UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU INFUSÃO INTRAVENOSA DE GLICOSE E BALANÇO ENERGÉTICO NA EXPRESSÃO DE ENZIMAS HEPÁTICAS RESPONSÁVEIS PELO CATABOLISMO DE PROGESTERONA EM BOVINOS FERNANDA VICTOR RODRIGUES VIEIRA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Mestre BOTUCATU – SP Fevereiro – 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU INFUSÃO INTRAVENOSA DE GLICOSE E BALANÇO ENERGÉTICO NA EXPRESSÃO DE ENZIMAS HEPÁTICAS RESPONSÁVEIS PELO CATABOLISMO DE PROGESTERONA EM BOVINOS FERNANDA VICTOR RODRIGUES VIEIRA Zootecnista ORIENTADOR: Prof. Ass. Dr. José Luiz Moraes Vasconcelos Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Mestre BOTUCATU – SP Fevereiro – 2012 Dedico bons projetos e resultados aos meus queridos pais, Ana e Roberto, que me ensinam a ver a vida de maneira clara e boa, do jeito que ela é, nem mais, nem menos. Sempre esforçaram-se ao máximo para oferecer o melhor; sempre conseguiram. Não sei se sou o exemplo de filha e pessoa que eles queriam que eu fosse, mas, com certeza, fizeram de tudo para que isso acontecesse. Amor incondicional, carinho e respeito são qualidades que fazem, ou pelo menos deveriam fazer parte de todos os pais, sem dúvidas, eles as possuem e vão muito além. Muito obrigada! AGRADECIMENTOS Minha alegria e reconhecimento não seriam suficientes para agradecer a colaboração dos que se seguem: Ao querido professor Zequinha, pelo exemplo de orientação, pode ser que existam orientadores tão bons, objetivos, claros e eficientes quanto ele, porém não conheço nenhum. Ao professor Reinaldo Cooke, pela incansável ajuda sempre que precisei. Por suas explicações, paciência e entusiasmo em ensinar. Ao professor José Buratini Júnior, por abrir as portas do Laboratório de Fisiologia Molecular Ovariana do Instituto de Biociências/UNESP/Botucatu e por sua disposição em ajudar no que fosse necessário. À Paula, por sua disposição invejável, alegria e enorme ajuda nos testes de PCR. Aos professores Heraldo César Gonçalvez e José Buratini Júnior por participarem da banca do Exame Geral de Qualificação e pela excelente contribuição. Aos professores José Buratini Júnior e Roberto Sartori Filho por participarem da banca de Defesa e pela ajuda no crescimento e melhora desse trabalho. Às vacas 01, 02, 04, 05, 06, 07, 13, 14, 15, 309, 314, Rebeca, Rebelde, Recordista e Oreia. De alguma maneira, nosso débito com os outros animais é enorme. Aos laboratórios e técnicos responsáveis pelas análises de glicose, insulina, IGF-1, progesterona e expressão de RNAm. Aos amigos de pós-graduação Augusto, Adnan, Carlos, Everton, Fernando, Lucas, Marcos e Thiago, pelos momentos vividos e lições aprendidas. Agradecimento em especial ao amigo Augusto pelo convívio desde 2005. A condução deste experimento não seria possível sem muitas pessoas aqui citadas, ele, sem dúvidas, é uma delas. Ao amigo de graduação Bruno, pela amizade e ajuda nessa dissertação. Ao Desidério, funcionário do setor de Bovinocultura de Leite, por sua disposição em ajudar, discutir e, efetivamente, fazer parte dos experimentos conduzidos no setor. Ao professor André Mendes Jorge, por disponibilizar as instalações do setor de Bubalinocultura e aos funcionários do mesmo setor, Lipe e Liu, sempre dispostos a ajudar. À comunidade da FMVZ, principalmente aos queridos Barbosa, Carlos, Carmen, Professora Margarida, Renato, Seila, Solange e Marta. À Fapesp, pelo apoio financeiro. À Conapec, por seu exemplo de união e trabalho. A todos que se seguem pela ajuda durante todo o experimento, sem eles, a parte experimental desse projeto não seria possível: Rapariga, Jamanta, Du Mato, Caipora, Juízo, Clodovil, Xega, Crispim, Alce, Adnan, Barichelo, Almôndega, Atoladinha, Mc, Podecrê, Safada, Paulo, Prepúcio, Xaverin, Mamão Jr, Retirero, Tia Benê, Giromba, Shirlei, Xuasneguer, Abeia, Mundiça, Catarina, Heni e Michele. A minha querida família: Ana, Roberto, Ronan, Anna, Leia, Raul, Pitu, Gabi, Bibi e Zeca, por serem inspiração de amor e darem-me força para sempre continuar. Ao querido amigo e companheiro Fábio, por sempre me ensinar e mostrar o lado bom de tudo. Aos amigos que aqui fiz e que me ajudaram a crescer: Aline, Érica, Edson, Graciela, Lara, Raquel, Simone. Agradeço a Deus pela vida e pelas oportunidades fornecidas. Muito obrigada! "Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no livro do tempo. Aquilo que colocarmos nela, corre por nossa conta." Chico Xavier “Não há diferenças fundamentais entre o homem e os animais, nas suas faculdades mentais... os animais, como os homens, demonstram sentir prazer, dor, felicidade e sofrimento.” Charles Darwin “Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.” Chico Xavier SUMÁRIO Página LlSTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... i LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... ii LISTA DE TABELAS..................................................................................................... iii CAPÍTULO 1................................................................................................................. 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ....................................................................................... 1 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 2 2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 3 2.1. Escore de Condição Corporal e eficiência na reprodução .............................. 3 2.2. Balanço energético, hormônios e metabólitos ................................................ 3 2.3. Infusão de glicose e secreção de insulina....................................................... 5 2.4. Catabolismo de progesterona e ingestão de matéria seca ............................. 6 2.5. Família citocromo P450 e metabolismo de progesterona ............................... 7 2.6. Regulação dos citocromos P450s pela insulina .............................................. 9 3. Referências Bibliograficas ................................................................................... 11 CAPÍTULO 2............................................................................................................... 19 INFUSÃO INTRAVENOSA DE GLICOSE E BALANÇO ENERGÉTICO NA EXPRESSÃO DE ENZIMAS HEPÁTICAS RESPONSÁVEIS PELO CATABOLISMO DE PROGESTERONA EM BOVINOS ........................................................................ 19 RESUMO .................................................................................................................... 20 ABSTRACT ................................................................................................................ 22 1. Introdução ........................................................................................................... 23 2. Material e Métodos .............................................................................................. 25 2.1. Animais e dietas ........................................................................................... 25 2.2. Dispositivo intravaginal de progesterona ...................................................... 26 2.3. Infusão de glicose e colheitas de sangue ..................................................... 26 2.4. Biopsias hepáticas ........................................................................................ 27 2.5. Investigação da expressão do RNAm ........................................................... 28 2.6. Dosagens ..................................................................................................... 30 2.7. Métodos Estatísticos .................................................................................... 30 3. Resultados .......................................................................................................... 31 4. Discussão ............................................................................................................ 37 5. Conclusões .......................................................................................................... 42 6. Referências Bibliográficas ................................................................................... 43 CAPÍTULO 3............................................................................................................... 53 Conclusões Gerais e Implicações ............................................................................... 54 i LlSTA DE ABREVIATURAS AGNEs – Ácidos Graxos Não Esterificados AKR – Aldo keto redutase BE – Balanço Energético BEN – Balanço Energético Negativo BEP – Balanço Energético Positivo CIDR – Dispositivo intravaginal de progesterona CYP2C – Citocromo P450 2C CYP3A- Citocromo P450 3A ECC – Escore de Condição Corporal GH – Hormônio de crescimento GHR1A – Receptor de GH 1A GHR – Receptor de GH GRF – Fator de liberação de GH IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina IMS – Ingestão de Matéria Seca LH – Hormônio Luteinizante MS – Matéria Seca P4 - Progesterona PV – Peso Vivo RT-PCR – Transcrição reversa RNAm – RNA mensageiro PCR – Reação Polimerásica em Cadeia PPG – Propilenoglicol TºC – Temperatura em graus Celsius UGT – Uridina difosfato glucuronosiltransferase ii LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO 1 FIGURA 1......................................................................................................................04 Interação entre hipoinsulinemia e o eixo GH – IGF-1. Adaptado de Butler et al. (2003a) FIGURA 2......................................................................................................................09 Esquema geral da inativação da progesterona nos hepatócitos. Fonte: Lemley & Wilson (2010) CAPÍTULO 2 FIGURA 1......................................................................................................................26 Esquema de disposição de CIDR e colheitas de sangue FIGURA 2......................................................................................................................32 Concentrações séricas de glicose (mg/dL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) FIGURA 3......................................................................................................................33 Concentrações séricas de insulina (μIU/mL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) FIGURA 4......................................................................................................................35 Concentrações séricas de IGF-1 (ng/mL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) iii LISTA DE TABELAS Página CAPITULO 2 TABELA 1......................................................................................................................29 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para os genes alvo (CYP2C, CYP3A, GHR1A e IGF-1) e endógenos (β–actina, CYC-A, GAPDH e RPS9), temperatura em graus Celsius (TºC) de anelamento, eficiência e referência bibliográfica TABELA 2......................................................................................................................31 Mudanças no PV e ECC do d -28 ao d 0 do experimento e concentrações séricas de glicose, insulina, IGF-1 e P4 no início do jejum (12 horas antes da infusão dos tratamentos) de vacas ovariectomizadas e secas em BEN ou BEP TABELA 3......................................................................................................................34 Expressão de RNAm de CYP2C, CYP3A, GHR1A e IGF-1 às 0h de vacas ovariectomizadas e secas em BEN ou BEP TABELA 4......................................................................................................................34 Expressão de RNAm de GHR1A às 3 horas pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) TABELA 5......................................................................................................................36 Expressão de RNAm de CYP3A às 3 horas pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) iv TABELA 6......................................................................................................................36 Concentração sérica média de P4 (ng/mL) pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) 1 CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS 2 1. INTRODUÇÃO Várias pesquisas têm relatado a importância do estado nutricional em relação ao desempenho reprodutivo em vacas leiteiras (VAN KNEGSEL et al, 2005; ROCHE, 2006; GARNSWORTHY et al, 2008a). Neste sentido, ingestão de energia é associada ao reinício da sinalização endócrina normal na vaca pós-parto e a maiores taxas de prenhez (WILTBANK et al., 1962; SCHILLO et al., 1992), o que tem sido associado a dietas de alta energia que promovem secreção de insulina (CHAGAS et al., 2007). Hidalgo et al. (2004) observaram que energia adicionada na forma de propilenoglicol (PPG) uma vez por dia foi associada ao aumento nas concentrações séricas de insulina, progesterona (P4) e taxa de prenhez em vacas leiteiras (HIDALGO et al., 2004). Além disto, a insulina pode afetar a reprodução em bovinos modulando a expressão de enzimas hepáticas associadas ao catabolismo de P4, tais como citocromo P450 2C (CYP2C) e citocromo P450 3A (CYP3A) (MURRAY, 1991; LEMLEY et al., 2008a). Baixas concentrações séricas de P4, devido à elevada taxa de catabolismo e/ou deficiências na função luteal, podem ser responsáveis pelo aumento das perdas de prenhez (LEMLEY et al., 2008a). Trabalhos preliminares relataram que vacas leiteiras e vacas de corte com maiores concentrações séricas de insulina tiveram maiores concentrações séricas de P4 comparadas às vacas com menores concentrações séricas de insulina (MORIEL et al., 2008; LOPES et al., 2009), porém estes estudos avaliaram vacas em moderado balanço energético positivo (BEP). Sabe-se que o metabolismo de insulina é dependente do estado nutricional, e sua síntese, liberação e efeitos metabólicos diferem em bovinos em BEN (HOVE et al., 1978; VEERKAMP et al., 2003). Vieira et al. (2010), estudando vacas ovariectomizadas, secas e com CIDR, recebendo infusão intravenosa de glicose em diferentes BE, demonstraram que houve aumento nas concentrações séricas de glicose e insulina para vacas em BEN e BEP, porém houve aumento nas concentrações séricas de P4 apenas para vacas em BEP, provavelmente devido ao aumento nas concentrações séricas de insulina e à diminuição da atividade das enzimas responsáveis pela metabolização da P4 no fígado (MURRAY, 1991; LEMLEY et. al, 2008a). Há poucos estudos avaliando as concentrações séricas de P4 diretamente relacionadas às concentrações séricas de insulina e expressão de CYP2C e CYP3A. Estes mecanismos fisiológicos são importantes e necessitam maiores investigações, 3 uma vez que insulina e P4 séricas estão associadas à função reprodutiva em vacas leiteiras. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Escore de Condição Corporal e eficiência na reprodução O início da lactação está associado a período prolongado de BEN, durante o qual o consumo de energia é inferior às exigências energéticas envolvidas no rápido aumento da produção de leite (Butler et al., 2003a). Este processo metabólico e endócrino resulta em mudanças que afetam negativamente a fertilidade (VEERKAMP et al., 2003; BUTLER et al., 2004). Butler (2005) verificou que a taxa de concepção diminuiu em 10% para cada perda de 0,5 unidade de Escore de Condição Corporal (ECC) e Pescara et al. (2009) observaram que vacas com menor ECC (< 5,0) apresentaram menor concentração sérica de P4, menor taxa de concepção e maior perda embrionária quando comparadas com vacas com maior ECC (≥ 5,0). Beal et al. (1978) observaram que as concentrações séricas de P4 diminuíram em bovinos com restrição energética comparados a bovinos consumindo adequadas quantidades de energia. P4 é um hormônio necessário para retomada e estabelecimento dos ciclos estrais e manutenção da prenhez (SPENCER & BAZER, 2002;. LOOPER et al, 2003). Estes dados em conjunto sugerem que vacas em restrição energética, com maior perda de condição corporal, maiores concentrações séricas de ácidos graxos não esterificados (AGNEs), menores concentrações séricas de glicose e insulina podem ter menores concentrações séricas de P4, o que compromete o desempenho reprodutivo. 2.2. Balanço energético, hormônios e metabólitos Hormônios metabólicos influenciam a fertilidade de vacas leiteiras interagindo com hormônios reprodutivos que controlam a função ovariana e eventos reprodutivos (WEBB et al., 2004; GARNSWORTHY et al., 2008b). Concentrações séricas de glicose são afetadas pelo ECC (ADAMS et al., 1987) e podem influenciar o desempenho reprodutivo em bovinos (VIZCARRA et al., 1998). As 4 concentrações séricas de glicose e insulina são influenciadas positivamente pela taxa de ingestão de nutrientes (VIZCARRA et al., 1998). Vacas leiteiras em restrição alimentar e, consequentemente em BEN, têm diminuição nas concentrações séricas de glicose (BUTLER et al. 2003b) e insulina (SANGSRITAVONG et al., 2002; BUTLER et al. 2003a; BUTLER, 2005) e aumento nas concentrações de GH (BUTLER et al. 2003a). Mudanças nas concentrações séricas de GH durante este período são opostas às concentrações séricas de IGF-1 e insulina (BELL et al., 2000). Em adição, aumento nas concentrações séricas de IGF-1, devido à boa condição nutricional, geralmente é acompanhado por aumento nas concentrações séricas de glicose e insulina (BOSSIS et al., 2000). Vacas em BEN têm como característica, concentrações séricas de AGNEs aumentadas (BOSSIS et al. 1999; MACKEY et al., 2000). Butler et al. (2003a) observaram que durante situações de baixas concentrações séricas de insulina, incluindo períodos de BEN, a expressão hepática de receptor de GH (GHR) e RNAm de IGF-1 está reduzida, resultando em diminuição na concentração sérica de IGF-1 e aumento na concentração sérica de GH. No tecido adiposo, a expressão de GHR é aumentada durante a hipoinsulinemia, resultando em aumento da mobilização do tecido adiposo (Figura 1). Os receptores de GH são encontrados em muitos tecidos, sendo o fígado o lugar de maior abundância (LUCY et al., 1998). O RNAm de GHR1A é expresso exclusivamente em fígado bovino adulto (LUCY et al., 1998), é a maior das três variantes (GHR1A, GHR1B e GHR1C) de GHR, que normalmente representa 50% do total de mRNA GHR no fígado de bovinos (JIANG & LUCY 2001). Figura 1. Interação entre hipoinsulinemia e o eixo GH – IGF-1. Adaptado de Butler et al. (2003a) 5 A hipoinsulinemia faz parte das mudanças que ocorrem em torno do periparto para que a lactação seja priorizada (BUTLER et al., 2003a). Baixos níveis séricos de insulina reduzem a absorção de glicose nos tecidos periféricos responsivos a este hormônio (adiposo e muscular) e facilitam maior captação de glicose pela glândula mamária (BAUMAN & ELLIOT, 1983), um tecido que não é insulino-responsivo. Assim, não é surpreendente que os avanços genéticos para produção de leite resultaram em baixos níveis séricos de insulina em vacas da raça Holandesa (BONCZEK et al. 1988). A restrição alimentar e BEN reduzem as concentrações séricas de insulina, (MACKEY et al., 2000; SINCLAIR et al., 2002), estes fatores estão associados à diminuição da pulsatilidade da secreção de LH, reduzida responsividade do ovário ao LH e reduzida secreção de estradiol pelo folículo dominante, efeitos que comprometem a ovulação do folículo dominante (BUTLER, 2003b). Vacas submetidas à dieta que induziu elevadas concentrações séricas de insulina ovularam mais cedo (GONG et al., 2002). Por outro lado, elevadas concentrações séricas de insulina tiveram impacto negativo sobre a qualidade e desenvolvimento de oócitos e embriões (ARMSTRONG et al., 2003; FOULADI-NASHTA et al., 2005). 2.3. Infusão de glicose e secreção de insulina A glicose é o principal regulador fisiológico de insulina nos mamíferos (PHILIPPE, 1991). Níveis séricos altos de glicose provocam secreção de insulina pelas células β do pâncreas; níveis baixos deprimem essa secreção e aumentam a secreção de glucagon pelas células α do pâncreas (BERG, 2008). Apesar dos fatores que influenciam a liberação de insulina em vacas continuarem pouco documentados (BOSSAERT, et al., 2008), e também ser secretada em resposta a hormônios gastrointestinais e a mecanismos neurais/parácrinos associados com ingestão de alimentos, ela é principalmente secretada em resposta à concentração sérica de glicose (NUSSEY & WHITEHEAD, 2001). Segundo Fraser (1991), os valores de glicose no sangue de vacas, na faixa de variação considerada normal, estão entre 42 e 74 mg/dL. A concentração sérica de glicose em bovinos é dependente da gliconeogênese hepática, oriunda dos ingredientes da dieta, sendo este mecanismo o responsável por grande parte da glicose circulante (YOUNG, 1977; ARMENTANO, 1992). Entretanto, bovinos em inadequado estado nutricional devem usar outros substratos, tais como aminoácidos endógenos e glicerol vindo de triacilglicerídeos, 6 para, via gliconeogênese, compensar as deficiências nutricionais e previnir reduções significativas na circulação de glicose, dado que a glicose é essencial para a manutenção e diversas funções produtivas nos ruminantes (HUNTINGTON, 1997). Assim, o metabolismo de insulina é altamente dependente do estado nutricional, e sua síntese, liberação e efeitos metabólicos diferem em bovinos em BEN, tais como vacas leiteiras no periparto quando comparadas com vacas em BEP (HOVE, 1978; VEERKAMP et al., 2003). Em condições de hiperglicemia, como infusão intravenosa de glicose, a taxa de secreção de insulina pancreática aumenta, assim como a taxa de remoção e armazenamento de glicose do sangue (SMITH et al., 2009). O suprimento de glicose exógena através de infusão intravenosa ou intraduodenal diminui a síntese de glicose endógena (BARTLEY & BLACK, 1966; LENG, 1970). Para vacas em BEP, maior disponibilidade de glicose aumenta o BE dos tecidos e a oxidação de glicose (REYNOLDS et al., 1994). Hove (1978), após infusão de glicose em vacas em lactação com adequada ou inadequada ingestão de nutrientes, observou comportamento bifásico na curva de insulina para vacas em adequado BE, sendo o primeiro e maior pico caracterizado por maiores concentrações séricas de insulina e mais rápida queda e o segundo pico por menores concentrações séricas de insulina, porém sendo mantidas em níveis mais elevados durante mais tempo, e apenas um pico para vacas em inadequado BE, sugerindo que estas diferenças podem ser atribuídas à alteração de reservas de pró- insulina nas células β do pâncreas devido ao estado nutricional (NELSON & COX, 2005). Vieira et al. (2010) observaram o mesmo padrão na curva de liberação de insulina, sendo bifásico para vacas em BEP e apenas um pico para vacas em BEN, porém estes resultados ainda não são suficientes para elucidar este mecanismo em bovinos, sendo necessária a realização de mais pesquisas para esclarecer este assunto. 2.4. Catabolismo de progesterona e ingestão de matéria seca Elevadas taxas de catabolismo, deficiências na função luteal ou ambos devem ser responsáveis por menores concentrações séricas de P4 e pelo aumento das perdas de prenhez em vacas leiteiras (LEMLEY et al., 2008a; RHINEHART et al., 2009). 7 Alguns estudos mostraram relação positiva entre a taxa de catabolismo de P4 e fluxo sanguíneo no fígado de ovelhas e vacas leiteiras (PARR et al, 1993; SANGSRITAVONG et al, 2002). Harrison et al. (1990) observaram correlação entre Ingestão de Matéria Seca (IMS) e produção de leite, sendo alta IMS uma característica da vaca leiteira de alta produção em lactação (SANGSRITAVONG et al., 2002). Diversos estudos têm relatado os efeitos prejudiciais da IMS nas concentrações de P4 (PARR et al., 1987; DUNNE et al., 1999; SANGSRITAVONG et al., 2002; VASCONCELOS et al., 2003). Neste mesmo sentido, alguns estudos mostraram que aumento na ingestão de IMS provoca maior fluxo sanguíneo na veia porta hepática (SYMONDS & PRIME, 1989) e aumenta o catabolismo de P4 (PRIME & SYMONDS, 1993; PARR et al., 1993; MILLER et al., 1999; VASCONCELOS et al., 2003). Sangsritavong et al. (2002), utilizando vacas leiteiras, observaram aumento no fluxo sanguíneo no fígado e na taxa de catabolismo de P4 pelas células hepáticas, resultando em diminuição nas concentrações séricas de P4 após a alimentação (SANGSRITAVONG et al., 2002; VASCONCELOS et al., 2003). Uma quantidade considerável de P4 é catabolizada nos rins, cérebro, ovário e adrenal (BEDFORD et al, 1974; PARR et al, 1993), porém, dado que o fígado é o maior local de catabolismo de P4 (PARR et al., 1993; FREETLY & FERRELL, 1994), o aumento na IMS aumentaria o catabolismo destes esteróides devido à elevação no fluxo sanguíneo no fígado (SANGSRITAVONG et al., 2002). A diminuição nas concentrações séricas de P4 devido ao catabolismo de esteróides elevado pode ser parcialmente responsável pela redução da fertilidade (LUCY, 2001; WASHBURN et al, 2002) e aumento de perda da gestação (VASCONCELOS et al, 1997) em vacas lactantes. 2.5. Família citocromo P450 e metabolismo de progesterona Os citocromos P450s estão presentes na maioria dos tecidos, mas são altamente expressos nos hepatócitos (as enzimas P450s representam de 1 a 2% do peso dos hepatócitos) e estão tipicamente no retículo endoplasmático liso (RUCKPAUL & REIN, 1984). O catabolismo de P4 ocorre principalmente no fígado via subfamília CYP2C e CYP3A. Os citocromos P450s estão envolvidos no metabolismo de inúmeros compostos endógenos, incluindo a ativação da vitamina D3, o catabolismo de 8 colesterol em ácidos biliares e o metabolismo de todas as principais classes de hormônios esteróides (WAXMAN et al., 1991). A P4 é inativada no fígado em duas fases: na primeira, há a adição de grupos hidroxil ao núcleo do esteróide, produzindo o metabólito 21-hidroxiprogesterona ou 6β- hidroxiprogesterona via CYP2C ou CYP3A, respectivamente (MURRAY et al., 1991, 1992). Ainda na primeira fase, a subfamília aldo keto redutase (AKR) 1C converte P4 em 3α-hidroxiprogesterona ou 20α-hidroxiprogesterona em humanos e roedores (PENNING et al., 2000). As enzimas AKR também estão envolvidas na redução da glicose, metabolismo das prostaglandinas, geração de ácidos biliares e redução de esteróides contendo grupos aldeído ou cetona (PENNING et al, 2000; BARSKI et al, 2008;. KABUTUTU et al., 2009). Já na segunda fase, as enzimas uridina difosfato glucuronosiltransferase (UGT) 1A e 1B conjugam o metabólito hidroxiprogesterona com o ácido glicurônico (BOWALGAHA et al., 2007) (Figura 2). Waxman et al. (1991) determinaram os citocromos P450s predominates em humanos que catabolizam androstenediona, estradiol, P4 e testosterona. A P4 foi predominantemente catabolizada em 6β-hidroxiprogesterona e 16α- hidroxiprogesterona por CYP3A4, CYP3A3, CYP4B1, CYP3A5 e CYP2C8, em ordem de maior para menor atividade. You (2004) observou que as enzimas CYP2C e CYP3A são responsáveis por converter P4 em hidroxiprogesterona. Dean & Stock (1975) sugeriram que a diminuição na atividade total dos citocromos P450 no fígado, elevaria as concentrações séricas de P4. Em suínos, o catabolismo de P4 não parece associado ao conteúdo de CYP no fígado depois de alterar o consumo de ração. No entanto, o conteúdo total de CYP foi positivamente correlacionado com a taxa de inativação de P4 “in vitro” (MILLER et al, 1999). Murray (1991; 1992) mostrou que as principais isoenzimas envolvidas no catabolismo de P4 em ovinos pertencem à subfamília CYP2C e 3A e os principais metabólitos que foram achados foram a 21- hidroxiprogesterona e a 6β-hidroxiprogesterona. Lemley & Wilson (2010) concluíram que as enzimas CYP2C, AKR1C e CYP3A são as que mais contribuem para a inativação hepática de P4 em vacas em lactação em ordem de maior para menor atividade, sendo necessárias mais pesquisas para elucidar as específicas isoenzimas e seus mecanismos durante vários estados fisiológicos “in vivo”. 9 Figura 2. Esquema geral da inativação da progesterona nos hepatócitos. Fonte: Lemley & Wilson (2010) 2.6. Regulação dos citocromos P450s pela insulina A relação entre a expressão dos citocromos P450 e insulina foi proposta quando Barnett et al. (1990) e Shimojo et al. (1993) observaram aumento na expressão da enzima CYP3A em ratos diabéticos insulino-dependentes (concentrações baixas de insulina), que foi revertido pela reposição de insulina. Moriel et al. (2008) e Lopes et al. (2009) estudando vacas ovariectomizadas e secas, com dispositivo intravaginal de P4 (CIDR), observaram que vacas com maior concentração sérica de insulina apresentavam maiores concentrações séricas médias de P4 quando comparadas a vacas com menor insulina. sugerindo que a insulina pode modular a concentração sérica de P4 pelo efeito inibitório no catabolismo hepático deste hormônio em bovinos. Murray (1991) e Lemley et al. (2008a) observaram que insulina alterou a expressão das enzimas catabólicas CYP2C e CYP3A, sugerindo redução no catabolismo hepático de P4. Saad et al. (1994) encontraram uma redução de 40% na formação de 6β- hidroxitestosterona, produto metabólico primariamente catabolizado pela subfamília CYP3A, em hepatócitos de ratos expostos a 10 nM de insulina versus 1 nM. Smith et 10 al. (2006) relataram diminuição na taxa fracional constante de catabolismo de P4 em células hepáticas de ratos desafiados com aumento nas concentrações fisiológicas de insulina. Lemley et al. (2009), utilizando o mesmo tipo de célula e as mesmas condições experimentais, relataram diminuição na atividade de CYP2C e CYP3A depois de desafiar hepatócitos com aumento das concentrações fisiológicas de insulina. Semelhante aos dados “in vitro”, Smith et al. (2006) observaram diminuição no catabolismo de P4 em ovelhas oralmente tratadas com propionato de sódio versus acetato de sódio. Lemley et al. (2008b) encontraram diminuição de aproximadamente 50% na atividade de CYP2C e CYP3A, uma hora pós-alimentação em ovelhas ovariectomizadas suplementadas com propionato de sódio em relação as suplementadas com acetato de sódio. Apesar de existirem trabalhos sobre baixa concentração sérica de P4 e baixa fertilidade em vacas leiteiras, ainda existem poucos trabalhos sobre a importância das enzimas CYP2C e 3A “in vivo” no catabolismo de P4. Portanto, mais pesquisas são necessárias para avaliar os efeitos da insulina sobre as concentrações séricas de P4 “in vivo”. Por isso, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da infusão intravenosa de glicose sobre as concentrações séricas de glicose, insulina, IGF-1, P4, expressão de RNAm de GHR1A e IGF-1, e expressão de RNAm das enzimas hepáticas CYP2C e CYP3A, responsáveis pelo catabolismo de P4 no fígado, em vacas leiteiras secas, ovariectomizadas e com dispositivo intravaginal de P4 (CIDR) em diferentes BE. No capítulo 2, é apresentado o trabalho “Infusão intravenosa de glicose e balanço energético na expressão de enzimas hepáticas responsáveis pelo catabolismo de progesterona em bovinos”. Pretende-se submeter esse trabalho no Journal of Dairy Science. 11 3. Referências Bibliograficas ADAMS, D. C.; SHORT, R. E.; KNAPP, B. W. Body size and body condition effects on performance and behavior of grazing beef cows. Nutrition Reports International, v. 35, p. 269-277,1987. ARMENTANO, L. E. Ruminant hepatic metabolism of volatile fatty acids, lactate and pyruvate. The Journal of Nutrition. Conference: Hepatic Metabolism of Organic Acids in Ruminants. p. 838-842, 1992. ARMSTRONG, D. G.; GONG, J. G.; WEBB, R. Interactions between nutrition and ovarian activity in cattle: physiological, cellular and molecular mechanisms. Reproduction Supplement, v. 61, p. 403 – 414, 2003. BARNETT, C. R. et al. Induction of cytochrome P450III and P450IV family proteins in streptozotocin-induced diabetes. 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Foram utilizadas 15 vacas mestiças Holandês/Gir ovariectomizadas e secas, aleatoriamente distribuídas em um de dois tratamentos nutricionais: 1) BEN (n=7) e 2) BEP (n=8). O grupo de vacas em BEP recebeu concentrado individualmente uma vez ao dia. Durante a fase de adaptação (d-28 ao d-15,5), cada vaca recebeu um CIDR de terceiro uso, sendo que após esta fase (d-14), cada vaca recebeu um CIDR novo. No d 0, as vacas foram aleatoriamente distribuídas em crossover design contendo dois períodos de 24 horas cada (d 0 e d 1): 1) infusão intravenosa de glicose (0,5g/Kg de PV) ou 2) infusão intravenosa de salina (0,9% NaCl). Imediatamente após jejum de 12 horas, as infusões foram feitas em período de três horas. Amostras de sangue foram coletadas às -12 (início do jeum), 0 (antes da infusão), 3 e 6 horas após início da infusão através da veia coccígea em tubos tipo vacutainer. As biopsias hepáticas foram feitas às 0 e 3 horas nos dias do tratamento (d 0 e d 1). Vacas em BEN perderam mais PV e ECC em relação às vacas em BEP (-23,15 vs. 16,5 kg ± 3,9; - 0,200 vs. 0,075 unidades de ECC ± 0,062, respectivamente). Vacas recebendo infusão intravenosa de glicose tiveram maiores concentrações séricas de glicose às 3 horas do início da infusão do que vacas recebendo salina. Vacas em BEN recebendo glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina do que vacas em BEP recebendo glicose às 3 horas pós-infusão, entretanto vacas em BEP recebendo glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina do que vacas recebendo salina. Não houve efeito pós-infusão de tratamentos para expressão de CYP2C. Em vacas em BEP, infusão de glicose reduziu expressão de CYP3A, sem mudança nas concentrações séricas de P4, enquanto que em vacas BEN, infusão de glicose aumentou expressão de CYP3A e reduziu as concentrações séricas de P4. Em 21 conclusão, os efeitos da infusão de glicose nas concentrações séricas de insulina, P4 e expressão CYP3A dependem do estado nutricional. Palavras chaves: vacas, insulina, citocromo P450 2C, citocromo P450 3A 22 Intravenous glucose infusion and nutritional balance on expression of enzymes responsible for catabolism of progesterone in bovines ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the effect of intravenous glucose infusion on serum concentrations of glucose, insulin, IGF-1, progesterone (P4), mRNA expression of GHR1A, IGF-1, and mRNA expression of hepatic enzymes CYP 2C and CYP 3A responsible for the catabolism of P4 in the liver in dry cows, ovariectomized with intravaginal device P4 (CIDR) in different energy balances. Fifteen non-lactating, ovariectomized Gir × Holstein cows, and randomly assigned to: 1) negative nutrient balance (NB; n=7)) and 2) positive nutrient balance (PB; n=8). The group of cows in PB was supplemented individually once a day. For the adaptation phase (d-d-28 to 15, 5), each cow received a CIDR of the third use, and after the adaptation phase (d-14), each cow received a new CIDR. On d 0, cows within nutritional treatment were randomly assigned to receive, in a crossover design containing 2 periods of 24 h each (d0 and d1): 1) intravenous glucose infusion (0.5g/Kg of BW), or 2) intravenous saline infusion (0,9% NaCl). Immediately after fasting for 12 hours, infusions were made over a period of three hours. Blood samples were collected at -12 (beginning of fasting), 0 (before infusion), 3 and 6 hours after start of infusion via the coccygeal vein in vacutainer tubes without anticoagulant type. The liver biopsies were performed at 0 and 3 hours in the day of treatment (d 0 and d 1). NB cows lost more BW and BCS than PB cows (-23.15 vs. 16.5 kg ± 3.9, vs. -0.200. 0.075 ± 0.062 BCS units, respectively). Cows receiving intravenous infusion of glucose had higher serum concentrations of glucose to 3 hours for the start of infusion than cows receiving saline. NB cows receiving glucose had higher serum concentrations of insulin than PB cows receiving glucose, however PB cows receiving glucose had higher serum concentrations of insulin than cows receiving saline at 3 hours. There was no effect of post-infusion treatments for CYP2C expression. In PB cows, glucose infusion reduced the expression of CYP3A, there was no effect in serum concentration of P4, whereas in NB cows, glucose infusion increased expression of CYP3A and decreased serum concentration of P4. In conclusion, the effects of glucose infusion on serum insulin, progesterone and CYP3A expression depend on the nutritional status. Keywords: cows, insulin, cytochrome P450 2C, cytochrome P450 3A 23 1. Introdução Baixa fertilidade em vacas leiteiras tem sido associada à alta demanda metabólica, como resultado de contínua seleção para produção de leite, com alteração de perfis hormonais e da fertilidade (Chagas et al., 2007; Leroy et al., 2008). O consumo de energia é associado ao melhor desempenho reprodutivo (Schillo et al., 1992), sendo os efeitos benéficos do melhor aporte energético na reprodução regulados, em parte, pela circulação de hormônios e metabólitos, tais como glicose, insulina e IGF-1 (Wettemann et al., 2003). Butler (2005) verificou que a taxa de concepção diminuiu em 10% para cada perda de 0,5 unidade de ECC e Pescara et al. (2009) observaram que vacas com menor ECC (< 5,0) apresentaram menor concentração sérica de P4, menor taxa de concepção e maior perda embrionária quando comparadas com vacas com maior ECC (≥ 5,0). Estes dados em conjunto sugerem que vacas com maior perda de condição corporal, menores concentrações de glicose e insulina podem ter menores concentrações de P4, o que compromete o desempenho reprodutivo. Além disso, vacas em restrição alimentar e menor ECC têm menores concentrações séricas de insulina; baixas concentrações séricas de insulina reduzem a expressão de GHR e RNAm de IGF-1 no fígado, modulando as concentrações séricas de GH e IGF-1 (Butler et al., 2003), o que pode prejudicar o desempenho reprodutivo. Neste mesmo sentido, Vieira et al. (2010) observaram que vacas em BEN recebendo glicose tiveram aumento de insulina, porém não houve alteração do catabolismo de P4, segundo proposto por Lemley et al. (2008), podendo sugerir que, talvez, IGF-1 tenha impacto no catabolismo de P4. Gong et al. (2002) relataram que vacas leiteiras com elevada concentração sérica de insulina pós-parto tiveram menor intervalo do parto até a ovulação em comparação às vacas com reduzida concentração sérica de insulina. Por outro lado, em vacas alimentadas com dieta que induziu maiores concentrações séricas de insulina, houve impacto negativo sobre a qualidade e desenvolvimento de oócitos e embriões (Armstrong et al., 2003; Fouladi-Nashta et al., 2005). A P4 é um hormônio necessário para o estabelecimento e manutenção da prenhez (González-Padilla et al., 1975; Spencer & Bazer, 2002; Looper et al., 2003; Lemley & Wilson, 2010). Uma porção de perda embrionária e fetal precoce em vacas leiteiras pode ser explicada por baixas concentrações séricas de P4, as 24 quais podem ser resultado de aumento no catabolismo, diminuição da produção ou ambos (Inskeep e Dailey, 2005). A insulina influencia positivamente a síntese e liberação de LH pela hipófise (Monget & Martin, 1997), estimula a síntese luteal (Spicer e Echternkamp, 1995), pode afetar a reprodução em bovinos modulando a expressão de enzimas hepáticas, tais como CYP2C e CYP3A (Murray, 1991; Lemley et al., 2008a), modula as concentrações séricas (Moriel et al., 2008; Lopes et al., 2009) e reduz o catabolismo hepático (Murray, 1991;. Lemley et al, 2008a) de P4. Vacas com menor ECC (Spicer et al., 1990) têm menores concentrações de LH (Jolly et al., 1995), menor folículo dominante (Roche et al., 2000), menor corpo lúteo (Vanderhaar et al. 1995) e menor concentração sérica de P4 (Spicer et al., 1990, Villa-Godoy et al., 1990; Butler, 2000; Roche et al., 2000), porém Hasler et al. (1980) observaram que o tamanho do corpo lúteo não influenciou nas concentrações séricas de P4. Em vacas recebendo infusão intravenosa de glicose, foi demonstrado que houve aumento nas concentrações séricas de glicose e insulina para vacas em BEN e BEP, porém houve aumento nas concentrações séricas de P4 apenas para vacas em BEP (Vieira et al., 2010). Este resultado foi atribuído à redução no catabolismo de P4, dado que as vacas eram ovariectomizadas e suplementadas com fonte exógena de P4. O catabolismo de P4 ocorre principalmente no fígado via subfamílias do CYP2C e CYP3A. O mecanismo proposto por Lemley et al. (2008a) sugere que a elevação nos níveis de insulina pode diminuir expressão e atividade destas enzimas hepáticas responsáveis pelo catabolismo de P4. Lemley et al. (2008a) relataram os efeitos da insulina na expressão hepática das enzimas catabólicas de P4 em vacas leiteiras em BEN. Entretanto, estes autores não avaliaram as concentrações séricas de P4 diretamente relacionadas com elevadas concentrações séricas de insulina e expressão reduzida destas enzimas. Pouca informação existe sobre a regulação das enzimas que catabolizam P4 em bovinos. Estes mecanismos fisiológicos são importantes e necessitam maiores investigações, uma vez que insulina e P4 circulantes estão relacionadas à função reprodutiva em bovinos. Assim, o objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito da infusão intravenosa de glicose sobre as concentrações séricas de glicose, insulina, IGF-1, P4, expressão de RNAm de GHR1A e IGF-1, e expressão de RNAm das 25 enzimas hepáticas CYP2C e CYP3A, responsáveis pelo catabolismo de P4 no fígado, em vacas leiteiras secas, ovariectomizadas e com dispositivo intravaginal de P4 (CIDR) em diferentes BE. A hipótese é que a infusão intravenosa de glicose aumenta as concentrações séricas de insulina em vacas em BEN e BEP, e diminui a expressão de RNAm das enzimas hepáticas CYP2C e CYP3A, responsáveis pelo catabolismo de P4, apenas em vacas em BEP. 2. Material e Métodos O ensaio foi conduzido na Universidade Estadual Paulista (UNESP), na Fazenda Experimental Lageado, localizada em Botucatu, São Paulo, Brasil. 2.1. Animais e dietas Foram utilizadas quinze vacas mestiças Holandês/Gir ovariectomizadas e secas (n=15, PV= 654,53 kg ± 85,34, ECC inicial = 3,6 ± 0,34) estratificadas de acordo com o PV e ECC (Wildman et al., 1982), e aleatoriamente distribuídas em um de dois tratamentos nutricionais no d-28 do experimento: 1) BEN (n=7) e 2) BEP (n=8). Do d - 28 ao d 0, as vacas permaneceram em dois pastos de Brachiaria brizantha de acordo com o tratamento nutricional, com menor (média de 47% de NDT, 7,6 % de PB e 60,0% de FDN, com base na MS) ou maior qualidade de forragem (média de 54% de NDT, 12,2 % de PB e 54,0% de FDN, com base na MS) e menor (média de 4,5 kg de MS / vaca / dia) ou maior disponibilidade de forragem (média de 10,0 kg de MS / vaca / dia). Ambos os grupos receberam suplemento mineral completo (7,7% de Ca, 4,0% de P, 3,0% de Na, 0,20% de K, 0,20% de Mg, 2,0% de S, 0,002% de Co, 0,03% de Cu, 0,002% de I, 0,02% de Mn , 0,13% de Zn, e 0,02% de F) e água ad libitum durante todo o experimento. O grupo de vacas em BEP foi suplementado individualmente uma vez ao dia às 12 horas, com adaptação por quatorze dias (d-28 ao d-15) com 2,0 kg de ração/vaca/dia, e após este período foram fornecidos 4,5 Kg de ração/vaca/dia por mais quatorze dias (d-14 ao d0). O concentrado consistiu de (base MS) 66,02% de milho moído, 27,73% de farelo de soja, 2,5% de mistura mineral (18% de Ca, 10,7% de Na, 8% de P, 1,2% de S, 0,5% de Mg, 0,13% de Cu , 0,007% de Co e 0,007% de I), 2,5% de calcário e 1,25% de ureia. O conteúdo nutricional de concentrado foi estimado em (base MS) 78% de NDT, 22,5% de PB e 12,9% de FDN. Tratamentos nutricionais foram projetados de acordo com o sistema de avaliação e formulação de 26 dietas CNCPS - Cornell versão 5. e formulados para induzir a perda de PV (-1,0 kg/dia) em vacas em BEN e ganho de PV (0,25 kg/dia) em vacas em BEP. 2.2. Dispositivo intravaginal de progesterona Durante o período de adaptação (d-28 ao d-15,5), cada vaca recebeu um dispositivo intravaginal de P4 (CIDR® 1,9 g de progesterona, Pfizer Saúde Animal, São Paulo, Brasil) de terceiro uso (CIDR 3º uso), para adaptação das enzimas hepaticas à P4, sendo que após a fase de adaptação (d-14), cada vaca recebeu um novo CIDR (CIDR 1º uso), para que no dia da colheita de sangue o dispositivo estivesse nos dias 14/15 após a inserção (Figura 1). Figura 1. Esquema de disposição de CIDR e colheitas de sangue 2.3. Infusão de glicose e colheitas de sangue No d 0, as vacas foram aleatoriamente distribuídas em um crossover design contendo 2 períodos de 24 horas cada (d 0 e d 1): 1) infusão intravenosa de glicose (Glicose; 0,5 g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou 2) infusão intravenosa de solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas). As infusões de ambos os tratamentos foram feitas pela veia jugular com Cateter Venoso para a Introdução Percutânea Uni Lúmen (Biocat®) com agulha 14 GA e 30 cm 27 (Biomedical®, SP, Brasil) por três horas, imediatamente após o jejum de 12 horas. No começo de cada período, todas as vacas foram submetidas a jejum de 12 horas. No momento em que se iniciou o jejum (12 horas antes da infusão dos tratamentos), foram realizadas colheitas de sangue para verificar os níveis basais de glicose, insulina, IGF-1 e P4 e estabelecer seus valores para vacas em BEN e BEP. Amostras de sangue foram coletadas às -12 horas (início do jejum) e às 0 (antes da infusão), 3 e 6 horas após o início da infusão através da veia coccígea em tubos tipo Vacutainer sem anticoagulante (10 ml; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Após a última amostra de sangue do período 1, todas as vacas retornaram para os respectivos pastos e receberam (BEP) ou não (BEN) concentrado. As vacas foram submetidas ao jejum antes da infusão para evitar confundimento entre os efeitos de ingestão de alimentos e tratamentos de infusão nas concentrações séricas de P4 (Vasconcelos et al., 2003). Imediatamente após a colheita, os tubos foram centrifugados e o soro extraído foi acondicionado em frascos “eppendorf” e congelado a -20ºC até o momento das análises laboratoriais. 2.4. Biopsias hepáticas As biopsias hepáticas foram feitas no dia do tratamento (d 0 e d 1) às 0 e às 3 horas após o início da infusão em vacas recebendo glicose ou salina. O pêlo foi removido do lado direito e a pele dos animais foi escovada duas vezes com iodo. O espaço para a biopsia foi entre a 11ª e 12ª costela e foi anestesiado com Lidocaina. Foi feita uma incisão de aproximadamente 1 cm na pele, sendo puncionada usando bisturi e agulha para biopsia de 14 GA X 15 cm (TRU-CUT; Allegiance) foi usada para coletar as amostras de fígado, de acordo com os procedimentos descritos por Lemley (2007). O lado da incisão foi suturado e tratado com Furacin powder (Durvet, Inc., Blue Springs, MO). As amostras foram congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ºC em TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies) até as análises laboratoriais. 28 2.5. Investigação da expressão do RNAm Para as análises laboratoriais, as amostras de fígado foram descongeladas e homogeneizadas com Polytron e submetidas imediatamente à extração total do RNA do tecido, de acordo com o descrito no protocolo do fabricante (TRIzol Reagent). Após a extração, a concentração de RNA total das amostras foi mensurada por espectrofotômetro NanoDrop® ND 1000. As amostras foram tratadas com DNase (Invitrogen®), conforme protocolo do fabricante, para eliminação de possível contaminação com DNA genômico e submetidas à transcrição reversa (RT-PCR). Para a RT-PCR, foi utilizado o “kit“ SuperScript III (Invitrogen®) com oligonucleotídeo poli T (12 a 18 nucleotídeos). A expressão dos genes alvo CYP2C, CYP3A, GHR1A e IGF-1 foi investigada por ensaio de PCR em tempo real utilizado o sistema Power Sybr®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) no ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystem). A identidade dos amplicons foi confirmada pela análise de seu tamanho por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5% e curva de dissociação. A expressão relativa de cada gene alvo foi calculada utilizando o método ΔΔCt e foi corrigida pela eficiência de amplificação das reações utilizando-se a equação descrita por Pfaffl (2001). Os valores médios de eficiência para cada gene foram calculados pelo perfil de amplificação de amostras individualmente pelo programa LinRegPCR (Ramakers et al., 2003). Para cada primer, a linha de threshold foi fixada no ponto médio da janela de linearidade, determinada pelos valores mínimos e máximos de fluorescência. Os genes β–actina, CYC-A, GAPDH e RPS9 foram testados por meio do programa geNorm (Microsoft®) para seleção do controle endógeno mais estável para o fígado bovino, sendo escolhido o CYC-A como gene endógeno. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para os genes alvo e endógenos estão decritos na tabela 1. 29 Ta be la 1 . O lig on uc le ot íd eo s in ic ia do re s ut iliz ad os p ar a os g en es a lv o (C YP 2C , C YP 3A , G H R 1A e IG F- 1) e e nd óg en os (β –a ct in a, C YC -A , G A P D H e R PS 9) , t em pe ra tu ra e m g ra us C el si us (T ºC ) d e an el am en to , e fic iê nc ia e re fe rê nc ia b ib lio gr áf ic a G en e Se qu ên ci a T ºC a ne la m en to Ef ic iê nc ia R ef er ên ci a C YP 2C fo rw ar d: 5 ′-T A TG G A C TC C TG C TC C TG C T- 3′ 60 97 .5 0% Le m le y et a l., 2 00 8a re ve rs e: 5 ′-C A TC TG TG TA G G G C A TG C A G -3 ′ C YP 3A fo rw ar d: 5 ′-G TG C C AA TC TC TG TG C TT C A -3 ′ 60 10 1% Le m le y et a l., 2 00 8a re ve rs e: 5 ′-C C A G TT C C AA AA G G C A G G TA -3 ′ G HR 1A fo rw ar d: 5 -'C C AG C C TC TG TT TC AG G AG TG T- 3' 60 92 % H au se r e t a l., 1 99 0 re ve rs e: 5 '-T G C C A C TG C C AA G G TC A A C -3 ' IG F- 1 fo rw ar d: 5 ′-A C C C TG G A G TT G G TA G A TT G C TG T- 3′ 60 89 ,1 % G en B an k: X 15 72 6. 1 re ve rs e: 5 '-C A C C C A TG C A TT TG TG G C TC TT G A -3 ′ β- ac tin a fo rw ar d: 5' -G C G TG G C TA C A G C TT C A C C -3 ' 60 10 0% Ja no vi ck -G ur et zk y et a l., 2 00 7 re ve rs e: 5' -T TG A TG TC A C G G A C G A TT TC -3 ' C YC -A fo rw ar d: 5' -G C C A TG G A G C G C TT TG G -3 ' 60 10 2% M ac ha do e t a l., 2 00 9 re ve rs e: 5' -C C A C A G TC AG C A A TG G TG A TC T- 3' G AP D H fo rw ar d: 5' -G G C G TG A C C A C G A G AA G TA TT AA -3 ' 62 99 .9 0% M ac ha do e t a l., 2 00 9 re ve rs e: 5' -C C C TC C A C G A TG C C AA A G T- 3' R PS 9 fo rw ar d: 5' -C C TC G A C C A AG A G C TG A AG -3 ' 60 10 0% Ja no vi ck -G ur et zk y et a l., 2 00 7 re ve rs e: 5' -C C TC C A G A C C TC A C G TT TG TT C -3 ' 30 2.6. Dosagens Glicose. Método enzimático colorimétrico (Katal ® Biotecnológica Ind. Com. Ltda.) no Laboratório Clínico do Hospital Veterinário (LC) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ)/UNESP/Botucatu. Insulina. Radioimunoensaio (RIA) com anticorpo em fase sólida (Cout-A-Count kit; DPC® Diagnostic Products Inc., Los Angeles, CA). O coeficiente de variação foi de 6,9%, sendo as concentrações mínimas detectadas de 0,05 μUI/mL, no Laboratório de Endocrinologia Animal/UNESP/Araçatuba. IGF-1 livre. Imunoensaio imunométrico (IMMULITE 2000 IGF-I) de fase sólida, marcado enzimaticamente por quimioluminescência no Grupo São Camilo – Medicna Diagnóstica (Veterinária)/Maringá. Progesterona. Radioimunoensaio (RIA) com anticorpo em fase sólida (Cout-A- Count kit; DPC® Diagnostic Products Inc., Los Angeles, CA). O coeficiente de variação foi de 5,8%, sendo as concentrações mínimas detectadas de 0,1 ng/mL, no Laboratório de Endocrinologia Animal/UNESP/Araçatuba. Investigação da expressão de RNAm. PCR em tempo real no Laboratório de Fisiologia Molecular Ovariana do Instituto de Biociências/UNESP/Botucatu. 2.7. Métodos Estatísticos Os dados foram analisados utilizando o procedimento MIXED do SAS (SAS Inst., Inc., Cary, NC) e da aproximação Satterthwaite para determinar os graus de liberdade do denominador para os testes de efeitos fixos. O modelo estatístico usado para mudanças em PV e ECC continha os efeitos de tratamento nutricional (BEN e BEP). Os dados foram analisados usando vaca (tratamento nutricional) como variável aleatória. Dados fisiológicos coletados no começo do jejum foram analisadas independentemente daqueles coletados imediatamente antes ou após as infusões devido ao significante intervalo e efeito do jejum entre estas colheitas, considerando que medidas no mesmo animal coletadas em tempo próximo são potencialmente mais correlacionadas do que amostras coletadas em tempos mais afastados (Littell et al., 1998). Os modelos estatísticos usados para os dados fisiologicos no começo do jejum continham os efeitos do tratamento nutricional e foram analisados usando vaca (tratamento nutricional) como variável aleatória. Os modelos estatísticos usados para os dados fisiológicos após o jejum continham os efeitos de tratamento nutricional, 31 tratamento de infusão (Glicose e Controle), variáveis de tempo, e as interações adequadas. Dados coletados imediatamente antes da infusão dos tratamentos foram adicionados nesse modelo como covariáveis independentes. Dados foram analisados usando vaca (tratamento nutricional) como variável aleatória. O termo específico para as medidas repetidas foi vaca (tratamento nutricional x infusao x dia) e a estrutura de covariância utilizada foi auto-regressiva, a qual proporcionou o melhor ajuste para estas análises de acordo com o critério de informação Akaike. Todos os resultados foram separados usando LSD. A significância foi estabelecida como P ≤ 0,05 e tendências são declaradas se P > 0,05 e ≤ 0,10. Os resultados são apresentados de acordo com os efeitos do tratamento, se não houver interações significativas ou de acordo com a maior ordem de interação detectada. 3. Resultados Vacas em BEN perderam mais PV e ECC em relação às vacas em BEP (Tabela 2). Tabela 2. Mudanças no PV e ECC do d -28 ao d 0 do experimento e concentrações séricas de glicose, insulina, IGF-1 e P4 no início do jejum (12 horas antes da infusão dos tratamentos) de vacas ovariectomizadas e secas em BEN ou BEP1 Item BEN 2 BEP 3 SEM P-value Mudança de PV, kg -23,15 16,5 3,9 0,01 Mudança no ECC (1 a 5) 4 -0,2 0,075 0,062 0,02 Glicose, mg/dL 65,3 61,7 2,1 0,23 Insulina, μUI/mL 5,82 6,33 0,86 0,69 IGF-1, ng/mL 126,01 85,97 12,7 0,04 P4, ng/mL 1,72 1,33 0,13 0,05 1 Mudanças no ECC e PV foram calculadas pelas medidas obtidas no d -28, d-14 e d 0. Colheitas de sangue foram realizadas no início do jejum de 12 horas 2 Vacas em BEN foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha com menor disponibilidade de foragem; 3 Vacas em BEP foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha com maior disponibilidade de foragem e receberam diariamente 2 kg/vaca de concentrado do d -28 ao d -15 e 4,5 kg/vaca do mesmo concentrado do d -14 ao d 0; 4 De acordo com Wildman et al. (1982); 32 No início do jejum, as concentrações séricas de glicose não diferiram (Tabela 2) entre vacas em BEN e BEP. Foi detectada uma interação entre infusão e tempo (P < 0,01) para concentrações séricas de glicose, independentemente do tratamento nutricional. Vacas recebendo infusão intravenosa de glicose tiveram maiores concentrações séricas de glicose às 3 horas relativas ao início da infusão do que vacas recebendo salina (Figura 2). Figura 2. Concentrações séricas de glicose (mg/dL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas). Comparação do tratamentos nas horas: ** P < 0,01 As concentrações séricas de insulina foram semelhantes para vacas em BEN e BEP (Tabela 2) no início do jejum. Foi detectada uma interação (P = 0,02) entre balanço energético, infusão e tempo nas concentrações séricas de insulina. Após a infusão, vacas que receberam infusão intravenosa de glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina às 3 horas do que vacas que receberam salina. Vacas em BEN recebendo glicose apresetaram maiores concentrações séricas de insulina do que vacas em BEP (Figura 3). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 3 6 G lic os e, m g/ dl Hora relativa infusão Glicose Salina ** 33 Figura 3. Concentrações séricas de insulina (μIU/mL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) Horas designadas com letras indicam diferenças entre os seguintes tratamentos: a = BEN Glicose vs. BEN Salina (P < 0,01); b = BEP Glicose vs. BEP Salina (P < 0,05). Comparação nas horas para vacas em BEN e BEP recebendo infusão intravenosa de glicose: ** P < 0,01. Expressão de RNAm de GHR1A foi semelhante às 0h (Tabela 3) para vacas em BEN e BEP. Foi detectada uma interação entre balanço energético e infusão. Em vacas BEN, infusão de glicose aumentou expressão de GHR1A, enquanto em vacas BEP, infusão de glicose reduziu expressão de GHR1A (Tabela 4). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 3 6 In su lin a, μ U I/m L Horas relativa infusão BEN Glicose BEN Salina BEP Glicose BEP Salina a b ** 34 Tabela 3. Expressão relativa de RNAm de CYP2C, CYP3A, GHR1A e IGF-1 às 0h de vacas ovariectomizadas e secas em BEN ou BEP1 Item BEN 2 BEP 3 SEM P-value CYP2C 1,04 0,89 0,13 0,41 CYP3A 0,98 0,79 0,12 0,25 GHR1A 2,8 2,68 0,31 0,78 IGF-1 3,94 2,20 0,62 0,07 1 Biopsias de de fígado, para investigação da expressão do RNAm, foram feitas às 0h (imediatamente antes da infusão dos tratamentos); 2 Vacas em BEN foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha com menor disponibilidade de foragem; 3 Vacas em BEP foram mantidas em pasto de Brachiaria brizantha com maior disponibilidade de foragem e receberam diariamente 2 kg/vaca de concentrado do d -28 ao d -15 e 4,5 kg/vaca do mesmo concentrado do d -14 ao d 0; Tabela 4. Expressão relativa de RNAm de GHR1A às 3 horas pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) Tratamento BEN BEP Glicose 3,53 ± 0,33a,c 2,34 ± 0,30b,c Salina 2,25 ± 0,33a,d 3,63 ± 0,30b,d (a,b): Letras distintas nas linhas referem-se a diferenças significativas (P <0,05) (c,d): Letras distintas nas colunas referem-se a diferenças significativas (P <0,05) Antes da infusão dos tratamentos, expressão de RNAm de IGR-1 foi maior (Tabela 3) em vacas em BEN comparadas às vacas em BEP. No início do jejum, as concentrações séricas de IGF-1 foram maiores (Tabela 2) em vacas em BEN comparadas às vacas em BEP. Foi detectada uma interação entre infusão e tempo (P = 0,04) para concentrações séricas de IGF-1, independentemente do tratamento nutricional. Vacas recebendo infusão intravenosa de salina tiveram menores concentrações séricas de IGF-1 às 6 horas relativas ao início da infusão do que vacas recebendo salina (Figura 4). 35 Figura 4. Concentrações séricas de IGF-1 (ng/mL) em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas). Comparação do tratamentos nas horas: * P = 0,04 Expressão de RNAm de CYP2C e CYP3A foi semelhante às 0h (Tabela 3) para vacas em BEN e BEP. Infusão de glicose aumentou expressão de CYP3A em vacas em BEN e reduziu em vacas em BEP às 3 horas relativas ao início da infusão (Tabela 5). Não houve efeito pós-infusão de tratamentos para expressão de RNAm de CYP2C. 60 70 80 90 100 110 120 0h 3h 6h IG F- 1; n g/ m L Hora relativa à infusão Glicose Salina * 36 Tabela 5. Expressão relativa de RNAm de CYP3A às 3 horas pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) Tratamento BEN BEP Glicose 1,09 ± 0,11a,c 0,62 ± 0,10b,c Salina 0,72 ± 0,11a,d 0,95 ± 0,10a,d (a,b): Letras distintas nas linhas referem-se a diferenças significativas (P <0,05) (c,d): Letras distintas nas colunas referem-se a diferenças significativas (P <0,05) No início do jejum, as concentrações séricas de P4 foram maiores (Tabela 2) em vacas em BEN comparadas às vacas em BEP. Foi detectada uma interação entre balanço energético e infusão. Vacas em BEN, recebendo salina, tiveram maior concentração sérica média de P4 do que vacas recebendo glicose (Tabela 6), enquanto não houve efeito de infusão para vacas em BEP. Tabela 6. Concentração sérica média de P4 (ng/mL) pós-infusão em vacas não lactantes infundidas via intravenosa com solução de glicose a 5% (Glicose; 0,5g/kg de PV; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) ou com solução fisiológica (Salina; 0,9% NaCl; solução administrada, na média, em 36 mL/min durante período de 3 horas) Tratamento BEN BEP Glicose 1,44 ± 0,10 a,c 1,60 ± 0,10 a,c Salina 1,83 ± 0,10 a,d 1,54 ± 0,10 b,c (a,b): Letras distintas nas linhas referem-se a diferenças significativas (P = 0,06) (c,d): Letras distintas nas colunas referem-se a diferenças significativas (P <0,05) 37 4. Discussão Vacas em BEN perderam mais PV e ECC em relação às vacas em BEP, o que era esperado devido as diferenças na ingestão de nutrientes e consequente estado nutricional de vacas em BEN e BEP. Antes da infusão dos tratamentos, as concentrações séricas de glicose não diferiram entre vacas em BEN e BEP. As concentrações séricas de glicose em bovinos são dependentes de gliconeogênese hepática dos ingredientes da dieta depois da digestão (Young, 1977), particularmente o propionato originado da fermentação do rúmen (Huntington, 1997; Reynolds et al., 1994; Reynolds, 2005). Entretanto, bovinos em inadequado estado nutricional podem utilizar outros substratos gliconeogênicos, tais como aminoácidos endogênicos e glicerol proveniente de ácidos graxos e também aumentar a gliconeogênese para compensar as deficiências nutricionais e prevenir significantes decréscimos na circulação de glicose, sendo que a glicose é essencial para a mantença e para as funções produtivas de ruminantes (Huntington, 1997), o que pode explicar as concentrações semelhantes de glicose, independentemente do BE. Resultados de Vieira et al. (2010) estão de acordo com o presente experimento, pois vacas infundidas com glicose tiveram maiores concentrações séricas de glicose às 3 horas relativas ao início da infusão do que vacas recebendo salina, independentemente de estado nutricional. Outros autores também relataram maiores concentrações séricas de glicose em vacas leiteiras recebendo infusão intravenosa de glicose comparadas a grupos recebendo salina, independentemente do estado nutricional (Subiyatno et al., 1996; Al-trad et al., 2009). As concentrações séricas de insulina antes da infusão de tratamentos foram semelhantes para vacas em BEN e BEP, apesar das concentrações séricas de insulina estarem associadas à ingestão de nutrientes (Vizcarra et al., 1998; Bossis et al., 2000; Lapierre et al., 2000), insulina é sintetizada e secretada principalmente em resposta às concentrações de glicose (Nussey & Whitehead, 2001). Após a infusão dos tratamentos, vacas que receberam infusão intravenosa de glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina às 3 horas do que vacas que receberam salina, o que está de acordo com Vieira et al. (2010). Entretanto, vacas em BEN recebendo glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina às 3 horas do que vacas em BEP recebendo glicose. Vieira et al. (2010) observaram que vacas em BEN conseguiram manter a concentração de 38 insulina alta por mais tempo comparadas às vacas em BEP, ainda Hove (1978) observou comportamento bifásico na curva de insulina com pico máximo dentro de 20 minutos depois do começo da infusão de glicose, sendo seguido pela sustentação da elevação nas concentrações séricas de insulina em vacas normais; em vacas sofrendo restrição alimentar, somente a fase posterior foi detectada, sugerindo que, talvez, os resultados do presente experimento podem ser devido ao momento do pico. Entretanto, novas pesquisas são necessárias para avaliar esta questão. Expressão de RNAm de GHR1A foi igual para vacas em BEN e BEP, apesar das diferenças na ingestão de nutrientes e mudanças no ECC e PV. Os receptores de GH são encontrados em muitos tecidos, sendo o fígado o lugar de maior abundância (Lucy et al., 1998). Além do RNAm de GHR1A ser expresso exclusivamente em fígado bovino adulto (Lucy et al., 1998), é a maior das três variantes (GHR1A, GHR1B e GHR1C) de GHR, que normalmente representa 50% do total de mRNA GHR no fígado de bovinos (Jiang & Lucy 2001). A expressão de GHR e RNAm de IGF-1 no fígado é sensível (responsivo) ao estado nutricional (Bornfeldt et al., 1989; Pell et al., 1993) e ao estado fisiológico (Kobayashi et al., 1999). Segundo Butler et al. (2003), durante situações de baixa insulina plasmática, incluindo períodos de BEN, a expressão de GHR e IGF-1 é reduzida. No presente trabalho, as concentrações séricas de insulina antes da infusão foram as mesmas para vacas em BEN e BEP, o que pode explicar expressão semelhante de RNAm de GHR1A entre diferentes BE. McCarthy et al. (2009), observaram redução de RNAm de GHR1A durante o meio da lactação em comparação ao início da lactação, porém as vacas estavam em melhor condição de BE no dia 140 comparado às vacas no dia 35 pós-parto. Lucy et al. (2001, 2009), analisaram biópsias de fígado no dia do parto e ao longo da lactação, e observaram aumento substancial de GHR1A com o avanço no estágio de lactação. Entretanto, Rhoads et al. (2008), não observaram mudança na expressão de RNAm de GHR1A no fígado de vacas leiteiras entre o dia 40 e 160 pós-parto. Por outro lado, os níveis de RNAm de GHR1A nem sempre refletem a abundância da proteína de GHRs (McCarthy, et al., 2009). Rhoads et al. (2007) observaram reduzida proteína de GHR sem corresponder a redução de RNAm de GHR1A no fígado em vacas nutricionalmente estressadas, o que também pode ter acontecido no presente estudo. Ainda, o declínio na expressão de GHR1A parece ser específico para vacas leiteiras, pois não ocorre mudança no GHR1A em vacas de corte (Jiang et al., 2005), o 39 que pode explicar os resultados desse experimento, uma vez que foram utilizadas vacas secas e mestiças Holandês/Gir. O mecanismo, proposto por Butler et al. (2003), é que hiperinsulinemia aumenta GHR no fígado, estes autores observaram que após a infusão de glicose, vacas em BEN tiveram maior expressão de GHR1A, enquanto vacas BEP tiveram redução na expressão de GHR1A. Butler et al. (2003) demonstraram que, em vacas em início de lactação e consequente BEN, houve redução da expressão hepática de RNAm de GHR1A e IGF-1 em vacas recebendo salina (controle), mas foi aumentada em 3,6 vezes e 6,3 vezes, respectivamente, em vacas recebendo infusão intravenosa de insulina, o que está de acordo com o presente trabalho. Observou-se menor expressão de GHR1A após a infusão de glicose em vacas em BEP, de acordo com McCarthy et al. (2009), para vacas entre o dia 35 e 140 pós- parto, foi observada menor expressão de GHR1A com aumento de BE. Segundo Jiang et al. (2005), os mecanismos que causam declínio de GHR1A fora do período do parto são desconhecidos. Antes da infusão de tratamentos, expressão de RNAm e concentração sérica de IGF-1 foi maior em vacas em BEN comparadas às vacas em BEP. Restrição alimentar em vacas leiteiras aumentou (Bauman et al., 1979; Vicini et al., 1988; Lapierre et al., 1995) ou não afetou (DeBoer et al., 1989; McGuire et al., 1992), as concentrações séricas de GH. De maneira semelhante, restrição alimentar aumentou (Lapierre et al., 1992a) ou não afetou (Elsasser et al., 1989) a resposta nas concentrações séricas de GH pelo GRF (Fator de liberação de GH). O grau da restrição alimentar é provavelmente um dos maiores efeitos nas diferenças observadas (Lapierre et al., 1995). Talvez, no presente experimento, vacas em BEN apresentaram maiores concentrações séricas de GH comparadas às vacas em BEP, o que pode explicar maior expressão de RNAm e concentração sérica de IGF-1 às 0 h no grupo em BEN, já que a expressão de GHR1A foi a mesma para os diferentes BE e as ações fisiológicas de GH são iniciadas quando GH se liga aos receptores de GH em células- alvo. No fígado, local de maior abundância de GHR, a ligação do GH ao GHR-1A inicia a síntese e secreção de IGF-I (Roche et al., 2009). Vacas recebendo infusão intravenosa de salina tiveram menores concentrações séricas de IGF-1 às 6 horas relativas ao início da infusão do que vacas recebendo glicose, o que pode ser explicado devido ao período prolongado de jejum, totalizando, às 6 horas pós-infusão, jejum de 18 horas. 40 Antes da infusão dos tratamentos, expressão de RNAm de CYP2C e CYP3A foi semelhante para vacas em BEN e BEP, o que pode ser explicado devido a semelhantes concentrações séricas de insulina neste momento (Lemley et al., 2008a). Não houve efeito pós-infusão para expressão de RNAm de CYP2C. O que pode explicar as concentrações séricas de P4 em vacas em BEP, já que CYP2C é a enzima que mais contribui para inativação hepática de P4 em vacas (Lemley & Wilson, 2010). Para vacas em BEP, infusão intravenosa de glicose reduziu expressão de CYP3A, o que era esperado. Enquanto que, para vacas em BEN, infusao de glicose aumentou expressão de CYP3A, o que foi inesperado e necessita maiores investigações, uma vez que maiores níveis de insulina diminuem a expressão desta enzima em bovinos (Lemley et al., 2008a; Lemley et al., 2010). Lemley et al. (2008a), observaram que mesmo com aumento de 30% de insulina para vacas que recebiam PPG e melhora no BE, expressão de RNAm de CYP2C em vacas recebendo água ou PPG não diferiu entre os tratamentos, entretanto, vacas recebendo PPG tiveram redução de 40% na quantidade de RNAm de CYP3A. No mesmo trabalho, durante administração de insulina (1,0 μg/insulina/Kg PV/h por 96 horas), houve aumento de aproximadamente 9 vezes (2,33 vs. 0,27 ng/mL) nas concentrações de insulina e redução na expressão de RNAm de CYP2C e CYP3A e diminuição de 88 e 45% na atividade de CYP2C e CYP3A comparado ao grupo controle. Estes resultados podem sugerir que, para ocorrer diminuição na expressão de RNAm de CYP2C, seja necessário maior concentração de insulina e/ou desafio mais longo do que foi observado no presente experimento. In vitro, Smith et al. (2006) observaram diminuição na degradação de P4 em linhagem de hepatócitos de ratos cultivados com aumento na concentração de insulina. Lemley (2007) demonstrou que as mesmas células de hepatócitos, cultivadas sob idênticas condições experimentais, tiveram atividades diminuídas de CYP2C e CYP3A após um desafio de 4 horas de insulina, o que é congruente com a diminuição observada nas concentrações de P4. Entretando, apesar de alguns estudos demonstrarem que em ovelhas ovariectomizadas e vacas leiteiras alimentadas com dietas que estimulam a secreção de insulina houve diminuição na atividade e/ou expressão de CYP 2C e/ou CYP 3A, não houve diferença no catabolismo de P4 (Lemley et al., 2008a; Lemley et al., 2008b; Lemley et al., 2010). 41 Adicionalmente, no presente estudo, vacas receberam infusões de glicose somente uma vez durante o experimento e o aumento nas concentrações séricas de insulina foi agudo, mas temporário, considerando que nos citados estudos as infusões de insulina são administradas continuamente durante período de 4 dias (Butler et al., 2003; Lemley et al., 2008a) e a administração diária de PPG fornecida por 35 dias (Butler et al., 2006; Lemley et al., 2008a) antes das coletas de amostras do fígado. Vieira et al. (2010) observaram diminuição no catabolismo de P4 em vacas em BEP com altas concentrações séricas de insulina, sugerindo diminuição na expressão e/ou atividade de CYP2C e CYP3A. Talvez, os níveis de insulina necessários para alterar CYP2C e CYP3A, e alterar as concentrações séricas de P4 no grupo em BEP, sejam maiores do que o observado no presente experimento. Não houve alteração da enzima CYP2C, o que pode explicar a inalteração dos níveis de P4 em vacas em BEP neste experimento, já que esta enzima é a mais importante na inativação de P4 em vacas leiteiras (Lemley & Wilson, 2010). No início do jejum, as concentrações séricas de P4 foram maiores em vacas em BEN em comparação às vacas em BEP, o que está de acordo com estudos de Vieira et al. (2010) e Rodrigues et al. (2011). As vacas utilizadas no presente estudo eram ovariectomizadas e, portanto, a principal fonte de circulação de P4 foi o CIDR, além disso, os animais passaram por jejum de 12 horas antes das infusões dos tratamentos para eliminar os efeitos da ingestão de alimento nas concentrações séricas de P4 (Vasconcelos et al., 2003). As diferenças nas concentrações séricas de P4 entre vacas em BEN e BEP antes da infusão dos tratamentos podem ser atribuídas a vários fatores. Vacas em BEP tiveram maior ingestão de alimento comparadas às vacas em BEN, considerando que maior ingestão de alimento leva a maior fluxo de sangue no fígado e, consequentemente maior catabolismo hepático de P4 (Sangsritavong et al., 2002). A glândula supra-renal é capaz de sintetizar quantidades significativas de P4 como um intermediário da síntese de corticóide quando estimulado por fatores estressantes (O'Connor et al., 2000), e restrição alimentar pode aumentar a síntese adrenal de cortisol (Murayama et al. 1986; Ward et al, 1992;. Henricks et al, 1994), e, talvez, a produção P4 pela adrenal (Cooke & Arthington, 2009). Por outro lado, Rodrigues et al. (2011) observaram que não existem correlações significativas entre cortisol e P4 em vacas perdendo peso. Além disso, P4 é armazenada no tecido adiposo e pode ser liberada para a circulação quando a gordura corporal é mobilizada (Hamudikuwanda et al., 1996; Rodrigues et al., 2011). 42 Vacas em BEN, recebendo infusão intravenosa de salina, tiveram concentração sérica média de P4 maior do que vacas recebendo glicose. Pesquisas anteriores demonstraram que a circulação de AGNEs em vacas leiteiras lactantes e não-lactantes recebendo precursores de glicose, tais como PPG, diminuiu particularmente quando vacas estavam em BEN (Christensen et al., 1997; Butler et al., 2006). Neste mesmo sentido, Madureira et al. (2011) observaram que vacas em BEN recebendo PPG tiveram diminuição nas concentrações séricas de P4 das 0,5 às 3 horas depois da administração de PPG, porém vacas em BEP não, sugerindo que a mobilização de gordura diminuiu devido à adiministração de PPG, o que pode ter acontecido no presente trabalho. Para vacas em BEN recebendo glicose houve diminuição na concentração sérica media de P4, o que pode ser explicado pelo aumento na expressão de CYP3A, sugerindo maior catabolismo de P4 neste grupo. Era esperado que vacas em BEP recebendo infusão intravenosa de glicose tivessem maiores concentrações de P4, porém não houve efeito de infusão em vacas BEP. Vieira et al. (2010) observaram aumento nas concentrações séricas de P4 em vacas em BEP recebendo infusão intravenosa de glicose, porém as concentrações séricas de insulina destas vacas alcançaram aproximadamente 220 μIU/mL, sendo que, no presente experimento, vacas em BEP alcançaram aproximadamente 50 μIU/mL de concentração sérica máxima de insulina. Talvez, para que ocorra diminuição no catabolismo de P4, seja necessário alcançar maiores níveis de concentração sérica de insulina do que os observados neste experimento. 5. Conclusões Os efeitos de infusão intravenosa de glicose nas concentrações séricas de insulina, P4 e expressão de CYP3A, em vacas ovariectomizadas e secas recebendo dispositivo intravaginal de P4, foram dependentes do BE. Vacas em BEN recebendo glicose tiveram maiores concentrações séricas de insulina comparadas às vacas em BEP. O aumento temporário nas concentrações séricas de insulina aumentou expressão de CYP3A e reduziu concentrações séricas de P4 em vacas em BEN, por outro lado, reduziu expressão de CYP3A em vacas em BEP, o que não foi suficiente para alterar as concentrações séricas de P4 neste grupo. 43 6. Referências Bibliográficas Al-Trad, B., K. Reisberg, T. Wittek, G. B. Penner, A. Alkaassem, G. Gabel, M. Furll, J. R. Aschenbach. 2009. Increasing intravenous infusions of glucose improve body condition but not lactation performance in midlactation dairy cows. J. Dairy Sci. 92: 5645-5658. Armstrong, D. G., J. G. Gong, R. Webb. Interactions between nutrition and ovarian activity in cattle: physiological, cellular and molecular mechanisms. 2003. Reprod. Suppl. 61: 403 – 414, 2003. Bauman, D. E., R. M. Akers, L. T. Chapin, H. A. Tucker, and E. M. Convey. 1979. Effect on intake on serum concentrations of prolactin and growth hormone in lactating cows. J. Dairy Sci. 62(Suppl. I): 14 (Abstr). Bornfeldt, K. 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