Cliciane Portela Sousa Estudo in vitro da eficácia do gel de EDTA 24% na remoção de "smear layer" e exposição de fibras colágenas da superfície radicular ARARAQUARA 2004 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA Cliciane Portela Sousa Estudo in vitro da eficácia do gel de EDTA 24% na remoção de "smear layer" e exposição de fibras colágenas da superfície radicular ARARAQUARA 2004 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Araraquara, para obtenção do Título de Doutor no programa de Pós- Graduação em Odontologia - Área de PERIODONTIA . Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio. Sousa, Cliciane Portela Estudo in vitro da eficácia do gel de EDTA 24% na remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas da superfície radicular. / Cliciane Portela Sousa. – Araraquara : [s.n.], 2004. 112 f. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia. Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio 1. Ácido edético 2. Camada de esfregaço 3. Colágeno 4. Microscopia eletrônica de varredura I. Título. Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley Cristina Chiusoli Montagnoli CRB 8/5646 Serviço de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP Dados Curriculares Cliciane Portela Sousa Nascimento - 06/01/1973 Filiação - Wilson Barbosa de Sousa Elzeni Portela de Araújo Sousa 1993 - 1996 - Graduação em Odontologia Universidade Estadual da Paraíba - UEPB 1998 - 1999 - Especialização em Periodontia Associação Paulista de Odontologia dos Cirurgiões - Dentista APCD Regional de Araraquara - SP 2000 - 2002 - Mestre em Periodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP 2002 - 2004 - Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Nível Doutorado, Área de Periodontia, Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP. SAUDADES DA INFÂNCIA Saudade - amor de uma vida da vida de uma criança, das horas muito vividas, dos meus dias de infância. Saudade – rua florida a juventude a passar... a minha escola querida... as noites frias... o luar... Ah, saudade, se soubesses... a dor grande que fizeste na ânsia dos dias meus! Ah, minha infância querida, hoje lembrança perdida dos melhores dias meus. Elzeni Portela Dedico este trabalho... Aos meus pais Wilson e Elzeni que a todo o momento apoiaram as minhas decisões. Sei da saudade e preocupação causadas durante o trajeto deste curso de Pós-graduação (Mestrado e Doutorado). Sem o apoio de vocês esta vitória seria ainda mais difícil. Aos meus irmãos Ceciane, Caciane, Vanilson e Nayane por entenderem a minha ausência durante este período. “A distância e a saudade durante este período, me fizeram valorizar ainda mais a convivência em família.” AMO VOCÊS Agradecimentos Especiais Ao Marcio Por participar desta fase da minha carreira acadêmica, me ensinado a não desistir e sempre lutar, mostrando a minha capacidade mediante a cada novo desafio. Obrigada por me fazer seguir adiante. Ao meu fiel companheiro “Alguns anjos não possuem asas, possuem quatro patas, um corpo peludo, nariz de bolinha, orelhas de atenção, olhar de aflição e carência. Apesar dessa aparência, são tão anjos quantos os outros (aqueles com asas) e se dedicam aos seus humanos tanto qualquer anjo costuma dedicar-se. Que bom seria se todos os humanos pudessem ver a humanidade perfeita de um cão.” Agradecimentos Especiais À Professora Adriana Marcantonio Pela capacidade de ouvir e compreender seus alunos. À minha amiga Teresinha Santana Pela sua amizade e apoio. Sua “orientação” que por tantas vezes me fizeram suportar as dificuldades deste trajeto. Além de amiga, você foi meio “mãe” e “professora”. À Elaine Massucato Pelas palavras de apoio e incentivo. Você é um exemplo de pessoa e profissional. À minha grande amiga Adriana Beloti (Dri) A tua amizade significa muito para mim. Obrigada por estar sempre “presente”. "Seja pela amizade, confiança, carinho e companheirismo, vocês contribuíram de forma significativa para esta conquista. Muito Obrigado”. Agradecimentos Especiais Ao meu Orientador Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio Pela orientação segura na realização deste trabalho. A confiança e respeito adquiridos pela nossa convivência antecedentes ao inicio deste curso, permitiram a oportunidade de trabalhar com você nesta linha de pesquisa. Obrigada por me “acolher” como sua orientada. Os meus sinceros agradecimentos... À Faculdade de Odontologia de Araraquara -UNESP na pessoa da Diretora Profa. Dra. Adriana Chiérici Marcantonio e de seu Vice-Diretor Antônio Carlos Martins Sagalla, pela oportunidade de crescimento profissional junto à UNESP. Aos professores da Disciplina de Periodontia da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP: Adriana, Carlinhos, Egbert, Élcio, José Eduardo, Joni, Ricardo e Silvana, pelos conhecimentos transmitidos e pela oportunidade de conviver profissionalmente. Ao coordenador do curso de pós-graduação em Periodontia, professor Joni Augusto Cirelli, pelo profissionalismo e competência. A todos os funcionários do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia, em especial à Regina Lúcia, D. Maria, D. Teresinha, Cláudia e Maria José, pelo carinho e atenção a mim dispensada. Aos funcionários da Pós-graduação em especial à Mara, Rosangela e Silvia pela atenção e simpatia. Aos funcionários da Biblioteca em especial à Maria José e Maria Helena, pela atenção e disponibilidade em nos auxiliar. Ao professor Gibson Luiz Pilatti, pela execução da análise estatística deste trabalho. Aos colegas Andréa Abi Rached Dantas e Luiz Henrique Carvalho Batista pela colaboração para realização da pesquisa. O Sr. Sebastião Dametto, técnico em microscopia eletrônica, do Instituto de Química do Campus de Araraquara, UNESP, pela colaboração na obtenção das fotomicrografias. Aos amigos de turma: Cris, Celso, Esmeralda, Karina, José Marcos, Luis Henrique, Marinella, Ricardo, Rodrigo, Rogério e Teresinha, pelos bons momentos de convivência durante o curso. A todos os amigos do curso de pós-graduação, em especial a Alessandra, Andréia Marcaccini, Daniela Grisi, Letícia, Laura e Roberto pela amizade, convivência e oportunidade de aprendizado. A Bia, pelas suas dicas sugeridas ao início do curso, que mudaram toda a trajetória do mesmo. Ao Jorge Noriega, Esmeralda e Ana Emília pela colaboração em diversas atividades durante este curso. Às todas as companheiras de república Adriana, Helen, Ana Paula, Luana, Fabiana e Daniela pelo apoio e compreensão. À minha amiga e última companheira de república Dani Zandim, pela agradável convivência. À família do Marcio (D. Dalva e S. Carmo) pelo carinho, cuidado e atenção a mim dispensado durante este curso. Aos meus amigos de Araraquara que por meio dos momentos de lazer contribuíram para amenizar a distância e a saudade. Aos pacientes que cederam seus dentes para realização desta pesquisa. A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. A CAPES, pelo apoio financeiro através da Bolsa de Estudos. Enfim, agradeço a DEUS, pois ele é o maior responsável por esta vitória. Sua presença constante foi a maior fonte de força e coragem para enfrentar as dificuldades da vida e seguir em frente. Sumário 1 - Introdução 11 2 - Revisão da literatura 15 3 - Proposição 34 4 - Material e método 35 5 - Resultado 47 6 - Discussão 77 7 - Conclusão 86 8 - Referências 87 Apêndice 99 Resumo 109 Abstract 111 1 - Introdução O principal objetivo da terapia periodontal é eliminar a infecção bacteriana e as endotoxinas presentes na superfície radicular, produzindo uma superfície limpa, a fim de proporcionar um meio biocompatível e apto a receber nova inserção periodontal (POLSON e PROYE, 1983). A biomodificação radicular consiste no processo de remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas promovendo o reparo das estruturas periodontais de suporte (KASSAB e COHEN, 2003). O emprego da biomodificação radicular na terapêutica periodontal é justificado pelo fato de que as superfícies contaminadas pela doença periodontal, podem apresentar-se hipermineralizadas (SELVIG e ZANDER,1962; SELVIG e HALS, 1977) além de conter citotoxinas (ADRIAENS et al., 1988) que não podem ser eliminadas totalmente pela Raspagem e Alisamento Radicular (RAR) (JONES e O’LEARY, 1978). A biomodificação radicular, realizada por meio do condicionamento da superfície radicular, com aplicação de agentes químicos tem por objetivo: 1) remover as endotoxinas (WHIRTLIN e HANCOCK, 1980); 2) promover a desmineralização da superfície radicular, através da remoção de “smear layer” (BRANNSTROM et al., 1980); 3) expor as fibras colágenas da matriz orgânica do cemento ou dentina (CHAVES et al., 1993); 4) favorecer a formação e adesão do coágulo de fibrina (WIKESÖ et al., 1992); 5) inibir a migração apical do epitélio (PITARU et al., 1988); 6) possibilitar a liberação dos fatores de crescimento existente na matriz Introdução 12 orgânica do cemento ou dentina, estimulando a divisão e proliferação das células do ligamento periodontal (LÓPEZ, 1984; FARDAL e LOWENBERG, 1990; BLOMLÖF et al., 1995; ZAMAN et al., 2000). Dentre os agentes químicos utilizados para condicionamento da superfície radicular, pode-se citar: o ácido fosfórico (LEIDAL e ERICKSEN, 1979; HÉRITIER, 1984), o ácido cítrico (REGISTER e BURDICK, 1976), o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (LASHO et al., 1983; BLOMLÖF e LINDSKOG 1995a;b) e o cloridrato de tetraciclina (TROMBELLI et al., 1995). Kassab e Cohen (2003) relatam que o procedimento de biomodificação da superfície radicular tem sido empregado empiricamente como coadjuvante à terapia mecânica no tratamento da doença periodontal desde o século XIX, quando Marshall (1883) utilizou o ácido sulfúrico; Young (1889) usou ácido láctico e Setwart (1899) usou o ácido hidroclorídrico e sulfúrico com o objetivo de desmineralização da superfície radicular. Já no século XX, diversos autores começaram a avaliar a ação destes agentes desmineralizadores sobre a superfície radicular em estudos experimentais. Em 1973, Register avaliou microscopicamente o efeito do condicionamento químico com ácido hidroclorídrico em dentina radicular de animais. Nesta década também começaram a ser desenvolvidos os estudos com o ácido cítrico (REGISTER e Introdução 13 BURDICK,1975; 1976), sendo observado evidências de inserção conjuntiva para o uso deste agente (NALBANDIAN e COTE, 1982). O uso do ácido fósfórico como agente de condicionamento também demonstrou evidências de inserção conjuntiva, com formação de cemento e presença de fibrilas colágenas. No entanto, há relatos na literatura de que o condicionamento com ácido cítrico e ácido fosfórico, devido ao seu baixo pH (pH=1), poderiam interferir no processo de reparação tecidual e causar erosão na superfície dentária (POLSON e PROYE, 1982; BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995b; BLOMLÖF, 1996). O emprego do cloridrato de tetraciclina como agente de condicionamento químico foi proposto por Wikesjö et al. (1986), visto à capacidade deste agente de manter-se aderido à superfície dentinária proporcionando sua atividade antimicrobiana por um período mínimo de 48 horas. A tetraciclina é um agente quelante (BJORVATN, 1983) capaz de remover "smear layer", além produzir uma superfície dentinária que poderia melhorar a inserção periodontal (TERRANOVA et al., 1986). Os estudos com o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em Periodontia (LASHO et al., 1983) começaram a ser desenvolvidos a partir de relatos na literatura da efetividade deste ácido na remoção de “smear layer” da superfície dentinária (BRANNSTROM et al., 1980). Estudos in vitro têm demonstrado que o EDTA promove superior remoção de "smear layer" e exposição das fibras colágenas em relação a outros agentes químicos de condicionamento radicular, como o ácido cítrico e o ácido Introdução 14 fosfórico (LASHO et al., 1983; FARDAL e LOWENBERG, 1990; BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b; BLOMLÖF et al., 1996b). Devido ao seu pH neutro (próximo a 7), o condicionamento com o EDTA, preserva a vitalidade das células remanescentes dos tecidos periodontais, com menores efeitos adversos de necrose dos tecidos adjacentes (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a; BLOMLÖF et al. 1996b). Está estabelecido na literatura que o gel de EDTA 24% é uma concentração que apresenta resultados satisfatórios com relação à remoção de "smear layer" (BLOMLÖF et al., 1996a; BLOMLÖF et al., 1997b; SAMPAIO, 1999; BLOMLÖF et al., 2000a;b) e exposição das fibras colágenas (BERGENHOLTTZ e BABAY, 1998). Contudo, o efeito das diversas marcas comerciais do gel de EDTA 24%, bem como, o tempo e o modo de aplicação destas marcas comerciais devem ainda ser analisadas. Diante disto, observou-se a necessidade de realizar um estudo in vitro no qual sejam avaliadas a eficácia do gel de EDTA 24% de diversas marcas comerciais quanto à remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas da superfície radicular. 2 - Revisão da literatura Lasho et al. (1983) avaliaram o efeito de diferentes agentes de condicionamento radicular em dentes com doença periodontal. As faces proximais de 25 dentes de humanos extraídos foram submetidas à raspagem para remoção de cálculo e placa visível, constituindo o grupo teste. No grupo controle (n = 25), a raspagem foi realizada até total remoção do cemento. Todos os dentes foram cortados em fragmentos e divididos em 5 grupos experimentais com 5 amostras em cada subgrupo, as quais foram condicionadas com as seguintes soluções: 1) ácido cítrico (pH = 1) por 3 minutos; 2) EDTA 15% (pH = 7,7) por 5 minutos; 3) hipoclorito de sódio por 5 minutos + ácido cítrico 5% por 30 segundos; 4) hipoclorito de sódio por 5 minutos; 5) deoxicolato de sódio a 2% + fração IV de Cohn a 5% por 1 minuto. Os resultados mostraram que, apenas os grupos tratados com EDTA 15%, com ácido cítrico e com hipoclorito de sódio foram eficazes na abertura de túbulos dentinários e exposição de fibras colágenas. Fardal e Lowenberg (1990) realizaram um estudo in vitro, no qual foi feita uma comparação dos efeitos de vários agentes de condicionamento químico sobre a migração, adesão e orientação de fibroblastos em dentes saudáveis e dentes comprometidos pela doença periodontal. Os dentes foram previamente submetidos à raspagem e Revisão da literatura 16 alisamento radicular. Após o seccionamento dentário, um grupo de fragmentos de superfícies radiculares recebeu condicionamento com ácido cítrico (pH=1) por 3 minutos e outro grupo de fragmentos foi condicionado com EDTA 18% (pH=7,2) por 30 minutos. Os resultados demonstraram que o condicionamento químico da superfície radicular favoreceu o crescimento celular por meio da migração, inserção dos fibroblastos e que houve, diferenças estatísticas para o modo de ação entre o ácido cítrico e o EDTA. Os autores concluíram que o crescimento celular ocorreu devido à exposição de fibras colágenas e a formação de um ambiente biocompatível. Os efeitos necrosantes dos agentes de condicionamento radicular com baixo e neutro pH sobre a vitalidade celular dos tecidos periodontais foram estudados por Blömlof e Lindskog (1995a). Amostras da mucosa palatina e de superfícies radiculares dos segundos pré-molares de macacos foram condicionadas com ácido cítrico (pH=1), ácido fosfórico 37% (pH=1), EDTA 24% e solução salina (grupo controle) nos tempos de 20 segundos e 3 minutos. Os efeitos necrosantes foram avaliados pela atividade da enzima lactato-dehidrogenase (LDH), enzima envolvida na glicólise anaeróbia. As análises histológicas demonstraram que o grupo condicionado com ácido fosfórico apresentou falhas na reparação periodontal e inserção histológica com menor ganho ósseo. Os grupos condicionados com ácido cítrico e o ácido fosfórico provocaram redução Revisão da literatura 17 na atividade da enzima LDH, resultados contrários aos grupos condicionado com EDTA 24% e grupo controle. Com base nestes resultados, os autores sugerem que o uso de agentes condicionadores com baixo pH pode comprometer vitalidade das células periodontais. Ainda em 1995, Blömlof e Lindskog (b), compararam a textura superficial da dentina após o condicionamento com ácido cítrico, ácido fosfórico e EDTA, avaliando tempo e modo de aplicação destas substâncias. O estudo foi realizado em duas etapas: um estudo in vitro e outro in vivo. O estudo in vitro foi realizado utilizando-se 56 dentes extraídos de macacos adultos. Os dentes foram divididos em 14 grupos, dos quais, 12 grupos foram condicionados com ácido cítrico (pH = 1.0), ácido fosfórico (pH = 1.0) e EDTA 24% (pH = 7.0) por meio de fricção e aplicação tópica nos tempos de 20 segundos e 3 minutos. Dois grupos foram utilizados como controle, onde, em um grupo não foi aplicado nenhum tipo de tratamento e no outro, foi aplicado um tampão fosfato por 3 minutos. O estudo in vivo foi realizado em dentes caninos de macacos. Estes dentes foram extraídos e desgastados com broca. A superfície de dentina exposta foi condicionada com ácido cítrico (pH = 1.0), ácido fosfórico (pH = 1.0) e EDTA 24% (pH = 7.0) por 3 minutos. Os dentes foram irrigados com solução salina e, depois re-implantados. Após o período de cicatrização, os dentes foram extraídos e preparados para avaliação em microscopia eletrônica de varredura. Os resultados do Revisão da literatura 18 estudo in vitro revelaram que os grupos controles apresentaram superfície radicular coberta por "smear layer". Os grupos condicionados com EDTA 24% apresentaram remoção de "smear layer" e exposição de fibras colágenas, independente do modo e do tempo de aplicação, com melhores resultados para o tempo de 3 minutos e para aplicação por fricção. Os grupos condicionados com ácido cítrico e fosfórico também apresentaram remoção de "smear layer", no entanto foi observado que estes agentes dissolviam a matriz do colágeno e promoviam fendas na superfície de dentina. No estudo in vivo foi observado que não houve colonização de células para o grupo controle. Nos grupos condicionados com ácido cítrico e fosfórico foi observada incompatibilidade tecidual, no entanto no grupo condicionado com EDTA 24%, foi observado colonização celular. Com base nestes resultados, os autores puderam concluir que o EDTA 24% apresenta biocompatibilidade sobre os tecidos periodontais por agir seletivamente sobre a dentina exposta e expor fibras colágenas, em relação aos agentes de baixo pH. Blomlöf (1996) avaliou o cemento radicular após condicionamento químico com agentes de baixo e neutro pH. O estudo teve por objetivo comparar o efeito do condicionamento radicular com ácido cítrico (pH = 1), ácido fosfórico 37% (pH = 1) e EDTA 24 % (pH = 7,0); que foram aplicados por meio de fricção com bolas de algodão durante 3 minutos em 16 dentes de macacos e em 16 dentes humanos extraídos por doença Revisão da literatura 19 periodontal. Todos os dentes (humanos e macacos) foram divididos respectivamente em quatro grupos (n= 4), formando um grupo controle, que não recebeu tratamento e três grupos testes, tratados com os agentes já citados. Todos os dentes foram desidratados por imersão em uma série crescente de álcool e posteriormente, montados em bases de alumínio para avaliação em microscopia eletrônica de varredura. Os resultados demonstraram que o condicionamento com EDTA 24% nos grupos de dentes de humanos e de macacos, não só promoveu remoção de componentes minerais, como também preservou a integridade das fibras colágenas expostas. Os grupos tratados com ácido cítrico e fosfórico apresentaram aspecto de erosão na superfície do cemento e dentina, sem exposição das fibras colágenas. Mediante os resultados, os autores citam que se faz necessária remoção do cemento de dentes comprometidos por doença periodontal antes do condicionamento radicular. Procurando avaliar a superioridade do condicionamento com EDTA em relação ao condicionamento com ácido cítrico, Blömlof et al. (1996b), realizaram um estudo comparativo em animais. Foram realizadas cirurgias a retalho para exposição radicular em 32 dentes, de 4 macacos. Lesões de deiscência mediante a remoção de osso alveolar e cemento foram criadas nas raízes dos primeiros pré-molares e molares de cada animal, constituindo dois grupos testes. O tratamento instituído para estes grupos Revisão da literatura 20 foi o condicionamento de ácido cítrico durante 3 minutos, aplicado por meio de fricção com bolinhas de algodão em um quadrante. No quadrante contra-lateral, as raízes foram condicionadas com EDTA 24% da mesma forma, durante 8 minutos. No grupo controle, constituído de raízes de segundos pré-molares e molares superiores, foi feito apenas exposição radicular cirúrgica. A avaliação histomorfométrica mostrou que os dentes condicionados com EDTA 24% apresentaram resultados mais favoráveis em relação aos dentes condicionados com ácido cítrico e ao grupo controle, para os aspectos de: recessão gengival, presença de bolsa periodontal e menor extensão de epitélio juncional longo, levando aos autores concluírem que a exposição da matriz colágena proveniente do condicionamento com EDTA 24% pode melhorar a reparação periodontal, por apresentar pH neutro e induzir menor efeito adverso nos tecidos periodontais adjacentes. Blömlof et al. (1996a) avaliaram a eficácia da aplicação sub- gengival do gel de EDTA 24% para remoção de "smear layer" e exposição das fibras colágenas, em terapia periodontal não cirúrgica. Para tanto, foram utilizados 24 dentes com extração indicada por doença periodontal. Todos os dentes foram submetidos à raspagem e alisamento radicular antes da extração. Estes foram divididos em 4 grupos (n = 6), nos quais foram aplicados os seguintes tratamentos: Grupo 1) apenas RAR + extração; Grupo 2) RAR + extração + imersão em solução de tripsina a Revisão da literatura 21 1%; Grupo 3) RAR+ aplicação do gel de EDTA 24% + extração; Grupo 4) RAR + aplicação do gel de EDTA 24% + extração + imersão em solução de tripsina a 1%. O gel de EDTA 24% foi aplicado por meio de uma seringa durante 2 minutos e em seguida, os dentes foram lavados com solução salina. Após a extração, os dentes foram desidratados por imersão em uma série crescente de álcool e montados em bases de alumínio. A avaliação em microscopia eletrônica de varredura mostrou que o grupo condicionado com EDTA 24% + imersão em solução de tripsina a 1%, apresentou abertura dos túbulos dentinários e exposição das fibras colágenas. Com base nestes resultados os autores concluíram que o gel de EDTA 24% poderia ser usado associado à RAR na terapia periodontal. Blomlöf et al. (1997a) realizaram um estudo in vitro no qual avaliaram se diferentes concentrações de EDTA são eficientes para a remoção de "smear layer" e exposição de fibras colágenas. Doze dentes de humanos extraídos por doença periodontal severa foram divididos em 4 grupos (n = 3). Todas as amostras foram condicionadas durante 2 minutos com as respectivas concentrações de EDTA: Grupo I) EDTA 1.5%; Grupo II) EDTA 5%; Grupo III) EDTA 15% e Grupo IV) EDTA 24%. Em seguida, as amostras foram desidratadas em séries de álcool. As amostras foram montadas em bases de alumínio para análise em microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram diferença Revisão da literatura 22 estatísticamente significante entre os grupos. O grupo IV apresentou maior abertura de túbulos dentinários e presença de fibras colágenas nas regiões peri e intertubulares, levando os autores concluírem que o gel EDTA 24% é eficiente na remoção de "smear layer", bem como exposição das fibras colágenas. Blomlöf et al (1997c) avaliaram o efeito da raspagem sub-gengival com ultra-som associado ao condicionamento com EDTA 24% em um estudo in vitro e in vivo sobre a remoção de "smear layer" e exposição de fibras colágenas. Foram utilizados 24 dentes extraídos por doença periodontal severa para ambos estudos. No estudo in vitro, oito dentes foram divididos em dois grupos: Grupo I) RAR com ultra-som + irrigação com água e Grupo II) RAR com ultra-som + irrigação com EDTA 24%. No estudo in vivo, dezesseis dentes foram divididos em 4 grupos: Grupo I) RAR com ultra-som (ponta convencional)+ irrigação com água; Grupo II) RAR com ultra-som (ponta convencional)+ irrigação com EDTA 24%; Grupo III) RAR com ultra-som (ponta modificada)+ irrigação com água; Grupo IV) RAR com ultra-som (ponta modificada)+ irrigação com EDTA 24%. Após os procedimentos de RAR, os dentes foram extraídos e submetidos à imersão em tripsina 1% por 20 minutos. Todas as amostras foram analisadas em microscopia eletrônica de varredura, sendo constatado uma remoção mais efetiva de “smear layer” quando do emprego da ponta modificada associada ao condicionamento com gel de Revisão da literatura 23 EDTA 24%. O emprego do Ultra-som (ponta convencional) associado ao gel de EDTA 24% promoveu efetiva remoção de “smear layer” somente na região cervical. Com base nestes resultados os autores concluíram ser possível a combinação da RAR e condicionamento químico radicular num só procedimento. A formação e remoção de "smear layer" após diferentes modalidades de RAR, foram avaliadas por Blomlöf et al. (1997b), em 24 dentes extraídos por doença periodontal severa. Os dentes foram divididos em 6 grupos: Grupos 1 e 2 = raspados com ultra-som; Grupos 3 e 4 = raspados com curetas Mc Call 12/13; Grupos 5 e 6 = desgastados com ponta diamantada. Os dentes dos grupos 2, 4 e 6 foram condicionados com gel de EDTA 24% por 2 minutos, e os dentes dos grupos 1, 3 e 5 não receberam tratamento, constituindo os grupos controle. Todos os dentes foram desidratados em séries de álcool e montados em bases de alumínio. Na análise em microscopia eletrônica de varredura, os dentes foram analisados com relação a presença ou ausência de "smear layer" e exposição de fibras colágenas. A abertura de túbulos na superfície dentinária foi o critério de utilizado para avaliar a eficácia de remoção de "smear layer" por tratamento. Os autores constataram que a raspagem radicular resulta na formação de "smear layer", independente do tipo de procedimento mecânico, visto que, não foi observado diferenças com relação à textura da superfície radicular, nem a Revisão da literatura 24 abertura dos túbulos dentinários para os 3 tipos de tratamento. Pequena variação na espessura de “smear layer” foi observada de acordo com a modalidade de tratamento. Fibras colágenas foram observadas em vários graus, de acordo com o tipo de condicionamento químico. Os grupos condicionados com EDTA 24% apresentaram superior remoção de "smear layer" e exposição das fibras colágenas. Mayfield et al. (1998) avaliaram o efeito do condicionamento com gel de EDTA 24% associado a terapia cirúrgica. A amostra era composta de 18 pacientes para os grupos teste e controle, os quais deveriam apresentar sítios com Profundidade a Sondagem > 5mm e sangramento à sondagem, além de defeitos infra-ósseos maior ou igual a 4 mm, sem envolvimento de furca. Os dados dos parâmetros clínicos de Profundidade a Sondagem (PS), Nível de Inserção Clínico (NIC), Sangramento à Sondagem (SS), Recessão Gengival e Profundidade de Sondagem Óssea, coletados através de placa de acrílico, foram mensurados por um único examinador ao exame inicial e 6 meses após a terapia cirúrgica. Após o exame inicial, os pacientes foram submetidos a 3 meses de fase higiênica (instruções sobre higiene + RAR). Na fase cirúrgica, em ambos os grupos, foram realizados o debridamento dos defeitos e raspagem e alisamento radicular. No grupo teste, a superfície radicular foi condicionada com gel de EDTA 24%, aplicado em bolinhas de algodão por 03 minutos. Os resultados mostraram reduções significativas nos Revisão da literatura 25 parâmetros clínicos avaliados, no entanto não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos teste e controle, levando os autores a concluir que o emprego do EDTA 24% na prática cirúrgica é um procedimento questionável havendo necessidade de outros estudos para testar esta hipótese. A textura superficial após o tratamento com diferentes agentes de condicionamento foi avaliada por Bergenholtz e Babay em 1998. As amostras de dentes extraídos foram divididos em 4 grupos que receberam os seguintes tratamentos: Grupo 1) solução salina; Grupo 2) ácido cítrico (pH=1.0); Grupo3) tetraciclina hidroclorada (pH = 1,8); Grupo 4) EDTA 8% (pH = 7.3). Após o condicionamento, realizado por meio de imersão durante 10, 30 e 40 segundos e fricção com bolinhas de algodão por 180 segundos, as amostras foram lavadas com água destilada, desidratadas em séries de álcool e montadas em bases de alumínio para análise em microscopia eletrônica de varredura. Foi observado que o grupo tratado com ácido cítrico removeu "smear layer" em um intertalo de tempo menor de que o EDTA 8% e a tetraciclina. No entanto, a forma de aplicação por "fricção" promoveu o rompimento das fibras colágenas. Os autores sugerem que o modo de aplicação, bem como, o tipo de agente utilizado para condicionamento, afeta de diferentes formas a superfície radicular. Revisão da literatura 26 Em 1999, Sampaio avaliou a eficiência de detergentes e do EDTA para a remoção de "smear layer" de superfícies radiculares submetidas à raspagem e alisamento radicular. Para tanto utilizou amostras obtidas de dentes humanos extraídos, que foram divididas em 6 grupos de acordo com o condicionamento químico: Grupo 1(solução fisiológica); Grupo 2 (detergente lauril sulfato de sódio); Grupo 3 (detergente de mamona); Grupo 4 (Plax); Grupo 5 (EDTA 24%) e Grupo 6 (apenas RAR). Dentro de cada grupo, as amostras foram divididas em subgrupos de acordo com o tempo de aplicação de 1, 2 e 3 minutos e à exceção do Grupo 6, que recebeu apenas a RAR, estas foram condicionadas com a aplicação tópica de bolinhas de algodão. Após a avaliação em microscopia eletrônica de varredura, foi observado que a instrumentação com curetas de Gracey provocou a formação de "smear layer", onde, dentre os agentes utilizados para sua remoção, o EDTA 24% foi o que apresentou os melhores resultados. A remoção de "smear layer" foi parcial pelos detergentes Plax e de mamona e insuficiente pelo detergente de lauril sulfato de sódio. O efeito da aplicação do gel de EDTA em terapia não cirúrgica foi avaliado por Blomlöf et al. (2000a). Foram utilizados 91 pacientes com a presença de 1 sítio interproximal com Profundidade a Sondagem > 5 mm, que foram divididos em Grupo Teste = aplicação de EDTA 24% durante 2 minutos + irrigação com solução salina por 20 segundos e Grupo Controle Revisão da literatura 27 = aplicação de solução salina por 20 segundos. Todos os pacientes receberam instruções de higiene oral e em seguida foram submetidos à RAR. Os parâmetros clínicos periodontais de presença de placa, sangramento à sondagem profundidade de sondagem, bem como nível de inserção clínico, foram registrados ao exame inicial e 6 meses após a RAR. Os resultados mostraram que não houve diferenças estatísticas para os parâmetros periodontais levando os autores a sugerirem a necessidade de realização de mais estudos que justifiquem o condicionamento com EDTA 24% associado a RAR. Neste mesmo ano, Blomlöf et al. (2000b) realizaram outro estudo clínico para avaliar o efeito da aplicação do gel de EDTA em terapia cirúrgica. Neste estudo foram utilizados 68 pacientes, selecionados de acordo com a presença de no mínimo 1 sítio interproximal com Profundidade a Sondagem > 6mm e defeito infra-ósseo de 2 mm mensurados radiograficamente. Dentes com envolvimento de furca, bem como, com presença de lesão endo-periodontal, não foram incluídos no estudo. Todos os sítios foram submetidos a RAR durante terapia cirúrgica e em seguida foram condicionados de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo teste = aplicação com seringa do gel de EDTA 24% por 2 minutos; Grupos controles = aplicação passiva de ácido cítrico ou solução salina por 20 segundos. Os parâmetros clínicos periodontais de presença de placa, sangramento à sondagem profundidade de Revisão da literatura 28 sondagem, bem como nível de inserção clínico, foram registrados ao exame inicial, 3 e 6 meses após o procedimento cirúrgico. Os resultados demonstraram que não houve diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos, para os parâmetros periodontais coletados. Ainda em 2000, Zaman et al. realizaram um estudo in vitro no qual foi avaliadas a aderência e orientação de células do ligamento periodontal sobre a dentina e cemento de superfícies radiculares após o condicionamento com agentes de baixo e neutro pH. Após a RAR, fragmentos obtidos de 5 dentes extraídos por doença periodontal, foram divididos em 4 grupos e submetidos à imersão por 3 minutos em solução de: Grupo 1= ácido cítrico; Grupo 2 = EDTA 24%; Grupo 3 = tetraciclina hidroclorada. O Grupo 4 recebeu somente a RAR. A avaliação foi realizada por meio de microscopia de contraste de fase após o período de 1, 3 e 7 dias. Os resultados mostraram não haver diferenças na aderência e orientação das células do ligamento periodontal entre cemento e dentina em nenhum dos grupos em relação ao grupo que recebeu apenas a RAR. Um estudo in vitro foi realizado por Pillati (2001), com o objetivo de avaliar a eficácia de um gel de EDTA na remoção de "smear layer", avaliando-se fatores como concentração, tempo e modo de aplicação. Um total de 240 amostras foi obtido de 80 dentes humanos extraídos, as Revisão da literatura 29 quais foram divididas em 6 grupos: I) grupo controle (solução fisiológica); II) gel de EDTA 5%; III) gel de EDTA 10%; IV) gel de EDTA 15%; V) gel de EDTA 20% e VI) gel de EDTA 24%. Cada grupo continha 40 amostras, divididas em subgrupos de acordo com o tempo e modo de aplicação. As amostras de cada subgrupo (n= 5), dentro de cada grupo, foram condicionadas nos tempos de 01, 02, 03 minutos e 03 minutos intercalados com irrigação de 10ml de soro fisiológico e nos modos de aplicação passiva (aplicação tópica de bolinhas de algodão) e aplicação ativa (esfregação com pincel pêlo de camelo). Após a análise dos dados obtidos por meio do microscópio eletrônico de varredura, os resultados demonstraram que independente da concentração, modo ou tempo de aplicação, o gel de EDTA promoveu uma eficiente remoção de "smear layer". O gel de EDTA 5% proporcionou uma remoção mais efetiva de "smear layer" com aplicação passiva. O modo de aplicação ativa (exceto para o gel de EDTA 5%) e tempo de 3 minutos mostraram superioridade na remoção de "smear layer", levando os autores a concluírem que o condicionamento químico da superfície radicular com o gel de EDTA com aplicação ativa por 3 minutos, pode favorecer a remoção de "smear layer" produzida durante a raspagem e alisamento radicular. Em 2002, um estudo de metodologia similar à do estudo de Pillati, 2001, foi realizado por Batista, onde foram empregados gel de EDTA nas concentrações de 5%, 10%, 15%, 20% e 24% associados a um detergente tensoativo (Texapon), que tem por finalidade de melhorar a Revisão da literatura 30 capacidade de espalhamento do agente condicionador. Após o condicionamento químico, as amostras foram preparadas para avaliação em microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram que o gel de EDTA - T foi eficiente na remoção de "smear layer". A concentração de EDTA 15% com aplicação passiva apresentou superior remoção em relação às demais concentrações. Para aplicação ativa não houve diferença entre as concentrações. O modo de aplicação ativa e o tempo de 3 minutos mostraram tendência para melhor remoção de "smear layer". Os autores concluíram que o modo de aplicação parece ser o fator fundamental na remoção de "smear layer", pois pode influenciar fatores de concentração e tempo de aplicação do gel de EDTA - T. Em 2003, Sampaio et al. realizaram um estudo no qual foram comparados o efeito da aplicação com gel de EDTA e EDTA - T (Texapon) avaliando-se diferentes concentrações e tempos de aplicação. Neste estudo 220 amostras obtidas de dentes humanos extraídos foram divididas em 3 grupos: Grupo I = controle (n= 20); Grupo II = EDTA e Grupo III = EDTA - T aplicados respectivamente nas concentrações de 5% (n = 20), 15% (n = 20), 20% (n = 20) e 24% (n = 20). As amostras foram condicionadas com bolinhas de algodão nos tempos de 1, 2 e 3 minutos. Após o condicionamento as amostras foram irrigadas com solução salina e submetidas à imersão em solução seriada de álcool. A análise em microscopia eletrônica de varredura relevou que no Grupo I Revisão da literatura 31 (controle) havia presença de "smear layer" em todas as amostras. Nos Grupos II (EDTA) e III (EDTA - T), foi observado remoção de "smear layer" e abertura dos túbulos dentinários. No entanto não houve diferenças estatísticas entre ambos os grupos. Dentro de cada grupo não houve diferença estatística para a concentração do gel. Com relação ao tempo de aplicação, o tempo de 3 minutos apresentou resultados mais satisfatórios em relação aos tempos de 1 e 2 minutos. Os autores concluíram que o gel de EDTA é eficiente na remoção de "smear layer" e que a adição de um detergente (Texapon) não proporciona melhores resultados. Neste mesmo ano, Theodoro (2003), realizou um estudo com objetivo de avaliar a ação do laser de Er:YAG e de Diodo sobre superfícies radiculares , bem como a adesão de elementos sanguíneos nestas superfícies irradiadas. Dentes humanos extraídos por doença periodontal foram submetidos à RAR com cureta de Gracey 5-6. Em seguida, estes dentes foram secionados obtendo-se 120 amostras que foram dividas aleatoriamente em seis grupos (n= 20): Grupo 1 = não recebeu nenhum tratamento (grupo controle); Grupo 2 = aplicação tópica com gel de EDTA 24% ; Grupo 3 = irradiação com laser Er:YAG com 7,6 J/cm2 ; Grupo 4 = irradiação com laser de Er:YAG com 12,9 J/cm2; Grupo 5 = irradiação com laser de diodo de 90 J/cm2 ; Grupo 6 = irradiação com laser de diodo de 108 J/cm2. Após as aplicações dos tratamentos, 10 Revisão da literatura 32 amostras de cada grupo foram submetidas à imersão de tecido sanguíneo periférico humano. Todas as amostras foram analisadas por meio do microscópio eletrônico de varredura e avaliadas através do índice de adesão de elementos sanguíneos e índice de morfologia da superfície radicular. Os resultados com relação à adesão de elementos sanguíneos revelaram que, apesar de Grupo 4 demonstrar maior adesão de elementos sanguíneos que os demais grupos, não houve diferenças estatísticas entre o grupo controle e os grupos tratados com lasers de Er: YAG. O Grupo 2 (EDTA 24%) foi apresentou menor adesão de elementos sanguíneos. Com relação à morfologia da superfície radicular, houve diferenças significantes entre os grupos controles e de lasers de Er:YAG e o Grupo 5. Os autores concluíram que nenhum tratamento proposto aumentou a adesão de elementos sanguíneos de forma significativa; sendo que o EDTA inibiu a adesão do tecido sanguíneo. O laser de Er:YAG (12,9 J/cm2) foi mais efetivo do que o laser de Diodo (90 J/cm2)na adesão, no entanto promoveu alterações na morfologia das superfícies radiculares irradiadas. Em 2004, Leite e Sampaio, analisaram in vitro a ação de agentes condicionantes na adesão de células sanguíneas sobre superfícies radiculares. Amostras obtidas de dentes humanos extraídos por doença periodontal foram divididas em oito grupos: − Grupo 1 = (grupo controle); Revisão da literatura 33 − Grupo 2 = aplicação de ácido cítrico com pincel por 3 minutos; − Grupo 3 = aplicação de EDTA 24% com pincel por 3 minutos; − Grupo 4 = aplicação de EDTA 24% com pincel por 3 minutos + Tetraciclina Hidroclorada (50 mg/ml) com pincel por 3 minutos; − Grupo 5 = aplicação de EDTA 24% com pincel por 3 minutos + Ácido Cítrico com pincel por 3 minutos; − Grupo 6 = aplicação de Ácido Cítrico com pincel por 3 minutos + EDTA 24% com pincel por 3 minutos; − Grupo 7 = aplicação de Tetraciclina Hidroclorada (50 mg/ml) com pincel por 3 minutos + EDTA 24% com pincel por 3 minutos; − Grupo 8 = aplicação de Tetraciclina Hidroclorada (50 mg/ml) com pincel por 3 minutos + Ácido Cítrico com pincel por 3 minutos; Após o condicionamento as amostras foram submetidas à imersão de sangue humano periférico e preparadas para análise em microscopia eletrônica de varredura. As fotomicrografias foram avaliadas pelo Índice de Adesão de Elementos Sanguíneos (THEODORO, 2003). Os resultados revelaram que as aplicações do ácido cítrico (Grupo 2) e de tetraciclina seguida pela aplicação de ácido cítrico (Grupo 8) proporcionaram estatisticamente maior adesão de elemento sangüíneos quando comparado ao grupo controle (Grupo 1). O Grupo 3 (EDTA) e o Grupo 6 (Ácido cítrico+EDTA) demonstraram menor adesão de elementos sangüíneos que o grupo controle. Com base nestes resultados os autores concluíram que o uso do EDTA como agente de condicionamento pode inibir a adesão de elementos sangüíneos. 3 - Proposição O objetivo do presente estudo foi avaliar, por meio da microscopia eletrônica de varredura, a eficácia do condicionamento químico com o gel de EDTA 24% quanto à remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas, avaliando-se diferentes marcas comerciais, tempos e modos de aplicação. 4 - Material e método A presente pesquisa foi desenvolvida na Disciplina de Periodontia do Departamento de Diagnóstico e Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP, com auxílio financeiro CAPES, tendo sido aprovada pelo CEP-FO/CAr. no 218/2002 (Apêndice 1). 4.1 - Coleta dos dentes No presente trabalho, as amostras foram obtidas de 75 dentes de humanos (incisivos, caninos, pré-molares ou molares) extraídos na Clínica de Cirurgia da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP, por motivos de: lesão de cárie extensa (destruição coronária), doença periodontal ou indicação ortodôntica. Foram excluídas as faces dos dentes que não apresentaram intacta junção cemento-esmalte. Os pacientes doadores dos dentes utilizados nesta pesquisa assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Após a extração, os dentes foram mantidos em um recipiente de vidro contendo soro fisiológico com objetivo de não sofrerem processo de ressecamento. Material e método 36 4.2- Obtenção das amostras Para obtenção das amostras os dentes foram preparados por um único pesquisador de acordo com as seguintes etapas: Confecção de dois sulcos paralelos, nas faces livres ou proximais, com auxílio de uma fresa cilindro cônica de número 2135* em alta rotação, sob refrigeração. O primeiro sulco foi feito na junção cemento-esmalte, e o segundo sulco foi a 4mm em sentido apical ao primeiro sulco. O critério de seleção da área de confecção dos sulcos foi a presença de uma face com intacta junção cemento- esmalte, bem como uma face que pudessem produzir maior quantidade ou tamanho das amostras (Figuras 1 e 2). Remoção da camada de cemento na região entre os dois sulcos, com o auxílio da mesma fresa cilindro-cônica (Figura 3). Raspagem e aplainamento radicular, com o auxílio de uma cureta de Gracey 5-6** previamente afiada, na área demarcada (Figura 4). Foram realizados 50 movimentos com os objetivos de: remover o cemento remanescente (COLDIRON et al., 1990; O´LEARY e KAFRAWY, 1983), possibilitar exposição da dentina e dos túbulos dentinários e formar “smear layer” (SAMPAIO, 1999). Sempre que necessário, foi realizada a afiação da cureta em pedra de afiar***. * * KG Sorensen - Indústria e Comércio Ltda. - Barueri - SP - Brasil ** Trinity - Indústria e Comércio Ltda. São Paulo - SP - Brasil *** Pedra Norton - Norton Company Material e método 37 Seccionamento dentário com disco diamantado em baixa rotação. As raízes foram seccionadas transversalmente no primeiro sulco, separando-se a coroa da raiz (Figura 5). Em seguida, foi realizado o seccionamento longitudinal no sentido mesio-distal ou vestíbulo- lingual, até a região do segundo sulco, dividindo-se a amostra em 2 porções (Figura 6). Posteriormente, outro seccionamento transversal foi feito no segundo sulco, obtendo-se as amostras (Figura 7). As amostras obtidas foram de aproximadamente 2mm de largura por 3mm de comprimento (Figura 8). As amostras foram conservadas em um recipiente com soro fisiológico, para evitar ressecamento. Material e método 38 FIGURA 1 - Confecção dos sulcos com fresa FIGURA 2 - Sulcos paralelos. FIGURA 3 - Remoção do cemento FIGURA 4 - Raspagem e aplainamento radicular FIGURA 5 - Corte transversal da coroa FIGURA 6 - Corte longitudinal com disco diamantado FIGURA 7 - Segundo corte transversal para obtenção da amostra FIGURA 8 - Amostra de dentina Material e método 39 4.3 - Distribuição e tratamento das amostras As amostras foram distribuídas ao acaso em cinco grupos, segundo o tipo de solução aplicada sobre a superfície radicular. Cada grupo foi dividido em nove subgrupos, segundo o tempo e o modo de aplicação. Cada subgrupo continha 5 amostras, totalizando 45 amostras em cada grupo. Grupos: Grupo I: Aplicação de Soro Fisiológico (Grupo controle) Grupo II: Aplicação de EDTA 24% (Farmácia Santa Paula*) Grupo III: Aplicação de EDTA – T (Texapon) 24% (Farmácia Santa Paula*) Grupo IV: Aplicação de EDTA 24% (Biora**) Grupo V: Aplicação EDTA 24% (Biodinâmica***) As amostras foram condicionadas nos modos de aplicação: passiva, ativa vigorosa (fricção) e ativa suave (pincel). A aplicação passiva foi realizada com a aplicação tópica de bolinhas de algodão (Figura 9). A aplicação ativa vigorosa foi realizada por meio de fricção de bolinhas de algodão sobre as amostras (Figura 10) e, a aplicação ativa * Farmacêutica Responsável: Elisabeth L.N. Gama Vicentino ** Prefgel - Biora - Suiça *** Biodinâmica Química e Farmacêutica Ltda. - Brasil Material e método 40 suave foi realizada com pincéis de pêlo de Marta n° 0 - 308* (Figura 11). Nos dois primeiros modos de aplicação, as bolinhas de algodão saturadas, com os respectivos produtos de aplicação, foram trocadas a cada 30 segundos. Durante a aplicação, as bolinhas de algodão e as amostras foram estabilizadas com uma pinça clínica**. O estudo constou de 225 amostras, como mostra a tabela abaixo: Tabela 1 - Distribuição das amostras de acordo com a marca comercial, tempo e modo de aplicação Aplicação Passiva Aplicação Ativa vigorosa (fricção) Aplicação Ativa suave (pincel) Total Tempo de aplicação Marca comercial do EDTA 24% 1’ 2’ 3’ 1’ 2’ 3’ 1’ 2’ 3’ I) Controle (Sol. Fisiológica) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 45 II) EDTA (Farmácia Santa Paula) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 45 III) EDTA - T (Farmácia Santa Paula) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 45 IV) EDTA (Biora) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 45 V) EDTA (Biodinâmica) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 45 Total 45 45 45 45 45 45 45 45 45 225 * Condor – Condor S.A São Bento do Sul – SC - Brasil ** Duflex - S.S. Withe Artigos Dentários Ltda - Rio de Janeiro - RJ Material e método 41 As aplicações foram realizadas por um único pesquisador. Um segundo pesquisador foi responsável pelo controle do tempo, utilizando um cronômetro eletrônico*. Após as aplicações, cada amostra foi irrigada com 10 ml de solução fisiológica, com o auxílio de uma seringa descartável** sendo em seguida, armazenada em "cassetes plásticos" e codificadas de acordo com seu respectivo grupo e subgrupo (Figura 12). FIGURA 9 - Aplicação passiva FIGURA 10 - Aplicação ativa vigorosa. FIGURA 11 - Aplicação ativa suave FIGURA 12 - amostras em cassete codificado Em seguida, com o objetivo de evidenciar as possíveis fibras colágenas expostas pelo tratamento da superfície radicular (TAY et al., * Jumbo Display Clock Timer ** Plastipak - BD - Curitiba - PR IV( a) (b) Material e método 42 2000), estes cassetes plásticos devidamente codificados, foram colocados em uma Placa de Petri (Figura 13) e submetidos à imersão em uma série crescente de álcool a 30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100%, durante uma hora em cada concentração, visando atingir o ponto crítico por desidratação das amostras (TAY et al., 2000). Cada cassete recebeu uma identificação alfabética (A, B, C, D, E, F), correspondendo a um respectivo grupo e subgrupo (Figura 14). Posteriormente, amostras foram retiradas destes cassetes plásticos e transportadas para uma placa acrílica de 12 (doze) orifícios dividida em 2 metades. Na primeira metade, cada orifício foi codificado em A, B, C, D, E e F (Figura 15) e continham solução de etanol-hexametildisilazane (HMDS)* e álcool 100% em partes iguais (0,75 ml), onde as amostras permaneceram submersas por 30 minutos. Em seguida, com o auxílio de uma pinça clínica**, as amostras foram transportadas respectivamente para a segunda metade, onde os orifícios estavam codificados em A1, B1, C1 D1, E1 e F1 contendo HMDS puro (1,5 ml), onde permaneceram por mais 10 minutos. O procedimento de manejo do HMDS foi realizado dentro de uma capela com ventilação acionada, utilizando-se uma micropipeta automática (100-1000µL)***, visto que, este é um material tóxico e cancerígeno (Figura 16). * HMDS - Sigma Chemical CO. ** Duflex - S.S. Withe Artigos Dentários Ltda - Rio de Janeiro - RJ *** Boeco, Germany Material e método 43 Posteriormente, as amostras foram novamente armazenadas nos "cassetes plásticos" já codificados de acordo com seu respectivo grupo e subgrupo e colocados em Placas de Petri forradas com papel filtro. Os "cassetes plásticos” foram mantidos neste recipiente por dois dias, para a remoção do excesso de umidade (Figura 17). FIGURA 13 - Desidratação seqüencial FIGURA 14 - Identificação alfabética FIGURA 15 - Amostras em placa de acrílico FIGURA 16 - HMDS FIGURA 17 - Cassete sobre papel filtro FIGURA 18 - Dessecador a vácuo A B C F ED Material e método 44 4.4 -Preparação das amostras para Análise em Microscopia Eletrônica de Varredura As amostras foram coladas em bases metálicas, utilizando uma mistura de grafite em pó com esmalte incolor. Logo após, todas as amostras foram levadas ao dessecador a vácuo, por uma semana para remoção da umidade (Figura 18). Utilizando o aparelho Bal-Tec SCD-050 (com o tempo de 120 segundos), foi realizada a metalização em ouro, com 99,99% de pureza, das amostras (Figura 19), resultando em uma película de 25 nanômetros, processo este que permitiu a leitura da superfície no microscópio eletrônico de varredura. As amostras metalizadas foram levadas a um microscópio eletrônico de varredura*(Figura 20) para obtenção das fotomicrografias**, com aumento de 1500 e 3500 vezes. A região central das amostras foi selecionada, com o intuito de verificar os efeitos das substâncias e suas variáveis, sobre a superfície radicular. * JEOL JSM – T330A ** Filme Neopan SS,120 – Fuji Material e método 45 4.5 - Análise das fotomicrografias As fotomicrografias foram avaliadas por um único examinador cego para os grupos e subgrupos, previamente calibrado. O grau de remoção de “smear layer” foi determinado por um índice proposto por Sampaio (1999) e modificado para aplicação no presente estudo: ÍNDICE DE REMOÇÃO DE "SMEAR LAYER" Grau 1: Superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários sem indício de "smear layer" na abertura dos túbulos e exposição de fibras colágenas da dentina. Grau 2: Superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários sem indício de "smear layer" na abertura dos túbulos. Grau 3: Superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários com indícios de "smear layer" na abertura dos túbulos. Grau 4: Superfície radicular sem "smear layer" com abertura parcial dos túbulos dentinários. Grau 5: Superfície radicular coberta por "smear layer" com aspecto uniforme, apresentando indícios de abertura dos túbulos dentinários. Material e método 46 Grau 6: Superfície radicular coberta por "smear layer" com aspecto uniforme, sem indícios de abertura dos túbulos dentinários. Grau 7: Superfície radicular coberta por "smear layer" com aspecto irregular e presença de estrias e/ou depósitos esparsos. 4.6 - Planejamento estatístico A variável ordinal “grau de smear layer residual” foi avaliada primeiramente levando-se em conta o fator de variação grupo experimental, num total de cinco grupos (solução fisiológica, EDTA 24% Santa Paula, EDTA-T 24% Santa Paula, EDTA 24% Biora e EDTA 24% Biodinâmica), através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. A análise foi feita para cada um dos modos de aplicação separadamente. A seguir, o fator de variação modo de aplicação foi analisado para cada grupo experimental separadamente, utilizando-se o mesmo modelo estatístico. Para todos os testes foi adotado como nível de significância o valor de 0,05. Desta forma, a hipótese de nulidade (Ho), pela qual todos os tratamentos apresentaram igual capacidade de remoção de “smear layer”, foi aceita quando p>0,05 e foi rejeitada quando p≤0,05. Neste caso, a comparação entre os postos médios das amostras foi efetuada através do teste de Dunn, a fim de se detectar entre quais grupos houve diferenças estatisticamente significantes. 5 - Resultado Os índices atribuídos a cada uma das amostras encontram-se no apêndice. Os resultados deste trabalho estão apresentados de maneira separada, ou seja, primeiramente será apresentada a análise descritiva dos achados relativos a cada um dos grupos experimentais e, posteriormente, a análise estatística dos dados coletados. 5.1 - Análise Descritiva A análise descritiva refere-se às características observadas nas fotomicrografias que receberam condicionamento químico após a instrumentação manual. Esta análise está apresentada separadamente para os grupos, de acordo com o modo de aplicação. Grupo I (Solução Fisiológica à 0,9%) Aplicação passiva: foi possível observar que todas as amostras tratadas exibiram presença de "smear layer" com aspecto uniforme ou irregular, sem indícios de abertura dos túbulos dentinários, correspondendo aos graus 6 e 7 (Figuras. 21, 22 e 23). Aplicação ativa vigorosa (fricção): foi observado que 2 das amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer", com abertura parcial dos túbulos dentinários correspondendo ao grau 4, enquanto Resultado 48 que as demais, mostraram-se com presença de "smear layer" (graus 5 e 6)(Figuras 24, 25 e 26). Destas, 7 amostras apresentaram indícios de abertura dos túbulos dentinários (grau 5). Aplicação ativa suave (pincel): todas as amostras apresentaram superfície radicular coberta por "smear layer" (Figuras 27, 28 e 29), sendo 12 amostras com aspecto uniforme, sem indícios de abertura dos túbulos dentinários (grau 6) e 3 amostras com aspecto irregular e presença de depósitos esparsos (grau 7). Resultado 49 Grupo I (Solução Fisiológica à 0,9%) Aplicação passiva FIGURA 19 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 01 minuto - (grau 7) FIGURA 20 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 02 minutos - (grau 6) FIGURA 21 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 03 minutos - (grau 7) Resultado 50 Aplicação ativa vigorosa (fricção) FIGURA 22 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 01 minuto - (grau 5) FIGURA 23 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 02 minutos - (grau 6) FIGURA 24 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 03 minutos - (grau 6) Resultado 51 Aplicação ativa suave (pincel) FIGURA 25 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 01 minuto - (grau 6) FIGURA 26 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 02 minutos - (grau 6) FIGURA 27 - Grupo I (solução fisiológica) – aplicação por 03 minutos - (grau 6) Resultado 52 Grupo II (EDTA 24% - Farmácia Santa Paula) Aplicação passiva: Foi observada ausência de “smear layer" em 14 das 15 amostras (Figuras 30, 31 e 32), sendo que 11 amostras apresentaram abertura total dos túbulos dentinários (grau 3) e 3 amostras apresentaram abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4). Observou-se presença de "smear layer" na superfície radicular de 1 amostra (grau 7). Aplicação ativa vigorosa (fricção): Todas as amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários (Figuras 33, 34 e 35), dentre estas, 4 amostras apresentaram exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). Aplicação ativa suave (pincel): Neste subgrupo, todas as amostras também apresentaram superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários (Figuras 36, 37 e 38), no entanto, 5 amostras apresentaram exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). Resultado 53 Grupo II (EDTA 24% - Farmácia Santa Paula) Aplicação passiva FIGURA 28 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 01 minuto - (grau 3) FIGURA 29 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 02 minutos - (grau 3) FIGURA 30 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 02 minutos - (grau 3) Resultado 54 Aplicação vigorosa ativa (fricção) FIGURA 31 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 01 minuto - (grau 2) FIGURA 32 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 02 minutos (grau 2) FIGURA 33 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 03 minutos (grau 1) Resultado 55 Aplicação vigorosa suave (pincel) FIGURA 34 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 01 minuto (grau 2) FIGURA 35 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 02 minutos (grau 1) FIGURA 36 - Grupo I I (EDTA 24% Santa Paula) – aplicação por 03 minutos (grau 2) Resultado 56 Grupo III (EDTA 24% - T - Farmácia Santa Paula) Aplicação passiva: Foi observada ausência de “smear layer" na superfície radicular, com abertura total dos túbulos dentinários em todas as amostras (Figuras 39, 40 e 41). Dentre essas, 8 amostras apresentaram exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). Aplicação ativa vigorosa (fricção): Todas as amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários (Figuras. 42, 43 e 44), correspondendo aos graus 2 e 3. Aplicação ativa suave (pincel): Todas as amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer" (Figuras 45, 46 e 47). Destas, 13 amostras apresentaram-se com abertura total dos túbulos dentinários (graus 2 e 3), 1 amostra apresentou abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4) e somente 1 amostra apresentou exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1) . Resultado 57 Grupo III (EDTA 24% - T - Farmácia Santa Paula) Aplicação passiva FIGURA 37 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação passiva 01 minuto (grau 1) FIGURA 38 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação passiva 02 minutos (grau 1) FIGURA 39 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação passiva 03 minutos (grau 2) Resultado 58 Aplicação ativa vigorosa (fricção) FIGURA 40 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 01 minuto (grau 2) FIGURA 41 -Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 02 minutos (grau 2) FIGURA 42 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 03 minutos (grau 3) Resultado 59 Aplicação ativa suave (pincel) FIGURA 43 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 01minuto (grau 2) FIGURA 44 -Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 02 minutos (grau 3) FIGURA 45 - Grupo III (EDTA -T 24% Santa Paula) - aplicação por 03 minutos (grau 3) Resultado 60 Grupo IV (EDTA 24% - Biora) Aplicação passiva: Foi observada superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários em 12 amostras (graus 2 e 3). Em 3 amostras foi observado abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4) (Figuras 48, 49 e 50). Aplicação ativa vigorosa (fricção): Foi observado ausência de "smear layer" na superfície radicular em todas as amostras (Figuras 51, 55 e 53). Em 10 amostras observou-se abertura total dos túbulos dentinários (graus 2 e 3) e em 4 amostras observou-se abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4). Apenas 1 amostra apresentou exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). Aplicação ativa suave (pincel): Onze das 15 amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários e exposição de fibras colágenas de dentina (grau 1) (Figuras 54, 55 e 56). Em 2 amostras foi observada apenas superfície radicular sem "smear layer" com abertura total dos túbulos dentinários (grau 3). Resultado 61 Grupo IV (EDTA 24% - Biora) Aplicação passiva FIGURA 46 -Grupo IV (Biora) - aplicação por 01 minuto (grau 4) FIGURA 47 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 02 minutos (grau 3) FIGURA 48 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 03 minutos (grau 2) Resultado 62 Aplicação ativa vigorosa (fricção) FIGURA 49 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 01 minuto (grau 3) FIGURA 50 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 02 minutos (grau 3) FIGURA 51 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 03 minutos (grau 2) Resultado 63 Aplicação ativa suave (pincel) FIGURA 52 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 01 minuto (grau 1) FIGURA 53 - Grupo IV (Biora) - aplicação por 02 minutos (grau 1) FIGURA 54 -Grupo IV (Biora) - aplicação por 03 minutos (grau 1) Resultado 64 Grupo V (EDTA 24% - Biodinâmica) Aplicação passiva: Foi observada ausência de "smear layer" na superfície radicular em 8 amostras, sendo que 4 destas apresentavam abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4) (Figuras 57, 58 e 59). Em 6 amostras foram observados a presença de “smear layer” com indícios de abertura dos túbulos dentinários e em 1 amostra foi observada presença de “smear layer” com presença de depósitos esparsos. Aplicação ativa vigorosa (fricção): neste subgrupo, onze amostras apresentaram superfície radicular sem "smear layer" (Figuras 60, 61 e 62). Destas, oito amostras apresentaram abertura total dos túbulos dentinários (graus 2 e 3), 2 apresentaram abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4) e 1 amostra apresentou exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). Em 4 amostras, foram observados presença de "smear layer" com aspecto uniforme e indícios de abertura dos túbulos dentinários. Aplicação ativa suave (pincel): Em 14 amostras foi observado ausência de "smear layer" na superfície radicular (Figuras. 63, 64 e 65), sendo que 3 amostras apresentaram abertura parcial dos túbulos dentinários (grau 4) e 2 amostras apresentou exposição de fibras colágenas da dentina (grau 1). A presença de "smear layer" com aspecto uniforme na superfície radicular foi encontrada em 1 amostra (grau 5). Resultado 65 Grupo V (EDTA 24% - Biodinâmica) Aplicação passiva FIGURA 55 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 01 minuto (grau 5) FIGURA 56 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 02 minutos (grau 4) FIGURA 57 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 03 minutos (grau 4) Resultado 66 Aplicação ativa vigorosa (fricção) FIGURA 58 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 01 minuto (grau 5) FIGURA 59 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 02 minutos (grau 3) FIGURA 60 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 02 minutos (grau 3) Resultado 67 Aplicação ativa suave (pincel) FIGURA 61 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 01 minuto (grau 4) FIGURA 62 - Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 02 minutos (grau 3) FIGURA 63: Grupo V (Biodinâmica) - aplicação por 03 minutos (grau 3) Resultado 68 5.2 - Análise Estatística Na Tabela 2 pode-se observar as hipóteses relativas ao grupo experimental quando analisadas todas as amostras em conjunto (aplicação passiva, aplicação ativa vigorosa (fricção) e aplicação ativa suave (pincel)). O emprego do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou num valor de H = 125,83, o qual foi significante e que a ele correspondeu um valor de p< 0,0001 com 4 graus de liberdade. Assim Ho pelo qual todos os grupos experimentais proporcionaram igual remoção de “smear layer” foi rejeitada. A comparação entre postos médios, das amostras demonstrou que os espécimes do grupo controle exibiram grau de “smear layer” residual estatisticamente superior aos demais grupos. Além disso, o grupo Biodinâmica exibiu valores de “smear layer” estatisticamente superior aos dos grupos II, III e IV. Não houve diferenças estatísticas entre os demais grupos testados. Tabela 2 - Freqüência, mediana e posto médio para o grau de “smear layer” residual segundo o grupo experimental Grupo experimental n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios* Solução fisiológica 45 6,0 199,33 C EDTA 24% - Santa Paula 45 2,0 80,05 A EDTA-T 24% - Santa Paula 45 2,0 70,74 A EDTA 24% - Biora 45 3,0 85,20 A EDTA 24% - Biodinâmica 45 3,0 129,60 B *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre si. Resultado 69 O Grupo I (Solução Fisiológica) não apresentou amostras representativas dos graus 1, 2 e 3, conforme pode ser observado no Gráfico 1. O grupo Biodinâmica apresentou as menores porcentagens para os graus 1 e 2. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% So l. F isi ol. Sa nta Pa ula Sa nta Pa ula - T Bi or a Grupos Grau 7 Grau 6 Grau 5 Grau 4 Grau 3 Grau 2 Grau 1 GRÁFICO 1 - Distribuição das freqüências dos índices de "smear layer" para os grupos experimentais Na Tabela 3 observa-se o resultado da análise relativa ao tempo de aplicação. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou em um valor de H = 0.22, não significante porque a ele correspondeu um valor de p = 0,8952 com 2 graus de liberdade. Desta forma, não houve diferenças estatisticamente significantes entre os diferentes tempos de aplicação, quanto à presença de "smear layer" residual. Resultado 70 Tabela 3 - Frequência, mediana e posto médio segundo tempo de aplicação Tempo de Aplicação n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios 1’ 75 3,0 114,31 A 2’ 75 3,0 110,17 A 3’ 75 3,0 114,52 A *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre si. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 min 2 min 3 min Grau 7 Grau 6 Grau 5 Grau 4 Grau 3 Grau 2 Grau 1 GRÁFICO 2 - Distribuição de freqüência dos índices de "smear layer" para o tempo de aplicação Na Tabela 4 observa-se o resultado da análise relativa ao modo de aplicação. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou em um valor de H=7,95, significante porque ele correspondeu um valor de p = 0,018 com 2 graus de liberdade. Desta forma, houve diferenças estatisticamente significantes entre os modos de aplicação passiva e ativa Resultado 71 suave (pincel) (p<0,05), sendo que o modo de aplicação ativa suave (pincel) resultou em menor quantidade de "smear layer" residual em comparação ao modo de aplicação passiva. Tabela 4 - Freqüência, mediana e posto médio segundo o modo de aplicação Modo de Aplicação n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios Aplicação passiva 75 3,0 129,2 B Aplicação ativa vigorosa (fricção) 75 3,0 109,0 AB Aplicação ativa suave (pincel) 75 3,0 100,7 A *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre si. 0% 20% 40% 60% 80% 100% Passiva Ativa vigorosa (fricção) Ativa suave (pincel) Grau 7 Grau 6 Grau 5 Grau 4 Grau 3 Grau 2 Grau 1 GRÁFICO 3 - Distribuição de freqüência dos índices de "smear layer" para o modo de aplicação Resultado 72 Na Tabela 5 pode-se observar a hipótese relativa ao grupo experimental quando analisadas apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação passiva. O emprego do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou em um valor de H = 55.90, o qual foi significante porque a ele correspondeu um valor de p<0.0001, com 4 graus de liberdade. Assim, Ho, pela qual todos os grupos experimentais proporcionaram igual remoção de “smear layer” quando aplicadas passivamente, foi rejeitada. A comparação entre os postos médios das amostras demonstrou que os espécimes do grupo controle exibiram grau de "smear layer" residual estatisticamente superior aos demais grupos. Além disso, o grupo EDTA-T 24% - Santa Paula apresentou "smear layer" residual estatisticamente inferior aos grupos EDTA 24% Santa Paula e EDTA 24% Biodinâminca. Não houve diferença estatisticamente significante entre os demais grupos avaliados. Tabela 5 – Freqüência, mediana e posto médio segundo grupo experimental, utilizando-se apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação passiva Grupo experimental n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios* Solução fisiológica 15 7,0 66,60 C EDTA 24% - Santa Paula 15 3,0 36,90 B EDTA-T 24% - Santa Paula 15 1,0 11,20 A EDTA 24% - Biora 15 3,0 28,63 AB EDTA 24% - Biodinâmica 15 4,0 46,66 BC *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre os postos médios. Resultado 73 Ao se analisar a hipótese relativa ao grupo experimental, utilizando- se apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação ativa vigorosa (fricção), o emprego do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou em um valor de H = 44.37, o qual foi significante porque a ele correspondeu um valor de p<0.0001, com 4 graus de liberdade. Assim, Ho, pela qual todos os grupos experimentais proporcionariam igual remoção de “smear layer” quando aplicadas por fricção, foi rejeitada. A comparação entre os postos médios das amostras demonstrou que os espécimes do grupo controle exibiram grau de "smear layer" residual estatisticamente superior aos demais grupos. Além disso, O grupo que empregou EDTA 24% Santa Paula apresentou grau de "smear layer" residual estatisticamente inferior ao do grupo EDTA 24% Biodinâmica, não havendo diferença estatisticamente significante entre os demais grupos testados (Tabela 6). Tabela 6 – Frequência, mediana e posto médio segundo concentração, utilizando-se apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação vigorosa (fricção) Grupo experimental n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios* Solução fisiológica 15 5,0 66,13 C EDTA 24% - Santa Paula 15 2,0 18,53 A EDTA-T 24% - Santa Paula 15 2,0 26,80 AB EDTA 24% - Biora 15 3,0 35,56 AB EDTA 24% - Biodinâmica 15 3,0 42,96 B *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre os postos médios. Resultado 74 Na Tabela 7 pode-se observar a hipótese relativa ao grupo experimental quando analisadas apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação ativa suave (pincel). O emprego do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis resultou em um valor de H = 46.85, o qual foi significante porque a ele correspondeu um valor de p<0.0001, com 4 graus de liberdade. Assim, Ho, pela qual todos os grupos experimentais proporcionariam igual remoção de “smear layer” quando aplicadas com pincel, foi rejeitada. A comparação entre os postos médios das amostras demonstrou que os espécimes do grupo controle exibiram grau de "smear layer" residual estatisticamente superior aos demais grupos, sem haver diferença estatisticamente significante entre os demais grupos testados. Tabela 7 – Frequência, mediana e posto médio segundo concentração, utilizando-se apenas as amostras submetidas ao modo de aplicação ativa suave (pincel) Grupo experimental n Mediana Posto médio Comparação entre postos médios* Solução fisiológica 15 6,0 68,00 B EDTA 24% - Santa Paula 15 2,0 24,40 A EDTA-T 24% - Santa Paula 15 2,0 34,16 A EDTA 24% - Biora 15 1,0 20,83 A EDTA 24% - Biodinâmica 15 3,0 42,60 A *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre os postos médios. Resultado 75 Na Tabela 8 observam-se os resultados da aplicação do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e da comparação entre os postos médios (Teste de Dunn) para avaliação da influência do fator modo de aplicação dentro de cada grupo experimental. No grupo Solução Fisiológica, os espécimes tratados com fricção exibiram um grau de "smear layer" residual estatisticamente inferior em relação àqueles tratados com aplicação passiva ou com pincel. Para o grupo EDTA 24% Santa Paula, ao modo de aplicação passiva resultou em valores estatisticamente superiores de "smear layer" em relação aos modos de aplicação por fricção e com pincel. Por outro lado, no grupo EDTA-T 24% Santa Paula, o grau de "smear layer" residual foi estatisticamente superior para os modos de aplicação por fricção e com pincel, em comparação à aplicação passiva. Ao analisar-se o grupo EDTA 24% Biora, o modo de aplicação ativa vigorosa (pincel) resultou em menor grau de "smear layer" residual do que os outros modos de aplicação. Por fim, para o grupo EDTA 24% Biodinâmica, o modo de aplicação com pincel mostrou-se estatisticamente superior na remoção de "smear layer" em comparação com o modo de aplicação passiva, não havendo diferenças entre a aplicação passiva e a aplicação por fricção, e entre esta e a aplicação com pincel (Tabela 8). Resultado 76 Tabela 8 – Frequência, mediana, postos médios e valores de H (Kruskal- Wallis) e valores de p segundo modo de aplicação dentro de cada concentração testada Grupo Experimental Forma de Aplicação n Mediana Postos Médios Valor de H (valor de p) Comparação entre os postos médios Passiva 15 7,0 32,3 B Fricção 15 5,0 11,6 A Solução Fisiológica Pincel 15 6,0 25,1 23,25 B Passiva 15 3,0 35,8 B Fricção 15 2,0 17,0 A EDTA 24% - Santa Paula Pincel 15 2,0 16,2 23,74 A Passiva 15 1,0 16,2 A Fricção 15 2,0 26,0 B EDTA-T 24% - Santa Paula Pincel 15 2,0 26,8 6,94 B Passiva 15 2,0 27,3 B Fricção 15 1,0 27,3 B EDTA 24% - Biora Pincel 15 1,0 14,3 10,52 A Passiva 15 2,0 29,7 B Fricção 15 1,0 21,2 AB EDTA 24% - Biodinâmica Pincel 15 1,0 17,9 7,05 A *Grupos com letras iguais sem diferença estatisticamente significante entre si. 6 – Discussão A doença periodontal tem como fator etiológico principal a placa bacteriana. As superfícies radiculares contaminadas pela placa bacteriana abrigam bactérias e endotoxinas (componentes da parede celular de bactérias gram negativas) (ADRIAENS et al., 1988). A ação direta dos produtos bacterianos sobre os tecidos periodontais acaba por ativar a resposta inflamatória do hospedeiro, com perda de inserção de fibras colágenas (SELVIG, 1969) levando assim a uma contribuição indireta para a destruição dos tecidos periodontais (AAP,1999). A adequada remoção de placa bacteriana e de substâncias tóxicas da superfície radicular contaminada parece ser essencial à regeneração periodontal (WIRTHLIN, 1981), visto que, as toxinas bacterianas penetram no interior do cemento radicular contaminando-o (FINE et al.,1992; DALY et al., 1982). Segundo alguns autores não é necessária a remoção de excessiva quantidade de cemento para obter a eliminação das endotoxinas das superfícies radiculares expostas à doença periodontal, visto que apenas a eliminação dos depósitos de bactérias da superfície radicular seria suficiente para o restabelecimento da saúde periodontal (HUGUES e SMALES, 1986; NYMAN et al., 1986). A Raspagem e Aplainamento Radicular (RAR) são o principal método mecânico de descontaminação radicular, pois tem como objetivo a remoção de depósitos bacterianos e de endotoxinas da superfície Discussão 78 radicular, proporcionando biocompatibilidade à superfície radicular e assim, tornado-as aptas a receber nova inserção periodontal (BIAGGNI et al., 1998). No entanto, este procedimento periodontal resulta na formação de “smear layer” (EICK et al., 1970; JONES et al., 1972; PASHLEY, 1984). O “smear layer” é uma camada de debris composto de tecido calcificado inorgânico e material orgânico (processos odontoblásticos, bactérias, toxinas bacterianas e células sangüíneas) (SAMPAIO, 1999). A presença de “smear layer” sobre a superfície radicular pode dificultar a adesão de fibroblastos e inserção conjuntiva, o que retarda o processo de regeneração periodontal (NALBANDIAN e COTE 1982; POLSON et al., 1984), além de obliterar parcial ou totalmente os túbulos dentinários. Estudos sugerem que tanto o “smear layer”, quanto o cemento contaminado trazem efeitos negativos aos tecidos periodontais, inibindo a migração celular e a formação de uma nova inserção (BOYKO et al.,1980; POLSON et al. 1984). Os agentes empregados para o condicionamento químico têm por função a eliminação do material citotóxico da superfície radicular (WHIRTLIN e HANCOCK, 1980); limpeza da dentina exposta e descalcificação plena da superfície radicular (BRANNSTROM et al., 1980), expondo a matriz colágena do cemento ou dentina (CHAVES et al., 1993), que possibilita maior adesão de fibrina à superfície radicular (WIKESJO et al., 1992). Discussão 79 É sabido que a presença de uma rede inicial de fibrina é considerada um precursor para formação de inserção conjuntiva (POLSON e PROYE, 1983). A matriz extracelular, especificamente o colágeno é um pré-requisito essencial para adesão celular (McCARTHY e TURLEY, 1993). Deste modo, a exposição das fibras colágenas pelo condicionamento com EDTA sobre a superfície de dentina, possibilitaria adesão e proliferação dos fibroblastos (FARDAL e LOWENBERG, 1990) favorecendo o processo de regeneração periodontal com a obtenção de inserção conjuntiva (POLSON e PROYE, 1983). Blomlöf e Lindskog, 1995b citam que o EDTA é uma substância de pH neutro que em meio aquoso apresenta-se como um quelante divalente de Ca2+, Mg2+, Fe2+ e Pb2+. Esta substância é utilizada em soluções de infusão para desinfecção e como anticoagulantes em uso laboratorial, pois apresenta a capacidade de remover íons cálcio, podendo inibir o processo de coagulação do sangue (McSHINE et al.,1991). Dentre as vantagens do condicionamento com o gel de EDTA pode-se citar: 1) apresentar pH neutro, ocasionando menores efeitos adversos de necrose dos tecidos adjacentes (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b); 2) promover superior remoção de “smear layer” (BLOMLÖF, 1996; BLOMLÖF et al. 1996b; BLOMLÖF et al., 1997b); 3) promover superior exposição de fibras colágenas (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b); 4) preservar as fibras colágenas expostas (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a; BLOMLÖF, 1996; BLOMLÖF et al., 1997a;b;c). Discussão 80 Em estudos comparativos entre o gel de EDTA e outros agentes de condicionamento, foi constatada que o EDTA promove superior remoção de “smear layer” do que o ácido cítrico (LASHO et al., 1983; FARDAL e LOWENBERG, 1990; BLOMLÖF et al. 1996b) e o ácido fosfórico (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b; BLOMLÖF, 1996), sendo ainda observado que estes agentes podem promover dissolução da matriz de colágeno (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995b), causar erosões na superfície da dentina (BLOMLÖF, 1996), além de causar reações de necrose nos tecidos adjacentes, devido ao baixo pH destes (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b; BLOMLÖF, 1996; BLOMLÖF et al, 1996b). O gel de EDTA 24% tem sido amplamente estudado, tanto em estudos in vitro (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b; BLOMLÖF, 1996; BLOMLÖF et al. 1996b; SAMPAIO, 1999; ZAMAN et al., 2000; PILATTI, 2001; BATISTA, 2002; SAMPAIO et al., 2003) como em estudos in vivo (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995a;b; BLOMLÖF et al. 1996a, MAYFILED et al., 1998; BLOMLÖF, 2000 a;b;). Nos estudos in vitro, ficaram estabelecidas a efetividade deste agente na remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas. Os estudos in vivo, por sua vez apresentam resultados controversos, visto que alguns autores recomendam o uso do EDTA associado à terapia mecânica (BLOMLÖF et al. 1996b; BLOMLÖF et al. 1997c) e outros autores sugeriram a necessidade de realização de mais trabalhos científicos que possam Discussão 81 comprovar a eficácia deste agente como meio coadjuvante à terapia mecânica (MAYFILED et al., 1998; BLOMLÖF, 2000a). Em vista da concordância de diversos autores nos estudos in vitro quanto à efetividade do gel de EDTA na concentração de 24%, o presente estudo foi realizado com objetivo de avaliar algumas marcas comerciais encontradas no mercado, analisando as variáveis de “tempos e modos de aplicação”. Foram avaliadas as marcas comerciais: EDTA 24% e EDTA – T (Texapon) 24% manipulados em Farmácia Especializada*, Biora e Biodinâmica. Quando da avaliação do grau de “smear layer” residual segundo o grupo experimental avaliando-se todas as amostras em conjunto, independente do modo de aplicação, os resultados deste estudo demonstraram o grupo relativo à marca comercial Biodinâmica promoveu inferior remoção de "smear layer" em relação aos outros agentes testados (Tabela 2; Gráfico 1). A justificativa para a avaliação relativa às variáveis “tempos e modos de aplicação” deve-se ao fato de que estas são dependentes dos tipos de agentes, bem como da concentração utilizada, portanto a determinação dos “tempos e modos de aplicação” ideais torna-se fundamental para o adequado uso destes agentes condicionadores. Há na literatura relatos de que o tempo de 2 minutos seria satisfatório para remoção de “smear layer” (BLOMLÖF, 1996; BLOMLÖF et al, 1996a; BLOMLÖF et al, 1997a;b), outros estudos, porém relatam * Farmácia Santa Paula Discussão 82 que o tempo de 3 minutos seria mais eficiente (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995b; BERGENHOLTZ e BABAY, 1998; PILATTI, 2001; SAMPAIO et al., 2003). Neste estudo, as amostras foram condicionadas nos tempos de 1, 2 e 3 minutos, intercalados com irrigação de soro fisiológico (10ml). A análise estatística revelou que todos os tempos de aplicação promoveram eficiente remoção de “smear layer”, pois não houve diferenças estatísticas (p = 0,8952) entre os tempos testados (Tabela 3), resultado este semelhante aos estudos de Sampaio (1999) e Batista (2002), no entanto nestes estudos, os autores observaram uma tendência de melhor desempenho do EDTA para o tempo de 3 minutos. A variável “modo de aplicação” para o EDTA 24%, tem sido avaliada nos modos de: 1) imersão (ZAMAN et al., 2000); 2) irrigação (BLOMLÖF et al. 1996a; BLOMLÖF et al., 2000a;b), 3) aplicação ativa pela fricção vigorosa com bolinhas de algodão (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995b; BLOMLÖF, 1996; BERGENHOLTZ e BABAY, 1998); 4) aplicação passiva pela aplicação tópica com bolinhas de algodão (SAMPAIO, 1999; PILATTI, 2001; BATISTA, 2002; SAMPAIO et al., 2003) e 5) aplicação ativa pela fricção suave com pincel (PILATTI, 2001; BATISTA, 2002; SAMPAIO et al., 2003). Estudos realizados com gel de EDTA 24% revelaram que os modos de aplicação ativa e passiva foram eficientes na remoção de “smear layer” (BLOMLÖF e LINDSKOG, 1995b), no entanto, Bergenholtz e Babay (1998) verificaram que o condicionamento com EDTA 8%, Discussão 83 tetraciclina e ácido cítrico pela fricção vigorosa com bolinhas de algodão, provocou rompimento das fibras colágenas. O modo de aplicação ativa suave (pincel), tem demonstrado ser o mais efetivo na remoção de “smear layer”, pois apresentaria a vantagem de não causar os efeitos indesejáveis até então citados para a aplicação ativa vigorosa (fricção com bolinhas de algodão) (PILATTI, 2001; BATISTA, 2002; SAMPAIO et al., 2003). Os resultados deste estudo corroboram os estudos de Pilatti (2001); Batista (2002) e Sampaio et al. (2003), pois foi observado que o modo de aplicação ativa suave (pincel), resultou em menor quantidade de "smear layer" residual em comparação ao modo de aplicação passiva (p = 0,018). No entanto, não foi observada diferença estatística entre este e o modo de aplicação ativa vigorosa (Tabela 4), sendo os respectivos postos médio de 100,7 e 109, 0. Quando da avaliação individual dos três modos de aplicação (passiva, ativa vigorosa e ativa suave) relativos a cada grupo experimental, foi constatado que, o grupo relativo à marca comercial EDTA-T (Farmácia Santa Paula) aplicado no modo passivo apresentou tendência de melhor desempenho (posto médio = 11,20). Isto pode ser explicado pela adição do detergente tensoativo propiciando a efetividade do gel de EDTA 24%. Contudo, não foi observada diferença estatística entre este e o grupo relativo à marca comercial Biora. Foram observados também que não houve diferença estatística entre o grupo controle Discussão 84 (solução fisiológica) e o grupo condicionado com a marca comercial Biodinâmica (Tabela 5). Para o modo de aplicação ativa vigorosa (fricção), todos os grupos experimentais foram capazes de promover superior remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas em relação ao grupo controle. Todavia, o grupo relativo à marca comercial EDTA (Farmácia Santa Paula) apresentou uma tendência de melhor remoção de "smear layer", mas também, não foi observada diferença estatística entre este e os grupos relativos às marca comerciais EDTA – T (Farmácia Santa Paula) e Biora (Tabela 6). Para o modo de aplicação ativa suave (pincel), não houve diferenças estatísticas entre os grupos experimentais, sendo todos estes superiores ao grupo controle (Tabela 7). Em todas as avaliações relativas ao modo de aplicação foi observado que o grupo relativo à marca comercial Biodinâmica apresentou o pior desempenho (Tabelas 5, 6 e 7). Conforme discutido anteriormente, verificou-se que a variável “tempo de aplicação” para as marcas comerciais de EDTA 24% testadas, não apresentou influência sobre o condicionamento da superfície radicular. Por sua vez a variável “modo de aplicação”, além de apresentar- se com diferenças estatísticas, mostrou influenciar de forma diferente para cada marca comercial. Frente a estes resultados, foi avaliada a influência da variável “modo de aplicação” dentro de cada grupo experimental por meio dos testes não paramétrico de Kruskal-Wallis e teste de Dunn. Discussão 85 Analisando a Tabela 8, constatou-se que dentro de cada grupo experimental há um modo de aplicação que se mostra mais efetivo, apresentado o menor posto médio. Dentre os grupos experimentais, o grupo relativo à marca comercial Biora aplicado no modo ativo suave (pincel), apresentou a tendência de melhor remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas em relação aos outros grupos experimentais. Este estudo in vitro deixou claro que o condicionamento da superfície radicular com gel de EDTA 24% é eficiente na remoção de “smear layer” e exposição de fibras colágenas, podendo trazer benefícios ao processo de regeneração periodontal. No entanto, vale ressaltar que estudos in vivo ainda não demonstraram vantagens adicionais do uso deste agente condicionador em terapias básicas e cirúrgicas (MAYFILED et al.;1998; BLOMLÖF et al 2000a;b). Provavelmente isto se deve à dificuldade de adesão de elementos sanguíneos como foi observado por Theodoro (2003) e Leite e Sampaio (2004), justificando ineficácia do EDTA como meio auxiliar ao tratamento periodontal destes estudos clínicos. Diante disto, fica evidente a necessidade de realização de mais estudos in vitro e in vivo, avaliando a capacidade de adesão de elementos sanguíneos, para que se possa analisar a viabilidade deste agente condicionador para uso clínico. 7 - Conclusão Mediante a metodologia empregada, concluiu-se que: Todas as marcas comerciais testadas do gel de EDTA 24% foram eficientes na remoção de “smear layer“ e exposição de fibras colágenas. O tempo de aplicação destas marcas comerciais não exerceu influência sobre o condicionamento da superfície radicular. Os modos de aplicação ativa vigorosa (fricção) e ativa suave (pincel) foram efetivos na remoção de “smear layer“ e exposição de fibras colágenas. A marca comercial Biodinâmica promoveu inferior remoção de “smear layer“ e exposição de fibras colágenas em relação às outras marcas comerciais testadas. 8 - Referências* ADRIAENS, P. A. et al. Ultrastructural observations of bacterial invasion in cementum and radicular dentin of periodontally diseased human teeth. J. Periodontol.,Chicago, v.59, n. 8, p. 493-503, Aug.1988. AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY REPORTS. The pathogenesis of periodontal disease. J. Periodontol., Chicago, v.70, p. 457-470, 1999. BATISTA, L.H.C. Estudo in vitro da eficácia de um gel de EDTA - T na remoção da "smear layer" da superfície radicular. 2002. 62 f. Dissertação (Mestrado em Periodontia) - Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araraquara. BERGENHOLTZ, A.; BABAY, N. 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