SARA REGINA DE MARQUI Estudo fitoquímico e busca de substâncias bioativas de Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae) Dissertação apresentada ao Instituto de Química – Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Orientadora: Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva ARARAQUARA 2007 1 FICHA CATALOGRÁFICA Marqui, Sara Regina de M357e Estudo fitoquímico e busca de substâncias bioativas de Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae) / Sara Regina de Marqui. -- Araraquara : [s.n], 2007 109 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Dulce Helena Siqueira Silva 1. Produtos naturais. 2. Fitoquímica. 3. Substâncias bioativas. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação 2 CURRICULUM VITAE DADOS PESSOAIS Nome: Sara Regina de Marqui Data de nascimento: 09 de julho de 1981 Nacionalidade: Brasileira Naturalidade: Tabatinga, SP Estado civil: Solteira Profissão: Química Endereço Residencial: Rua Antônio Caldeiras Dantas, nº 483, Centro – Tabatinga, SP Endereço Profissional: Instituto de Química – Universidade Estadual Paulista - UNESP Rua Professor Francisco Degni, s/n, Quitandinha – Araraquara E-mail: saramarq@iq.unesp.br, sararegina@yahoo.com FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2004 - atual Mestrado em Química Orgânica. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. Título: Estudo fitoquímico e busca de substâncias bioativas em Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae). Orientadora: Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva. 1999 – 2003 Graduação em Química Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2005 Atividades anímicas e Biodiversidade. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2004 Workshp de Metrologia Científica e Legal de Massas. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2002 Química Forense. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2002 Prática de Leitura e Produção de Texto Científico. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2001 Monitoramento da Qualidade de Combustíveis. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2001 Gestão e Administração do Tempo. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2001 Capacitação e Assistência Técnica a Laboratórios da Rede de Monitoramento de 3 Combustíveis. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2000 Enzima de Uso industrial. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. 2000 O Profissional do Ensino. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil. ATUAÇÃO PROFISSIONAL 1. Diretoria Regional de Ensino – Região de Araraquara - DREA 2006 EE Comendador Pedro Morganti – Rincão 2006 EE Bento de Abreu – Araraquara 2006 EE Luzia de Abreu – Nova Europa 2005 EE Bento de Abreu – Araraquara 2005 EE Ergília Micelli – Araraquara 2005 EE Luzia de Abreu – Nova Europa 2004 EE Luzia de Abreu – Nova Europa 2004 EE Dorival Alves – Araraquara 2004 EE Abdalla Miguel – Tabatinga 2. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP Instituto de Química – Unesp de Araraquara 2004-2007 Mestrado em Química Orgânica Título: Estudo fitoquímico e busca de substâncias bioativas de Chrysophylllum flexuosum (Sapotaceae). Orientadora: Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva Estágios 2001-2003 Centro de Monitoramento e Pesquisa da Qualidade de Combustíveis Petróleo e Derivados – CEMPEQC. Convênio com a Agência Nacional do Petróleo – ANP. Atividades desenvolvidas no laboratório 1. Ponto de fulgor 2. Determinação de densidade 3. Determinação do teor de álcool na gasolina 4. Determinação de pH 4 5. Determinação de teor de gasolina no álcool combustível 6. Análise no aparelho IROX - infravermelho 7. Destilação de combustíveis 8. Desenvolvimento do método de resfriamento do aparelho de ponto de fulgor. 9. Práticas cotidianas em laboratórios. Atividades desenvolvidas no setor administrativo 1. Palestras ministradas em escolas de ensino fundamental e médio. 2. Desenvolvimento do setor administrativo do CEMPEQC. 3. Secretariado. 4. Publicidade e propaganda. 5. Recursos humanos. 6. Prestação de contas. 7. Setor de compras e cotações. 8. Auxiliar administrativo. 2000-2001 Representante Discente do Departamento de Química Analítica 1999 – 2001 Centro de Ciências Unesp Araraquara Atividades desenvolvidas 1. Elaboração e manutenção de experimentos no laboratório de química 2. Monitoria de visitas de escolas do ensino fundamental e médio 3. Plantão de dúvidas na área de exatas 4. Manutenção de kits da experimentoteca. LINHAS DE PESQUISA 1. Estudo fitoquímico e busca de substâncias bioativas de Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae) 2. Desenvolvimento do funcionamento e resfriamento do aparelho de ponto de fulgor. ÁREAS DE ATUAÇÃO Professora de Química, Física e Matemática Monitoria na área de exatas Apresentações de palestras e workshops Química Orgânica Fitoquímica 5 Secretariado executivo Administração de empresas IDIOMAS Inglês (Intermediário) Espanhol (Iniciante) PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos. MARQUI, S. R. de; et al. Lactonas Triterpênicas das folhas de Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae). In: Sociedade Brasileira de Química – SBQ, Águas de Lindóia, 2006. MARQUI, S. R. de; et al. Conservação e uso sustentável da diversidade vegetal do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química e busca de drogas potenciais. In: V Simpósio e V Reunião de Avaliação do Programa Biota/Fapesp, Águas de Lindóia, 2005. MARQUI, S. R. de; et al. Estágio Supervisionado Presencial e Atividades de Formação de Professores: do Rascunho à Arte Final. In: VI JORNADA DE EDUCAÇÃO DO DEPARTAMENTO DE EDUCAÇÃO DA FACULDADE DE CIÊNCIAS E LETRAS DA UNESP. Assis, 2003. Processos ou Técnicas sem Registro ou Patente. MARQUI, S. R. de Desenvolvimento do Método de Resfriamento do Aparelho de Ponto de Fulgor, 2002. Demais Trabalhos. 1. Difusão do Conhecimento Científico, 2000. 2. Metodologias Alternativas, 2000. 3. Novas Técnologias de Ensino Fundamental e Médio, 2000 4. Elaboração de Práticas Científicas a serem aplicadas no cotidiano, 1999. Participação em eventos. 1. Sociedade Brasileira de Química, 2006. Lactonas Triterpênicas de Chrysophyllum flexuosum (Sapotaceae). 6 2. Workshop de Pós-Graduação em Química da Unesp, 2006. 3. V Simpósio e V Reunião de Avaliação do Programa Biota/Fapesp, 2005. Conservação e uso sustentável da diversidade vegetal do Cerrado e Mata Atlântica: diversidade química e busca de drogas potenciais. 4. Workshop de Metrologia Científica e Legal de Massas, 2004. 5. VI Jornada da Educação, 2003. Estágio Supervisionado Presencial e Atividades de Formação de Professores: do Rascunho à Arte Final. 6. Mostra de Tecnologia e de Projetos do IQ – UNESP, 2003. 7. Primeiro Curso de Especialização de Inverno, 2002. 8. XXXII Semana da Química, 2002. 9. VI Jornada Pedagógica, 2000. 10. XXX Semana da Química, 2000. 11. XII Jornada Científica, 2002. 7 Dedicatória A Deus por tudo que tenho recebido, pelo dom do amor, paciência e dissernimento. Ao meu avô paterno Pedro de Marqui e minha avó materna Santina Jacoboni (em memória). Obrigada pelo momentos inesquecíveis que passamos juntos. Onde quer que vocês estejam, sei que estão velando por mim. Aos meus pais José Benedito de Marqui e Aparecida Maria de Fátima Eleotério de Marqui, que com fé em Deus, lutaram para me dar suporte e educação. Em nenhum momento deixaram de acreditar nos meus sonhos. A eles devo tudo o que sou hoje. Agradeço por terem compreendido o distanciamento físico que foi necessário para a realização da minha graduação e mestrado. Ao meu imão Isaac Rogério de Marqui que a todo momento se preocupava com meu bem estar. Esteve sempre presente em minha vida acadêmica. Ele é fã incondicional do meu trabalho. Tenho-o como exemplo a seguir em minha vida. A minha avózinha Aparecida Jacoboni de Marqui pelo apoio incondicional, amor e dedicação. Ela nunca negou esforços e incentivos para a realização dos meus objetivos. Tenho-a como segunda mãe, pois me criou desde pequena com muitos mimos e nunca deixando eu desistir. Obrigada pelas incasáveis orações. A todos meus famíliares que sempre estiveram presentes em minha vida, demonstrando confiança, carinho e dedicação: Adriana Sâmila Tia Fátima (madrinha) Alan Tia Antônia Tio João Anderson Tia Celina Tio José Moreira Cilinho Tia Danuzia Tio Mário Francine Tia Dolores Tio Roberto Márcia (madrinha) Tio Esvaldi Tio Vitório Moiséis Tia Fátima Vô Felipe Rodrigo Eu amo muito todos vocês. Sem vocês, pessoas maravilhosas que Deus colocou em minha vida, não tinha cumprido parte de minha missão. 8 Gratidão Eterna Sei que o que fez Sei do que fizeste Mesmo com tantos ais Por tudo que me destes Faz porque gosta de mim Porque de ti sou parte Quantos nãos ao invés de sim Reprovando as minhas artes Lembro-me quando criança Das grandes dificuldades Da falta de tempo que tinhas Das grandes necessidades Saías de casa bem cedo Munido de dignidade Levando a marmita enrolada Recheada de honestidade Fiel aos seus compromissos Levou-nos à universidade Sentia-se todo orgulhoso Por ter os filhos formado Hoje sou o que sou Porque voce me ensinou Outro não escolheria Pois certamente eu não o amaria (Autor desconhecido) Pai e mãe amo vocês, serei eternamente grata a tudo que fizeram por mim.Obrigada. 9 Agradecimentos Especiais A minha querida Profa. Dra. Dulce Helena Siqueira Silva pela orientação, paciência e amizade e principalmente por ter me acolhido de braços abertos quando mais precisei. Não irei esquecer os bons conselhos, sugestões e exigências. A Luciana Ávila pelos ensinamentos de técnicas necessárias para o desenvolvimento do trabalho no laboratório e pela paciência. A minha amiga Vera que sempre me deu atenção e apoio emocional (incondicional) em todos os momentos que precisei. Você é para mim a “mãe Vera”. Existem pessoas que aparecem em nossas vidas em momentos turbulentos e adversos. A elas damos o título de amigo pela suavidade e compreensão que nos dedicam. Juntos sorrimos e cantamos enfim compartilhando o que a vida num todo tem nos reservado a cada dia. Alguns desses seres são como estrelas guias que nós fazem enxergar o melhor caminho e ao nos verem trilhar esse caminho desaparecem sem deixar rastro mas deixando pra sempre em nosso coração a certeza de que estará ali quando mais necessitarmos. Também temos amigos irmãos que podem sumir por um tempo mas jamais completamente.Uma amizade que nem distância e nem o tempo farão acabar. Amar um amigo é adotar um irmão ao qual não dotamos defeitos e nem destacamos qualidades banais. Por isso, agradeço a Deus por sua amizade e por ter me feito encontrar um ser tão admirável quanto você. Obrigada pela atenção, carinho e ensinamentos nos momentos bons e ruins. 10 Agradecimentos Ao Instituto de Química – Unesp e ao Nubbe (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais), pela oportunidade de desenvolver este trabalho. Aos professores do Departamento de Química Orgânica pela amizade, confiança e aprendizado de conteúdos disciplinares e lição de vida: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro Profa. Dra. Ângela Regina de Araújo Prof. Dr. Ian Castro Gamboa Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira Profa. Dra. Márcia Nasser Lopes Profa. Dra. Vanderlan da Silva Bolzani Prof. Dr. Wagner Vilegas A Profa. Dra. Hosana Maria Debonsi Navickiene da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP de Ribeirão Preto pela disponibilidade de ser Membro da Banca Examinadora da Defesa de Mestrado. Aos funcionários do NuBBE pela amizade e ajuda incondicional: Dr. Nivaldo Boralle pela obtenção dos espectros de RMN Dr. Alberto Camilo Alécio pela orientação no uso de CLAE. Hélia, técnica do laborátorio. Aos meus amigos do NuBBE: André Jonas Motta Silvia Andréa Nastri Luciana Ávila Vânia Daniara Luís Octávio Viviane Douglas Maria Amélia Fernando Patricia Pauletti As funcionárias da Seção de Pós-Graduação: Célia Maria Chicareli Vieira Coelho 11 Patrícia Freitas Sandra Pavanelli As funcionárias da Biblioteca E a todos que de uma forma ou de outra estiveram presentes durante esta empreitada. Muito obrigada. Amizade A verdadeira amizade é aquela que está disposta a reconhecer as falhas e imperfeição daqueles que realmente podemos chamar de amigos. Amizade verdadeira se contenta por ter alguém ao seu lado que apesar de às vezes não concordar com o que dizemos ou fazemos está ao nosso lado para nos consolar e aconselhar e o mais importante, para nos encorajar a prosseguir admitindo que todos têm falhas e que pequenos defeitos jamais farão com que nos afastemos dos nossos amigos verdadeiros. Minha grande felicidade é ter ao meu lado um amigo que mostre que erramos e que devemos nos arrepender e que está ao meu lado para me apoiar e ajudar e me corrigir quando precisar. Inestimáveis são os amigos verdadeiros grandes tesouros que devem ser prezados. Zelo e amor demonstram em tudo o que fazem procurando sempre estar fazendo a coisa certa para agradar seus amigos. Amigos são somente aqueles que estão dispostos a se alegrarem mesmo que estejam tristes, para ver o seu amigo sorrir. Demostra por ações e palavras que realmente é amigo, que quer estar sempre ao nosso lado. Esses amigos tão especiais nos ajudam em todas as ocasiões, fazem coisas por nós que duvidaríamos, o que temos de fazer para que essa verdadeira amizade floresça e cresça regularmente é: cultivá-la. 12 Epígrafe No príncipio, Deus criou os céus e a terra (Gênesis 1,1). Deus disse: “Produza a terra plantas, ervas que contenham sementes e árvores frutíferas que dêem fruto segundo a sua espécie e o fruto contenha a sua semente”. E assim foi feito. (Gênesis 1,11). 4O Senhor fêz a terra produzir os medicamentos: O homem sensato não os despreza. 5Uma espécie de madeira não adoçou o amargor da água? Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens. 6O Altíssimo deu-lhes a ciência Para ser honrado em suas maravilhas; 7E dela se serve para acalmar as dores e curá-las; O farmacêutico faz misturas agradáveis, Compõe unguentos úteis à saúde. E seu trabalho não terminará, 8Até que a paz divina se estenda sobre a face da terra. (Eclesiástico 38, 4-8) 13 “Maior do que a tristeza de não ter vencido é a vergonha de não ter lutado.” (Rui Barbosa) 14 RESUMO A família Sapotaceae é composta de 53 gêneros com aproximadamente 600 espécies. Esta família não é extensivamente estudada e é encontrada nas regiões tropicais e subtropicais como arbustos e árvores, incluindo espécies comestíveis como Manilkara zapote (sapoti), Pouterie caimito (abiu), Chrysophyllum cainito (“star-apple”) e Synsepalum dulcificum (“miracle-fruit”). Poucas espécies do gênero Chrysophyllum foram investigadas quimicamente, sendo que algumas apresentaram atividades biológicas importantes. Estudos mais recentes têm focalizado os constituintes de frutos comestíveis, buscando antioxidantes polifenólicos e substâncias com atividade antiinflamatória, como triterpenos derivados do ácido oleanólico e do ácido glicirretínico. Algumas espécies são usadas na medicina popular para desordens gástricas e tratamento de úlcera. Outras apresentaram atividade redutora dos níveis de LDL, colesterol e triglicerídeos séricos. O estudo fitoquímico de Chrysophyllum flexuosum inclui em um projeto de pesquisa que visa conhecer a composição química das espécies vegetais com potencial atividade biológica. Análise preliminar do extrato bruto das folhas e ramos apresentou atividade antioxidante em teste utilizando CCDC nebulizada com solução de β-caroteno e inibiu a peroxidação lipídica em modelo de lipossomas usando Fe2+ como iniciador de reações radicalares. O extrato etanólico de folhas e ramos da espécie Chrysophyllum flexuosum foi submetido a partição líquido-líquido com hexano, acetato de etila, butanol e metanol/água (9:1). Da fração hexânica foram isolados 4 triterpenos pentacíclicos majoritários identificados como: butanolídeo [1,3]-α-amirina (1), sendo inédito na literatura, 3-O-β-acetil-β-amirina (2), 3-O-β-acetil-lupeol (3) e 3-O-β-acetil-α-amirina (7), constituindo 1/3 da massa total da fração. Também foram identificados na fração hexânica a α- amirina (4), β-amirina (5) e lupeol (6). Na fração acetato de etila foi identificado o ácido gálico (8) como constituinte principal. Através de comparação dos cromatogramas em CLAE das fases FAc, FB e FM em vários comprimentos de onda e fases móveis, observou-se a presença do ácido gálico nas três fases. Conforme observado na literatura, o gênero Chrysophyllum apresenta substâncias com atividade antioxidante em potencial, o que foi verificado na espécie em estudo através do teste em CCDC revelada com solução de β-caroteno para as subfrações obtidas da fase em AcOEt do extrato etanólico das folhas e ramos de Chrysophyllum flexuosum. O ácido gálico deve ser a substância responsável pela atividade antioxidante observada para o extrato e fração AcOEt. Adiionalmente, a lactona triterpênica butanolídeo [1,3]-α-amirina (1) apresentou baixa atividade anticolinesterásica e frente ao fungo patogênico humano Candida albicans. Também apresentou moderada atividade frente ao fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans. A substância 8 apresentou moderada atividade frente ao fungo fitopatogênico Cladosporium sphaerospermum e patogênico humano Cryptococcus neoformans. Também apresentou baixa atividade anticolinesterásica e frente aos fungos patogênicos humanos Candida albicans e C. Krusei. 15 ABSTRACT The Sapotaceae family is composed of 53 genera with ca. 600 species. This family is not extensively studied and is found in tropical and subtropical regions as shrubs and trees, including edible species as Manilkara zapote (sapoti), Pouterie caimito (abiu), Chrysophyllum cainito (star- apple) and Synsepalum dulcificum (miracle-fruit). Few species of Chrysophyllum genus have been investigated although some present important biological properties. Recent studies have focused on the constituents of edible fruits, searching for antioxidant phenolics and anti-inflammatory compounds, as triterpene derivatives of oleanolic acid and glicerretinic acid. Some species have presented reducing activity on LDL, cholesterol and triglyceride blood levels. The phytochemical study on Chrysophyllum flexuosum is included in a research project focusing on the search for bioactiveormolecular compounds from São Paulo flora with potential biological activity. Preliminary analysis of its leaves crude extract by a TLC test nebulized with beta-carotene solution in a liposome model using Fe2+ as radicalar reactions initiator, indicated the presence of antioxidant compounds. The ethanol extract from leaves of Chrysophyllum flexuosum was submitted to liquid- liquid partition with organic solvents: hexane, ethyl acetate, butanol and methanol/water (9:1), followed by chromatographic procedures. The hexane fraction afforded four pentacyclic triterpenes, including the new butanolide-[1,3]-α-amyrin (1), 3-O-β-acetyl-β-amyrin (2), 3-O-β-acetyl-lupeol (3); and 3-O-β-acetyl-α-amyrin (7), comprising ca. one third of its total weight. Lupeol (6), β-amyrin (5); and α-amyrin (4) were also identified from the hexane fraction. The ethyl acetate, butanol and methanol fractions using several mobile phases and UV wavelength detection disclosed the presence of gallic acid in the three fractions. As observed in the literature, Chrysophyllum genus presents compounds with antioxidant activity, which was confirmed by the results obtained from the TLC analysis. The new triterpene lactone 1 presented moderate MIC (minimum inhibitory concentration) towards acethylcholinesterase (AchE) in the TLC test, whereas gallic acid (8) showed moderate activity when bioautographed with phytopathogenic fungi Cladosporium sphaerospermum. Both compounds presented moderate inhibitory activity towards human pathogens Candida albicans, C. krusei and Cryptococcus neoformans. 16 SUMÁRIO 1. Introdução 24 1.1. A família Sapotaceae 24 1.2. Atividade Biológica dos Triterpenos 25 1.3. Descrição botânica da familia Sapotaceae 28 1.4. O gênero Chrysophyllum 30 1.5. A éspecie Chrysophyllum flexuosum 32 2. Objetivos 33 3. Metodologia 33 3.1. Materiais, Equipamentos e Técnicas 33 3.1.1. Moinho de facas e funil de separação 33 3.1.2. Solventes 33 3.1.3. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e Preparativa 33 3.1.4. Cromatografia em Coluna 34 3.1.5. Rotaevaporador 34 3.1.6. Ultra-som 34 3.1.7. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 34 3.1.8. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 34 3.2. Ensaios químicos e biológicos 34 3.2.1. Autografia em CCDC com β-caroteno para atividade antioxidante 35 3.2.2. Ensaio colorimétrico com 2,2-difenil-picrihidrazila (DPPH) – detecção do potencial sequestrador de radicais livres 35 3.2.3. Avaliação da atividade antifúngica – fungos fitopatogênicos 36 3.2.4. Detecção da atividade anticolinesterásica 36 3.2.5. Avaliação da atividade antifúngica – fungos patógenos humanos 38 3.3. Procedimentos Experimentais 39 3.3.1. Coleta e identificação do material vegetal 39 3.3.2. Obtenção do extrato bruto 39 3.3.3. Partição do extrato bruto EtOH 39 3.3.4. Avaliação da atividade antioxidante 40 3.3.5. Fracionamento cromatográfico da fração hexânica 41 3.3.6. Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila 46 3.3.7. Fracionamento cromatográfico da fração Butanólica e Hidroalcóolica 57 4. Resultados e discussões parciais 58 4.1. Determinação estrutural da substância 1 58 4.2. Determinação estrutural da substância 2 60 4.3. D eterminação estrutural da substância 3 63 4.4. Determinação estrutural das substâncias 4, 5 e 6 65 4.5. Determinação estrutural da substância 7 67 17 4.6. Determinação estrutural da substância 8 69 5. Resultados de ensaios químicos e biológicos realizados 70 5.1. Ensaio colorimétrico com 2,2-difenil-picrihidrazila (DPPH) – detecção do potencial sequestrador de radicais livres 70 5.2. Avaliação da atividade antifúngica – fungos fitopatogênicos 71 5.3. Detecção da atividade anticolinesterásica 72 5.4. Avaliação de atividade antifúngica – fungos patógenos humanos 73 6. Conclusões 74 7. Referências 75 8. Anexos 81 18 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Triterpenos pentacíclicos de esqueleto lupano extraídos da espécie Mimusops e ácido protobásico extraído da espécie Gambeya, respectivamente 25 Figura 2: Ácido ursólico e ácido betulínico, respectivamente, que apresentaram atividades citotóxicas e citostática 26 Figura 3: Folhas e frutos de Mimusops elengi 28 Figura 4: Folhas e frutos de Manilkara zapota 29 Figura 5: Folhas e frutos de Pouteria caimito 29 Figura 6: Antocianinas isoladas de espécies de Chrysophyllum 30 Figura 7: Folhas e frutos de Chrysophyllum spp 31 Figura 8: Flavonóides antioxidantes de espécies de Chrysophyllum 32 Figura 9: Redução do radical difenil-picrilhidrazila (DPPH) 35 Figura 10: Galantamina, controle positivo nos ensaios de inibição da AChE 37 Figura 11: Reação da AChE com acetato de 1-naftila e subsequente formação do corante azóico roxo no bioensaio em CCD 38 Figura 12: Cromatogramas obtidos via CLAE da FH1-Y (494,9mg), (coluna analítica “Luna” Phenomenex LC-18, fase móvel MeOH/CH2Cl2 9:1, fluxo de 1mL/min, λ 201nm e λ 215nm) 43 Figura 13: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc1-8 (38,3mg) e FAc7-4 (14,2mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) 48 Figura 14: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-5 (38,3mg) e FAc7-6 (10,5mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) 49 Figura 15: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-9 (21,7mg) e FAc7-10 (45,8mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) 49 Figura 16: Cromatograma obtido via CLAE da FAc7-11 (96,0mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 235nm) 50 Figura 17: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-11-Z-2 (6,2mg) e FAc7-11-Z-3 (45,8mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) 51 Figura 18: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc4-1 (3,8 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 52 Figura 19: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc4-2 (4,9 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 53 19 Figura 20: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc5-1 (2,9 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 53 Figura 21: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc5-2 (2,0 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 53 Figura 22: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc6-1 (3,5 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 54 Figura 23: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc6-2 (3,5 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 54 Figura 24: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc8-1 (15,8 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 54 Figura 25: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc8-2 (9,1 mg), coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 55 Figura 26: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc9-1 (72,6 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 55 Figura 27: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc9-2 (30,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 55 Figura 28: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc14-2 (86,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 56 Figura 29: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc14-3 (35,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 56 Figura 30: Estrutura molecular proposta para a substância 1 (butanolídeo [1,3]-α-amirina) 58 Figura 31: Algumas correlações de HMBC (H C) da substância 1 (butanolídeo [1,3]-α-amirina) 59 Figura 32: Estrutura molecular proposta para a substância 2 (3-O-β-acetil-β-amirina) 60 Figura 33: Algumas correlações de HMBC (H C) da substância 2 (3-O-β-acetil-β-amirina) 62 Figura 34: Estrutura molecular proposta para a substância 3 (3-O-β-acetil-lupeol) 63 Figura 35: Algumas correlações de HMBC (H C) da substância 3 (3-O-β-acetil-lupeol) 64 Figura 36: Estruturas moleculares propostas para a: α-amirina (substância 4), β-amirina (substância 5) e lupeol (substância 6) respectivamente 65 20 Figura 37: Estrutura molecular proposta para a substância 7 (3-O-β-acetil-α-amirina) 67 Figura 38: Algumas correlações de HMBC (H C)da substância 7 (3-O-β-acetil-α-amirina) 69 Figura 39: Estrutura molecular proposta para a substância 8 (ácido gálico) 69 Figura 40: Algumas correlações de HMBC da substância 8 (ácido gálico) 70 Figura 41 Atividade sequestradora de radicais livres da substância 8 frente ao DPPH 71 Figura 42: Biautografia da substância 8 (ácido gálico) 72 Figura 43: Biautografia em placa de sílica, detecção da atividade anticolinesterásica 73 ÍNDICE DE FLUXOGRAMAS Fluxograma 1: Partição do extrato EtOH bruto 39 Fluxograma 2: Fracionamento cromatográfico da FH1 42 Fluxograma 3: Fracionamento cromatográfico parcial da FH 45 Fluxograma 4: Fracionamento das subfrações com resultados positivos em testes de atividade antioxidante 47 Fluxograma 5: Fracionamento da FA7-11 50 Fluxograma 6: Fracionamento cromatográfico da FAc 57 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1: Fases móveis utilizadas na CCDC para o EE e suas sub-frações 41 Tabela 2: Eluição de FH em CC (sílica mesh 70-230) 41 Tabela 3: Eluição de FH1 em CC (sílica mesh 70-230) 42 Tabela 4: Fração obtidas de FH1-1 por CCDP (Hex/AcOEt 9:1) 42 Tabela 5: Frações obtidas da FH1-Y por CLAE preparativo (MeOH/ CH2Cl2 (9:1), fluxo 18mL/min, λ 215nm) 43 Tabela 6: Eluição de FH2 em CC (sílica mesh 70-230, gradiente Hex/AcOEt) 44 Tabela 7: Fração obtidas de FH2-9 por CCDP (Hex/AcOEt 9:1) 44 Tabela 8: Eluição de FH3 em CC (sílica mesh 70-230, gradiende Hex/AcOEt) 45 Tabela 9: Frações obtidas de FH4 por CCDP (Hex/AcOEt 8:2) 45 Tabela 10: Frações obtidas de FH4-1 por CCDP (Hex/AcOEt 95:5, 3x) 45 Tabela 11: Eluição de FAc em CC (Sephadex) eluída com MeOH 46 Tabela 12: Eluição de FAc1 em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH 47 Tabela 13: Eluição de FAc7 em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH 48 Tabela 14: CCDP (Hex/AcOEt 86:12:2) da FAc7-11 50 Tabela 15: CC Sephadex (MeOH) da FAc7-11-Z 51 Tabela 16: CCDP (AcOEt/MeOH/H2O 86:12:2) da FAc7-11-Z-3 52 Tabela 17: Subfrações obtidas das frações FAc (4, 5, 6, 8, 9, 11, 12 e 14) submetidas a coluna C- 18 57 Tabela 18: Eluição de FB em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH 57 21 Tabela 19: Eluição de FM em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH 58 Tabela 20: Dados de RMN da substância 1 (butanolídeo [1,3]-α-amirina) a, b, c, n.a 60 Tabela 21: Dados de RMN da substância 2 (3-O-β-acetil-β-amirina) a, b, c, n.a 62 Tabela 22: Dados de RMN da substância 3 (3-O-β-acetil-lupeol) a, b, c, n.a 64 Tabela 23: Dados de RMN da substância 4 (α-amirina), substância 5 (β-amirina) e substância 6 (lupeol) respectivamente a, b, c, n.a. 66 Tabela 24: Dados de RMN da substância 7 (3-O-β-acetil-α-amirina) a, b, c, n.a. 68 Tabela 25: Dados de RMN da substância 8 (ácido gálico) a, b, c 70 Tabela 26: Biautografia das substâncias 1 (butanolídeo [1,3]-α-amirina) e 8 (ácido gálico) 71 Tabela 27: Método de microdiluição das substâncias butanolídeo [1,3]-α-amirina (1) e ácido gálico (8) 74 ÍNDICE DE ESPECTROS Espectro 1: RMN de 1H da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 81 Espectro 2: RMN de 1H ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 81 Espectro 3: RMN de 13 C da FH1-Y-2 (CDCl3, 125 MHz) 82 Espectro 4: RMN de 13 C ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 125 MHz) 82 Espectro 5: DEPT 135° da FH1-Y-2 (CDCl3, 125 MHz) 83 Espectro 6: DEPT 135° ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 125 MHz) 83 Espectro 7: DEPT 90° da FH1-Y-2 (CDCl3, 125 MHz) 84 Espectro 8: HMQC da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 84 Espectro 9: HMQC ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 85 Espectro 10: HMQC ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 86 Espectro 11: HMBC da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 86 Espectro 12: HMBC ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 87 Espectro 13: HMBC ampliado da FH1-Y-2 (CDCl3, 500 MHz) 88 Espectro 14: RMN de 1H da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 88 Espectro 15: RMN de 1H ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 89 Espectro 16: RMN de 13C da FH1-1-b (CDCl3, 125 MHz) 89 Espectro 17: RMN de 13C ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 125 MHz) 90 Espectro 18: DEPT 135° da FH1-1-b (CDCl3, 125 MHz) 90 Espectro 19: DEPT 135° ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 125 MHz) 91 Espectro 20: HMQC da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 91 Espectro 21: HMQC ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 92 Espectro 22: HMBC da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 93 Espectro 23: HMBC ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 93 Espectro 24: HMBC ampliado da FH1-1-b (CDCl3, 500 MHz) 94 Espectro 25: RMN de 1H (integração) da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 94 22 Espectro 26: RMN de 1H ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 95 Espectro 27: RMN de 13C da FH2-9-2 (CDCl3, 125 MHz) 95 Espectro 28: RMN de 13C ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 125 MHz) 96 Espectro 29: DEPT 135° da FH2-9-2 (CDCl3, 125 MHz) 96 Espectro 30: DEPT 135° ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 125 MHz) 97 Espectro 31: HMQC da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 97 Espectro 32: HMQC ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 98 Espectro 33: HMQC ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 98 Espectro 34: HMBC da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 99 Espectro 35: HMBC ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 99 Espectro 36: HMBC ampliado da FH2-9-2 (CDCl3, 500 MHz) 100 Espectro 37: RMN de 1H da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 100 Espectro 38: RMN de 1H ampliado da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 101 Espectro 39: RMN de 13C da FH4-1-4 (CDCl3, 125 MHz) 101 Espectro 40: RMN de 13C ampliado da FH4-1-4 (CDCl3, 125 MHz) 102 Espectro 41: DEPT 135° da FH4-1-4 (CDCl3, 125 MHz) 102 Espectro 42: DEPT 135° da FH4-1-4 (CDCl3, 125 MHz) 103 Espectro 43: HMQC da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 103 Espectro 44: HMQC ampliado da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 104 Espectro 45: HMBC da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 105 Espectro 46: HMBC ampliado da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 105 Espectro 47: HMBC ampliado da FH4-1-4 (CDCl3, 500 MHz) 106 Espectro 48: RMN de 1H da FAc9-2 (D2O, 500 MHz) 106 Espectro 49: RMN de 13C da FAc9-2 (D2O, 125 MHz) 107 Espectro 50: DEPT 135° da FAc9-2 (D2O, 125 MHz) 107 Espectro 51: HMQC da FAc9-2 (D2O, 500 MHz) 108 Espectro 52: HMBC da FAc9-2 (D2O, 500 MHz) 108 Espectro 53: HMBC ampliado da FAc9-2 (D2O, 500 MHz) 109 23 ABREVIATURAS E SÍMBOLOS CC Cromatografia em Coluna CCD Cromatografia em Camada Delgada CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa CDCl3 Clorofórmio Deuterado CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência d Dubleto dd Duplo Dubleto ddl Duplo Dubleto Largo DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer dl Dubleto Largo DMSO-d6 Dimetil Sulfóxido Deuterado D2O Água Deuterada EE Extrato Etanólico FAc Fração Acetato de Etila FB Fração n-Butanol FH Fração Hexânica FM Fração Hidrometanólica gCOSY Correlated Spectroscopy gHMBC Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence gHMQC Gradient Heteronuclear Multiple Bond Coherence Hz Hertz J Constante de Acoplamento m Multipleto MHz MegaHertz RMN Ressonância Magnética Nuclear s Singleto sl Singleto Largo t Tripleto δ Deslocamento Químico λ Comprimento de Onda 24 1. INTRODUÇÃO. A flora brasileira é a segunda maior área florestal do planeta. Nossas florestas apresentam os maiores índices de biodiversidade e de ecossistemas e o homem tende a beneficiar-se desta situação. Dos diversos biomas brasileiros, estima-se que existam de 40 mil a 55 mil espécies (STASI, 1996). Dentre os seis principais biomas do Brasil estão o Cerrado e a Mata Atlântica (BDT, 2003a). O Cerrado, cobrindo 22% do terrritório nacional (BDT, 2003b), é formado por diversos tipos de vegetação savânica que diferem entre si pela abundância relativa de espécies rasteiras e de árvores e arbustos (BDT, 2003c), num total de 10.000 espécies de plantas, sendo 4.400 endêmicas dessa área (IBAMA, 2003a). Já a Mata Atlântica, com apenas 7,3% de sua cobertura florestal original, possui ainda cerca de 20.000 espécies de plantas vasculares, sendo 8.000 espécies endêmicas (IBAMA, 2003b). Assim, tendo como exemplo a devastação da Mata Atlântica, o ritmo atual de extinção das espécies vegetais pode fazer com que um grande número de plantas com propriedades medicinais desapareçam antes de ter seu valor reconhecido. O potencial de plantas superiores como fontes para novos fármacos é ainda pouco explorado. Entre as 250.000 espécies estimadas de plantas, somente pequena porcentagem foi investigada quimicamente e a fração delas submetida a ensaios biológicos ou farmacológicos é ainda menor. Cerca de 140 mil metabólitos intermediários, oriundos, sobretudo de plantas superiores, já foram isolados e caracterizados. A maioria, no entanto, ainda não foi avaliada biologicamente (CALIXTO, 2000). Diversas famílias ainda não investigadas química e farmacologicamente vêm sendo estudadas dentro do Projeto Temático – BIOTA, intitulado “Conservation and sustainable use of the plant biodiversity from cerrado and Atlantic Forest: chemical diversity and prospecting for potencial drugs”, desenvolvido pelo Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBe). A seleção das espécies vegetais é baseada em bioensaios preliminares (antitumoral, antiinflamatório, antioxidante e antifúngico) dos extratos vegetais, visando o estabelecimento de modelo para a preservação, estudo e exploração racional da flora remanescente no Estado de São Paulo. 1.1. A família Sapotaceae. A família Sapotaceae é composta de 53 gêneros com aproximadamente 600 espécies. Esta família não é extensivamente estudada, sendo os gêneros Pouteria, Mimusops, Manilkara, Gambeya, Argania, Ormosia, Sideroxylum, Calocarpum, Butyrospermum, Madhuka, Planchonella e Chrysophyllum, os mais investigados quimicamente em função de relatos de seus usos etnofarmacológicos. Espécies de Mimusops são usadas na medicina popular para desordens gástricas e tratamento de úlcera (SHAH et al., 2003). Estas forneceram triterpenos pentacíclicos de esqueleto 25 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH3 OH OH OH COOH OH CH3 COOR2 CH3 CH3 CH3 H H CH2 CH3 COOR2 R1 lupano (Figura 1) e ursano com inibição sobre as enzimas β-glucuronidase e α-glucosielase (JAHAN et al., 1995; JAHAN et al., 2000; JAHAN et al., 2001; SEM et al., 1995), além de saponinas triterpênicas derivadas do ácido protobásico (SAHU, 1996; SAHU et al., 1997; LAVAUD et al., 1996). Espécies de Gambeya também forneceram ácido protobásico, além de outros triterpenos pentacíclicos: ácido oleanólico, miriântico e de ácidos graxos triterpênicos e esteróides glicosilados (WANDJI et al., 2002; WANDJI et al., 2003). Outras saponinas triterpênicas derivadas do ácido protobásico (Figura 1) foram isoladas das raízes de Sideroxylon (NICOLAS et al., 1995; JIANG et al., 1994) e das sementes de Madhuca butyraceae (LI et al., 1994; NIGAM et al., 1992). O óleo comestível extraído das sementes de Argania spinosa, endêmica do Marrocos, mostrou atividade redutora dos níveis de LDL, colesterol e triglicerídeos séricos, possivelmente relacionadas ao seu conteúdo de ácidos graxos insaturados (BERROUGUI et al., 2003). Esse óleo mostrou ainda a presença de esteróis, álcoois triterpênicos (MORTON, 1987; FARINES et al., 1984a; FARINES et al., 1984b) e saponinas (ALAOUI et al., 2002), enquanto o estudo químico de suas folhas evidenciou a presença de flavonóides glicosilados (TAHROUCH et al., 2000). Os óleos essenciais obtidos pela destilação das folhas de Argania spinosa apresentaram álcoois sesquiterpênicos (epi-cubenol) como constituintes majoritários, que mostraram atividade antimicrobiana (EL KABOUSS et al., 2002). Figura 1: Triterpenos pentacíclicos de esqueleto lupano extraídos da espécie Mimusops e ácido protobásico extraído da espécie Gambeya, respectivamente. 1.2. Atividade Biológica dos Triterpenos. Os triterpenos são metabólitos secundários não esteroidais da flora, fauna marinha e terrestre, ocorrendo na forma livre, bem como na forma éter, éster ou glicosídeo. Triterpenos são isoprenóides compostos de 30 átomos de carbono e podem possuir esqueletos carbônicos acíclicos, mono, di, tri, tetra ou pentacíclicos, com posterior modificação da estrutura devido a rearranjos e mudanças de grupos funcionais (MANN et al., 1994a; MANN et al., 1994b). Triterpenos pentacíclicos são constituintes dominantes desta classe e têm sido largamente investigados. Dentro da classe dos triterpenos pentacíclicos existem os esqueletos do tipo R1 R2 OH H OH CH3 OAc H O CH3 26 oleanano, taraxerano, friedooleanano, friedelano, ursano, lupano entre outros associados à presença e posicionamento de ligações duplas, grupos metílicos e tamanho dos ciclos (MAHATO et al., 1994). Mesmo considerando-se as limitadas potencialidades farmacológicas dos triterpenos para atividade antioxidante, a ampla ocorrência a e diversidade estrutural destas substâncias despertaram o interesse nas pesquisas de suas atividades biológicas nos últimos anos. Neste contexto, um grande número de triterpenos com atividades citotóxicas e citostática foram descritos, sendo potenciais substâncias antineoplásicas. Dentre estas substâncias destacam-se vários triterpenos pentacíclicos como o epimadiol, manalidol, saforadiol, ácido ursólico, ácido betulínico (Figura 2) e seus derivados, entre outros (MAHATO et al., 1994). CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH COOH CH3 CH3 Figura 2: Ácido ursólico e ácido betulínico, respectivamente, que apresentaram atividades citotóxicas e citostática. O ácido ursólico, também conhecido como urson, prunol, micromerol e malol, é um triterpeno pentacíclico cuja ocorrência natural se dá em um grande número de alimentos vegetais, ervas medicinais e outras plantas (LIU, 1995; THE MERCK INDEX, 1996). Por muito tempo, ele foi considerado farmacologicamente inativo (MEZZETTI et al., 1971). Por causa disto, o ácido ursólico e seus sais alcalinos (ursolato de potássio ou sódio) foram exclusivamente usados como agentes emulsificantes em preparações farmacêuticas, cosméticas e alimentares (MEZZETTI et al., 1971; HARRY et al., 1973). Entretanto, descobriu-se que o ácido ursólico era ativo medicinalmente tanto na forma tópica quanto ingerido. Suas propriedades antiinflamatória tópica, antitumoral (câncer de pele) e antimicrobiana fizeram-no muito utilizado em aplicações dermatológicas (LIU, 1995). Plantas medicinais que contém ácido ursólico (responsável por sua eficiência terapêutica) eram usadas na medicina popular antes de serem conhecidos seus constituintes químicos. Pesquisas científicas atuais que levaram ao isolamento e identificação do ácido ursólico revelaram e confirmaram que vários efeitos farmacológicos, tais como antitumoral, hepatoprotetor, antiinflamatório (oral e tópico), antiúlcera, antimicrobiano, anti-hiperlipidêmico e antiviral podem ser atribuídos ao ácido ursólico (LIU, 1995). O ácido ursólico demonstrou várias atividades biológicas: antiprotease HIV-1 (XU et al., 1996), antiinvasiva nas células humanas de fibrosarcoma metastático (HT 1080), inibição do ciclo celular na fase G1 de células de câncer de mama (MCF- CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H H H H CH2 CH3 RO COOH 27 7), atividade inibitória de tumor de pele (AHN et al., 1998) e atividade antiinflamatória (SAFAYHI et al., 1997). Atividades biológicas contra microrganismos têm sido relatadas para inúmeros triterpenos, sendo que vários derivados do ácido oleanólico apresentam significativa atividade fungicida apenas quando possuem na estrutura um ácido carboxílico livre nos carbonos C-27 ou C-29 (DAS et al., 1983). A atividade antiinflamatória de triterpenos foi determinada para diversos derivados do ácido oleanólico e do ácido glicirretínico (DAS et al., 1983). O olean-12-ene-3-β-0-diol, com atividade antiinflamatória, antiulcerogênica e antialérgica apresenta menores efeitos colaterais que o ácido glicirretínico. Destacam-se também os triterpenos ácidos: 3-β-acetoxiolean-12-eno-27-óico e 2α, 3α-diidroxi-olean-5,12-dieno-28-óico; 2β,3α-diacetoxi-olean-5,12-dieno-28-óico e 2α,3β-diacetoxi- 18-hidroxi-olean-5,12-dieno-28-óico, os quais exibiram atividade antiinflamatória. Assim como o moretenol e o neolupanol, além dos acetatos de taraxasterol e moretenol (MAHATO et al., 1997). Os derivados do fridelano, ácidos 3-oxofridelan-29-óico, 3-oxofriedelan-28-óico e 28,29- diidroxifriedelan-3-ona exibiram atividade contra células de câncer de pulmão A-549. O ácido 3- oxofriedelan-28-óico mostrou-se também ativo contra células tumorais dos tipos L-1210 e KB (MAHATO et al., 1997). O lupeol foi avaliado por seus efeitos antiinflamatórios e antipiréticos em ratos e camundongos. Ele exerceu efeito significativo em processos inflamatórios agudos e crônicos, mas não possui propriedades analgésicas ou antipiréticas (SINGH et al., 1997). Os triterpenos com esqueletos lupânico e nor-lupânico são descritos na literatura como ativos contra o vírus HIV, destacando-se entre eles os ácidos betulínico e platônico. Estudos compararam o efeito do AZT a esses ácidos e aos derivados do ácido betulínico, comprovando uma potente atividade das substâncias com esqueleto lupânico contra o vírus HIV (FUJIOKA et al., 1994). A atividade anti-HIV dessas substâncias parece estar relacionada com os substituintes nas posições 3, 19 e 28. Ao triterpeno ácido betulínico foi relacionada uma atividade antimalárica in vitro moderada a boa contra o parasita da malária humana, Plasmodium falciparum. A ele foi também atribuída uma grande variedade de atividades biológicas, entre elas atividade antitumoral contra melanoma humano (BRINGMANN et al., 1997). A comparação da atividade anti-HIV do ácido betulínico (MAYAUX et al., 1994) e dos seus derivados (KASHIWADA et al., 1996; EVERS et al., 1996; SOLER et al., 1996; PISHA et al., 1995; FULDA et al., 1999; RECIO et al., 1995; RIBEIRO et al., 2005), do ácido platânico (HOMANS et al., 1970) e do ácido diidrobetulínico (MUKHERJEE et al., 1997) mostra claramente que a esterificação do -OH em C-3 com os grupos acetila (SOLER et al., 1996), benzoíla (PISHA et al., 1995), crotonila (FULDA et al., 1999), sulfonila (RECIO et al., 1995) e succinila (RIBEIRO et al., 2005) conduz a um decréscimo da atividade sugerindo que, quando o grupo -OH em C-3 está livre, as substâncias estruturalmente relacionadas apresentam uma atividade anti-HIV mais acentuada (KASHIWADA et al., 1996; EVERS et al., 1996; SOLER et al., 1996; PISHA et al., 1995; FULDA et al., 1999; RECIO et al., 1995; RIBEIRO et al., 2005). Substituintes na posição 19 aumentam ou diminuem a atividade mostrando que esta porção é importante para uma boa atividade anti-HIV, sendo essencial também o grupo carboxila em C-28 (FUJIOKA et al., 1994). Pesquisas recentemente desenvolvidas têm demonstrado que o ácido 28 betulínico e alguns dos seus derivados desempenharam um papel relevante como potentes inibidores seletivos da replicação do vírus HIV tipo 1 (MAYAUX et al., 1994; KASHIWADA et al., 1996; EVERS et al., 1996; SOLER et al., 1996), como inibidores de tumores (PISHA et al., 1995; FULDA et al., 1999), como antimaláricos (BRINGMANN et al., 1997), e como agente antiinflamatório (RECIO et al., 1995; RIBEIRO et al., 2005). O ácido betulínico está sendo atualmente utilizado em ensaios pré-clinicos para o tratamento e prevenção de melanomas malignos (PISHA et al., 1995). 1.3. Descrição botânica da familia Sapotaceae. Plantas da família Sapotaceae são encontradas nas regiões tropicais e subtropicais como arbustos e árvores. Algumas plantas produzem látex. As folhas são espirais arranjadas ou alternadas. Espécies desta família possuem flores de simetria radial. Alguns gêneros dessa família possuem frutos comestíveis como a Mimusops, Manilkara, Pouteria. Mimusops elengi também conhecida como abricó-da-praia, é encontrada em regiões subtropicais. Ocorre principalmente no litoral porque tolera bem solos arenosos e salinos. A árvore pode chegar a dez metros de altura e é muito usada para ornamentação. O fruto é doce, possuindo casca resistente e polpa farinhosa. Pode ser comido, mas só quando bem maduro. Antes disso, produz um látex branco e pegajoso (Figura 3). Possui elevada concetração de vitamina C. Ele é utilizado na medicina popular como adstringente (SHAH et al., 2003). Online: PHUMCHOOSRI, A. Mimusops elengi. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. TRADE WINDS FRUIT. Mimusops elengi. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. Figura 3: Folhas e frutos de Mimusops elengi. Manilkara zapota também conhecida como sapoti, se desenvolve em regiões de clima mais quente, solos profundos, bem drenados e ricos em matéria orgânica. A árvore pode chegar a vinte metros de altura. Os frutos podem ter diferentes formas, como: esférica, ovóide e achatada e a cor da sua casca é castanho-escura. O fruto possui casca marrom, seca, fina e áspera. A polpa é mole e de coloração amarela para marrom (Figura 4). Tem sabor exótico e adocicado, sendo consumido principalmente ao natural, mas pode ser utilizado no preparo de geléia, sorvete, 29 refresco e xarope. Este é um adstringente poderoso usado em infecções agudas. As sementes são diuréticas. O látex extraído da planta pode ser usado na fabricação de goma de mascar (CORDEIRO, NUNES, 1996). Online: CIRAD, G. C. Manilkara zapota. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. LES FRUITS DE TAHITI ET SES ILES. Manilkara zapota. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. Figura 4: Folhas e frutos de Manilkara zapota. Pouteria caimito também conhecida como abiu, se desenvolve em regiões tropicais e subtropicais, principalmente em solos férteis. A árvore pode atingir de 3 a 8 metros. O fruto tem forma arredondada com casca amarela (Figura 5). A polpa é branca e doce (Online:http://pt.wikipedia.org/wiki/Lucuma_caimito; http://www.agrobyte.com.br/frutas_med.htm#Abiu, Data do acesso: 14 de jan de 2007). Online: CAPE TRIB. Pouteria caimito. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. GAIA YOGA. Pouteria caimito. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. Figura 5: Folhas e frutos de Pouteria caimito. 30 1.4. O gênero Chrysophyllum. Poucas espécies do gênero Chrysophyllum foram investigadas quimicamente, sendo que algumas apresentaram atividades biológicas importantes. Estudos recentes mostram que frutos e folhas desse gênero contêm flavonóides e outros polifenóis (antioxidantes naturais) que reduzem a velocidade de processos oxidativos associados a desordens neurodegenerativas, doença coronária (CHD), arteriosclerose e câncer. As atividades antioxidantes de extratos aquosos de plantas não foram estudadas extensivamente, devido à presença de antioxidantes solúveis em água e açúcares, que podem mascarar a atividade de polifenóis. A polaridade e complexidade de extratos aquosos dos frutos dificultam o isolamento de componentes puros como antocianinas e taninos (GORDON, 1996; WANG et al., 1999). Flavonóides são freqüentemente associados por suas propriedades antioxidantes com a proteção de sistemas biológicos, em especial, membranas lipídicas, contra o estresse oxidativo. A oxidação é um dos maiores causadores de degradação de materiais e alimentos. As espécies com oxigênio reativo, principalmente radicais livres, têm sido reconhecidas como as principais envolvidas em muitas doenças, incluindo as duas maiores causas de morte: câncer e arteriosclerose. Isso tem levado à intensificação de pesquisas relacionadas com as possíveis contribuições de antioxidantes para a prevenção de doenças, já que eles são capazes de remover ou evitar formação de radicais livres ou espécies reativas de oxigênio, evitar reações de degradação oxidativa, exercendo papel fundamental na manutenção do equilíbrio entre fatores pró e antioxidantes nos sistemas biológicos (BORING et al., 1994). O uso de produtos naturais como agentes quimiopreventivos, que inibem os eventos iniciais da formação de tumores, tem sido difundido em função da quantidade crescente de resultados positivos sobre a inclusão de alimentos ricos em antioxidantes na dieta. As antocianinas, uma subclasse da classe de flavonóides, são pigmentos importantes nas flores e nos frutos (Figura 6). Sendo responsáveis pela coloração vermelho, azul e roxo. A cianidina é a antocianidina mais comum, e o seu 3-glicosídeo é o antioxidante mais frequente em plantas. Glicosilação da antocianidina diminui a atividade antioxidante e hidroxilação aumenta a mesma (WANG et al., 1999). R1 R2 Nome OH H Cianidina OCH3 H Peonidina OH OH Definidina OCH3 OH Petunidina OCH3 OCH3 Malvidina H H pelargonidina Figura 6: Antocianinas isoladas de espécies de Chrysophyllum. Muitos produtos naturais ou seus derivados têm mostrado atividade marcante na inibição da proliferação de células tumorais. Antocianinas análogas às obtidas de Chrysophyllum cainito, por OH OH O + OH R1 OH R2 31 exemplo, mostraram-se ativas em bioensaios realizados com linhagens de células tumorais (GUNDRAN et al., 2001). O câncer é a segunda maior causa de morte nos Estados Unidos e no Brasil (cerca de 21%) em regiões desenvolvidas, aumentando ainda mais o índice em regiões subdesenvolvidas (LUO et al., 2002; MORTON, 1987). As duas principais formas de reduzir a mortalidade por câncer são a prevenção e a quimioterapia. Produtos naturais derivados de plantas e seus análogos semi-sintéticos forneceram algumas drogas muito eficientes, usadas como antitumorais: paclitaxel (Taxol), vimblastina (Velban), vincristina (Oncovin) entre outras. Chrysophyllum cainito, geralmente conhecido como “star apple”, é uma árvore nativa da América Central. Seus frutos têm forma de pêra e coloração vermelho púrpura ou verde claro. Quando a fruta é cortada à metade, observa-se a forma de uma estrela de oito segmentos, dando origem ao seu nome popular. A polpa é macia com sabor doce e de aroma agradável. A casca não é comestível. Embora as frutas sejam consideradas muito gostosas, elas são de pequena importância comercial comparado com outras frutas da família Sapotaceae (Figura 7). Esta planta contém uma grande variedade de substâncias químicas com atividade antioxidante. A análise nutricional mostrou que frutos “star apple” possuem alcalóides, saponinas, cardenolídeos e bufadienolídeos, flavonóides, taninos, antraquinonas, além de aminoácidos, β-caroteno, ácido ascórbico, α-tocoferol, terpenos e polifenóis (KING, 1959). O acetato de β-amirina e o ácido gentísico foram identificados nas folhas. Identificaram-se nove componentes antioxidantes nos frutos dessa espécie: (+)-catequina (1), (-)-epicatequina (2), (+)-galocatequina (3), (-)-epigalocatequina (4), quercetina (5), quercitrina (6), isoquercitrina (7), miricetrina (8), e ácido gálico (Figura 8). Online: ARMSTRONG, W. P. Chrysophyllum cainito. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. FRUIT LOVER’S NURSERY. Chrysophyllum cainito. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. THE BANANA TREE. Chrysophyllum cainito. Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. TROPICAL FRUIT PHOTOGRAPHY. Chrysophyllum cainito. . Disponível em: . Acesso em: 12 de jan. de 2007. Figura 7: Folhas e frutos de Chrysophyllum spp. 32 R1 R2 R3 1 (+)-catequina H H H 2 (-)-epicatequina H OH H 3 (+)-galocatequina OH H OH 4 (-)-epigalocatequina H OH OH R1 R2 5 quercetina OH H 6 quercitrina Rha H 7 isoquercitrina Glc H 8 miricetrina Rha OH Figura 8: Flavonóides antioxidantes de espécies de Chrysophyllum. Esta planta contém uma grande variedade de substâncias químicas com atividade antioxidante. Além de seus usos culinários, a fruta “star apple” é usada na medicina popular no tratamento de diabetes mellitus, inflamações associadas com laringites, pneumonia, além de diarréia, febre e doenças venéreas. Estudos epidemiológicos indicam que o consumo dos frutos e das folhas está relacionado inversamente a doenças coronárias e câncer (OBASI, 1991). A loção contendo extrato de Chrysophyllum cainito mostrou condicionamento na pele e efeitos adstringentes, podendo ser utilizado em cosméticos e sais para banho (PARODI,1997). Extratos alcalinos das folhas podem ser utilizados para saponificação (AINA et al., 1999; et al., 1997). Avaliações químicas foram realizadas com a casca e polpa dos frutos comestíveis “star apple” africana (Chrysophyllum albidum), mostrando quantidades significativas de ácido ascórbico e alguns componentes como os taninos, oxalato, ácido hidrociânico, ácido fítico. Geléias preparadas com polpa dos frutos mostraram-se de boa qualidade para comercialização após armazenagem em condições ambientais tropicais (FOUSSARD-BLANPIN et al., 1965). O óleo das sementes secas de “star apple” africana apresentaram ácidos graxos livres, podendo assim ser usado para a preparação de sabão sólido, resina, pintura, polimento e verniz de madeira (SILVA et al., 2003). O extrato de Chrysophyllum perpulchrum mostrou algumas propriedades farmacodinâmicas para a cardiocrisina, como agente hipotensivo por vasodilatação periférica, inibição de colesterase e antiespasmódico fraco (PRATT et al., 1984). 1.5. A éspecie Chrysophyllum flexuosum. A escolha da espécie Chrysophyllum flexuosum para este estudo fitoquímico biomonitorado se deu, principalmente, pelo resultado positivo no teste em CCDC revelada com β-caroteno, indicando a presença de substâncias antioxidantes no extrato etanólico das folhas e ramos desta espécie. Esse extrato apresentou também atividade inibitória de peroxidação lipídica, avaliada em lipossomas e atividade inibitória de cicloxigenases I e II, sugerindo a presença de substâncias que atuem nos processos inflamatórios. R1 R2 OH OH O OH HO O O O OH OH R3 OH HO R2 R1 33 A espécie Chrysophyllum flexuosum é encontrada no estado de São Paulo, principalmente na Mata Atlântica. Ela está na lista das espécies ameaçadas de extinção no Brasil. 2. OBJETIVOS. O trabalho visa realizar o estudo fitoquímico da espécie Chrysophyllum flexuosum a fim de se isolar e determinar a estrutura química das substâncias presentes nas suas folhas e ramos. Através do fracionamento cromatográfico monitorado por testes para detecção de atividade antioxidante, pretende-se isolar as substâncias bioativas destas espécies. Pretende-se também comparar o perfil cromatográfico das frações obtidas com o extrato bruto da espécie Chrysophyllum innornatum e, através do uso de CLAE-UV, CLAE-EM e de substâncias padrão isoladas, identificar os constituintes majoritários das frações analisadas. 3. METOLOGIA. 3.1. MATERIAIS, EQUIPAMENTOS E TÉCNICAS. 3.1.1. Moinho de facas e funil de separação. Foi utilizado um moinho de facas da marca Marconi e um funil de separação. 3.1.2. Solventes. Os solventes utilizados nos processos de extração, fracionamento e isolamento foram grau pA. Synth. Os solventes deuterados utilizados nos processos de RMN foram clorofórmio deuterado (CDCl3), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) e água deuterada (D2O) da marca CIL (Cambridge Isotope Laboratories). 3.1.3. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa e Preparativa. Nas análises por CCDC foi utilizada 0,25mm de sílica gel 60G (Merck). Já em análises por CCDP utilizou-se camadas de 0,75mm de sílica (5-45 μm). Tanto as placas comparativas como as preparativas foram reveladas com irradiação de luz ultravioleta de 254 e 366 nm (aparelho UV-vis CAMAG), por nebulização de solução de anisaldeído seguida do aquecimento da placa em forno e por imersão em cubas com vapores de iodo. A recuperação das amostras, após CCDP, foi efetuada através de lavagens da sílica com solventes orgânicos e filtração em placa porosa. O critério de pureza adotado foi a observação de apenas uma mancha em CCDC, variando-se o sistema de eluentes de baixa até alta polaridade. 34 3.1.4. Cromatografia em Coluna. Na separação cromatográfica em coluna sob pressão foi utilizada sílica gel 60G (0,063- 0,200mm) da Merck, 70-230 mesh para CC “flash”. Também foi utulizada para frações mais polares Sephadex LH-20 (25-100μm – Pharmacia Biotech) e sílica derivatizada (C–18). 3.1.5. Rotaevaporador. As concentrações das soluções foram efetuadas em rotaevaporador sob pressão reduzida (Buchi). 3.1.6. Ultra-som. Lavadora ultra-sônica modelo USC-2800 da marca Unique. 3.1.7. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Foi utilizado espectrômetro Brucker AC-200F operando a 200 MHz para 1H e 50MHz para 13C. Também utilizou-se o espectrômetro Varian, INOVA 500 “multi65” operando a 500 MHz para 1H e 125 MHz para 13C (11.7T). 3.1.8. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Cromatógrafo analítico com sistema ternário Varian Pro Star PS 230 e detector UV-arranjo de diodo modelo PS310. Coluna analítica “Luna” Phenomenex LC-18 (250mm x 4,60mm). Cromatógrafo analítico sistema ternário Varian Pro Star modelo PS 230 com auto injetor Varian Pro Star modelo PS 410 e detector UV-arranjo de diodo modelo 330. Coluna analítica “Luna” Phenomenex LC-18 (250mm x 4,60mm). Cromatógrafo analítico sistema ternário Shimadzu LC 10 AD com injetor automático SIL 10A Shimadzu, detector de arranjo de diodo SPD-M 10 AVP. Coluna analítica Supelco LC-18 (250mm x 4,60 mm). Cromatógrafo preparativo sistema ternário Varian Prep Star modelo SD-1 e detector Variam Pro Star UV-VIS modelo 320. Coluna preparativa “Luna” Phenomenex LC-18 (250mm x 21,2mm). 3.2. ENSAIOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS. 3.2.1. Autografia em CCDC com β-caroteno para atividade antioxidante. 35 A atividade antioxidante em CCDC revelada com solução de β-caroteno foi realizada por mim no NuBBe – Instituto de Química da Unesp Campus de Araraquara. A propriedade antioxidante pode ser detectada nas substâncias com estruturas químicas que têm capacidade de doar um hidrogênio radicalar (reação com quebra homolítica), estabilizando facilmente o elétron desemparelhado remanescente na sua estrutura, através de ressonância. As amostras foram aplicadas em cromatoplacas em duplicata, eluídas com solventes específicos e adequados, escolhidos anteriormente por testes utilizando eluentes de diversas polaridades para que, cada substância existente nas frações e extratos tivesse um Rf entre 0,2 e 0,8. Após completa evaporação do solvente utilizado, uma das placas foi nebulizada com solução de β-caroteno em MeOH (0,02%), permanecendo amarelada e, em seguida expostas à luz. O β- caroteno é oxidado pelo oxigênio atmosférico, numa reação fotoquímica e após cerca de quatro horas percebe-se que a placa de sílica volta à cor original branca, exceto nas áreas onde existam substâncias com atividade antioxidante, verificando-se a permanência da coloração amarela do β- caroteno. Em seguida, a outra placa foi nebulizada com solução de anisaldeído sulfúrico e colocada na estufa para aquecimento. Então comparou-se os Rf das substâncias nas duas placas (PRATT et al., 1984). 3.2.2. Ensaio colorimétrico com 2,2-difenil-picriehidrazila (DPPH) – detecção do potencial sequestrador de radicais livres. A detecção do potencial sequestrador de radicais livres foi realizada por mim com o auxilio da Dra. Patricia Pauletti no NuBBe – Instituto de Química da Unesp Campus de Araraquara, Em solução, o radical DPPH apresenta cor violeta intensa que é consequência do életron desemparelhado. Esse radical absorve a 517nm e um decréscimo nesse comprimento de onda ocorre pela estabilização do radical através do recebimento de um hidrogênio radicalar da espécie antioxidante, que é indicada pela mudança de cor (Figura 9). N N NO2 NO2 O2N N NH NO2 NO2 O2N DPPH (DPPH) H reduzido (máxima absorção a 517nm) (diminuição na absorção a 517nm) Figura 9: Redução do radical difenil-picrielhidrazila (DPPH). + RH antioxidante 36 A solução a 0,004% (2mL) de DPPH é utilizada como fonte de radicais livres e adicionada à soluções de diferentes concentrações (5, 10, 20, 40, 80 e 100µmol.mL-1) das amostras a serem testadas. Após 30 minutos de reação, realiza-se a leitura da absortividade molar destas soluções a 517nm. O decréscimo na absortividade molar expressa o potencial antioxidante da amostra teste que é representada por uma curva da concentração pela porcentagem da variação da absortividade molar (ΔA) (RIBEIRO, A. B. et al., 2005). 3.2.3. Avaliação da atividade antifúngica – fungos fitopatogênicos. Os ensaios são realizados no laboratório do Instituto Botânico de São Paulo sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marse Young, utilizando como reveladores, soluções de esporos das espécies de fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporoides e Cladosporium sphaerospermum. Em cromatoplacas (Merck), as amostras foram aplicadas e eluídas em solventes adequados. Após a secagem destas cromatoplacas, uma solução de glicose e sais contendo esporos do fungo foi nebulizada sobre as placas que foram incubadas à temperatura de 25º C em câmara úmida e escura por 2-3 dias. O halo de inibição aparece na placa sobre áreas onde existam substâncias fungitóxicas e este halo pode ser relacionado com a concentração da amostra aplicada, comparando-se o limite de detecção com os padrões utilizados, os antibióticos nistatina e gentamicina (HOMANS et al., 1970). 3.2.4. Detecção da atividade anticolinesterásica. O ensaio qualitativo e quantitativo por bioautografia CCD são realizados no laboratório do Instituto Botânico de São Paulo sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marse Young. Este consiste no desenvolvimento de uma cromatoplaca da substância em análise, juntamente com um controle positivo inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE) (galantamina, Figura 10). Para os ensaios quantitativos (Concentração Inibitória Mínima – CIM) foram aplicadas quantidades conhecidas e em ordem decrescente de massa, do controle e da amostra, objetivando encontrar a menor quantidade inibidora de AChE, que possa ser observada visualmente. Após o desenvolvimento da cromatografia a placa foi borrifada com a solução da enzima AChE (6,66 U) (Solução A) e o solvente evaporado. A placa cromatográfica foi incubada em câmara úmida fechada a 37º C por 20 minutos, e em seguida borrifada com a Solução D que é a mistura de 10mL da solução B (250mg de acetato de 1-naftila em 100mL de etanol ) mais 40mL da solução C (400mg do sal Fast Blue B em 160mL de água destilada) (MARSTON, A. et al., 2002). 37 OH3CO OH N CH3 Figura 10: Galantamina, controle positivo nos ensaios de inibição da AChE. A coloração roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de mancha branca (indicação de inibição da reação enzimática), sobre um fundo de coloração roxa indica que houve inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase. A Figura 11 mostra um esquema das reações que se sucedem até o aparecimento da coloração na cromatoplaca (MARSTON, A. et al., 2002). Os resultados foram observados e fotografados em câmara fotográfica Epson e os valores de Rf calculados para os halos onde houve inibição da enzima. Soluções: Solução A: Acetilcolinesterase (1000U, Sigma, produto nº C2880) dissolvida em 150mL do tampão Tris-HCl (0,05M; Ph=7,9), a solução estoque será armazenada a 4 º C, no momento do uso será adicionado 0,1% de albumina de soro bovino fração V; Solução B: 250mg de acetato de 1-naftila em 100mL de etanol; Solução C: 400mg do sal Fast Blue B em 160mL de água destilada; Solução D: mistura de 10mL da solução B + 40mL da solução C. 38 AChE acetato de 1-naftila α-naftol OH N N H3CO OCH3 N N OH Corante azóico (roxo) Figura 11: Reação da AChE com acetato de 1-naftila e subsequente formação do corante azóico roxo no bioensaio em CCD. 3.2.5. Avaliação da atividade antifúngica – fungos patógenos humanos. Os ensaios são realizados no Laboratório Micologia Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara sob a supervisão da Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini. A avaliação da atividade antifúngica e determinação das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) foram realizadas por meio da técnica de microdiluição com adaptações, de acordo com os documentos M27-A e M-A2 do National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). O meio de cultura utilizado foi RPMI 1640, suplementado com 2% de glicose (a concentração de MOPS é de 0,165M). Esteriliza-se por filtração em membrana 0,22μm a vácuo. Reserva-se. Prepara-se o ágar duas vezes concentrado: 30g/L. Autoclava-se e mantém-se a 65°C. Mistura-se as duas soluções em ambiente estéril e preparam-se placas deixando altura de 9mm ou uma razão de 20mL por placa de acordo com NATIONAL COMMITTE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS, NCCLS, 1997 (1-2) apud MONTEIRO, 20061. O preparo do inóculo é feito através de repiques de 24 a 48h a 30°C. Ressuspende-se uma alçada da amostra em 5mL de solução salina a 85% e realiza-se contagem em câmara de 1 NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. M27-A. 1997. 2 NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. M27-A2. 1997. OHOCOCH3 + CH3COOH OCH3 H3CO N + N + N N 39 Neubauer. Prepara-se a suspensão equivalente a 1x106 – 5x106UFC/mL. O volume da solução a ser inoculada na placa é de 1mL. Incuba-se a 35°C, durante 24 a 48h. Anfotericina B é utilizada como controle a 16μg/mL. O resultado é avaliado medindo-se o tamanho dos halos de inibição através da medida total do diâmetro pelo verso da placa. Microorganismos utilizados: Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei, Cryptococcus neoformans. Estes ensaios foram realizados sob supervisão da Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Gianinni - Faculdade de Fármacia de Araraquara – Deapartamento de Micologia – Unesp. 3.3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS. 3.3.1. Coleta e identificação do material vegetal. Folhas e ramos de Chrysophyllum flexuosum foram coletadas na Reserva da Juréia – Parque Estadual da Serra do Mar, em outubro de 2004, pela Dra. M. Claudia M. Young e identificadas pela Dra. Inês Cordeiro. Excicatas encontram-se depositadas no Herbário do Jardim Botânico de São Paulo. 3.3.2. Obtenção do extrato bruto. Folhas e ramos de Chrysophyllum flexuosum foram secos a temperatura ambiente, triturados em moinho de facas e pesados numa balança analítica, obtendo-se 400g. Estas foram submetidas a 5 extrações com etanol em banho de ultra-som, fornecendo o Extrato Etanólico (EE). Após evaporação do solvente em rotaevaporador e secagem em capela, o EE seco foi pesado, fornecendo 29,82g de extrato bruto. 3.3.3. Partição do extrato bruto EtOH. Foram separadas duas alíquotas do extrato etanólico seco: a primeira, de 100 mg reservado para contra-prova, e a segunda, de 5 mg para realização de CCDC em placas cromatográficas para comparação com as frações da partição. O restante do extrato foi dissolvido em 400 mL de MeOH/H2O e submetido a partição líquido-líquido com solventes orgânicos, fornecendo quatro frações de polaridades crescentes: fração hexânica (FH), fração AcOEt (FAc), fração n-butanol (FB) e fração hidrometanólica (FM) (Fluxograma 1). Destas quatro frações foram guardadas alíquotas de 20mg para contra-prova e CCDC. 40 EtOH (5 x 500mL) Concentrar em rotaevaporador e secar em capela Dissolver em MeOH/H2O (9:1), 400mL Hexano (3 x 200mL) Concentrar em rotaevaporador Secar em capela Adicionar água AcOEt (3 x 200mL) Concentrar em rotaevaporador n-butanol (3 x 200mL) Secar em capela Concentrar em rotaevaporador Concentrar em rotaevaporador Secar em capela Secar em capela Fluxograma 1: Partição do extrato EtOH bruto. 3.3.4. Avaliação da atividade antioxidante. O EE e as frações obtidas da partição (FH, FAc, FB e FM) foram submetidos a análises por CCDC, utilizando-se uma série de eluentes que permitem a visualização dos constituintes de baixa, média e alta polaridade (Tabela 1). Inicialmente foi utilizado como revelador o anisaldeído sulfúrico para a verificação de sistemas de eluição com boa resolução nas placas. Extrato EtOH (EE) seco (29,82g) Extrato MeOH/H2O (9:1) Fração Hexânica Fração MeOH/H2O (9:1) Fração MeOH/H2O (6:4) Fração Hexânica (FH) (4,05 g) Fração n-butanol Fração MeOH/H2O Fração MeOH/H2O (FM) (7,46 g) Fração n-butanol (FB) (3,23 g) Fração AcOEt Fração MeOH/H2O Fração AcOEt (FAc) (3,07 g) Folhas e ramos secos triturados (400g) 41 Tabela 1: Fases móveis utilizadas na CCDC para o EE e suas sub-frações. Fases Móveis Fração Hex/AcOEt (9:1) EE, FH, FAc Hex/AcOEt (4:1) EE, FH, FAc Hex/AcOEt (1:1) EE, FH, FAc AcOEt EE, FH, FAc Hex/AcOEt (1:4) EE, FH, FAc AcOEt/MeOH (4:1) EE, FH, FAc, FB AcOEt/MeOH (1:1) EE, FH, FAc, FB AcOEt/MeOH (1:9) EE, FH, FAc, FB AcOEt/MeOH/H2O (65:30:5) EE, FH, FAc, FB, FM Em seguida, as amostras foram aplicadas em duas cromatoplacas e eluídas simultaneamente na mesma cuba. Os sistemas de eluição utilizados foram aqueles selecionados em função da boa resolução em CCDC revelada com anisaldeído. Após eluição completa e evaporação do solvente, uma placa foi nebulizada com solução de β-caroteno em MeOH (0,02%) e em seguida exposta à luz natural. Durante cerca de 4 horas observou-se o descoramento da placa e a possível permanência de manchas laranjas. Observou-se que as frações FAc, FB e FM deram resultado positivo no teste com β-caroteno. A segunda placa foi revelada com anisaldeído e comparada com a primeira placa. 3.3.5. Fracionamento cromatográfico da fração hexânica. A FH foi selecionada para o início dos estudos fitoquímicos. Esta fração (1,6 g) foi submetida a CC flash com sílica-gel, que forneceu 8 subfrações (Tabela 2). Esta foram submetidas a CCDC em várias fases móveis. Tabela 2: Eluição de FH em CC (sílica mesh 70-230). Fração Eluentes Volume do Eluente Massas (mg) FH1 Hex/AcOEt (9:1) 200mL 556,7 FH2 Hex/AcOEt (4:1) 200mL 73,9 FH3 Hex/AcOEt (7:3) 200mL 115,1 FH4 Hex/AcOEt (3:2) 200mL 62,6 FH5 Hex/AcOEt (1:1) 200mL 33,0 FH6 AcOEt 200mL 79,0 FH7 AcOEt/MeOH (3:2) 200mL 48,9 FH8 MeOH 200mL 552,0 Observou-se que a primeira subfração, denominada FH1, após secagem possuia 1/3 de massa da fração hexânica inicial. Esta apresentou coloração amarela. Após eluição com Hex/AcOEt (9:1) em CCDC, verificou-se a presença de duas manchas separadas que revelaram na coloração roxa com anisaldeído sulfúrico. Com o objetivo de isolar as substâncias aí presentes, esta fração foi aplicada em CC flash com sílica gel eluída com gradiente mais suave de solventes orgânicos (Tabela 3) fornecendo 6 subfrações. No entanto, a análise por CCDC das frações obtidas mostrou que não houve separação das duas manchas referentes às substâncias principais de FH-1. 42 Tabela 3: Eluição de FH1 em CC (sílica mesh 70-230). Fração Massas (mg) Eluentes FH1-1 61,8 Hex FH1-2 118,2 Hex/AcOEt (98:2) FH1-3 117,9 Hex/AcOEt (97,5:2,5) FH1-4 133,8 Hex/AcOEt (95:5) FH1-5 32,2 Hex/AcOEt (92,5:7,5) FH1-6 1,4 Hex/AcOEt (9:1) Com bases nas massas obtidas, selecionou-se FH1-1 para separação por CCDP (Hex/AcOEt 9:1) em 3 placas cromatográficas, fornecendo quatro subfrações (Tabela 4). Estas foram submetidas a análise de RMN (1H, 13C, HMQC, HMBC e g-COSY), e as subfrações FH1-1-c e FH1-1-b apresentaram as substâncias 1 (inédita), 2 e 3 (Fluxograma 2). CC flash sílica gel 70-230 mesh gradiente Hex/AcOEt/MeOH) Hex/AcOEt (9:1) CC flash (sílica gel 70-230 mesh, gradiente Hex/AcOEt) Reunir as frações CCDP Hex/AcOEt (9:1) CLAE preparativo, fase móvel MeOH/CH2Cl2 (9:1), fluxo 18mL/min, λ 215nm Fluxograma 2: Fracionamento cromatográfico da FH1. Tabela 4: Fração obtidas de FH1-1 por CCDP (Hex/AcOEt 9:1). Fração Rf Massas (mg) RMN de 1H Substâncias identificadas FH1-1-a 0,0 a 0,4 5,8 * FH1-1-b 0,5 20,4 * 1, 2 e 3 FH1-1-c 0,7 32,2 * 1 e 2 FH1-1-d intermediário 3,0 * * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). Comparando os espectros de RMN (1H, 13C, HMQC, HMBC e g-COSY) com os dados da literatura (OLEA et al., 1990; MAHATO et al., 1994) observou que a substância 1 é inédita na Substâncias 1, 2 e 3 Substâncias 1 e 2 FH1 (556,7mg) FH (1,6g) FH1-1-b (20,4mg) FH1-1-c (32,2mg) FH1-1 (61,8 mg) FH1-2 - FH1-6 FH1-Y (494,9 mg) FH1-Y-2 (3,3mg) Substância 1 43 literatura. Com o objetivo de isolar a mesma para determinar sua estrutura, reuniu-se as subfrações de FH1-2 a FH1-6, na fração FH1-Y. A análise CLAE (λ 201nm e λ 215nm) foi realizada utilizando como fase móvel MeOH/CH2Cl2 (9:1), fluxo de 1mL/min para verificar sua composição (Figura 12). Devido ao resultado satisfatório a fração foi submetida a CLAE preparativo, λ 215nm, fase móvel MeOH/ CH2Cl2 (9:1), fluxo 18mL/min. As frações foram recolhidas (Tabela 5) e analisadas por RMN de 1H, e FH1-Y-2 apresentou a substância 1. Essa foi submetida a análises adicionais de RMN (13C, HMQC, HMBC e g-COSY) para determinação estrutural. Figura 12: Cromatogramas obtidos via CLAE da FH1-Y (494,9mg), (coluna analítica “Luna” Phenomenex LC-18, fase móvel MeOH/CH2Cl2 9:1, fluxo de 1mL/min, λ 201nm e λ 215nm) Tabela 5: Frações obtidas da FH1-Y por CLAE preparativo (MeOH/ CH2Cl2 (9:1), fluxo 18mL/min, λ 215nm). Fração Rf (min) Massas (mg) RMN de 1H Substância identificada FH1-Y-1 0 a 10 15,7 * FH1-Y-2 10,7 4,9 * 1 FH1-Y-3 11,6 3,3 * FH1-Y-4 15,7 4,6 * FH1-Y-5 20,0 4,4 * FH1-Y-6 25,7 2,3 * FH1-Y-7 28,2 2,9 * FH1-Y-8 29,6 16,0 * FH1-Y-9 32,0 66,5 * * Amostras submetidas a análise por RMN em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). A FH2 foi submetida a CC flash com sílica gel utilizando o mesmo gradiente de eluentes para FH1 (Tabela 3), e forneceu 73 subfrações. Estas subfrações foram analisadas por CCDC (Hex/AcOEt 8:2) e devido ao perfil cromatográfico, foram reunidas em 14 subfrações (Tabela 6). Estas subfrações foram submetidas a CCDC em diversos eluentes e as frações com melhor resolução foram analisadas por RMN de 1H. Devido o espectro de RMN de 1H da fração FH2-9, esta foi submetida a CCDP (Hex/AcOEt 9:1) fornecendo 4 subfrações (Tabela 7). Estas foram analisadas por RMN de 1H, e escolheu-se a FH2-9-2 para purificação devido ao seu espectro de 44 RMN de 1H. Análises adicionais por RMN de 13C, HMQC, HMBC e g-COSY permitiram identificar as substâncias 4, 5 e 6 nesta fração (Fluxograma 3). Tabela 6: Eluição de FH2 em CC (sílica mesh 70-230, gradiente Hex/AcOEt). Fração Massas (mg) RMN de 1H FH2-1 8,6 FH2-2 3,4 FH2-3 9,9 FH2-4 3,4 FH2-5 2,7 FH2-6 5,0 FH2-7 7,4 FH2-8 7,8 * FH2-9 20,4 * FH2-10 4,2 * FH2-11 6,5 FH2-12 8,2 FH2-13 12,1 * FH2-14 6,7 * Amostras submetidas a análise por RMN em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). Tabela 7: Fração obtidas de FH2-9 por CCDP (Hex/AcOEt 9:1). Fração Rf Massas (mg) RMN de 1H Substâncias identificadas FH2-9-1 0,0 à 0,4 1,5 * FH2-9-2 0,5 13,0 * 4, 5 e 6 FH2-9-3 0,7 4,1 * FH2-9-4 0,8 1,0 * * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). A fração FH3 foi submetida a CC flash com sílica gel utilizando o mesmo gradiente de eluentes usado para FH1 (Tabela 3), fornecendo 83 subfrações, que foram analisadas por CCDC (Hex/AcOEt 7:3) e reunidas em 15 subfrações devido à semelhança de seus perfis cromatográficos (Tabela 8). Após a análise por CCDC destas frações em diversos eluentes, escolheu-se as frações com melhor resolução em placa cromatográfica. FH3-2, FH3-3, FH3-4 e FH3-5 foram reunidas na fração FH3-X devido ao perfil cromatográfico semelhante. Após análise por CCDC em vários eluentes, selecionou-se Hex/AcOEt (9:1) para realização de CCDP (Hex/AcOEt 9:1, 3 x). A análise de RMN de 1H das 5 subfrações obtidas evidenciou material graxo. 45 Tabela 8: Eluição de FH3 em CC (sílica mesh 70-230, gradiende Hex/AcOEt). Fração Massas (mg) RMN de 1H FH3-1 9,7 * FH3-2 4,0 * FH3-3 2,7 * FH3-4 13,6 * FH3-5 7,8 * FH3-6 1,7 FH3-7 1,9 FH3-8 1,3 FH3-9 1,9 FH3-10 5,5 FH3-11 8,2 FH3-12 3,4 FH3-13 1,6 FH3-14 1,9 FH3-15 40,4 * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). As frações FH4, FH5, FH6 e FH7 foram submetidas a CCDC em diversos eluentes e pode-se selecionar as frações com melhor resolução cromatográfica. A FH4 foi submetida a CCDP (Hex/AcOEt 8:2), fornecendo 5 subfrações (Tabela 9) que foram analisadas por RMN de 1H. Observou-se na FH4-1 uma substância de interesse, porém impura, realizando-se novamente CCDP (Hex/AcOEt 95:5, 3 x) que forneceu 6 subfrações (Tabela 10). A análise por RMN de 1H destas subfrações mostrou que a substância de interesse estava na FH4-1-4. Foi realizada análise por RMN (1H, 13C, HMQC, HMBC e g-COSY), que indicou a presença da substância 7 em FH4-1-4 (Fluxograma 3). A FH4-4 foi submetida a CCDP (Hex/AcOEt 7:3) fornecendo 2 subfrações que foram analisadas por RMN de 1H e observou-se a presença de material graxo. Tabela 9: Frações obtidas de FH4 por CCDP (Hex/AcOEt 8:2). Fração FH4 Rf Massas (mg) RMN de 1H FH4-1 0,0 à 0,2 19,7 * FH4-2 0,3 5,1 * FH4-3 0,4 9,8 * FH4-4 0,5 17,8 * FH4-5 0,7 9,9 * * Amostras que foram submetidas a análise em espectrômetro Brucker AC-200F operando a 200 MHz para 1H. Tabela 10: Frações obtidas de FH4-1 por CCDP (Hex/AcOEt 95:5, 3x). Fração FH4-1 Rf Massas (mg) RMN de 1H Substâncias identificadas FH4-1-1 0,0 à 0,2 2,5 * FH4-1-2 0,3 2,1 * FH4-1-3 0,4 2,2 * FH4-1-4 0,5 5,3 * 7 FH4-1-5 0,6 4,2 * FH4-1-6 0,7 2,6 * * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). 46 CC flash com sílica gel 70-230 mesh gradiente Hex/AcOEt/MeOH Hex/AcOEt (8:2) Hex/AcOEt (6:4) CC flash com sílica gel 70-230 mesh CCDP Hex/AcOEt (8:2) gradiente Hex/AcOEt CCDP (Hex/AcOEt 9:1) CCPD Hex/AcOEt (95:5) 3x Fluxograma 3: Fracionamento cromatográfico parcial da FH. A análise de FH7 por CCDP (Hex/AcOEt 7:3) forneceu 7 subfrações (Tabela 13). Sua análise por RMN de 1H indicou a ausência de substâncias de interesse. 3.3.6. Fracionamento cromatográfico da fração acetato de etila. Com objetivo da procura de substâncias com atividade antioxidante nas três frações de partição do extrato bruto: FAc, FB e FM, que se mostraram ativas frente ao teste com β-caroteno, foi escolhida a FAc para prosseguimento do estudo. Esta fração (1,5g) foi submetida a CC (Sephadex LH-20) eluída com MeOH fornecendo 135 subfrações. Estas foram submetidas a análise por CCDC (AcOEt/MeOH 1:1) e reunidas em 14 subfrações devido seu perfil cromatográfico semelhante (Tabela 11). Tabela 11: Eluição de FAc em CC (Sephadex) eluída com MeOH. Com as frações descritas na tabela acima realizou-se análise por CCDC com diversas fases móveis. Em seguida, realizou-se o teste de atividade antioxidante com β-caroteno em CCDC Fração Massas (mg) Fração Massas (mg) FAc 1 106,8 FAc 8 64,3 FAc 2 284,1 FAc 9 139,5 FAc 3 148,7 FAc 10 51,9 FAc 4 56,6 FAc 11 44,3 FAc 5 21,5 FAc 12 66,3 FAc 6 20,7 FAc 13 44,9 FAc 7 624,0 FAc 14 178,2 FH (1,6g) FH2 (73,9mg) FH2-9 (20,4mg) FH4 (62,6mg) FH4-1 (19,7mg) Substâncias 4, 5 e 6 FH4-1-4 (5,3mg) Substância 7 47 (AcOEt/MeOH 1:1). As frações FAc 1 e FAc 7 deram resultado positivo e foram submetidas a CC utilizando como fase estacionária sílica derivatizada (C–18) eluída em gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro (Tabelas 12 e 13) (Fluxograma 4). Em busca de substâncias com atividade antioxidante realizou-se o teste com β-caroteno em CCDC (AcOEt/MeOH 1:1) nas 8 subfrações da FAc 1 e as 14 subfrações da FAc 7 (Tabelas 12 e 13). CC Sephadex LH-20 CC (C-18 derivatizada) Gradiente H2O/MeOH CC (C-18 derivatizada) Gradiente H2O/MeOH Fluxograma 4: Fracionamento das subfrações com resultados positivos em testes de atividade antioxidante. Tabela 12: Eluição de FAc1 em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH. Fração Eluentes Massas (mg) Teste com β-caroteno FAc1-1 H2O/MeOH (95:5) 6,0 FAc1-2 H2O/MeOH (9:1) 3,8 FAc1-3 H2O/MeOH (8:2) 3,8 FAc1-4 H2O/MeOH (7:3) 3,8 FAc1-5 H2O/MeOH (6:4) 4,4 FAc1-6 H2O/MeOH (5:5) 4,8 FAc1-7 H2O/MeOH (2,5:7,5) 4,3 FAc1-8 MeOH 38,3 ** ** Amostras com atividade antioxidante moderada. FA (1,5g) FA1 (139,5mg) FA1-8 (38,3mg) FA7 (624,0mg) FA7-4 (14,2mg) FA7-5 (38,3mg) FA7-6 (10,5mg) FA7-9 (21,7mg) FA7-10 (45,8mg) FA7-11 (96,0mg) 48 Tabela 13: Eluição de FAc7 em CC (sílica C-18) com gradiente de H2O/MeOH. Fração Eluentes Massas (mg) Teste com β-caroteno FAc7-1 H2O/MeOH (95:5) 31,6 FAc7-2 H2O/MeOH (9:1) 6,2 FAc7-3 H2O/MeOH (8:2) 7,1 FAc7-4 H2O/MeOH (7:3) 14,2 ** FAc7-5 H2O/MeOH (6:4) 38,3 ** FAc7-6 H2O/MeOH (1:1) 10,5 ** FAc7-7 H2O/MeOH (4:6) 8,1 FAc7-8 H2O/MeOH (3:7) 6,1 FAc7-9 H2O/MeOH (2:8) 21,7 *** FAc7-10 H2O/MeOH (1:9) 45,8 *** FAc7-11 MeOH 96,0 *** FAc7-12 MeOH 16,6 FAc7-13 MeOH 5,3 FAc7-14 MeOH 4,3 ** e *** Intensidade moderada e forte, respectivamente, das atividades antioxidantes observadas. As frações que se mostraram ativas ao teste com β-caroteno foram analisadas em CCDC em diversas fases móveis e submetidas a CLAE (gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro durante 30 min., em comprimentos de onda de λ 240 e λ 254 mn , fluxo de 1mL) para verificação de seu perfil cromatográfico (Figuras 13-16) (Fluxograma 4). Os cromatogramas da subfração da FAc1 e FAc7-11 não apresentaram picos com tempos de retenção que possibilitassem boa resolução. Figura 13: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc1-8 (38,3mg) e FAc7-4 (14,2mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) 49 Figura 14: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-5 (38,3mg) e FAc7-6 (10,5mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) Figura 15: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-9 (21,7mg) e FAc7-10 (45,8mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e 254nm) 50 Figura 16: Cromatograma obtido via CLAE da FAc7-11 (96,0mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 235nm) As frações FAc7-9 e FAc7-10 foram analisadas por RMN de 1H, mostrando sinais característicos de misturas de triterpenos glicosilados (Fluxograma 4) . A FAc7-11 foi submetida a CCDP utilizando como fase móvel AcOEt/MeOH/H2O (86:12:2), fornecendo 5 subfrações (Tabela 14). Estas foram submetidas a análise por RMN de 1H, observando-se também sinais para misturas de triterpenos glicosilados nas cinco subfrações. Como este método de isolamento não foi eficaz, resolveu-se reunir as 5 subfrações em FAc7-11-2 para nova tentativa de purificação (Fluxograma 5) . CCDP (AcOEt/MeOH/H2O 43:6:1) Reuniu-se as frações CC Sephadex LH-20 (MeOH) CCDP (AcOEt/MeOH/H2O 86:12:2) Fluxograma 5: Fracionamento da FA7-11. Tabela 14: CCDP (Hex/AcOEt 86:12:2) da FAc7-11. Fração FAc7-11 Rf Massas (mg) RMN de 1H FAc7-11-1 0,0 até 0,3 18,0 * FAc7-11-2 0,4 4,0 * FAc7-11-3 0,5 6,0 * FAc7-11-4 0,6 7,0 * FAc7-11-5 0,7 12,0 * * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). FA7-11 (96,0mg) 5 subfrações FA7-11-Z FA7-11-Z-2 (6,2mg) FA7-11-Z-3 (45,8mg) FA7-11-Z-2 (7,0mg) 4 subfrações 51 FAc7-11-Z foi submetida a CC Sephadex LH-20 eluida com MeOH e forneceu 5 subfrações (Tabela 18). Estas frações foram analisadas por CLAE (gradiente H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, λ 240 e λ 254nm, fluxo de 1mL) (Figura 17). Verificou-se a atividade antioxidante das mesmas com CCDC nebulizada com solução de β-caroteno, onde 3 subfrações deram resultados positivos (Tabela 18). A fração FAc7-11-Z-3 (45,8mg) foi submetida a CCDP (AcOEt/MeOH/H2O 86:12:2) e forneceu 4 subfrações (Tabela 19). Estas frações foram analisadas por CLAE (gradiente H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, λ 235 e λ 240, fluxo de 1mL) indicando ainda a presença de misturas em cada fração. Verificou-se a atividade antioxidante das mesmas por CCDC nebulizada com solução de β-caroteno, onde 2 subfrações deram resultados positivos (Tabela 19) (Fluxograma 5). Figura 17: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc7-11-Z-2 (6,2mg) e FAc7-11-Z-3 (45,8mg), (coluna analítica Supelco LC-18, gradiente H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro, fluxo de 1mL/min, λ 240nm e λ 254nm) Devido ao perfil cromatográfico em CLAE, algumas frações foram submetidas a análise de RMN de HMQC e HMBC (Tabela 15 e 16), apresentando sinais caracteristicos de triterpenos pentacíclicos glicosilados. Tabela 15: CC Sephadex (MeOH) da FAc7-11-Z. Fração Massas (mg) Atividade antioxidante RMN de HMQC e HMBC FAc7-11-Z-1 5,1 FAc7-11-Z-2 6,2 ** * FAc7-11-Z-3 45,8 ** FAc7-11-Z-4 7,0 ** * FAc7-11-Z-5 4,0 * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). ** Amostras com atividade antioxidante moderada. 52 Tabela 16: CCDP (AcOEt/MeOH/H2O 86:12:2) da FAc7-11-Z-3. Fração Massas (mg) Atividade antioxidante RMN de HMQC e HMBC FAc7-11-Z-3-1 4,0 FAc7-11-Z-3-2 5,3 ** FAc7-11-Z-3-3 6,0 ** * FAc7-11-Z-3-4 5,5 * Amostras submetidas a análise em espectrômetro Bruker AC-200F (200 MHz para 1H). ** Amostras com atividade antioxidante moderada. As frações FAc2 e FAc3 devido terem semelhanças em análises por CCDC, foram reunidas e submetidas a CC (Sephadex LH-20) eluída com MeOH fornecendo 42 subfrações. Estas foram submetidas a análise de CCDC utilizando como fase móvel AcOEt/MeOH (1:1) e reunidas em 5 subfrações devido ao seu perfil cromatográfico semelhante. Realizou-se CLAE λ 254 e λ 320, mas não apresentaram boa resolução. As frações FAc1-8, FAc7-4, FAc7-5, FAc7-6, FAc7-9, FAc7-10, FAc7-11, FAc4, FAc5, FAc6, FAc8, FAc9, FAc10, FAc11, FAc12, FAc13 e FAc14 foram submetidas a CLAE (gradiente de H2O/MeOH 95:5 até MeOH puro), para a varredura das substâncias presentes. A partir dos cromatogramas, as frações com melhores resoluções foram submetidas a uma coluna C-18 utilizando quatro fases móveis (Tabela 17). As subfrações obtidas foram submetidas a CLAE isocrático (H2O/MeOH 80:20, H2O/MeOH 60:40 e H2O/MeOH 25:75), usando-se detector de UV em 254 nm (Figuras 18-29). Os cromatogramas obtidos com eluente H2O/MeOH 8:2 foram pouco informativos no geral, enquanto os cromatogramas obtidos com eluente H2O/MeOH 6:4 e 25:75 mostraram picos com tr entre 0 e 20 min. Figura 18: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc4-1 (3,8 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 53 Figura 19: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc4-2 (4,9 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 20: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc5-1 (2,9 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 21: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc5-2 (2,0 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 54 Figura 22: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc6-1 (3,5 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 23: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc6-2 (3,5 mg), (coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 24: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc8-1 (15,8 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 55 Figura 25: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc8-2 (9,1 mg), coluna analítica Supelco LC-18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 26: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc9-1 (72,6 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 27: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc9-2 (30,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3), H2O/MeOH (3:2) e H2O/MeOH (4:1), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) 56 Figura 28: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc14-2 (86,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Figura 29: Cromatogramas obtidos via CLAE da FAc14-3 (35,0 mg), coluna analítica Supelco LC- 18, fases móveis: H2O/MeOH (1:3) e H2O/MeOH (3:2), fluxo de 1mL/min, λ 254nm) Observou-se que as subfrações obtidas da coluna C-18 (Tabela 17) não apresentaram boa resolução em CLAE. A eluição em modo isocrático com H2O/MeOH (25:75) mostrou baixa resolução, onde a maioria das amostras eluiam em tR < 5 minutos, indicando a necessidade do uso de eluente com menor força de eluição. A eluição com H2O/MeOH (8:2) em algumas amostras mostraram resultados insatisfatórios, pois no tempo de corrida de 30 minutos não foi suficiente para o aparecimento dos picos. Já os cromatogramas obtidos com o uso de H2O/MeOH (6:4)