção (TULI et al., 2015; VENIL et al., 2014). Comercialmente, muitos colorantes sintetizados por microrganismos já são autorizados e produzidos industrialmente em diversos países, tais como os colorantes vermelhos e o colorante amarelo Ankascin® de Monascus sp., astaxantina de Xanthophyllomyces dendrorhous, Arpink redTM de Penicillium oxalicum, riboflavina de Ashbya gossypii, β-caroteno de Blakeslea trispora, licopeno de Erwinia uredovora e Fusarium sporotrichioides (CARO et al., 2015; DUFOSSÉ, 2018). Os colorantes fúngicos estão atualmente recebendo mais atenção do que outros colorantes biológicos devido à sua diversidade de cores (LAGASHETTI et al., 2019). A diversidade de colorantes naturais não se relaciona apenas com a sua estrutura química, mas também com a gama de cores que podem adicionar à paleta de cores ou mesmo uma nova gama de cores (MAPARI; MEYER; THRANE, 2006). Uma das características mais interessantes dos colorantes fúngicos é o potencial para uso como colorantes alimentares funcionais, visto que alguns podem apresentar propriedades biológicas. Algumas espécies de Talaromyces sp. e Monascus sp. foram reportadas como produtoras de colorantes que apresentam atividade antioxidante e antimicrobiana, bem como propriedades imunossupressoras, antivirais, anticancerígenas e anticolesterolêmica (KEEKAN et al., 2020; KIM; KU, 2018; ZACCARIM et al., 2018). Os fungos são organismos eucarióticos e podem produzir uma impressionante gama de metabólitos secundários. Dentre esses, os policetídeos representam uma classe que não exibem íons localizados negativamente carregados e geralmente têm função poli-insaturada, ou seja, um sistema de anéis, um ou mais grupos de carbono, ácido carbólico e grupos funcionais de éster ou amidas que absorvem no espectro UV visível em estrutura de Revisão da Literatura 40 tetracetídeos a octacetídeos, que possuem quatro ou oito unidades de C2 (MAPARI; MEYER; THRANE, 2009). Esses compostos são tipicamente sintetizados por policetídeos sintases (PKS) que unem derivados de ácido carboxílico (acetil-coenzima A (CoA) e malonil-CoA) de forma semelhante à síntese de ácidos graxos. As classes representativas incluem colorantes como antraquinonas, azafilonas, hidroxiantraquinonas, naftalenos, naftoquinonas, flavonoides, melaninas, flavinas, entre outros (GMOSER et al., 2017; LAGASHETTI et al., 2019; VENIL et al., 2014). As azafilonas constituem um subconjunto da classe de policetídeos e podem ser definidas como uma classe estruturalmente diversa de metabólitos secundários fúngicos, ou seja, colorantes com estruturas de pirona-quinona contendo um núcleo bicíclico altamente oxigenado e um centro quaternário quiral (DUFOSSÉ et al., 2014; WEI; YAO, 2005) (Figura 3.A). Revisão da Literatura 41 Figura 3. Colorantes produzidos por fungos dos gêneros Monascus, Talaromyces, Penicillium e Aspergillus. (A) Estrutura das azafilonas evidenciando o núcleo bicíclico altamente oxigenado, que constitui o cromóforo dos colorantes de Monascus. (B) Resumo da rota de biossíntese do β-cetoácido pela FAS (Ácido graxo sintase). (C) Possível rota biossintética das azafilonas coloridas envolvendo a ação da PKS (Policetídeo sintase) e FAS na esterificação de um cromóforo de azafilona e um β-cetoácido (Adaptado de Hajjaj et al., 1997). As azafilonas são responsáveis pelas cores amarela, vermelha ou verde encontradas em micélios de várias espécies de ascomicetos, incluindo os gêneros Monascus, Talaromyces, Penicillium e Aspergillus (DUFOSSÉ et al., 2014; MAPARI et al., 2009). O nome azafilona surgiu devido à sua afinidade pela amônia: os colorantes reagem com aminas, como proteínas, aminoácidos e ácidos nucléicos, para formar ɤ–piridonas vinílicas vermelhas ou roxas devido à Revisão da Literatura 42 troca de oxigênio do pirano por nitrogênio (STADLER et al., 1995; WEI; YAO, 2005). As azafilonas são tradicionalmente classificadas como colorantes vermelhos, laranjas e amarelos com base em sua absorbância máxima em 490– 530, 460–480 e 330–450 nm, respectivamente (CHEN et al., 2017b). Até o presente momento, pouco se sabe sobre as reações biossintéticas e os genes envolvidos na produção das azafilonas. No entanto, há evidências de que pelo menos uma, e possivelmente duas, policetídeo sintases estejam envolvidas na biossíntese, e ainda que, ácidos graxos são possíveis precursores dos colorantes formados (CHEN et al., 2017b; YANG et al., 2015b). A via hipotética de biossíntese envolve a formação de um cromóforo hexacetídeo, reação catalisada pela policetídeo sintase e, posterior, condensação com um β- cetoácido, proveniente de um ácido graxo de cadeia média, produzido pela via biossintética dos ácidos graxos (Figura 3.B). No caso dos colorantes de Monascus, o cetoácido é ligado à estrutura do cromóforo por uma reação de transesterificação para gerar a monascorubrina, colorante laranja, (ou rubropunctatina mediante transesterificação com ácido hexanóico). A redução do colorante laranja dá origem ao amarelo ankaflavina a partir da monascorubrina (ou monascina da rubropunctatina). Por conseguinte, os colorantes vermelhos são formados quimicamente a partir do laranja por aminação através de uma base de Schiff dando origem à monascorubramina e rubropunctamina (HAJJAJ et al., 1997) (Figura 3.C). As mesmas cores existem em duas estruturas moleculares diferindo no comprimento das cadeias alifáticas e são produzidas, principalmente, como colorantes intracelulares com baixa solubilidade em água (WONG; KOEHLER, 1983). Quando determinados grupamentos amina estão presentes no meio de cultivo, reações envolvendo os colorantes contendo os grupos aminofílicos e certos grupamentos amina mudam a localização dos colorantes vermelhos predominantemente ligados à célula para o meio extracelular (SHAH et al., 2014). No desenvolvimento de um bioprocesso, a exportação do metabólito de interesse para fora da célula microbiana é uma vantagem, pois diminui o número de etapas requeridas no processo de downstream diminuindo os custos de produção (MEITZ et al., 2014; STRUBE et al., 2011). O uso de Monascus sp. para a produção de azafilonas é o mais antigo registrado e têm sido frequentemente encontrados em alimentos orientais, como Revisão da Literatura 43 o koji vermelho ou angkak, o arroz fermentado usado na Ásia durante séculos como colorante alimentar em vinho tinto de arroz, queijo vermelho de soja, carne e produtos de peixe (DUFOSSÉ et al., 2005; NARSING RAO; XIAO; LI, 2017). Desta forma, as azafilonas também são chamadas de "colorantes Monascus" e um número superior a 100 tipos de colorantes típicos de Monascus foram identificados e isolados de Monascus, Penicillium e Talaromyces (CHEN et al., 2019). Nesse sentido, o fungo Monascus tem sido alvo de muitos estudos visando a produção de colorantes (SHI et al., 2015; TERÁN HILARES et al., 2018; VENDRUSCOLO et al., 2016a). Segundo a literatura, os colorantes produzidos por esse microrganismo apresentam estabilidade na faixa de pH de 2 a 10, estabilidade ao calor e um amplo espectro de cores (MAPARI et al., 2005; MAPARI; MEYER; THRANE, 2006). Contudo, juntamente com o colorante, o microrganismo produz a micotoxina citrinina que reduz o seu valor comercial e impede sua aplicação como colorante pelas agências regulatórias do Brasil (ANVISA), Europa (EFSA) e Estados Unidos (FDA) (KALLSCHEUER, 2018; YANG et al., 2015a). Por esse motivo, diversos estudos com o gênero Monascus focaram por muito tempo na redução da produção de citrinina e não no aumento da produção dos colorantes (DE CARVALHO et al., 2005; HAJJAJ et al., 2012; KANG et al., 2014; OROZCO; KILIKIAN, 2008). Assim, outros microrganismos vêm sendo estudados visando a produção de colorantes naturais com aplicabilidade industrial. Dentre esses, foi relatado que o fungo filamentoso T. amestolkiae produz colorantes naturais com atividade biológica (antimicrobiana) (ZACCARIM et al., 2018). Além disso, diferentemente de Monascus sp., a maioria das espécies que pertencem ao gênero Talaromyces não produzem micotoxinas, viabilizando a aplicabilidade industrial em produtos como alimentos, fármacos e têxteis (FRISVAD et al., 2013; TEIXEIRA et al., 2012; TOLBORG et al., 2020). 2.4 Talaromyces amestolkiae O gênero Penicillium compreende quatro subgêneros, Aspergilloides, Furcatum, Penicillium e Biverticillium. No entanto, foi observado que o subgênero Biverticillium é filogeneticamente distinto de outros subgêneros de Penicillium e que essa distinção deve ser refletida em sua taxonomia (PITT, 1979). Nesse Revisão da Literatura 44 sentido, seguindo o conceito de nomenclatura de nome único, 40 espécies de Penicillium subg. Biverticillium foram transferidas e combinadas em Talaromyces. Benjamin (1955) introduziu o nome Talaromyces como uma metamorfose sexual e este gênero foi caracterizado como produtor de ascomas amarelos suaves que consistem em hifas entrelaçadas. O delineamento, a composição de espécies e a classificação taxonômica deste grupo foram modificados com base em fatores morfológicos e ecológicos. Assim, as espécies dos estágios sexuais anamórficas de Penicillium foram classificadas em Eupenicillium e Talaromyces (PITT, 2014). Isso significa que Talaromyces sensu stricto agora contém espécies que podem se reproduzir sexualmente (ascomata) e/ou assexualmente (conidióforos). Os conidióforos desse gênero emergem a partir do micélio reprodutor e apresentam conídio elipsoidal de parede lisa e esterigma terminal biverticiladas com ramificação. Em meio Batata Dextrose Ágar suplementado com extrato de levedura (BDA-YE) ocorre difusão intensa e rápida de pigmentação vermelha (Figura 4). A produção de colorantes tem sido estudada por fungos do filo Ascomycota, que apresentam reprodução sexuada (teleomórfica) e assexuada (anamórfica), sendo observado nos indivíduos que compõem esse filo um micélio septado. A meiose, algumas vezes seguida por divisão mitótica, ocorre na formação sexuada de ascósporos dentro de um asco, na classe Eurotiomycetes (YILMAZ et al., 2012). Revisão da Literatura 45 Figura 4. Aspecto morfológico de T. amestolkiae. (A) e (B) Aspecto macroscópico de T. amestolkiae em placa de Petri contendo BDA-YE (frente e verso) e apresentando excreção dos colorantes para o meio. (C) e (D) Microscopia de campo claro do T. amestolkiae caracterizando os conidióforos e as hifas. Colônias incubadas em placas de Petri contendo meio de cultura BDA- YE a 30 °C por 7 dias (Ampliação de 100X). (Fonte: Autoria própria). As espécies de Talaromyces geralmente produzem colorantes amarelo, laranja e vermelho no micélio ou como colorantes difusos no meio de cultivo. Algumas espécies do gênero Talaromyces excretam altas quantidades de colorantes vermelhos, incluindo as espécies T. amestolkiae, T. atroroseus, T. purpurogenus e T. albobiverticillius (PANDIT et al., 2018; SAMSON et al., 2011; SANTOS-EBINUMA et al., 2013; TOLBORG et al., 2020; VENKATACHALAM et al., 2019). Especificamente, a espécie T. amestolkiae produz colorantes da classe das azafilonas derivados de policetídeos semelhantes aos colorantes de Monascus (SAMSON et al., 2011; YILMAZ et al., 2012). Adicionalmente, já foi reportado na literatura que colorantes produzidos por T. amestolkiae apresentam atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e baixa citotoxicidade Revisão da Literatura 46 contra células de fibroblastos (ZACCARIM et al., 2018), sinalizando o seu potencial uso na indústria farmacêutica ou na indústria alimentícia para aplicação em alimentos funcionais. Apesar dos benefícios do uso de colorantes de origem microbiana, esforços têm sido feitos para reduzir os custos do processo, uma vez que colorantes sintéticos ou extraídos de fontes vegetais geralmente apresentam custos de produção menores (SEN; BARROW; DESHMUKH, 2019). O alto custo do processo de fermentação para a obtenção dos colorantes está relacionado, principalmente, pelo custo dos substratos de cultivo. Por exemplo, o custo total da produção de 50 L de prodigiosina de Serratia marcescens UTM1 usando meio de crescimento comercial (caldo nutritivo) é de US$ 58,61 contra US$ 5,91 usando substratos agrícolas. Outro exemplo é o alto custo da produção do β- caroteno por bactérias, que é aproximadamente de US$ 1000/kg contra US$ 500/kg para síntese do colorante amarelo sintético tartrazina (amarelo número 5, E102) (VENIL; ZAKARIA; AHMAD, 2013). 2.5 Cultivo submerso 2.5.1 Parâmetros que afetam a produção de colorantes Existem diversas formas de condução de processo ao se trabalhar com cultivo de microrganismos. Entre eles, pode-se citar o processo em batelada (também denominado descontínuo), no qual todos os nutrientes requeridos durante o cultivo, exceto oxigênio, em processos aeróbios, ou componentes químicos para ajustes de pH, são adicionados antes do início do cultivo e o produto é retirado somente no término de cada operação (SCHMIDELL et al., 2001). Um processo típico de produção biotecnológica pode ser dividido nas seguintes etapas: (a) upstream (preparação do meio de cultura e cultivo); (b) downstream (extração e purificação); (c) formulação. O processo downstream inclui etapas de (i) preparação; (ii) isolamento de sua molécula de interesse; (iii) purificação e (iv) polimento (MEITZ et al., 2014; STRUBE et al., 2011). Visando uma produção econômica com qualidade uniforme na etapa upstream, além de se trabalhar com uma espécie específica, é importante ter conhecimento dos fatores que afetam a produção da biomolécula alvo, como o tipo de cultivo (fermentação sólida, semi-sólida e submersa), pH, fontes de carbono, nitrogênio Revisão da Literatura 47 e outros nutrientes, viscosidade do caldo de cultivo, oxigênio dissolvido (para microrganismos aeróbios), frequência de agitação e taxa de aeração (OROZCO; KILIKIAN, 2008; TERÁN HILARES et al., 2018; VENDRUSCOLO et al., 2016a). Os colorantes fúngicos são metabólitos secundários que, muitas vezes, não têm função conhecida (MAPARI; THRANE; MEYER, 2010). Esses metabólitos são compostos que não estão envolvidos nas vias bioquímicas essenciais para o crescimento e a reprodução dos microrganismos, ao contrário dos metabólitos primários, e são representados por processos como síntese de proteínas, biossíntese de ácidos graxos e policetídeos. A síntese dos metabólitos secundários está relacionada à velocidade baixa de crescimento microbiano, sendo sintetizados quando o crescimento microbiano está na fase estacionária. Os metabólitos secundários são normalmente derivados do substrato utilizado ou quando grandes quantidades dos precursores de metabólitos primários, tais como aminoácidos, acetato, piruvato e outros, são acumulados (HAJJAJ et al., 1999). Há uma série de trabalhos sobre as necessidades nutricionais de várias espécies de Monascus focados na importância de certos açúcares e fontes de nitrogênio para a produção de colorantes (DE OLIVEIRA; DA COSTA; VENDRUSCOLO, 2019; KONGRUANG, 2011; SHI et al., 2015; VENDRUSCOLO et al., 2016b). No entanto, na maioria desses estudos, a descrição dos fatores que contribuem para o crescimento do microrganismo e/ou a síntese de colorantes ainda são escassas e superficiais. Por serem metabólitos secundários, a produção, composição e excreção dos colorantes depende da velocidade de crescimento do microrganismo, dos nutrientes disponíveis, como o tipo de fonte de nitrogênio, e uso de cepas específicas (MIYAKE et al., 2008). A principal fonte de nitrogênio pesquisada na produção de colorantes por fungos filamentosos em cultivo submerso tem sido de origem complexa como extrato de levedura e peptona de carne (SANTOS- EBINUMA; TEIXEIRA; PESSOA, 2013; ZACCARIM et al., 2018). Fontes complexas de nitrogênio são ideais para o crescimento microbiano, no entanto, uma parte dos colorantes produzidos permanecem intracelulares apresentando baixa taxa de excreção (DE OLIVEIRA et al., 2020; LIN; DEMAIN, 1991). Os colorantes extracelulares são preferidos, pois são solúveis no meio de cultivo e as etapas de downstream são mais simples e baratas (VELMURUGAN et al., 2010). Além disso, a maioria das cepas fúngicas produz uma mistura de Revisão da Literatura 48 moléculas de colorantes e o desafio é produzir uma molécula colorida específica e extracelular com alto rendimento. Recentemente, várias espécies de Monascus, Penicillium e Talaromyces têm sido reportadas como cepas produtoras de colorantes azafilona solúveis em água, tais como N-glutarilmonascorubramina, N-glutarilrubropunctamina, 6-[(Z)- 2N-Carboxivinil]-GABA-PP-V e PP-R-[(10Z)-7-(2-Hidroxietil)]- monascorubramina (VENKATACHALAM et al., 2018; YILMAZ et al., 2012). A adição de fontes de nitrogênio apropriadas no meio de cultivo, como os aminoácidos, pode facilitar a liberação e a solubilização desses colorantes (PASTRANA et al., 1995). Os colorantes vermelhos policetídicos são quimicamente similares aos laranjas diferindo apenas pela presença de um grupo -NH no lugar de um grupo -O. Essa modificação química ocorre através de uma reação aminofílica entre os colorantes laranjas policetídicos e uma amina primária (CHEN et al., 2017b; SHI et al., 2016). O glutamato monossódico (GMS) tem sido utilizado para melhorar a eficiência de produção de colorantes vermelhos extracelulares, pois serve tanto como fonte de nitrogênio quanto como espécie reativa na formação de um complexo ácido glutâmico-colorante, que leva à eventual excreção para o meio (HAJJAJ et al., 1997; LIN et al., 1992) (Figura 5). Revisão da Literatura 49 Figura 5. Representação esquemática da reação aminofílica entre os colorantes laranjas (monascorubrina ou rubropunctatina, R = C5H11 ou C7H15) de Monascus anka e o GMS, a qual pode ocorrer no interior das células durante o cultivo submerso e desencadeia a excreção no meio de cultivo dos colorantes vermelhos (N-gutarilmonascorubramina ou N-glutarilrubropunctamina, R = C28H33NO8 ou C26H29NO8) solúveis em água, apresentando o resíduo GMS (seta pontilhada). (Adaptado de Xiong et al., 2015). Jung et al. (2003) estudaram as características colorimétricas e estruturais dos colorantes de Monascus produzidos a partir de vários aminoácidos adicionados ao meio de cultivo. Esses autores relataram que dependendo do aminoácido precursor, pode-se determinar as quantidades de colorantes amarelo, laranja e vermelho produzidos durante a fermentação. Os resultados indicaram que os compostos hidrofóbicos amarelos e laranjas foram produzidos independentemente do aminoácido precursor. No entanto, quando aminoácidos hidrofílicos, como ácido aspártico e ácido glutâmico, foram usados como suplementos, os colorantes eram geralmente mais hidrofílicos. Em adição, as análises estruturais mostraram que os aminoácidos usados como suplementos foram aparentemente incorporados na estrutura dos colorantes. Entre os parâmetros que mais afetam o crescimento e a produção de colorantes por fungos filamentosos, o pH exerce um papel essencial nos Revisão da Literatura 50 colorantes produzidos (OROZCO; KILIKIAN, 2008; SHI et al., 2015; TERÁN HILARES et al., 2018). Variações no pH do meio de cultivo em processos empregando o gênero Monascus sp. alteram a proporção entre os colorantes amarelos, laranjas e vermelhos produzidos, como também a sua liberação no meio, principalmente, dos colorantes vermelhos (MUKHERJEE; SINGH, 2011). A influência do pH na formação destas biomoléculas está associada, principalmente, à forma química dos seus percursores. Vendruscolo et al. (2016b) estudaram a influência do pH na produção de colorantes por Monascus ruber através do ponto isoelétrico dos aminoácidos usados no meio de cultivo. Para a formação dos colorantes vermelhos, o íon NH3 + dos aminoácidos deve estar na forma protonada para interagir com o colorante laranja. De acordo com os autores, o ponto isoelétrico dos aminoácidos influencia na protonação dos grupos e é nesta característica que o pH tem importância no processo de formação dos colorantes ao se empregar aminoácidos no meio de cultivo. No trabalho acima reportado, os autores avaliaram o aminoácido glicina e verificaram que os colorantes amarelos eram produzidos em valores de pH entre 2,0 e 3,0, os laranjas na faixa entre 3,0 e 4,0 enquanto os vermelhos em pH acima de 5,0, pois nesta última condição o valor do pH é superior ao ponto isoelétrico da glicina. Embora uma grande quantidade de trabalhos sobre a produção de colorantes por fungos já terem sido publicados, faltam informações consistentes sobre o desempenho do cultivo em biorreatores. A melhoria dos processos geralmente é realizada em biorreatores em escala de bancada e, em seguida, dimensionada para equipamentos de escala industrial para produção comercial (LV et al., 2017). Até o momento, a maioria dos cultivos com base em colorantes fúngicos foram realizados em escala de laboratório usando frascos do tipo Erlenmeyer em agitador rotativo. No entanto, a viabilidade de atingir uma escala comercial de colorantes fúngicos dependerá da melhoria bem sucedida da síntese do colorante e da reprodutibilidade de cultivo em biorreatores. Para alcançar processos reprodutíveis, é necessário estabelecer protocolos padronizados de cultivo em escala de bancada (DUFOSSÉ, 2006). Vale ressaltar que abordagens integradas para avaliar o desempenho celular (com base nas taxas de crescimento e morfologia do microrganismo) em biorreator podem levar a uma melhora significativa na produção de colorantes Revisão da Literatura 51 fúngicos. Ademais, por ser um processo aeróbio, para tornar viável a ampliação de escala da produção de colorantes fúngicos, é indispensável primeiro definir o meio de cultivo e as condições de agitação e aeração mais adequadas ao processo (GIBBS; SEVIOUR; SCHMID, 2000; STANBURY; WHITAKER; HALL, 1995). 2.5.2 Aumento de escala Como citado anteriormente, grande parte dos cultivos de células fúngicas têm sido estudados em escala laboratorial alterando fatores intrínsecos e extrínsecos que afetam a síntese dos colorantes, onde os objetivos eram entender o desempenho do processo fermentativo e obter altos rendimentos em termos de intensidade de cor e não com foco em uma molécula específica (MORALES-OYERVIDES et al., 2020; TOLBORG et al., 2020). O desenvolvimento de novos colorantes para diversos fins industriais é desafiador, pois os colorantes precisam ser seguros, compatíveis com a matriz a qual serão aplicados, sintetizados a partir de processos sustentáveis e que, em última instância, tenham impacto mínimo no preço do produto final (DUFOSSÉ et al., 2014; WROLSTAD; CULVER, 2012). Nesse contexto, existem ainda deficiências no desenvolvimento de cultivos submersos para produção de colorantes fúngicos que sejam economicamente viáveis e reprodutíveis (SHI et al., 2015; YANG et al., 2015a). Tais deficiências como a mudança no comportamento reológico do caldo de cultivo durante o processo fermentativo devido à alteração da composição do substrato, concentração de biomassa e morfologia dos microrganismos podem ser contornadas através da compreensão da fisiologia microbiana e interações do microrganismo com o meio (CHO et al., 2002; KIM et al., 2002). A ampliação de escala pode ser definida como um procedimento em que os resultados experimentais com equipamento de menor escala são empregados para projetar e construir um sistema de maior escala, sendo considerado um importante passo no desenvolvimento de processos (OKONKOWSKI et al., 2005). De acordo com Mavituna (1996) o aumento de escala está condicionado a ensaios iniciais em bancadas de laboratório, para que estes sejam, em seguida, testados em escala piloto e industrial. De acordo com Stanbury; Whitaker; Hall (1995) e Okonkowski et al. (2005) há vários fatores Revisão da Literatura 52 que devem ser considerados ao analisar-se o aumento de escala até chegar ao nível industrial, dentre eles podemos citar: preparação do inóculo, esterilização e parâmetros ambientais (disponibilidade de nutrientes, pH, temperatura, teor de oxigênio dissolvido, condições de cisalhamento, concentração de dióxido de carbono dissolvido e formação de espuma). No caso de processos aeróbios, a agitação e aeração, seja em termos de volume de mistura ou disponibilidade de oxigênio, são parâmetros muito importantes no aumento de escala (STANBURY; WHITAKER; HALL, 1995). 2.5.2.1 Agitação e aeração em cultivo submerso Agitação e aeração são parâmetros de grande influência no crescimento e na produção de metabólitos secundários por microrganismos aeróbios, dentre eles M. ruber e T. amestolkiae (GOMEZ et al., 2015; HAJJAJ et al., 2000a; OLIVEIRA et al., 2020). A agitação é responsável por manter a homogeneidade do sistema em termos de homogeneidade de massa e energia, mantendo os microrganismos em suspensão. A aeração é responsável pelo suprimento de oxigênio para que os microrganismos executem suas atividades metabólicas e também ajuda a manter os microrganismos em suspensão (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009; GOMEZ et al., 2015). Os microrganismos aeróbios necessitam de oxigênio dissolvido no meio, necessário para o crescimento celular e responsável pela produção de metabólitos. O suprimento de oxigênio em cultivos submersos é promovido por meio da dissolução de oxigênio contido na fase gasosa para a fase líquida pela passagem através da interface gás-líquido, de modo a estar disponível para o consumo microbiano através da respiração pela passagem através da interface líquido-membrana celular. Quando em baixa disponibilidade, afeta diretamente o desempenho do processo (GARCIA-OCHOA et al., 2010; GOMEZ et al., 2015). Um dos principais problemas da transferência de oxigênio, no entanto, é a sua baixa solubilidade em água. À pressão ambiente e à temperatura de 30 °C – condições típicas de um processo aeróbio – a concentração de oxigênio saturado em água destilada é de 0,23 mmolL-1 (7,5 mgL-1) (BADINO; FACCIOTTI; SCHMIDELL, 2001). O kLa é definido como coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (h-1), onde “a” representa a área interfacial gás- líquido e kL é o coeficiente de transferência de massa com base na película Revisão da Literatura 53 líquida, que é dependente da difusividade do oxigênio e da espessura da película estagnada. Sendo C é a concentração de oxigénio dissolvido (OD) na fase líquida e Cs é a concentração de oxigênio que está em equilíbrio com o teor de oxigênio na fase gasosa, tem-se que a variação de C com o tempo devido à transferência da concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura é dada por: 𝑑𝐶 𝑑𝑡 = 𝑘𝐿𝑎. (𝐶𝑠 − 𝐶) equação 1 onde a variação de oxigênio dissolvido no meio de cultura com o tempo (dC/dt) é resultado da diferença do que é transferido (kLa.(Cs – C)). Aumentando-se a pressão parcial de oxigênio no gás de aeração, ou seja, aumentando-se a velocidade de transferência de oxigênio, aumenta-se o teor de oxigênio na fase gasosa no cultivo devido ao acréscimo de Cs e, consequentemente, da força motriz (Cs – C). Altas frequências de agitação acarretam em aumento da velocidade de transferência gás-líquido devido à diminuição da espessura da película estagnada (kL) e devido a maior área específica “a” pela fragmentação de bolhas, resultando em um acréscimo global do kLa, ou seja, incremento na transferência de oxigênio (BADINO; FACCIOTTI; SCHMIDELL, 2001; VENDRUSCOLO et al., 2012). O kLa é um parâmetro extensivamente estudado no aumento de escala de processos aeróbios. Isso se deve ao fato que para uma determinada força motriz, um aumento no valor de kLa melhora a taxa de transferência de oxigênio e seu valor expressa a capacidade do equipamento de transferir oxigênio independente do volume do reator (GALACTION et al., 2004; GILL et al., 2008). O kLa é significativamente influenciado por uma série de fatores, como características geométricas e operacionais dos vasos, tipo de impelidor empregado, frequência de agitação, vazão de ar, componentes do meio de cultivo, morfologia do microrganismo e a reologia do caldo de cultivo (GALACTION et al., 2004). A morfologia de microrganismos filamentosos desempenha um papel importante no seu metabolismo durante o processo fermentativo. A concentração celular e a morfologia do microrganismo afetam as propriedades reológicas do caldo de cultivo, afetando a produção de metabólitos de interesse Revisão da Literatura 54 (QUINTANILLA et al., 2015; VEITER; RAJAMANICKAM; HERWIG, 2018). Dada a relação complexa e não intuitiva entre morfologia fúngica e produtividade de metabólitos secundários, inúmeros esforços têm sido feitos para controlar a macromorfologia de microrganismos filamentosos usando abordagens abióticas como o fornecimento de oxigênio (YANG et al., 2015), pH (VEITER; RAJAMANICKAM; HERWIG, 2018), tamanho do inóculo (PAPAGIANNI; MATTEY, 2006), além de outros (KIM et al., 2002). As formas morfológicas mais comuns de fungos filamentosos são as hifas ramificadas, hifas isoladas e aglomerações de micélios chamados de pellets (GRIMM et al., 2005; QUINTANILLA et al., 2015). Em cultivos que as hifas ramificadas predominam, o caldo de cultivo resulta em um fluido heterogêneo e viscoso com características reológicas de fluidos não-Newtonianos (BLANCH; BHAVARAJU, 1976). Muitos estudos têm demonstrado que a viscosidade aparente de cultivos de microrganismos filamentosos contendo altas concentrações de biomassa é alta. Assim, esse tipo de fluido não segue a equação de proporcionalidade entre o valor da tensão de cisalhamento aplicada e o coeficiente de viscosidade dinâmica, assumindo problemas de transferência de massa (CHO et al., 2002; CHOI; PARK; OKABE, 2000; LV et al., 2017). Por outro lado, os pellets são compostos por aglomerações de hifas, com formas que vão do esférico ao alongado podendo apresentar superfície lisa ou ramificada. Em caldos de cultivo que predominam a morfologia de pellets, a viscosidade aparente é baixa, o que é uma vantagem, pois as condições de mistura e transferência de oxigênio são muitas vezes facilitadas. A maior desvantagem dos pellets é a difusão limitada de nutrientes e oxigênio dissolvido do caldo de cultivo para o interior do pellet (EL-ENSHASY, 2007; SERRANO- CARREÓN et al., 2015). Portanto, as variáveis hidrodinâmicas do biorreator afetam significativamente a morfologia celular através das condições de cisalhamento impostas às células fúngicas (LIN; SCHOLZ; KRULL, 2010; YU et al., 2012). Como a difusão natural em líquidos é relativamente lenta, o biorreator do tipo tanque agitado pode proporcionar uma melhor homogeneização do meio através dos agitadores rotativos providos de motor e eixo com impelidores. Os impelidores geram linhas de corrente de alta velocidade que, por sua vez, arrastam regiões de líquido estagnadas ou mais lentas, resultando em mistura Revisão da Literatura 55 uniforme por transferência de momento. À medida que a viscosidade do líquido aumenta, o processo de mistura torna-se mais difícil, uma vez que o atrito retarda as linhas de corrente de alta velocidade e confina-os ao redor do impelidor (HOLLAND; BRAGG, 1995). Os impelidores também são importantes no processo de transferência de massa gás-líquido. A mistura proporcionada pelos impelidores cria certa uniformidade das bolhas de gás dentro do reator. Quando utilizados em conjunto – geralmente em processos fermentativos aeróbios – são responsáveis por assegurar a distribuição do gás por todo o equipamento. Portanto, a agitação tem influência nos valores dos coeficientes de transferência de calor e de massa, evita a precipitação de sólidos e facilita sua dissolução, aumentando a capacidade de mistura gás/líquido e permitindo a manipulação da velocidade superficial dos gases liberados (GOGATE; BEENACKERS; PANDIT, 2000). A seleção de um impelidor eficiente determina as condições de cisalhamento que podem afetar as células microbianas no cultivo em biorreator tanque agitado, influenciando assim na eficiência de crescimento, quebra da parede celular, formação de produtos e possivelmente alterando a morfologia filamentosa (ZHONG, 2010). O processo de agitação pode danificar tanto os pellets quanto as estruturas de hifas isoladas ou ramificadas (ŽNIDARŠIČ; PAVKO, 2001). A direção e a magnitude da mistura são pontos críticos em sistemas com agitação mecânica. A direção dos vetores de velocidade e sua magnitude em fluidos viscosos e em regime turbulento são constantes. Na literatura, são comumente conhecidas como linhas de corrente ou padrão de escoamento. Essas correntes são responsáveis pela mistura e dependem do tipo de impelidor utilizado (COKER, 2001). Para exemplificar, o padrão de escoamento gerado por impelidores do tipo turbina Rushton e do tipo orelha de elefante são ilustrados na Figura 6. De modo geral, linhas de corrente para escoamento radial são ideais para dispersão de fluidos – as quais necessitam altos níveis de cisalhamento. Linhas de corrente para escoamento axial são mais adequadas em operações de mistura, suspensão de sólidos e transferência de calor (COKER, 2001). Revisão da Literatura 56 Figura 6. (A) Linhas de corrente para escoamento radial produzidas por impelidor do tipo turbina Rushton. (B) Linhas de corrente mistas para escoamento radial e axial produzidas por impelidor do tipo orelha de elefante. (Adaptado de Holland; Bragg, 1995). O padrão de escoamento radial gera linhas de corrente perpendicularmente ao eixo do agitador, ou seja, impulsiona a massa líquida contra as paredes do tanque e possuem alto consumo de potência, grande capacidade dispersiva e são considerados agressivos às células microbianas. Os modelos de impelidores do tipo turbina de pás retas, turbina de pás inclinadas e turbina de disco, tais como as turbinas Rushton, são responsáveis por gerar esse tipo de escoamento. O padrão de escoamento axial é aquele que gera linhas de corrente paralelas ao eixo do agitador, ou seja, impulsiona a massa líquida contra o fundo do tanque, seu consumo de potência é baixo, possuem grande abrangência por sua distribuição geométrica das linhas de corrente dentro do tanque. São encontrados nos modelos de hélice marítima, turbinas de pás inclinadas e orelha de elefante (COKER, 2001; HOLLAND; BRAGG, 1995). A turbina Rushton é o impelidor mais usado para a mistura em processos biológicos aeróbicos (DORAN, 2013). No entanto, a orelha de elefante produz um padrão de escoamento misto axial e radial, o que a tornou amplamente estudada para sistemas biológicos sensíveis às tensões de cisalhamento, como Revisão da Literatura 57 cultivos de células animais e fungos. Isso se deve, principalmente, à baixa força de cisalhamento imposta ao microrganismo e características satisfatórias de transferência de oxigênio. Com isso, diferentes impelidores envolvem distintas forças motrizes e, portanto, características de transferência de massa divergentes, resultando em, eventualmente, danos celulares e redução da produtividade (NIENOW, 2010). Portanto, definir não somente a melhor forma de condução do processo, mas também o tipo de impelidor e a taxa de aeração/agitação são fatores essenciais para um bom desenvolvimento de processos em biorreator tanque agitado. Diante do exposto, este trabalho visou estudar a produção de colorantes naturais por cultivo submerso de T. amestolkiae tanto em agitador rotativo quanto em biorreator tanque agitado de bancada operando os processos em modo batelada de forma a desenvolver um processo viável industrialmente. Assim, as características dos colorantes produzidos sob diferentes condições também foram estudadas. Objetivos Objetivos 59 3.1 Objetivo Geral Estudar o processo de produção e a estabilidade dos colorantes obtidos em cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo e biorreator tanque agitado de bancada. 3.2. Objetivos Específicos ➢ Avaliar a influência da fonte de nitrogênio na produção de colorantes por T. amestolkiae em agitador rotativo; ➢ Utilizar planejamentos estatísticos a fim de melhorar a produção de colorantes em agitador rotativo; ➢ Avaliar a suplementação do meio GMS-glicose com diversas fontes de amina em agitador rotativo; ➢ Avaliar o crescimento do microrganismo e a reologia do caldo de cultivo ao longo do tempo utilizando diferentes fontes nutricionais em agitador rotativo; ➢ Avaliar a influência da composição do meio do inóculo, vazão de ar, controle de aeração e tipo de impelidor empregado para prdução de colorantes por T. amestolkiae em biorreator do tipo tanque agitado operando os processos em modo batelada; ➢ Verificar a estabilidade dos colorantes em diversos valores de pH; ➢ Verificar os padrões de cor dos colorantes na presença dos sais K3PO4 e MnSO4. Materiais e Métodos Materiais e Métodos 61 A condução dos experimentos foi realizada em 6 etapas, descritas na Figura 7. Figura 7. Fluxograma representando a condução dos experimentos para a produção de colorantes naturais por T. amestolkiae. 1ª etapa: Avaliação de diferentes fontes de nitrogênio na produção de colorantes em cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo. 2ª etapa: Produção de colorantes em cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo avaliando, através de planejamentos estatísticos, as variáveis: pH, concentração de glicose, concentração de GMS, tamanho do inóculo, presença e concentração de macro e micronutrientes. Nesta etapa, definiu-se o meio GMS-glicose empregado nas etapas posteriores. 3ª etapa: Avaliação do efeito da suplementação do meio GMS-glicose definido na etapa anterior com fontes de aminas provenientes de fontes complexas de nitrogênio (extrato de levedura, extrato de carne e peptona de carne), aminoácidos e vitaminas para produção de colorantes em agitador rotativo. Materiais e Métodos 62 4ª etapa: Avaliação do crescimento do microrganismo e da reologia do caldo de cultivo ao longo de 168 h de cultivo submerso em agitador rotativo empregando o meio GMS-glicose e o meio contendo fonte complexa de nitrogênio definido por Zaccarim et al. (2018). 5ª etapa: Após selecionar as melhores condições para produção de colorantes vermelhos a partir das etapas anteriores (frascos agitados), os cultivos foram conduzidos em batelada em biorreator tanque agitado de bancada. A influência da composição do meio do inóculo, vazão de ar, controle de aeração e tipo de impelidor empregado foram os focos desta etapa. 6ª etapa: Estudo de estabilidade dos colorantes naturais obtidos nos cultivos anteriores frente à variação do pH por ácido, base e sais. 4.1 Materiais A glicose e o glutamato monossódico (GMS) foram obtidos da LS Chemicals e da Dinâmica (São Paulo, Brasil), respectivamente. O meio de manutenção e inóculo (Batata Dextrose Ágar suplementado com extrato de levedura) foram obtidos da Acumedia (São Paulo, Brasil). Todos os outros reagentes utilizados foram de grau analítico. 4.2 Microrganismo e preparação do inóculo O microrganismo utilizado foi o fungo filamentoso T. amestolkiae, cedido pela Coleção de Culturas DPUA, do laboratório de Micologia da Universidade Federal do Amazonas – UFAM (Cadastro de Acesso no Ministério do Meio Ambiente nº A3FE0C3). Uma cultura estoque da linhagem foi mantida em tubos de ensaio contendo meio Batata Dextrose Ágar suplementado com extrato de levedura (BDA-YE) a 30 ºC por 168 h e, posteriormente, mantidos a 4 ºC. O meio BDA-YE apresentou a seguinte composição (gL-1 água deionizada): ágar batata dextrose (39,0) e extrato de levedura (5,0). Na preparação do inóculo, o fungo foi transferido da cultura estoque para o centro da placa de Petri (60 x 15 mm) contendo meio BDA-YE e mantido a 30 ºC por 168 h. Todos os meios foram esterilizados a 121°C por 20 min. Materiais e Métodos 63 4.3 Produção de colorantes em agitador rotativo 4.3.1 Avaliação da fonte de nitrogênio Inicialmente, estudou-se a produção de colorantes naturais em agitador rotativo (New Brunswick Innova 40R, Eppendorf, Inc., USA) variando a fonte de nitrogênio. Para tanto, 5 discos de micélio de T. amestolkiae foram perfurados a partir do inóculo com um tubo de 8 mm de diâmetro e transferidos para 50 mL de meio de cultivo em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL. Os frascos foram incubados à 30 ºC, 150 rpm por 168 h. Sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de sódio e GMS foram testados como fontes de nitrogênio em substituição às duas fontes complexas de nitrogênio: peptona de carne e extrato de carne (ZACCARIM et al., 2018). O meio descrito por Zaccarim et al. (2018) tinha a seguinte composição (gL-1 em água deionizada): glicose (30), peptona de carne (10) e extrato de carne (1,0). Posteriormente, foi avaliada uma curva de crescimento e produção de colorantes por T. amestolkiae cultivado na melhor condição anterior. Nesse ensaio, amostras foram retiradas em triplicata a cada 24 h a partir de 168 h de cultivo até completar 360 h, para se determinar a produção de colorantes, pH final e biomassa. Todos os meios tiveram o pH ajustado em 7,0 e, posteriormente, foram esterilizados a 121 °C por 20 min. 4.3.2 Planejamentos estatísticos Em seguida, empregou-se planejamentos estatísticos para aumentar a produção dos colorantes. Os dois primeiros planejamentos experimentais foram conduzidos utilizando 5 discos de micélio por 50 mL de meio de cultura em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL. Todos os ensaios foram realizados em agitador rotativo (New Brunswick Innova 40R, Eppendorf, Inc., USA) a 30 °C, 150 rpm por 168 h. Primeiramente, foram realizados experimentos utilizando um planejamento fatorial 23 completo (8 experimentos mais 3 pontos centrais) para investigar os efeitos da concentração de glicose, concentração de GMS e pH na produção de colorantes vermelhos. A partir desse planejamento fatorial, a concentração de glicose foi mantida constante a 10 gL-1 e os efeitos do pH e concentração de GMS na produção de colorantes vermelhos foram avaliados por um delineamento central composto 22. Neste planejamento fatorial, um conjunto de 12 experimentos contendo uma matriz fatorial central composta com pontos Materiais e Métodos 64 centrais e pontos axiais foram realizados. A partir dos resultados desses experimentos, as variáveis concentração de GMS e pH foram fixadas em 25 gL- 1 e 5,0, respectivamente. A Tabela 1 mostra as variáveis e níveis dos fatores para ambos os desenhos experimentais. Tabela 1. Variáveis e níveis dos fatores usados nos planejamentos experimentais utilizados para o estudo da produção de colorante vermelho por cultivo submerso de T. amestolkiae em agitador rotativo a 30 °C, 150 rpm por 168 h. Fatores Níveis Axial (-1.41) Inferior (-1) Central (0) Superior (+1) Axial (+1.41) Planejamento fatorial 23 Glicose (gL-1) 0,0 5,0 10 GMS (gL-1) 8,0 14 20 pH 5,0 7,0 9,0 Planejamento central composto 22* GMS (gL-1) 12,95 15 20 25 27,05 pH 2,59 3,0 4,0 5,0 5,41 *Glicose foi mantida a 10 gL-1 e o tamanho do inóculo foi de 5 discos de micélio para 50 mL de meio. Para a análise estatística, os valores reais de cada variável independente (Xi) foram codificados para fornecer níveis codificados de acordo com a equação: i oi i X XX x  − = equação 2 em que xi representa o valor codificado correspondente, Xo, o valor real do ponto central e ΔXi, o valor de cada passo. O software “Statistica” versão 7.0 (Statsoft, Tulsa, OK, EUA) foi utilizado para a análise de regressão dos dados obtidos e para estimar os coeficientes da equação de regressão. A qualidade do ajuste do modelo polinomial foi expressa pelo coeficiente de determinação R2, e sua significância estatística foi validada pelo teste F ao nível de significância (p) ≤ 0,05; a significância dos coeficientes de regressão foi testada por um teste t. Após fixar a concentração de glicose, GMS e o pH inicial, nas seguintes condições: 10 gL-1 de glicose, 25 gL-1 de GMS e pH 5,0, foi realizado um estudo para analisar o tamanho do inóculo, variando o número de discos de micélio (5, Materiais e Métodos 65 10 e 15) por 50 mL de meio de cultivo em frascos tipo Erlenmeyer de 250 mL em agitador rotativo (New Brunswick Innova 40R, Eppendorf, Inc., USA) a 30 °C, 150 rpm por 168 h. Posteriormente, um planejamento Plackett-Burman para 7 variáveis foi utilizado para triagem da concentração de macro e micronutrientes (PLACKETT; BURMAN, 1946). As concentrações de sais foram determinadas com base na literatura (LEE et al., 2001; LIN; DEMAIN, 1991; WEINBERG, 1990). Cada variável foi testada em dois níveis: superior (+) e inferior (-) mais 3 pontos centrais. Os níveis dos fatores para este desenho experimental estão apresentados na Tabela 2. A seguir, foi realizado um estudo da variação da concentração de MgSO4 (mgL-1: 6,0; 12; 24) enquanto FeSO4 e CaCl2 foram mantidos constantes a 10 e 15 mgL-1. Tabela 2. Variáveis e níveis dos fatores usados no planejamento Plackett- Burman utilizado para o estudo da produção de colorant