RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2017. Laís Salomão Arias EFEITO DO TIROSOL SOBRE BIOFILMES DE STREPTOCOCCUS MUTANS ARAÇATUBA - SP 2016 Laís Salomão Arias EFEITO DO TIROSOL SOBRE BIOFILMES DE STREPTOCOCCUS MUTANS Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciência Odontológica – Área Saúde Bucal da Criança. Orientador: Prof. Dr. Douglas Roberto Monteiro Coorientador: Prof. Tit. Alberto Carlos Botazzo Delbem ARAÇATUBA - SP 2016 Catalogação-na-Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Arias, Laís Salomão. A696e Efeito do tirosol sobre biofilmes de Streptococcus mutans / Laís Salomão Arias. - Araçatuba, 2016 96 f. : il. ; tab. + 1 CD-ROM Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientador: Prof. Douglas Roberto Monteiro Coorientador: Prof. Alberto Carlos Botazzo Delbem 1. Percepção de quorum 2. Anti-infecciosos 3. Biofilmes 4. Streptococcus mutans 5. Tirosol I. Título Black D27 CDD 617.645 Laís Salomão Arias Dados Curriculares LAÍS SALOMÃO ARIAS Nascimento 07/06/1990 Campo Grande-MS Filiação Edison Rubens Arrabal Arias Sônia Maria Salomão Arias 2008/2011 Curso de graduação em Odontologia na Universidade Federal de Mato Grosso do Sul 2012/2014 Residência em Odontopediatria na Universidade Estadual de Londrina 2014/Atual Curso de Pós-Graduação em Ciência Odontológica – área Saúde Bucal da Criança, nível de Mestrado, na Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP Associações CROSP - Conselho Regional de Odontologia de São Paulo SBPqO - Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica IADR - International Association for Dental Research Dedicatória ________________________________ Dedicatória _______________________________________________ Laís Salomão Arias Dedico este trabalho Aos meus pais, Edison e Sônia Pelo apoio em todos os momentos difíceis, pelo exemplo de bondade e dedicação, pelos olhares atentos às minhas necessidades mais do que às minhas vontades. Por me ensinarem a ter firmeza de caráter e a levantar frente às dificuldades sempre com muita humildade. Finalmente, por me ensinarem o caminho para uma fé na qual a vida é plena. Não poderia ter tido melhor berço. Amo e admiro muito vocês! À minha irmã, Juliana Por vir ao mundo por um capricho meu e cultivar nossa relação com um toque todo seu. Nem sempre irmãos gostam das mesmas coisas, mas se pudesse escolher as coisas que teríamos em comum, até agora eu não mudaria nada. Pelo companheirismo e até pelas "argumentações" bastante ousadas, por fazer de mim um modelo seu sem eu muito merecer e por me amparar quando o chão me escapa. Por me dar a certeza de que eu não estarei sozinha. Estamos uma para a outra. Amo e tenho muito orgulho de você! À minha avó Helena (in memoriam) Por viver o amor. Ser exemplo. Ser fé. Ser vida. Ser bondade. Ser carinho. Ser sabedoria. Ser vó. Ser mãe. Ser todos os recursos que nunca me faltaram. Exemplo é isso: ser. Tudo isso já fez minha vida valer a pena. Nada é mais forte, nem mais bonito do que este legado. Não importa quanto tempo passe, sempre me lembrarei de você com extremos carinho e esperança. Minha meta é poder algum dia, servir de exemplo para alguém. Vó Helena, mulher de fé. Tenho saudades e vou amá-la sempre. Agradecimentos Especiais ___________________________________ Agradecimentos especiais _______________________________________________ Laís Salomão Arias A Deus Pela minha vida, família e saúde. Pela proteção recebida a todo momento, por guiar meus passos pelos melhores caminhos e por me conferir a centelha que vem de ti, pulsa e gera todas as coisas. Pelo amor universal. Agradeço pela curiosidade em conhecer cada vez mais, e me frustrar e me encantar com todos os seus planos que jamais sonhei em conhecer. Obrigada por todas as pessoas maravilhosas e amparo nos momentos difíceis. À minha família Por serem tão bons, me apoiarem e me fazerem sentir importante e amada. Por se tornarem meu motivo de querer crescer cada dia mais e melhor, de querer doar e receber... Ao meu coorientador Alberto Carlos Botazzo Delbem Por me oportunizar estudar nessa faculdade e me incluir em um campo de pesquisa interessante e motivador. Ao meu orientador Douglas Roberto Monteiro Por me acolher de modo tão singelo e bondoso, pela generosidade em compartilhar seus ensinamentos, pelo tempo despendido no meu período de instrução, pela atenção constante, pela compreensão e paciência em momentos difíceis. Por ser um verdadeiro mestre em todos os sentidos. Por ser líder, ser guia, ensinar com zelo e aprender com incabível humildade. Agradeço a confiança, conselhos e a amizade. A minha admiração por você como pessoa e profissional com certeza serão eternas! Você sempre será um exemplo para mim e para todos que convivem com você. Agradecimentos especiais _______________________________________________ Laís Salomão Arias Ao Prof. Juliano Pelim Pessan Por ser um exemplo incrível de como equilibrar perfeitamente a amizade e o profissionalismo. Obrigada pelo companheirismo diário, pelo apoio no laboratório sempre superando expectativas e seu tempo concorrido, pelas risadas, convites, disposição e companheirismo. É motivador vislumbrar um futuro profissional no qual um pesquisador/ professor/ orientador demonstre satisfação constante como você é capaz de fazer. Ao Prof. Robson Agradeço por conhecer profissionais que amam tanto nossa profissão. Amor-dedicação. É que você vive, faz e brilha. Obrigado por me agregar cada vez mais conhecimento, e me recordar orgulhosamente a cada dia o verdadeiro significado de ser professor. Obrigado, portanto, Robson, sinônimo de professor. Ao meu querido amigo Vinícius Barboza Por cultivar nossa amizade com grande parte do adubo, por ser querido, sempre se lembrar e se importar, mesmo e apesar da minha vida cigana. Por toda força e apoio em tantas etapas da minha vida. Por ser assim tão grande e maravilhoso com todos os seus amigos. Muito obrigada. Aos meus amigos de Araçatuba... Ao Renan Aparecido Fernandes É difícil explicar o início de uma amizade que sempre esteve ali. Foi tão natural ser sua amiga, que as conversas, dos mais variados níveis, surgiam sem Agradecimentos especiais _______________________________________________ Laís Salomão Arias explicação. E foi essa parceria, tanto na vida profissional quanto pessoal que deixou tudo mais fácil e mais leve. À Luhana Por ter me aceitado em tão pouco tempo. Mesmo às pressas e sem me conhecer, aceitou morar comigo, nos adaptamos e sem perceber, a Luhana se tornou de maneira tão natural uma amiga e confidente. É generosa, respeitosa, amorosa, engraçada e muito querida. Deus não poderia me abençoar com uma amiga e "colega de república" melhor. À Priscila Vieira Por ser uma amiga tão especial, parceira de clínica, de confidências, alguém fundamental para a minha sanidade. Sem brincadeiras. Obrigada por tornar tudo mais leve e me lembrar que existe um mundo grande e lindo lá fora. À Giovana Dalpasquale, Larissa Cardoso e Sâmia Sass Pela química que rolou na nossa turma e que só nós conhecemos. Agradeço todos os momentos compartilhados. Caminho com a confiança de que entre nós, uma deseja sempre o sucesso e coisas boas para a outra. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Pelo grande incentivo na forma de Bolsa de Mestrado (FAPESP, Processo 2014/05507-9). Agradecimentos _________________________________ Agradecimentos _______________________________________________ Laís Salomão Arias À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP na pessoa de seu diretor Prof. Tit. Wilson Roberto Poi, pela oportunidade de aprendizado e crescimento pessoal e profissional. Ao atual coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciência Odontológica da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Prof. Adj. Luciano Tavares Angelo Cintra, pelo trabalho, competência e acessibilidade. Ao Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP pela oportunidade da realização do meu mestrado e aos professores e funcionários pelo convívio tão agradável. Às funcionárias da seção de Pós-graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Valéria, Cristiane e Lilian, pela presteza, apoio e suporte durante todo esse tempo. Aos queridos Pós-graduandos do Departamento de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP Agradecimentos _______________________________________________ Laís Salomão Arias pela amizade, convivência agradável e auxílio mútuo que proporcionaram um ambiente maravilhoso de intenso crescimento pessoal e profissional. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho Meu muito obrigada! “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” Arthur Schopenhauer Resumo ________________________________ Resumo _______________________________________________ Laís Salomão Arias ARIAS, L.S. Efeito do tirosol sobre biofilmes de Streptococcus mutans. 2016 96f. Dissertação (Mestrado em Ciência Odontológica, área de Saúde Bucal da Criança) - Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba 2016. O tirosol é uma molécula de quorum-sensing (QS) que participa do controle da morfogênese em Candida albicans. Contudo, seu efeito como agente antimicrobiano sobre biofilmes de Streptococcus mutans permanece desconhecido. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tirosol em diferentes concentrações sobre a produção de ácido e formação de biofilmes por S. mutans ATCC 25175, bem como quantificar biofilmes pré-formados desta espécie desenvolvidos sobre espécimes de hidroxiapatita (HA) e tratados com tirosol. A concentração inibitória mínima (CIM) de tirosol sobre células no estado planctônico foi determinada de acordo com o método da microdiluição. Na sequência, biofilmes de S. mutans foram formados durante 48 horas sobre espécimes de HA na presença de diferentes concentrações de tirosol (11,25, 22,5, 50, 100 e 200 mmol l-1), usando saliva artificial como meio de cultura. Após, a produção de ácido foi avaliada através da mensuração do pH do meio, enquanto a formação de biofilmes foi determinada através da quantificação da biomassa total (BT), atividade metabólica (AM) e número de unidades formadoras de colônias (UFCs). Ainda, biofilmes pré-formados (24 horas) de S. mutans foram tratados com tirosol a 100 e 200 mmol l-1 por 1 minuto, duas vezes ao dia, durante três dias, totalizando biofilmes de 96 horas. Em seguida, a atividade antimicrobiana foi avaliada por meio da quantificação da BT, AM, número de UFCs e composição da matriz extracelular (proteínas e carboidratos). Gluconato de clorexidina (490 µmol l-1) foi usado como controle positivo. Os dados foram analisados por ANOVA a um critério, seguido pelos testes de Tukey e Holm-Sidak (α = 0,05). Microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizada na análise da estrutura dos biofilmes. A CIM de tirosol foi 90 mmol l-1. Tirosol em concentrações subinibitórias (11,25 e 22,5 mmol l-1) não reduziu a produção de ácido dos biofilmes de S. mutans. Entretanto, biofilmes formados na presença de tirosol a 50, 100 e 200 mmol l-1 mostraram reduções significativas na AM e no número de UFCs, variando de 23,4 a 85,5 % e 1,19 a 4,54-log10, respectivamente. Para os biofilmes pré-formados, os tratamentos Resumo _______________________________________________ Laís Salomão Arias com tirosol não promoveram reduções significativas, exceto para a AM do biofilme tratado com tirosol a 200 mmol l-1, a qual mostrou uma redução de 40 % (p = 0.015) quando comparada ao controle negativo. Ainda, o tratamento com tirosol a 200 mmol l-1 resultou em aumento significativo no conteúdo proteico da matriz extracelular do biofilme pré-formado de S. mutans. As imagens de MEV confirmaram os resultados de quantificação das UFCs. Portanto, foi possível concluir que o tirosol mostrou melhores efeitos sobre a formação de biofilmes do que sobre biofilmes pré-formados, e esta molécula de QS não foi capaz de reduzir a produção de ácido dos biofilmes de S. mutans. Esses resultados podem ser úteis no desenvolvimento de terapias tópicas voltadas para a prevenção de doenças orais associadas aos biofilmes, como a cárie dentária. Palavras-chave: Percepção de quorum; Anti-infecciosos; Biofilmes; Streptococcus mutans; Tirosol. Abstract _______________________________ Abstract _______________________________________________ Laís Salomão Arias ARIAS, L.S. Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms. 2016 96f. Dissertação (Mestrado em Ciência Odontológica, área de Saúde Bucal da Criança) - Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba 2016. Tyrosol is a quorum-sensing molecule (QS) that participates in the control of Candida albicans morphogenesis. However, its effect as an antimicrobial agent on Streptococcus mutans biofilms remains unknown. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of tyrosol at different concentrations on the acid production and biofilm formation by S. mutans ATCC 25175, as well as to quantify pre-formed biofilms of this species developed on hydroxyapatite (HA) specimens and treated with tyrosol. Minimum inhibitory concentration (MIC) of tyrosol against planktonic cells was determined in accordance with the microdilution method. Subsequently, S. mutans biofilms were formed during 48 hours on HA specimens in the presence of different concentrations of tyrosol (11.25, 22.5, 50, 100 and 200 mmol l-1), using artificial saliva as culture medium. Next, the acid production was assessed by pH determination of the medium, while the biofilm formation was determined through quantification of total biomass (TB), metabolic activity (MA) and number of colony-forming units (CFUs). Further, S. mutans pre-formed biofilms (24 h) were treated with tyrosol at 100 and 200 mmol l-1 twice a day for 1 min, during 3 days, totaling 96-h biofilms. Then, the antimicrobial activity was evaluated through quantification of TB, MA, number of CFUs and composition of biofilms’ extracellular matrix (proteins and carbohydrates). Chlorhexidine gluconate (490 µmol l-1) was used as positive control. Data were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s and Holm-Sidak's tests (α = 0.05). Scanning electron microscopy (SEM) observations were performed in order to analyze biofilms’ structure. MIC of tyrosol was 90 mmol l-1. Tyrosol at sub-inhibitory concentrations (11.25 and 22.5 mmol l-1) was not able to significantly reduce acid production by S. mutans biofilms. However, biofilms formed in the presence of tyrosol at 50, 100 and 200 mmol l-1 showed significant decreases in MA and number of CFUs, ranging from 23.4 to 85.5 % and 1.19 to 4.54-log10, respectively. For pre-formed biofilms, the treatments with tyrosol did not promote significant reductions, except for MA of Abstract _______________________________________________ Laís Salomão Arias biofilm treated with 200 mmol l-1 tyrosol, which showed a 40 % reduction (p = 0.015) compared to the negative control. Moreover, treatment with 200 mmol l-1 tyrosol resulted in a significant increase in the protein content of the extracellular matrix of S. mutans pre-formed biofilm. SEM observations confirmed the results of CFU enumeration. In conclusion, tyrosol showed better effects on biofilm formation than on pre-formed biofilm, and this QS molecule was not able to reduce acid production by S. mutans biofilms. These results may be useful in the development of topical therapies focused on preventing biofilm-associated oral diseases, such as dental caries. Keywords: Quorum Sensing; Antimicrobials; Biofilms; Streptococcus mutans; Tyrosol. Lista de Figuras ________________________________ Lista de figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias LISTA DE FIGURAS FIGURE 1 - Mean absorbance values per cm2 obtained with crystal violet staining assay for single biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite specimens in the presence of different concentrations of tyrosol. NC: negative control (biofilm formed without tyrosol); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate); 50T, 100T and 200T: tyrosol at 50, 100 and 200 mmol l-1, respectively. Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA)............................................................................ 65 FIGURE 2- Mean absorbance values per cm2 obtained with XTT reduction assay for single biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite specimens in the presence of different concentrations of tyrosol. NC: negative control (biofilm formed without tyrosol); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate); 50T, 100T and 200T: tyrosol at 50, 100 and 200 mmol l-1, respectively. Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA with Holm-Sidak post-hoc test)............................. 66 FIGURE 3 - Mean values of the logarithm of colony forming units per cm2 (log10 CFU cm-2) obtained for single biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite specimens in the presence of different concentrations of tyrosol. NC: negative control (biofilm formed without tyrosol); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate); 50T, 100T and 200T: tyrosol at 50, 100 and 200 mmol l-1, respectively. Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA with Holm-Sidak post-hoc test)....... 67 Lista de figuras _______________________________________________ Laís Salomão Arias FIGURE 4 - Mean absorbance values per cm2 (crystal violet) for pre-formed biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite, and treated with tyrosol at 100 mmol l-1 (100T) and 200 mmol l-1 (200T). NC: negative control (non-treated biofilm); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate). Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA)....... 68 FIGURE 5 - Mean absorbance values per cm2 (XTT reduction) for pre-formed biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite, and treated with tyrosol at 100 mmol l-1 (100T) and 200 mmol l-1 (200T). NC: negative control (non-treated biofilm); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate). Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA with Holm-Sidak post hoc test).................................................................... 69 FIGURE 6 - Mean values of the logarithm of colony forming units per cm2 (log10 CFU cm-2) obtained for pre-formed biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite, and treated with tyrosol at 100 mmol l-1 (100T) and 200 mmol l-1 (200T). NC: negative control (non- treated biofilm); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate). Error bars indicate standard deviations of the means. Different letters represent significant differences among the groups (p < 0.05, using one-way ANOVA with Holm-Sidak post hoc test)...... 70 FIGURE 7 - Scanning electron micrographs of S. mutans ATCC 25175 biofilms formed on hydroxyapatite in the presence of different concentrations of tyrosol. NC (a) = negative control; PC (b) = positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate); tyrosol at 50 (c), 100 (d) and 200 mmol l-1 (mM) (e). Magnification: x 5000. Bar: 5.0 µm........................ 71 FIGURE 8 - Scanning electron micrographs of pre-formed biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite and treated with tyrosol at 100 mmol l-1 (mM) (c) and 200 mmol l-1 (mM) (d). NC (a) = negative control; PC (b) = positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate). Magnification: x 5000. Bar: 5.0 µm.................................. 72 Lista de Tabelas ________________________________ Lista de Tabelas _______________________________________________ Laís Salomão Arias LISTA DE TABELAS Table 1 - Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values of tyrosol and chlorhexidine gluconate against the tested strain..................................................................... 62 Table 2 - Mean (SD) pH values obtained with the acid production assay by single biofilms of S. mutans ATCC 25175 formed on hydroxyapatite in the presence of tyrosol at 11.25 mmol l-1 (11.25T) and 22.50 mmol l-1 (22.50T). NC: negative control (non-treated biofilm); PC: positive control (0.45 µmol l-1 chlorhexidine gluconate).................... 63 Table 3 - Mean (SD) protein and carbohydrate contents (from extracellular matrix) for S. mutans ATCC 25175 biofilms obtained after treatment with tyrosol at 200 mmol l-1 (200T). NC: negative control (non- treated biofilm); PC: positive control (490 µmol l-1 chlorhexidine gluconate)....................................................................................... 64 Lista de Abreviaturas e Símbolos ________________________________ Lista de Abreviaturas e Símbolos _______________________________________________ Laís Salomão Arias LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 60Co Cobalto a.m. Ante Meridiem Abs/Absorb Absorbance Abs cm-2 Absorbance per square centimeter ANOVA Análise de Variância/Analysis of Variance AS Artificial Saliva ATCC American Type Culture Collection BCA Bicinchoninic acid BHI Brain Heart Infusion BSA Bovine Serum Albumin CaCl2 Calcium chloride cells ml-1 Cells per mililiter CFU(s) Colony-forming unit (s) CFU cm-2 Colony-forming unit (s) per square centimeter CHG Chlorhexidine gluconate cm Centimeter CO2 Gás carbônico CV Crytal Violet FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Fig. Figure g Gramme g Gravity h Hora/Hour HA Hidroxiapatita/Hydroxyapatite KCl2 Potassium chloride KGy Kilogray l Litro/Liter Log10 Logaritmo na base 10/ Logarithm to the base 10 MBC Minimum Bactericidal Concentration M Molar MEV Microscopia Eletrônica de Varredura mg Miligrama/Milligram mg g-1 Miligrama por grama/Milligram per gramme MIC Minimum Inibitorium Concentration min Minuto/Minute ml Mililitro/Milliliter mm Milímetro/Millimeter Lista de Abreviaturas e Símbolos _______________________________________________ Laís Salomão Arias mM/ mmol l-1 Milimolar/Millimolar NaCl Cloreto de Sódio/Sodium Chloride nm Nanômetro/Nanometer ºC Graus Celsius/Degrees Celsius p Probabilidade/Probability PBS Phosphate-buffered saline pH Potencial Hidrogeniônico/Hydrogen potential p.m. Post Merediem QS Quorum Sensing Ra Rugosidade/Roughness rev min-1 Revolução por minuto/Revolution per minute s Segundo/Second SD Desvio Padrão/Standard Deviation SEM Scanning Eletron Microscopy t Tonelada/Tonne T Tirosol/Tyrosol UFC(s) Unidades Formadoras de Colônias UNESP Universidade Estadual Paulista v Volume/Volume v v-1 Volume por volume/Volume per volume W Watts XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5- Carboxanilide) α Alfa θ Teta μl Microlitro/Microliter µm Micrômetro/Micrometer μmol l-1 Micromolar/Micromolar Sumário _______________________________ Sumário _______________________________________________ Laís Salomão Arias SUMÁRIO TITLE PAGE 30 ABSTRACT 31 INTRODUCTION 33 MATERIALS AND METHODS 35 RESULTS 43 DISCUSSION 46 ACKNOWLEDGEMENTS 51 REFERENCES 51 FIGURE CAPTIONS 59 ANEXOS 73 Laís Salomão Arias Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms Running headline: Tyrosol against Streptococcus mutans Laís Salomão Arias 1 , Alberto Carlos Botazzo Delbem 1 , Renan Aparecido Fernandes 2 , Débora Barros Barbosa 2 and Douglas Roberto Monteiro 1* Departments of 1 Pediatric Dentistry and Public Health and 2 Dental Materials and Prosthodontics, Araçatuba Dental School, Univ Estadual Paulista (UNESP), Araçatuba, SP, Brazil *Corresponding author: Douglas Roberto Monteiro Araçatuba Dental School, Univ. Estadual Paulista (UNESP) Department of Pediatric Dentistry and Public Health Rua José Bonifácio 1193 16015-050 Araçatuba - SP - Brazil Tel: (+55) 18 3636 3316 Fax: (+55) 18 3636 3332 Email: douglasrmonteiro@hotmail.com *De acordo com as instruções aos autores do periódico Journal of Applied Microbiology (Anexo A). Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms - 31 - _______________________________________________ Laís Salomão Arias Abstract Aim: the aim of this study was to evaluate the effect of tyrosol at different concentrations on the acid production and biofilm formation by Streptococcus mutans, as well as to quantify pre-formed biofilms of this species developed on hydroxyapatite (HA) surfaces and treated with tyrosol. Methods and Results: S. mutans biofilms were formed on HA in the presence of different concentrations of tyrosol, during 48 h. Next, the acid production was assessed by pH determination, while the biofilm formation was determined through quantification of total biomass, metabolic activity and number of colony-forming units (CFUs). Moreover, pre-formed biofilms (24 h) were treated with tyrosol, twice a day for three days, and the antimicrobial activity was evaluated through quantification of total biomass, metabolic activity, number of CFUs and composition of biofilms’ extracellular matrix. Data were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s and Holm- Sidak's tests (α = 0.05). Scanning electron microscopy (SEM) observations were performed in order to analyze biofilms’ structure. Tyrosol was not able to significantly reduce acid production by S. mutans biofilms. However, biofilms formed in the presence of tyrosol showed significant decreases in metabolic activity and number of CFUs. For pre-formed biofilms, in general, tyrosol did not promote significant reductions. SEM observations confirmed the results of CFU enumeration. Conclusion: Tyrosol showed better effects on biofilm formation than on pre-formed biofilm of S. mutans. Significance and Impact of the Study: This is the first study showing the effect of tyrosol on S. mutans biofilms. These results may be useful in the development of topical therapies focused on controlling biofilm-associated oral diseases, such as dental caries. Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms - 32 - _______________________________________________ Laís Salomão Arias Keywords: Antimicrobials, Biofilms, Hydroxyapatite, Quorum sensing, Streptococci, Tyrosol. Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms - 33 - _______________________________________________ Laís Salomão Arias Introduction Biofilms are defined as structured microbial communities attached to an inert or living surface and surrounded by an extracellular matrix into an aqueous medium (Costerton et al. 1999; Jakubovics and Kolenbrander 2010). The human oral cavity provides an environment with hard and soft tissues, which favors the formation of polymicrobial biofilms (Jakubovics and Kolenbrander 2010). The relationship among microorganisms within biofilms may enhance their resistance and chances of survival (De Sordi and Mühlschlegel 2009; Jakubovics and Kolenbrander 2010). In this sense, imbalances in these communities lead to the increase of pathogenic species (Spratt and Pratten 2003), contributing to the emergence of biofilm-related oral diseases such as dental caries. Yee and Sheiam (2002) reported that in third world countries, dental caries is the fourth most expensive disease to treat. Also, this oral disease affects approximately 80-90 % of developing countries (Petersen 2004). Streptococcus mutans are Gram-positive bacteria regarded as the major causative agent of dental caries (Loesche 1986; Marsh 1999; Krzysciak et al. 2014), freely identified in saliva or located on teeth, mucosal surfaces and tongue dorsum (Liljemark and Gibbons, 1972). Their resistance to acidic environments and ability to produce an extracellular polysaccharide matrix are characteristics that confer a high degree of virulence to these bacteria (Loesche 1986; Krzysciak et al. 2014). In addition, some studies show that S. mutans is able to interact with other species in oral polymicrobial biofilms, such as Candida albicans, further increasing its virulence (Raja et al. 2010; Metwalli et al. 2013; Falsetta et al. 2014). Microbial biofilms, including those formed by S. mutans, have already developed resistance to some of the http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1013905214000406#b0185 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1013905214000406#b0185 Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms - 34 - _______________________________________________ Laís Salomão Arias conventional forms of treatment (Feverstein 2012; Taff et al. 2013; Jalal et al. 2015; Kouidhi et al. 2015), thereby contributing to disease chronicity. To overcome the resistance problem, new strategies have been studied in order to control pathogenic biofilms. An alternative therapy involves the use of quorum sensing (QS) molecules (Weber et al. 2010). These molecules are secreted by the microbial cells in response to cell density within the biofilms, generating a cell-cell communication circuit that modifies the expression of target genes, resulting in the regulation of several intra- and inter-species physiological activities (biofilm formation, virulence, etc.) (Miller and Bassler 2001; Alem et al. 2006; Martins et al. 2007; De Sordi and Mühlschlegel 2009; Weber et al. 2010; Gori et al. 2011; Jeon et al. 2011). Farnesol and tyrosol are the main QS molecules isolated from C. albicans. Farnesol is an aliphatic alcohol with antibiofilm activity against various species of fungi and bacteria (Ramage et al. 2002; Koo et al. 2003; Jeon et al. 2011). In C. albicans, this molecule inhibits the yeast-to-hyphae switch (Ramage et al. 2002; Weber et al. 2010). In contrast, tyrosol is an aromatic alcohol which induces the yeast-to-hyphae transformation (Chen et al. 2004; Chen and Fink 2006; Alem et al. 2006), but its effect on biofilms has been less studied. Shanmughapriya et al. (2014) found a synergistic antibiofilm effect of tyrosol in combination with amphotericin B against C. krusei and C. tropicalis isolated from intrauterine device users. Furthermore, it was recently demonstrated that high concentrations of tyrosol alone or combined with amphotericin B, itraconazole and fluconazole reduced biofilms formed by several strains of C. albicans and C. tropicalis (Cordeiro et al. 2015). Although there are some reports regarding tyrosol activity on Candida biofilms, its effect on S. mutans biofilms remains unknown. Therefore, the objective of this study Effect of tyrosol on Streptococcus mutans biofilms - 35 - _______________________________________________ was to evaluate the effect of tyrosol at different concentrations on the acid production and biofilm formation by S. mutans, as well as to quantify pre-formed biofilms of this species developed on hydroxyapatite surfaces and treated with tyrosol. The tested hypothesis was that tyrosol has an inhibitory effect on S. mutans biofilms. Laís Salomão Arias References Alem, M.A.S., Oteef, M.D.Y., Flowers, T.H. and Douglas, L.J. (2006) Production of tyrosol by Candida albicans biofilms and its role in quorum sensing and biofilm development. Eukariot Cell 5, 1770-1779. Anter, J., Tasset, I., Demyda-Peyrás, S., Ranchal, I., Moreno-Millán, M., Romero-Jimenez, M., Muntané, J., Luque de Castro, M.D. et al. 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