LIGIA KERCHE VASCONCELLOS “Ação de nanopartículas de prata sobre Candida albicans e Candida glabrata – análise da mínima concentração inibitória” Araçatuba-SP 2012 LIGIA KERCHE VASCONCELLOS “Ação de nanopartículas de prata sobre Candida albicans e Candida glabrata – análise da mínima concentração inibitória” Trabalho de Conclusão do Curso como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharelado em Odontologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”. Orientadora: Profa. Dra. Debora Barros Barbosa Araçatuba – SP 2012 Dedicatória A Deus pela constante companhia, compreensão e força em todos os momentos mais difíceis, e por sempre guiar meus passos para superar cada obstáculo. Aos meus pais por sempre me apoiarem em tudo, pelo grande incentivo e confiança constante. Aos meus irmãos Caroline e Matheus por serem sempre meus melhores amigos e companheiros. Agradecimentos A todos os professores desta Universidade, em especial à Profa. Dra. Debora Barros Barbosa pela orientação e pelos conhecimentos transmitidos com tanto profissionalismo. Aos meus queridos amigos Aline e Douglas pela paciência, ajuda, tempo e dedicação durante todo o desenvolvimento deste trabalho. E também pelos momentos divertidos que passamos no laboratório. Às amizades que cultivei neste período universitário, pelo apoio e carinho imensos. À Unesp pela grande oportunidade de ampliar os meus conhecimentos e me formar uma Cirurgiã – dentista. “As melhores e mais lindas coisas do mundo não se pode ver nem tocar. Elas devem ser sentidas com o coração.” Charles Chaplin VASCONCELLOS LK. Ação de nanopartículas de prata sobre Candida albicans e Candida glabrata – análise da mínima concentração inibitória 2012 59 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2012 Resumo A prata (Ag) é um metal conhecido por seu largo espectro de ação contra bactérias Gram positivas e negativas, fungos, protozoários e alguns tipos de vírus. A atividade antimicrobiana de nanopartículas de Ag pode apresentar-se mais efetiva por serem partículas extremamente pequenas e com maior razão de área de superfície por volume. A adição dessas nanopartículas a polímeros odontológicos poderia beneficiar usuários de próteses com base em resina acrílica ao prevenir patologias como estomatite protética. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a mínima concentração inibitória (MCI) de diferentes tipos de nanopartículas de Ag sobre os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata. As nanopartículas de Ag foram preparadas na forma coloidal por meio da redução do nitrato de Ag pelo citrato de sódio. Os fatores de variação foram o tamanho médio das nanopartículas (5, 10 e 60 nm), a concentração de Ag na solução coloidal (107,9 µl/mL; 2 x 107,9 µl/mL e 5 x 107,9 µl/mL) e o tipo de nanopartículas de Ag (coloidal estabilizada com amônia e funcionalizada com poli vinil pirrolidona - PVP). Foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente, Nistatina e água deionizada estéril. A MCI foi avaliada por meio das técnicas do halo de inibição com filtro de papel absorvente e do “pour plate”. O efeito fungicida ou fungiostático das nanopartículas que formaram halos de inibição foi avaliado após coletar-se material deste halo e semeá-lo em placas com meio de cultura ágar Sabouraud dextrose. Os resultados obtidos com as duas técnicas mostraram que as nanopartículas de Ag nas formas estabilizada e funcionalizada, nos tamanhos 5, 10 e 60 nm e nas três diferentes concentrações inibiram os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata de maneira semelhante. Podendo futuramente ser adicionadas a polímeros para base protética e auxiliar no controle de patologias como a estomatite protética. Palavras-chave: Nanotecnologia. Prata. Candida. Estomatite protética. Prevenção VASCONCELLOS LK. Effect of silver nanoparticles on Candida albicans and Candida glabrata – Analysis of the minimum inhibitory concentration 2012 59 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2012 Abstract Silver is a metal known for its broad-spectrum antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa and certain viruses, including antibiotic-resistant strains. Antimicrobial activity of Ag nanoparticles can be presented more effective because they are extremely small particles and exhibit a larger surface-to-volume ratio. The incorporation of these nanoparticles to dental polymers could benefit denture wearers by preventing pathologies such as denture stomatitis. The aim of this study was to evaluate the minimum inhibitory concentration (MIC) of different types of silver nanoparticles on Candida albicans and Candida glabrata biofilms. Silver nanoparticles were synthesized through the reduction of silver ions of silver nitrate by sodium citrate. The variation factors were size of silver nanoparticles (5, 10 e 60 nm), concentration of silver in the colloidal solution (107,9 µl/mL; 2 x 107,9 µl/mL e 5 x 107,9 µl/mL) and type of silver nanoparticles (colloidal ammonia stabilized and polyvinylpyrrolidone (PVP) coated). Sterile deionized water and nistatina were used as positive and negative control, respectively. MIC was evaluated through inhibition zone with filter paper and pour plate techniques. Fungicide or fungiostatic effects of silver nanoparticles were analyzed though sowing material collected from the inhibition zone. Results obtained from both techniques showed that silver nanoparticles ammonia stabilized and PVP coated, with 5, 10 and 60 nm and in three different concentrations inhibited Candida glabrata and Candida albicans similarly, suggesting that silver nanoparticles may eventually be added to denture base polymers and assist in controlling diseases such as denture stomatitis. Keywords: Nanotechnology. Silver. Candida. Denture stomatitis. Prevention Lista de Figuras Figura 1 Ilustração esquemática da síntese de nanopartículas de prata na forma coloidal por meio da redução dos íons prata do nitrato de prata pelo citrato de sódio. 41 Figura 2 Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu Multspec 1501 utilizado durante a síntese para acompanhar a formação das nanopartículas de prata 42 Figura 3 Difratômetro de raios-X, Rigaku DMax-2000PC, com anodo rotatório e radiação CuKα (λ = 1,5418 Å), utilizado para confirmar a presença de prata na solução coloidal. 42 Figura 4 a) Meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose (ASD), Difco; b) meio de cultura Caldo Sabouraud com Dextrose (CSD), Difco. 43 Figura 5 Espectrofotômetro UV/VIS 1800, utilizado para ajustar e padronizar a concentração de microorganismos nas suspensões para inoculação de meio de cultura. 43 Figura 6 Contador eletrônico de colônias CP 600 Plus, Phoenix, utilizado para a contagem de colônias. 44 Figura 7 Meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose (Difco) sendo vertido em placas de Petri. 44 Figura 8 Cem microlitros do inoculo de microorganismos com concentração ajustada em 1 x 106 UFC/mL sendo adicionados sobre Agar Sabouraud Dextrose. 45 Figura 9 Inóculo de microorganismos sendo semeado em Agar Sabouraud Dextrose. 45 Figura 10 a) disco de papel filtro sendo posicionado sobre ágar sabouraud dextrose inoculado; b) cinco microlitros de solução de nanopartículas de prata sendo depositado no disco de papel filtro. 46 Figura 11 a) nanopartículas de prata funcionalizadas; b) nanopartículas de prata coloidais. 46 Figura 12 Gráfico de absorbância versus comprimento de onda do colóide obtido a partir da reação de redução da Ag pelo citrato de sódio na temperatura de 97ºC. O gráfico mostra a banda plasmon de absorção característica de nanopartículas de Ag. 47 Figura 13 MEV das nanopartículas de prata sintetizadas via redução dos íons prata do nitrato de Ag pelo citrato. O substrato de silício foi degradado por KOH por 2 horas e a Ag coloidal foi depositada sobre o substrato e secada para se obter a imagem. Essa técnica ilustra claramente a forma e o tamanho das nanopartículas de Ag. a) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 5 nm. Aumento: 90,75 Kx; b) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 10 nm. Aumento: 90,75 Kx. c) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 60 nm. Aumento: 90,75 Kx. 48 Figura 14 MET das nanopartículas de prata, onde se adicionou uma gota de colóide sobre grades de cobre recobertas com filme fino de carbono. a) os pontos escuros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 5 nm. Aumento: 64,84Kx; b) os pontos escuros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 10 nm. Aumento: 64,84Kx. c) os pontos claros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 60 nm. Aumento: 64,84Kx. 49 Figura 15 Difratograma de raios-X das nanopartículas de prata em substrato de silício com seus planos de reflexão indexados. 50 Figura 16 Microorganismo Candida albicans a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm na concentração 1x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm na concentração 1x, funcionalizada e pela ação da nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, na concentração 1x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentração de 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo); c) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata com tamanho de 60 nm na concentração 1x, coloidal, pela ação de nanopartículas de prata funcionalizadas com tamanhos 5, 10 e 60 nm na concentração 2x e pela nistatina (controle positivo); d) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5, 10 e 60 nm na forma coloidal e concentração de 5x pela ação de nanopartículas de prata de tamanho 5 nm na concentração 5x funcionalizada e ausência de formação de halo pela água deionizada estéril (controle negativo); e) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm na concentração de 5x funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10nm na concentração 1x na forma coloidal e pela nistatina (controle positivo). 51 Figura 17 Microorganismo Candida glabrata a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm na concentração 1x na forma coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm na concentração 1x, funcionalizada e pela ação da nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, na concentração 1x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentração de 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo); c) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata com tamanho de 60 nm na concentração 1x na forma coloidal, pela ação de nanopartículas de prata funcionalizadas com tamanhos 5, 10 e 60 nm na concentração 2x e pela nistatina (controle positivo); d) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5, 10 e 60 nm na forma coloidal e concentração de 5x pela ação de nanopartículas de prata de tamanho 5 nm na concentração 5x funcionalizada e ausência de formação de halo pela água deionizada estéril (controle negativo); e) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm na concentração de 5x funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10nm na concentração 1x na forma coloidal e pela nistatina (controle positivo). 52 Figura 18 Microorganismo Candida albicans a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm nas concentrações 1x, 2x e 5 x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada e ausência de halo de inibição para água deionizada estéril (controle negativo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentrações de 1x, 2x e 5x na forma coloidal, e pela nistatina (controle positivo). 53 Figura 19 Microorganismo Candida glabrata a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm nas concentrações 1x, 2x e 5 x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada e pela nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 com concentrações de 1x e 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo). 54 Figura 20 Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida albicans. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 55 Figura 21 Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida glabrata. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 56 Figura 22 Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida albicans. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 57 Figura 23 Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida glabrata. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 58 Lista de Tabelas Tabela 1 Diferentes tipos de nanopartículas de prata analisadas no estudo de acordo com o tamanho e concentração. 59 Lista de Abreviaturas Ag = Prata MCI = Mínima concentração inibitória Nm = Nanômetro µL/ml = Microlitro por mililitro mg/L = Miligrama por litro PVP = Poli vinil pirrolidona PMMA = Poli ( metil metacrilato) SZ = Prata zeolite Ag+ = Íons prata C6H8O6 = Ácido ascórbico C6H6O6 = Ácido dehidroascórbico H+ = Cátions Hidrogênio µµµµg = Micrograma Ag/cm2 = Prata por centímetro cúbico LB = Luria- Bertani CFU = Unidades formadoras de colônia PPM = Partes por milhão M = Mol KNO³ = Nitrato de Potássio Au/Ag = Ouro/Prata PMMA/Au-Ag =Poli (metil metacrilato) UV/Vis = Ultravioleta visível EDX = Energia dispersiva de raios-x AgNO3 = Nitrato de Prata Na3C6H5O7 = Citrato de sódio ml = Mililitro Mol.L-1 = Mol por litro ºC = Grau Celsius pH = Potencial hidrogeniônico CuKα = Radiação Kα do cobre λ = Comprimento de onda Å = Ângstron Θ = Ângulo teta KV = Quilovolts mA = Miliampère Mm = Milímetros MEV = Microscopia eletrônica de varredura MET = Microscopia eletrônica de transmissão ATCC = American Type Culture Collection % = Porcentagem UFC/mL = Unidades formadoras de colônia por mililitro µL = Microlitro NaCl = Cloreto de sódio UI/mL = Unidade Internacional por mililitro KOH = Hidróxido de potássio Sumário 1 - Introdução .................................................................................................. 19 2 - Revisão de Literatura ................................................................................. 21 3 - Materiais e Métodos .................................................................................. 26 3.1. Síntese e caracterização do colóide de nanopartículas de prata ......... 26 3.2 - Avaliação da MCI das diferentes nanopartículas de prata sobre os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata ........................................ 27 3.2.1. Cepas de microorganismos e condições de crescimento .............. 27 3.2.2. Confecção da curva padrão do número de UFC/mL de acordo com a densidade óptica em espectrofotômetro para Candida albicans e Candida glabrata ............................................................................................................... 27 3.2.3. Determinação da mínima concentração inibitória (MCI) ................. 28 3.2.4 Técnica do disco de papel absorvente ............................................ 29 3.2.5 Técnica baseada no “pour plate” ..................................................... 29 4. Resultados .................................................................................................. 31 4.1. Síntese e caracterização do colóide de nanopartículas de prata ......... 31 4.2. Determinação da mínima concentração inibitória (MCI) – Técnica do disco de papel absorvente e “Pour Plate” .............................................................. 31 5 - Discussão .................................................................................................. 33 6 - Conclusão .................................................................................................. 36 Referências ..................................................................................................... 37 Figuras ............................................................................................................ 41 Tabela ............................................................................................................. 59 19 1 - Introdução A nanotecnologia tem sido responsável atualmente por começar a transformação tecnológica deste século, já que nanomateriais estão sendo utilizados em computadores, cosméticos, tintas, equipamentos esportivos e testes de diagnósticos médicos27. Nanopartículas inorgânicas, de natureza simples ou composta, exibem propriedades físicas e químicas únicas e representam um aumento no desenvolvimento de novos nanoartifícios que podem ser usados em numerosas aplicações físicas, biológicas, biomédicas e farmacêuticas4. Como a resistência bacteriana aos antibióticos tem aumentado nos últimos anos devido ao desenvolvimento de cepas resistentes, estudos prévios têm apresentado formulações antimicrobianas na forma de nanopartículas que podem ser usadas como efetivos materiais bactericidas7,11. Desde que Klabunde et al.3 em 2002 provaram que nanopartículas de óxidos de metais altamente reativos exibem excelente ação biocida contra bactérias Gram positivas e negativas, é de grande interesse investigar o uso de outras nanopartículas inorgânicas como materiais antimicrobianos. Recentemente foi mostrado que nanopartículas de prata podem ser preparadas com custo baixo e efetivo e testadas como novo tipo de nanomaterial bactericida28. Nanopartículas apresentam além do menor tamanho das partículas, uma maior razão da área de superfície por volume e maior área disponível para oxidação9, e este imenso aumento produz uma área necessária para permitir a contínua liberação de íons prata9. Existem relatos na literatura mostrando que a atração eletrostática entre a carga negativa da célula bacteriana e a carga positiva das nanopartículas de prata é crucial para a atividade das nanopartículas como materiais bactericidas10,30. Deve ser destacado também que os fabricantes de materiais poliméricos estão trabalhando para estender a efetividade da prata através da adição de prata misturada com os polímeros, que têm sido designados por liberarem íons prata quando molhados por corpos fluidos31. Acrílicos à base de poli (metil metacrilato) (PMMA) e materiais condicionadores de tecidos utilizados em próteses totais e parciais removíveis 20 podem ser colonizados e infectados por Candida e outros microorganismos, resultando em estomatite protética23. Em pacientes idosos que têm sua atividade imunológica reduzida, tais complicações, incluindo problemas do trato respiratório, são inevitáveis quando microorganismos acumulam-se sobre esses materiais1. Conseqüentemente, a manutenção dos acrílicos e condicionadores de tecidos e a prevenção do acúmulo de microorganismos sobre tais materiais são de grande importância1. 21 2 - Revisão de Literatura A prata apresenta uma forte afinidade ao zeolite, que é um material cristalino poroso de aluminosilicato de sódio hidratado e pode ser ligado eletrostaticamente a este íon em mais de 40% na sua estrutura. Na área da Odontologia, a prata-zeolite (SZ) tem sido incorporada aos condicionadores de tecido e enxaguatórios bucais1,19,21,23. Matsuura et al.19 em 1997 avaliaram in vitro o efeito antimicrobiano prolongado dos condicionadores de tecidos contendo SZ. Acondicionados em saliva, esses condicionadores apresentaram efeito antimicrobiano por quatro semanas sobre Candida albicans e bactérias que causam infecções respiratórias hospitalares. Em 1998, Morishita et al.21 analisando o efeito de dois enxaguatórios bucais contendo SZ sob a formação de placa bacteriana, encontraram redução no nível de placa após o uso dos enxaguatórios com SZ por cinco dias em 10 dos 11 pacientes testados. Como a saliva humana contém diversos tipos de cátions, íons prata podem ser liberados a partir da SZ na cavidade oral. Por não dissolver na água, a SZ pode ser depositada na cavidade oral depois do uso do enxaguante. Assim, a SZ remanescente pode exibir ação inibitória na formação de placa através da liberação gradual de íons prata. Kawahara et al.13 em 2000, mostraram que a SZ sob condições anaeróbicas inibiu o crescimento de diversas bactérias patogênicas, entre elas P. gingivalis, P. intermédia e A. actinomycetemcomitans. Visto que muitos patógenos residem em áreas anaeróbicas, esses resultados sugerem que a SZ pode ser benéfica para uso em Odontologia. Esses autores também explicaram que a prata é liberada a partir da SZ através de troca iônica com outros cátions e a quantia de prata é dependente da concentração de cátions na solução. O presente estudo também demonstrou que em água não ocorreu a liberação de quantias detectáveis de prata. Assim, a SZ exibiria atividade antibacteriana a longo prazo em soluções com baixa força iônica. No ano de 2003, Sondi et al.28 prepararam dispersões estáveis de nanopartículas de prata através da redução química de soluções de nitrato de prata 22 com ácido ascórbico na presença de Daxad 19 como agente estabilizante. O ácido ascórbico foi selecionado como agente redutor devido a sua habilidade para precipitar prata metálica em soluções ácidas de acordo com a reação: 2Ag+ + C6H8O6 ↔ 2Ag0 + C6H6O6 + 2H+. Os autores destacaram que um importante aspecto neste processo é o aumento da acidez da mistura de reação durante a redução, devido à liberação de prótons. Baker et al.2 em 2005 sintetizaram nanopartículas de prata através das técnicas de condensação de gás inerte e da co-condensação. A média de tamanho das nanopartículas produzidas foi de 75 nanômetros (nm) e 15 nm, respectivamente. Ambas as técnicas são baseadas na evaporação de um metal no interior de uma atmosfera inerte com o subseqüente resfriamento para a nucleação e o crescimento das nanopartículas. Esses autores também investigaram a eficiência antibacteriana das nanopartículas de prata em solução e sobre placas de petri, através da introdução das partículas no interior de um meio de cultura contendo Escherichia coli. Encontraram que as menores partículas com uma grande razão de superfície por volume proveram as mais eficientes medidas de atividade antibacteriana e que superfícies completamente antibacterianas para Escherichia. coli podem ser obtidas em concentrações tão baixas quanto 8 µg de Ag/cm2. Sondi e Salopek-Sondi29 em 2004 avaliaram a aplicação de nanopartículas de prata como agente antimicrobiano através do crescimento de Escherichia. coli sobre placas de ágar e em um meio líquido Luria-Bertani (LB), ambos suplementados com nanopartículas de prata. Quando as nanopartículas estavam presentes nas placas de ágar LB, elas inibiram completamente o crescimento bacteriano. Entretanto, a inibição dependeu da concentração de nanopartículas bem como do CFU (unidades formadoras de colônias) de bactérias usadas nos experimentos. Em contraste, as nanopartículas de prata em meio líquido, nas mesmas concentrações, causaram somente atraso no crescimento de Escherichia coli. Nesse caso, a concentração de nanopartículas diminuiu gradualmente, permitindo o crescimento de células bacterianas. Este processo égovernado através da interação dessas partículas com substâncias intracelulares das células destruídas, causando sua coagulação e remoção do sistema líquido. Sendo assim, 23 segundo os autores, essas partículas podem ter seu poder biocida reduzido em sistemas líquidos devido a sua baixa estabilidade coloidal. A utilização da prata metálica como cobertura de catéteres e pinos ortopédicos é observada na literatura. Em 2006, Hetrick e Schoenfisch12 realizaram uma revisão da literatura sobre a liberação de antibióticos, íons prata e óxido nítrico a partir de revestimentos antimicrobianos. Os catéteres revestidos com prata mostraram uma redução significativa quando utilizados in vitro. Contudo, estudos in vivo com pinos fixados revestidos com prata falharam por demonstrarem diminuição da adesão bacteriana. Os revestimentos com prata aplicados em modelos de implantes ortopédicos também não reduziram a adesão de S. epidermidis e S. aureus. De acordo com os autores, uma explicação para a baixa eficácia antibacteriana de coberturas com prata seria a não liberação ativa de íons prata. Relataram que as propriedades antibacterianas da prata relacionam-se com sua forma oxidada, forma esta que não está necessariamente presente na superfície de revestimentos com prata metálica. Entretanto, observaram que polímeros que liberam prata ativamente no estado oxidado têm exibido forte atividade antibacteriana. Tais coberturas agiriam como reservatórios de prata e seriam capazes de manter a liberação de níveis antibacterianos de íons prata por períodos extensos (maiores que 3 meses). Também encontraram na literatura que a adição de platina aumentava a formação e liberação de íons prata em revestimentos de poliuretano e reduzia a adesão de S. epidermidis quase duas vezes mais quando comparada com coberturas de prata sem platina. Furno et al.8 em 2004 usaram uma solução de precursores organometálicos dissolvidos em dióxido de carbono supercrítico para o enchimento e penetração de nanopartículas de prata em um polímero utilizado para implantes médicos. A formação de nanopartículas de prata na matriz de silicone foi confirmada através de uma análise detalhada na microscopia eletrônica de transmissão. Os autores testaram duas séries de polímeros. Na primeira, os discos poliméricos eram lavados em água deionizada e, na segunda, não. Em cada série, metade dos discos poliméricos era coberto com uma proteína plasmática. Encontraram que poucos íons prata foram liberados nas amostras com água (<0,5 ppm). Uma maior quantidade de íons prata foi liberada no interior das amostras com a proteína 24 plasmática (4 ppm) durante os primeiros 3 dias. Uma quantia significante de íons prata ainda foi liberada no interior do plasma nos dias 4 e 5. Os autores destacaram que a contínua liberação desses íons em concentrações antimicrobianas na presença de um filme condicionador e a habilidade para proteger as supefícies externa e interna dos catéteres contra a colonização bacteriana poderia ser esperada a partir do uso deste novo método para impregnar biomateriais poliméricos com prata. Kumar e Munstedt16 em 2005 verificaram a capacidade de liberação de níveis ajustáveis de íons prata a partir de polímeros poliamida utilizados em implantes médicos. Matrizes higroscópicas de poliamida foram escolhidas porque a ionização e a liberação da prata são fortemente dependentes da incorporação em água. Pó de prata foi incorporado no interior da matriz em diferentes porcentagens de peso através de um processo de derretimento da mistura. Após solidificação sob resfriamento, os íons prata liberados foram medidos em 0,1 M KNO3 por meio de um voltímetro anódico. A incorporação de água pela matriz poliamida ocorreu rapidamente nos primeiros 3 dias de imersão. Como um resultado direto, íons prata foram liberados inicialmente em maior quantidade no mesmo período, seguida de uma liberação muito mais lenta nos dias 5 e 6. Uma interessante característica exibida por esses revestimentos foi que, após 6 dias, a liberação de íons prata aumentou para níveis iguais ou maiores que os da liberação inicial. Os revestimentos continuaram a liberar níveis significantes de íons prata após um período de 3 meses16. A longevidade da liberação foi atribuída à interrupção da ligação de hidrogênio intermolecular dentro da matriz de poliamida após prolongada absorção de água (>3 dias), resultando no aumento da mobilidade dos íons através da matriz plasticizada15. O perfil trifásico de liberação de íons prata foi único e distinto em relação aos perfis exibidos por outras coberturas antimicrobianas. Os autores destacam ainda que o aumento da liberação de íons prata por longa duração (>6 dias) pode permitir o aumento da biocompatibilidade dos implantes cobertos com tais polímeros15. O fluxo de íons prata a partir do polímero poliamida mostrou ser altamente ajustável baseado na cristalinidade do polímero15 e na inclusão de vários enchimentos16. Reduzindo a cristalinidade da matriz, Kumar e Monstedt16 25 encontraram um aumento nos níveis de liberação de íons prata. Em outro trabalho, Kumar et al.15 verificaram que enchimentos higroscópicos resultaram em maiores níveis iniciais de liberação de íons prata. Entretanto, a liberação desses íons em coberturas com enchimentos modificados reduziu substancialmente a partir de 3 meses. Contrariamente, ocorreu um aumento na liberação de íons prata no mesmo período em polímeros sem enchimentos. Por sua vez, Sambhy et al.26 em 2006 sintetizaram um material constituído por um polímero catiônico e nanopartículas de brometo de prata. Esse composto manteve a liberação de íons prata biocidas em meio aquoso Luria-Bertani. Para esses autores, a proporção de liberação de íons prata pode estar relacionada com a variação do tamanho das nanopartículas embebidas no polímero. Além disso, o composto manteve sua atividade antibacteriana após exposição em fluidos mamários e também inibiu a formação de biofilme. Os autores destacam ainda que o composto pode ser utilizado como cobertura antimicrobiana para uma variedade de aplicações de uso geral e biomédico. Recentemente, Chatterjee e Jewrajka5 em 2007 desenvolveram um protocolo para síntese de alta concentração de nanopartículas de liga Au-Ag em uma matriz polimérica, prepararam filmes de PMMA/Au-Ag e realizaram sua caracterização. A formação dessa liga de nanopartículas foi avaliada utilizando-se a espectroscopia de UV-visível e a análise pela Energia Dispersiva de Raios-X (EDX). Observaram uma boa dispersibilidade das nanopartículas Au-Ag no interior do co-polímero produzido (Au-Ag(PDMA-b-PMMA-b-PDMA)/PMMA), em função da compatibilidade dessas nanopartículas com a matriz homopolimérica de PMMA. Concluíram que é possível preparar séries de filmes híbridos orgânicos-inorgânicos transparentes a partir desses co-polímeros contendo nanopartículas de Au-Ag. Verifica-se que a avaliação da estabilidade destas nanopartículas no interior do PMMA utilizado como resina acrílica para base protética seria bastante oportuna para o momento atual. Esses testes permitiriam estudos subseqüentes relacionados à eficácia antimicrobiana do composto PMMA/Ag, que agiria na prevenção e no controle de infecções induzidas por bases protéticas confeccionadas em PMMA. 26 3 - Materiais e Métodos 3.1. Síntese e caracterização do colóide de nanopartículas de prata O método de síntese empregado foi baseado no proposto por Turkevich et al.31 Nanopartículas de prata coloidal e funcionalizada foram sintetizadas através da redução de íons prata (Ag+) do AgNO3 (nitrato de prata) (Merck KGaA, Darmstadt, Hesse, Alemanha) pelo Na3C6H5O7 (citrato de sódio) (Merck KGaA, Darmstadt, Hesse, Alemanha) com relações estequiométricas de 1:3, respectivamente. Em um balão de fundo redondo, 100 mL de solução de AgNO3 (1,0 x 10-3 mol.L-1) foram aquecidos até a temperatura de 97ºC e em seguida adicionou-se 20 mL de solução de citrato de sódio (1,5 x 10-2 mol.L-1) com pH entre 8,0 e 8,5. A mistura foi mantida sob agitação magnética e aquecimento a 97ºC por cerca de 10 minutos, até o aparecimento da coloração amarelo âmbar, que evidencia qualitativamente a formação de nanopartículas de prata (Figura 1). Durante o processo de síntese, a formação das nanopartículas foi acompanhada por espectroscopia de absorção na região do Ultravioleta/Visível (UV/Vis) (Espectrofotômetro Shimadzu MultSpec-1501, Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão) (Figura 2), para isto foi montado um sistema composto por uma bomba peristáltica e uma cubeta de análise adaptada de forma a proporcionar a análise on-line da reação de formação das nanopartículas pela banda plasmon, na região de 190 a 800nm. As nanopartículas de prata também foram caracterizadas qualitativamente por difração de raios-X (Difratômetro Rigaku DMax-2000PC, Rigaku Corporation, Tóquio, Japão) com anodo rotatório e radiação CuKα (λ = 1,5418 Å) para que se conhecesse a estrutura cristalina das mesmas. O difratômetro de raios-X (Figura 3) operou na faixa 2θ de 20 a 110 graus, 27 voltagem de 40 KV, corrente de 40 mA, fenda divergente de 1,0 mm, fenda de coleta de 0,2 mm e acumulação para leitura a cada 0,02 segundo. A amostra foi preparada gotejando o colóide sobre um substrato de silício e aguardando-se a secagem do mesmo na temperatura ambiente. A forma e a distribuição do tamanho das partículas (5, 10 e 60 nm) foram confirmadas a partir de imagens de MEV e de MET (microscópio eletrônico FEG-VP Supra 35, Carl Zeiss, Jena, Turíngia, Alemanha). 3.2 - Avaliação da MCI das diferentes nanopartículas de prata sobre os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata 3.2.1. Cepas de microorganismos e condições de crescimento Os microrganismos utilizados foram: Candida albicans (ATCC 18804) e Candida glabrata (ATCC 90030). As culturas dos microrganismos foram mantidas a –80°C em glicerina, semeadas em Ágar Sabouraud Dextrose (Agar Sabouraud Dextrose, Becton Dickinson France SAS, Le Pont de Claix, France) (Figura 4) e cultivadas por 24 horas. Em seguida, foi preparada uma suspensão de microorganismos em solução fisiológica (NaCl 0,9%) contendo 106 UFC/mL com auxílio de espectrofotômetro (Espectrofotômetro UV – 1800, Shimadzu Corporation, Nakagyo-Ku, Kyoto, Japão) (Figura 5) utilizando padrões pré-estabelecidos (item 2.2.2). Um inóculo foi preparado adicionando-se 200 µL dessa suspensão em 10 mL de Caldo Sabouraud Dextrose (Caldo Sabouraud Dextrose, Becton Dickinson France SAS, Le Pont de Claix, France) (Figura 4). 3.2.2. Confecção da curva padrão do número de UFC/mL de acordo com a densidade óptica em espectrofotômetro para Candida albicans e Candida glabrata Para a padronização da concentração de células (UFC / mL) nas suspensões de Candida albicans e Candida glabrata utilizadas no presente estudo, 28 foram confeccionadas duas curvas padrão em espectrofotômetro (Espectrofotômetro UV – 1800, Shimadzu Corporation, Nakagyo-Ku, Kyoto, Japão). Para isto foram obtidas suspensões das duas espécies de microorganismos em solução fisiológica (NaCl 0,9%) com concentrações variadas e aleatórias que tiveram suas densidades ópticas medidas em comprimento de onda visível de 530 nm, com auxílio de um espectrofotômetro UV/Vis (Figura 5). Os microrganismos utilizados para a obtenção das suspensões apresentavam crescimento em Agar Sabouraud Dextrose por 24 horas a 37ºC em condições de aerobiose. Após a leitura das densidades ópticas, foram obtidas diluições seriadas de cada suspensão até a diluição 10-4. Cem microlitros de cada diluição foram plaqueados em triplicata em Agar Sabourraud Dextrose e após 48 horas de incubação a 37ºC, em aerobiose, o número de colônias formadas para a diluição 10-4 foi contado para cada concentração de células nas suspensões (para cada valor de absorbância obtido), utilizando contador eletrônico de colônias (Contador de colônias eletrônico CP 600 Plus, Phoenix Indústria e Comércio de Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, São Paulo, Brasil) (Figura 6). Multiplicou-se a média aritmética da triplicata pelo respectivo fator de diluição (104) e depois multiplicou-se este valor por 10, que correspondia ao volume da suspensão que foi plaqueado. Os resultados foram expressos em UFC/mL. Com isso pôde-se padronizar a concentração de células utilizadas no presente estudo através da leitura da densidade óptica em espectrofotômetro de luz visível com comprimento de onda de 530 nm. 3.2.3. Determinação da mínima concentração inibitória (MCI) Foi considerada a mínima concentração inibitória a suspensão de nanopartículas de prata capaz de inibir o crescimento fúngico. Para sua determinação, foram utilizados os métodos do disco de papel absorvente e do “Pour Plate”, ambos em meio Agar Sabouraud Dextrose. 29 3.2.4 Técnica do disco de papel absorvente Foi preparado meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose e o mesmo foi vertido em placas de Petri (Figura 7), totalizando 20 mL de meio por placa. Após o teste de esterilidade, ou seja, incubação das placas com o meio à 37ºC por 24 horas em condições de aerobiose, 100 µL das suspensões dos microorganismos Candida albicans e Candida glabrata preparadas em solução fisiológica (NaCl 0,9%) e ajustadas em espectrofotômetro foram semeadas sobre o Agar (Figuras 8 e 9). A concentração de microorganismos no inoculo foi de 1 x 106 UFC/mL tanto para a suspensão de Candida albicans como para a suspensão de Candida glabrata. A seguir, discos de papel absorvente estéreis, com diâmetro aproximado de 5 mm foram posicionados sobre o meio já inoculado (Fig. 10a). Cinco microlitros da solução de nanopartículas (Figura 11a e 11b) foram adicionadas ao disco de papel absorvente (Fig. 10b) e um período de 48 horas a 37ºC foi aguardo para permitir o crescimento do microorganismo sobre o meio Agar. O crescimento das leveduras foi avaliado visualmente após o término desse período. Para controle positivo utilizou-se Nistatina 100.000 UI/mL (SEM / AS, Hortolândia, São Paulo, Brasil) e para o negativo, água deionizada estéril. Todos os testes foram realizados em duplicata. A inibição do crescimento fúngico foi avaliada após 48h de incubação a 37ºC em condições de aerobiose através da formação de halos de inibição e posterior semeadura das regiões próximas aos halos em placas contendo meio Agar Sabouraud Dextrose. O efeito fungicida/fungiostático foi observado após 48h de incubação a 37º C por meio do crescimento ou não de colônias de Candida albicans e Candida glabrata. 3.2.5 Técnica baseada no “pour plate” Na técnica baseada no “pour plate”, 1 mL do inóculo preparado em solução fisiológica (NaCl 0,9%) e padronizado com auxílio de espectrofotômetro foi adicionado a placas de Petri e em seguida 20 mL do meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose foi vertido. A placa foi agitada homegeneamente em movimentos em “8” e após a geleificação do Agar, pocinhos foram confeccionados 30 com canudos estéreis de 5 mm de diâmetro. Cinquenta microlitros de cada solução coloidal de nanopartículas de prata e dos controles foram adicionados no interior desses poços. Para o controle positivo foi utilizado Nistatina 100.000 UI/mL e para o negativo água deionizada estéril. A inibição do crescimento fúngico foi avaliada após 48h de incubação através da formação de halo de inibição e posterior semeadura das regiões próximas aos halos/poços em placas contendo meio Agar Sabouraud Dextrose. O efeito fungicida/fungiostático foi observado após 48h de incubação por meio do crescimento ou não de colônias dos fungos Candida albicans e Candida glabrata. 31 4. Resultados 4.1. Síntese e caracterização do colóide de nanopartículas de prata Um indício da formação de nanopartículas de Ag foi a coloração amarelo âmbar observada na solução instantes após a etapa de adição do agente redutor. O espectro de absorção UV/Vis do colóide mostrou uma banda plasmon característica de nanopartículas de Ag, com máximo em aproximadamente 430 nm (Figura 12). As imagens de MEV (Figuras 13a, 13b, 13c) e de MET (Figura 14a, 14b, 14c) confirmaram a forma esférica das partículas e evidenciaram nanopartículas de Ag com diâmetros médios de 5, 10 e 60 nm em uma concentração de 107,9µg de Ag/mL na solução coloidal. A difração de raios-X também confirmou a presença de nanopartículas de Ag com estrutura cristalina cúbica (Joint Committee on Powder Diffraction Standards 04-0783). De acordo com a Figura 15, os picos de difração de raios-X de aproximadamente 38,5º, 44,5º, 64,8º e 78º podem ser atribuídos aos planos cristalográficos (111), (200), (220) e (311) da Ag, respectivamente. 4.2. Determinação da mínima concentração inibitória (MCI) – Técnica do disco de papel absorvente e “Pour Plate” Os resultados obtidos com ambas as técnicas (disco de papel absorvente e “Pour Plate”) mostraram que as nanopartículas de Ag nas formas coloidal e funcionalizada inibiram o crescimento dos microorganismos Candida albicans e Candida glabrata. Foi possível observar que não houve diferença no tamanho dos halos de inibição formados para os diferentes tamanhos, tipos (coloidal e funcionalizada) e concentrações de nanopartículas de prata avaliadas através das duas técnicas. Comparando-se as nanopartículas de prata nas formas coloidal e funcionalizada, nos diferentes tamanhos e concentrações, com os grupos controle 32 positivo e negativo, foi possível notar que a nistatina apresentou os maiores halos de inibição, enquanto para o grupo controle negativo não foi possível notar-se a presença de halos. As figuras 16 e 17 ilustram os halos de inibição obtidos para os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata, respectivamente, para a técnica do papel absorvente. As figuras 18 e 19 mostram os halos de inibição obtidos com a técnica do “pour plate” para Candida albicans e Candida glabrata, respectivamente. Ainda, para as soluções de nanopartículas de prata coloidais e funcionalizadas, independentemente da concentração e do tamanho das partículas, foi observado efeito fungiostático frente aos microorganismos Candida albicans e Candida glabrata, uma vez que a semeadura das regiões próximas aos halos formados em ambas as técnicas empregadas mostrou crescimento fúngico após 48 horas de incubação em condições de aerobiose (Figuras 20 e 21 - técnica do papel absorvente, figuras 22 e 23 - técnica do pour plate). 33 5 - Discussão O presente trabalho analisou o efeito antimicrobiano de diferentes nanopartículas de Ag para os microorganismos Candida albicans e Candida glabrata através da Mínima Concentração Inibitória (MCI), utilizando duas diferentes técnicas (técnica do disco de papel absorvente e do “pour plate”). Também foi avaliado o tipo de ação antimicrobiana, fungicida ou fungiostática para as concentrações de nanopartículas de Ag testadas. Os resultados mostraram em ambos os ensaios realizados que as nanopartículas de Ag tanto na forma coloidal como na forma funcionalizada, nos diferentes tamanhos (5, 10 e 60nm) e concentrações (1x, 2x e 5x 107,9ug/mL) possuem ação antimicrobiana para os fungos Candida albicans e Candida glabrata. Esses resultados estão de acordo com Kin et al.14 que avaliaram a ação de nanopartículas de Ag com forma esférica e tamanho médio de 3 nm e encontraram que as mesmas inibiram células de Candida albicans de forma semelhante à anfotericina B, e causaram menos lise de eritrócitos que a anfotericina B na mesma concentração. Segundo os autores, as nanopartículas de Ag agiram rompendo a membrana celular plasmática e inibindo processos normais da célula fúngica. O mecanismo de ação antimicrobiana da Ag, especificamente na forma de nanopartículas, ainda não é bem claro na literatura. Alguns trabalhos relataram que tanto íons Ag20,18,6 como nanopartículas de Ag20,24,25 agiriam comprometendo a integridade da membrana plasmática de células fúngicas14,20,24. Ainda, outros estudos sugerem que a Ag por apresentar um tamanho nanométrico, penetraria através da membrana celular do microorganismo e alteraria seu metabolismo celular, interagindo com componentes citoplasmáticos e ácidos nucléicos, inibindo enzimas da cadeia respiratória e alterando a permeabilidade da membrana plasmática, podendo levar a célula a morte14,20. Devido a esses mecanismos de ação da Ag, a probabilidade do desenvolvimento de resistência dos microorganismos pode ser considerada menor14,20,24. Em nosso estudo não foi observada diferença na atividade antifúngica para as diferentes concentrações de nanopartículas de Ag (1x, 2x e 5x 107,9 µg/mL) e 34 espécies de Candida avaliadas. Panacek et al.24 observaram que nanopartículas de Ag não estabilizadas inibiram o crescimento de Candida albicans em concentrações muito baixas (0,21 mg/L) e que a inibição foi dependente da concentração e do tipo de espécie fúngica avaliada. Com relação ao tipo de ação antimicrobiana das nanopartículas de Ag, o presente trabalho observou que para as três diferentes concentrações, o mecanismo de ação observado foi fungiostático frente aos dois microorganismos, tanto para as nanopartículas na forma coloidal como para as nanopartículas funcionalizadas. Panacek et al.24 em um estudo comparativo da ação fungicida/fungiostática de duas formas de prata (iônica e nanoparticulada) também observaram um maior efeito fungiostático para nanopartículas de Ag, sendo que a ação fungiostática para nanopartículas de Ag foi determinada a uma concentração 100 vezes menor que a sua concentração citotóxica para células eucarióticas. Os autores também observaram um maior efeito antifúngico para Ag iônica, devido provavelmente à maior toxicidade da Ag iônica quando comparada com a forma nanoparticulada para células eucarióticas . Trabalhos na literatura também relataram que o tamanho das nanopartículas de Ag interfere em sua ação antimicrobiana14,22. No presente estudo, não foi observada diferença na formação de halos de inibição para os diferentes tamanhos de nanopartículas de prata avaliados (5, 10 e 60nm). De acordo com Panacek et al.24 partículas menores possuem uma maior área de superfície disponível para interação podendo assim promover maiores efeitos antimicrobianos que partículas maiores. Morones et al.22 relataram que partículas de pequeno tamanho (aproximadamente 5 nm) apresentam ação de caráter eletrônico, devido a alterações na estrutura de superfície causadas pelo tamanho reduzido. Essas alterações estão relacionadas à reatividade das nanopartículas, uma vez que a força de ação das partículas sobre os microorganismos irá depender da área de superfície para interação. Uma maior superfície será capaz de interagir mais diretamente com os microorganismos, o que ocorre principalmente com partículas menores. De acordo com Lok et al.18 o efeito tamanho-dependente das nanopartículas de Ag também pode ser explicado pelas diferenças nos níveis de associação 35 nanopartículas – microorganismo. A esse respeito, estudos prévios mostraram que nanopartículas de Ag apresentam uma associação direta com o microorganismo preferencialmente quando possuem um diâmetro entre 1 e 10 nm. Um fator importante para a atividade antimicrobiana das nanopartículas de Ag está relacionado à agregação das partículas. É necessário que haja uma boa dispersão das nanopartículas para uma efetiva ação biocida, uma vez que a agregação poderia levar a uma diminuição da superfície de reatividade ou ainda diminuir a capacidade de interação com as células18. No presente estudo, os dois tipos de nanopartículas de Ag testadas, coloidal e funcionalizada, não mostraram diferença na ação antimicrobiana. Isso pode ser devido ao fato de ambos os tipos possuírem um agente estabilizador. As nanopartículas de Ag na forma coloidal utilizadas possuíam amônia em sua composição que visava a estabilização das partículas evitando sua agregação e a forma funcionalizada apresentava-se com polivinilpirrolidona (PVP) tem como objetivo além de evitar a agregação, também facilitar a sua incorporação em polímeros. Assim, a adição dessas nanopartículas a polímeros odontológicos futuramente poderia beneficiar usuários de próteses com base em resina acrílica ao controlar patologias como a estomatite protética, através principalmente do controle do desenvolvimento de biofilme sobre superfícies poliméricas. 36 6 - Conclusão O presente estudo mostrou que as nanopartículas de Ag nos tamanhos 5, 10 e 60 nm, na forma coloidal e na forma funcionalizada exibiram um potencial efeito antifungico para Candida albicans e Candida glabrata em diferentes concentrações. 37 Referências 1. Abe Y, Ueshige M, Takeuchi M, Ishii M, Akagawa Y. Cytotoxicity of antimicrobial tissue conditioners containing silver-zeolite. International J Prosthodontics. 2003; 16 (2): 141-44. 2. Baker C, Pradhan A, Pakstis L, Pochan DJ, Shah SI. Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles. J Nanosci Nanotech. 2005; 5 (2): 244-49. 3. Bosetti M, Massè A, Tobin E, Cannas M. 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Espectrofotômetro UV 1800, utilizado para ajustar a concentração de microrganismos nas suspensões para inoculação de meio de cultura. 44 Figura 6. Contador eletrônico de colônias eletrônico CP 600 Plus, Phoenix, utilizado para a contagem de colônias. Figura 7. Meio de cultura Agar Sabouraud Dextrose (Difco) sendo vertido em placas de Petri. 45 Figura 8. Cem microlitros do inoculo de microorganismos com concentração ajustada em 1 x 106 UFC/mL sendo adicionados sobre Agar Sabouraud Dextrose. Figura 9. Inóculo de microorganismos sendo semeado em Agar Sabouraud Dextrose. 46 Figura 10. a) disco de papel filtro sendo posicionado sobre ágar sabouraud dextrose inoculado; b) cinco microlitros de solução de nanopartículas de prata sendo depositado no disco de papel filtro. Figura 11. a) Nanopartículas de prata funcionalizadas; b) nanopartículas de prata coloidais. 47 300 400 500 600 700 800 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Plasmon de absorção de NPs de prata A b so rb ân ci a λλλλ (comprimento de onda nm) Figura 12. Gráfico de absorbância versus comprimento de onda do colóide obtido a partir da reação de redução da Ag pelo citrato de sódio na temperatura de 97ºC. O gráfico mostra a banda plasmon de absorção característica de nanopartículas de Ag. 48 Figura 13. MEV das nanopartículas de prata sintetizadas via redução dos íons prata do nitrato de Ag pelo citrato. O substrato de silício foi degradado por KOH por 2 horas e a Ag coloidal foi depositada sobre o substrato e secada para se obter a imagem. Essa técnica ilustra claramente a forma e o tamanho das nanopartículas de Ag. a) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 5 nm. Aumento: 90,75 Kx; b) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 10 nm. Aumento: 90,75 Kx. c) os pontos claros representam nanopartículas de Ag com tamanho médio de 60 nm. Aumento: 90,75 Kx. 49 Figura 14. MET das nanopartículas de prata, onde se adicionou uma gota de colóide sobre grades de cobre recobertas com filme fino de carbono. a) os pontos escuros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 5 nm. Aumento: 64,84Kx; b) os pontos escuros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 10 nm. Aumento: 64,84Kx. c) os pontos claros representam as partículas de prata com diâmetro médio de 60 nm. Aumento: 64,84Kx. 50 20 30 40 50 60 70 80 0 1x103 2x103 3x103 4x103 5x103 6x103 7x103 (2 20 ) A g (3 11 ) A g (2 00 ) A g plano (111) silicio (1 11 ) A g In te nc id ad e 2θθθθ - Figura 15. Difratograma de raios-X das nanopartículas de prata em substrato de silício com seus planos de reflexão indexados. 51 Figura 16. Microorganismo Candida albicans a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm na concentração 1x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm na concentração 1x, funcionalizada e pela ação da nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, na concentração 1x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentração de 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo); c) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata com tamanho de 60 nm na concentração 1x, coloidal, pela ação de nanopartículas de prata funcionalizadas com tamanhos 5, 10 e 60 nm na concentração 2x e pela nistatina (controle positivo); d) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5, 10 e 60 nm na forma coloidal e concentração de 5x pela ação de nanopartículas de prata de tamanho 5 nm na concentração 5x funcionalizada e ausência de formação de halo pela água deionizada estéril (controle negativo); e) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm na concentração de 5x funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10nm na concentração 1x na forma coloidal e pela nistatina (controle positivo). 52 Figura 17. Microorganismo Candida glabrata a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm na concentração 1x na forma coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm na concentração 1x, funcionalizada e pela ação da nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, na concentração 1x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentração de 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo); c) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata com tamanho de 60 nm na concentração 1x na forma coloidal, pela ação de nanopartículas de prata funcionalizadas com tamanhos 5, 10 e 60 nm na concentração 2x e pela nistatina (controle positivo); d) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5, 10 e 60 nm na forma coloidal e concentração de 5x pela ação de nanopartículas de prata de tamanho 5 nm na concentração 5x funcionalizada e ausência de formação de halo pela água deionizada estéril (controle negativo); e) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm na concentração de 5x funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10nm na concentração 1x na forma coloidal e pela nistatina (controle positivo). 53 Figura 18. Microorganismo Candida albicans a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm nas concentrações 1x, 2x e 5 x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada e ausência de halo de inibição para água deionizada estéril (controle negativo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 e 10 nm com concentrações de 1x, 2x e 5x na forma coloidal, e pela nistatina (controle positivo). 54 Figura 19. Microorganismo Candida glabrata a) formação de halos de inibição pela ação das nanopartículas de tamanho 5, 10 e 60 nm nas concentrações 1x, 2x e 5 x coloidal, pela ação de nanopartículas de tamanho 5 nm nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada e pela nistatina (controle positivo); b) formação de halos de inibição pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 10 e 60 nm, nas concentrações 1x, 2x e 5x, funcionalizada, pela ação de nanopartículas de prata de tamanhos 5 com concentrações de 1x e 2x na forma coloidal, e ausência de halo para água deionizada estéril (controle negativo). 55 Figura 20. Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida albicans. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 56 Figura 21. Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida glabrata. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 57 Figura 22. Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida albicans. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 58 Figura 23. Efeito fungiostático das nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida glabrata. a) ilustração do efeito para nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 1x na forma coloidal; b) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 2x na forma coloidal; c) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 5x na forma coloidal; d) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 2x funcionalizada; e) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 5x funcionalizada; f) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 1x funcionalizada; g) nanopartículas de tamanho 5nm na concentração 5x funcionalizada; h) nanopartículas de tamanho 10nm na concentração 1x na forma coloidal; i) nanopartículas de tamanho 60nm na concentração 2x funcionalizada. 59 Tabela Tipo de nanopartícula de prata Tamanho (nm) Concentração (x) 107,9µg de Ag/mL 1x 5 2x 5x 1x Coloidal 10 2x 5x 1x 60 2x 5x 1x 5 2x 5x 1x Funcionalizada 10 2x 5x 1x 60 2x 5x Tabela 1. Diferentes tipos de nanopartículas de prata analisadas no estudo de acordo com o tamanho e concentração.