ALANA EMANOELE PEREIRA Trichoderma spp. NO MANEJO DE Fusarium verticillioides EM SEMENTES DE MILHO E EFEITO NA QUALIDADE FISIOLÓGICA Botucatu 2024 ALANA EMANOELE PEREIRA Trichoderma spp. NO MANEJO DE Fusarium verticillioides EM SEMENTES DE MILHO E EFEITO NA QUALIDADE FISIOLÓGICA Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de “Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). ” Orientadora: Profa. Dra. Adriana Zanin Kronka Botucatu 2024 AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida, por sua proteção e presença ao longo da minha caminhada e por me permitir concretizar mais esse sonho. Aos meus pais Vera e Claudecir, e minha irmã Aline por não medirem esforços para realização dos meus sonhos, sou grata pelo cuidado, amparo e apoio incondicional. Obrigada por acreditarem em mim, vocês fazem parte de todas as minhas conquistas. A minha orientadora Prof.ª Dr.ª Adriana Zanin Kronka pela orientação, ensinamentos, disponibilidade, paciência e compreensão. Obrigada por participar da minha formação profissional e pessoal, serei sempre grata. A Prof.ª Dr.ª Maria Marcia Pereira Sartori pela ajuda e disponibilidade na condução do trabalho. As minhas amigas Luana Catelan, Camile Dutra e amigo Marcos Pedroza, vocês foram essenciais para condução desse trabalho. Obrigada pela parceria e amizade dentro e fora do laboratório de patologia de sementes. Aos funcionários da UNESP/ Botucatu que colaboraram direta ou indiretamente com esse trabalho. A todos que contribuíram de forma direta ou indireta para realização desse sonho. Muito obrigada. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil – CAPES – Código de financiamento 001. “É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se com os pobres de espírito, que nem gozam muito, nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota. ” ROOSEVELT, T. The strenuous life: essays and adresses. New York: Adegi Graphics LLC,1924. p. 4. RESUMO O milho é o segundo grão mais cultivado no Brasil, e um dos cereais mais produzidos em todo o mundo. As doenças são um dos principais fatores que podem afetar o rendimento desta cultura. O gênero Fusarium está entre os mais importantes agentes fitopatogênicos associados a perdas de qualidade de grãos de milho. A contaminação das sementes e a disseminação de patógenos podem ser amenizadas por meio do tratamento de semente, o qual também proporciona melhor estabelecimento das plantas. O tratamento biológico de sementes é uma alternativa ao uso de produtos químicos, que visa controlar doenças e pragas por meio da ação antagônica de inimigos naturais. Além disso, a partir do tratamento biológico é possível aumentar o crescimento e desenvolvimento de plantas, resultando em maior produtividade de grãos. Assim, objetivou-se avaliar a influência do tratamento de sementes de milho com três cepas de Trichoderma spp., isoladas e em mistura com o fungicida Maxim®, no controle de Fusarium verticillioides e na qualidade fisiológica das sementes. O experimento foi conduzido com sementes de milho da cultivar AL PIRATINGA e com as cepas SLV 10, LQC 96 e IF 205. Inicialmente, foi verificada a ação “in vitro” das cepas de Trichoderma sobre o isolado de Fusarium. Em seguida, as sementes foram tratadas com as cepas de Trichoderma, isoladas e em mistura com o fungicida, e avaliadas em laboratório [testes de sanidade, vigor (primeira contagem de germinação – PCG) e germinação, comprimento e massa de plântulas] e em casa de vegetação [comprimento e massa das plantas e índice de velocidade de emergência (IVE)]. As cepas de Trichoderma LQC 96 e SLV 10 apresentam potencial antagônico no controle micelial de F. verticillioides. Os resultados de qualidade sanitária e fisiológica das sementes de milho não justificam o uso da interação dos produtos químicos e biológicos. Uma vez que Trichoderma spp. tem reconhecida ação no controle de fitopatógenos, testes adicionais, com diferentes técnicas de tratamento das sementes de milho com este bioagente, e de ensaios em campo se fazem necessários para obtenção de resultados mais conclusivos. Palavras-chave: controle biológico; tratamento de sementes; patologia de sementes; Zea mays. ABSTRACT Corn is the second most cultivated grain crop in Brazil, and one of the most grown cereals around the world. Diseases are one of the main factors that can affect crop yield. Genus Fusarium is one of the most important phytopathogenic agents associated with quality loss of corn grains. Seed contamination and pathogens spread can be mitigated through seed treatment, which also provides better plant establishment. Biological seed treatment is an alternative to the use of chemical products, and it aims to control diseases and pests through the antagonistic action of natural enemies. Moreover, by using biological treatment, it is possible to increase plant growth and development, resulting in higher grains productivity. Thus, the objective was to evaluate the influence of corn seeds treatment with three strains of Trichoderma spp., isolated and mixed with the fungicide Maxim®, on Fusarium verticillioides control of and the seeds physiological quality. The experiment was carried out with AL PIRATINGA cultivar corn seeds and SLV 10, LQC 96 and IF 205 strains. Initially, Trichoderma strains “in vitro” action on Fusarium isolate was verified. Then, the seeds were treated with Trichoderma strains, isolated and mixed with the fungicide, and evaluated in laboratory [health, vigor (first germination count – PCG) and germination tests, as well as seedlings length and] and in greenhouse [plants length and mass as well as emergence speed index (IVE)]. LQC 96 and SLV 10 Trichoderma strains showed antagonistic potential in F. verticillioides mycelial control. Results regarding to the health and physiological quality of corn seeds do not justify the use of the interaction of chemical and biological products. Since Trichoderma spp. Has recognized action in phytopathogens control, more tests, with different techniques of corn seeds treatment with this bioagent, and field trials are necessary to obtain more conclusive results. Keywords: biological control; seed treatment; seed pathology; Zea mays. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 16 2.1 Aspectos gerais da cultura do milho............................................... 16 2.2 Podridões na cultura do milho......................................................... 19 2.3 Tratamento de sementes................................................................... 20 2.3.1 Tratamento biológico......................................................................... 22 2.3.1.1 Trichoderma spp................................................................................ 23 3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................. 28 3.1 Local do experimento....................................................................... 28 3.2 Obtenção dos fungos....................................................................... 28 3.2.1 Cepas de Trichoderma spp.............................................................. 28 3.2.2 Espécie de Fusarium verticillioides................................................ 28 3.3 Avaliação do antagonismo de cepas de Trichoderma spp. sobre Fusarium verticillioides.................................................................... 29 3.4 Tratamento biológico e químico de sementes de milho............... 31 3.5 Avaliação da qualidade sanitária e fisiológica das sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp............................................................... 31 3.5.1 Testes de laboratório......................................................................... 32 3.5.1.1 Teste de sanidade.............................................................................. 32 3.5.1.2 Testes de germinação e primeira contagem de germinação......... 32 3.5.1.3 Comprimento e massas seca e fresca de plântulas....................... 33 3.5.2 Testes em casa de vegetação........................................................... 34 3.5.2.1 Emergência e Índice de velocidade de emergência (IVE).............. 35 3.5.2.2 Comprimento e massas fresca e seca de plântulas....................... 35 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 36 4.1 Antagonismo de cepas de Trichoderma spp. sobre Fusarium verticillioides...................................................................................... 36 4.2 Qualidade sanitária de sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp...................................................................................................... 37 4.3 Qualidade fisiológica de sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp...................................................................................................... 39 4.4 Comprimento e massas seca e fresca de plântulas de milho...... 41 4.5 Desenvolvimento de plantas de milho em casa de vegetação..... 43 5 CONCLUSÕES................................................................................... 47 REFERÊNCIAS………………………………………………………….... 48 15 1 INTRODUÇÃO O milho ocupa o segundo lugar de grão mais cultivado no Brasil, sendo um dos cereais mais produzidos em todo o mundo. O cereal é amplamente utilizado na alimentação humana e animal, apresentando grande importância no setor econômico e social. Pode ser cultivado em baixa ou grande escala, sendo base de várias cadeias agroindustriais. Diversos fatores podem afetar o rendimento da cultura, dentro os quais estão as doenças, que envolvem as podridões de sementes e plântulas; do colmo; da espiga e as doenças foliares, as quais podem interferir no desenvolvimento da cultura. Espécies de Fusarium podem causar podridões da espiga e do colmo, com danos no período de floração até a colheita. A partir da infecção das espigas, o fungo pode atingir os grãos, promovendo o aparecimento de grãos ardidos. Há, também, a possibilidade de contaminação dos grãos pela produção de micotoxinas. O tratamento de sementes com fungicidas é muito utilizado pela indústria sementeira e pelos produtores, sendo bastante eficiente no controle de patógenos associados às sementes, porém podem apresentar riscos ao meio ambiente e à saúde humana e animal. Com isso, o tratamento biológico é uma alternativa viável e tem apresentado resultados interessantes no controle de patógenos, podendo diminuir o uso indiscriminado de produtos químicos na condução de lavouras. Dentre os fungos comumente empregados no controle biológico de fitopatógenos, o gênero Trichoderma se destaca pela comprovada ação antimicrobiana. Várias espécies de Trichoderma estão sendo estudadas no controle biológico de patógenos via tratamento de sementes, aplicação no solo e pulverização foliar, dentre as quais T. harzianum, T, viride e T. asperellum têm apresentado resultados satisfatórios e potencial emprego no manejo de doenças de plantas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento das sementes de milho com cepas de Trichoderma spp., isolado e em mistura com o fungicida Maxim®, no controle de Fusarium verticillioides e na qualidade fisiológica destas. 16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Aspectos gerais da cultura do milho O milho (Zea mays L.) é pertencente à ordem Gramineae, família Poaceae, denominado taxonomicamente como Zea mays L. spp. mays, o que o distingue do teosinto, considerado seu parente silvestre mais próximo, sendo da mesma espécie com várias subespécies (Galvão; Borém; Pimentel, 2017). Essa espécie possui alta adaptabilidade, sendo representada por diversos genótipos, e pode ser cultivada em áreas de climas tropicais, subtropicais e temperados. A germinação ideal está entre 25 e 30ºC, visto que temperaturas abaixo de 10ºC e acima de 40ºC causam prejuízos à cultura (Fancelli e Dourado Neto, 2003). Além disso, a cultura é exigente em água, com consumo durante o ciclo em média de 600 mm, assim deve ser cultivado em regiões com precipitações de 250 mm até 5000 mm anuais (Sans e Santana, 2001). Os estádios de crescimento da planta de milho são divididos em dois estádios, o vegetativo (VE a VT) e o reprodutivo (R1 a R6), proposto em uma escala aceita internacionalmente. Segundo Fancelli (1986), os estádios vegetativos abrangem o florescimento e englobam o período de crescimento e desenvolvimentos da planta, sendo VE (emergência), V1, V2, V3, ..., até que a última folha seja emitida antes do estádio VT (pendoamento). Já o estádio reprodutivo engloba a polinização, o enchimento e a maturação dos grãos, sendo dividido em R1 (florescimento), R2 (grão leitoso), R3 (grão pastoso), R4 (grão farináceo), R5 (grão farináceo-duro) e R6 (maturidade fisiológica), respectivamente. A planta de milho é composta por um caule do tipo colmo, formado por nós e entrenós. Na parte superior do caule, a folhas são distribuídas de forma alternada de um lado ao outro. Em grande maioria possui limbo foliar liso, largo e comprido (Morais, 2012). O sistema radicular é fasciculado ou em “cabeleira”, com profundidade média de 1,5 a 3,0 m de comprimento, localizado nas camadas mais superficiais do solo, sendo assim, possui pouca tolerância à deficiência hídrica, as raízes adventícias auxiliam na fixação do caule, além da absorção de nutrientes (Fornasieri Filho, 2007). Após a polinização do grão de pólen, a fertilização do óvulo do milho dentro do ovário ocorre em 12 a 36 horas, e leva em média 60 dias para finalização do grão. Dentro do grão estão presentes o endosperma e o embrião, uma vez que o 17 endosperma corresponde cerca 85% da massa do grão, o embrião 10% e o pericarpo 5% (Bresolin e Pons, 1983). O endosperma é constituído predominantemente por amido, 86 a 89% de carboidrato e 75% de proteína. Nas células do endosperma, o amido possui formato de grânulos, sendo composto por dois polissacarideos de glucose, 75% de amilopectina e 25% de amilose (Paes, 2008). A cultura apresenta grande importância no setor econômico e social. No setor econômico, devido ao valor nutricional de seus grãos, que são usados de forma intensa na alimentação humana e animal, com cerca de 60 a 80% destinados à alimentação animal, varia conforme a estimativa do ano. No setor social, devido ao cultivo ser realizado em pequena e grande escala, considerado um alimento de baixo custo e base de diversas cadeias agroindustriais (Bortolini e Gheller, 2012; Galvão et al., 2014). No Brasil, o milho é produzido duas vezes durante o mesmo ano agrícola, em 1ª safra (safra de verão) e 2ª safra (safra de inverno). Nos últimos anos, a produção de segunda safra de milho aumentou, porém, pode-se observar um decréscimo na primeira safra da cultura, em virtude da concorrência com a safra de soja (Conab, 2023). Ainda que a segunda safra seja conduzida em condições climáticas menos favoráveis, os sistemas de produção adotados são voltados para tais condições, de forma que contribuem para o aumento da produtividade da cultura (Boscaini e Chaves Neto, 2019). O milho está entre os principais cereais cultivados em todo o mundo, ocupando o segundo lugar de grão mais cultivado no Brasil. Segundo levantamentos realizados pela Conab, para a safra 23/24, a produção total de milho está estimada em 118,53 milhões de toneladas, com redução de 5,3% na área total cultivada. A redução da produção é resultante da diminuição da área plantada de milho, a qual é consequente da redução da segunda safra, em conjunto com menor produtividade em campo (Conab, 2023). O crescimento do cultivo da cultura, associado aos fatores sanitários, tem sido um limitante em diversas regiões produtoras do grão. A gravidade e incidência de doenças na cultura do milho têm aumentado nos últimos anos, decorrente, principalmente, das alterações climáticas, restrição hídrica, sistema de cultivo, população de plantas, além da falta de rotação de culturas (Chavaglia et al., 2020). 18 O plantio direito tem sido cada vez mais adotado pelos produtores nas áreas de cultivo de milho. Embora esse sistema tenha inúmeros benefícios, como proteger o ambiente, proporcionar sustentabilidade agrícola, melhorar a quantidade de palhada no solo e aumentar da matéria orgânica, alguns estudos relatam o aumento de doenças nesse sistema, que está associado à falta de rotação de culturas, ao monocultivo de milho e às condições climáticas para o desenvolvimento de doenças, como podridões de grãos e espigas (Mendes et al., 2012; Stone; Silveira; Moreira, 2006). Em estudo realizado com híbridos de milho, avaliado em duas safras agrícolas e em dois sistemas de cultivo (convencional e direto), onde as sementes de milho foram inoculadas com fungos causadores de podridão da espiga, foi observado que a produtividade dos grãos e a porcentagem de grãos ardidos são influenciadas pelo hibrido, a safra agrícola e pela ocorrência do patógeno, sendo mais presente no sistema de plantio direto (Mendes et al., 2012). Assim como em diversas culturas cultivadas no Brasil, a irrigação está cada vez mais presente no sistema de cultivo do milho. Esse aumento se deve à restrição hídrica ocorrida nos últimos anos, a qual pode ocasionar danos ou perda da produção. A partir da irrigação é possível determinar o momento certo para aplicar água e a lâmina de água, ou seja, quando e quanto aplicar. Porém, com a irrigação, cria-se um ambiente favorável ao desenvolvimento do patógeno, ocasionando maior taxa de desenvolvimento e crescimento do mesmo. Assim, em sistemas irrigados de milho, é possível que se observe maior severidade e perdas na qualidade dos grãos, uma vez que os conídios dos patógenos saprofíticos sobrevivem em restos culturais ou sementes durante anos, os quais podem ser disseminados pela chuva ou agua de irrigação (Piletti et al., 2014; Vilela et al., 2012). As doenças do milho podem ser divididas em podridões de sementes e plântulas; podridões do colmo; podridões da espiga e doenças foliares, interferindo no movimento de água e nutrientes, na fotossíntese, na qualidade dos grãos, na implantação da cultura e na produtividade de grãos (FORCELINI, 2015). Nesse contexto, as sementes estão entre as principais fontes de disseminação de fungos, os quais podem ser carregados a longas distancias. Ainda a contaminação de sementes por patógenos pode causar sérios problemas de germinação, emergência de plântulas e podridões radiculares e da base do colmo (Costa; Gonçalves; Machado, 2020). 19 2.2 Podridões na cultura do milho As podridões da espiga são causadas por vários fungos, entre eles pode-se mencionar Penicillium oxalium, agente causal da podridão da espiga por Penicillium, Aspergillus flavus, agente causal da podridão de Aspergillus e de grãos armazenados, Stenocarpella maydis e S. macrospora, agentes causais da podridão de diplódia ou podridão branca, Giberella zeae (anamorfo Fusarium graminearum), causador da podridão vermelha ou ponta de espiga e Fusarium verticilioides (F. moniliforme), F. subglutinas, F. proliferatum e F. graminearum, agentes causais da podridão rosada da espiga ou podridão de Fusarium (Casela; Ferreira; Pinto, 2006; Fantin e Duarte, 2009; Reis; Casa; Bresolin, 2004). O gênero Fusarium, mais especificamente as espécies F. verticillioides e F. graminearum, está entre os principais agentes fitopatogênicos associados aos danos na qualidade de grãos de milho e, consequentemente, redução da produtividade (Kuhnem Junior; Spolti; Ponte, 2013). É um fungo cosmopolita, com ampla distribuição no solo e encontrado mais facilmente em regiões temperadas e tropicais. Diversas espécies, além das mencionadas, são agentes patogênicos de plantas cultivadas, principalmente no setor agrícola (Leslie e Summerel, 2006). Fusarium possui ampla distribuição geográfica, e seu desenvolvimento está associado aos tipos de clima, microbiota, solo, nutrientes e vegetação. Ainda, pode ser distinguido pelo seu rápido crescimento, com micélios aéreos e ramificados (Frias, 2014; Maciel, 2012). Os patógenos podem causar prejuízos no colmo, com sintomas após a polinização e progredindo conforme a maturação. Na parte interna, os sintomas se caracterizam por mudanças na cor da medula, que podem variar de coloração esbranquiçada a marrom. Com a evolução da doença, ocorre o fendilhamento dos tecidos, que adquirem consistência semelhante à de um isopor, e pode também ocorrer a quebra do colmo e seca prematura das plantas (Amorim et al., 2016). Fusarium verticillioides causa podridão apenas em tecidos senescentes, em que os teores de carboidratos e substâncias fungistáticas são baixos, de forma que a infecção na planta ocorre no final do ciclo ou em plantas que tiveram algum estresse durante seu desenvolvimento (Fancelli e Dourado Neto, 2003). Além disso, o fungo produz uma micotoxina denominada fumonisina, que pode causar doenças 20 em animais, e até a morte destes, sendo os mais suscetíveis as aves, os equinos e os suínos (Marcondes, 2012). Com a incidência de fungos na espiga, os mesmos podem causar infecção nos grãos, o que resulta nos chamados grãos ardidos, caracterizados pela infecção por fungos e a descoloração de, ao menos, um quarto da superfície dos grãos, podendo variar de vermelho claro a vermelho intenso ou de marrom claro a roxo, conforme o patógeno presente (Pinto, 2005). As agroindústrias possuem um padrão para a presença de grãos ardidos nos lotes comerciais, com a tolerância de 6%, visto que a presença desses grãos provoca desvalorização do produto. A contaminação dos grãos por fungos pode ocorrer em pré e pós-colheita (Pinto, 2007), e pode ser favorecida pela deficiência hídrica no período de enchimento de grãos ou pela alta quantidade de chuva após a maturidade fisiológica dos grãos (Oliveira et al., 2004). Fatores como ferimentos em plantas, acamamento ou espigas mal empalhadas e não decubentes favorecem a entrada de água da chuva e esporos fúngicos na espiga (Silva e Schipanski, 2006). A doença é favorecida por temperatura média de 30ºC e altitudes abaixo de 700 m, com ocorrência logo após a polinização, principalmente quando a mesma é antecedida por período seco e seguida de um período chuvoso (Fancelli e Dourado Neto, 2004; Kimati et al., 2005; Silva; SCHIPANSki, 2006). O patógeno sobrevive saprofiticamente em restos de tecidos do hospedeiro no solo e pode ser disseminado pelo vento e pela chuva (Reis; Casa; Bresolin, 2004). As táticas mais indicadas para o manejo das podridões incluem a rotação de cultura com plantas não hospedeiras, adubação equilibrada, uso de cultivares resistentes, irrigação adequada e melhoramento de sementes com alta capacidade de produção (Gravina, 2011; Zhao et al., 2013). 2.3 Tratamento de sementes A utilização de sementes certificadas e com alta qualidade inicial é indispensável para o estabelecimento de estande de plantas vigorosas. A qualidade das sementes está diretamente relacionada a quatro fatores, sendo qualidade fisiológica, caracterizada por sementes vigorosas que proporcionam alta emergência de plântulas; qualidade física, caracterizada por lotes sem a presença de materiais inertes; qualidade genética, a qual compreende a utilização de cultivar 21 geneticamente pura para semeadura e qualidade sanitária, com lotes de sementes sem a presença de patógenos, como fungos, bactérias, nematoides e vírus (França Neto et al., 2016). As sementes possuem características intrínsecas que permitem a disseminação de patógenos associados às mesmas. A associação do agente causal em sementes pode provocar doença na planta em questão e ou se espalhar para outras plantas sadias. Além disso, os patógenos podem permanecer viáveis na semente por longo período, podendo ser disseminados a longas distâncias (Parisi e Medina, 2013). Para amenizar a contaminação e disseminação de patógenos, garantir a qualidade de sementes e proporcionar melhor estabelecimento inicial de plântulas, o tratamento de sementes é uma opção disponibilizada no mercado, com intuito de proteger as mesmas de microrganismos ou insetos, por meio da aplicação de substâncias que mantêm o desempenho da semente e permitem que as culturas expressem seu máximo potencial produtivo, podendo ser realizada com produtos fungicidas, inseticidas, inoculantes e micronutrientes, entre outros (Cunha Corrêa et al., 2015; Menten e Moraes, 2010; ParisI e Medina, 2013). O tratamento on farm (tratamento na fazenda) é um método bastante utilizado por agricultores brasileiros. Inicialmente, nos anos 50, o tratamento feito em fazendas era realizado em condições precárias, sobre lonas, em caixas de contenção, com produtos sem recomendação de um profissional capacitado e feito por pessoas sem treinamento para tal prática (Nunes, 2016). Um dos primeiros equipamentos utilizados foi o tambor giratório com eixo excêntrico, com movimentação manual, que proporciona rotação e movimentação das sementes e aos produtos adicionados (Henning, 2004). Com o tempo, houve uma evolução na tecnologia de aplicação, e surgiram máquinas de tratamento acionadas por energia elétrica ou ligadas na tomada de potência de tratores (Henning et al., 2010). O desenvolvimento de novos equipamentos para o tratamento de sementes continua sendo estudado para surgimento de novas tecnologias, devido ao crescimento do recobrimento de sementes, priorizando a aplicação de produtos na forma líquida, em menores dosagens, com formulações específicas, com maior precisão e monitoramento (Ludwig et al., 2011). O tratamento de sementes industrial (TSI) é uma prática realizada com técnicas de equipamentos de precisão, de forma que o tratamento assegure o 22 recobrimento e melhor aderência dos produtos às sementes, devido à utilização de doses precisas. Além disso, apresentam menor risco de intoxicação aos operadores e maior capacidade de rendimento (França-Neto, 2016; Henning, 2005). Dentre as opções de tratamento de sementes, o tratamento químico com fungicida objetiva diminuir a incidência de patógenos, proteger as sementes e plântulas dos microrganismos do solo, diminuir a introdução de inóculo em áreas isentas do mesmo, sendo uma prática econômica e de fácil execução (Parisi e Medina, 2013). Além disso, resulta em plantas mais vigorosas e, consequentemente, em estande com uniformidade de plantas (Hossen et al., 2014). Apesar dos benefícios mencionados do tratamento de sementes com fungicida químico, o mesmo pode ocasionar danos ao meio ambiente e à saúde humana (Morandi e Bettiol, 2009; Silva e Mello, 2017). Com isso, uma alternativa aos danos causados pelo uso em grande escala de fungicidas químicos é a utilização de produtos biológicos, que têm cada vez mais apresentado resultados relevantes para o controle de patógenos em sementes. 2.3.1 Tratamento biológico O controle biológico é caracterizado pelo controle natural de pragas e doenças, por meio de inimigos naturais, podendo ser feito com intervenção do homem (aplicado), no qual acontece a introdução de agentes benéficos, que agem conjuntamente para o controle da doença, ou sem a intervenção humana (natural), em que o controle por antagonistas acontece de forma natural no ambiente em equilíbrio, e tem sua eficiência reduzida em sistemas de cultivo intenso (Cruz e Valicente, 2015; Howell, 2003). O controle biológico pode contribuir positivamente no desenvolvimento das plantas, podendo aumentar a germinação, emergência de plântulas, o crescimento e produtividade de grãos (Machado et al., 2012). Dentre as inúmeras vantagens do controle biológico, pode-se citar a redução do custo para o descobrimento, desenvolvimento e registro dos produtos biopesticidas, quando comparado ao desenvolvimento de uma molécula química, além do tempo de lançamento do produto biológico no mercado ser mais rápido. Os produtos biológicos podem ser divididos em dois grupos, sendo macrorganismos, composto por vespas e ácaros predadores, e biopesticidas, divididos em 23 microbianos (fungos, vírus e bactérias) e bioquímicos (extratos de plantas e semioquímicos) (Pomella, 2014). O Brasil está entre os países que mais aderiram ao controle biológico (Pomella, 2014) e os agentes biológicos disponíveis para uso no país são Bacillus subtilis, utilizado no controle de várias doenças, Clonostachys rosea, para o controle de mofo cinzento, estirpes fracas do vírus da tristeza do citros (CTV), utilizado na premunização contra a tristeza do citros, e Trichoderma spp., para controle de patógenos de solo, substrato e parte aérea das plantas. Além desses, existem outros antagonistas que parasitam ou inibem a germinação de patógenos presentes no solo, como bactérias B. subtilis, B. pumilus, Pseudomonas putida e P. fluorescens, e fungos, como as espécies de Trichoderma T. koningii, T. pseudokoningii, T. viride e T. harzianum, entre outros (Morandi e Bettiol, 2009). Trichoderma spp. está entre os agentes de controle biológico mais estudados e usados na agricultura (Lucon; Chaves; Bacilieri 2014). Esses microrganismos podem se reproduzir de forma ilimitada na natureza e persistirem no solo ou em plantas, sem a necessidade de reaplicações (Faria; Albuquerque; Cassetari Neto, 2003). Os produtos à base do fungo Trichoderma estão disponíveis no mercado em diferentes formulações, como grânulos dispersíveis em água (WG), pó molhável (PM) e líquidas (esporos em suspensão aquosa ou oleosa). Os mesmos podem ser aplicados por tratamento de sementes, diretamente no solo, por materiais de propagação vegetal, pulverização na parte aérea das plantas e substratos para produção de mudas (Lucon; Chaves; Bacilieri, 2014; Pomella e Ribeiro, 2009). 2.3.1.1 Trichoderma spp. O gênero Trichoderma ganhou reconhecimento no controle de doenças de plantas décadas atrás. É um fungo encontrado em diversos ecossistemas, possui cepas capazes de reduzir a agressividade de patógenos, principalmente de solo ou em raízes, por meio de ações como antagonismo, micoparasitismo (Viterbo e Horwitz, 2010), inativação de enzimas dos fitopatógenos, tolerância a estresse, indução de resistência, solubilização e absorção de nutrientes inorgânicos (Silva e Mello, 2017). 24 O micoparasitismo realizado por algumas espécies de Trichoderma é considerado o principal mecanismo de ação do fungo. Nesse mecanismo, verifica-se o crescimento de Trichoderma spp. em direção ao fungo fitopatogênico, ocorrendo o reconhecimento e interação de hifas. Após a interação, há secreção de enzimas líticas que fazem a degradação da parede celular e limitam o crescimento e desenvolvimento do patógeno associado (Druzhinina et al., 2011; Monteiro et al., 2010; Steindorff et al., 2012; Zeilinger et al., 2016). O fungo Trichoderma possui a capacidade de estimular o crescimento de plantas e amenizar as doenças que são causadas por uma gama de hospedeiros patogênicos. Além disso, possuem capacidade de reprodução na rizosfera, modificação da mesma, utilização de nutrientes de forma eficiente, e sobrevivência mesmo em condições desfavoráveis. Ainda, exercem amplo espectro de controle de patógenos em diversas condições ambientais (Benítez et al., 2004; Harman, 2006; Lorito et al., 2010; Prabhakaran et al., 2015). Entre os principais patógenos alvos, destacam-se Rhizoctonia, Macrophomina, Sclerotinia, Sclerotium, Fusarium, Botrytis, e Crinipellis, em culturas de soja, feijão, algodão, cebola, alho, fumo, plantas ornamentais, cacau, morango e tomate (Lucon; Chaves; BacilierI, 2014; Morandi e Bettiol, 2009). Trichoderma harzianum reduz a incidência de fungos que afetam negativamente algumas culturas, sendo Aspergillus flavus em sementes de milho (Agüero et al., 2008), Aspergillus spp., Cladosporium spp. e Sclerotinia sclerotiorum em sementes de feijão (Carvalho et al., 2011), Pyricularia oryzae, Bipolaris oryzae e S. sclerotiorum em diversas culturas (Prabhakaran et al., 2015). Trichoderma asperellum apresentou inibição de 71% do crescimento micelial de Fusarium solani, o mesmo teve efeito antagônico sobre os fungos S. sclerotiorum, R. solani e F. solani (Qualhato et al., 2013). A aplicação de produtos biológicos à base de Trichoderma spp. pode ser feita por meio de tratamento de sementes, em substratos, na parte aérea de plantas ou em resíduos culturais. A aplicação vai ser realizada conforme a área e a formulação de cada produto, podendo ser com pulverizadores tratorizados ou costais, e por sistemas de irrigação de diferentes formas (Lucon; Chaves; Bacilieri, 2014). Algumas cepas de Trichoderma são eficientes na colonização da rizosfera, sendo considerado um dos principais microrganismos de importância para crescimento vegetal, proporcionando aumento no potencial de crescimento, maior 25 absorção de nutrientes e fertilizantes, solubilização de fósforo, aumento da germinação de sementes, consequentemente aumento no rendimento da cultura, resistência sistêmica induzida (ISR), estímulo na defesa contra danos bióticos e abióticos ocorrentes em plantas (Harman et al., 2004; Oliveira et al., 2012; Shoresh; Harman; Mastouri, 2010; Silva et al., 2012). As cepas de Trichoderma capazes de interagir e proporcionar tais efeitos induzem alterações metabólicas em plantas que aumentam a resistência a diversos microrganismos patogênicos (Harman et al., 2004). A resposta sistêmica nas plantas acontece por meio da sinalização de ácido jasmônico ou etileno, de forma parecida com o ISR de rizobactérias (Shoresh; Yedidia; Chet, 2005; Van Loon, 2007). Os benefícios observados pela ação de Trichoderma variam conforme a cepa fúngica, a concentração e o genótipo da planta (Segarra et al., 2011). Trichoderma spp. liberam compostos proteicos e metabólitos, semelhantes à auxina, que são percebidos inicialmente pelas raízes das plantas, os quais alteram os mecanismos hormonais que fazem o controle do crescimento e desenvolvimento das mesmas, podendo acontecer em condições normais ou em condições de estresse (BAE et al., 2011; BAE et al., 2009; DJONOVIC et al., 2006; GARNICA- VERGARA et al., 2015). A inoculação de T. virens e T. atroviride em Arabidopsis thaliana resultou em aumento da produção de biomassa e estimulação do desenvolvimento das raízes laterais, sendo características fenotípicas relacionadas à auxina (Contreras-Cornejo et al., 2009) O crescimento de Trichoderma nas raízes é incentivado devido à alta quantidade de polissacarídeos hidratados que são secretados pelas raízes e aos monos e dissacarídeos excretados pelas mesmas na rizosfera. Além disso, a sacarose provida de plantas, fornecida às células de Trichoderma, facilita a colonização, a coordenação de mecanismos de defesa da planta e proporciona aumento da taxa de fotossíntese foliar (Vargas; Mandawe; Kenerley, 2009). Na rizosfera, as plantas interagem com os microrganismos associados por meio de moléculas de sinalização, as quais podem exercer efeito positivo ou negativo na interação (Contreras-Cornejo et al., 2016). Algumas espécies de Trichoderma possuem a capacidade de modificar o pH na rizosfera e adaptar o metabolismo às condições externas de desenvolvimento, o que resulta em redução da virulência de patógenos, devido a diversos fatores de patogenicidade não poderem ser sintetizados (Benítes et al., 2004). Diversas 26 espécies do gênero desempenham vantagens, apresentam crescimento rápido, sobrevivem em diferentes tipos de solos e substratos e são, em grande maioria, facilmente multiplicadas em condições de laboratório. São inúmeros os resultados positivos relacionados à promoção de crescimento de plantas e no controle de fitopatógenos causadores de doenças em plantas (Contreras-Cornejo et al., 2016; Gabardo et al., 2020; Garcés-Fiallos; Sabando-Ávila; Molina-Atiencia, 2017; Karthikeyan, 2016; Waghunde; Shelake; Sabalpara, 2016). Trichoderma spp. têm apresentado efeitos positivos na interação com sementes, ressaltando a importância do estudo em questão. O tratamento de sementes de milho com T. harzianum proporcionou maior acúmulo de matéria seca nas raízes das plantas oriundas dessas sementes (Resende et al., 2004). O tratamento biológico de sementes de milho com Trichoderma spp., associado a técnicas de restrição hídrica e peliculização, resultou no aumento do vigor de plântulas de milho, independente da técnica de microbiolização usada (Junges et al., 2014). Além disso, tratamento de sementes com T. harzianm em arroz teve efeitos positivos para a tolerância ao estresse hídrico quando foram comparados com a testemunha (genótipos de arroz), refletindo positivamente na produtividade da cultura (Pandey et al., 2013). Sementes de tomate tratadas com T. harzianum T22, condicionadas a condições de estresse osmótico, mostraram aumento da velocidade e uniformidade de germinação em todos os níveis de água (Mastouri; Bjorkman; Harman, 2010). Segundo Stefanello e Bonett (2013), a inoculação de sementes de milho com Trichoderma spp. apresentou efeito positivo sobre a matéria verde e seca das plantas. Os autores mencionam que as plantas resultantes do tratamento de sementes com Trichoderma spp. apresentaram maior desenvolvimento radicular, comprimento de parte aérea, massa fresca e massa seca de plantas. Chagas et al. (2017) realizaram trabalho com monocotiledôneas (arroz e milho) e dicotiledôneas (soja e feijão-caupi) e demonstraram a eficiência do isolado T. asperellum UFT-201 no aumento da biomassa das referidas culturas. Singh et al. (2016), investigaram a aplicação de T. asperellum no tratamento de sementes de diversas hortaliças e observaram que a concentração ideal do antagonista varia de acordo com a cultura. Segundo esses autores, o conhecimento da concentração apropriada evita o uso de doses excessivas de produtos à base de 27 Trichoderma e, dessa forma, os custos desnecessários decorrentes de aplicações com quantidades incorretas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento das sementes de milho com cepas de Trichoderma spp., isolado e em mistura com o fungicida Maxim® no controle de Fusarium verticillioides e na qualidade fisiológica destas. 28 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Local do experimento Os experimentos foram conduzidos na Faculdade de Ciências Agronômicas, Câmpus de Botucatu, SP, no Departamento de Proteção Vegetal. Os testes foram realizados com sementes de milho, disponibilizadas pelo Departamento de Sementes, Mudas e Matrizes/CATI - SP. 3.2 Obtenção dos fungos 3.2.1 Cepas de Trichoderma spp. Inicialmente foram reativadas cinco cepas em meio batata dextrose ágar (BDA) contido em placas de Petri (9 x 1,5cm), por 14 dias a 25 ± 2ºC, e fotoperíodo de 12 h. Para preservação das colônias esporuladas cultivadas em meio BDA, foram repicados discos de 5 mm, e conservados conforme o método de Castellani (CASTELLANI, 1939). Após a reativação, três cepas foram selecionadas para condução da pesquisa. As cepas utilizadas foram, cepa LQC 96, SLV 10 e TS. As cepas foram obtidas e isoladas de locais distintos, sendo: cepa LQC 96 isolada do solo de Jaguariúna/ SP, cepa SLV 10 isolada de plantas de ipê roxo em Urutaí/ GO, e cepa IF 205 isolada de sementes de araucária em Curitiba/ PR. 3.2.2 Espécie de Fusarium verticillioides A partir de testes preliminares foi constatado alta incidência de Fusarium sp. nas sementes. Sendo assim foi feito o isolamento do gênero presente nas sementes e realizado o teste de PCR para identificação da espécie, conforme descrito: o DNA genômico do fungo, selecionado para caracterização morfológica, foi extraído do material raspado do meio de cultura em placas de Petri com 100 μL de solução Q- Extract DNA (Ampliqon III) e 5 μL de proteinase K (20 mg/ml) incubadas em bloco térmico por 65ºC a seis minutos e 98ºC por 2 minutos. A reação de PCR, para amplificação da região ITS1 e ITS4 do rDNA, foi realizada em um volume total de 25 μL, utilizando tampão da Taq DNA polimerase 1x, 1,5 mM de MgCl2, 0,4 μM de cada primer ITS1 (5’–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) e ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), esses produtos foram usados para amplificar um 29 fragmento de DNA de ~ 600 pares de bases (pb) da região ITS. Para o mix de PCR foi utilizado 0,2 mM de dNTPs, 0,2 U de Taq DNA polimerase e 25 ng de DNA. Essa amplificação foi conduzida em termociclador, programado para uma desnaturação inicial de 95°C por 5 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação 95°C por 30s; anelamento a 62°C por 1min; extensão a 72 °C por 2 min e extensão final a 72°C por 5 min (XIONG et al, 2013). Os produtos das extrações de PCR (5 μL) foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1% sob luz UV e fotodocumentador. O resultado da amplificação purificados por beas magnéticas, foram encaminhadas para o IBTEC, UNESP/Botucatu para realização do sequenciamento de Sanger. A espécie identificada foi Fusarium verticillioides. 3.3 Avaliação do antagonismo de cepas de Trichoderma spp. sobre Fusarium verticillioides O efeito do antagonismo de Trichoderma spp. sobre o Fusarium verticillioides foi avaliado “in vitro”, adotando-se o método de confronto direto proposto por Dennis e Webster (1971). Os fungos foram cultivados em meio de cultura batata-dextrose- ágar (BDA) e, das colônias de dez dias de idade, foram retirados discos de micélio de 0,5 mm de diâmetro. O pareamento do antagonista com o patógeno foi realizado em 3 períodos, sendo: pareamento simultâneo, pré-estabelecimento de Fusarium verticillioides 48 horas e, pré-estabelecimento de Fusarium verticillioides 72 horas antes do antagonista. Cada pareamento (patógeno x antagonista) foi realizado em uma placa de Petri contendo meio BDA solidificado, dispondo, em sentidos opostos, um disco de micélio de cada agente a uma distância de 1,0 cm da borda da placa. A testemunha consistiu em placas com BDA, contendo um disco do patógeno pareado com um disco contendo apenas BDA. As placas foram mantidas por quinze dias na BOD a 22oC com fotoperíodo de 12 horas. A avaliação foi realizada aos quinze dias após o pareamento, quando o crescimento do micélio do patógeno contido na testemunha atingiu totalidade na placa de Petri. Os isolados foram avaliados com atribuição de notas, de acordo com o critério de Bell et al. (1982). 30 Figura 1 – Representação escala de notas proposta por Bell et al. (1982) Fonte: Bell et al. (1982) NOTA 1- Sobreposição de Trichoderma, que colonizou toda a superfície do meio e diminuiu a colônia de Fusarium verticillioides. NOTA 2- Sobreposição de Trichoderma spp., que colonizou pelo menos 2/3 da superfície do meio. NOTA 3- Trichoderma spp. e Fusarium verticillioides colonizaram mais que 1/3 e menos que 2/3 da superfície do meio. NOTA 4- Fusarium verticillioides colonizou ao menos 2/3 da superfície do meio, sem sobreposição de Trichoderma spp. NOTA 5- Sobreposição de Fusarium verticillioides que colonizou toda a superfície do meio. O experimento foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2), no delineamento inteiramente casualizado, com dez tratamento e quatro repetições, sendo cada placa de Petri considerada uma repetição. Os dados não seguiram distribuição normal foram submetidos a Kruscal-Wallis-Ranks test, usando o programa Minitab 17. 31 3.4 Tratamento biológico e químico de sementes de milho Sementes de milho da cultivar AL PIRATININGA foram submetidas ao tratamento biológico e químico, isolados e em mistura. Para o controle biológico, foram utilizadas três cepas de Trichoderma sp. Para tratamento químico com fungicida, foi utilizado o produto comercial Maxim® (fludioxonil), na concentração 150 mL p.c./100 kg de sementes, o qual apresentou compatibilidade com as cepas de Trichoderma spp. utilizadas no trabalho, resultados obtidos em testes preliminares. As concentrações de esporos das cepas de Trichoderma spp. foram ajustadas para 1x106 UFC/mL com auxílio de um hemocitômetro. As misturas foram constituídas da combinação de cada concentração do produto biológico e do fungicida. Os produtos foram aplicados nas sementes nas concentrações pré-estabelecidas e com volume de calda de 800 mL/100 kg de sementes, em sacos plásticos com agitação manual até a uniformização do tratamento. As quantidades de produtos foram ajustadas para o peso de 250 g de sementes por tratamento. Nos tratamentos que consistiram na associação dos produtos, cada um dos mesmos foi aplicado isoladamente, sendo realizado primeiro o tratamento biológico, seguido do tratamento químico. Após cada tratamento, as sementes permaneceram em temperatura ambiente de laboratório para promover secagem dos produtos. Os tratamentos realizados foram: 1- testemunha (inoculação natural do patógeno); 2- fungicida (Maxim®); 3- cepa 1 (LQC 96); 4- cepa 2 (IF 205); 5- cepa 3 (SLV10); 6- cepa1 + fungicida; 7- cepa 2 + fungicida; 8- cepa 3 + fungicida. 3.5 Avaliação da qualidade sanitária e fisiológica das sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp. As sementes utilizadas no trabalho passaram pelo processo de desinfestação artificial sendo imersas em solução de hipoclorito de sódio a 1%, por 1 minuto, e lavadas em água destilada por 3 minutos, após foram secas com papel toalha e acondicionadas na bancada onde permaneceram por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, foram submetidas aos tratamentos anteriormente descritos e 32 avaliadas quanto à qualidade sanitária e fisiológica, em laboratório e casa de vegetação, de acordo com os testes apresentados a seguir. 3.5.1 Testes de laboratório 3.5.1.1 Teste de sanidade A sanidade de sementes foi avaliada pelo método do papel filtro (blotter test), conduzido de acordo Brasil (2009a). As sementes, foram dispostas isoladamente, a uma distância de um centímetro umas das outras, em placas de Petri, sobre três folhas de papel de germinação. Os recipientes com as sementes foram transferidos para BOD, com lâmpadas de luz fluorescente branca, com fotoperíodo de 12 horas e à temperatura de 20 ± 2ºC, onde foram mantidos por oito dias. Após a incubação, cada semente foi examinada individualmente com auxílio de um estereomicroscópio à resolução de 4-10X, avaliando-se a ocorrência de frutificações típicas do crescimento de Fusarium verticillioides. Os resultados foram expressos em percentual de incidência Fusarium verticillioides nas sementes. O experimento foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2), no delineamento inteiramente casualizado, com oito tratamentos e vinte repetições de 10 sementes, totalizando 200 sementes/tratamento. Os resultados foram avaliados quando à normalidade, e transformados para arc sen (x/100). Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico AgroEstat - Versão 1.0 (Barbosa e Maldonado, 2011). 3.5.1.2 Testes de germinação e primeira contagem de germinação A germinação das sementes foi avaliada pelo teste do rolo de papel (Brasil, 2009b), distribuindo-se as sementes sobre duas folhas de papel de germinação e cobertas com uma terceira folha, previamente umedecidas com água destilada no volume de 2,5 vezes a massa do papel seco, confeccionando-se em seguida os rolos e acondicionando-os em sacos plásticos. Os rolos foram mantidos em germinador com temperatura de 20 ± 2ºC, com fotoperíodo de 12 h. Duas avaliações da germinação foram efetuadas, sendo a primeira no quarto dia e a segunda, no 33 sétimo dia de instalação do teste, computando-se o número de plântulas normais. A primeira avaliação corresponde ao teste de primeira contagem de germinação – PCG (brasil, 2009a), que reflete o vigor das sementes. Os resultados de ambos os testes foram expressos em porcentagem de plântulas normais. O experimento foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2), no delineamento inteiramente casualizado, com oito tratamentos e oito repetições de 50 sementes, totalizando 400 sementes por tratamento. Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico AgroEstat - Versão 1.0 (BARBOSA e MALDONADO, 2011). 3.5.1.3 Comprimento e massas seca e fresca de plântulas O comprimento de plântulas foi determinado conforme metodologia descrita por Krzyzanowski et al. (2020), que consiste na semeadura de cinco repetições de 20 sementes, sobre linha traçada longitudinalmente no terço superior de papel substrato previamente umedecido; os substratos, na forma de rolos, foram mantidos verticalmente à temperatura de 20 ± 2ºC, em câmara BOD, com fotoperíodo de 12 h, para avaliação do comprimento da raiz primária, parte aérea e total das plântulas normais no sétimo dia após a semeadura. Os resultados foram obtidos pela divisão da quantidade de plântulas normais por tratamento. A massa fresca e seca foram determinadas com as plântulas obtidas a partir do teste de comprimento de plântulas. A parte aérea e as raízes das plântulas foram pesadas em balança de precisão para obtenção da massa fresca. Para obtenção da massa seca, as plântulas foram acondicionadas em sacos de papel, e mantidas em estufa de circulação forçada de ar, à temperatura de 65oC por 48 h. Após, as amostras foram pesadas em balança de precisão e os resultados foram obtidos pela divisão da massa da amostra pelo número de plântulas normais (Krzyzanowski et al., 2020). O experimento foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2), no delineamento inteiramente casualizado, com oito tratamentos e 5 repetições de 20 sementes, totalizando 100 plântulas por tratamento. Os resultados de comprimento foram expressos em centímetros e os de massa fresca e seca, em gramas. Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo 34 teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico AgroEstat - Versão 1.0 (Barbosa e Maldonado, 2011). 3.5.2 Testes em casa de vegetação As sementes foram semeadas em vasos de 5 L, contendo substrato Carolina Soil®, com quatro sementes por vaso. Após o desbaste, foi deixada apenas uma plântula por vaso. Os tratamentos de sementes (TS) foram os mesmos descritos para os testes realizados em laboratório. O experimento foi realizado em duplicata (ensaios 1 e 2), no delineamento experimental inteiramente casualizado, com 14 tratamentos e seis repetições. Os tratamentos realizados foram: 1- testemunha (sem tratamento); 2- fungicida (Maxim®) via TS ; 3- cepa 1 (LQC 96) via TS; 4- cepa 2 (IF 205) via TS; 5- cepa 3 (SLV10) via TS; 6- cepa 1 + fungicida, via TS; 7- cepa 2 + fungicida, via TS; 8- cepa 3 + fungicida, via TS; 9- cepa 1 via TS + aplicação cepa 1 em sulco; 10- cepa 2 via TS + aplicação cepa 2 em sulco; 11- cepa 3 via TS + aplicação cepa 3 em sulco; 12; cepa 1 + fungicida, via TS + aplicação cepa 1 em sulco; 13- cepa 2+ fungicida, via TS + aplicação cepa 2 em sulco; 14- cepa 3 + fungicida, via TS + aplicação cepa 3 em sulco. As concentrações de esporos das cepas de Trichoderma spp. para aplicação em sulco foram de 1x106 UFC/mL, e a quantidade aplicada do produto biológico por vaso foi ajustada considerando o peso de 700 g de substrato/vaso. A aplicação em sulco foi realizada logo após a semeadura, com temperatura ambiente de 17ºC. As plantas foram conduzidas até estágio de V3 (terceira folha formada), sendo realizados os seguintes testes: 3.5.2.1 Emergência e Índice de velocidade de emergência (IVE) Foi computado o número de plântulas normais emergidas, diariamente, até a estabilização de emergência, que correspondeu à emergência total e foi a última leitura do IVE, sendo os resultados de emergência expressos em porcentagem. Com base no número de plântulas emergidas, foi calculado o IVE, empregando-se a seguinte fórmula: 𝐼𝑉𝐸 = 𝐸1 𝑁1 + 𝐸2 𝑁2 + ⋯ 𝐸𝑛 𝑁𝑛 35 Em que: N1, N2, ..., Nn é o número de dias decorridos da semeadura até a primeira, segunda, ..., última contagem. E1, E2, ..., En é o número de plântulas emergidas computadas na primeira, segunda, ...., última contagem (Brasil, 2009a). Os dados não seguiram distribuição normal e foram submetidos a Kruscal- Wallis-ranks test, usando o programa Minitab 17. 3.5.2.2 Comprimento e massas fresca e seca de plântulas Ao final do teste de emergência, foi medido, com régua graduada, o comprimento da parte aérea e do sistema radicular das plântulas, sendo os valores somados e expressos em centímetros. A parte aérea e as raízes das plântulas foram pesadas em balança de precisão para obtenção da massa fresca. Em seguida, as plântulas foram colocadas em estufas de circulação de ar a 65ºC por 48 horas, para obtenção da massa seca. O resultado foi expresso em gramas (g). Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando o programa estatístico AgroEstat - Versão 1.0 (Barbosa e Maldonado, 2011). 36 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Antagonismo de cepas de Trichoderma spp. sobre Fusarium verticillioides Com relação ao teste de antagonismo com cepas de Trichoderma spp. sobre Fusarium verticillioides, no ensaio 1, observou-se redução no crescimento micelial do patógeno no confronto com a cepa 1 (pareamento simultâneo ao patógeno) e cepa 3 (pareamento antagonista após 72 horas). No ensaio 2, a redução do crescimento micelial do patógeno ocorreu no confronto com cepa 3 (pareamento simultâneo ao patógeno) e cepa 3 (pareamento do antagonista após 48 horas), com notas iguais ou menores que 2,0, em ambos os ensaios (tabela 1). Tabela 1- Inibição do crescimento de Fusarium verticillioides por cepas de Trichoderma spp. em cultivo pareado Tratamento Ensaio 1 Ensaio 2 Períodos Medianas Períodos Medianas F x BDA Simultâneo Simultâneo Simultâneo 5,00 a Simultâneo 5,00 a Cepa 1 x F 2,00 c Simultâneo 3,00 b Cepa 2 x F 3,00 bc Simultâneo 3,00 b Cepa 3 x F Cepa 1 x F Cepa 2 x F Cepa 3 x F Cepa 1 x F Cepa 2 x F Cepa 3 x F Simultâneo 48 h 48 h 48 h 72 h 72 h 72 h 3,00 bc 3,00 bc 3,00 bc 3,00 b 3,00 b 3,00 bc 2,00 c Simultâneo 48 h 48 h 48 h 72 h 72 h 72 h 1,00 c 3,00 b 3,00 b 2,00 c 3,00 b 3,00 b 3,00 b P>0,05 0,02 * 0,002* Medianas seguidas de letras iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis- Ranks. *: significativo a 5% de probabilidade. A redução do crescimento micelial do patógeno em relação ao crescimento micelial do antagonista é a característica desejável, considerando que se ambos competem entre si por espaço, nutrientes, entre outros fatores, o micro-organismo que apresentar o desenvolvimento mais rápido, vai ter vantagem sobre o outro (Quevedo et al., 2022). Trabalho realizado por Chagas Junior et al. (2018) corrobora os dados do presente trabalho, em que alguns isolados de Trichoderma apresentaram maior crescimento micelial em contato com Fusarium sp. Carvalho et al. (2011) avaliaram o controle de F. oxysporum “in vitro”, e observaram o controle do patógeno por três isolados de Trichoderma, com crescimento micelial total sobre a colônia do 37 fitopatógeno. Medeiros et al (2020) observaram maior crescimento micelial de T. harzianum, T. asperellum, T. viride e Trichoderma spp. sobre F. moniliforme. Quevedo et al. (2022) concluíram que isolados de Trichoderma spp. apresentaram potencial antagônico sobre F. oxysporum “in vitro”. A eficiência da inibição de fitopatógeno é variável conforme os isolados de Trichoderma spp. Resultados encontrados por Chagas Junior et al. (2018) demonstraram que os isolados de Trichoderma apresentam diferentes formas de antagonismo. A agressividade do fungo antagonista sobre o fungo patogênico é variável conforme a atividade que cada isolado possui a capacidade de exercer, além da estrutura física e da produção de substâncias inibitórias produzida pelos isolados. O controle pode ocorrer por diferentes mecanismos, como antibiose, micoparasitismo e competição (Rajesh; Rahul; Ambalal, 2016). 4.2 Qualidade sanitária de sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp. A incidência de Fusarium verticillioides em sementes com infecção natural do patógeno foi menor em sementes tratadas com fungicida e com a interação entre cepas de Trichoderma + fungicida (tabela 2). Considerando que os tratamentos com as cepas de Trichoderma isoladas não diferiram da testemunha, o controle sobre a incidência do Fusarium verticillioides nas sementes ocorreu majoritariamente pela aplicação do fungicida químico (tabela 2). Em um trabalho semelhante, com sementes de aveia preta, Silva e Lovatto (2019) fizeram o tratamento das sementes com Trichoderma spp. e Maxim® (fludioxonil), de forma isolada e combinada e observaram que, apesar da incidência de Trichoderma ter diminuído em 20% por ação do fludioxonil, a combinação entre os produtos químico e biológico inibiu a presença de fungos do gênero Fusarium nas sementes. Segundo os autores, a combinação entre os produtos se faz viável para controle de fungos na cultura referida. 38 Tabela 2 - Efeito do tratamento de sementes de milho com fungicida químico Maxim® isolado, cepas de Trichoderma isoladas e interação entre fungicida químico e cepas de Trichoderma, sobre a incidência de Fusarium verticillioides Tratamento Ensaio 1 Ensaio 2 F. verticillioides arc sen(x/100)1 (%)2 F. verticillioides arc sen(x/100)1 (%)2 Fungicida (F) 40,55 b (42,50) 39,11 b (41,50) 81,00 a (94,00) 77,84 a (89,00) 79,67 a (91,00) 43,22 b (47,00) 44,70 b (49,50) 42,02 b (45,00) 84,17 a (96,00) Cepa 1 86,68 a (97,00) Cepa 2 82,00 a (94,50) Cepa 3 89,08 a (99,50) Cepa 1 + F 38,72 b (39,50) Cepa 2 + F 41,16 b (43,50) Cepa 3 + F 38,00 b (38,50) Testemunha 86,83 a (98,00) Teste F 127,63** 52,35** DMS (5%) 9,61 12,41 CV (%) 15,72 20,78 1 Dados transformados para arc sen (x/100). 2 Dados originais em porcentagem. Médias seguidas de letras iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. **: significativo a 1% de probabilidade. O tratamento com fungicida químico em sementes de milho, entre outras culturas, é um método eficiente e que beneficia a produção, ou seja, o produtor faz um investimento em sementes tratadas, mas tem um retorno financeiro com o aumento da população de plantas na área e na produtividade. A presença de fungos em sementes pode causar deformações, descolorações, necroses e podridões. Dessa maneira, a alta incidência de patógenos pode afetar negativamente o vigor e viabilidade das sementes, interferindo na germinação e no estabelecimento inicial de plantas (Tekle; Skinnes; Bjørnstad, 2013). Embora no presente trabalho as cepas de Trichoderma não tenham sido eficientes para controle de Fusarium verticillioides, Ferrigo et al. (2020) observaram a redução da incidência de doenças por F. verticillioides em 37,1% e F. graminearum em 30,7% a partir da aplicação da cepa INAT11 de T. harzianum em sementes de milho. Na literatura é possível encontrar diversos resultados positivos do tratamento de sementes com Trichoderma no controle de Fusarium spp. em culturas variadas, como milho (Coninck et al., 2020), algodoeiro (Farias et al., 2019), feijão (Ishizuka et al., 2020), pinus (Silva e Lovato, 2019) e trigo (Xue et al., 2017). Sabe-se que a eficiência de Trichoderma como agente de biocontrole está relacionada, entre outros fatores, ao seu modo de aplicação. Medeiros et al (2020) 39 avaliaram três formas de aplicação de Trichoderma spp. (tratamento de sementes, aplicação via solo e aplicação foliar) visando o controle de F. moniliforme “in vitro” e “in situ”. Os autores observaram que o tratamento de sementes foi a forma de aplicação de Trichoderma spp. menos eficiente para controle do patógeno, enquanto os tratamentos via solo e foliar reduziram os sintomas de infecção do patógeno nas plantas. No presente trabalho as cepas de Trichoderma não apresentaram controle na incidência de Fusarium verticillioides a partir do tratamento de sementes em milho. Considerando que a maioria dos trabalhos disponíveis na literatura demonstra resultados positivos na redução da incidência de doenças por meio do uso de Trichoderma spp. em diferentes culturas, pode-se dizer que a forma de aplicação das cepas utilizadas não foi eficiente, pois estas não conseguiram expressar seu potencial de colonização e controle do patógeno. Deve-se considerar que as pesquisas “in vitro” são realizadas em condições controladas e possuem grande importância referencial. Porém, o comportamento do agente de controle biológico testado “in vivo” pode ser diferente, considerando que a ação de Trichoderma spp. é totalmente dependente das condições ambientais favoráveis para seu estabelecimento no ambiente, sendo esse, um fator limitante para a eficiência no controle de fitopatógenos (Ghazanfar et al., 2018; Lobo Junior et al., 2018). Isso pode ser uma justificativa para falta de resultados eficientes no controle da incidência de Fusarium verticillioides em sementes de milho, referente às cepas utilizadas, uma vez que o comportamento do antagonista é influenciado conforme seu estabelecimento e desenvolvimento. 4.3 Qualidade fisiológica de sementes de milho infectadas com Fusarium verticillioides e tratadas com cepas de Trichoderma spp. Quanto ao efeito do tratamento de sementes sobre o vigor (primeira contagem de germinação, PCG) e germinação, no primeiro ensaio, não houve diferença significativa entre os tratamentos para o vigor das sementes, enquanto os resultados de germinação não diferiram da testemunha. No ensaio dois, tanto vigor, quanto germinação foram significativos, entretanto nenhum dos tratamentos apresentou dados superiores à testemunha (tabela 3). 40 Tabela 3 - Efeito do tratamento de sementes de milho com fungicida químico Maxim® isolado, cepas de Trichoderma isoladas e interação entre fungicida químico e cepas de Trichoderma, sobre o vigor (primeira contagem de germinação; PCG) e a germinação (G) Tratamento Ensaio 1 Ensaio 2 PCG (%) G (%) PCG (%) G (%) Fungicida (F) 94,75 a 98,25 a 96,25 a 97,50 a Cepa 1 95,25 a 97,25 ab 90,75 ab 94,00 ab Cepa 2 93,00 a 95,75 ab 91,25 ab 94,50 ab Cepa 3 91,75 a 94,00 b 85,00 b 93,25 b Cepa 1 + F 93,00 a 96,50 ab 90,50 ab 96,75 ab Cepa 2 + F 93,25 a 97,50 a 91,00 ab 97,50 a Cepa 3 + F 92,75 a 96,75 ab 93,50 a 97,25 ab Testemunha 94,00 a 96,75 ab 96,75 a 98,00 a Teste F 0,79NS 2,95* 5,33** 4,06** DMS (5%) 5,68 3,32 7,18 4,12 CV (%) 3,86 2,19 4,97 2,73 Médias seguidas de letras iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *: significativo a 5% de probabilidade; **: significativo a 1% de probabilidade; NS: não significativo. As cepas de Trichoderma foram compatíveis com o fungicida químico quando aplicadas juntamente no tratamento de sementes. Os dados resultantes do tratamento de sementes referentes a vigor e germinação podem estar relacionados à alta porcentagem de vigor inicial das sementes, observada em testes preliminares (dados não apresentados). Para comercialização das sementes, o teste de germinação é obrigatório no território brasileiro, segundo o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento, sendo, para sementes de milho, estipulada a taxa de germinação mínima de 85% (Mapa, 2013). Considerando que os testes de germinação são realizados em condições ideais, é importante que além da porcentagem de germinação, seja considerada a porcentagem do vigor da semente, ainda que os testes de vigor não sejam obrigatórios, os dados referentes ao vigor fornecem ao produtor informações importantes para escolha dos lotes de sementes (Ribeiro, 2023). Segundo os dados apresentados na tabela 3, os valores de germinação em sementes com inoculação natural do patógeno (testemunha) estão entre 94 a 98%, ou seja, acima do padrão mínimo exigido para comercialização e próximos do máximo (100%), o que pode ser uma justificativa para os tratamentos não apresentarem dados superiores à testemunha. Além disso, os tratamentos de semente utilizados não influenciaram 41 negativamente no vigor e na germinação das sementes, exceto com a cepa 3 (LQC 93), que foi inferior à testemunha, no ensaio 2. A partir das pesquisas realizadas, tem sido cada vez mais demonstrado que os resultados benéficos provenientes de Trichoderma spp. não variam apenas entre as espécies, mas também entre os isolados da mesma espécie (Carvalho Filho et al., 2008; Harman, 2011; Peccatti; Rovedder; Steffen, 2019; Santos; Mello; Peixoto, 2010). Com isso, é importante que seja avaliada a eficiência de isolados diferentes, para cada espécie vegetal em questão, com intuito de selecionar os que obtiverem melhores resultados para a agricultura. Isso ocorre porque cada cepa apresenta um mecanismo específico ou mais um de modo de ação, impossibilitando que o resultado benéfico de determinada cepa possa ser generalizado (Harnam, 2011). Diante os dados de vigor e germinação, os tratamentos isolados, e as interações do fungicida químico com as cepas de Trichoderma não foram eficientes para que se justifique o uso dos produtos em interação nas condições que o trabalho foi realizado. 4.4 Comprimento e massas seca e fresca de plântulas de milho O tratamento de sementes proporcionou resultados efetivos tanto no comprimento de raiz e parte aérea, quanto na massa fresca e seca de plântulas, uma vez que, em todas as variáveis avaliadas, os tratamentos foram superiores ou iguais quando comparados com a testemunha (tabela 4). No ensaio 1, o comprimento de parte aérea foi maior nos tratamentos com fungicida, cepa 1 + F., e cepa 2 + F., os quais não difeririam da cepa 3 + F., mas foram superiores à testemunha e demais tratamentos. O comprimento de raiz foi superior a todos os demais tratamentos quando tratado com a cepa 2 isolada. Os resultados obtidos para massa fresca e seca foram semelhantes, em que os tratamentos com fungicida, cepa 1 + F., cepa 2 + F. e cepa 3 + F. não diferiram entre si, porém foram superiores aos demais tratamentos, incluindo a testemunha (tabela 4). 42 Tabela 4 - Efeito do tratamento de sementes de milho com fungicida químico Maxim® isolado, cepas de Trichoderma isoladas e interação entre fungicida químico e cepas de Trichoderma, sobre o comprimento (cm) e massa (g) das plântulas. Tratamento Ensaio 1 CPA CRA MF MS Fungicida (F) 10,86 ab 15,31 b 0,85 a 0,067 a Cepa 1 8,74 cd 14,29 b 0,62 bc 0,053 cd Cepa 2 9,50 bcd 17,31 a 0,65 b 0,058 bc Cepa 3 7,94 d 12,09 c 0,51 c 0,047 d Cepa 1 + F 11,40 a 14,16 b 0,86 a 0,070 a Cepa 2 + F 11,62 a 15,51 b 0,82 a 0,071 a Cepa 3 + F 10,10 abc 14,28 b 0,81 a 0,066 ab Testemunha 9,14 cd 15,47 b 0,68 b 0,056 c Teste F 12,76** 23,35** 26,39** 22,12** DMS (5%) 1,68 1,42 0,12 0,0085 CV (%) 8,30 4,69 7,98 6,83 Tratamento Ensaio 2 CPA CRA MF MS Fungicida (F) 10,85 a 16,58 ab 0,84 a 0,062 ab Cepa 1 9,31 b 16,81 ab 0,76 ab 0,067 a Cepa 2 7,84 cd 15,72 b 0,57 c 0,051 d Cepa 3 7,30 d 14,23 c 0,48 d 0,043 e Cepa 1 + F 10,47 a 17,51 a 0,85 a 0,064 ab Cepa 2 + F 8,98 bc 15,73 b 0,76 ab 0,059 bc Cepa 3 + F 10,81 a 16,19 b 0,81 a 0,064 ab Testemunha 8,84 bc 14,43 c 0,68 b 0,053 cd Teste F 28,89** 16,98** 42,69** 24,67** DMS (5%) 1,14 1,26 0,09 0,0078 CV (%) 5,97 3,87 6,39 6,51 CPA: comprimento de parte aérea. CRA: comprimento de raiz. MF: massa fresca. MS: massa seca. Médias seguidas de letras iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. **: significativo a 1% de probabilidade. No ensaio 2, os resultados se assemelham ao experimento 1, em que o comprimento de parte aérea também foi maior nos tratamentos com fungicida, cepa 1 + F., e cepa 3 + F., diferindo dos demais tratamentos. O comprimento de raiz foi maior no tratamento com a cepa 1+ F., não diferindo do tratamento com fungicida e cepa 1. Os maiores índices de massa fresca foram observados com os tratamentos fungicida, cepa 1 + F., cepa 3 + F., os quais não diferiram dos tratamentos cepa 2 e cepa 2 + F. Para massa seca, o maior índice foi observado com o tratamento com a cepa 1, o qual não diferiu dos tratamentos fungicida, cepa 1 + F. e cepa 3 + F. (tabela 4). Diversos autores relatam resultados positivos do uso do agente biológico no desenvolvimento de plantas. Chagas Junior et al. (2022) observaram o aumento do volume radicular e biomassa das plantas de milho e arroz resultantes do tratamento 43 de sementes com Trichoderma asperellum UFT-201. Steffen et al. 2021 realizaram um trabalho para avaliar o efeito da inoculação de Trichoderma harzianum (cepa TF13) sobre a produtividade do milho, e constataram um aumento na produtividade a partir de sementes tratadas com o bioagente, a produtividade foi de 13,800 kg para de 16.232 kg por hectare. Os autores mencionam que, possivelmente, o aumento ocorreu a partir da capacidade de plantas provenientes das sementes inoculadas absorverem e translocarem nutrientes e água durante o desenvolvimento da cultura, considerando o aumento do volume do sistema radicular e do diâmetro do colmo das plantas resultantes do tratamento de sementes com a cepa TF13. No presente trabalho, pode-se observar que os resultados mais eficientes foram obtidos nos tratamentos com o fungicida isolado ou na interação entre as cepas e o fungicida (tabela 4). 4.5 Desenvolvimento de plantas de milho em casa de vegetação A maior parte dos dados obtidos em casa de vegetação não apresentou diferença significativa entre os tratamentos, para as variáveis avaliadas, com exceção da massa fresca. No ensaio 1, a massa fresca no tratamento de sementes com cepa 2 + aplicação da cepa 2 em sulco de semeadura foi superior ao tratamento de sementes com a cepa 1 + aplicação da cepa 1 em sulco de semeadura + fungicida, entretanto ambos os tratamentos não diferiram dos demais. No ensaio 2, os dados se assemelham ao ensaio 1 (tabela 5). Algumas linhagens do gênero Trichoderma possuem a capacidade de estimular o crescimento de plantas ao se estabelecerem na rizosfera (González e Fuentes 2017; Jalali; Zafari; Salari, 2017). O crescimento de plantas está relacionado com aumento da disponibilidade e absorção de nutrientes proporcionado por meio da interação da rizosfera com o fungo antagonista (Chen et al., 2016; Estrada-Rivera et al., 2019; Machado et al., 2012). A capacidade de promoção de crescimento de plantas pelo uso de Trichoderma tem sido cada vez mais descrita. 44 Tabela 5- Efeito do tratamento de sementes de milho com fungicida químico Maxim® isolado, cepas de Trichoderma isoladas e interação entre fungicida químico e cepas de Trichoderma, sobre o comprimento (cm) e massa (g) de plantas em casa de vegetação Tratamento Ensaio 1 Comp PA Comp RA Massa fresca Massa seca Fungicida (F) 26,33 a 32,17 a 3,71 ab 0,28 a Cepa 1 24,92 a 35,83 a 3,52 ab 0,22 a Cepa 2 26,00 a 33,17 a 3,08 ab 0,19 a Cepa 3 22,50 a 36,33 a 3,24 ab 0,21 a Cepa 1 + F 24,25 a 29,83 a 3,71 ab 0,26 a Cepa 2 + F 24,08 a 32,83 a 3,61 ab 0,25 a Cepa 3 + F 27,25 a 34,50 a 3,51 ab 0,23 a Cepa 1/sulco 25,08 a 29,00 a 3,32 ab 0,21 a Cepa 2/sulco 27,92 a 31,58 a 3,94 a 0,24 a Cepa 3/sulco 25,83 a 27,50 a 2,97 ab 0,21 a Cepa 1/sulco + F 23,90 a 28,67 a 2,58 b 0,21 a Cepa 2/sulco + F 26,08 a 29,42 a 3,06 ab 0,23 a Cepa 3/sulco + F 23,50 a 30,17 a 2,98 ab 0,25 a Testemunha 27,92 a 34,83 a 3,68 ab 0,23 a Teste F 1,44NS 1,01NS 2,27* 1,71NS DMS (5%) 6,78 13,88 1,24 0,08 CV (%) 13,30 21,73 18,51 19,52 Tratamento Ensaio 2 Comp PA Comp RA Massa fresca Massa seca Fungicida (F) 22,83 a 31,67 a 3,72 ab 0,20 a Cepa 1 23,25 a 35,17 a 3,52 abcd 0,20 a Cepa 2 22,00 a 33,00 a 3,08 bcde 0,17 a Cepa 3 23,25 a 35,00 a 3,24 bcd 0,19 a Cepa 1 + F 21,33 a 37,50 a 3,71 ab 0,22 a Cepa 2 + F 23,17 a 37,50 a 3,61 abc 0,23 a Cepa 3 + F 23,75 a 35,33 a 3,50 abcd 0,20 a Cepa 1/sulco 21,00 a 38,33 a 3,32 abcd 0,19 a Cepa 2/sulco 24,17 a 29,67 a 3,94 a 0,19 a Cepa 3/sulco 22,08 a 31,17 a 2,97 de 0,22 a Cepa 1/sulco + F 23,75 a 39,33 a 2,58 e 0,22 a Cepa 2/sulco + F 24,67 a 25,25 a 3,06 cde 0,22 a Cepa 3/sulco + F 23,08 a 31,83 a 3,11 bcde 0,18 a Testemunha 22,83 a 37,83 a 3,68 abc 0,20 a Teste F 1,46NS 1,32NS 8,19* 1,17NS DMS (5%) 7,56 16,94 0,64 0,08 CV (%) 16,42 24,70 9,50 18,85 Comp PA: comprimento parte aérea. Comp RA: comprimento raiz. Médias iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. *: significativo a 5% de probabilidade; NS: não significativo. Corroborando dados do presente trabalho, alguns autores também mencionam resultados relevantes a partir do uso de Trichoderma no desenvolvimento de plantas. Pedro et al. (2012) demonstraram que 54 isolados de Trichoderma spp. aplicados ao substrato resultaram em aumento de até 57,81% na produção de matéria seca em plantas de feijão. Sousa et al. (2018) observaram o aumento de 54% na matéria seca e 35% na parte aérea e raiz de plantas de arroz a 45 partir da aplicação de T. asperellum em combinação com silício em adubação. Ozdemir et al. (2016) verificaram que a aplicação foliar de T. harzianum promoveu maior teor de clorofila em plantas de alface, o qual está relacionado diretamente com a produção de biomassa vegetal. Os resultados do teste do índice de velocidade de emergência realizado em casa de vegetação não diferiram estatisticamente entre si, pelo teste de Kruskal- Wallis-Ranks (tabela 6). Tabela 6 - Efeito do tratamento de sementes de milho com fungicida químico Maxim® isolado, cepas de Trichoderma isoladas e interação entre fungicida químico e cepas de Trichoderma, sobre índice de velocidade de emergência (IVE) em casa de vegetação Tratamento Ensaio 1 Ensaio 2 IVE IVE Fungicida (F) 0,36 a 0,32 a Cepa 1 0,36 a 0,33 a Cepa 2 0,34 a 0,31 a Cepa 3 0,36 a 0,32 a Cepa 1 + F 0,33 a 0,35 a Cepa 2 + F 0,36 a 0,34 a Cepa 3 + F 0,35 a 0,34 a Cepa 1/sulco 0,34 a 0,35 a Cepa 2/sulco 0,34 a 0,34 a Cepa 3/sulco 0,35 a 0,34 a Cepa 1/sulco + F 0,34 a 0,33 a Cepa 2/sulco + F 0,34 a 0,32 a Cepa 3/sulco + F 0,28 a 0,34 a Testemunha 0,35 a 0,34 a P>0,05 0,21 NS 0,11 NS Medianas seguidas de letras letra iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis- Ranks. NS: não significativo. Corroborando os dados do presente trabalho Silva et al. (2017) observaram que a aplicação do produto comercial à base de T. harzianum no tratamento de sementes não aumentou a emergência de plântulas em relação à testemunha. Dados semelhantes foram encontrados por Ferreira (2015) em que a presença de Trichoderma spp. no tratamento de sementes de soja não favoreceu a emergência e o índice de velocidade de emergência, em condições de casa de vegetação. Bortolin et al. (2019) também observaram que T. harzianum no tratamento de sementes de Paspalum regnellii não foi eficiente no aumento do índice de velocidade de emergência de plantas quando comparadas com a testemunha. 46 A eficiência de Trichoderma é variável conforme as condições ambientais e o uso de substratos favoráveis ao seu desenvolvimento e sua atividade antagônica (ferreira, 2015; Smolinska et al., 2016). Dessa maneira, a falta de resultados eficientes quanto à velocidade de emergência de plântulas de milho pode estar relacionada ao substrato utilizado no presente trabalho, o qual pode não ter sido favorável ao desenvolvimento de Trichoderma. 47 5 CONCLUSÕES Nas condições em que o experimento foi conduzido, pode-se concluir que: As cepas de Trichoderma LQC 96 e SLV 10 apresentam potencial antagônico no controle micelial de Fusarium verticillioides; Os resultados de qualidade sanitária e fisiológica das sementes de milho não justificam o uso da interação dos produtos químico e biológicos; Uma vez que Trichoderma spp. tem reconhecida ação no controle de fitopatógenos, testes adicionais, com diferentes técnicas de tratamento das sementes de milho com este bioagente, e de ensaios em campo se fazem necessários para obtenção de resultados mais conclusivos. 48 49 REFERÊNCIAS AGÜERO, L. E. M.; ALVARADO, R.; MARTÍNEZ, A.; DORTA, B. 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