JOSÉ MARIA BERTÃO ANÁLISE CLÍNICA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA COMPUTADORIZADA PELO MÉTODO DA AgNOR DE CARCINOMA ESPINOCELULAR DE DIFERENTES REGIÕES DA BOCA DE HUMANOS Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", para concorrer ao Título de Doutor em Odontologia. Área de concentração em ESTOMATOLOGIA. Orientadora: Dra. Ana Maria Pires Soubhia ARAÇATUBA – SP 2003 JOSÉ MARIA BERTÃO ANÁLISE CLÍNICA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA COMPUTADORIZADA PELO MÉTODO DA AgNOR DE CARCINOMA ESPINOCELULAR DE DIFERENTES REGIÕES DA BOCA DE HUMANOS Bertão, José Maria. B536a Análise clínica e histoquímica comparativa computadorizada pelo método da Agnor de carcinoma espinocelular de diferentes regiões da boca de humanos. / José Maria Bertão. - Araçatuba, [s.n.], 2003. 155 f. :il. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2003 1. Carcinoma espinocelular. 2. Processamento de imagem assistida por computador. 3. Agnor. Black D65 CDD 617.601 JOSÉ MARIA BERTÃO ANÁLISE CLÍNICA E HISTOQUÍMICA COMPARATIVA COMPUTADORIZADA PELO MÉTODO DA AgNOR DE CARCINOMA ESPINOCELULAR DE DIFERENTES REGIÕES DA BOCA DE HUMANOS COMISSÃO JULGADORA TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR Presidente e Orientador ............................................................................... 2.º Examinador ............................................................................................. 3º Examinador .............................................................................................. 4º Examinador .............................................................................................. 5º Examinador .............................................................................................. Araçatuba, de de 2003 DADOS CURRICULARES JOSÉ MARIA BERTÃO NASCIMENTO: 22 de setembro de 1946. FILIAÇÃO: Primo Bertão Rosa Zaccari Bertão 1976 / 1979 Curso de graduação em Odontologia na Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente. 1980 / 1985 Professor Assistente da Disciplina de Patologia Geral e Patologia Bucal na Universidade do Oeste Paulista de Presidente Prudente. 1981 / 1985 Curso de Pós Graduação, Nível de Mestrado em Biologia e Patologia Buco Dental na Faculdade de Odontologia de Piracicaba – Unicamp SP. 1985 / 2002 Professor Titular da Disciplina de Patologia Geral e Patologia Bucal na Universidade do Oeste Paulista de Presidente Prudente - Unoeste. 1990 / 2002 Professor Assistente na Disciplina de Estomatologia da Universidade do Oeste Paulista de Presidente Prudente - Unoeste. 1998 / 2002 Curso de pós Graduação em Odontologia Área de Concentração Estomatologia, Nível de Doutorando na Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Unesp - SP D E D I C A T Ó R I A Dedico este trabalho ao meu pai Primo Bertão (in memória) que me ensinou a arte e a importância da leitura para a vida. A minha mãe Rosa Zaccari Bertão que sempre me incentivou cada vez mais aos estudos. Dedico este trabalho a minha esposa Elizabeth Eliza Cacciatore Bertão que soube com paciência, entender e apoiar a importância desta realização profissional. Dedico também aos meus dois filhos, Ricardo Cacciatore Bertão e Rosane Cacciatore Bertão, que pelo amor, renova nossa esperança de um futuro cada vez melhor. A Pró Reitora de Assuntos Acadêmicos Professora Ana Cardoso Maia de Oliveira Lima pelo Apoio e incentivo na realização desse doutorado, assim como a reitoria da Unoeste por tornar possível a realização deste curso. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS A Professora Dra. Ana Maria Pires Soubhia, orientadora, amiga e professora, exemplo de dedicação e seriedade, pelas orientações dedicadas a este trabalho, por todos os ensinamentos e pela confiança depositada em mim, toda minha homenagem e agradecimento especial. A todos os professores do Departamento de Diagnóstico e Propedêutica da F.O .A . pela convivência de vários anos, onde criamos forte relacionamento científico e um forte vínculo de amizade. Dr. Alvimar Lima de Castro Dra. Ana Maria Pires Soubhia Dr. Eder Ricardo Biazolla Dr. Elersom Gaetti Jardim Jr Dr. Gilson Machado D´Antônio Dr . Glauco Issamu Miyahara Dr. Marcelo Macedo Crivelini Dr. Norberto Perri Moraes Dra Renata Callestini Dr. Takeo Ademar Furuse Dr. Acyr Lima de Castro nobre professor que sempre nos incentivou ao estudo e sempre nos aconselhou nos momentos difíceis. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer... À Diretoria da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, na pessoa do Sr. Diretor Professor Titular Dr. Francisco Antônio Bertóz, pela oportunidade de poder realizar este curso. Aos meus irmãos Jorge Bertão, Rita Bertão, Diná Bertão, Luiz Bertão, Maria Helena Bertão (In Memorian) e Maria de Lourdes Bertão que sempre me apoiaram aos estudos. Aos meus colegas de disciplina de Patologia Professora Arlete Gomes Santos Parizi e Dr. José Luis Parizi que colaboraram comigo nas minhas ausências do Departamento. Aos meus colegas da Disciplina de Estomatologia da Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente Dr. Pedro Ângelo Cintra, Dr. Edison Calixto da Fonseca, Dra. Arlete Gomes Santos Parizi e Dr. Marcos Arcanjo Vendrame que sempre me apoiaram na realização deste Curso. Aos Funcionários do Laboratório de Anatomia Patológica da UNOESTE que sempre colaboram comigo para que tudo ocorresse dentro da mais perfeita ordem. Aos meus amigos do curso de Doutorado, Dra. Elaine Maria Sgaviolli Massucato, Dra. Sandra Hall Mestrener e Dr. Élio Shinohara pelos momentos difíceis e alegres que estivemos juntos, e pela eterna amizade. A todos os Professores da Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente – UNOESTE que sempre deram o seu apoio. A todos os Funcionários e alunos da Faculdade de Odontologia de Presidente Prudente que prestigiaram o meu trabalho. A todos os colegas, Funcionários e alunos da Faculdade de Odontologia de Araçatuba que me receberam com carinho. A todos os Funcionários do Depto. de Diagnóstico e Propedêutica da Faculdade de Odontologia de Araç atuba – UNESP pela colaboração e dedicação. Ao Professor Emerson Wruck pela colaboração dos dados Estatísticos. Ao Professor Paulo Benicio pela revisão gramatical. Ao Centro de Oncologia Bucal (COB) pela permissão na utilização dos prontuários para coleta de informações. Ao paciente que cedeu material para realização do trabalho. Quero também agradecer a Deus por estar sempre comigo em todos os momentos de minha vida. SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS............................................................................ 11 LISTA DE TABELAS............................................................................ 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................... 18 1 INTRODUÇÃO.................................................................................. 20 2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................. 24 2.1 Carcinoma espinocelular............................................................... 25 2.1.1 Etiologia...................................................................................... 27 2.1.2 Apresentação clínica do carcinoma de boca.............................. 28 2.1.3 Estadiamento do câncer de boca............................................... 36 2.1.4 Características histológicas........................................................ 39 2.2 Carcinoma espinocelular X Agnor................................................. 41 3 PROPOSIÇÃO.................................................................................. 61 4 MATERIAL E MÉTODO.................................................................... 63 4.1 Análise clínica................................................................................ 64 4.2 Análise histopatológica.................................................................. 64 4.3 Análise histoquímica...................................................................... 65 4.4 Análise quantitativa e morfométrica............................................... 68 4.5 Análise estatística.......................................................................... 73 5 RESULTADO.................................................................................... 74 5.1 Aspectos clínicos........................................................................... 75 5.1.1 Carcinomas de lábio................................................................... 75 5.1.2 Carcinomas de língua................................................................. 76 5.1.3 Carcinomas de assoalho da boca............................................... 77 5.1.4 Carcinomas de palato duro......................................................... 78 5.1.5 Carcinomas de região retromolar............................................... 80 5.2 Aspectos histopatológicos............................................................. 89 5.3 Análise quantitativa e morfométrica das regiões organizadoras de nucléolos.................................................................................. 90 5.4 Avaliação dos dados estatísticos................................................... 97 5.5 Análise de associação linear......................................................... 101 6 DISCUSSÃO..................................................................................... 104 7 CONCLUSÃO................................................................................... 115 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 117 APÊNDICES........................................................................................ 129 RESUMO............................................................................................. 152 ABSTRACT.......................................................................................... 154 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Aspectos clínicos do carcinoma espinocelular de assoalho bucal. 33 Figura 2 - Aspectos histopatológicos do carcinoma espinocelular bem diferenciado, apresentando pérolas de queratina e mitoses atípicas (H/E) 400x. 41 Figura 3 - Ideograma dos cromossomos humanos onde se observam os braços curtos dos números 13, 14, 15, 21 e 22. 43 Figura 4 - Desenho de um cromossomo identificado a localização das regiões organizadoras de nucléolos no seu braço curto. 43 Figura 5 - Área de Nors e núcleos corados pela técnica Agnor para serem analisados (1000x). 68 Figura 6 - Equipamento utilizado para análise quantitativa e morfométrica das Nors (Disciplina de Patologia da F.O.P.P. – Unoeste). 69 Figura 7 - Área das Nors circundadas para analise (1000x). 70 Figura 8 - Área das Nors circundadas e selecionadas para análise (1000x). 71 Figura 9 - Áreas das Nors circundadas e selecionadas para análise (1000x). 71 Figura 10 - Planilha com resultados da contagem das Nors, núcleos e áreas para compor o trabalho. 72 Figura 11 - Planilha com os resultados da contagem dos núcleos e áreas para compor o trabalho. 72 Figura 12 - Dados representativos dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao local anatômico. 81 Figura 13 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao sexo. 82 Figura 14 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação à idade. 83 Figura 15 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação à raça. 84 Figura 16 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao estadiamento clínico (TNM). 85 Figura 17 - Distribuição dos dados carcinoma espinocelular bucal em relação ao grau de diferenciação. 86 Figura 18 - Distribuição dos dados de carcinoma espinocelular bucal em relação ao tabagismo. 87 Figura 19 - Distribuição dos dados de carcinoma espinocelular bucal em relação ao etilismo. 88 Figura 20 - Aspectos histopatológicos do carcinoma espinocelular moderadamente diferenciado, apresentando mitoses atípicas (H/E) 400x. 89 Figura 21 - Área com células coradas pelo Agnor indicando pontos escuros ou castanhos (Nors) no interior do núcleo. 90 Figura 22 - Área com células coradas pelo Agnor indicando os núcleos. 91 Figura 23 - Resultados do número médio de Nors pelo número médio de núcleos. 93 Figura 24 - Número médio de Nor, número médio de núcleo, média da área dos Nor e média da área dos núcleos de cada região da boca. 95 Figura 25 - A existência de uma relação linear entre o número médio de núcleos (y1) e a área média do núcleo (y2). 101 Figura 26 - A existência de uma relação linear entre o número de Nors (x1) e a área média do Nor (x2). 101 Figura 27 - A existência de uma relação linear entre o número médio de Nors (x1) e o número médio de núcleos (y1). 102 Figura 28 - A existência de uma relação linear entre a área média de Nors (x2) e a área média do núcleo (y2). 102 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Número de pacientes (%) com carcinoma espino celular bucal 26 Tabela 2 - Dados representativos dos casos de carcinoma espinocelular em relação ao local anatômico 81 Tabela 3 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao sexo 82 Tabela 4 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação à idade 83 Tabela 5 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação à raça 84 Tabela 6 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao estadiamento clínico (TNM) 85 Tabela 7 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao grau de diferenciação 86 Tabela 8 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao tabagismo 87 Tabela 9 - Distribuição dos casos de carcinoma espinocelular bucal em relação ao etilismo 88 Tabela 10 - Resultados do número médio do Nors pelo número médio de núcleos 93 Tabela 11 - Número médio de Nors, número médio de núcleo, média da área das Nor e média da área dos núcleos de cada área da boca 94 Tabela 12 - Quadro descritivo com relação ao número de núcleos segundo os fatores 96 Tabela 13 - Quadro da ANOVA com relação ao número médio de núcleos 96 Tabela 14 - Contrastes significativos (Teste de Tukey) 97 Tabela 15 - Quadro descritivo com relação área média dos núcleos segundo os fatores 97 Tabela 16 - Quadro da ANOVA com relação à área dos núcleos 98 Tabela 17 - Contrastes significativos (Teste de Tukey) 98 Tabela 18 - Quadro descritivo com relação ao número de Nors 98 Tabela 19 - Quadro da ANOVA com relação ao número de Nors 99 Tabela 20 - Contrastes significativos (Teste de Tukey) 99 Tabela 21 - Quadro descritivo com relação à área média do Nors 100 Tabela 22 - Quadro da ANOVA com relação à área média do Nors 100 Tabela 23 - Contrastes significativos (Teste de Tukey) 100 Tabela 24 - Dados quantitativos e morfométricos do número de Nors e área das Nors de carcinoma espinocelular de lábio inferior 137 Tabela 25 - Dados quantitativos e morfométricos do número de núcleo e área dos núcleos de carcinoma espinocelular de lábio inferior 138 Tabela 26 - Dados quantitativos e morfométricos do número de Nors e área dos Nors de carcinomas espinocelular da língua 139 Tabela 27 - Dados quantitativos e morfométricos do número de núcleos e área de núcleo de carcinoma espinocelular da língua 140 Tabela 28 - Dados quantitativos e morfométricos do número de Nors e área das Nors de carcinoma espinocelular de assoalho bucal 141 Tabela 29 - Dados quantitativos e morfométricos do número de núcleos e área de carcinoma espinocelular de assoalho bucal 142 Tabela 30 - Dados quantitativos e morfométricos do número de Nors e área das Nors de carcinoma espinocelular de palato 143 Tabela 31 - Dados quantitativos e morfométricos do número de núcleos e área de núcleo de carcinoma espinocelular de palato 144 Tabela 32 - Dados quantitativos e morfométricos do número de Nors e área das Nors de carcinoma espinocelular de retromolar 145 Tabela 33 - Dados quantitativos e morfométricos do número de núcleos e área de núcleos dos carcinoma espinocelular de retromolar 146 Tabela 34 - Dados quantitativos e morfométricos das médias do número da Nors/Núcleos e área das Nors/Núcleo de carcinoma espinocelular do lábio inferior 147 Tabela 35 - Dados quantitativos de morfométricos das médias do número da Nors/Núcleo e área das Nors/Núcleo de carcinoma espinocelular da língua 148 Tabela 36 - Dados quantitativos de morfométricos das médias do número das Nors/Núcleo e área das Nors/Núcleos de carcinoma espinocelular do assoalho bucal 149 Tabela 37 - Dados quantitativos de morfométricos das médias do número das Nors/Núcleos e área das Nors/Núcleos de carcinoma espinocelular do palato 150 Tabela 38 - Dados quantitativos e morfométricos das médias do número das Nors/Núcleos e área das Nors/Núcleos de carcinoma espinocelular de região retromolar 151 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS EUA = Estados Unidos da América Ag = Símbolo químico da prata Agnors = Do inglês argynophilic nucleolar organizer region – Técnica histoquímica de impregnação pela Ag ou refere-se as regiões organizadoras de nucléolos coradas pela prata CEC = Carcinoma Espinocelular Cm = Centímetro DNA = Do inglês deoxyribanuclec acid – ácido desoxirribonucléico FOA = Faculdade de Odontologia de Araçatuba UNESP = Universidade Estadual Paulista g = Grama G1 = do inglês gap (intervalo) intervalo pós mitótico e pré-síntese do DNA G2 = do inglês gap (intervalo) intervalo pós-síntese do DNA GO = do inglês gap (intervalo) se refere ao intervalo de latência entre as fases do ciclo celular no qual as células se encontram fora do ciclo H/E = Hematoxilina e Eosina HPV = Do Inglês human papilomavirus – papiloma vírus humano IBM = International Busines Machines Ki67 = Tipo de antígeno ou anticorpo mono ou policlonal NORS = Do inglês nucleolar organizer regions (Regiões organizadoras de nucléolos) ºC = Graus Celsius P120 = Proteína associada à proliferação celular P53 = Proteína p53 gene supressor de tumor PCNA = do inglês proliferating cell nuclear antigen (antígeno de proliferação celular) RGB = Tons de cor analisado pelo programa Imajelab – vermelho – verde e Azul rRNA - do inglês ribossomal ribonucleic acid (ácido ribonucléico ribossômico) S = Refere-se à fase do ciclo celular onde ocorre a síntese do DNA TNM = Sistema de Estadiamento do Câncer – tamanho da lesão comprometimento de estruturas adjacentes e evidência de metástases µ = Micrômetro USP = Universidade de São Paulo UVR = Radiação ultra violeta UICC = União Internacional contra o câncer MO = Microscópio Óptico INTRODUÇÃO 21 1 INTRODUÇÃO A incidência do câncer de boca é extremamente variável. Ainda hoje é um problema de saúde pública em muitas partes do mundo. Ocorrem atualmente 262.000 óbitos por cânceres da cavidade oral e faringe em todo mundo (Parise Júnior, 2000). As neoplasias da boca e da faringe ocupam a 6º posição entre os cânceres mais freqüentes no mundo, sendo 7% para o sexo masculino e 3,8% para o sexo feminino, e no Brasil o câncer de boca representa 8% no sexo masculino e 2% no sexo feminino (Parise Júnior, 2000). O câncer de boca pode ser induzido por uma combinação de fatores: hábitos pessoais, atividade profissional e região onde o indivíduo habita. A incidência do câncer de boca tem acompanhado os padrões de consumo de tabaco e de álcool há várias décadas. Devido à função e à localização, a boca está continuamente em contato com diversos agentes químicos, físicos e biológicos, os quais, atuando isolados ou conjuntamente, aumentariam os riscos de câncer (Parise Júnior, 2000). A incidência do câncer de boca tem aumentado significativamente em todo mundo, constituindo um grave problema de saúde e pode ocorrer em várias localidades porém as mais comuns são, lábio, borda da língua, e assoalho bucal. Os carcinomas espinocelular da 22 boca geralmente são diagnosticados em pacientes adultos com mais de 40 anos (Parise Júnior, 2000). A literatura vem há muitos anos reforçando a importância do valor do diagnóstico precoce do câncer, afirmando que são reduzidas as possibilidades de sobrevida de casos tratados em fases de lesões avançadas. Ainda hoje persiste um dilema para os patologistas e para os clínicos, a determinação do grau de malignidade das neoplasias, tradicionalmente esta determinação tem-se baseado na avaliação clínica dos profissionais e nos aspectos histopatológicos reconhecidos no exame histopatológico proposto por Broders em 1920, através do exame em H/E. Entretanto métodos mais sofisticados vêm sendo introduzidos na rotina de exames histopatológicos como as análises Imunohistoquímica que estão cada vez mais sendo usados principalmente em grandes centros e nas pesquisas. Alguns outros métodos, preconizados por vários autores, estão sendo utilizados para colaborar na avaliação dos resultados histopatológicos de neoplasias malignas dentre eles a técnica de coloração pela prata das Regiões Organizadoras Nucleolares (Agnors) é de valor considerável tanto para experimentos, como para um prognóstico histopatológico. Devido à estreita relação entre as Regiões Organizadoras Nucleolares (Nors) e a atividade celular, o tamanho e/ou o número destas 23 Nors podem refletir ou predizer a proliferação celular, a transformação ou uma evidente malignidade. Este método tem recebido grande atenção dos patologistas e as técnicas para o estudo das Nors estão cada vez mais sendo estudadas. Podemos considerar que esta técnica de coloração das Nors pela prata é oportuna, pois trata-se de uma técnica de confecção de baixo custo e que pode ser utilizada como rotina em qualquer laboratório de histopatologia. Observando-se as dificuldades que muitas vezes os patologistas encontram para graduar o carcinoma espinocelular e que esta graduação implica diretamente no tratamento do paciente, resolvemos realizar uma análise clínica e histoquímica comparativa computadorizada pelo método AgNOR de carcinoma espinoceular de diferentes regiões da boca de humanos. REVISÃO DE LITERATURA 25 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Carcinoma espinocelular A incidência do câncer de boca é extremamente variável. Ainda hoje é problema de saúde pública em muitas partes do mundo. Ocorrem ainda hoje aproximadamente 262.000 óbitos por câncer da boca e faringe em todo mundo, onde 83% são em países sub- desenvolvidos como a India e algumas regiões da França. Das neoplasias malignas em boca o carcinoma espinocelular é o 6º tipo de câncer mais comum em todo mundo. O número real do câncer ainda é difícil de ser calculado, pois as notificações são limitadas e muitos pacientes são tratados no setor privado sem comprovação adequada (Marks, 1996). A forma prevalente do câncer de boca é o carcinoma espinocelular também chamado de carcinoma epidermoide, num total de 90 a 95% de todos os casos diagnosticados (Bertotto et al., 1997) e no Brasil esse tipo de câncer está entre as oito neoplasias malignas mais freqüentes do total de casos diagnosticados e estimava-se para o ano 2000, 10.980 casos novos (De Melo et al., 2001). No Brasil entre as principais causas mortes figuram as neoplasias como 3ª causa, precedidas pelas doenças do aparelho circulatório e causas externas, representando 10,2% dos óbitos em 1990 26 e 10% em 1994 (Parise Júnior, 2000). No Brasil os dados do período de 1976 a 1980 mostraram que o câncer de boca representou 8% dos casos de câncer incidentes em indivíduos do sexo masculino e 2% do sexo feminino. Revisão feita dos casos no Centro de Tratamento e Pesquisa do Hospital do Câncer no período entre 1953 a 1980 (Kowalski et al., 1999), indica a prevalência por localização nas seguintes distribuições expressa na Tabela 1. Tabela 1 - Número de pacientes (%) com carcinoma espino celular bucal Local anatômico Masculino Feminino Total (%) Lábio 1.580 (85.5%) 267 (14.5%) 1.847 (40.8%) Língua 839 (89.1%) 103 (10.9%) 942 (20.8%) Assoalho 684 (90.5%) 72 (9.5%) 756 (16.7%) Outros locais 783 (79.7%) 199 (19.3%) 982 (21.7%) Total 3.886 (85.8%) 641 (14.2%) 4.527 (100.0%) Fonte: Dib citado por Kowalski (1999, p.114). O carcinoma espinocelular pode acometer todas as regiões topográficas da boca sendo o lábio inferior e a língua os locais de maior incidência acompanhados pelo assoalho bucal e osso alveolar inferior. No estado de São Paulo, no ano de 1998, a incidência de câncer de língua foi de 7,4 por 100.000 e a de câncer de lábio 5,4 por 100.000 em indivíduos do sexo masculino (Bertotto et al., 1997). 27 2.1.1 Etiologia A boca está continuamente em contato com diversos agentes químicos, físicos e biológicos, os quais atuando isolados ou em conjunto, aumentam o risco do câncer. Esses agentes são denominados carcinógenos. O fumo e o álcool são tidos como fatores importantes na etiologia do câncer de boca e o risco de desenvolver essa neoplasia na mucosa aumenta proporcionalmente com a quantidade de cigarros diários e as doses e freqüência do uso de álcool. O envolvimento do álcool isoladamente no câncer de boca não está totalmente esclarecido, mas numerosos trabalhos têm demonstrado a forte associação entre o seu uso e do tabaco. O consumo concomitante dificulta o acesso aos efeitos desses dois fatores, individualmente (Wight & Ogden, 1998). Em 1997, La Vecchia et al., sugeriram que o álcool e o tabaco representavam 75% das causas de câncer bucal na Europa, enquanto que as deficiências alimentares ou as dietas não balanceadas poderiam representar de 10 a 15%. Outros autores estudando a gênese do câncer bucal, afirmavam que o tabaco seria responsável por mais de 70% dessas neoplasias e mortes e ao sugerirem o mecanismo de agressão do tabaco, tornou-se difícil implicar o álcool como fator de risco isolado. Eles concluíram que a combinação dos dois fatores aumentariam 28 significativamente o risco de câncer na boca e ou faringe (Lockhart et al., 1998). Além do uso do tabaco, elevados níveis de consumo de álcool conferem considerável risco de desenvolvimento do câncer bucal, porém outros fatores estão envolvidos como dietas, má higiene bucal, uso de colutórios bucais e infecções virais (Rodrigues et al., 1998). Silverman & Surgerman, em 2000 relataram que a causa do câncer bucal é desconhecida e que a transformação maligna seria sempre resultado de um dano genético, porém haveria um aumento no risco de câncer bucal quando da associação de agentes mutagênicos como o tabaco e álcool. Acrescentam ainda que, as mutações gênicas nos casos de câncer de boca têm sido detectadas nos cromossomos 3p, 8p, 9p, 13q, 17p, 18q e 21q. Cruz et al. (1996) consideram que outros fatores também podem estar relacionados ao câncer bucal, como alguns tipos do papilomavírus humano (HPV) e a susceptibilidade genética do indivíduo. 2.1.2 Apresentação Clínica do Carcinoma de Boca Câncer de Lábio: O carcinoma espinocelular geralmente apresenta-se como um nódulo ulcerado proliferativo exofitico com evolução moderadamente rápida (meses) endurecido à palpação e com tamanho variando de 29 poucos milímetros a alguns centímetros, dependendo da fase na qual é diagnosticado. Ocasionalmente são lesões infiltrativas e firmes sem o componente exofitico (Marks, 1996). Essa lesão pode se espalhar por vários mecanismos: localmente (invadindo músculos, planos capsulares ou periosteo), através dos vasos linfáticos (dando metástase linfática) ou por via hematogênica (Bernstein et al., 1996). Na maioria dos casos o câncer de lábio ocorre no vermelhão do lábio inferior em torno de 95%, por ser esta área considerada a parte da boca mais exposta a alguns carcinógenos como tabaco, álcool, além da intensa exposição solar (Campbell, 1998). Os tumores do lábio superior contribuem com cerca de 2% a 8% das neoplasias labiais e lesões das comissuras representa menos de 1% (Parise Júnior, 2000). O efeito das radiações solares na etiologia do carcinoma espinocelular de lábio é evidenciado por sua maior incidência em pessoas de pele clara que se apresentam mais sensíveis à luz solar. Relata-se que entre os carcinógenos orais são citados outros dois fatores no desenvolvimento de câncer de lábio além da radiação ultravioleta (principalmente os raios UVB). O trauma mecânico pode contribuir mas com pouca comprovação experimental e epidemiológica e o fator físico calor, que teria um efeito sinérgico com a carcinogenese química no câncer de lábio (Parise Júnior, 2000). 30 Em um estudo sobre câncer de lábio na Finlândia, foi relatado uma diminuição em homem de 4,8/100.000 em 1983 – 1987 para 1,4/100.000 em 1993 – 1997 e que a incidência em mulheres foi de 0,30 a 0,36. Relataram que 90% dos pacientes tinham fatores de risco comum que eram domicilio na zona rural, ocupação com exposição constante ao sol e uso do tabaco. Concluíram que a diminuição do uso do tabaco bem como a diminuição da exposição ao sol reduzia o número de casos do câncer de lábio (Alho et al., 2000). Bernstein et al., em 1996 desenvolveram um trabalho sobre carcinoma espinocelular e relataram que, geralmente esse tipo de lesão, quando ocorre na pele pela agressão da radiação solar, tem índice de metástase muito baixo (entre 0,5 a 5,2%) mas que o carcinoma de lábio a partir de queilites actínicas, apresentaria um comportamento mais agressivo e com maior índice de metástase, entre 3 e 29%. Em pacientes com alto risco de câncer de lábio, o acompanhamento deve ser pela vida toda e não apenas por cinco anos como se preconiza para as neoplasias malignas. Isso para que se possa detectar um possível segundo tumor primário, ter maiores chances de sucesso terapêutico e aumentar a sobrevida do paciente (Van Der Tol et al.,1999). Câncer de língua: A língua é o sitio de acometimento de cerca de três 31 quartos dos cânceres de toda língua. Nessa região, suas formas mais comuns de apresentação clínica, são as exofiticas e as infiltrativas. A borda lateral da língua é o subsítio mais freqüente, especialmente no terço médio e posterior (45%) e muitas vezes o tumor estende-se para o assoalho adjacente, com invasão da musculatura e fixação do órgão. Lesões do terço posterior da língua, também podem progredir através do músculo estiloglosso e para o processo estilóide e avançar através da base da língua ou do assoalho da boca para atingir a orofaringe. Tumores do ventre língual acometem rapidamente o assoalho em direção ao osso hióide ou mesmo à mandíbula, levando a fixação da língua. Neoplasias localizada no dorso ou na ponta da língua ou parte da língua são raras. Os carcinomas de língua no início são indolores, mas em fases avançadas invadem os ramos do nervo lingual, causando dor à região do ouvido a qual tem origem comum do nervo lingual e aurículo temporal, responsáveis pela sensibilidade do condutor auditívo externo e membrana timpânica. Lesões avançadas podem levar à disartria e disfagia. As neoplasias da língua causam mais metástases cervicais do que tumores de outros sítios, estas metástases podem ser bilaterais ou contralaterais, principalmente nas cadeias jugulocarotídeas 32 altas. As metástases são de incidência maior quando ocorrem extensões posteriores ou em profundidade do tumor (Parise Júnior, 2000). Câncer do assoalho da boca: O câncer do assoalho da boca adquire na maioria das vezes a forma exofítica, podendo apresentar áreas de ulceração. Ocorrem normalmente na região anterior, próximo da mandíbula, e atingem com facilidade a região submentoniana. Executar palpação criteriosa do local, principalmente bimanual é fundamental para avaliação do grau de comprometimento dessas estruturas. O ventre lingual geralmente está comprometido levando à fixação desse órgão (Parise Júnior, 2000). Como na língua, tais tumores só irão produzir sintomatologia álgica se forem infiltrativos, envolvendo o periósteo mandibular ou ramos do nervo lingual. Quando os tumores estão próximos à linha média, podem comprometer a drenagem das glândulas submandibulares por obstrução de seus ductos que, por sua vez, podem representar a via de disseminação do tumor. A obstrução do ducto de Warthon leva a um aumento de volume e consistência da glândula submandibular. A freqüência de metástase cervical no momento do diagnóstico do tumor primário chega a 50%, geralmente nos linfonodos submandibulares e subdigástricos. E a disseminação linfática segue pelas cadeias jugulocariotídeas (Parise Júnior, 2000). 33 FIGURA 1- Aspectos clínicos do carcinoma espinocelular de assoalho bucal. Fonte: Arquivo próprio (2002). Câncer do palato duro: O carcinoma espinocelular em região de palato duro é freqüentemente uma lesão ulcerada com tendência à infiltração das estruturas adjacentes como a cavidade nasal e os seios maxilares, mas, de início, de crescimento predominantemente lateral. Da mesma forma, um tumor diagnosticado no palato duro pode ter origem no assoalho de cavidade nasal ou nos seios maxilares. No palato duro, o carcinoma espinocelular é semelhante à neoplasia malígna das glândulas salivaris menores, como os carcinomas adenoide-cístico e muco epidermóide. Estes geralmente se manifestam como tumores submucosos. No diagnóstico inicial cerca de 10 a 20% dos pacientes apresentam evidências clínicas de metástases cervicais, número baixo em relação aos carcinomas em outros locais da boca. A dor e 34 sangramento são sintomas tardios, porém quando o tumor atinge o palato mole pode provocar odinofagia ou rinolalia sua extensão posterior pode levá-lo à fossa pterigopalatina. Metástases à distância não são freqüentes nos casos de carcinoma espinocelular desse local, porém ocorrem em até 12% em casos de neoplasias malignas de glândulas salivares menores. Câncer do trigono retromolar: Em região de trigono retromolar podem ocorrer carcinomas que rapidamente atingem estruturas adjacentes como a base da língua, pilares amigdaliano anterior, loja amigdaliana, palato mole, mucosa jugal e fossa pterigopalatina. As apresentações clínicas desse tumor nessa região incluem mais comumente as formas infiltrativas e ulcerativas, e o tumor já pode encontrar-se em estágio avançado quando diagnosticado. Mesmo tumores mais superficiais já podem provocar aderência da mucosa ao periósteo da mandíbula. O comportamento biológico do carcinoma de área retromolar assemelha-se mais a tumores da orofaringe que de cavidade bucal propriamente dita. Estima-se que 50 a 60% dos pacientes já apresentam metástase regional na primeira consulta e que são observadas nos linfonodos jugulodigástricos. 35 Câncer do rebordo alveolar e mucosa jugal: No rebordo alveolar observam-se lesões exofíticas e friáveis, fixas às estruturas ósseas adjacentes, devido à grande aderência da gengiva ao periósteo que a recobre. As lesões podem crescer em direção à mucosa jugal, assoalho da boca, língua ou palato duro. A ausência dos dentes facilita a progressão dos tumores através dos alvéolos dentários e também se associa a um afilamento da cortical mandibular pela reabsorção do osso alveolar, de tal forma que a lesão pode atingir com maior facilidade a medula da mandíbula. A dor e sangramento, perda de dentes, dificuldade no ajuste da prótese dentária são queixas comuns em portadores de carcinoma de rebordo alveolar. Das lesões da região alveolar, 70 a 80% infiltram o rebordo mandibular sendo a maioria, no terço posterior. Mais de 30% apresentam metástases cervicais no diagnóstico da neoplasia primária. Lesões do rebordo superior apresentam menor freqüência de disseminação linfática enquanto que rebordo inferior normalmente dão metástase em linfonodos da cadeia submandibular, os quais juntamente com os linfonodos da cadeia jugulocarotídea alta também representam o primeiro sítio de disseminação das neoplasia do rebordo superior (Parise Júnior, 2000). Na mucosa jugal o carcinoma espinocelular é encontrado mais comumente na porção posterior, e com grande freqüência 36 desenvolve-se a partir de uma leucoplasia. Os aspectos clínicos encontrados são dos tipos exofitico, ulcero-infiltrativo e verrucoso. A dor é verificada quando endurecido, odor fétido pode aparecer em fases avançadas da doença. Apesar da progressão do tumor nessa área ser insidiosa, na maioria dos pacientes já se observa extensão tumoral além da mucosa jugal, em cerca de 50% dos pacientes nota-se a presença de metástases regionais. Em tumores mais anteriormente localizados, as metástases ocorrem em linfonodos submandibulares e aqueles mais posteriores disseminam-se para linfonodos da cadeia jugulocariotídea (Parise Júnior, 2000). 2.1.3 Estadiamento do câncer de boca O carcinoma espinocelular de boca apresenta um alto nível de metástase e por isso devemos procurar diagnosticar essas lesões o mais precocemente possível, o que resultaria em alto índice de sobrevida dos pacientes e até cura de alguns casos. Em 1982, a União Internacional Contra o Câncer (UICC) e a American Joint Committe On Câncer criaram o sistema TNM que padronizou o estadiamento do câncer. Em 1998 modificações foram executadas na classificação pela União Internacional Contra o Câncer (UICC), para melhorar e atualizar as denominações e classificação das condições do câncer, que estão 37 descritas no quadro 1. Na região da cabeça e pescoço esse sistema auxilia na determinação da Terapêutica a ser empregada e na definição do prognóstico quanto à disseminação oncoplásica e sobrevida do paciente. Ao se seguir o sistema TNM são considerados a maior dimensão da lesão, a invasão de estruturas adjacentes, as evidências de metástases cervicais e a distância. As classificações clínicas do envolvimento linfonodal cervical e de metástase à distância (N e M, respectivamente) são as mesmas para os carcinomas do território da cabeça e pescoço. Da composição dos dados citados acima, os pacientes são agrupados em estágios que vão de “0” a “IV” como demonstrado no Quadro 1. Quadro 1 - Classificação dos Carcinoma Espinocelular bucal de acordo com o estadiamento clínico (TNM) UICC – 1998 Classificação TNM Descrição Tumor primário (T) Tx T0 Tis T1 T2 T3 T4 O tumor primário não pode ser avaliado. Não há evidências de tumor primário. Carcinoma in situ. Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão. Tumor com mais de 2 cm e até 4 cm em sua maior dimensão. Tumor com mais de 4 cm em sua maior dimensão. Lábio: O tumor invade as estruturas adjacentes, p. ex., cortical óssea, nervo alveolar inferior, soalho da boca, pele da face. Cavidade bucal: O tumor invade as estruturas adjacentes, p. ex., a cortical óssea, até a profundidade do músculo extrínseco da língua, seios maxilares, pele. (A erosão superficial isolada do alvéolo dentário por um tumor primário de gengiva não é suficiente para classificá-lo como T4). 38 Classificação TNM Descrição N – Linfonodos Regionais NX N0 N1 N2 N2a N2b N2c N3 Linfonodos regionais não podem ser avaliados. Ausência de metástaes em linfonodos regionais. Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3cm ou menos em sua maior dimensão. Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão, ou em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão, ou em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão. Metástase em um único linfonodo homolateral, com mais de 3 cm e até 6 cm em sua maior dimensão. Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão. Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6 cm em sua maior dimensão. Metástase em linfonodo com mais de 6 cm em sua maior dimensão. Os linfonodos de linha média são considerados lifonodos homolaterais Metástases a distância (M) Mx M0 M1 A presença de metástase à distância não pode ser avaliada. Ausência de metástases à distância Metástases à distância p TNM – Classificação Patológica As categorias pT, pN e pM correspondem às categorias T, N e M. Gupamento por Estádios Estádio 0 Tis N0 M0 Estádio I T1 N0 M0 Estádio II T2 N0 M0 Estádio III T3 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0 Estádio IVA T4 N0 M0 T4 N1 M0 Qualquer T N2 M0 Estádio IVB Qualquer T N3 M0 Estádio IVC Qualquer T Qualquer N M1 Fonte: Ministério da Saúde, Secretaria de Assistência à Saúde, Instituto Nacional de Câncer (1998). 39 O tamanho do tumor, avaliado pelo sistema TNM, tem um importante valor prognóstico, além da avaliação clínica, e ainda outros marcadores prognósticos como margens cirúrgicas, aspectos histopatológicos, anomalias das células e as doenças concomitantes (De Melo et al., 2001). 2.1.4 Características histológicas Os carcinomas de boca não possuem problemas no que se referem ao diagnóstico histopatológico, apesar do seu comportamento biológico não ser uniforme. Desde 1920, Broders propôs uma análise dos aspectos histopatológicos juntamente com uma graduação histopatológica de malignidade: Grau I bem diferenciado Grau II moderadamente diferenciado Grau III pobremente diferenciado Grau IV indiferenciado O sistema TNM não considera o grau de diferenciação celular do tumor, o qual não parece estar relacionado ao prognóstico dos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço de modo geral. A maior dimensão, está mais fortemente relacionada ao desenvolvimento de metástases regionais do que ao estadiamento propriamente dito, também invasões vasculares, sangüíneas e linfáticas e 40 perineurais se correlacionam com o prognóstico e não são consideradas pelo estadiamento TNM. É variável o grau de diferenciação do carcinoma espinocelular, por isso foi subdividido por Broders em graus de I a IV conforme a proporção de células diferenciadas no sentido da cornificação: No grau I há mais de 75/100 células diferenciadas; No grau II, mais de 50/100 células diferenciadas; No grau III, mais de 25/100; e no grau IV, menos 25/100 células diferenciadas. Esta subdivisão, baseada em porcentagem, é de difícil execução por exigir contagem no número de células e por isto não tem valor prático. É preferível basear-se o diagnóstico na análise qualitativa de todo o preparado microscópico ou, de preferência, de vários cortes do mesmo bloco ou de blocos de pontos diferentes do tumor. Assim se pode avaliar o grau de diferenciação, baseado sobretudo na formação da substância córnea. Neste exame também se avalia a freqüência das atípias celulares (Fonseca, 1981). O conjunto de aspectos observados permite dizer o grau de malignidade: No grau I, a diferenciação é grande, com pontes intercelulares (como na epiderme normal), freqüêntes pérolas córneas e poucas e discretas atípias celulares. No grau II, a ceratinização é muito menos evidente, havendo presença de pérolas córneas e as atípias celulares são mais freqüentes e evidentes. No grau III, a ceratinização falta em muitas áreas, havendo paraceratose ou cornificação de células 41 isoladas com a maioria de células atípicas e mitose atípicas. No grau IV, (ou indiferenciado) a ceratinização não existe geralmente, e as células são fusiformes na sua maioria e com Núcleos de tamanhos diversos e hipercromáticos, além do grande número de mitoses atípicas (Fonseca, 1981). FIGURA 2- Aspectos histopatológicos do carcinoma espinocelular bem diferenciado, apresentando pérolas de queratina e mitoses atípicas (H/E) 400x. Fonte: Arquivo próprio (2002). 2.2 Carcinoma Espinocelular X Agnor (Técnica de Evidenciação das Regiões Organizadores de Nucleolares - Agnor) Várias técnicas têm sido utilizadas com finalidade de se conseguir observar o comportamento e modificações das células em diferentes espécies. Uma técnica que ultimamente vem sendo usada com maior freqüência é a da Agnor, a qual foi descrita em 1975 por Goodpasture & Bloon. Estes autores observaram que as proteínas Pérola mitose mitose 42 relacionadas às Nors poderiam ser demonstradas com um simples método de coloração pela prata. Mais tarde esta técnica sofreu modificações (Plotton et al., 1986), e tornou-se conhecida como técnica da Agnor e pode ser aplicada em cortes histológicos de rotina nos serviços de Histopatologia. A técnica da Agnor que utiliza a prata coloidal como veículo, se ligaria às proteínas acídicas, não histônicas (Rna Polimerase I e C23 (nucleolina) e B23 (numatrin) associadas às chamadas regiões organizadoras de nucléolos (Nors). As regiões organizadoras de nucléolos são verdadeiras alças de DNA que contêm genes de RNA Ribossômico que são transcritos para RNA polimerase (Hozak et al., 1986), (Kamel et al., 1990). As Nors estão presentes na Interfase celular dentro dos nucléolos e nos seres humanos estão localizados nos braços curtos dos cromossomos acrocêntricos números 13-14-15-21 e 22 (Babu & Verma, 1985), como vemos na (Figura 3 e 4) com função importante na formação desses nucléolos (Derenzini et al., 1988; Aguiar, 1996; Van Diest et al., 1998; Derenzini et al., 1999; Derenzini, 2000). 43 FIGURA 3 - Ideograma dos cromossomos humanos onde observa-se os braços curtos dos números 13, 14, 15, 21 e 22. Fonte: (www.biologiaarizonaedu) FIGURA 4 - Desenho de um cromossomo identificando a localização das regiões organizadoras de nucléolos no seu braço curto. Fonte: (www.biologiaarizonaedu) 44 A natureza bioquímica das Agnors ainda é controversa, mas passou a ser considerada um marcador da atividade e do potencial de transcrição do DNA possibilitando a aplicação da coloração pela prata para intensificação dessas regiões no material histológico. A coloração pela prata revela a posição ativa de transcrição da Nors dentro do Núcleo em interfase e se traduz visualmente por pontos negros que podem ser identificados ao microscópico óptico (Buys & Osinga 1980; Buys & Osinga 1984; Matolcsy et al., 1992). Já os números de Agnors numa célula pode refletir o seu grau de ploidia e/ou seu índice de dispersão pelo Núcleo (Underwood & Giri, 1988). A possibilidade de que a atividade das Nors esteja relacionada à atividade celular e assim talvez à transformação maligna, já foi observada anteriormente (Ploton et al., 1986; Crocker & Nar 1987). Sano et al. (1991), verificaram que contagens altas de Agnors são muito sugestivas de um prognóstico pior para carcinomas epidermóides de boca. A razão pela qual o número de Agnors aumenta em células malignas quando comparadas com as de tecidos normais não é conhecido. Pode haver um aumento na ploidia, no entanto (Rosa et al., 1990), consideram que em células aneuploides pode haver um número maior de cromossomas, inclusive daqueles que possuem Nors. Esta técnica vem sendo estudada em inúmeros trabalhos procurando relacionar, o número e/ou configuração das Nors com as 45 atividades nuclear e celular bem como critérios de malignidade (Crocker & Nar, 1987; Crocker 1990; Ofner et al., 1990). Egan & Crocker (1988), usaram esta técnica para analisar e comparar neoplasias benignas e malignas do tecido epitelial e concluíram que o número de Nors dos carcinomas foi maior que nas demais neoplasias indicando assim esta técnica como auxiliar de diagnóstico nas neoplasias cutâneas. Usando a técnica do Agnor (Crocker & Skilbeck, 1987), observaram que o número de Agnors era maior nos melanomas, comparados com os nevos juncionais e, frente aos resultados, salientaram o auxílio da técnica para diagnóstico diferencial entre lesões melanóticas malignas e benignas na pele. Vários outros estudos surgiram empregando a análise quantitativa das Nors, e seus resultados colaboraram na distinção entre benignidade e malignidade como vemos nos estudos de pleura normal e mesioteliomas (Ayres et al., 1988), tumores benignos e malignos do colo uterino (Derenzini et al., 1988; Yang et al., 1990), mama normal e lesões benignas e malignas da mama (Smith & Crocker, 1988) tumores de glândulas salivares benignos e malignos (Morgan et al., 1988, Matsumura et al., 1989), endocervix normal e adenocarcinoma in situ e invasivo (Darne et al., 1990). Endométrio normal e hiperplásico, neoplasias intra endometriais graus I, II e III e adenocarcinomas (Hansen & Ostergard, 1990), mucosa gástrica normal, displasia e metaplasia intestinais e 46 carcinomas gástricos (Rosa et al., 1990), tumores benignos e malignos de glândulas salivares menores (Van Heerden & Raubenheimer, 1991) mucosa oral normal, papiloma e carcinoma epidermóide (Cabrini et al., 1992). Ainda com objetivo de analisar alterações em mucosa bucal (Schwint et al., 1994), observaram diferenças estatísticas significantes entre o número de Agnor de epitélio normal e epitélio adjacente ao carcinoma epidermóide e concluíram que a técnica auxilia no diagnóstico precoce e conhecimento do crescimento tumoral. Estudando as leucoplasias bucais pela técnica da Agnor, (Nunes et al., 1990), observaram que a variação de Nors foi alterada de acordo com diferentes graus de atipia celular e salientaram o provável potencial desta técnica no comportamento biológico dessas lesões. Vários casos de carcinoma espinocelular foram observados por (Sano et al., 1991), que após contar o número de Agnor sugeriram que os casos com maior contagem comportavam-se biologicamente de forma mais agressiva. Ainda observamos na literatura que essa técnica vem sendo usada em vários outros tipos de lesões benignas e malignas de locais diversos do organismo. Embora as técnicas histopatológicas habituais empregadas atualmente tenham conseguido esclarecer muitas dúvidas dos patologistas, a técnica da Agnor pode trazer maior contribuição sobre o comportamento e diferenciação dos inúmeros 47 tumores benignos e malignos e portanto, pode ser aplicada na rotina diária colaborando na agilização e precisão dos diagnósticos. No homem, as Nors estão localizadas nos braços curtos dos cinco pares de cromossomas acrocêntricos dos grupos D (13,14,15,21,22) especialmente nas regiões de constrições que prendem as regiões satélite (Babu & Verma, 1985 , Orrel et al., 1991). Sano et al. (1991), estudaram a presença de Agnors em carcinomas espinocelulares de boca e tentaram relacionar a graduação histológica com o número de Agnors. Estes autores demonstraram que as lesões com 6 ou mais Nors por núcleo podem ter um comportamento mais agressivo e apresentar um pior prognóstico. Morita et al. (1991), analisando o significado prognóstico das Agnors em carcinomas de esôfago, concluíram que o prognóstico dos pacientes com número elevado de Agnors era significativamente pior. Estes autores relataram também que o número de Agnors estava intimamente relacionados com as metástases nos linfonodos, com a profundidade da invasão neoplásica e com a extensão da lesão. Abe et al. (1991), estudaram a diferença citomorfológica entre metaplasia escamosa atípica e carcinoma “in situ” de brônquios. Através da análise com microscopia eletrônica de transmissão, estes autores concluíram que os carcinomas “in situ” mostravam uma formação mais predominante de centros fibrilares e um número mais abundante de grânulos de pericromatina, quando comparados com as metaplasias 48 escamosas. A formação de centros fibrilares correlacionava-se bem com o número de Agnors no Núcleo. Valores elevados de Agnors representam uma célula mais maligna e o número de Agnors pode ser um indicador do grau de malignidade. Estes autores sugeriram que o número de Agnors é um método muito útil no diagnóstico diferencial principalmente nas lesões boderline do epitélio brônquico. Orrel et al. (1991), demonstraram que a contagem de apenas 30 Núcleos é suficiente para se obter um número médio de Agnors por Núcleo que seja representativo da lesão. De acordo com Egan & Crocker (1992), as Nors são partes essenciais dos constituintes nucleolares. Elas podem ser vistas como áreas eletrolucentes ao nível ultra-estrutural que são o equivalente interfásico das Nors cromossômicas interfasicas. Estas estruturas podem ser vistas ao microscópio ótico (m.o) utilizando uma variedade de técnicas. Estas Nors estão envolvidas na produção de ribossomas e, alterações potencialmente qualitativas ou quantitativas nas Nors interfásicas, quando visíveis em relação à atividade proliferativa, podem predizer um diagnóstico ou um prognóstico. Cabrini et al. (1992), constatou com dados da literatura, que o número absoluto de Agnors poderá permitir uma distinção entre lesões com grau baixo e severo de displasia. Entretanto, outros autores têm demostrado que o diagnóstico diferencial entre estas lesões com base apenas no valor numérico das Nors é impossível, considerando 49 essencial a avaliação morfológica. Segundo Cabrini et al. (1992), o aumento do número, a irregularidade e a diminuição do tamanho das Nors são uma expressão de mecanismos de proliferação e diferenciação alterados, em conjunto com a síntese de novas proteínas oncogênicas presentes no carcinoma. Mourad et al. (1992), afirmaram que célula com cinco ou mais Agnors relacionava-se com a fração da fase S medidas por meio de citometria de fluxo de DNA. Numa dupla coloração com Agnors e Ki67. Mourad et al (1994) demonstraram que o número de Agnors variava de 1 a 3 Nors nos Núcleos Ki67 negativos enquanto que Ki67 positivos apresentavam de 2 a 12 Agnors. Como a positividade ao Ki67 reflete células que estão em ciclo em muitos sistemas celulares, células com poucas Agnors pertencem a fase GO ou células em repouso, ao passo que células com números elevados de Agnors representam células em ciclos . Para Cabrini et al. (1992) e Lo Muzio et al. (1997), o número de Agnors na interfase é um reflexo mais da proliferação do que do grau de malignidade. Uma população celular anaplásica dividindo-se rapidamente provavelmente tem maior proporção de células nos estágios iniciais G1 e, deste modo, com números mais elevados de Agnors, contrariamente, neoplasias com baixo nível de proliferação celular tendem a apresentar uma única Agnor. Hirsch et al. (1992), não observaram uma relação 50 significativa entre o número médio de Agnors a localização e a graduação histológica das neoplasias de cabeça e pescoço por eles estudados. Relataram ainda que o número de Agnors correlaciona-se bem com o estágio da lesão, sugerindo que este aspecto provavelmente esteja relacionado à natureza biológica agressiva das neoplasias epiteliais malignas. Isto sugere, mas não prova que o número de Agnors tem um significado prognóstico para tumores em mesmo estágio, visto que presumivelmente o número de Agnors pode alterar-se à medida que o tumor progride. Warnakulasuriya & Johnson (1993), ressaltaram que alguns relatos sobre a aplicação da técnica Agnors para o diagnóstico histopatológico através de biópsias incisionais de lesões da cavidade bucal são de valor limitado. Segundo estes autores as Agnors podem apresentar-se de três maneiras: como uma mancha negra dentro do Núcleo representando os nucléolos; como pequenas manchas escuras discretas dentro do Núcleo ou como pequenas manchas negras dispersas no nucleoplasma. Os autores acima relataram que a interpretação do número de Agnors em população de células altamente estruturadas com um rápido tunover tais como o epitélio da mucosa bucal, pode ser um processo mais complexo comparado a tecidos com populações celulares estáveis. Números elevados de Agnors estão relacionados com o aumento na ploidia celular, com um aumento na atividade Trancricional e 51 em estados de proliferação celular ativa. Os mesmos autores citados, estudando a distribuição das Nors como marcadores do diagnóstico de hiperqueratose, displasia e carcinoma espinocelulares bucais, concluíram, que o número de Agnors apresenta um marcador prognóstico valioso em muitas condições malignas, incluindo os carcinomas espinocelulares de boca. De acordo com Kahn et al. (1993), a técnica da Agnors baseia-se na ligação da prata coloidal as proteínas acidicas não histônicas associadas a Nor, (Agnoraps), embora a verdadeira Nor que é o DNA ribossômico, tenha sido originalmente identificado através do RNA radiomarcado. Aceita-se que a argirofilia é uma característica das Nors que estão transcrevendo ativamente. Estas proteínas argirófilas estão provavelmente associadas à RNA polimerase I ou outras proteínas como a C23 (nucleolina) e a proteína B23 (numatrin) (Hall & Levison, 1990). A função dessas proteínas ainda não foi totalmente esclarecida. Epivatianos (1994), afirmou que o número de Agnors no Núcleo pode refletir o estado de ativação e o grau de malignidade da lesão envolvida. Este método tem sido utilizado para distinguir neoplasias malignas de benignas e para avaliar a graduação histológica de lesões malignas em vários órgãos. Schwint et al. (1994), relataram que Agnors nos carcinomas espinocelulares estudados por ele, apresentaram-se como aspectos mais irregulares, eram menores e mais abundantes. 52 Os mesmos autores relataram que o número de Agnors interfásica reflete o índice de proliferação celular, uma população dividindo se rapidamente apresenta uma maior proporção de células nos estágios iniciais de G1, conseqüentemente, as Agnors são observadas em maior números, por outro lado tecidos com baixa proliferação celular tendem a apresentar Agnors única. Segundo Epivatianos et al. (1994), o prognóstico do carcinoma espinocelular de boca situado no lábio inferior é melhor do que a dos situados em língua e assoalho bucal. Estes autores estudando uma possível correlação entre a localização e a contagem de Agnors, Não observaram diferenças estatísticas significativas. Afirmaram eles que, possivelmente, estes resultados sugerem que o número de Agnors não é indicativo do prognóstico dos carcinomas espinocelulares de boca, com relação à localização. De acordo com Vuhahula et al. (1994), existe uma correlação positiva entre o número de Agnors e a localização do tumor. Enquanto que a maioria dos pacientes com tumores localizados no assoalho bucal, retromolar e glândulas salivares apresentavam elevados números de Agnors e um prognóstico fatal, apenas dois dos dez pacientes com lesões no palato possuíam número elevado de Agnors e um prognóstico desfavorável. Schwint et al. (1994), estudando Agnors em epitélio de revestimento adjacente ao carcinoma espinocelular de boca, relataram 53 que um aumento no nível de proliferação de um tecido iniciado é a principal alteração nos estágios iniciais da promoção dos tumores que caracterizam as lesões pré cancerízaveis. As alterações dos números de Agnors neste epitélio indicando um maior risco de transformação maligna, sugerem uma possível contribuição da técnica Agnors na detecção de lesões pré-malignas. A coloração, das regiões organizadoras de nucléolos pela prata expressa os Nors nos Núcleos em forma de alças de DNA. A informação codificada neste DNA é transcrita para o RNA. O significado biológico destes Nors está relacionado às funções fundamentais durante a síntese de proteínas nas células. O número ou tamanho das Nors reflete a atividade proliferativa do tecido neoplásico (Kobayashi et al., 1995). Kobayashi et al. (1995), demonstraram que a severidade, em relação à displasia de cérvix uterino correlaciona-se bem com a atividade proliferativa representada pela antígeno celular de proliferação nuclear (PCNA) pelo índice mitótico e pelo número de Agnors. Epivatianos (1995), verificou que o número de Agnors e a porcentagem de células com cinco ou mais Agnors não parece ter o valor discriminativo entre o carcinoma verrucoso e o carcinoma espinocelular bem diferenciado. Altemani et al. (1995), relataram que o número de Agnors foi de valor limitado para o diagnóstico diferencial, quando estudaram 54 hiperplasias pseudoepteliomatosas secundárias às infeccões parasitárias crônicas e o carcinoma espinocelular de boca. Teixeira et al. (1996), relataram que o número de Nors, o tipo e a distribuição da área ocupada pelos Agnors, podem ser úteis para predizer o índice de sobrevida do paciente com vários tipos de neoplasias. Contudo esses autores concluíram que o tamanho das Agnors está mais consistentemente relacionado com o estado das células do que com simples contagem do número de Agnors. A correlação entre o número de Agnors por Núcleos e a atividade proliferativa tem sido demonstrada em vários relatos, em locais anatômicos variados e em diferentes malignidades (Huang, 1996). Teixeira et al. (1996), relataram que a expressão de Agnors é um bom indicador para o intervalo livre de recorrência e o prognóstico de carcinoma espinocelular de boca localizado em língua e assoalho bucal. Kinoshita et al. (1996), avaliaram a relação entre as Agnors e os efeitos histológicos da químio e radioterapia pré-operatória em carcinomas espinocelulares de boca. Estes autores relataram que quanto menor o número de Nors menores eram os efeitos terapêuticos e que quanto mais elevado o número de Nors melhores eram os efeitos terapêuticos. Os autores sugerem que o número de Agnors reflete a atividade proliferativa do tumor e confirma observações de outros autores 55 que células na fase proliferativa de seu ciclo celular são altamente sensíveis à químio e à radioterapia. Apesar do índice de sobrevida dos pacientes ser influenciados pelo estádio e pela graduação histopatológica da lesão quando do diagnóstico, o sistema TNM, assim como os demais sistemas convencionais de graduação são indicadores muito limitados do prognóstico. Isto se deve à natureza heterogênea dos carcinomas de boca e a complexidade dos aspectos prognósticos (Piffko et al., 1997). Cada um destes cromossomos possui duas Nors. Deste modo, o número de Nors em células diplóides normais é 20, tipicamente agregadas em um ou dois nucléolos durante a interfase nuclear (Lo Muzio et al., 1997). Segundo Chatterjee et al. (1997), o número de Nors pode variar de acordo com o número de cromossomos que contem Nors no cariótipo, com a atividade transcricional e com o estagio do ciclo celular. Piffko et al. (1997), relataram que o custo da reação Agnors é mais baixo do que o da maioria das reações imuno- histoquímicas geralmente utilizadas no diagnóstico de neoplasias. Várias tentativas têm sido feitas para melhorar a acuracidade do prognóstico e para minimizar a subjetividade das classificações histológicas estabelecidas. Nos últimos anos, a técnica Agnors tem se tornado um método amplamente utilizado na patologia tumoral, principalmente na determinação do prognóstico de neoplasias 56 malignas. As Agnors refletem as atividades biossintéticas e nucleolares de uma célula servindo como indicadores da rapidez do ciclo celular (Piffko et al., 1997). Xie et al. (1997), relataram que uma lesão displásica que evolui para carcinoma apresenta um número mais elevado de Agnors do que o número de Agnors das demais displasias. Isto indica que a contagem de Agnors pode auxiliar na determinação do prognóstico de uma lesão displásica. Segundo Xie et al. (1997), vários estudos têm demonstrado que um número aumentado de Agnors está associado com uma maior agressividade do tumor, uma vez que o número médio de Agnors por Núcleo é maior em lesões malignas quando comparado com lesões benignas, em lesões com alto grau de malignidade e em tumores com um pior prognóstico. Lo Muzio et al. (1997), afirmaram que o aumento do número, irregularidades na forma e redução nas dimensões das Agnors poderiam ser a expressão de uma alteração nos mecanismos que controlam a proliferação celular e, provavelmente, a diferenciação celular. Desta forma, a análise do número médio de Agnors na mucosa bucal poderia ser um indicativo do grau de malignidade, orientando, deste modo, o prognóstico dos carcinomas espinocelulares de boca. Uma das principais características de malignidade é uma alteração no índice de proliferação celular. Tem sido sugerido que esta 57 alteração poderia refletir a agressividade biológica de um dado tumor, exercendo, deste modo, um efeito decisivo no curso clínico de diferentes neoplasias malignas. Contudo, Piffko et al. (1997), afirmaram que a determinação da proliferação, do ponto de vista clinico, é ainda problemática. Segundo estes autores, a análise das Agnors permite uma melhor observação da cinética da proliferação de uma neoplasia, pois fornece uma informação adicional sobre a atividade metabólica da população celular investigada. Segundo Chiusa et al. (1997), a quantidade de Agnors relaciona-se com atividades de duplicação e proliferação celulares e é um fator prognóstico significativo em várias neoplasias. As Agnors estão associadas com o grau de diferenciação histológica, com o estágio tumoral e com a sobrevida de pacientes com carcinomas de próstata. Apesar do significado biológico das Agnors ainda ser incerto, Xie et al. (1997), relataram que a relação entre a quantidade de Agnors e a cinética celular tem sido demonstrada em vários estudos. Células em repouso normalmente tem apenas uma única Agnor. A quantidade de Agnors aumenta durante a fase G1 e atinge o nível máximo durante as fases S e G2. Xie et al. (1997), afirmaram que o número de Agnors em qualquer estágio do ciclo de divisão celular parece ser inversamente proporcional ao tempo deste ciclo, ou seja, quanto maior a quantidade de Agnors, mais curto será o ciclo celular. O valor prognóstico do número de Agnors em neoplasias 58 é bem reconhecido, apesar de algumas observações contraditórias. O número de Agnors reflete várias características dos tumores, principalmente o nível de proliferação celular, o grau de diferenciação, a presença de metástase e recorrência. Valores elevados de Agnors em carcinomas pobremente diferenciados indicam uma associação com a agressividade e com um prognóstico mais pobre (Chatterjee et al., 1997). De acordo com Xie et al. (1997), áreas com necrose, com inflamação pronunciada, com destruição artificial ou com evidente queratinização não devem ser incluídas na contagem das Agnors. Todas as estruturas coradas pela prata dentro do Núcleo que apareciam como manchas negras isoladas ou agrupadas eram distinguidas e contadas. Agnors agrupadas e nucléolos com grânulos corados pela prata muito pequenos eram contados com apenas uma única Agnors. Chiusa et al. (1997), relataram que a contagem das Agnors deve ser realizada nas áreas menos diferenciadas dos tumores. Há portanto uma grande necessidade de se estudar novos marcadores de prognóstico que possam orientar o clinico na escolha correta da modalidade terapêutica a ser empregada. Alem disso esses marcadores são fundamentais para o melhor entendimento da biologia dessas neoplasias (Bryne, 1998). Portanto, o diagnóstico precoce do câncer é de fundamental importância, visando a maior sobrevida e melhor qualidade de vida dos pacientes (Martin et al., 1998). 59 Geralmente é aceito que quanto mais precoce for o diagnóstico e o tratamento do câncer bucal mais favorável será o prognóstico (Seetharam & Ramachandran, 1998). Wolanski et al. (1998), relataram que o uso de métodos de avaliação das Agnors em diagnósticos não tem sido universalmente aceito. Métodos variados de coloração da Agnor demonstrando que é essencial que se desenvolva uma técnica padronizada para que se possa fazer a análise de estudos comparativos. Wolanski et al. (1998), em seus estudos têm demonstrado alguma correlação entre o número de Agnors por célula e a malignidade. Contudo, um número de superposição entre os casos benignos e malignos tem levado alguns investigadores a questionar o valor diagnóstico deste método. Mais recentemente, tem sido sugerido que a área ocupada pelas Agnors pode ser mais útil na determinação do diagnóstico. O significado das Agnors dentro de uma célula ainda não foi completamente determinado mas tem sido sugerido que seja um reflexo da proliferação celular, da ploidia celular ou de um aumento na transcrição gênica (Wolanski et al., 1998). Migaldi et al. (1998), estudando a correlação entre Agnors e o p 120 (antígeno nuclear de 120 KDa detectado em células em proliferação), observaram que valores elevados destes marcadores parecem refletir uma atividade citoproliferativa aumentada e um menor 60 grau de diferenciação celular. Isto estaria diretamente envolvido com o diagnóstico e um provável prognóstico em Patologia Bucal. Recentemente, os mais novos marcadores que predizem a agressividade de uma neoplasia, como a cinética celular, os oncogênes, os genes supressores tumorais e o conteúdo de DNA nuclear, têm auxiliado a elucidação do comportamento biológico dos tumores e têm complementado os fatores prognósticos tradicionais. Isto tem se tornado possível graças aos avanços da biologia molecular em vários tipos de neoplasias (Suto et al., 1998). Suto et al. (1998), afirmaram que as Agnors demonstram o potencial maligno dos tumores, mas não necessariamente prevem a sobrevida dos pacientes com carcinomas de ducto biliar extra – hepático. Hamakawa et al. (1998), estudando as expressões do pc53, Pcna e Agnors antes e após a quimioterapia em carcinomas espinocelulares de boca, não observaram nenhuma tendência de alteração na contagem de Agnors em resposta à quimioterapia. Wolanski et al. (1998), sugeriram que a análise das Agnors deve ser realizada através de imagem computadorizada, visando uma melhora na acuracidade e reprodutibilidade obtidas pelo aumento da precisão dos meios de medidas. De acordo com Suto et al. (1998), a técnica de coloração das Agnors é de fácil manejo e barata, justificando sua grande utilidade em histopatologia. PROPOSIÇÃO 62 3 PROPOSIÇÃO Os carcinomas espinocelulares de boca apresentam durante a sua evolução alterações substanciais nas células neoplasicas, o número de cromossomos sofre alterações e conseqüentemente o número de Nors também está alterado. A nossa proposta neste trabalho foi realizar uma análise clínica quantitativa e morfométrica de Nors e Núcleos presentes nas células neoplásicas de carcinomas espinocelulares em diferentes regiões da boca de humanos, pelo método da Agnor, através da técnica computadorizada, utilizando sistema Imagelab 2000, para verificar o comportamento clínico e morfométrico das Nors e Núcleos dos carcinomas. MATERIAL E MÉTODO 64 4 MATERIAL E MÉTODO Foi realizado um levantamento dos casos de carcinomas espinocelulares de boca, diagnosticados clinica e histológicamente no departamento de Diagnóstico e Propedêutica da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, no período de 10 anos (1989 a 1998) onde foram selecionados 81 casos de carcinomas espinocelulares de grau I (bem diferenciado) e grau II (moderadamente diferenciado) (Apêndice B). 4.1 Análise clínica Após a realização do levantamento nos arquivos de lâminas, os dados clínicos referentes aos casos estudados foram obtidos nas requisições de exame anátomo patológico existentes no arquivo do serviço de Patologia (Apêndice A) e nos prontuários dos pacientes do COB (Centro de Oncologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Araçatuba). As informações anotadas sobre os carcinomas foram: sexo, raça, idade, grau de diferenciação do tumor, TNM (Estadiamento do tumor) e se paciente fumava ou bebia. 4.2 Análise histopatológica Dos 81 casos de carcinomas espinocelulares existentes 65 nos arquivos do departamento de Diagnóstico e Propedêutica da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, 13 casos foram desprezados, pois o conteúdo dos blocos de parafina eram insuficiente para novos cortes e não pôde ser aproveitado. Foram então selecionados 68 casos (Apêndice C) para serem os blocos separados e deles cortes de 3µm de espessura serão retirados para a confecção da técnica Agnor. As lâminas dos 68 casos sendo 12 casos de carcinoma do lábio, 14 casos de carcinoma da língua, 18 casos de carcinoma de assoalho bucal, 12 casos de carcinoma de palato, e 12 casos de carcinomas de retromolar, sendo eles caracterizados como bem diferenciados ou moderadamente diferenciados. As lâminas desses casos foram revisadas para confirmar o grau de diferenciação e se a quantidade de material existente era suficiente para a realização da técnica de Agnor. 4.3 Análise histoquímica Nas biópsias incluídas em parafina foram realizados cortes seriados de 3µm para serem submetidos à técnica Agnor, descrita por Ploton et al. (1986), com ligeiras modificações propostas por Nunes et al. (1990). Além disso introduzimos outras modificações para adaptar a técnica às nossas condições laboratoriais, a fim de permitir a visualização das Nors. A técnica utilizada neste trabalho foi realizada da seguinte forma: 66 1. Preparação da solução A (gelatina 2%) em água fervente (não deixar ferver); deixar esfriar bem e adicionar 0,25 ml de acido fórmico à mistura e guardá-la em local escuro. 2. Preparação da solução B (prata), 5g de nitrato de prata em 10 ml de água destilada, sem saturar. Filtrar a solução e guardar em local escuro. 3. Preparação da câmara escura e úmida, mantendo-a em estufa a 40ºC. 4. Os cortes de 3µm selecionados foram desparafinizados, em estufa a 80ºC por 5 minutos. 5. Em seguida deu-se continuidade ao processo de desparafinizaçao, retirando-se as lâmina da estufa e colocando-as em 3 banhos de xilol. 6. Após a retirada das lâminas do xilol foi realizado o processo de hidratação, através das passagens sucessivas das lâminas em várias soluções decrescentes de etanol. 7. Após a hidratação, e com as lâminas colocadas ligeiramente inclinadas em um suporte de madeira, foi conduzida a lavagem dos cortes vagorosamente por gotejamento ou jatos suaves com água destilada, usando pipetas ou até pissetas, pelo menos por 10 minutos. 8. Após a lavagem das lâminas misturou-se em câmara escura 1 volume da solução A (gelatina) e 2 volumes da solução B 67 (prata). 9. Coloração: As lâminas a serem coradas foram colocadas em posição horizontal e sobre os cortes foi gotejada a solução preparada (A+B), cobrindo-os totalmente. Em seguida a câmara úmida foi levada de volta para a estufa a 40ºC por 20 minutos. Esse tempo está na dependência da temperatura, pois o calor acelera a reação. No nosso trabalho chegamos à conclusão que a temperatura de 40 graus durante 20 minutos foi ideal para estabelecer uma coloração satisfatória. 10. Após a coloração as lâminas foram retiradas da câmara úmida e colocadas em um suporte de madeira ou de vidro de maneira que ficassem inclinadas para a realização da lavagem vigorosa dos cortes com água destilada fria, por um período de 15 minutos, para retirar todo tipo de precipitação pela prata. 11. Após a lavagem adequada os cortes passaram por um processo de desidratação em série crescente de etanol. 12. Após a desidratação os cortes foram submetidos a um processo de diafanização em dois banhos de xilol: 13. Procedeu-se a montagem com lamínulas de vidro em PermountR*, que não interfere no processo de coloração. 14. Após a obtenção de todas as lâminas as mesmas foram submetidas a microscopia de luz para verificação da qualidade da coloração. * PermountR – meio de adesão de lamínula com índice de refração de 1,53, transparente, neutro e seca rapidamente. 68 4.4 Análise quantitativa e morfométrica Para a análise quantitativa das Nors, após a coloração pela técnica Agnor já descrita, dois campos em cada lâmina foram selecionados de forma aleatória para a contagem das Nors, e as imagens foram obtidas através de um microscópio de luz com objetiva de imersão e aumento final de 1000x, com foco de luz que permitia uma clareza de campo, e melhores condições de contagem e identificação. As imagens do microscópico óptico eram captadas por uma câmera, transferidas para um monitor, que permitia serem arquivadas no computador para posteriormente ter condições de se determinar as análises morfométricas das Nors e Núcleos (Figura 5). FIGURA 5 - Área de Nors e Núcleos corados pela técnica Agnor para serem analisados (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). 69 A análise morfométrica das Nors e Núcleos (nº, área) foi realizada por um sistema computadorizado que utiliza o software Imagelab 2000. O sistema computadorizado compõe-se de um computador IBM – Personal Computer 300GL que contém o programa Imagelab 20001. As imagens dos campos são obtidas em um microscópio de luz Nikon YS2-T Japan acoplado a um sistema de câmera de captação de imagem modelo CV 730 PDC – 12VDC – 800MA – made in Japan que são transferidas para o monitor do computador (Figura 6). FIGURA 6 - Equipamento utilizado para análise quantitativa e morfométrica das Nors (Disciplina de Patologia da F.O.P.P. – Unoeste). Fonte: Arquivo próprio (2002). O sistema permite que na imagem captada no monitor, passamos de forma bastante cuidadosa, com dispositivo do próprio 1 O software Imagelab 2000 foi adquirido pela Unoeste, tendo como referência sido desenvolvido pela USP São Paulo. 70 software circundar todas as estruturas das Nors visualizadas na tela, bem como em uma segunda oportunidade circundar todos os Núcleos, e com isso obter o número de estruturas circundadas, bem como sua área, que ficam registradas em uma planilha de resultados. Todas as estruturas das Nors e Núcleos apresentadas na tela do monitor foram circundadas por um dispositivo que selecionava as regiões e permitia efetuar o contorno da Nor e Núcleo (Figura 7). Após todos selecionados e circunscritos, pela ativação de um dispositivo do computador era conferido a essas áreas uma coloração azul, caracterizando bem as estruturas selecionadas (ver foto das Nors e Núcleos selecionados), (Figura 8 e Figura 9). FIGURA 7 - Área das Nors circundadas para análise (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). Os resultados das áreas selecionadas, número de Nors, 71 Núcleo, área de Nors e Núcleo foram automaticamente calculadas em uma planilha que posteriormente eram selecionadas e impressas para auxiliar na elaboração dos resultados (Ver planilha, Figuras 10 e 11). FIGURA 8 - Área das Nors circundadas e selecionadas para análise (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). FIGURA 9 - Área dos Núcleos circundadas e selecionadas para análise (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). 72 As planilhas e áreas selecionadas podem ser impressas ou fotografadas para ilustração. FIGURA 10 - Planilha com os resultados da contagem das Nors. Fonte: Arquivo próprio (2002). FIGURA 11 - Planilha com os resultados da contagem Núcleos e áreas para compor o trabalho. Fonte: Arquivo próprio (2002). 73 As planilhas foram impressas para auxiliar na proposição do trabalho. 4.5 Análise estatística O número final das Nors/Núcleo para cada caso foi obtido pela média aritmética (ver Apêndice D) enquanto que os valores de área das Nors e Núcleo foram fornecidos pelo sistema (através de planilhas). Após a análise quantitativa e morfométrica, todos os dados foram tabulados e submetidos à análise estatística. Para a comparação das médias relativas às variáveis quantitativas foram verificadas as médias das Nors/Núcleos e a relação área Nor/Núcleo submetidas a uma análise de variância (ver Apêndice E, Tabelas 34, 35, 36, 37 e 38). Também foram realizadas análises separadas de cada área distinta do carcinoma da boca. Em todos os casos adotou-se um nível de 5% de significância. Foram determinados ainda e apresentados, intervalos de confiança entre as médias de Nor/Núcleo e as médias da área dos Nor e Núcleos. RESULTADO 75 5 RESULTADO 5.1 Aspectos clínicos Foi feito um levantamento das lâminas do arquivo do Laboratório de Patologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – FOA UNESP, obtidas de 1989 até 1998, totalizando 81 casos de carcinomas espinocelulares de boca (ver Apêndice B), distribuídos em cinco áreas distintas (Tabela 2), ou seja, quinze casos (18,5%) são carcinomas de lábio inferior, quinze casos (18,5%) carcinomas de língua, vinte e quatro casos (29,7%) carcinomas de assoalho de boca, treze casos (16,0%) carcinomas de palato duro e catorze casos (17,3%) carcinomas de região retromolar (Figura 12). 5.1.1 Carcinomas de lábio Dos quinze casos de carcinomas de lábios, treze (86,66%) eram do sexo masculino, sendo 100% leucodermas com idades entre 41 a 85 anos, média de 63 anos (Tabelas 3, 4, 5; Figuras 13, 14, 15). Observamos que esses carcinomas de acordo com a ficha de avaliação, segundo a classificação TNM, apresentavam doze (80,0%) T1NoMo (tumor com 2cm ou menos em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase a distância), dois casos (13,33%) T2NoMo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase a distância), um caso (6,67%) T3NoMo (tumor com 76 mais de 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase adistância), (Tabela 6; Figura 16). Todos os carcinomas apresentavam uma graduação histopatológica bem diferenciados (Tabela 7; Figura 17), e observamos que entre os casos de carcinomas nove (60,0%) pacientes eram tabagista e etilistas e os outros 6 (40%) não participavam desses hábitos (Tabelas 8, 9; Figuras 18, 19). 5.1.2 Carcinomas de língua Nos quinze casos dos carcinomas de língua todos (100%) eram do sexo masculino, catorze (93,33%) pacientes eram leucodermas e apenas um (6,67%) era melanoderma e que suas idades variavam entre 36 a 83 anos com média de 60 anos (Tabelas 3, 4, 5; Figuras 13, 14, 15). Esses carcinomas de língua apresentavam treze casos (86,66%) T2NoMo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), dois casos (13,34%) T2N1Mo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, metástase em um único linfonodo homolateral com 3cm ou menos em sua maior dimensão, e ausência de metástase à distância), (Tabela 6; Figura 16). Dentre esses carcinomas de língua doze (80,0%) eram de acordo com a graduação histopatológica bem diferenciados e três (20,0%) moderadamente diferenciados (Tabelas 7; Figura 17) entre esses pacientes que apresentavam o carcinoma de língua catorze (93,33%) fumavam e todos (100%) consumiam bebida alcoólica (Tabelas 77 8, 9; Figuras 18, 19). 5.1.3 Carcinomas de assoalho da boca Entre os vinte e quatro casos de carcinomas de assoalho da boca vinte e três (95,83%) eram do sexo masculino e apenas um (4,17%) era do sexo feminino; dezessete (70,83%) eram leucodermas e sete (29,17%) eram melanodermas, com relação às idades que variavam entre 42 a 72 anos em média de 57 anos (Tabelas 3, 4, 5; Figura 13, 14, 15). Os casos de carcinomas apresentavam um caso (4,16%) TxNoMo (tumor primário não pode ser avaliado, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), seis casos (25,0%) T2NoMo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), seis casos (25,0%) T3NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um caso T3N1Mo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, metastase em um único linfonodo homolateral com 3cm ou menos em sua maior dimensão e ausência de metástase à distância), um caso (4,16%) T3N2cMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão e ausência de metástase à distância), quatro casos (16,66%) T4NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, ausência de metástase em linfonodos 78 regionais e ausência de metástase a distância), um caso (4,16%) T4N1Mx (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, metástase em um único linfonodo homolateral, com 3cm ou menos em sua maior dimensão e a metástase à distância não pode ser avaliada), dois casos (8,33%) T4N1Mo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, metástase em um único linfonodo homolateral, com 3cm ou menos em sua maior dimensão e ausência de metastase a distância), dois casos (8,33%) T4N2cMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão, e ausência de metastase à distância), (Tabela 6; Figura 16). Dentre esses vinte e quatro carcinomas, vinte deles (83,33%) eram de acordo com a graduação histopatológica, bem diferenciados e os outros quatro (16,66%) moderadamente diferenciados (Tabela 7; Figura 17) e ainda observamos que dentre esses pacientes, vinte deles (83,33%) fumavam e dezoito (75,0) deles consumiam bebida alcoólica, quatro (16,66%) não fumavam e nem bebiam e apenas dois (8,33%) fumavam mas não consumiam bebida alcoólica (Tabelas 8, 9; Figura 18, 19). 5.1.4 Carcinomas de palato duro Dos trezes casos de carcinomas de palato duro, onze (84,62%) eram do sexo masculino e dois (15,38%) do sexo feminino; dez (76,92%) eram leucodermas e três (23,08%) eram melanodermas, e as 79 idades variavam entre 30 e 81 anos com idade média de 55 anos (Tabelas 3, 4, 5; Figuras 13, 14, 15). Os casos de carcinomas apresentavam um caso (7,69%) T1NoMo (tumor com 2cm ou menos em sua maior dimensão, ausência de metástase linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um (7,69%) T2NoMo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), seis (46,16%) T3NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, ausência de metastase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um (7,69%) T3N2cMx (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão e ausência de metástase à distância), três (23,08%) T4NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um (7,69%) T4N2cMx (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, metástase em linfonodos bilaterais e contralaterais, nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão, ausência de metástase à distância), (Tabela 6; Figura 16). Dentre os trezes carcinomas, onze deles (84,62%), de acordo com a graduação histopatológica, eram bem diferenciados e os outros dois (15,38%) eram moderadamente diferenciados (Tabela 7; Figura 17) e observamos também que esses pacientes, doze deles (92,31%) fumavam e onze 80 (84,62%) consumiam bebida alcoólica, apenas um (7,69%) não fumava e dois (15,38%) deles não bebiam (Tabelas 8, 9; Figuras 18, 19). 5.1.5 Carcinomas de região retromolar Dos catorzes casos de carcinomas espinocelulares da região retromolar, doze (85,71%) eram do sexo masculino e dois (14,28%) do sexo feminino; doze (85,71%) eram leucodermas e dois (14,28%) melanodermas, e as idades entre eles variavam de 41 a 93 anos, com média de 67 anos (Tabelas 3, 4, 5; Figuras 13, 14, 15). Os casos de carcinomas apresentavam cinco (35,71%) T2NoMo (tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), três (21,42%) T3NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um (7,15%) T3N2bMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão, metástase em linfonodos homolaterais múltiplos nenhum deles com mais de 6cm em sua maior dimensão e ausência de metástase à distância), quatro (28,57%) T4NoMo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, ausência de metástase em linfonodos regionais e ausência de metástase à distância), um (7,15%) T4N1Mo (tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão com invasão das estruturas adjacentes, metástase em um único linfonodo homolateral, com 3cm ou menos em sua maior dimensão e ausência de metastase a distância), (Tabela 6; Figura 16). Os carcinomas de região 81 retromolar apresentavam uma graduação histopatológica, sendo onze (78,57%) bem diferenciados e três (21,43%) eram moderadamente diferenciados (Tabela 7; Figura 17). E ainda observamos que onze (78,57%) dos pacientes fumavam e dez (71,42%) bebiam, apenas três (21,43%) não fumavam e quatro deles (28,58 %) deles não consumiam bebida alcoólica (Tabelas 8, 9; Figuras 18, 19). Tabela 2 – Dados representativos dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao local anatômico Local Anatômico Freqüência % Lábio 15 18,5 Língua 15 18,5 Assoalho 24 29,7 Palato 13 16,0 Retromolar 14 17,3 Total 81 100 15 18,5 15 18,5 24 29,7 13 16 14 17,3 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Lábio Língua Soalho Palato Retromolar Total Freqüência % FIGURA 12 - Dados representativos dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao local anatômico. Fonte: Arquivo próprio (2002). 82 Tabela 3 – Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao sexo Sexo Freqüência % Masculino 74 91,3 Feminino 07 8,7 Total 81 100 74 91,3 7 8,7 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Masculino Feminino Total Freqüência % FIGURA 13 - Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao sexo. Fonte: Arquivo próprio (2002). 83 Tabela 4 – Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação à idade Faixa Etária Freqüência % 30-40 05 6,1 41-50 19 23,5 51-60 26 32,1 61-70 13 16,1 71-80 14 17,3 81-90 04 4,9 Total 81 100,0 5 6,1 19 23,5 26 32,1 13 16,1 14 17,3 4 4,9 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 Total Freqüência % FIGURA 14 - Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação à idade. Fonte: Arquivo próprio (2002). 84 Tabela 5 – Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação à raça Raça Freqüência % Leucoderma 68 84,0 Melanoderma 13 13,5 Total 81 100 68 84 13 13,5 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Leucoderma Melanoderma Total Freqüência % FIGURA 15 - Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação à raça. Fonte: Arquivo próprio (2002). 85 Tabela 6 – Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao estadiamento clínico TNM TNM Lábio Língua Assoalho Palato Retromolar T1Nomo 12 01 05 T2Nomo 02 13 06 01 T3Nomo 01 06 06 03 T3N1mo 02 01 T3N2bmo 01 T3N2cmo 01 T3N2cmx 01 T4Nomo 04 03 04 T4N1mo 02 01 T4N1mx 01 T4N2mo 02 T4N2cmx 01 TxNomo 01 Total 15 15 24 13 14 12 2 1 15 13 2 15 6 6 11 4 212 1 24 11 6 1 3 1 13 5 3 1 4 1 14 0 5 10 15 20 25 Lábio Língua Assoalho Palato Retromolar T1Nomo T2Nomo T3Nomo T3N1mo T3N2bmo T3N2cmo T3N2cmx T4Nomo T4N1mo T4N1mx T4N2mo T4N2cmx TxNomo Total FIGURA 16 - Distribuição dos casos Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao estadiamento clínico TNM. Fonte: Arquivo próprio (2002). 86 Tabela 7 – Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao grau de diferenciação Grau de Local Local Local Local Local Diferenciação Lábio % Língua % Assoalho % Palato % Retromolar % Bem diferenciado 15 100 12 80 20 83 11 84 11 79 Moderadamente diferenciado - - 03 20 04 17 02 16 03 21 Total 15 100 15 100 24 100 13 100 14 100 15 0 12 3 20 4 11 2 11 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Lábio Língua Assoalho Palato Retromolar Bem diferenciado Moderadamente diferenciado FIGURA 17 - Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao grau de diferenciação. Fonte: Arquivo próprio (2002). 87 Tabela 8 – Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao tabagismo Tabagismo Freqüência % Tabagista 66 81,5 Não tabagista 15 18,5 Total 81 100 66 81,5 15 18,5 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tabagista Não tabagista Total Freqüência % FIGURA 18 - Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao tabagismo. Fonte: Arquivo próprio (2002). 88 Tabela 9 – Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao etilismo Etilismo Freqüência % Etilista 62 76,5 Não Etilista 19 23,5 Total 81 100,0 62 76,5 19 23,5 81 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Etilista Não Etilista Total Freqüência % FIGURA 19 - Distribuição dos casos de Carcinoma Espinocelular bucal em relação ao etilismo. Fonte: Arquivo próprio (2002). 89 5.2 Aspectos histopatológicos As lâminas das biopsias dos carcinomas espinocelulares selecionados para coloração da técnica Agnor, foram revisadas para confirmação do resultado em H/E e verificação do campo que seria selecionado para a contagem das Nors (Figura 20). Após isso os blocos de parafina foram separados e de cada um deles foram retirados 2 cortes de 3µm e 2 lâminas eram confeccionadas para a contagem das Nors. FIGURA 20 - Aspectos histopatológicos do carcinoma espinocelular moderadamente diferenciado, apresentando mitoses atípicas (H/E) 400x. Fonte: Arquivo próprio (2002). mitose mitose mitose mitose mitose 90 5.3 Análise quantitativa e morfométrica das regiões organizadoras de nucléolos Nas lâminas estudadas, as regiões organizadoras de nucléolos coradas pela prata (Agnors), foram visualizadas como pontos negros ou castanhos, localizados no interior dos Núcleos (Figura 21). Figura 21 – Área com células coradas pela Agnor indicando pontos escuros ou castanhos (Nors) no interior do Núcleo (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). Os Núcleos eram verificados como estruturas maiores de coloração amarelada, redondas ou ovóides (Figura 22). 91 FIGURA 22 – Área com células coradas pela Agnor indicando os Núcleos (1000x). Fonte: Arquivo próprio (2002). Apresentamos a seguir, os dados que foram obtidos da análise dessas regiões organizadoras nucleolares (Nors), de células dos casos de carcinoma de várias áreas distintas da boca. Para análise das Nors e Núcleos de todos os casos estudados, selecionamos duas áreas em cada lâmina das biópsias para captação da imagem pela câmera. Esta imagem era projetada na tela do computador onde eram contadas todos as Nors e Núcleos presentes no campo. Para a contagem dos números de Nors, área da Nors, número de Núcleo e área do Núcleo, selecionados no (Apêndice D) apresentou os seguintes resultados: Lábio (Tabelas 24 e 25), Língua (Tabelas 26 e 27), Assoalho (Tabelas 28 e 29), Palato (Tabelas 30 e 31) e 92 Retromolar (Tabela 32 e 33). Após a contagem do número de Nors e Núcleo