RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 03/03/2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Letícia Antunes Muniz Ferreira Potenciais microRNAs circulantes como biomarcadores de Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica: recém diagnosticada e tratada com mesilato de imatinibe Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestra em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra. Célia Regina Nogueira Coorientadora: Profa. Dra. Paula de Oliveira Montandon Hokama Botucatu 2016 Letícia Antunes Muniz Ferreira Potenciais microRNAs circulantes como biomarcadores de Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica: recém diagnosticada e tratada com mesilato de imatinibe Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestra em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa.Dra. Célia Regina Nogueira Coorientadora:Profa.Dra. Paula de Oliveira Montandon Hokama Botucatu 2016 ii “Viva como se fosse morrer amanhã. Aprenda como se fosse viver para sempre.” Mahatma Gandhi DEDICATÓRIA iv Àqueles que tanto apoiam e incentivam meu crescimento pessoal e profissional: meus pais, Ana Maria e Silvestre AGRADECIMENTOS vi A realização desta dissertação só foi possível com a colaboração e contribuição, de forma direta ou indireta, de algumas pessoas, às quais gostaria de exprimir meu profundo reconhecimento: Às Professoras Doutoras Célia Regina Nogueira e Paula de Oliveira Montandon Hokama, pela orientação e confiança no nosso trabalho, às palavras amigas e incentivos nos momentos de maior dificuldade; Aos meus pais, Ana Maria e Silvestre, e à minha irmã, Larissa, que sempre apoiaram incondicionalmente minhas decisões e por tudo que me ensinaram ao longo da vida; Às minhas irmãs de coração da República Micasa, por tornarem minha vida mais doce diante das dificuldades. À queridíssima Mixera, que mesmo distante sempre esteve presente. Obrigada por sempre me ouvir, Mi! Ao meu namorado Cleber, por todo apoio e carinho. E, à minha querida amiga Daiane pelo companheirismo; À companheira de pós-graduação Juliane Dias Dadalto, pela amizade, por sempre me ouvir e pelos conselhos precisos, principalmente nessa reta final; Ao Prof. Dr. Robson Francisco Carvalho e Mestre Leonardo Nazario de Moraes, pelo empréstimo do laboratório e pela grande ajuda com as RT-qPCR. Ao serviço de hematologia e transplante de medula óssea do Hospital Amaral Carvalho de Jahu-SP, pela ajuda e empenho desde o início deste projeto. À Mestra Juliana Capannacci pela dedicação, conselhos e amizade ao longo do projeto; Ao Professor Doutor Ney Lemke e ao Doutor Marcio Luis Acencio, pela preciosa colaboração; À Biogem s.c.a.r.l., especialmente aos funcionários Olga Sampietro, Remo Pernacchia e Michele Farisco, por toda ajuda com a documentação do intercâmbio e pela paciência que tiveram em meu período de adaptação; Ao Laboratório de Bioinformática da Biogem e aos amigos que lá fiz Giovanna Maria Ventola, Alessia Russo, Mario Cangiano e Fulvio D’Angelo, que me acolheram vii de braços abertos, me mostram Ariano Irpino e ainda tentaram me ensinar italiano. Grazie mille per tutto! Aos Professores Doutores Michele Ceccarelli e Luigi Cerullo, pela orientação no período em que estive na Biogem; Ao Instituto de Medicina Molecular (IMM) de Lisboa, à Professora Doutora Maria Carmo-Fonseca, à Doutora Evguenia Bekman e aos alunos de pós-graduação do Laboratório MC Fonseca Lab, por me apresentarem uma nova técnica de edição gênica; Ao Laboratório de Biologia Molecular da Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) sob responsabilidade da Profª Draª Célia Regina Nogueira, nosso muito obrigada; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro recebido ao longo deste trabalho; À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - 2011/50629-7), pelo apoio financeiro dado ao projeto; Agradeço aos docentes e funcionários do programa de pós-graduação de Fisiopatologia em Clínica Médica, por contribuírem com novos conhecimentos; A todos os meus familiares, pela torcida e carinho. A todos, o meu sincero obrigada. RESUMO ix FERREIRA, L. A. M. Potenciais microRNAs circulantes como biomarcadores de Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica: recém diagnosticada e tratada com mesilato de imatinibe. 2016. 102 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu – SP, 2016. A Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, resultado da expansão clonal de células tronco progenitoras hematopoiéticas, caracterizada pelo gene de fusão BCR-ABL1, resultado da translocação recíproca t (9;22) (q34; q11) que dá origem ao cromossomo Philadelphia (Ph). Com todo o conhecimento acumulado sobre os mecanismos de ação do BCR-ABL1 foi possível o desenvolvimento de uma droga alvo-específica muito eficiente. Porém, alguns pacientes não respondem ou desenvolvem mutações que levam a resistência ao tratamento e as células tronco leucêmicas da LMC também são resistentes ao tratamento. Tais fatores renovaram o interesse na fisiopatologia da LMC, incluindo o papel dos microRNAs (miRNAs). miRNAs são pequenos RNAs não codificantes (ncRNAs) que controlam a expressão gênica e desempenham um importante papel no desenvolvimento e progressão do câncer. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar um perfil global de expressão de miRNAs circulantes em pacientes com LMC-FC (Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica) recém diagnosticada e LMC-FC tratados com imatinibe, correlacionar o perfil de expressão de miRNAs entre os dois grupos de pacientes e, por fim, detectar redes de interação entre miRNAs e BCR-ABL1. RT-qPCR array foi utilizado para a análise de 768 miRNAs. Os resultados indicam que dos 768 miRNAs analisados, 43 miRNAs caracterizam a LMC-FC recém diagnosticada versus LMC-FC tratada com imatinibe. Destes, 39 miRNAs apresentam níveis de expressão diminuído, a saber miR-16-5p, miR-1-3p, miR-291a-3p, miR-27a-3p e 4 miRNAs apresentam níveis de expressão aumentado, a saber miR-150-5p e miR-451a, os mais significativos estatisticamente. As principais vias canônicas afetadas na LMC- FC incluem mecanismo molecular do câncer, sinalização LMC, sinalização PTEN, via TP53, via PI3K-AKT e via MAPK. As principais funções celulares e moleculares envolvidas nessa patogênese estão relacionadas à oncogênese. Os resultados até aqui obtidos nos mostram a complexidade da LMC e sugerem que esses miRNAs, que identificamos com níveis de expressão alterado, desempenham um papel central nessa neoplasia. Acreditamos que este trabalho permitirá uma melhor compreensão do comportamento molecular desta patologia e que poderá servir de base para possível monitoramento do tratamento da LMC e identificação de biomarcadores de prognóstico. Palavras-chave: Leucemia Mieloide Crônica, microRNAs, RT-qPCR array SUMMARY xi FERREIRA, L. A. M. Circulating microRNAs as potencial biomarkers Chronic Myeloid Leukemia – Chronic Phase: newly diagnosed and treated with imatinib mesylate. 2016. 102 f. Dissertation (Master) – Botucatu Medical School, São Paulo State University, Botucatu – SP, 2016. Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder, result of clonal expansion of hematopoietic stem cells progenitor, characterized by BCR-ABL1 fusion gene as a result of reciprocal translocation t (9;22) (q34;q11) called chromosome Philadelphia (Ph). With the acquired knowledge about the BCR-ABL1 action mechanisms has been possible to develop a target specific drug very efficient. However, some patients have refractoriness to treatement or develop mutations which induce drug resitence and also CML leukemia stem cells can be resistant to treatment. Such factors renewed interest in the pathophysiology of CML, including the role of microRNAs (miRNAs). miRNAs are small non-coding RNAs (ncRNAs) that control the gene expression, and play an important role in cancer development and progression. The aims of this study were to identify a global expression profile of circulating miRNAs in patients CML-CP (Chronic Myeloid Leukemia – chronic phase) newly diagnosed and CML-CP treated with imatinib, correlating the profile of miRNA expression between the two groups of patients, and finally, detect networks of interactions between miRNAs and BCR-ABL1. RT-qPCR array was used for analysis of 768 miRNAs. The results indicated that the 768 miRNAs analyzed, 43 miRNAs characterize CML-CP newly diagnosed versus CML-CP treated with imatinib. Of these, 39 miRNAs are downregulated – miR-16-5p, miR-1-3p, miR-291a-3p and miR-27a-3p – and 4 miRNAs are upregulated – miR-150- 5p and miR-451a – the most statistically significant. The main canonical pathways affected in the CML-CP include molecular mechanisms of cancer, CML signaling, PTEN signaling, TP53 signaling, PI3K-AKT and MAPK pathways. The main cellular and molecular functions involved in this pathogenesis are related to oncogenesis. The results obtained showed the complexity of CML and suggested that these miRNAs deregulated play a central role in this neoplasia. This research may allows better understanding of molecular behavior of this disease and maybe useful for possible monitoring CML treatment and prognostic biomarkers identification. Keywords: Chronic Myeloid Leukemia, microRNAs, RT-qPCR array. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xiii AGO: Argonauta ATP: Adenosina trifosfato BCR-ABL1: Breakpoint cluster region – Abelson leukaemia 1 cDNA: DNA complementar CEPHAC: Comitê de Ética em Pesquisa Hospital Amaral Carvalho CML: Chronic Myeloid Leukemia CML-CP: Chronic Myeloide Leukemia – Chronic Phase CXCR4: Chemokine receptor 4 DGCR8: DiGeorge syndrome critical region gene 8 DNA: Ácido desoxirribonucleico EGR1: Early growth response ELN: Europen LeukemiaNet EUA: Estados Unidos da América Exp5: Exportina 5 F: Feminino FAK: Focal adhesion kinase FMB: Faculdade de Medicina de Botucatu FT: Fator de transcrição HLA: Human leukocyte antigen IBB: Instituto de Biociências de Botucatu IFN-α: Interferon alfa xiv IL: Interleucina IM: Mesilato de imatinibe IPA: Ingenuity Pathway Analysis ITK: Inibidor de tirosina-quinase JAK: Janus kinase JNK: c-Jun N-terminal Kinase KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LLA: Leucemia Linfocítica Aguda LLC: Leucemia Linfocítica Crônica LMA: Leucemia Mieloide Aguda LMC: Leucemia Mieloide Crônica LMC-FC: Leucemia Mieloide Crônica – Fase Crônica M: masculino MAPK: Mitogen-activated protein kinase miRNA: microRNA miRNoma: níveis globais de expressão de miRNA mRNA: RNA mensageiro mTOR: Mammalian target of rapamycin ncRNA: RNA não codificante NF-kB: Nuclear transcription factor kappa B nt: nucleotide xv ORF: Open reading frame Ph: Philadelphia PI3K: Phosphatidylinositol-3 kinase PLZF: Promyelocytic leukaemia zinc-finger pri-miRNA: microRNA primário pré-miRNA: microRNA precursor Ran-GTP: RAS-related nuclear protein – Trifosfato de guanosina RAS: Rat sarcoma viral oncogenes homolog RCC: Remissão citogenética completa RT qPCR: Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction RICTOR: RPTOR independent complain of mTOR, complex 2 RIGH: Rede integrada de interações entre genes humanos RISC: RNA-induced silence complex RNA: Ácido ribonucleico RNase II: RNA polimerase II RNase III: RNA polimerase III RPS6KB2: ribosomal protein S6 kinase SAPK: Stress-activated protein kinase SIRT1: Silent information regulator 1 SP: São Paulo STAT: Signal transducer and activator of transcription xvi SUS: Sistema Único de Saúde TCTH: Transplante de células-tronco hematopoiéticas TF: Transcription factor TGF-β: Transforming growth factor-beta TRBP: TAR element binding protein tRNA: RNA transportador UTR: Untranslated region VEGF: Vascular endothelial growth factor LISTA DE FIGURAS xviii Figura 1 - Cromossomo Ph. ....................................................................................................................... 26 Figura 2- Localizações dos posntos de quebra nos genes ABL1 e BCR e estrutura dos mRNAs derivados das várias quebras. ..................................................................................................................................... 27 Figura 3- Vias de sinalização ativadas pela oncoproteína BCR-ABL1. .................................................... 28 Figura 4- Mecanismo de ação do IM. ........................................................................................................ 31 Figura 5- Via clássica da biogênese dos miRNAs. ..................................................................................... 33 Figura 6- Diagramas de Venn com perfil de miRNAs que caracteriza a LMC-FC recém diagnosticada versus LMC-FC tratada com IM. ............................................................................................................... 58 Figura 7- Rede de interações contendo os 29 FTs e os 18 miRNAs com expressão diminuída em pacientes com LMC-FC recém diagnosticada em comparação com pacientes com LMC-FC tratados com IM. ...... 62 Figura 8- Rede de sinalização oncogênica formada após concatenação das 29 redes do Anexo 10. ........ 63 LISTA DE TABELAS xx Tabela 1- Características dos pacientes: ........................................................ Erro! Indicador não definido. Tabela 2- Número de miRNAs com expressão alterada nos grupos analisados: ....................................... 49 Tabela 3- Resumo das análises realizadas no IPA: Pool de doadores saudáveis versus LMC-FC recém diagnosticada ............................................................................................................................................. 49 Tabela 4- Resumo das análises realizadas no IPA: Pool de doadores saudáveis versus LMC-FC tratada com IM........................................................................................................................................................ 52 Tabela 5- Resumo das análises realizadas no IPA: LMC-FC recém diagnosticada versus LMC-FC tratada com IM ........................................................................................................................................... 55 Tabela 6- Resumo das análises realizadas no IPA após construção dos Diagramas de Venn (os resultados dos miRNAs com expressão aumentada encontram-se na Tabela 5 pois são se repetem) ........ 59 Tabela 7- Vias de sinalização que estão significativamente representadas no módulo "Signaling pathways -> TFs" ....................................................................................................................................................... 64 Tabela 8- Interações metabólicas no módulo "Signaling pathways -> TFs" ............................................. 65 SUMÁRIO xxii INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 24 Leucemia Mieloide Crônica ................................................................................................ 25 MicroRNAs .......................................................................................................................... 32 MicroRNAs circulantes ....................................................................................................... 35 HIPÓTESE .............................................................................................................................. 37 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 39 Objetivo geral ...................................................................................................................... 40 Objetivos específicos........................................................................................................... 40 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 41 Pacientes e amostras ........................................................................................................... 42 Extração e purificação de RNA ........................................................................................... 42 Reação de transcrição reversa ............................................................................................ 42 qPCR array ......................................................................................................................... 43 ExpressionSuite Software V1.0.1 (ABI ® ) ............................................................................. 43 Análises de bioinformática .................................................................................................. 44 Análise estatística ................................................................................................................ 45 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 42 miRNAs diferencialmente expressos na LMC-FC recém diagnosticada ............................ 49 miRNAs diferencialmente expressos na LMC-FC tratada com IM ..................................... 52 miRNAs diferencialmente expressos na LMC-FC recém diagnosticada versus LMC-FC tratada com IM .................................................................................................................... 55 Rede de interação entre miRNAs e BCR-ABL1 ................................................................... 61 CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 48 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 70 ANEXOS ...................................................................................................................................... 71 ANEXO 1 ............................................................................................................................ 78 ANEXO 2 ............................................................................................................................ 81 ANEXO 3 ............................................................................................................................ 83 ANEXO 4 ............................................................................................................................ 84 ANEXO 5 ............................................................................................................................ 86 ANEXO 6 ............................................................................................................................ 90 ANEXO 7 ............................................................................................................................ 92 ANEXO 8 ............................................................................................................................ 97 xxiii ANEXO 9 .......................................................................................................................... 100 INTRODUÇÃO 25 Leucemia Mieloide Crônica A Leucemia Mieloide Crônica é uma doença mieloproliferativa caracterizada por uma excessiva proliferação da linhagem mieloide (INCA 2003; AYALA et al., 2016). As leucemias são neoplasias do tecido hematopoiético, resultado de uma multiplicação irregular de células leucêmicas, originadas de uma linhagem celular pluripotente, que, progressivamente substituem as células normais. São classificadas em quatro grandes grupos, dependendo do tecido atingido e da sua evolução clínica: (a) Leucemia Mieloide Aguda (LMA); (b) Leucemia Mieloide Crônica (LMC); (c) Leucemia Linfocítica Aguda (LLA); (d) Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2001). A LMC foi primeiramente descrita em 1845 por Bennett, no relato de vários casos de esplenomegalia, anemia e granulocitose maciça (BENNETT, 1845). Em 1960, Peter Nowell e David Hungerford descobriram um cromossomo de tamanho reduzido em cultura de células de sangue periférico de pacientes com leucemia granulocítica crônica. Esse cromossomo recebeu o nome de cromossomo Philadelphia (Ph) (NOWELL; HUNGERFORD, 1960). Na década de 1970, Janet Rowley demonstrou que o cromossomo Ph era resultado de uma translocação recíproca e equilibrada entre os cromossomos 9 e 22, essa anormalidade é agora designada t (9;22) (q34;q11) (ROWLEY, 1973). Mais tarde, como revisado em Chandra et al., John Groffen, Nora Heisterkamp e colaboradores, através da clonagem de DNA genômico de pacientes com LMC, identificaram quebras cromossômicas dentro de uma região limitada no cromossomo 22, que chamaram de “breakpoint cluster region” (BCR). Assim, a presença altamente especifica do ponto de quebra cromossômica BCR em pacientes com LMC Ph-positivo sugeriu fortemente o envolvimento deste gene na leucemia. O gene ABL1 (Abelson leukaemia 1) foi encontrado junto ao BCR como resultado da formação t (9;22) (CHANDRA et al., 2011). Dois genes de fusão são gerados: BCR-ABL1 codificando uma proteína tirosina-quinase constitutivamente ativa (Figura 1) (CHAUFFAILLE et al., 2015). A identificação desta anomalia é de extrema importância para o diagnóstico da doença e para fins de tratamento. 26 Figura 1 - Cromossomo Ph. Há translocação de parte do braço longo do cromossomo 22 para o braço longo do cromossomo 9 e translocação recíproca de parte do braço longo do cromossomo 9 para o cromossomo 22 (cromossomo Ph). Um segmento do gene ABL1 do cromossomo 9 transloca e se funde com a porção remanescente do gene BCR no cromossomo 22, resultando em um gene de fusão: BCR-ABL1. O neogene codifica uma oncoproteína de mesmo nome, BCR-ABL1, que possui elevada atividade tirosina-quinase. A atividade exacerbada dessa oncoproteína é a responsável pela oncogênese inicial na LMC FONTE: Adaptado de Hoffbrand e Moss (2013). A incidência da LMC é de 1 a 2 casos para cada 100.000 habitantes/ano, é uma neoplasia mieloproliferativa que responde por 15 a 20% de todos os casos de leucemia em adultos. A mediana de idade ao diagnóstica é de 55 a 60 anos, com menos de 10% dos casos em pacientes com menos de 20 anos (TEFFERI et al., 2005). Embora a maioria dos pacientes com LMC apresentem a translocação clássica t (9;22) (q34;q11.2), translocações variantes no cromossomo Ph estão presentes em 5 a 10% dos casos de LMC. Estas são citogeneticamente classificadas como variantes simples envolvendo o cromossomo 22 e outro cromossomo que não o 9, e variantes complexas envolvendo os cromossomos 9, 22 e mais um ou outros cromossomos (VALENCIA, 2009). A incidência de translocações Ph variantes em pacientes Brasileiros é semelhante à de outras populações. O ponto de interrupção 17q21 é o mais frequente e repetido, sendo esta região a mais provável de estar relacionada em translocações Ph variantes (CHAUFFAILLE et al., 2015). 27 A proteína de fusão codificada pelo gene BCR-ABL1varia em tamanho, dependendo do ponto de quebra no BCR-ABL1. Três regiões de quebra estão caracterizadas: maior (M-bcr), menor (m-bcr) e micro (µ-bcr) (Figura 2). A grande maioria dos pacientes com LMC possuem um gene BCR-ABL1 p210 (M-bcr), cujos transcritos de mRNA possuem as junções b3a2 e/ou b2a2. A menor das proteínas de fusão, p190 BCR-ABL1 , (m-bcr) está principalmente associada à LLA Ph positivo e raros são os casos de LMC devido a esse tipo de quebra. A LMC resultante do gene BCR- ABL1 p230 (µ-bcr) também é rara (MELO 1997). Figura 2- Localizações dos posntos de quebra nos genes ABL1 e BCR e estrutura dos mRNAs derivados das várias quebras. Os éxons estão representados por caixas e os introns por linhas horizontais. Regiões de quebra no gene ABL1 estão ilustradas por setas verticais e as regiões de quebra no BCR, pelas três setas horizontais de duas pontas. A metade inferior da figura mostra a estrutura dos diferentes mRNAs trancritos do BCR- ABL1, que são formados de acordo com a posição do ponto de quebra no BCR. FONTE: Deininger et al., 2000. A atividade exacerbada da BCR-ABL1 substitui a função normal da enzima ABL1 interagindo com uma variedade de proteínas efetoras, como: GRB-2, CBL, SHC, CRKL, ativando RAS (rat sarcoma viral oncogenes homolog), a via JAK (Janus kinase)-STAT (signal transducer and activator of transcription), PI3K (phosphatidylinositol-3 kinase)-AKT; NF-kB (nuclear transcription factor kappa B) e FAK (focal adhesion kinase) (Figura 3) (SANTOS; FERREIRA, 2006). 28 Figura 3- Vias de sinalização ativadas pela oncoproteína BCR-ABL1. A BCR-ABL1 ativa vias de sinalização intracelulares que promovem a proliferação e instabilidade genômica, enquanto suprime sinais de apoptose e enfraquece a adesão celular. As vias de sinalização que são conhecidamente ativadas pela oncoproteína BCR-ABL1 são: RAS (rat sarcoma viral oncogenes homolog), MAPK (mitogen-activated protein kinase), JNK/SAPK (c-Jun NH2-terminal kinase/stress- activated protein kinase), PI3K (phosphotidylinositol 3-kinase), NF-kB (Nuclear transcription factor kappa B), CRK oncogene-like protein/FAK (focal adhesion kinase) e STAT (signal transducer and activator of transcription). NOTA: A fosforilação é representada pela letra P dentro do círculo vermelho; setas indicam a ativação da molécula downstream e a barra no fim da linha uma inibição da molécula downstream. FONTE: Adaptado de Ahmed e Van Etten (2013) A ativação dessas vias de sinalização faz com que ocorra a desregulação de processos celulares, tais como: proliferação, diferenciação, reparo do DNA (ácido desoxirribonucleico), diminuição da adesão das células leucêmicas ao estroma da medula óssea e redução da resposta apoptótica ao estímulo mutagênico, acarretando uma proliferação clonal descontrolada (SANTOS; FERREIRA, 2006). Embora a doença esteja relacionada à presença de uma única alteração gênica, o quadro clínico é heterogêneo, tanto na apresentação clínica quanto na evolução. Classicamente, a doença evolui em três fases: crônica, acelerada e crise blástica. No início da fase crônica, alguns pacientes são assintomáticos, mas outros apresentam fadiga, fraqueza, dores de cabeça, irritabilidade, febre, suor noturno e perda de peso (BORTOLHEIRO; CHIATTONE, 2008). 29 O diagnóstico é realizado pelos achados clínicos, citogenéticos e hematológicos do sangue periférico e medula óssea (INCA, 2003). A fase acelerada surge após um período variável do diagnóstico, de poucos meses a vários anos e caracteriza-se pelo aumento de blastos na medula óssea e no sangue periférico, leucocitose e basofilia no sangue periférico, anemia e trombocitopenia (BORTOLHEIRO; CHIATTONE, 2008). Posteriormente, a doença evolui para a fase blástica, definida hematologicamente pelo aumento de blastos leucêmicos no sangue periférico e/ou medula óssea (mais de 20%). Nesse estágio da doença, muitos pacientes evoluem para óbito entre três e seis meses. A progressão para a fase acelerada e blástica parece estar associada, principalmente, à instabilidade genômica, o que predispõe ao aparecimento de outras anormalidades moleculares (BORTOLHEIRO; CHIATTONE, 2008). Mutações em genes além do BCR-ABL1 incluem ASXL1, TET2, RUNX1, DNMT3A, EZH2 e TP53 em paciente em fase crônica e mutações RUNX1, ASXL1, IKZF1, WT1, TET2, NPM1, IDH1, IDH2, NRAS, KRAS, CBL, TP53, CDKN2A, RB1 e GATA-2 em pacientes em fase avançada. Este último grupo de pacientes também podem apresentar anomalias citogenéticas adicionais, incluindo perdas ou ganhos de regiões submicroscópicas que apenas array de polimorfismo de nucleotídeo único e array de hibridização genômica comparativa podem detectar (SOVERINI et al., 2015). Desta forma, a descoberta do cromossomo Ph, posterior identificação do gene BCR-ABL1 e demais estudos sobre a LMC permitiram uma melhor compreensão da biologia da doença, desenvolvimento de drogas alvo-específicas e métodos moleculares para seu monitoramento. Para o tratamento da LMC, as terapias utilizadas incluem: mesilato de imatinibe (Gleevec), inferteron alfa (Roferon ® , Intron-A ® ) – que pode estar associado à Citarabina (Aracytin ® ) em baixa dose, hidroxiureia (Hydrea ® ) e transplante de células- tronco hematopoéticas (TCTH) (INCA 2003). O tratamento com hidroxiureia é considerado paliativo, pois promove rápida resposta clínica e hematológica (ZAGO et al., 2001). O uso do interferon está associado a efeitos colaterais semelhantes aos da gripe. No entanto, como revisado em Dobbin e Gadelha, em alguns pacientes esse medicamento apresenta uma toxicidade muito alta e precisam de alterações na 30 abordagem terapêutica (DOBBIN; GADELHA, 2002). Uma possibilidade de cura para a LMC é o TCTH alogênico, porém está associado ao aumento da mortalidade e da morbidade, devido à intercorrências nos períodos pré e pós-transplante, como: doença enxerto contra o hospedeiro, imunossupressão e toxicidade de múltiplos órgãos (KANTARJIAN et al., 1998; FADERL et al., 1999; ALVARENGA et al., 2010). Outro fator que também limita a realização do transplante é a dificuldade em encontrar doador histocompatível. Entre irmãos do mesmo pai e da mesma mãe, a chance de encontrar um irmão HLA (human leukocyte antigen)-idêntico é de 25%. As chances serão maiores quanto maior o número de irmãos. O grande problema é que, aproximadamente, 60% dos pacientes não encontram doador na família e precisam buscar um doador compatível voluntário cadastrado no centro de registros de doadores de medula óssea (DOBBIN; GADELHA, 2002). A chance de cura pós TCTH é de aproximadamente 65%, podendo atingir uma taxa de sobrevida de 70% em dez anos. Porém, essas taxas podem variar dependendo da idade do paciente, compatibilidade com o doador, combinação de sexo, tempo entre o diagnóstico e o transplante e a fase em que a doença se encontra. Apesar do seu poder de cura, somente 15-30% dos pacientes serão candidatos ao transplante, tendo como principais limitantes a idade a indisponibilidade de doador compatível. Além disso, as taxas de recidiva após TCTH variam de 5-30% na fase crônica, podendo chegar a 60% nas fases acelerada e blástica (PALLOTTA et al., 2006). Com todo o conhecimento sobre o mecanismo de ação da BCR-ABL1 foi possível, no início dos anos 90, identificar compostos inibidores da atividade de proteínas quinases. Dentre eles, o STI-571 (Mesilato de imatinibe; Gleevec; Novartis Pharmaceutics, East Hanover, NJ) mostrou ser um inibidor específico das tirosino- quinases ABL1, mudando o paradigma no tratamento onocológico e iniciando a era da “terapia alvo-específica” (DOBBIN; GADELHA, 2002). Inibidor seletivo da enzima tirosina-quinase ABL1, o mesilato de imatinibe (IM) (2-fenil-amino-pirimidina) atua na porção efetora da oncoproteína BCR-ABL1. Liga-se no mesmo sítio ao qual o ATP se ligaria na proteína BCR-ABL1, assim ocorre a 31 interrupção dos sinais oncogenéticos para o núcleo da célula, reduzindo a proliferação celular e induzindo os mecanismos apoptóticos (Figura 4) (JABBOUR et al., 2009; HUGHES et al., 2009; KANTARJIAN et al., 2012). O IM é utilizado como primeira linha de tratamento em pacientes com LMC recém-diagnosticados (MANLEY et al., 2005; SCHOLL et al., 2012) e disponibilizado pelo SUS (Sistema Único de Saúde). Embora não seja capaz de curar a doença, uma revisão feita por Goldman e Melo indica que o IM pode induzir remissão citogenética completa (RCC) ou quase completa em até 80% dos pacientes (GOLDMAN; MELO, 2003). Figura 4- Mecanismo de ação do IM. A figura da esquerda mostra a molécula de ATP ligada à proteína BCR-ABL1 e a consequente fosforilação dos resíduos de tirosina do substrato que, quando fosforilado, ativa outras moléculas efetoras. A figura da direita mostra que, quando o IM (STI571) ocupa o sítio de ligação do ATP, a fosforilação do substrato é impedida. FONTE: Adaptado de Goldman e Melo (2001) Apesar do sucesso da terapia com IM, a persistência do gene BCR-ABL1 em pacientes que atingiram resposta citogenética, o desenvolvimento de mutações no domínio quinase BCR-ABL1 conferindo resistência ao tratamento (WANG et al., 2007) e o reconhecimento de que as células-tronco leucêmicas da LMC são resistentes ao tratamento com inibidor tirosina-quinase (ITK) (PEREZ et al, 2008) renovaram, como revisado em Gordon et al., o interesse na fisiopatologia da LMC, incluindo o papel dos microRNAs (miRNAs) (GORDON et al., 2013). 32 MicroRNAs Os miRNAs foram descobertos em 1993 quando um grupo de pesquisadores estudava o gene lin-4 em Caenorhabditis elegans. O gene lin-4 é essencial para o controle temporal normal de diversos eventos pós-embrionários do desenvolvimento de C. elegans. Pesquisadores observaram que lin-4 produz um par de pequenos RNAs e também notaram que o RNA lin-4 tem complementariedade antissenso para vários locais na região 3’UTR (untranslated region) do gene lin-4, o que sugeriu um mecanismo de regulação antissenso (LEE et al., 1993). Descobriu-se que o RNA antissenso lin-4 é um regulador temporal que controla as fases de desenvolvimento de C. elegans, inibindo a tradução do mRNA alvo, propondo uma nova classe de pequenos RNAs (miRNAs) que é evolutivamente antiga (LEE; AMBROS, 2001). O marco da descoberta dessa nova classe de pequenos RNAs sugeriu um novo mecanismo de regulação gênica. Hoje, sabe-se que os miRNAs são uma família de RNA não codificante (ncRNA) envolvidos no controle de diferentes processos biológicos e patológicos, tais como desenvolvimento, proliferação, diferenciação e morte celular programada e resposta ao estresse (XUE et al., 2014). Essas pequenas moléculas possuem ~22 nucleotídeos, são tipicamente processados a partir de estruturas precursoras de RNA com ~70 nucleotídeos de comprimento (CALIN; CROCE, 2006). A via de biogênese clássica dos miRNAs encontra-se na Figura 5. 33 Figura 5- Via clássica da biogênese dos miRNAs. No núcleo, a RNA polimerase II (RNase II) transcreve o gene do miRNA, gerando uma longa sequência, o miRNA primário (pri-miRNA). O pri-miRNA dobra-se em estrutura de hairpin e, ainda no núcleo, é clivado pela RNase III (RNA polimerase III) Drosha e seu co-fator DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region 8), liberando estruturas stem-loop com ~70 nucleotídeos chamadas de miRNA precursor (pré- miRNA). O pré-miRNA é transportado rapidamente para o citoplasma pela Exportina-5 (Exp5), uma proteína de exportação nuclear que utiliza Ran-GTP como co-fator. No citoplasma, o pré-miRNA é clivado pela RNase III Dicer (complexada com a proteína TRBP), dando origem a um miRNA dupla fita com aproximadamente 22 nucleotídeos. Em seguida, o duplex de miRNA é separado e o RNA maduro pode ser carregado no complexo de silenciamento RISC (RNA-induced silence complex) juntamente com seu mRNA-alvo, levando ao silenciamento gênico pós-transcricional. FONTE: Adaptado de Xue (2014) A revisão de Cheng mostra que além da via clássica de biogênese dos miRNAs, mencionada na Figura 5, alguns miRNAs também são processados de uma maneira Drosha ou Dicer independente. Por exemplo, os mirtrons são gerados a partir do splicing e não passam pela clivagem de Drosha. Drosha pode ser substituída por outras RNases, como a RNase Z ou o complexo integrador, durante a biogênese do miRNA. O miR-451 utiliza a Argonauta 2 (ago2) para realizar funções de clivagem ao invés da Dicer e alguns miRNAs podem ser derivados da via tRNA (CHENG, 2015). Muitas pesquisas tem revelado a diversidade e flexibilidade da biogênese de miRNAs em células de mamíferos. 34 Os miRNAs são considerados um dos principais mecanismos de regulação gênica (TÉTREAULT; DE GUIRE, 2013). De modo geral, diminuem pós- transcricionalmente a expressão gênica pela inibição da tradução dependente de ribossomo e/ou desestabilizando mRNAs de genes alvos (XUE et al., 2014). Normalmente, miRNAs maduros reconhecem seus genes alvos através da complementariedade de sequência na região 3’UTR do mRNA para a região semente do miRNA (nucleotídeos 2-7). Contudo, sítios alvos para miRNA endógenos podem ser identificados em ORFs (open reading frame) e regiões 5’UTR, sendo menos frequentes e menos eficazes que as 3’UTR (LYTLE et al., 2007). As regras que regem a interação de miRNAs com seus mRNAs alvo são bastantes complexas. Lewis et al. introduziram o princípio de sequência semente de miRNAs, demonstrando, que na maioria das vezes, miRNAs ligam-se a seus alvos entre seus 2nt (nucleotídeo) e 8 nt da sua extremidade 5’, sendo esta a sequência semente (LEWIS et al., 2005). Embora a interação entre as sequências que não correspondem a sequência semente e o mRNA alvo sejam necessárias, a complementaridade perfeita não é essencial (TÉTREAULT; DE GUIRE, 2013). Por modularem uma ampla e complexa rede regulatória da expressão gênica, os miRNAs representam uma das áreas mais estimulantes da biologia molecular (FILIPOWICZ et al., 2008; OLIVEIRA- CARVALHO et al., 2012). 35 MicroRNAs circulantes Os miRNAs desempenham papéis críticos na tumorigênese e progressão do câncer através da modulação da iniciação do tumor, crescimento, metástase e resistência terapêutica (XUE et al., 2014). O envolvimento dos miRNAs na iniciação e progressão do câncer foi relatado pela primeira vez na LLC, em um estudo com o intuito de identificar os supressores tumorais na região 13q14, que está frequentemente suprimida nesse câncer. Foi observada uma expressão diminuída dos miR-15a e miR-16-1 na LLC, sugerindo que a perda desses dois miRNAs está entre os eventos iniciadores da patogênese dessa doença (CALIN et al., 2002). Os miRNAs estão presentes em fluidos biológicos, tais como: sangue, saliva, lágrimas, urina, liquido amniótico, colostro, leite materno, secreções brônquicas, fluido cerebroespinhal, fluido peritoneal, fluido pleural e fluido seminal (WEBER et al., 2010). A estabilidade de miRNAs em fluidos biológicos, como soro e plasma, é o principal fator que contribui para sua utilização como potenciais biomarcadores de câncer, como revisado em Ardila-Molano, 2015. Como a revisão de O’Connell e Baltimore indica, os miRNAs regulam a hematopoiese tanto em células estaminais hematopoiéticas quanto em células progenitoras comprometidas. Essas pequenas moléculas de ncRNA também estão envolvidas na patogênese de algumas neoplasias hematológicas adquiridas, por isso a expressão anormal de miRNAs tem sido documentada em múltiplas malignidades hematológicas (O’CONNELL; BALTIMORE, 2012). Recentemente, um crescente número de evidências tem descrito miRNAs específicos na patogênese da leucemia e miRNAs circulantes poderiam ser úteis como biomarcadores não invasivos para a detecção da leucemia no momento do diagnóstico e prognóstico (TOMBAK et al., 2015). Os miRNAs circulantes, assim como os hormônios, podem regular a expressão de genes alvo em células receptoras. Conhecimentos acumulados sobre sua liberação, empacotamento e absorção são fundamentais na elucidação de suas funções reguladoras, como indica a revisão de Cheng, 2015. Esta revisão também sugere que miRNAs circulantes podem, de certa forma, submeter-se a empacotamento seletivo e 36 lançamento, e podem até mesmo ser, preferencialmente, secretados em células associadas com condições patológicas específicas. No entanto, os mecanismos envolvidos em tais processos não foram completamente compreendidos. O perfil do miRNoma (níveis globais de expressão de miRNA) tem se tornado prevalente e dados abundantes de miRNoma estão disponíveis para vários tipos de câncer. O padrão de expressão de miRNAs pode ser correlacionado com o tipo de câncer, fase e outras variáveis clínicas, desta forma um perfil de miRNAs pode ser utilizado como ferramenta para o diagnóstico e prognóstico de câncer, como revisado em Lee & Dutta, 2009. Assim, análises de expressão de miRNAs sugerem seu papel como oncogenes ou supressores tumorais, dependendo do seu local de atuação. Por estarem envolvidos em quase todos os aspectos da biologia do câncer, esperamos, com este estudo, identificar miRNAs envolvidos nas alterações celulares e moleculares que ocorrem na LMC-FC. CONCLUSÕES 69 Existe um perfil de miRNAs circulantes que caracteriza os pacientes com LMC-FC recém diagnosticada e tratados com IM, nas vias de mecanismo molecular do câncer, sinalização LMC, sinalização PTEN, via p53, via PI3K-AKT e via MAPK. As principais funções celulares e moleculares envolvidas nessa patogênese estão relacionadas à tumorigênese e compreendem crescimento, desenvolvimento e proliferação, sobrevivência e morte celular e ciclo celular. Os resultados mostram como os sinais oncogênicos enviados pelo BCR- ABL1 influenciam a expressão dos miRNAs com expressão desregulada. A rede de sinalização oncogênica, criada a partir de interações entre miRNAs e FTs, contem 446 genes e 4712 interações direcionadas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71 ACENCIO, M. L. et al. 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