UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU RELAÇÃO DA INCIDÊNCIA DE MASTITE, MORFOMETRIA DA GLÂNDULA MAMÁRIA E PRODUÇÃO DE LEITE EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS DE ALTA E BAIXA LIBERAÇÃO DE CORTISOL RODRIGO MARTINS DE SOUZA EMEDIATO Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Zootecnia BOTUCATU - SP Agosto - 2015 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU RELAÇÃO DA INCIDÊNCIA DE MASTITE, MORFOMETRIA DA GLÂNDULA MAMÁRIA E PRODUÇÃO DE LEITE EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS DE ALTA E BAIXA LIBERAÇÃO DE CORTISOL RODRIGO MARTINS DE SOUZA EMEDIATO Zootecnista ORIENTADOR: PROF. DR. RICARDO DE OLIVEIRA ORSI Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Zootecnia BOTUCATU - SP Agosto – 2015 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Emediato, Rodrigo Martins de Souza , 1979- E53r Relação da incidência de mastite, morfometria da glându- la mamária e produção de leite em ovelhas da raça Santa Inês de alta e baixa liberação de cortisol / Rodrigo Martins de Souza Emediato. – Botucatu : [s.n.], 2015 iv, 73 f.: grafs., tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Fa- culdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2015 Orientador : Ricardo De Oliveira Orsi Inclui bibliografia 1. Ovelha. 2. Mastite. 3. Glândulas mamarias. 3. Hormo- nios. 4. Leite – Produção. I. Orsi, Ricardo de Oliveira. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de Medicina Veteri- nária e Zootecnia. III. Título. i DEDICO À pessoa que com seu amor incondicional, soube me compreender e ter muita paciência comigo durante todos estes anos... Que no meio deste processo todo, tornou-se minha esposa amada e carinhosa, que me apoiou de forma irrestrita durante todo esse tempo... Carolina, obrigado pela parceria, companheirismo, amor e amizade! Esta tese é nossa!!! À minha mãe Sylvia, meu pai Luiz Fernando, pelo incentivo e carinho e por me ensinarem o valor do estudo e do comprometimento. Aos meus irmãos Fernanda e Alexandre, pela amizade e apoio. Às minhas queridas e amadas cachorrinhas, que não conseguiram chegar até o final ao meu lado, Milka e Nathaly, mas que com um amor incrível e incondicional, me incentivavam e acolhiam ao menor sinal de desânimo. ii “Não culpe ninguém! Não espere nada! Faça alguma coisa! Isso mesmo. A responsabilidade é totalmente sua. A partir de agora você está condenado à liberdade de escolhas. Então, vá em frente. Esse pode ser o primeiro passo para a sua grande virada profissional" Bill Parcells "As dificuldades são o aço estrutural que entra na construção do carácter” Carlos Drummond de Andrade "A aprendizagem não ocorre quando se tem todas as respostas, mas quando se convive com as perguntas" Max Dupree "Você pode encarar um erro como uma besteira a ser esquecida, ou um resultado que aponta uma nova direção." Steve Jobs “Não é o mais forte nem o mais inteligente que sobrevive, é o mais adaptado à mudanças” Charles Darwin iii AGRADECIMENTOS Primeiramente, ao meu professor, amigo e orientador Edson Ramos de Siqueira, por me receber de braços abertos em um momento de tantas incertezas, pelo qual passei. Pelas palavras serenas e sinceras, pelos conselhos e direcionamentos. À querida amiga Simone Fernandes, pelo apoio, direcionamento e compreensão, pelas correções iniciais, pela amizade e confiança. Ao amigo e orientador Ricardo Orsi, por me ajudar em diversos momentos deste doutorado, pela compreensão e paciência comigo nos momentos mais difíceis pelos quais passei e pela confiança em mim depositada. Aos queridos amigos Hélio e Carol, pelas hospedagens, conversas, conselhos e incentivo, apoio, momentos de descontração e etc, etc, etc!!! para que eu fosse até o final. À Sirlei Maestá, pelo apoio e sugestões, quando esta pesquisa era apenas um embrião lá no comecinho desta história, pela amizade e ajuda nas correções. Aos meus amigos de SP, Rodolfo, Rejane, Déborah, Daniel Balabanian, Janaina, Bruno, Mayara e Rainier pela força e apoio, não me deixando desanimar, nem desistir. Aos meus sogros queridos Fernando e Nilza, pelo acolhimento, conselhos, palavras de carinho e incentivo em todos os momentos, principalmente os de incerteza. À D. Dirce e D. Irene, minhas vizinhas e parceiras queridas, que fizeram a vez de minhas avós, cuidando de mim e de minhas cachorras sempre que foi preciso! Aos amigos produtores Ricardo Negrini e Martha, pelos momentos de descontração, longas conversas e pela receptividade única no sitio em Cunha/SP. À Tortuga Cia Zootécnica agrária, por permitir que mesmo a trabalho, pudesse participar ativamente do meu experimento. À equipe da pós graduação, pelas informações precisas e ajuda com a burocracia. Aos funcionários do Departamento de Produção Animal pelo companheirismo e agradável convivência. À todos os estagiários e amigos que ajudaram na realização do experimento. E às ovelhas que sem elas, nada disso seria possível! iv SUMÁRIO Página CAPITULO 1 ................................................................................................................. 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS........................................................................................ 2 1. RAÇA SANTA INÊS .............................................................................................. 3 2. DESEMPENHO DE OVELHAS E CORDEIROS ................................................... 4 3. QUALIDADE DO LEITE ........................................................................................ 6 4. MASTITE .............................................................................................................. 7 5. MORFOMETRIA DA GLÂNDULA MAMÁRIA ...................................................... 12 6. CORTISOL ......................................................................................................... 16 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 20 CAPITULO 2 ............................................................................................................... 34 Resumo .................................................................................................................. 35 Abstract .................................................................................................................. 35 Introdução ............................................................................................................... 36 Material e Métodos ................................................................................................. 37 Resultados e Discussão.......................................................................................... 40 Conclusões ............................................................................................................. 47 Referências Bibliográficas ....................................................................................... 48 CAPITULO 3 ............................................................................................................... 52 Resumo .................................................................................................................. 53 Abstract .................................................................................................................. 53 Introdução ............................................................................................................... 54 Material e Métodos ................................................................................................. 56 Resultados e Discussão.......................................................................................... 58 Conclusões ............................................................................................................. 67 Referências bibliográficas ....................................................................................... 67 CAPITULO 4 ............................................................................................................... 72 IMPLICAÇÕES ....................................................................................................... 73 1 CAPITULO 1 2 CONSIDERAÇÕES INICIAIS Segundo dados da FAOSTAT (2013), o Brasil possui um rebanho de aproximadamente 17,02 milhões de ovinos, produzindo cerca de 85 mil toneladas de carne por ano. Levantamentos anteriores da mesma instituição mostram aumento de cerca de 16,8% no rebanho e de 23,9% na produção de carne ovina nos últimos 10 anos. De acordo com o último levantamento de produção pecuária do IBGE (2012), o Nordeste possui 55,5% do rebanho nacional, seguido da região Sul (30,0%), Centro- Oeste (6,4%), Sudeste (4,4%) e Norte (3,6%), sendo que no período de 2002 a 2012 ocorreu grande crescimento dos rebanhos ovinos nas regiões Norte (63,0%), Sudeste (62,8%) e Centro-Oeste (43,2%). Estes dados indicam que a ovinocultura brasileira tem mostrado sinais de amadurecimento nos últimos 15 anos, tornando-se uma atividade interessante economicamente para a produção de carne. O forte crescimento do rebanho ovino em algumas regiões do Brasil foi viabilizado e sustentado pela raça Santa Inês, originária da região nordeste e adaptada aos diversos climas brasileiros (MALHADO et al., 2009), em razão de sua maior rusticidade, prolificidade e menor sazonalidade reprodutiva. Quando comparada a outras raças especializadas em produção de carne, é frequentemente utilizada como raça materna em rebanhos de corte (COSTA, 2003). Enquanto países tradicionais na ovinocultura buscam formas de diminuir a taxa de descarte por problemas relacionados à saúde do úbere em rebanhos leiteiros (BARILLET, 2007; CONINGTON et al., 2008; DOGRUER et al., 2010), no Brasil os mesmos problemas são enfrentados em rebanhos de corte com a raça Santa Inês (BOLSANELLO et al., 2009; FERNANDES et al, 2013). Devido ao momento favorável que a ovinocultura de corte passa no Brasil, fortalecida também com a criação da Câmara Setorial de Caprinos e Ovinos da Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo, desde 2007, e com a atuação das associações de criadores de ovinos em todo país, a grande maioria das pesquisas está focada na produção e qualidade da carne, sistemas de produção e cruzamentos. Poucos são os estudos realizados sobre as causas da grande incidência de mastite e sua relação com a conformação de úbere e qualidade do leite de ovelhas para produção de carne. 3 1. RAÇA SANTA INÊS Influenciada pelos espanhóis, a ovinocultura no Brasil iniciou-se profissionalmente na região Sul com a criação de animais especializados em produção de lã até a crise do setor na década de 90 (FERREIRA, 2009), quando o mercado ovino foi direcionado para a produção de carne de cordeiro, crescendo a cada ano e concentrando os rebanhos comerciais em regiões tradicionais da pecuária bovina (IBGE, 2012) e consumidora desta carne, considerada nobre e de alto valor agregado. Assim, o interesse por raças deslanadas e adaptadas aumentou em todo país, especialmente nas regiões Sudeste e Centro-Oeste (MORAIS, 2002; MARTINS et al., 2006), resultando na difusão destas raças em todas as regiões do Brasil (FERREIRA, 2009). Desta forma, a raça Santa Inês tornou-se popular em todos os estados brasileiros, principalmente devido aos bons índices de fecundidade, prolificidade, baixa estacionalidade reprodutiva, boa habilidade materna e potencial de produção de leite, quando criada sob adequadas instalações e sistemas de produção (SILVA et al., 2012). A raça Santa Inês é nativa da região Nordeste do Brasil, formada pelo cruzamento das raças Morada Nova, Bergamácia e Somalis, além de ovinos sem raça definida (SRD) existentes na região (CARVALHO et al., 2001) e sofreu seleção natural ao longo de décadas. A população desta raça cresceu rapidamente, especialmente devido aos produtores de animais para exposição, onde nestes rebanhos, a escolha dos indivíduos superiores foi enfatizada pelas características de conformação e peso, que elevaram o tamanho dos animais adultos (SILVA, et al., 2012). Atualmente ela é considerada uma das raças mais importantes do Brasil e é a base da maior parte dos rebanhos comerciais (ASCARI et al., 2013) Segundo a definição da Associação Brasileira de Criadores de Ovinos (ARCO, 2014) a raça Santa Inês é representada por animais deslanados, com pelos curtos e sedosos, de grande porte, com machos pesando em média de 80 a 120 kg e as fêmeas de 60 a 90 kg. Apresentam excelente qualidade de carne e baixo teor de gordura, pele de altíssima qualidade, rústicos e precoces, com fêmeas prolíferas e de boa habilidade materna, são adaptáveis a qualquer sistema de criação e pastagem e às mais diversas regiões do país. A presença da raça Bergamácia na composição racial tornou as ovelhas da raça Santa Inês boas produtoras de leite para uma raça de corte, revelando-se excelentes mães, capazes de desmamar cordeiros saudáveis e com bom peso (FERNANDES et al., 2013). Apesar da influência de uma raça europeia (Bergamácia), a Santa Inês 4 manteve a característica de rusticidade herdada da raça Morada Nova, adaptando-se bem ao manejo extensivo, com boa produtividade (CARVALHO et al., 2001), por isso, é comum o uso desta raça em cruzamentos com raças exóticas especializadas na produção de carne (SOUZA, et al., 2013) 2. DESEMPENHO DE OVELHAS E CORDEIROS A lactação é o período de maior exigência nutricional de ovelhas em produção (SNOWDER & GLIMP, 1991) e a perda de peso, durante este período é explicado pelo aumento da produção de leite e gordura (WILDE et al., 1989; BARNES et al., 1990). Silva Sobrinho et al. (1996) afirmaram que as ovelhas normalmente perdem peso durante o início da lactação e a amplitude desta perda varia de acordo com a quantidade e qualidade de alimento disponível, do número de cordeiros amamentados, de fatores ambientais e do potencial produtivo da ovelha. A perda de peso das ovelhas durante as primeiras semanas pós parto depende também da persistência da lactação e a relação entre a taxa de crescimento de cordeiros e a produção de leite é mais evidente do nascimento à 4ª semana de idade (TORRES-HERNANDEZ & HOHENBOKEN, 1980). Os cordeiros recém-nascidos apresentam o sistema imunológico pouco desenvolvido e possuem pequena reserva energética para a produção de calor e metabolismo, sendo dependentes do colostro para o fornecimento de imunoglobulinas e energia (O’DOHERTY & CROSBY, 1997). Assim, a ingestão de nutrientes via colostro é importante para a produção inicial de calor, pois as reservas dos cordeiros são esgotadas rapidamente após o seu nascimento (DWYER & MORGAN, 2006). A sobrevivência dos cordeiros e sua taxa de crescimento até a desmama é reflexo da habilidade de produção de leite das ovelhas (SNOWDER & GLIMP, 1991). Dentro do sistema de produção de carne ovina, o leite da ovelha possui papel fundamental, tendo a principal função de nutrir os cordeiros durante as primeiras semanas de vida, período em que são totalmente dependentes do leite materno (FERREIRA, 2005). A habilidade materna é muito importante para toda a cadeia produtiva de carne ovina, pois o crescimento adequado dos cordeiros até a desmama é diretamente influenciado pela produção de leite das ovelhas (GODFREY et al., 1997). A quantidade adequada de leite produzido pela ovelha é dependente da alimentação na época do aleitamento, que pode aumentar a taxa de crescimento dos 5 cordeiros, reduzir a mortalidade e evitar restrições na produção futura destes animais (SILVA SOBRINHO, 2001). O consumo de leite pelos cordeiros influencia diretamente o seu crescimento durante as primeiras três a quatro semanas de vida (RAMSEY et al., 1994). Após o pico de lactação, para compensar a diminuição da ingestão de leite há aumento no consumo de alimentos sólidos pelos cordeiros (PEART, 1982). Snowder & Glimp (1991) verificaram maior coeficiente de correlação para crescimento de cordeiros no período pré-desmama com produção de leite das ovelhas decrescente ao longo da lactação, sendo maior no seu início (r=0,7) e menor no final (r=0,2), o que pode ser esperado devido à diminuição natural da dependência do cordeiro do leite em função do aumento do consumo de volumoso e/ou concentrado. Segundo os mesmos autores, essa correlação é maior entre os cordeiros de parto simples do que para os gêmeos, tanto no início da lactação (0,75 vs 0,60, respectivamente) quanto na desmama (0,30 vs 0,15, respectivamente). O cordeiro é a categoria animal que apresenta a maior eficiência de produção, devido a sua elevada taxa de crescimento (WOMMER, 2010). Entretanto, de acordo com Pires et al. (2000) a taxa de ganho de peso do cordeiro do nascimento à desmama não é sustentado do período pós-desmama até o abate. A produção de leite de ovelhas multíparas saudáveis é adequada para as exigências de manutenção e crescimento de cordeiros gêmeos e de parto simples até a 4ª semana de vida (SNOWDER & GLIMP, 1991). Segundo Pires et al. (2000) o peso ao nascer dos cordeiros está diretamente relacionado com fatores de ordem genética e da nutrição da ovelha gestante, enquanto que o peso à desmama depende, principalmente, da produção de leite da ovelha e da disponibilidade de alimentos sólidos ao cordeiro. Ovelhas que amamentaram gêmeos produziram mais leite do que as que criaram apenas um cordeiro, sendo que no período de 28 a 56 dias de lactação, as mães de gêmeos produziram 23 a 58% mais leite e aos 70 a 98 dias de lactação a diferença foi ainda maior, variando de 71 a 149% em relação as ovelhas de parto simples (SNOWDER & GLIMP, 1991). Ao estudarem o desempenho de cordeiros de parto simples e gemelar, Guerson et al. (2008) concluíram que os cordeiros gêmeos foram em média 12,5% mais leves em todas as idades estudadas, desde o nascimento até os 180 dias, e que em relação ao ganho de peso médio diário, cordeiros de parto simples tiveram melhor desempenho (20,0% maior ganho de peso 6 diário) apenas do nascimento à desmama, sendo 12,3% inferior da desmama aos 180 com relação aos cordeiros gêmeos. Torres-Hernandez & Hohenboken (1980) observaram que cordeiros únicos ganharam mais peso (27,2 kg) durante o período de amamentação do que cordeiros gêmeos (23,2 kg), porém nestes, o ganho total por prole foi maior (46,4 kg) que em cordeiros de parto simples. Já Carneiro et al. (2004) ao avaliarem o desempenho de cordeiros de parto simples e duplo, encontraram maior ganho médio diário, do nascimento aos 21 dias, para cordeiros nascidos de parto simples (0,380 vs 0,290 g/dia). Estes autores relataram que esse fato pode estar relacionado com a quantidade de leite consumido pelos cordeiros, pois ovelhas que parem mais de um cordeiro tendem a produzir mais leite, porém, este aumento de produção não é proporcional ao número de cordeiros nascidos, assim, a quantidade disponível de leite para cada cordeiro de parto gemelar é menor do que a disponível para os cordeiros únicos. Neste mesmo trabalho, no período referente ao 21º e 42º dia de idade, o maior ganho de peso diário dos cordeiros de partos simples não se sustentou (0,210 vs 0,230 g/dia), pois o consumo de alimentos sólidos pelos cordeiros gêmeos já era significativo. Da mesma forma, Snowder & Glimp (1991) avaliaram a influência do número de cordeiros amamentados sobre a produção de leite e o desempenho e verificaram que apesar da produção de leite ter sido superior para ovelhas que amamentaram gêmeos (1,53 vs 1,02 kg/dia), a quantidade de leite não é suficiente para que estes cordeiros cresçam no mesmo ritmo que os cordeiros de partos simples. Esses autores ainda relataram que a suplementação em creep feeding é uma opção economicamente viável para melhorar o ganho de peso dos cordeiros gemelares, principalmente durante as primeiras semanas de lactação. De acordo com Stephenson et al. (1981) o desempenho dos cordeiros se correlaciona positivamente com a produção de leite (r=0,91) e com seus teores de gordura (r=0,71) e de proteína (r=0,84) e) com o escore de produção de leite da ovelha (r=0,68) para Sawalha et al., (2005). 3. QUALIDADE DO LEITE O leite de ovelha é prioritariamente destinado à produção de queijo e como consequência, é necessário que contenha elevados teores de proteína e gordura para proporcionar queijo de alta qualidade (SEVI & CAROPRESE, 2012), no entanto, a 7 qualidade do leite pode variar de acordo com diversos fatores como: genética do animal, manejo, nutrição e meio ambiente (PIRISI et al., 2007). Os produtos lácteos são fonte confiável de proteínas de alta qualidade, bem equilibradas em aminoácidos, cujo teor pode variar de 4,7% a 7,2% e os principais fatores que podem influenciar na variação desse conteúdo proteico são o estágio de lactação, época do ano, raça, idade e alimentação (RAYNAL-LJUTOVAC et al., 2007). Já o teor de gordura é o componente do leite mais variável quantitativa e qualitativamente, e depende do estágio de lactação, época do ano, raça, genótipo e alimentação, sendo este último, um dos principais fatores. A outra característica da gordura do leite de ovelhas é o tamanho dos glóbulos com maior proporção de glóbulos pequenos em comparação ao leite de vaca (ATTAIE & RICHTER, 2000). A lactose é o principal carboidrato do leite ovino (49%) e sua concentração não sofre grande influencia como a proteína e gordura (LOPEZ et al., 1999). A composição do leite, principalmente os teores de proteína e gordura são afetados de forma indireta pelas diversas situações que podem provocar algum tipo de estresse nos animais, como alteração climática, isolamento, manejo (tosquia, manipulação dos animais), barulho, medo, transporte, podendo inibir ou aumentar o consumo de alimentos, aumentar a sudorese, mobilizar reservas corporais, provocar queda na imunidade que pode resultar em alguma enfermidade, como por exemplo, a mastite (CAROPRESE, 2008; CAROPRESE et al., 2009; CAROPRESE et al., 2010; SEVI & CAROPRESE, 2012) 4. MASTITE A doença animal mais discutida no mundo é, provavelmente, a mastite, que é responsável por grandes perdas econômicas estimadas com base na menor produção e descarte de leite devido à mastite clínica (MARTINS et al., 2013). No entanto, a mastite subclínica também provoca grandes perdas, devido à ação contínua de micro- organismos na mucosa, durante uma ou várias lactações, o que provoca uma perda progressiva do epitélio secretor, reduzindo a produção de leite e prejudicando o crescimento da prole (PUGH, 2005). A saúde da glândula mamária, em particular, é influenciada pela quantidade e qualidade do leite produzido. A mastite é economicamente importante em rebanhos leiteiros, pois além de reduzir a produção de leite, causa mudanças em sua composição, alterando as características e o processamento dos produtos obtidos (BENCINI & PULINA, 1997). Em um estudo com cerca de 1000 ovelhas, a produção 8 de leite de úberes não infectados foi maior do que a das metades mamárias infectadas (2,77 vs 2,55 lts/dia, respectivamente), enquanto que o teor de gordura (4,68% vs 5,29%) e de proteína (5,13% vs 5,50%) foi inferior nas metades não infectadas do que nas infectadas, devido a uma grande redução do volume de leite, apesar de inferior a síntese destes compostos (LEITNER et al., 2003). Ainda neste trabalho, os autores registraram que quando ambas as glândulas estão infectadas, as perdas de produção de leite são agravadas (queda de 60%). Mavrogenis et al. (1995) encontraram uma redução evidente da produção de leite ao realizar análise de regressão e conforme a contagem de células somáticas (CCS) do leite aumentou, houve redução de cerca de 18 g na produção de leite diária individual para cada aumento de CCS na ordem de 0,5x106 células/ml. Leitner et al. (2004) ao analisarem as metades mamárias como modelo experimental, encontraram produção de leite menor para aquelas infectadas do que nas não infectadas (0,36 kg vs 0,76 kg/ordenha), os teores de gordura (6,17 vs 6,49%) e proteína (5,35 vs 5,85%) nas metades infectadas foram menores do que nas não infectadas, como resultado da diminuição na síntese de gordura devido a lesão nas células secretoras e o coeficiente de correlação entre a contagem de célula somática (CCS) e a produção de leite foi de 0,81. O processo inflamatório da mastite começa através de uma dilatação dos vasos sanguíneos, que aumenta o fluxo de sangue para o úbere infectado, elevando a temperatura neste ponto (MARTINS et al., 2013). Numa fase crônica, o edema diminui o fluxo sanguíneo para a glândula mamária (MCGAVIN & ZACHARY, 2007) e quando atinge um estágio avançado da infecção, as porções afetadas podem perder a sua função e, consequentemente, reduzir o seu metabolismo, uma vez que 98% do fluxo de sangue do úbere em ovelhas lactantes é através do tecido lóbulo-alveolar, que é diretamente responsável por atender as exigências nutricionais desse tecido (THOMPSON, 1980). A mastite subclínica em ovinos representa até 95% dos casos de mastite diagnosticados e a ausência de sinais clínicos dificulta a detecção e o tratamento do animal enfermo (MARTINS et al., 2013). A contagem de células somáticas (CCS), assim como o California Mastitis Test (CMT), são os métodos mais utilizados para a detecção de mastite subclínica em rebanhos leiteiros (MAISI, 1990). A contagem de células somáticas (CCS) em pequenos ruminantes considera os diferentes tipos de células presentes no leite, incluindo leucócitos e células epiteliais 9 (SOUZA et al., 2012). Em ovelhas a secreção do leite é apócrina e as partículas citoplasmáticas semelhantes, em tamanho, às células somáticas, e apesar de não serem consideradas células, são contadas pelo equipamento (MADUREIRA et al., 2010). Portanto, ao analisar a CCS de ovelha, esta particularidade deve ser levada em consideração, principalmente em avaliações de saúde do úbere e qualidade do leite (SOUZA et al., 2012). Tanto no leite de vacas quanto de ovelhas, os macrófagos são as células predominantes (45-88%), seguidos pelos leucócitos polimorfonucleares (2-40%), linfócitos (6-20%) e em menor quantidade os eosinófilos e células epiteliais (BLAGITZ et al., 2008). No colostro de ovelhas os tipos de célula predominante são os leucócitos (41-84%), seguido pelos macrófagos (8-49%) e linfócitos (6-11%), em menor concentração (LEE & OUTTERIDGE, 1981). No início da infecção mamária Sordillo et al. (1989) verificaram predomínio de neutrófilos no tecido do úbere e no leite, correspondendo a 90% ou mais do total de leucócitos. Ao comparar as três principais espécies produtoras de leite, a CCS do leite de cabras saudáveis (270 a 2.000 × 103 células/ml) é maior do que do leite de vacas e ovelhas não infectadas (TIAN et al., 2005). Albenzio & Caroprese (2011) observaram uma forte correlação entre a percentagem de linfócitos (r = 0,84), leucócitos (r = 0,94) e macrófagos (r = 0,79) com baixas e altas CCS, por contagem microscópica de células e citometria de fluxo no leite de ovelha. Vários fatores de risco foram relatados ser associados com CCS em ovinos, como estágio de lactação (BAUMGARTNER et al., 1992), tipo de parto (simples e gemelar) e raça (NUDDA et al., 2002). A involução da glândula mamaria ocorre no final da lactação ou após a desmama, momento em que a morfologia das glândulas é alterada drasticamente e neste processo pode influenciar a concentração das células imunes locais e as proporções relativas das mesmas na glândula mamária (TATARCZUCH et al., 2002). Pouco depois da entrada de patógenos invasores na glândula mamária, os leucócitos residentes e células epiteliais iniciam uma resposta inflamatória com o objetivo de eliminar as bactérias invasoras do local (RAINARD & RIOLLET, 2003). Durante este processo, a CCS aumenta, principalmente devido ao influxo de neutrófilos, os quais podem compreender mais de 90% da CCS (ALBENZIO & CAROPRESE, 2011). 10 Em ovelhas, a incidência da mastite clínica é mais elevada durante início da lactação, seguido por uma constância até a desmama (WAAGE & VATN, 2008). A CCS baixa observada no início da lactação e o risco de contaminação dos tetos pelos cordeiros podem explicar esse padrão, pois as bactérias patogênicas podem estar presentes na boca dos filhotes e serem mecanicamente transmitidas para as ovelhas (GOUGOLIS et al., 2008). A alta incidência de mastite subclínica também foi registrada no início da lactação em ovelhas (GUARANÁ et al, 2011), embora a sua prevalência durante todo o período de lactação permaneceu relativamente constante (BLAGITZ et al., 2012). Os valores limite propostos para determinar metades mamárias saudáveis e infectadas são inferiores a 500×103 células/ml (NUNES et al., 2008), no entanto, valores mais elevados, de até 1.500×103 células/ml, tem sido sugerido por outros autores (FTHENAKIS et al., 1991; MAVROGENIS et al., 1995; LAFI, 2006). O California Mastitis Test (CMT) tem sido amplamente utilizado para medir indiretamente a CCS porque é prático, barato e rápido de realizar (PERSSON & OLOFSSON, 2011). Ao avaliar a sensibilidade e especificidade de CMT, Hueston et al. (1986), observaram sensibilidade de 69,3% e especificidade de 76,5% nas metades mamárias de ovelhas. Posteriormente, estudos avaliaram o CMT como um teste indireto para mastite e sugeriram que para escore 1 de CMT, o úbere deveria ser identificado como infectado (NUNES et al., 2008; PEIXOTO et al., 2010). Altas correlações entre CMT e o exame bacteriológico (73,2%) tem sido relatados com o escore de 1 para CMT como limite (PEIXOTO et al., 2010). Quando o escore de CMT foi 3, as culturas positivas aumentaram de 11,7% para 53,6% (ARSENAULT et al., 2008). De um total de 1.210 amostras de leite de ovelhas leiteiras Awassi, 719 (59,4%) amostras deram resultado negativo, sem crescimento bacteriano, destas amostras, 91% (654) e 80% (570) tinham menos de 1,0x106 células/ml e escore ≤2 para CMT, respectivamente (LAFI, 2006). Neste mesmo trabalho, em 472 amostras de leite (39,1%), observou-se pelo menos um patógeno na cultura bacteriana e destas, apenas 9% (44) tinham CCS menor de 1,0x106 células/ml, entretanto todas apresentaram escore de CMT >2+. A mastite subclínica caracteriza-se pela alta prevalência, diminuição da produção de leite e aumento de células somáticas, além de alterações na qualidade e nas propriedades físico-químicas do leite (HAMED et al., 1993), comprometendo a sua qualidade nutricional (SANTOS et al., 2007) e o desenvolvimento dos cordeiros 11 (FERNANDES et al., 2013), devido a danos na glândula mamária (SOUZA et al., 2012). Questões relacionadas a higiene das instalações está estritamente ligada com o bem-estar de ovinos e com a predisposição à mastite e quando o alojamento em baias for inferior a 7 m3/ovelha pode ter efeitos prejudiciais no ar, cama e higiene da instalação, aumentando a suscetibilidade da glândula mamária de mastite subclínica (CAROPRESE, 2008). A preocupação com a mastite é mais evidente em ovinos de produção leiteira, mas com a relevância da perda econômica causada por esta enfermidade, essa atitude está mudando, sendo motivo de atenção também em rebanhos de ovinos com aptidão para carne (FUENTE et al, 1997). Em rebanhos de ovinos de corte os surtos de mastite clínica podem ocorrer atingindo de 30 a 50% das matrizes, com alta taxa de mortalidade e com descarte de mais de 90% das ovelhas do rebanho, enquanto que para a mastite subclínica 5 a 30% dos animais podem ser acometidos e em rebanhos de produção de leite de 20 a 30% (LANGONI, 2005). Segundo Blood & Radostits (1991) a mastite foi responsável por 8,4% das mortes de ovelhas e mais de 34% das mortes de cordeiros. De acordo com Contreras et al. (2007) a incidência de mastite clínica em pequenos ruminantes geralmente é menor que 5%, mas este valor pode aumentar esporadicamente, entretanto, a prevalência de mastite subclínica tem sido estimada em valores entre 5 a 30%. A mastite subclínica é considerada a forma mais preocupante, pois os animais acometidos não apresentam sinais clínicos, dificultando a sua detecção e, consequentemente, o seu tratamento (FERREIRA et al., 1999). Assim, pode permanecer e se disseminar no rebanho, sem alterações evidentes do úbere e da secreção do leite, mas prejudicando a produção e a qualidade do leite produzido (RADOSTITS et al., 2002). De acordo com Las Heras et al. (1999) além da mastite subclínica reduzir a produção de leite, proporciona menor desenvolvimento do cordeiro e colabora com alta predisposição à mastite clínica. A mastite interfere diretamente na produção e qualidade do colostro e, portanto, no desempenho de ganho de peso dos cordeiros, aumentando a susceptibilidade às infecções e mortalidade dos filhotes (LANGONI et al., 2004). Assim, devido a mastite, cordeiros em período de amamentação morrem por inanição e as ovelhas quando não morrem, são descartadas precocemente (DOMINGUES & LEITE, 2005). 12 O prejuízo econômico em um rebanho devido a menor produção de leite é estimado entre 22,8% e 27,3% nas ovelhas primíparas, 37,3% nas ovelhas multíparas e as infecções unilaterais resultam em perdas de 11,5% na produção de leite total, enquanto que nas infecções bilaterais pode chegar a 58,3% do total produzido (SILVA, 1999). Ovelhas com mastite subclínica diminuem em 37% a produção de leite, além dos cordeiros apresentarem menor desempenho de ganho de peso (66 g/dia a menos) quando comparados aos amamentados por ovelhas sadias (LANGONI, 2005). Embora existam poucas informações na literatura relacionadas à ocorrência de mastite em ovelhas da raça Santa Inês, Fernandes et al. (2013) demonstraram que 37,93% das ovelhas experimentais apresentaram prevalência de mastite durante a lactação, sendo que 81,9% destas infecções mamárias foram bilaterais. Desde então, outros centros de pesquisa e universidades brasileiras têm relatado que a incidência de mastite nas ovelhas da raça Santa Inês parece ser maior do que em outras raças, resultando em altas taxas de descarte por perda de função da glândula mamária, o que não é comum em outras raças de corte. 5. MORFOMETRIA DA GLÂNDULA MAMÁRIA Nos países onde a ovinocultura de leite é importante comercialmente, estudos sobre a morfologia mamária tem sido desenvolvidos desde a década de 50, quando os primeiros trabalhos foram publicados com a preocupação inicial de avaliar alguns caracteres mamários considerados de importância na produção de leite (BONELLI, 1957; OWEN, 1975). Desde então as pesquisas focaram nas medidas de úbere (profundidade, comprimento e largura) e dos tetos como comprimento, largura, ângulo de inserção e a distância entre eles (MIKUS, 1978). Na década de 1980, foi proposta na Itália uma classificação de conformação de úbere com base em quatro classes (CASU et al., 1989). O método era de fácil aplicação, mas tinha a desvantagem de que traços básicos da morfologia mamária foram combinados em um único escore, impedindo uma classificação mais exata dos animais e, portanto, não sendo adequado para avaliação genética com modelos animais (CASU et al., 2006). Nos anos 90, De La Fuente et al. (1996) propuseram um método de pontuação linear para avaliar as características de úbere de ovelhas, que foi aplicado para raças espanholas (FERNANDEZ et al., 1997, SERRANO et al., 2002, LEGARRA & UGARTE, 2005). Nas últimas décadas as pesquisas começaram a abranger também as características funcionais, como por exemplo, habilidade de ordenha (CASU et al., 13 2006). Segundo os mesmos autores, tradicionalmente, os criadores de ovelhas selecionam as matrizes com base na produção de leite, uma avaliação subjetiva da morfologia do úbere e pela facilidade de ordenha manual. O úbere dos ruminantes tem estruturas semelhantes, mesmo que em diferentes proporções. Segundo Bruckmaier et al. (1994) os pequenos ruminantes, têm proporcionalmente maior cisterna (40 a 80% do volume total) quando comparado aos grandes ruminantes, com papel importante no armazenamento do leite entre as ordenhas, podendo afetar a sua extração. De acordo com Caja et al. (1999), a fração cisternal da maioria das raças de ovelhas leiteiras é maior do que 50%. Rovai et al. (2008), avaliaram aspectos da morfologia mamária de duas raças de ovinos leiteiros e encontraram uma relação percentual de área de cisterna e de alvéolos de 59:41 e 77:23 para ovelhas das raças Manchega e Lacaune, respectivamente. Portanto, uma grande parte do leite é armazenada nas cavidades cisternais do úbere (DZIDIC et al., 2004) e conforme a morfologia dessa glândula, parte do leite cisternal pode estar localizado abaixo do orifício do canal do teto, sendo necessária a intervenção manual para concluir a extração do leite (BRUCKMAIER & BLUM, 1992; BRUCKMAIER et al., 1997; CASU et al., 2000). A mensuração das estruturas internas do úbere é útil para estudar potenciais de produção de leite e habilidade materna das ovelhas (AYADI et al., 2011; MARTÍNEZ et al., 2011). O tamanho da cisterna e os parâmetros de morfologia do úbere estão correlacionados não só com a produção de leite, mas também com sua taxa de secreção e com a cinética de emissão de leite durante a ordenha em ovelhas leiteiras (LABUSSIÈRE, 1988; ROVAI et al., 1999; MARNET & MCKUSICK, 2001; EMEDIATO et al., 2008; IÑIGUEZ et al., 2009). O leite é prontamente transferido dos alvéolos para a cisterna durante o período entre ordenhas (MARNET & MCKUSICK, 2001), no entanto, esse armazenamento entre os dois compartimentos varia de acordo com a espécie, raça, intervalo de ordenha e fase de lactação (SALAMA et al., 2004). Animais que armazenam grandes quantidades de leite na cisterna da glândula mamária, geralmente produzem mais leite e suportam maiores intervalos entre ordenhas (KNIGHT & DEWHURST, 1994; AYADI et al., 2003; SALAMA et al., 2004; CASTILLO et al., 2008). Entretanto, embora o tamanho do úbere e a produção leiteira apresentem correlações positivas, a adaptação à ordenha mecânica não deve ser avaliada apenas por este parâmetro (LABUSSIÈRE et al., 1981; LABUSSIÈRE, 1988; CASU et al., 2000; EMEDIATO et al., 2009), pois o aumento da produção de leite 14 geralmente determina um úbere grande, com inserção de tetos desfavoráveis (ROVAI et al., 1999), podendo inviabilizar a ordenha mecânica ou mesmo prejudicar a mamada do cordeiro. Izadifard & Zamiri (1997) encontraram altos coeficientes de correlação de produção de leite com profundidade (r=0,75) e circunferência (r=0,72) de úbere, em ovelhas da raça Ghezel, duas semanas após o parto. Emediato et al. (2008) também verificaram correlações altas entre produção de leite de ovelhas Bergamácia Brasileira e circunferência, profundidade e volume do úbere (0,74; 0,75 e 0,84; respectivamente) após a desmama definitiva dos cordeiros, enquanto Iñiguez et al. (2009) obtiveram correlação de produção de leite com circunferência e largura de úbere de 0,80 e 0,73, respectivamente, em ovelhas da raça Awassi. O estudo das correlações entre medidas de úbere e produção de leite podem ajudar em futuros programas de cruzamentos, auxiliando estimativas de potencial de produção de leite (IZADIFARD & ZAMIRI, 1997). Estes autores verificaram em ovelhas Mehraban e Ghezel, profundidade de úbere, duas semanas após a desmama, de 12,1 cm e 13,3 cm, respectivamente. Iñiguez et al. (2009) com a raça Awassi (13,5 cm), observaram valores maiores do que Labussière (1988) e Ayadi et al. (2011) que reportaram em outras raças (5 a 10,7 cm), mas menores do que as publicadas por Emediato et al. (2008) de 19,1 cm antes da desmama e 17,3 cm após a desmama aos 60 dias de lactação em ovelhas da raça Bergamácia Brasileira. Com relação aos estudos que avaliaram a largura do teto de ovelhas das raças Tsigay, Karagouniko, Lacaune, Sarda, Manchega, Churra, Serra da Estrella, Mehraban, Ghezel, Bergamácia, Awassi e Sarda, observou-se uma variação de 1,43 a 2,29 cm (LABUSSIÈRE, 1988; IZADIFARD & ZAMIRI, 1997; EMEDIATO et al., 2008; IÑIGUEZ et al., 2009; AYADI et al., 2011). A morfologia mamária é um fator que determina aptidão para ordenha mecânica de ovelhas, pois o úbere precisa encaixar-se na ordenhadeira (LABUSSIÈRE, 1988), além disso, úberes fortemente ligados à parede abdominal e com tetos verticais inseridos na parte mais baixa da cisterna são menos sujeitos a queda do conjunto de ordenha e precisam de menos intervenções manuais para esgota (CASU et al., 2000). Labussière (1988) descreveu em sua revisão a morfologia mamária ideal para a realização da ordenha mecânica em ovelhas e concluiu que a profundidade e um forte ligamento suspensório do úbere são altamente correlacionados com produção de leite e que inserções de tetos muito horizontais podem causar a queda do conjunto de ordenha. Consequentemente, quando os tetos possuem inserções horizontais, uma 15 certa quantidade de leite pode ser mantido na cisterna (BRUCKMAIER et al., 1997, EMEDIATO et al., 2009). Tetos inseridos na horizontal também são mais suscetíveis à torção durante a ordenha e isso inibe o reflexo de ejeção, aumentando assim a retenção de leite alveolar (LABUSSIÈRE, 1988). Portanto, a inserção dos tetos deve ser vertical para ordenha mecânica, mas não completamente, pois pode dificultar a amamentação dos cordeiros, deste modo, com uma boa conformação do úbere, o tempo de trabalho na ordenha individual poderia ser diminuído (LEGARRA & UGARTE, 2005). De acordo com De La Fuente et al. (1996), ovelhas que apresentam úberes com profundidade excessiva, isto é, abaixo da linha do jarrete, geralmente possuem alguma deficiência no ligamento suspensório. Segundo os mesmos autores, a inserção ideal dos tetos é vertical ao solo, o que coincide com a altura mínima da cisterna. Legarra & Ugarte (2005) observaram que a profundidade do úbere é algo almejada, mas apenas até uma extensão intermediária, pois úberes muito profundos são difíceis de ordenhar e susceptíveis a injúrias e que quando o úbere é bem inserido pode suportar maior quantidade de leite sem problemas funcionais. Assim, a conformação do úbere pode estar ligada à longevidade funcional do animal porque ovelhas em pasto e com úberes profundos estão mais expostas a injúrias na glândula mamária e consequentemente podem ser mais elegíveis ao descarte (CASU et al., 2006). Em um estudo sobre a viabilidade de um método de classificação linear da morfologia mamária, Casu et al. (2006) concluíram que a habilidade de ordenha das ovelhas da Sardenha pode ser melhorada por seleção de morfologia do úbere. As características de ordenha e morfologia do úbere são fatores que determinam a habilidade de ordenha em ovelhas leiteiras e o conhecimento da produção de leite, tempo de ordenha e conformação de úbere é necessário para uma boa adaptação do ambiente de ordenha às necessidades das ovelhas (DZIDIC et al., 2004). A habilidade de ordenha pode ser avaliada pela análise da curva do fluxo de leite (LABUSSIÈRE, 1988; BRUCKMAIER et al., 1997), pelas características do leite (BRUCKMAIER et al., 1997; MARNET et al., 1999) e pelas medidas morfométricas do úbere (LABUSSIÈRE, 1988; FERNANDEZ et al., 1995; ROVAI et al., 1999, EMEDIATO et al., 2008). Normalmente a retenção de um grande volume de leite, resulta numa cisterna maior, assim como, maior tamanho de úbere, podendo alterar as dimensões exteriores do úbere, portanto, se a retenção do leite não for considerada nas avaliações, pode-se 16 incorrer em tendência quando animais com níveis diferentes de produção são comparados e à estimativas incorretas de correlação genética entre características de úbere e produção de leite (LEGARRA & UGARTE, 2005). Deste modo, torna-se necessário que criadores de ovelhas para exploração leiteira considerem o melhoramento genético relacionado com características de saúde de úbere (CMT e CCS), habilidade de ordenha e tipo de úbere (MARIE-ETANCELIN et al., 2001). 6. CORTISOL Animais domésticos reagem ao estresse pela alteração de respostas comportamentais e fisiológicas, como resultado da reatividade emocional individual (DEISS et al., 2009). Em condições de estresse, o organismo reage para se proteger e inicia uma série de reações biológicas desencadeadas pelo organismo, liberando substâncias como neurotransmissores (adrenalina), glicocorticóides (cortisol) e opióides endógenos (ß-endorfinas) na corrente sanguínea (ELOY, 2007). A resposta fisiológica ao estresse inclui a ativação dos sistemas nervoso central, endócrino e imunes, os quais estão conectados pelo sistema nervoso autônomo e eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) através da secreção de neuropeptídeos e neurohormônios que são responsáveis por mudanças nas respostas celulares e humorais imunes (ROMERO et al., 2015), que pode afetar o desempenho de produção do animal (CAROPRESE et al., 2009). Diversos hormônios (ACTH, glucocorticóides, catecolaminas, prolactina, etc), estão envolvidos na resposta ao stress e as glândulas supra-renais tem papel-chave na reações hormonais, pois estão envolvidas tanto no eixo HPA, quanto no sistema simpato-adreno-medular (MOBERG, 2000). As situações adversas desencadeiam respostas das glândulas supra-renais, que resultam no aumento de glucocorticóides e/ou secreções de catecolaminas, sendo estes aumentos os principais mecanismos endócrinos para defender o organismo contra as condições estressantes (MOSTL & PALME, 2002). Com a descoberta dos mecanismos metabólicos, imunológicos e neuroendócrinos tornou-se possível descrever a reação do estresse em termos fisiológicos (BALM, 1999). Em resposta ao estresse, o eixo HPA é ativado resultando numa cascata de acontecimentos hormonais que se inicia com o hormônio liberador de corticotropina e arginina vasopressina, que são liberados pelo hipotálamo e, juntos, estimulam a 17 hipófise a secretar ACTH, que por sua vez estimula a secreção de glucocorticóides pelo córtex adrenal (VAN LIER, et al., 2003). O cortisol é um glucocorticóide produzido pelo córtex da adrenal e sua síntese e liberação são estimuladas fundamentalmente pelo ACTH, cuja produção é modulada pelo hipotálamo e influenciada pela secreção do hormônio liberador de corticotrofina (ELOY, 2007). Para definir o estresse quantitativamente, foram usadas como indicadores a extensão de liberação de cortisol e a atividade geral da glândula adrenal (MACKENZIE et al., 1975). Estas medições assumem que o grau de estresse imposto é diretamente proporcional à quantia de ACTH liberada e consequentemente a atividade do córtex adrenal (DALLMAN & YATES, 1969). Fulkerson & Jamieson (1982) analisaram o efeito de diferentes concentrações de ACTH exógeno em ovelhas e registraram que para 0,0; 0,01; 0,1; 1,0 e 10 UI de ACTH exógeno, obtiveram picos de cortisol plasmático de 4, 18, 48, 59 e 82 ng/ml, respectivamente. A liberação de ACTH representa a resposta endócrina clássica ao estresse (PARROTT et al., 1988), no entanto, a baixa produção de cortisol resulta da baixa liberação de cortisol adrenal em resposta à estimulação do ACTH, devido a fatores como baixa massa da adrenal e atrofia ou destruição do córtex adrenal (KINTZER & PETERSON, 1997). A liberação de ACTH fornece um índice válido de estresse, porque o ACTH é o mediador entre o estresse imposto e o cortisol liberado, o qual foi linearmente relacionado com o logaritmo natural da dose de ACTH sintético administrado via intravenosa. Este padrão de resposta é válido apenas para o estresse agudo, para relacionar com um estresse crônico, é necessário outro padrão de dose-resposta usando a infusão prolongada de ACTH (FULKERSON & JAMIESON, 1982). A variação do nível plasmático de cortisol é utilizada como indicador universal de estresse, sendo que a elevação de seus níveis se contrapõe aos conceitos de conforto e bem-estar (BROOM, 1991; MOSTL & PALME, 2002), embora recomenda-se cautela, uma vez que um aumento não ocorre com todo o tipo de estressor (BROOM, 1993). Como outros hormônios, os glicocorticóides possuem ritmo circadiano, e coletas frequentes de sangue demonstraram que ritmos circadianos podem ser alterados por estresse prolongado (PRZKOP et al., 1985). Portanto, deve-se considerar que a coleta de amostras que envolve manipulação dos animais, pode por si só ser estressante e interferir nos resultados (HOPSTER et al., 1999). 18 Vários estudos examinaram mudanças no cortisol plasmático ou nas concentrações de glucocorticóides em animais sob diferentes condições estressantes e o cortisol plasmático foi considerado um confiável indicador fisiológico por determinar a resposta animal ao estresse (ROMERO et al., 2015). O estresse é um alerta para algo que não está em harmonia, no entanto, caso o estresse seja uma constante, provocará sérios danos à saúde, prejudicando o desempenho normal das funções reprodutivas, metabólicas e do sistema imunológico e como consequência, tem-se animais doentes e menos produtivos (ELOY, 2007). O eixo HPA desempenha um papel importante na adaptação da mãe ao aumento da demanda de energia durante a lactação. Além disso, os glicocorticoides são transportados do sangue da mãe para o leite e em seguida penetram a barreira epitelial intestinal do recém-nascido (ANGELUCCI et al., 1985), e, portanto, influenciam no desenvolvimento da prole (HASIEC et al., 2015). Ovelhas em lactação tem o mesmo nível de secreção de cortisol basal de ovelhas estéreis (TILBROOK et al., 2006), mas a atividade induzida pelo estresse do eixo HPA está fortemente atenuada (COOK, 1997). Alterações adaptativas no eixo HPA durante a lactação são causadas pela sucção e outros estímulos externos associados com a presença dos filhotes, que afetam a secreção de vários neurotransmissores, neuromoduladores, e hormônios (BRUNTON et al., 2008). De acordo com Kolb et al. (1984) em condições normais, o nível plasmático basal de cortisol encontrado em ovelhas é de 1,10 mg/ml. Starling et al. (2005) obtiveram variações nos valores médios de cortisol de 0,216 a 0,507 mg/ml em carneiros Corriedale submetidos a estresse térmico, valores inferiores aos obtidos por Hargreaves & Hutson (1990) que observaram pico de cortisol de 2,63 mg/ml ao utilizarem a tosquia como agente estressor. Boucinhas (2008) reportou que as ovelhas da raça Bergamácia que foram submetidas ao ordenhador com comportamento aversivo (falar alto e movimentos bruscos) apresentaram concentração plasmática de cortisol maior do que quando manejadas pelo ordenhador mais calmo (1,58 ± 0,69 vs 1,18 ± 0,70 mg/ml, respectivamente). Deste modo, evidencia-se que diferenças individuais de reatividade ao estresse podem ter papel importante na habilidade do animal em enfrentar situações aversivas e desafios imunológicos e a resposta de um animal ao estresse pode afetar sua predisposição a doenças ou patologias relacionadas ao estresse (CAROPRESE et al., 2010). 19 Sevi et al. (2001) constataram que vários estressores relacionados com a ativação do eixo HPA e o aumento de concentração de cortisol reduzem a produção de leite em ovelhas. De acordo com Pearson & Mellor (1976) estudos demonstraram que o confinamento de ovelhas isoladas em baias determinou a ativação do HPA, com um aumento na secreção de cortisol e na frequência de comportamentos estereotipados e anormais. Casamassima et al. (2001) verificaram que o manejo de ovelhas lactantes na pastagem durante o dia foi benéfico para as suas exigências comportamentais, estimulando comportamentos exploratórios e ativos. Além disso, as ovelhas criadas extensivamente produziram leite com contagens de células somáticas mais baixas em comparação com os animais confinados (CAROPRESE, 2008). Estudos com ovelhas demonstraram a piora em até 20% no desempenho de produção em resposta a manejos estressantes (SEVI et al., 2001). Segundo Caroprese et al. (2010) há algumas possíveis explicações para a redução de produção de leite em ovelhas com alto nível de cortisol plasmático. Primeiro: os altos níveis de cortisol podem reduzir a glicose no sangue, disponível para a glândula mamária. Segundo: a menor produção de leite pode ser o resultado do menor fluxo de sangue na glândula mamária, causada pelo aumento de catecolaminas com prejuízo na liberação e ação de oxitocina (BRUCKMAIER & BLUM, 1998). Além disso, junto com a associação entre a extensão da concentração de cortisol e produção de leite, existe uma relação entre concentração de cortisol e os níveis de CCS (CAROPRESE et al., 2010). Em ovinos, procedimentos estressantes podem afetar produção e qualidade do leite, causando um aumento na CCS (CAROPRESE et al., 2009). Existem evidências de uma relação íntima entre baixo nível de bem-estar e maior suscetibilidade à mastite (SEVI et al., 2001). Fulkerson & Jamieson (1982) administraram em ovelhas 1 ml de solução de ACTH sintético via intravenosa, em dias sucessivos para registrarem o padrão de liberação de cortisol e os resultados revelaram que usar mudanças no cortisol plasmático como um indicador de estresse requer alguns cuidados como realizar amostragens frequentes e usar cada animal como seu próprio controle. De acordo com os mesmos autores, estimativas da liberação do cortisol no plasma só são válidas se a taxa de liberação metabólica do cortisol não for alterada, embora isto possa ser verdade em curto prazo, pode não ser o caso para períodos mais longos, por exemplo, 1 a 2 dias. Esta técnica provavelmente é restringida à determinação de efeitos de estresse de curto prazo. Outros estudos encontraram que ambas as imposições de 20 estresse (Panaretto, 1974) e infusão de ACTH (Panaretto et al., 1973) levaram a um aumento na taxa de liberação metabólica. Segundo Caroprese et al., (2010) em ovelhas leiteiras existe uma relação entre reatividade do eixo HPA e a predisposição do desenvolvimento de processos inflamatórios na glândula mamária, portanto, levar em consideração a classificação das ovelhas de acordo com suas respostas fisiológicas e comportamentais ao estresse pode ser uma ferramenta útil para a separação dos animais com suscetibilidade para mastite. Diante do exposto, este trabalho propõe avaliar a relação do nível de concentração plasmática de cortisol, após aplicação de ACTH exógeno, com a produtividade dos animais e incidência de mastite ao longo da lactação e o estudo da morfometria da glândula mamária de ovelhas da raça Santa Inês, o que produziu dois artigos que serão apresentados nos capítulos 2 e 3 sob os títulos: Desempenho produtivo e incidência de mastite em ovelhas da raça Santa Inês com alta e baixa liberação de cortisol e Relação da morfometria do úbere com a produção do leite e incidência de mastite em ovelhas da raça Santa Inês, respectivamente. Ambos os artigos apresentam-se com a redação de acordo com as normas da revista Small Ruminant Research, na qual pretende-se publicá-los. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBENZIO, M.; CAROPRESE, M. Differential leukocyte count for ewe milk with low and high somatic cell count. J. Dairy Res. v.78, p.43-48, 2011. 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Foram analisados o desempenho de ovelhas e cordeiros ao parto e à desmama, assim como o CMT, CCS, produção de leite, proteína e gordura do leite. Os dados foram analisados utilizando-se a análise de variância e teste de Tukey a 5% de significância. O grupo AC obteve maior média de cortisol plasmático (225,45 ± 52,08 vs 114,65 ± 36,11 ng/ml) do que o grupo BC, entretanto não houve efeito de nível de liberação de cortisol sobre as variáveis consideradas. Foi observado efeito de período (antes e após a desmama) para produção de leite (924,27 vs 232,19 ml) e proteína bruta (4,16 vs 5,79 %), respectivamente. Para CMT e CCS não foram encontradas diferenças. Concluiu-se que o nível de liberação de cortisol não influencia o desempenho nem a incidência de mastite das ovelhas da raça Santa Inês. Palavras-Chave: CCS, CMT, estresse, glândula mamária, produção de leite. Productive performance and incidence of mastitis in Santa Inês ewes with high and low cortisol release Abstract The aim of this study at evaluating whether cortisol release level of Santa Ines ewes influences their performance and incidence of mastitis. It were used forty nine Santa Inês ewes, which were submitted to an application of exogenous ACTH (1ml/10 kg BW) for later be divided into 2 groups according to the level of plasma cortisol concentration at the peak of its release curve: AC (high cortisol) and BC (low cortisol). It were analyzed ewes and lambs performance for weight gain at lambing and weaning, as well as CMT, CCS, milk production, protein and fat. Data were analyzed using analysis of variance and Tukey test at 5% significance level. The AC group had higher mean plasma cortisol (225.45 ± 52.08 vs 114.65 ± 36.11 ng/ml) than the BC group, but there was no effect level of cortisol release on the variables considered. Effect was observed for period (before and after weaning) for milk production (924.27 vs 232.19 36 ml) and crude protein (4.16 vs 5.79%), respectively. For CMT and CCS, no differences were found. It was concluded that the level of cortisol release does not affect the performance or the incidence of mastitis of Santa Ines ewes. Key-words: SCC, CMT, stress, mammary gland, milk production. Introdução As principais respostas fisiológicas observadas em situações de estresse são: ativação do sistema nervoso autônomo (SNA) e liberação de neurotransmissores noradrenérgico e colinérgico, ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), aumento nas concentrações plasmáticas do hormônio liberador de corticotrofina (CRH), adrenocorticotrófico (ACTH), noradrenalina, adrenalina e cortisol (MOSTL & PALME, 2002). De acordo com Romero et al. (2015) as respostas fisiológicas ao estresse pelos animais, podem ser indicadas de forma confiável por alterações nos níveis de cortisol plasmático, sendo considerado portanto, um indicador universal de estresse (MOSTL & PALME, 2002). A liberação de ACTH representa a resposta endócrina clássica ao estresse (PARROTT et al., 1988), o qual pode ocasionar em aumento no nível plasmático de cortisol (LABUSSIÈRE, 1988) e, portanto, levar a liberação de neurotransmissores opiáceos no sistema nervoso central, que por sua vez inibem a síntese de ocitocina e a ejeção do leite (BRUCKMAIER & BLUM, 1996). O eixo HPA desempenha um papel importante na adaptação da mãe ao aumento da demanda de energia durante a lactação, além disso, os glicocorticoides são transportados do sangue da mãe para o leite e em seguida penetram a barreira epitelial intestinal do recém-nascido (ANGELUCCI et al., 1985), e, portanto, influenciam no desenvolvimento da prole (HASIEC et al., 2015). Sevi et al. (2001) constataram que vários estressores relacionados com a ativação do eixo HPA e com o aumento de concentração de cortisol reduzem em até 20% a produção de leite em ovelhas. Existe também uma relação desse hormônio com altos níveis de CCS (CAROPRESE et al., 2010) e baixos níveis de bem-estar evidenciaram maior suscetibilidade à mastite (SEVI et al., 2001). Considerando que nos diferentes sistemas de produção de ovinos, as ovelhas são submetidas a diversos manejos considerados estressantes, o objetivo deste estudo foi avaliar se o nível de liberação de cortisol de ovelhas da raça Santa Inês influencia o seu desempenho e incidência de mastite. 37 Material e Métodos Local do experimento O experimento foi conduzido no Laboratório de Fisiologia Animal do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP), Campus de Pirassununga, Estado de São Paulo. Animais experimentais Foram utilizadas 49 ovelhas primíparas (n=14) e multíparas (n=35) da raça Santa Inês prenhes de carneiro da raça Dorper. O peso (kg), escore de condição corporal (ECC) e a idade média (anos) dos animais no início do experimento eram de 58,40 ± 9,90 kg, 2,94 ± 0,46 e 3,35 ± 1,10 anos, respectivamente. As ovelhas foram pesadas em balança eletrônica portátil com precisão de 0,500 kg no dia do parto e da desmama, assim como o ECC (RUSSEL et al., 1969) e os cordeiros foram pesados em jejum, quinzenalmente do nascimento até os 75 dias de idade, em balança eletrônica portátil com precisão de 0,020 kg. As ovelhas foram alocadas em 5 baias de alvenaria, com 72m2, sendo 20m2 cobertos por telha de barro, com bebedouros, cocho saleiro para suplementação mineral, cocho para silagem e ração concentrada e para os cordeiros, creep-feeding (ad libitum) de 1,45m2. As matrizes foram distribuídas nas baias de acordo com as datas previstas para o parto, ocorridos entre o início de julho e meados de setembro de 2009, quando verificou-se 30 partos simples e 19 partos duplos. Durante todo o experimento as ovelhas foram mantidas confinadas com seus filhotes nas baias, onde foram alimentadas com silagem de milho (1,0kg MS/ovelha/dia) e ração balanceada (0,5kg MS/ovelha/dia), compondo uma dieta de 16% de proteína bruta (PB) e 70% de nutrientes digestíveis totais (NDT), de acordo com o NRC (2007). A desmama abrupta dos cordeiros foi realizada aos 60 dias, não permitido mais o contato entre ambos. As ovelhas foram secas após 90 dias de lactação, quando encerrou-se o experimento. Classificação dos animais Os grupos experimentais foram definidos de acordo com a concentração plasmática de cortisol no pico de sua liberação, obtida após 60 minutos da aplicação de ACTH exógeno conforme Caroprese et al. 2010. Este procedimento foi realizado 38 apenas no 15º dia de lactação, pois a aplicação de ACTH durante a gestação pode induzir as fêmeas ao parto (KENNEDY & MILLER, 1993). Assim, a partir de um rebanho de 49 ovelhas, estas foram retroativamente agrupadas em dois grupos, de acordo com a metodologia de Sevi et al., (2010), caracterizados em baixa ou alta concentração de cortisol. Os animais com concentração de cortisol ≥175 ng/ml foram identificados como AC (alto cortisol, n=26), enquanto que os com concentração <175 ng/ml foram chamados de BC (baixo cortisol, n=23). As ovelhas receberam 1ml/10 kg PV da solução de ACTH (SIGMA®) com soro fisiológico a 0,9%, o que correspondeu à aplicação de 0,6 UI do hormônio, por via intravenosa (jugular). Cortisol e ACTH (Hormônio Adrenocorticotrófico) Amostras de sangue (9 ml) foram coletadas em tubos do tipo vacutainer, por punção na veia jugular em cinco tempos: -20min (20 minutos antes), 0min (imediatamente antes) e 60, 120 e 300min após a aplicação de ACTH (CAROPRESE et al., 2010). As amostras de sangue foram centrifugadas a 1500 x G e 4ºC, durante 15 minutos e o plasma foi pipetado e estocado em tubos plásticos de fundo cônico de 2,5 ml a -20ºC. As análises do hormônio no plasma foram realizadas por meio de kit imunoenzimático (Assay Designs®), com leitura em 450nm no equipamento ELISA (Multiscan MS, Labsystem®). California Mastitis Test (CMT) Quinzenalmente, foi realizado o teste CMT de acordo com Schalm & Noorlander (1957). Para análise estatística dos resultados, foram dados escores de CMT, conforme abaixo: Negativo: 1; traços: 2; Fracamente positivo: 3; Positivo: 4; Fortemente positivo: 5; e Grumos (mastite clínica): 6 (SCHALM & NOORLANDER, 1957). Simultaneamente ao exame de CMT, foram colhidas amostras de leite para análises físico-químicas e contagem de células somáticas (CCS). Contagem de Células Somáticas (CCS) Para a realização da CCS, utilizou-se a metodologia de contagem microscópica direta de leucócitos do leite (PRESCOTT & BREED, 1910). As lâminas foram feitas em duplicatas e coradas pelo método de verde de metil e pironina-Y (MADUREIRA, 2010). 39 Proteína bruta (PB) e gordura (GORD) do leite As amostras de leite foram analisadas para proteína bruta pelo método de Kjeldahl, segundo a AOAC (1995) e para gordura pelo método volumétrico de Gerber utilizando-se o butirômetro de leite de 11 ml (BEHMER, 1985). As amostras de leite foram colhidas a cada 15 dias até os 90 dias de lactação. Produção de leite (PL) Antes da desmama, a produção de leite foi mensurada quinzenalmente pelo método “pesa-mama-pesa” do cordeiro, com intervalos de 12 horas e dois períodos de mamada em 24 horas, conforme detalhamento a seguir: às 18h00, as ovelhas e os cordeiros eram separados fisicamente. Na manhã seguinte, às 06h00, os cordeiros foram pesados, colocados para mamar até sentirem-se saciados e pesados novamente. Ao longo do dia, para estimativa de produção leiteira em 24 horas, os cordeiros voltaram a mamar após 12 horas. A produção de leite durante o período de amamentação (1 a 60 dias) foi considerada somando-se a diferença de peso dos cordeiros antes e após a mamada nos dois momentos (06h00 e 18h00). Depois da desmama, a produção leiteira foi mensurada diariamente, durante 30 dias, por ordenha manual, às 13h00, realizada por 4 ordenhadores em instalações próprias para este manejo, com fosso e plataforma com canzil para 10 animais. Antes da ordenha eram realizados os procedimentos de pré-dipping com solução de água e cloro a 5%, secagem dos tetos com papel toalha, Teste de Tamis (RADOSTITS et al., 1994) e após a ordenha manual, o pós dipping com iodo glicerinado a 0,1% e pesagem do leite obtido em balança de sensibilidade de 0,010 kg. Análise estatística Considerando o efeito da concentração plasmática do cortisol (AC e BC) e tipo de parto (simples e gemelar) utilizou-se a análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey para comparação de médias (P<0,05). Para os dados de PL, PB, GORD, CMT, CCS, CCS log, PV e GPD de cordeiros foram considerados dois momentos (antes e após a desmama). Já os dados relacionados às ovelhas, foram considerados os momentos ao parto e à desmama. Os valores de CCS, por não apresentarem distribuição normal, foram transformados em logaritmo. Todas as análises foram realizadas com auxilio do 40 programa Statistical Analysis System©, versão 9.1.3 (SAS, 2007), utilizando-se o procedimento PROC MIXED. Resultados e Discussão Concentração plasmática de cortisol Foram observadas diferenças entre os grupos, nas concentrações de cortisol plasmático, apenas no pico da curva de sua liberação, aos 60 minutos após a aplicação de ACTH. No entanto, não foram registradas diferenças para a concentração deste hormônio entre as ovelhas de parto simples e gemelar, conforme Tabela 1. Tabela 1. Concentração plasmática de cortisol (ng/ml), no pico da curva de liberação,