UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU CAMPANHA DE VACINAÇÃO CONTRA CINOMOSE COMO FERRAMENTA DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA, RESPOSTA IMUNE HUMORAL PARA PARVOVIRUS CANINO E EVENTOS ADVERSOS PÓS-VACINAIS EM CÃES NO DISTRITO DE RUBIÃO JÚNIOR, BOTUCATU- SP. CAMILA FERNANDA DOS SANTOS SANTANA Botucatu - SP Junho de 2018. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU CAMPANHA DE VACINAÇÃO CONTRA CINOMOSE COMO FERRAMENTA DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA, RESPOSTA IMUNE HUMORAL PARA PARVOVIRUS CANINO E EVENTOS ADVERSOS PÓS-VACINAIS EM CÃES NO DISTRITO DE RUBIÃO JÚNIOR, BOTUCATU- SP. CAMILA FERNANDA DOS SANTOS SANTANA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária na FMVZ – UNESP para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Prof.ª Titular Jane Megid Botucatu - SP Junho de 2018. ii Santana, Camila Fernanda dos Santos. Campanha de vacinação contra cinomose como ferramenta de vigilância epidemiológica, resposta imune humoral para parvovirus canino e eventos adversos pós-vacinais em cães no Distrito de Rubião Júnior, Botucatu- SP / Camila Fernanda dos Santos Santana. - Botucatu, 2018 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Jane Megid Capes: 50500007 1. Epidemiologia. 2. Doenças transmissíveis. 3. Saúde pública. 4. Medicina veterinária. 5. Cães. Palavras-chave: Doenças infecciosas em cães; Epidemiologia; FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: LUCIANA PIZZANI-CRB 8/6772 iii Nome do autor: Camila Fernanda dos Santos Santana Título: CAMPANHA DE VACINAÇÃO CONTRA CINOMOSE COMO FERRAMENTA DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA, RESPOSTA IMUNE HUMORAL PARA PARVOVIRUS CANINO E EVENTOS ADVERSOS PÓS VACINAIS EM CÃES NO DISTRITO DE RUBIÃO JÚNIOR, BOTUCATU- SP. COMISSÃO EXAMINADORA __________________________ Prof.ª Titular Jane Megid Presidente e Orientadora Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ- UNESP- Botucatu __________________________ Prof. Adj. Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza Membro Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem FMB- UNESP- Botucatu __________________________ Prof.ª Ass. Dr. José Carlos de Figueiredo Pantoja Membro Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ- UNESP- Botucatu iv __________________________ Prof. Ass. Dr. Cassiano Victória Suplente Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ- UNESP- Botucatu __________________________ Prof. Drª. Adriana Cortez Suplente UNISA- São Paulo Data: 15 de junho de 2018. v Àqueles que sempre me apoiaram e orientaram em todos os momentos da minha vida: À minha mãezinha, Dinda e Vovô (in memoriam). vi AGRADECIMENTOS À Deus por mais essa etapa concluída e por todas as oportunidades de evolução que tenho vivenciado desde a minha vinda ao mundo. À minha mãe, Marilene Santana, mulher guerreira e batalhadora. Obrigada por ter dedicado sua vida a mim, mãezinha. Espero poder retribuir tudo o que a sra já fez por mim! À minha Dinda Fernanda Velloso, personificação do sentimento mais generoso que existe nesse mundo: amor. Obrigada por ter escolhido se responsabilizar por mim independente de laços familiares ou qualquer obrigação. Se eu cheguei até aqui, a sra foi e é o meu maior exemplo e inspiração para isso. Ao meu dindo/pai/vô Fernando Velloso (in memoriam). Gratidão eterna pela oportunidade de viver e aprender contigo. Te amo, vô! À família Canteli, especialmente Dona Leonice Canteli, terceira mãe que conheci nesse caminho e que me “adotou” desde que cheguei à Botucatu. Seu carinho e cuidado foram muito importantes pra mim. À minha orientadora Profª Jane Megid, por ser a idealizadora da campanha de vacinação contra a cinomose do presente estudo. Gratidão pela amizade, pelo convite de mestrado, por ter me inserido no “mundo” da saúde única e, principalmente, pela compreensão e apoio nessa caminhada. Ao Prof. Márcio Garcia Ribeiro, meu preceptor desde a primeira vinda à Botucatu, na época de estágio, até a residência. Gratidão pela oportunidade de aprendizado e pela grande contribuição em minha banca de qualificação. À Profª Marília Junqueira pela contribuição em minha banca de qualificação, enfatizando minha atenção à medicina veterinária preventiva e que eu me posicionasse para jamais esquecer o papel do médico veterinário na saúde pública. Ao Prof. Pantoja pelo apoio nas análises estatísticas, pelo aprendizado durante as aulas e por aceitar participar dessa banca de defesa. Espero poder aprender cada vez mais sobre epidemiologia. Ao Prof. Carlos Magno por, prontamente, aceitar a participação nesta banca de defesa. Á equipe técnica do Laboratório de Biologia Molecular pela oportunidade de aprender e vivenciar um pouco da rotina de trabalho exercida ali, principalmente, à Bruninha, sempre prestativa e que me salvou várias vezes baixando artigos que eu não conseguia abrir em casa. vii Ás amigas que conheci ao morar com a família Canteli: Bruna (arriégua), Mirian (Sorriso), Carla (Rekebrada) e a Hermana Marina Gobbo. Obrigada pelas risadas, jantares compartilhados e produtivos finais de semana. Vocês fizeram minha mudança à Botucatu ser mais leve. A amiga Ana Cláudia, paraense que o universo fez questão que eu conhecesse e então sincronizou nosso encontro em Botucatu. Obrigada por me inspirar na jornada acadêmica. Agora é rumo ao doutorado! Aos amigos de residência que me fizeram fazer parte da família MI. Foram os momentos de maior transformação e aprendizado da minha vida, gratidão por fazerem parte dessa fase! Aos amigos de pós-graduação: Carol Lechinski, André Rocha (vulgo, dedezin do arrocha), Noelle e Marília Caxito (Uro). Obrigada pelo companheirismo e apoio nessa caminhada em comum. Aos técnicos e funcionários: Cris, Cleide, Sr. Roberto, Adilson (Pardal) e Adriana pela amizade, momentos de descontração e pelo cafezinho da copa. À FMVZ-Unesp/ Botucatu pela oportunidade de aprimoramento profissional e a todos o professores que contribuíram para minha formação nesse processo. À CAPES pelo apoio financeiro, permitindo que eu conseguisse me manter em Botucatu para a realização desse estudo. Gratidão a todos aqueles que, de alguma forma, colaboraram para a realização desse estudo! viii LISTA DE QUADROS Quadro 1- Inquérito epidemiológico aplicado aos tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. ............................................................................................ . 21 ix LISTA DE TABELAS Tabela 1- Características demográficas dos cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 (variáveis categóricas). ................................................................................ 29 Tabela 2- Associação das variáveis sexo e idade com o histórico de vacinação contra cinomose reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ...... 30 Tabela 3- Frequência relativa de respostas relacionadas a guarda responsável, dos tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. .................................... 31 Tabela 4- Associação do histórico de vacinação contra cinomose e o conhecimento da doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ...... 32 Tabela 5- Histórico de vacinação contra cinomose de acordo com o conhecimento a doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ...... 32 Tabela 6- Associação da realização de vacina ética e o conhecimento da doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 .................................. 33 Tabela 7- Uso de vacina ética de acordo com o conhecimento a doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ..................................... 33 x Tabela 8- Associação da vacina administrada previamente nos cães e o ano da última dose administrada, segundo o histórico vacinal reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ....................................................................... 35 Tabela 9- Uso de vacina antirrábica de acordo com o ano da última dose administrada, segundo o histórico vacinal, reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ............................................................................................... 35 Tabela 10- Associação dos animais desvermifugados e o ano de realização da última dose de antiparasitário, reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ...... 36 Tabela 11- Tipo de alimento fornecido, reportado pelos tutores, aos animais participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ....................................................................... 36 Tabela 12- Variáveis contínuas dos títulos de anticorpos dos cães submetidos à colheita de sangue durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ...................................................... 37 Tabela 13- Associação de possíveis fatores de risco de leptospirose, em amostras sororreagentes (N=52) para Leptospira spp. de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013... ............................................................................................ 41 Tabela 14- Distribuição dos títulos máximos dos sorovares dominantes e das co-aglutinações anti- Leptospira spp. na prova de soroaglutinação microscópica (SAM) em 52 amostras sorreagentes de cães participantes da campanha de vacinação conta cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013..... .......................................................................................................... 42 xi Tabela 15- Associação de possíveis fatores de risco de toxoplasmose em amostras sororreagentes (N=178) para T. gondii, de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ............................................................................................................... 43 Tabela 16- Associação de possíveis fatores de risco de erliquiose em amostras sororreagentes (N=316) para E. canis, de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ............................................................................................................... 44 Tabela 17- Associação entre os títulos de anticorpos contra E. canis na prova de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) (N=189) e o exame de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ............................................................................................................... 45 Tabela 18- Associação de possíveis fatores de risco de cinomose em amostras sororreagentes (N=94) para o Vírus da Cinomose canino, em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ................................................................................... 46 Tabela 19- Associação de possíveis fatores de risco de parvovirose em amostras sororreagentes (N=305) para o Parvovirus canino, em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ................................................................................... 47 Tabela 20- Valores de média, desvio padrão, mediana, 1° e 3° quartis, mínimo e máximo da titulação de anticorpos contra Parvovirus canino, imediatamente antes da aplicação da vacina em cães (N=187) participantes da campanha no de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 .... 49 xii Tabela 21- Associação entre as variáveis explanatórias e o aumento percentual relativo à soroconversão de anticorpos anti- Parvovirus canino de cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ....................................................................... 50 Tabela 22- Distribuição das amostras destinadas à sorologia para detecção de anticorpos contra o Virus Cinomose canina, Parvovirus Canino, Toxoplasma gondii, Ehrlichia canis e Leptospira spp. de cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013.. .................................................................................................................... 77 xiii LISTA DE FIGURAS Figura 1- Vacinas administradas previamente nos cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, segundo o histórico vacinal reportado pelos tutores. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. .............. 34 Figura 2- Representação gráfica dos valores de mediana, 1° e 3° quartis, valores mínimos, máximos do título de anticorpos contra leptospirose, toxoplasmose, erliquiose, cinomose e parvovirose pré-vacinação em cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. ...................................................................... 38 Figura 3- Distribuição do título de anticorpos contra Leptospira spp., T. gondii, E. canis, CDV e CPV em cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. ...................... 40 Figura 4- Representação gráfica dos valores de mediana, 1° e 3° quartis, valores mínimos, máximos do título de anticorpos contra parvovirose pré e pós vacinação em cães (N=187) participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 .................................. 48 Figura 5- Distribuição dos títulos de anticorpos anti- Parvovirus pré-vacinação e pós vacinação em cães (N=187) participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. ...................... 49 Figura 6- Observação de alteraões clínicas após vacinação de cães (N=19) participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 ....................................................................... 51 xiv SUMÁRIO RESUMO ..................................................................................................................... 1 ABSTRACT .................................................................................................................. 2 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................ 3 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 5 2.1. Ações de Vigilância Epidemiológica ............................................................... 5 2.2. Campanhas de Vacinação ............................................................................. 6 2.3. Diretrizes Vacinais de cãs e gatos .................................................................. 6 2.4. Resposta Imunogênica ................................................................................... 8 2.5. Eventos Adversos Pós-vacinais ..................................................................... 8 2.6. Enfermidades infectocontagiosas em animais de companhia ......................... 9 2.6.1. Leptospirose ........................................................................................... 9 2.6.2. Toxoplasmose ......................................................................................... 10 2.6.3. Erliquiose ................................................................................................ 12 2.6.4. Parvovirose ............................................................................................. 13 2.6.5. Cinomose ................................................................................................ 15 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 17 3.1. Geral ............................................................................................................ 17 3.2. Específicos ................................................................................................... 17 4. MATERIAL e MÉTODOS..................................................................................... 18 4.1. Área de estudo ............................................................................................. 18 4.2. Campanha de vacinação .............................................................................. 18 4.3. Colheita das amostras e vacinação dos animais .......................................... 20 4.4. Métodos diagnósticos ................................................................................... 22 4.4.1. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) ...................................... 22 xv 4.4.2. Soroaglutinação Microscópica (SAM) .................................................... 24 4.4.3. Soroneutralização (SN) ......................................................................... 24 4.4.4. Inibição da Hemaglutinação (HI) ........................................................... 25 4.4.5. Avaliação da imunogenicidade pós-vacinal ........................................... 27 4.4.6. Reação em Cadeia Polimerase (PCR) .................................................. 27 4.5. Métodos estatísticos: coleta, organização de dados e análises .................... 28 4.5.1. Organização de dados (planilha) ........................................................... 28 4.5.2. Análises estatísticas .............................................................................. 28 5. RESULTADOS .................................................................................................... 29 5.1. Características demográficas dos cães participantes da campanha ............. 29 5.2. Perfil do tutor participante da campanha quanto à guarda responsável ....... 30 5.3. Perfil sorológico de anticorpos contra Leptospira spp, T. gondii, E. canis, CDV e CPV .................................................................................................. 37 5.3.1. Distribuição de anticorpos contra leptospirose ...................................... 41 5.3.2. Distribuição de anticorpos contra toxoplasmose .................................... 43 5.3.3. Distribuição de anticorpos contra erliquiose .......................................... 44 5.3.4. Distribuição de anticorpos contra cinomose .......................................... 46 5.3.5. Distribuição de anticorpos contra parvovirose ....................................... 47 5.4. Resposta Imunogênica ................................................................................. 48 5.5. Alterações clínicas observadas após a vacinação ........................................ 51 6. Discussão............................................................................................................ 52 6.1. Características demográficas dos cães participantes da campanha ............. 52 6.2. Perfil do tutor participante da campanha quanto à guarda responsável........ 54 6.2.1. Imunização ............................................................................................ 54 6.2.2. Controle de parasitos ............................................................................ 58 6.2.3. Nutrição ................................................................................................. 60 xvi 6.3. Perfil sorológico de anticorpos contra Leptospira spp, T. gondii, E. canis, CDV e CPV .................................................................................................. 60 6.3.1. Distribuição de anticorpos contra leptospirose ...................................... 60 6.3.2. Distribuição de anticorpos contra toxoplasmose .................................... 63 6.3.3. Distribuição de anticorpos contra erliquiose .......................................... 65 6.3.4. Distribuição de anticorpos contra cinomose .......................................... 68 6.3.5. Distribuição de anticorpos contra parvovirose ....................................... 69 6.4. Resposta Imunogênica ................................................................................. 70 6.5. Alterações cínicas observadas após a vacinação ........................................ 74 7. LIMITAÇÕES ...................................................................................................... 76 8. CONCLUSÕES ................................................................................................... 78 9. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 79 10. TRABALHO CIENTÍFICO .................................................................................... 113 RESUMO SANTANA, C.F. S. Campanha de vacinação contra cinomose como ferramenta de vigilância epidemiológica. Resposta imune humoral para Parvovirus canino e eventos adversos pós vacinais em cães no Distrito de Rubião júnior, Botucatu- SP. Botucatu, 2017. 124 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Foi realizada uma campanha de vacinação contra a cinomose no período de 2013 a 2014, em bairros periféricos da região de Botucatu, SP, a fim de imunizar os cães contra cinomose devido às elevadas taxas de morbimortalidade, ampla disseminação e prognóstico reservado da enfermidade. O objetivo do presente estudo foi analisar a situação de saúde dos cães por meio da avaliação da soropositividade para agentes infecciosos, verificar a proteção induzida contra parvovirus canino pela vacina comercial utilizada e o perfil de práticas de guarda responsável dos tutores.Foram realizados os testes sorológicos de reação de imunofluorescência indireta, soroaglutinação microscópica, soroneutralização e inibição da hemaglutinação, respectivamente, para: Toxoplama gondii e Ehrichia canis; Leptospira spp.; Virus Canino da Cinomose (CDV) e Parvovirus canino (CPV). A avaliação da parasitemia por E. canis foi realizada por meio da PCR. A proteção vacinal induzida contra parvovirose foi avaliada por meio da soroconversão de anticorpos anti- CPV. Foi observada sororreatividade nos testes sorológicos para Lepstospira spp. (43,33%), T.gondii (52,97%), E. canis (72,14%), CDV (17,24%) e CPV (91,86%). A parasitemia por Ehrlichia canis foi confirmada em 13,33% das amostras. O aumento percentual médio da soroconversão foi de 1545,65%. Maior percentual de práticas de guarda responsável foi observada entre os tutores que afirmaram conhecer a cinomose e entre os que confirmaram realização de vacina antirrábica. Os dados encontrados poderão auxiliar no planejamento de condutas multidisciplinares entre setores públicos e sociedade para promover ações voltadas para melhor qualidade de vida dos animais e da população. Palavras-chave: epidemiologia; doenças infecciosas em cães; guarda responsável; medicina veterinária preventiva. ABSTRACT SANTANA, C.F. S. Canine distemper vaccination campaign as tool for epidemiological surveillance, humoral immune response to Canine Parvovirus and post-vaccinal adverse events in dogs from district of Rubião júnior, Botucatu- SP. Botucatu, 2017. 124 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. A vaccination campaign against canine distemper was carried out between 2013 and 2014, in peripheral districts of the Botucatu region, SP, aiming to immunize dogs against distemper due to the high rates of morbidity and mortality, widespread dissemination and reserved prognosis of the disease. The objective of the present study was to analyze the participating dogs health status by seropositivity evaluation for infectious agents, to verify the induced protection against Canine Parvovirus by the commercial vaccine used during the campaign and the profile of responsible pet ownership practices of the tutors. The following tests of indirect immunofluorescence, microscopic sero- agglutination, seroneutralization and haemagglutination inhibition were performed for: Toxoplasma gondii, Leptospira spp., Canine Canine Virus (CDV) and Canine Parvovirus (CDV). Indirect immunofluorescence reaction and PCR were performed for ehrlichiosis. . Vaccine protection induced against parvoviruses was evaluated by seroconversion of antibodies to Canine Parvovirus. Seroreactivity was observed in the serological tests performed with the following percent of positivity: Leptospira spp. (43.33%), T. gondii, (52.97%), E. canis (72.14%), CDV (17.24%%) and CPV (91.86%%). Ehrlichia canis was detected in 13.33% (28/210) of the samples by PCR in blood. The mean percentage variation of seroconversion was 1545.65%. A higher proportion of responsible pet ownership practices was observed among the tutors who confirmed knowledge about the distemper and who confirmed the accomplishment of anti-rabies vaccine. The data found could help to plan multidisciplinary actions between public sectors and civil societies aimed to improve the animal and human’s life quality. Key words: epidemiology; canine infectious diseases; responsible keeper; preventive veterinary medicine. 3 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA No Brasil, a população de animais de companhia ocupa o 4º lugar no ranking mundial. Em relação a cães e gatos, o país ocupa o 2° lugar com, aproximadamente, 106 milhões de animais (DOMINGUES, 2012; LIMA; LUNA, 2012). O estudo das populações caninas, visando o conhecimento do potencial desempenhado por estes animais como reservatórios de zoonoses representa uma ferramenta importante uma vez que o cão é fonte de infecção de inúmeras doenças transmissíveise reservatórios de zoonoses, (HAN et al., 2017). As zoonoses estão entre as principais doenças que afetam o homem. Dentre elas, leptospirose, brucelose e toxoplasmose são importantes enfermidades infecciosas que possuem ampla distribuição mundial, podendo ser transmitidas pelo cão e acomenter o homem como hospedeiro acidental na cadeia epidemiológica (ALTON et al., 2009; BENITEZ et al., 2017). As doenças virais nos cães representam as principais causas de mortes, nesta espécie, durante os primeiros anos de vida, principalmente em animais não vacinados. Parvovirose e hepatite infecciosa canina permanecem com elevados índices de morbidade e mortalidade em cães do mundo. A cinomose destaca-se devido à ampla disseminação e contagiosidade viral (KNOBEL et al., 2014). Apesar da alta taxa de morbidade e mortalidade, a ocorrência da doença é considerada bem controlada e até rara em muitos países desenvolvidos devido à ampla cobertura vacinal (MACLACHLAN; DUBOVI, 2011). Entretanto, no Brasil, ainda é endêmica e uma das principais causas de doenças infecciosas em cães. Tem-se observado o aumento da descrição da doença em hospedeiros não-convencionais no meio selvagem, podendo representar risco de vida dessas espécies pois os cães são os principais hospedeiros de manutenção e fonte de infecção do vírus para essas espécies (HÜBNER et al., 2010; MEGID et al., 2013; BEINEKE et al., 2015). Considera-se que o grau de infecção da cinomose seja maior que o grau de doença clínica, e que acima de 50% das infecções em cães domésticos 4 possam ser subclínicas (GREENE; VANDEVELDE, 2012). Estudos soroepidemiológicos realizados em diferentes regiões do Brasil demonstraram percentuais de prevalência com ampla variabilidade, desde 6,5% a 71,2% (BRITO et al., 2016; FERNANDES et al., 2013). No entanto, essa diferença pode estar relacionada a fatores como o método de investigação realizado, o estado imunológico dos animais e as condições locais (HEADLEY et al., 2012). Embora a vacinação tenha reduzido a incidência da cinomose, fatores como a presença do vírus no ambiente e em animais doentes, o aparecimento de novas cepas virais e o desenvolvimento do quadro clínico mesmo em animais vacinados têm contribuído para a manutenção do caráter enzoótico e a ocorrência ocasional de surtos (FREITAS-FILHO et al., 2014). Segundo Headley et al. (2012), estima-se que os impactos econômicos relativos ao tratamento e consulta de cães com suspeita de cinomose, baseado em dados de pesquisas realizadas no Brasil, seja de, aproximadamente, R$ 258,3 milhões ao ano. Embora sejam valores baseados em estimativas, ainda que os valores reais fossem 50% ou até mesmo 25% menores, os custos anuais são elevados uma vez que podem corresponder de 0,01% - 0,007% no crescimento anual do PIB (Produto Interno Bruto) no país. Com a finalidade de imunizar os animais e conscientizar os tutores sobre a importância da vacinação para prevenção de doenças, foi realizada campanha de vacinação direcionada a proteção contra a cinomose no período de 2013 a 2014, em um bairro periférico da região de Botucatu, SP. O presente estudo foi realizado com o objetivo de analisar as informações obtidas com base no inquérito epidemiológico aplicado durante campanha de vacinação e os exames laboratoriais realizados a fim de caracterizar a população de cães participantes, analisar o perfil dos tutores quanto à guarda responsável, a proteção para parvovirose induzida pela vacina comercial utilizada e os eventos adversos reportados pelos tutores após a vacinação. 5 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Ações de Vigilância Epidemiológica A epidemiologia de saúde pública produz conhecimento capaz de promover saúde individual por meio de medidas de alcance coletivo. Para definir um diagnóstico global e estabelecer intervenções adequadas, o método epidemiológico se inicia com o estudo dos fatores determinantes da saúde de uma população, a partir de informações obtidas em levantamentos primários (ROGAWSKI et al., 2016). A Vigilância Epidemiológica é definida pela Lei n° 8.080/90 como “um conjunto de ações que proporciona o conhecimento, a detecção ou prevenção de qualquer mudança nos fatores determinantes e condicionantes de saúde individual ou coletiva, com a finalidade de recomendar e adotar as medidas de prevenção e controle das doenças ou agravos”. (BRASIL, 1990) As principais fontes de informação para os sistemas de vigilância epidemiológica das zoonoses são: sistemas de informação em saúde, laboratórios de diagnóstico humano e veterinário e dados obtidos por meio de estudos de investigação, inquéritos ou levantamentos epidemiológicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). O diagnóstico laboratorial, quando corretamente utilizado, complementa as ações de controle e prevenção, além de fornecer embasamento clínico para a investigação da doença e orientar as medidas de controle mais adequadas (VELASCO et al., 2014). As primeiras iniciativas voltadas à aplicação da vigilância epidemiológica no Brasil ocorreram na década de 1970, durante a campanha de erradicação da varíola, onde se iniciou o processo de introdução de vacinas, campanhas de vacinação e de vacinação em massa (HOCHMAN, 2011). 6 2.2. Campanhas de Vacinação A realização de campanhas de vacinação tem sido sugerida como a principal ferramenta para o controle e prevenção da transmissão de doenças para a população humana e outros animais, além de oferecer boa oportunidade para obtenção de dados epidemiológicos e demográficos de populações caninas (DODET; MESLIN, 2001; CLEAVELAND et al., 2006; BELSARE et al., 2013). No município de Botucatu- SP, a participação dos acadêmicos da Faculdade de Medicina Veterinária em parceria com a Prefeitura Municipal no planejamento das campanhas de vacinação antirrábica permitiu a realização de várias pesquisas ao aproveitar o momento estratégico de execução anual da campanha para coletar dados (BABBONI; MODOLO, 2015). A aplicação de inquéritos aos tutores e colheita de amostras de sangue dos animais participantes das campanhas de vacinação já resultou em estudos epidemiológicos sobre a soroprevalência de doenças como leptospirose, toxoplasmose e neosporose em cães, além da caracterização demográfica da população canina e o perfil dos tutores quanto às práticas de guarda responsável (MODOLO et al., 2006. MORAES et al., 2008; LANGONI et al., 2011; COSTA et al., 2013). 2.3. Diretrizes Vacinais de cãs e gatos As diretrizes internacionais para vacinação de cães e gatos da Associação Veterinária Mundial de Pequenos Animais (WSAVA) recomendam a administração de vacinas que todo cão deve receber, independente de sua origem e estilo de vida. São produtos classificados como essenciais e que protegem contra doenças de distribuição global, que possam representar risco zoonótico, e/ou que não tenham tratamento eficaz, e/ou risco de óbito, sendo elas: raiva, cinomose, parvovirose e hepatite infecciosa canina (DAY et al., 2016). Vacinas não-essenciais são indicadas para cães cuja localização geográfica, ambiente doméstico ou estilo de vida se apresentem como fator de 7 risco para contrair infecções específicas como a leptospirose (ANGÉLICO; PEREIRA, 2012; DAY et al., 2016). As vacinas essenciais, em geral, são vacinas com longa duração e, recentemente, foram licenciadas com indicação para revacinação trienal dos animais, em países europeus e norte-americanos. No entanto, no Brasil os mesmos produtos ainda são licenciados para revacinação anual devido menor cobertura vacinal e elevada prevalência de doenças virais como cinomose e parvovirose (ANGÉLICO; PEREIRA, 2012). O conceito de “imunidade de rebanho” dos animais tem sido lentamente incorporado às práticas da medicina de pequenos animais, onde através da imunização individual busca-se também reduzir o número de animais susceptíveis na população regional e, consequentemente, a prevalência de doenças. Para isso, é necessário vacinar a maior quantidade possível de animais em uma população (MITCHELL et al. 2012). Em países desenvolvidos, estima-se que a população de cães e gatos vacinada contra as principais doenças infecciosas virais varie de 30 a 50%. Embora não sejam valores precisos, essa estimativa é menor nos países em desenvolvimento (ANON, 2013). No Brasil, o fornecimento gratuito da vacina antirrábica aos animais reduziu eficientemente os casos de raiva humana e animal (BRASIL, 2017). No entanto, as vacinas contra cinomose e parvovirose, também essenciais aos cães, são fornecidas apenas pelo setor privado e a cobertura vacinal acaba sendo menor (FIGHERA et al., 2008; DEL PUERTO, 2010). A adaptação e adesão às atualizações dos protocolos vacinais para cães dependem, na prática, do papel educativo dos veterinários, exercido através da divulgação aos tutores de informações sobre guarda responsável para que as práticas preventivas sejam executadas adequadamente e bem sucedidas (ANGÉLICO e PEREIRA, 2012; CIPOLLA et al., 2015). 8 2.4. Resposta Imunogênica O método mais objetivo de se avaliar a eficácia de uma vacina é monitorar animais desafiados com o agente patogênico após a vacinação. Nesse caso, a eficácia é avaliada pela capacidade de reduzir a excreção do agente e, principalmente, pela prevenção da doença. No entanto, esse método apresenta alguns obstáculos como o custo mais elevado, a dificuldade crescente do uso de animais para experimentação e incerteza quanto à cepa e dose viral a ser utilizadas no desafio (CANAL; VAZ, 2012). No controle de qualidade de vacinas, a capacidade imunogênica pode ser avaliada pela detecção e quantificação da resposta sorológica após a vacinação, tanto em animais de biotério (camundongos, cobaias e coelhos) quanto nas espécies-alvo para as quais a vacina é indicada (CRAVEIRO, 2008). A quantificação de anticorpos é o método mais utilizado para avaliar o potencial imunogênico de antígenos vacinais em curto prazo (30 a 60 dias). Vários estudos apontam para uma boa correlação entre a imunidade humoral e a proteção antiviral, ou seja, os níveis de anticorpos são bons indicadores da capacidade de resistência antiviral do animal vacinado (ABDELMAGID et al., 2004; ALMENDRA et al., 2005; TAGUCHI et al., 2012; VILA NOVA, 2017). 2.5. Eventos Adversos Pós-vacinais O conceito de reação adversa à vacina é definido como sendo qualquer manifestação clínica desfavorável que ocorra no indivíduo que recebeu a vacina, implicando em relação causal com o produto biológico administrado. Manifestações clínicas que ocorram após a vacinação e que não tenham sido necessariamente causadas pela mesma, são referidas como eventos adversos (BRASIL, 2003; AAHA, 2011). Os efeitos associados mais comuns são eventos adversos, transitórios em geral, tais como apatia, febre, inapetência e dor no local da aplicação. 9 Contudo, podem ocorrer reações de hipersensibilidade do tipo I, II, III e IV (WOLF, 2010; CANAL; VAZ, 2012). Nenhuma vacina é totalmente isenta de riscos. Reações adversas podem ocorrer devido à composição dos produtos como a presença de adjuvantes e o agente infeccioso vivo (atenuado/ modificado) ou morto (inativado). As vacinas recombinantes são mais seguras, uma vez que o agente infeccioso é submetido a processos que neutralizam seu potencial infeccioso e impossibilita o desenvolvimento da doença (CAETANO, 2011; CANAL; VAZ, 2012). Determinar a frequência de efeitos adversos ao uso de vacina depende do relato dos veterinários ou tutores junto aos fabricantes do produto, sendo a incidência uma informação amplamente desconhecida. (TIZARD; SCHUBOT, 2009; DAY et al., 2016). 2.6. Enfermidades infectocontagiosas em animais de companhia 2.6.1. Leptospirose A leptospirose é uma doença infectocontagiosa sistêmica, causada por bactérias do gênero Leptospira, de distribuição mundial e ocorrência sazonal de maior frequência em regiões tropicais e subtropicais associada a altos índices de pluviosidade (ADLER; MOCTEZUMA, 2010). Acomete diversas espécies de animais domésticos, silvestres, roedores e, acidentalmente, o homem resultando em importante problema de saúde pública, além das perdas econômicas quando presente em animais de produção (MONAHAN et al., 2009; CASTRO, 2011). Diversos animais domésticos e selvagens são considerados portadores renais responsáveis pela manutenção da Lepstospira spp. no ambiente. Um hospedeiro de manutenção é definido como um animal capaz de atuar como fonte natural de infecção de sorovares específicos de Lepstospira spp. para sua própria espécie (LEVETT et al., 2001; TAGLIABUE et al., 2016). No meio 10 urbano, o rato de esgoto (Rattus novergicus) e os cães são os principais reservatórios da leptospirose (ROJAS et al., 2010). Inquéritos sorológicos realizados em populações caninas brasileiras apresentam índices de prevalência variando desde < 10% até 85% (VIEGAS et al., 2001; FAVERO et al., 2002; MASCOLLI et al., 2002; BATISTA et al., 2004; BATISTA et al., 2005; BRANDESPIM et al., 2005; BLAZIUS et al., 2005; MODOLO et al., 2006; SILVA et al., 2006; MAGALHÃES et al., 2007; SARMENTO et al., 2007). A técnica padronizada e recomendada pela Organização Mundial de Sáude (OMS) e pelo Ministério de Saúde no Brasil (BRASIL, 2009), estabelecida como padrão-ouro no diagnóstico de leptospirose humana e animal, é a Soroaglutinação Microscópica (SAM) com a utilização de antígenos vivos. No entanto, esse método detecta principalmente imunoglobulinas da classe IgM, não relacionadas à proteção uma vez que a imunidade gerada pela vacina resulta no aumento predominante de anticorpos da classe IgG. A vacinação induz a produção de IgG com títulos baixos (100 a 400) e transitórios (um a quatro meses), portanto, títulos negativos ou baixos na SAM não indicam ausência de proteção (COYNE et al., 2001; LANGONI et al., 2012). 2.6.2. Toxoplasmose A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída no mundo, causada pelo protozoário Toxoplasma gondii (T. gondii). Acomete todos os animais homeotérmicos, sendo os gatos e outros felídeos hospedeiros definitivos do agente, e principais fontes de infecção para os animais de companhia e de produção (PINHEIRO Jr. et al., 2009; DUBEY, 2010; CARNEIRO et al., 2014). Em geral apresenta-se assintomática tanto em humanos quanto em animais, permanecendo em estágio latente ou crônico. Quadros clínicos com manifestações mais grave estão relacionados à doenças imunossupressoras, que caracteriza o agente como oportunista (SANTOS et al., 2000; DUBEY et al., 2012). 11 No Brasil, há relatos de prevalência em humanos alcançando valores acima de 80% em regiões específicas (GLASNER et al., 1992; GARCIA et al., 2003; GOMES, 2004). Em felídeos, espécie essencial para a manutenção do ambiente contaminado pelo protozoário, prevalência de 18 a 73% já foi observada enquanto que em cães essa variação, no Brasil, foi de 8,2 a 88,2% comparada a 16,8 e 67,4% no restante do mundo (SILVA; SILVA, 2016). Do ponto de vista da saúde pública, cães servem como sentinela para infecção ambiental e indicam que a população humana da área onde estes animais se localizam estão expostas aos mesmos fatores de risco para infecção por T. gondii (ULLMANN et al. 2008). As principais vias de transmissão de T. gondii são através da ingestão de água e alimentos contaminados com oocistos esporulados ou através da ingestão de cistos teciduais (bradizoítos) em carne crua ou mal cozida (DUBEY, 2010). Os cães são importantes na epidemiologia da toxoplasmose como portadores assintomáticos podendo contribuir na transmissão mecânica dos oocistos no ambiente, após a ingestão de água ou alimentos contaminados, sem a replicação do parasita no intestino (MEIRELES et al.,2004; VANWORMER et al., 2013). A presença de cães, ou mesmo de outras espécies domésticas infectadas reflete o nível da educação em saúde dos habitantes no local (DA SILVA, et al., 2010; DUBEY et al., 2012; YAN et al., 2012) O diagnóstico é usualmente baseado em métodos indiretos com testes sorológicos, uma vez que a produção de anticorpos pelo organismo infectado é intensa e precoce, e testes disponíveis apresentam boa sensibilidade e especificidade (GOMES, 2004). Aspectos de imunoprofilaxia vêm sendo estudados para a produção de vacinas, no entanto, ainda não existem produtos comerciais recomendados para humanos e animais. A maneira mais eficiente de controle da toxoplasmose é a prevenção por meio de medidas relacionadas a evitar 12 ingestão de cistos e oocistos (GERMANO et al., 1985; SCHARES et al., 2005; COSTA et al., 2013; SILVA; SILVA, 2016). 2.6.3. Erliquiose Erliquiose Monocítica Canina (EMC) está entre as hemoparasitoses mais graves que acometem os cães, causada pela proteobactéria Ehrlichia canis. È uma doença infecciosa, multisistêmica, não contagiosa, com maior prevalência nas áreas de maior distribuição geográfica do carrapato vetor (Rhipicephalus sanguineus), principal fator de risco para a infecção (MORAES-FILHO et al., 2011; PAROLA et al., 2013). No Brasil, a doença é endêmica devido à alta exposição dos cães aos carrapatos infectados (FIGUEREDO et al., 2017). A prevalência da EMC varia de 0,7% a 92% dependendo da população estudada e da técnica utilizada (esfregaço sanguíneo, ELISA, RIFI e técnicas moleculares) (OLIVEIRA et al., 2000; LABARTHE et al., 2003; DAGNONE et al., 2003; BULLA et al., 2004; SAITO et al., 2008; RAMOS et al., 2009; SANTOS et al., 2009; UENO et al., 2009; MELO et al., 2011; SILVA et al., 2012; ROTANDANO et al., 2017). A EMC manifesta-se sob as formas aguda, subclínica ou crônica, dependendo da virulência da cepa de E. canis (VIEIRA et al., 2011). Os cães infectados apresentam sinais clínicos de comprometimento sistêmico, gerais e inespecíficos, tais como depressão, perda de peso, letargia, hiporexia ou anorexia e febre, além de esplenomegalia e linfadenomegalia (CASTRO et al., 2004; HASEGAWA, 2005; NEER, 2006). O diagnóstico confirmatório ocorre pela visualização de mórulas bacterianas nos monócios, em exame de esfregaço sanguíneo, por cultivo celular ou detecção do DNA de E. canis na Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), esta última capaz de detectar a presença de E. canis, antes mesmo da produção de anticorpos devido a sua precisão, sensibilidade e acurácia (WANER; HARRUS, 2000). O diagnóstico por meio de exames sorológicos deve ser concluído em conjunto com os achados clínicos e resultados de outros exames 13 complementares. A imunidade humoral não é, aparentemente, protetora, mais indicativa de estímulo antigênico prolongado devido à presença do agente (HARRUS et al., 1997; WANER; HARRUS, 2013). Animais com títulos a partir de 40 indicam exposição prévia ao patógeno, não apresentando obrigatoriamente quadro clínico da doença. É válido ressaltar que não há relação direta entre os títulos de anticorpos anti-Ehrlichia e a gravidade dos sinais clínicos. Assim como cães assintomáticos podem apresentar altos títulos de anticorpos, cães sintomáticos podem não apresentar títulos detectáveis (HARRUS et al., 2015). Devido a inexistência de vacinas disponíveis comercialmente e a ausência de imunidade protetora induzida pela doença, a profilaxia é baseada essencialmente do controle do vetor, o carrapato R. sanguineus. Para tanto, o uso de produtos acaricidas no ambiente, aliado ao uso de produtos tópicos e orais no animal são eficazes, desde que seja realizado o manejo correto com aplicação periódica, de acordo com as condições do habitat do animal (WOODY et al., 1991; SANTARÉM; AGUIAR, 2016). 2.6.4. Parvovirose A parvovirose canina é uma das principais causas de diarreia de origem infecciosa em cães no mundo, caracterizada por gastroenterite hemorrágica e imunossupressão (CARMICHAEL, 2005; GODDARD; LEISEWITZ, 2010). Acomete principalmente filhotes entre seis semanas e seis meses de idade, via oronasal ou conjuntival, gerando altas taxas de morbidade e mortalidade (MEUNIER et al., 1985; MORAES; COSTA, 2012). A morbidade da doença pode chegar a 100% e a mortalidade, a 91% em filhotes (entre 6 semanas e 4 meses) e até 10% em adultos (DEZENGRINI et al., 2007; NANDI et al., 2010). Desde os primeiros relatos da ocorrência da doença no Brasil (ANGELO et al., 1980; HAGIWARA et al., 1980), o CPV vem se mantendo endêmico na população canina. Estudos realizados no Brasil pela técnica de inibição da hemaglutinação (HI) revelaram resultados com elevada prevalência de 90,9% 14 em Pelotas- RS (HASS et al., 2008); 94% em Passo Fundo- RS (FRANDALOSO et al., 2004) e 95,1% em Santa Maria- RS (BARCELOS et al., 1988). O diagnóstico geralmente é presuntivo, baseado no histórico do animal, sinais clínicos e hemograma (MORAES; COSTA, 2007). Contudo, o diagnóstico definitivo é realizado por meio da identificação viral. A detecção indireta do vírus por meio de testes sorológicos pode ser realizada para o diagnóstico de infecção pregressa, ou mesmo para o acompanhamento da condição imunológica do animal (HOSKINS, 2004; CASTANHEIRA et al., 2014). A forma mais efetiva de prevenção da parvovirose é a vacinação dos cães, particularmente filhotes com idade entre seis e oito semanas, a fim de evitar a susceptibilidade com a queda dos anticorpos maternos. Recomenda-se o isolamento dos animais até a completa imunização em associação às práticas de desinfecção ambiental devido à resistência do vírus, fato que dificulta seu controle (MORAES; COSTA, 2012). É pressuposto que a duração da imunidade após infecção natural possa durar a vida toda na maioria dos cães e, após protocolo vacinal completo, nove anos ou mais, baseado em estudos experimentais de desafios, seguido de testes sorológicos (SCHULTZ et al. 2010). Embora a vacinação tenha reduzido bastante a prevalência dessa enfermidade, é de conhecimento geral que continua a afetar grande número de animais e que o agente etiológico está presente na população canina. Isso pode ocorrer devido à resistência do vírus no ambiente (um ano ou mais) e à resposta imunitária variável dos animais por fatores relativos ao imunógeno utilizado, a interferência de anticorpos maternos ou até mesmo a forma de armazenamento da vacina, comprometendo proteção eficaz (TIZARD; NI, 1998; GREENE; VANDEVELDE, 2012). 15 2.6.5. Cinomose A cinomose canina é uma doença infectocontagiosa viral, de distribuição mundial que acomete carnívoros domésticos e selvagens (McCARTHY et al., 2007; BEINEKE et al., 2009; GILBERT et al., 2014). É um importante patógeno que apresenta alta morbidade e mortalidade, com letalidade inferior apenas à raiva canina (APPEL; SUMMERS, 1995). Animais doentes podem apresentar sinais clínicos sistêmicos (digestórios e respiratórios) e/ou neurológicos e que resultam em severa doença. Maior ocorrência é associada a animais jovens, de 3 a 4 meses de idade, relacionada ao desmame e a consequente perda da imunidade passiva (GAMA et al., 2007; MARTELLA et al., 2008; ORSINI; BONDAN, 2008). Estudos realizados para determinar a prevalência de anticorpos soroneutralizantes para a doença no Brasil apresentaram resultados com índices variando entre 11,6% em Porto Alegre (HARTMANN et al., 2007); 27,3% em Santa Maria, RS (DEZENGRINI et al., 2007), 58,3% em Pelotas, RS e na região sudeste, 71,2% em Taubaté, SP (FERNANDES et al., 2013). Trabalhos realizados em outras regiões do país utilizano a mesma técnica são escassos embora a ocorrência da infecção na população canina do Brasil seja conhecida (GOUVEIA et al., 1987; HEADLEY; GRAÇA, 2000). A prevenção é realizada por meio da vacinação dos cães, particularmente no período entre ses e oito semanas de idade. No caso de filhotes que não tenham recebido colosto ou que tenham entrado em contato com cães doentes, mas ainda não apresentam sinais clínicos, pode-se administrar soro hiperimune com gamaglobulinas específicas. O soro homólogo pode permanecer ativo entre 15 e 30 dias e, após esse período, recomenda-se a vacinação para induzir imunidade duradoura (MANGIA, 2008). A proteção após a recuperação de uma infecção natural pode ser vitalícia para a maioria dos cães enquanto que, após protocolo vacinal completo, considera-se por até seis anos (SCHULTZ et al. 2010). Essa proteção é considerada segura a menos que o animal seja submetido a 16 estirpes da alta virulência, título viral elevado ou quando exposto em estado de imunossupressão. Em países onde a disseminação viral é ampla e o desafio é contínuo, recomenda-se que a vacinação seja anual (GREENE; VANDEVELDE, 2012). 17 3. OBJETIVOS 3.1. Geral - Identificar o nível de exposição aos agentes etiológicos de cinco doenças infecciosas e avaliar o desempenho de uma vacina comercial utilizada durante a realização da campanha de vacinação contra a cinomose para cães do Distrito de Rubião Junior, Botucatu- SP em 2013. 3.2. Específicos - Apresentar as características demográficas da população de cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose; - Apresentar o perfil do tutor participante da campanha de vacinação contra cinomose quanto às práticas de guarda responsável de cães; - Apresentar o percentual de soropositividade de anticorpos contra Leptospira spp., Toxoplasmas gondii, Ehrlichia canis, Parvovovirus canino e Virus Canino da Cinomose de cães avaliados durante a campanha de vacinação contra a cinomose; - Apresentar o percentual de parasitemia por E. canis dos cães submetidos ao teste sorológico de detecção de anticorpos anti-E. canis; - Apresentar a soroconversão 30 dias após a primovacinação para anticorpos anti-Parvovirus canino induzidos pela vacina nacional Imuno-vet® (Laboratório BioVet S/A, Vargem Grande Paulista, SP), em cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose; - Verificar a existência de associação entre a soroconversão de anticorpos anti- Parvovirus canino e as características demográficas dos cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose; - Apresentar o perfil de eventos adversos após 30 dias da primovacinação reportado pelos tutores dos animais participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. 18 4. MATERIAL e MÉTODOS 4.1. Área de estudo O estudo foi realizado no Distrito de Rubião Júnior, situado na região mais elevada do município de Botucatu (930m), região centro sul do Estado de São Paulo. Segundo o IBGE, a população estimada no município, em 2017, era de 142.546 habitantes e a população de cães foi estimada em 26.721 no ano de 2015. O público-alvo da campanha foram tutores de baixa-renda e local em questão foi escolhido como área de estudo por ser um bairro periférico e também estar próximo à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ, no campus da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", a UNESP, situada no distrito. 4.2. Campanha de vacinação A campanha de vacinação contra cinomose foi organizada em colaboração com estudantes, residentes e professores do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública e parceria do Laboratório Biovet, sob coordenação da Profª Jane Megid, professora titular da disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais Domésticos e de Cassiano Victória, professor assistente da disciplina de Planejamento em Saúde da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ- UNESP, campus Botucatu) no período de 2013 a 2014. Antes de cada campanha, foram realizadas palestras nas Unidades Básicas de Sáude (UBS) para esclarecer a proposta do evento e a importância da cinomose por meio de vídeos demonstrando os sinais clínicos da doença. Foram distribuídos folders contendo breve resumo das principais doenças infecciosas de cães, bem como a importância da vacinação para prevenção dessas enfermidades. A campanha de vacinação foi esquematizada prevendo colheitas de sangue, durante o período da primovacinação, realizada em três finais de semana seguidos, para avaliação da exposição prévia dos animais a agentes https://pt.wikipedia.org/wiki/J%C3%BAlio_de_Mesquita_Filho https://pt.wikipedia.org/wiki/UNESP 19 infecciosos de importância aos cães e para analisar os títulos de anticorpos induzidos pela prImovacinação 30 dias após a vacinação coincidente com o momento de revacinação. Visando estimular o retorno dos tutores para a reavaliação dos animais primovacinados, com o objetivo, também, de realizar a vermifugação dos animais, doses de vermífugo Vermivet Plus® 600mg (Laboratório BioVet S/A, Vargem Grande Paulista, SP) foram distribuídos. Cartazes no distrito de Rubião Jr. e anúncios no site da FMVZ-UNESP/ Botucatu, SP, foram publicados para divulgar data e local da campanha de vacinação. Os animais foram vacinados com a vacina Imuno-vet® (Laboratório BioVet S/A, Vargem Grande Paulista, SP), vacina polivalente V8 contendo associação dos vírus da cinomose, hepatite infecciosa canina, adenovírus tipo 2, Parainfluenza e Parvovirose (CPV-2), modificados por passagens em cultura celular, liofilizados e do concentrado e lisado de Leptospira Canicola, L. Icterohaemorrhagiae, L. Grippotyphosa, L. Copenhageni e L. Pomona, ressuspendidas no antígeno de coronavírus, inativado, gentilmente cedida pelo laboratório produtor. A campanha de vacinação teve o apoio da Pró-Reitoria de Extensão da UNESP, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, do Laboratório Biovet e da Secretaria de Saúde do Município de Botucatu, sem custo algum para os tutores. Como critério de protocolo vacinal, foi estipulado que animais com mais de 1 ano que apresentavam vacinas atualizadas ou desatualizadas receberiam apenas uma dose; os nunca vacinados receberiam 2 doses e cães com menos de 1 ano e não vacinados receberiam 3 doses, especialmente filhotes com base nas diretrizes para vacinação de cães e gatos da World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) (DAY et. al., 2010). Fêmeas prenhes e filhotes com menos de 30 dias foram critérios de exclusão na participação deste estudo e não foram vacinados. Para avaliar a resposta humoral conferida pela vacina utilizada durante a campanha e outras análises associadas à titulação de 20 exames sorológicos, os cães foram divididos em 4 faixas etárias: 0 a 1 ano; >.1 a 2 anos; >2 a 5 anos e >5 anos (DAY, et al., 2016). 4.3. Colheita das amostras e vacinação dos animais Não houve parâmetro para estabelecer o tamanho da amostra, sendo obtida por conveniência, de acordo com a participação de tutores que concordaram em responder ao questionário aplicado. Os tutores assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e preencheram o questionário de identificação, junto com um membro da equipe. Após o consentimento, foi realizado inquérito epidemiológico a fim de identificar possíveis fatores de risco. O questionário abordou variáveis referentes à idade, sexo, dieta (comida caseira ou ração comercial), histórico de vacinação, contato com animais, conhecimento da doença, dentre outras (Quadro1). 21 Quadro 1: Inquérito epidemiológico aplicado aos tutores participantes da a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Ao término da entrevista, foi entregue um folder contendo informações sobre as principais doenças infecciosas de cães e a importância da vacinação. Após realização do inquérito, os animais foram submetidos ao exame físico geral com avaliação da frequência respiratória, cardíaca e temperatura. Como critério de inclusão, somente animais com parâmetros físicos dentro da faixa de normalidade (FEITOSA, 2014) foram destinados à colheita de sangue Nº cadastro animal: Nome do animal: __________________ idade Sexo M( ) F ( ) raça: Endereço __________________ Bairro:___________ Proprietário Foi vacinado contra cinomose? □sim □não Vacina ética? □sim □não Qual vacina? _______________ Data da última vacina: ___/___/___ Quantas doses foram administradas? ________________ Proprietário tem conhecimento da doença? □sim □não Tem outros animais □sim □não Can ( ) felino ( ) ov ( ) bov ( ) suíno ( ) aves ( ) Presença de morcegos residência □sim □não Presença de roedores □sim □não Animal vermifugado? □sim □não Data da última dose: ___/___/___ Alimentação: ração ( ____) Comida ( ) Diarreia □sim □não Vomitos □sim □não Perda de peso □sim □não Tosse □sim □não Secreção respiratória □sim □não Secreção ocular □sim □não Temp ( ) FC ( ) FR ( ) Auscultação normal □sim □não Swab fezes □sim □não Observações: 22 em tubo seco e em tubo com anticoagulante e, por fim, submetidos à vacinação. As amostras foram colhidas por punção da veia jugular com agulhas estéreis (30x8mm) e armazenadas em tubos sem anticoagulante. Após retração do coágulo, as amostras foram centrifugadas por dez minutos a 2000g, obtendo-se soros límpidos, que foram conservados à -20°C em alíquotas até a realização das provas sorológicas. 4.4. Métodos diagnósticos As amostras de sangue colhidas durante a campanha foram destinadas a testes sorológicos para avaliação da resposta vacinal induzida contra parvovirose, além de avaliar a sororreatividade para toxoplasmose, leptospirose, parvovirose, cinomose e erliquiose em cães. Também foi realizado PCR para erliquiose. 4.4.1. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) A detecção de anticorpos contra T. gondii foi realizada pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), segundo metodologia descrita por Camargo (1974). As amostras séricas permaneceram congeladas a -20ºC até seu processamento realizado no Núcleo de Pesquisa em Zoonoses (NUPEZO) FMVZ /UNESP – Botucatu/SP. Foram transferidos 10 µL dos soros testes e dos controles positivo e negativo para uma microplaca. Adicionados 150 µL de em solução salina de fosfato tamponada (PBS- pH 7,2). Após esse procedimento foram colocados 150 µL desta mesma solução nos três poços subseqüentes da placa e transferidos 50 µL do 1º para o 2º poço e assim por diante, quadruplicando a diluição de 1:16, 1:64, 1:256 e 1:1024. As lâminas previamente sensibilizadas com taquizoítos foram retiradas do congelador e secas em estufa à 37°C por cerca de 10 minutos. Em seguida, foram transferidos 10 µL de cada diluição do soro para as mesmas, que foram incubadas novamente à 37°C por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se 23 duas lavagens em PBS pH 7,2, por um período de 10 minutos cada uma, e subseqüente secagem em estufa à 37°C. A diluição do conjugado espécie- específico foi realizada em solução de Azul de Evans 2%, previamente diluída em PBS pH 7,2 na proporção de 1:5. A seguir, foram adicionados 10 µL do conjugado então diluído, em cada poço da lâmina, incubando-se a 37°C por 30 minutos em câmara úmida. Procedeu-se mais 2 lavagens em PBS pH 7,2 como descrito anteriormente, com posterior secagem em estufa à 37°C. Foram adicionadas duas gotas de glicerina tamponada pH 8,5, cobrindo-se com lamínula 24mm x 60mm, procedendo-se a leitura em microscópio de imunofluorescência Zeiss (aumento de 400x). Para cada lâmina testaram-se soros controles negativo e positivo, concomitantemente. Foram consideradas sororeagentes títulos ≥ 16/UI (DA SILVA et al., 2002). Mesma técnica também foi utilizada para erliquiose, segundo Aguiar et al., (2007), realizada no Laboratório de Virologia e Rickettsioses (LVR) do Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de MatoGrosso (UFMT), Cuiabá, MT, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar. As amostras de soro destinadas a RIFI foram submetidas à diluição inicial de 1:40 com PBS pH 7,2 acrescido de 1% de soroalbumina bovina e depositadas em lâminas contendo cepa São Paulo de E. canis juntamente com controles positivos e negativos previamente testados. Em seguida, as lâminas foram incubadas a 37°C em câmara úmida durante 30 minutos. Após esse período, as lâminas foram lavadas em PBS pH 7,2, secas em temperatura ambiente e, em cada poço, foi adicionado (diluição de 1:1000) conjugado de coelho anti-IgG canino (Sigma® Diagnostics, St. Louis, Mo) para novamente serem incubadas a 37ºC por 30 minutos, lavadas em PBS pH 7,2 e submetidas a secagem. Por fim, as lâminas foram devidamente examinadas em microscópio de epifluorescência e as amostras positivas foram diluídas sucessivamente na razão de dois para obtenção do título final. Foram consideradas sororreagentes amostras com títulos ≥ 40/UI (AGUIAR et al., 2007). 24 4.4.2. Soroaglutinação Microscópica (SAM) A pesquisa de anticorpos para Leptospira spp. foi realizada pela prova de soroaglutinação microscópica (SAM), segundo as normas do Ministério da Saúde (BRASIL, 2009), no Laboratório de Leptospirose do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva (DMVP) da Universidade Estadual de Londrina (UEL)- PR, sob responsabilidade do Prof. Dr. Julio Cesar de Freitas. As amostras foram estocadas a -20°C e enviadas em caixas de isopor e gelo reciclável para a manutenção da temperatura adequada até seu processamento. Foram utilizados como antígenos culturas de cepas-padrão de Leptospira spp. mantidas por repiques semanais em meio líquido de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). Foram utilizados 22 sorovares: Australis, Bratislava, Autumnalis, Butembo, Castellonis, Bataviae, Canicola, Whitcombi, Cynopteri, Djasiman, Grippotyphosa, Hebdomadis, Copenhageni, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Hardjo, Wolffi, Shermani e Tarassovi. O grau de aglutinação das diluições seriadas das amostras frente aos sorovares foi observado em microscópio de campo escuro no aumento 100X, considerando-se positivo/ reagente os soros que apresentaram 50% ou mais de aglutinação à triagem, onde foram então diluídos seriadamente para a determinação da diluição máxima positiva, resultando em diluições de 1:100 até 1:1280 por amostra (MYERS,1985). Na eventualidade do maior título ser apresentado para mais de um sorovar, a amostra foi caracterizada como co-aglutinação (BOLIN, 1996). Para a interpretação dos resultados, as amostras foram consideradas sororreagentes com títulos a partir de 100/UI (LANGONI et al., 2015). 4.4.3. Soroneutralização (SN) A avaliação quantitativa de anticorpos contra o vírus da cinomose canina (CDV) foi realizada pela prova de Soroneutralização microscópica e as amostras foram processadas pelo Laboratório de Controle de Qualidade da 25 empresa Bio-Vet S/A, localizado em Vargem Grande Paulista, São Paulo, seguindo a descrição de Appel e Robson (1973). A técnica foi adaptada com a utilização de CDV linhagem Lederle Bio-Vet para passagem em fibroblastos de embriões de galinha (FEG) com oito dias de vida (BIAZZONO et al., 2001). As amostras de soro foram descongeladas no momento de utilização em temperatura ambiente, inativadas a 56°C por 30 minutos em banho-maria, mantidas por 12 horas entre 2 a 8°C e diluídas serialmente 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e 1/256. As amostras diluídas foram incubadas em microplacas de 96 orifícios de fundo chato com 100 doses infectantes de CDV capazes de causar efeito citopático em 50% das células em cultura (100 TCID50%) por 60 minutos a 37°C em estufa com 3% a 5% de CO2. A seguir, foram adicionados 100 μL da suspensão celular de FEG com concentração de 5x105 células/mL em todas as cavidades e, em seguida, incubadas por cinco dias a 37°C em estufa com 3% a 5% de CO2. Após este período, foram realizadas as leituras das placas em microscópio invertido para verificar a presença ou ausência de efeito citopático que, quando presentes, indicavam a ausência de anticorpos em títulos suficientes para neutralizar o vírus e, assim, impedir sua replicação pelo tapete celular. O título para o CDV foi determinado como o inverso da maior diluição que determinou proteção completa do tapete celular (100%), sendo este considerado como ponto final (HOOVER; BALDWIN; RUPPRECHT, 1989). As amostras foram consideradas sororreagentes com título ≥8/UISN (FIORELLO et al., 2004). Títulos de anticorpos a partir da diluição 1:100 conferem proteção aos cães domésticos contra o vírus (YORK; BURCH, 1961; APPEL 1969; POVEY, 1986; MCCAW et al., 1998). 4.4.4. Inibição da Hemaglutinação (HI) A titulação de anticorpos contra o Parvovírus Canino (CPV) foi realizada com base na prova de Inibição da Hemaglutinação, segundo Carmichael et al. (1980) no Laboratório de Imunodiagnóstico aplicado a Enfermidades Infecciosas dos Animais do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde 26 Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Botucatu. As amostras de soro conservadas a -20ºC foram descongeladas. Após o descongelamento, foram separados 100 μl de soro e inativados a 56ºC em banho-maria por 30 minutos. Visualizando neutralizar possíveis inibidores da hemaglutinação inespecíficos, foram acrescidos, a cada soro inativado, 900 μL de tampão borato salina (PBS), resultando em uma diluição inicial da amostra a 1:10. Em seguida foram adicionados 100 μL de suspensão a 50% de hemácias de suíno. Esta mistura foi então incubada por 2 horas a temperatura ambiente. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 1.500 g por 10 minutos para a retirada dos eritrócitos e o sobrenadante foi separado para a realização do teste. Em uma placa de 96 orifícios com fundo em “U”, foi adicionado 50 μL do soro tratado na primeira coluna, seguido por 25 μL de PBS nas colunas 2 a 8. Em seguida, foram realizadas diluições dos soros na base 2, de 1:10 até 1:1280 e adicionados 25 μL de vírus atenuado da vacina Parvoguard (Solvay Saúde Animal Ltda., Brasil) contendo 8 unidades hemaglutinantes (UHA) a todos os orifícios. As placas foram então incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Após este período, foram acrescentados 50 μL de suspensão de hemácias a 1% em PBS com soro albumina bovina (0,1%). As placas foram incubadas em geladeira por 24 horas após o que foi realiza a leitura. Foram considerados positivos para exposição ao Parvovirus canino os soros dos animais que apresentaram inibição da hemaglutinação evidenciada pela formação do “botão” de hemácias na diluição 1:80. O título de anticorpos foi considerado o inverso da maior diluição das amostras de soro que foi capaz de inibir a hemaglutinação. Em cada lote de placas foram incluídos controles do antígeno (representado somente pela vacina atenuada), de hemácias, de uma amostra de soro sabidamente positiva e de soro negativo. As amostras foram testadas em duplicata e, no caso de resultados incompatíveis, o procedimento foi repetido. As amostras foram consideradas sororreagentes com título 27 >20/UIHI. Títulos de anticorpos iguais ou maiores que 80/UIHI conferem proteção aos cães domésticos (POLLOCK; CARMICHAEL, 1982; HOARE et al., 1997). 4.4.5. Avaliação da imunogenicidade pós-vacinal A resposta imunogênica pós-vacinal foi avaliada por meio dos resultados sorológicos de anticorpos anti-Parvovirus canino obtidos pela inibição da hemagutinação, observando-se a mudança do estado de soronegativo para soropositivo (titulação pós-vacinal ≥ 64UIHI) ou aumento do título pós-vacinal em, pelo menos, quatro vezes após 30 dias da primovacinação (POLLOCK; CARMICHAEL, 1982). 4.4.6. Reação em Cadeia Polimerase (PCR) A PCR foi realizada em 210 amostras de sangue, colhidas com anticoagulante armazenadas em tubo Eppendorf com EDTA no Laboratório de Virologia e Rickettsioses (LVR) do Hospital Veterinário (HOVET) da UFMT. A extração de DNA foi realizada por meio Kit de extração comercial (Axygen®) a partir do sangue total. A reação de PCR foi delineada visando amplificar um fragmento de 409 pares de base do gene dsb de Ehrlichia spp., utilizando os iniciadores Dsb-330 (GATGATGTCTGAAGATATGAAACAAAT’) e Dsb-728 (CTGCTCGTCTATTTTACTTCTTAAAGT) conforme Aguiar et al. (2013). A purificação dos produtos amplificados foi realizada utilizando o kit comercial Illustra GFX PCR DNA (GE Healthcare®) e as sequências foram obtidas através de kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applies Biosystems®) e analisadas em sequenciador automático Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer. O programa BLAST (Bethesda, MD) foi usado para comparar as semelhanças entre as sequências geradas no presente trabalho e as depositadas no GenBank. 28 4.5. Métodos estatísticos: coleta, organização de dados e análises 4.5.1. Organização de dados (planilha) A amostra do presente estudo foi constituída por dados levantados a partir de 644 questionários epidemiológicos selecionados sem critério estatístico, de forma não aleatória (amostra não probabilística) e de 603 amostras de sangue coletadas durante a campanha de vacinação. Os dados foram inseridos em planilha no Microsoft Office Excel® (versão 2013 Microsoft Corporation). 4.5.2. Análises estatísticas Realizou-se a análise estatística descritiva para cálculos das frequências relativa e absoluta dos resultados obtidos no teste sorológico. O estudo de associação entre as variáveis epidemiológicas e os resultados dos exames sorológicos foi realizado utilizando análise univariada com o teste do quiquadrado ou o teste exato de Fischer. Para avaliar diferença estatística entre aumento percentual da soroconversão (mudança do estado de soronegativo para soropositivo após vacinação ou aumento do título após da vacinação em, pelo menos, quatro vezes, segundo Pollock e Carmichael (1982) de anticorpos anti- Parvovirus e as demais variáveis presentes no inquérito, foram utilizados os testes não- paramétricos de Wilcoxon e Kruskal-Wallis. Para o processamento das análises foi utilizado o software Statistical Analyses System SAS®, free statistical software online, adotando-se o nível de significância (α) de 5% (THRUSFIELD, 2004). 29 5. RESULTADOS 5.1. Características demográficas dos cães participantes da campanha Foi identificada através do inquérito participação de 272 (51,81%) machos e 253 (48,19%) fêmeas. A idade média dos cães registrados no inquérito foi de 3,85 anos, com maior frequência de animais entre 0 a 1 ano (27,77%;135/486), com raça aparente predominante de animais SRD (77,33%;348/450). Demais características demográficas da população de cães participantes são descritas na tabela 1. Tabela 1: Características demográficas categóricas dos cães que compareceram a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013 (variáveis categóricas). A associação das variáveis: sexo, idade e raça aparente com o histórico de vacinação contra cinomose é apresentado na tabela 3. Foi observada diferença significativa (p<0,05) do histórico de vacinação contra cinomose entre as faixas etárias dos cães e entre as raças aparentes, onde a frequência Variável N % Sexo Macho 272 51,81 Fêmea 253 48,19 Idade 0 ⎯⎯| 1 ano 135 27,77 1 ⎯⎯| 2 anos 84 17,28 2 ⎯⎯| 5 anos 130 26,74 > 5 anos 137 28,18 Raça aparente Raça definida 102 22,66 SRD 348 77,33 Contato com outros animais domésticos 441 84,48 Presença de Morcegos na residência 119 24,34 Presença de Roedores na residência 287 56,72 Alimentação Caseira 33 6,43 Caseira e industrializada 267 52,96 Industrializada 213 41,52 Animal desvermifugado 327 64,37 Vacinado contra cinomose 163 31,71 *SRD: sem raça definida. 30 relativa de animais vacinados foi menor entre os animais de 0 a 1 ano (20%;26/130) e entre os animais sem raça definida (25,07%;85/339). (Tabela 2). 5.2. Perfil do tutor participante da campanha quanto à guarda responsável Através do registro nominal dos tutores no inquérito, foi identificada a participação de 151 homens (47,94%; 151/315) e 164 mulheres (52,06%; 164/315) na campanha de vacinação contra cinomose. Quanto ao perfil das espécies contactantes domésticas, 77,58% (391/504) dos entrevistados relataram contato de seu animal com outro cão e 31,25% (160/512), com outro felino. Demais informações relativas à guarda responsável são descritos da tabela 3. Variável Percentual de animais vacinados contra cinomose Valor P Teste estatístico Sexo 0,77 Exato de Fischer Macho 31,03 (81/261) Fêmea 32,40 (81/250) Idade 0,003 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 20,00 (26/130) 1 ⎯⎯| 2 anos 32,14 (27/84) 2 ⎯⎯| 5 anos 34,37 (44/128) > 5 anos 40,90 (54/132) Raça Aparente <0,001 Qui-quadrado Raça definida 54,08 (53/98) SRD 25,07 (85/339) Tabela 2: Associação das variáveis sexo e idade com o histórico de vacinação contra cinomose, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. SRD: sem raça definida. 31 Tabela 3: Frequência relativa de respostas relacionadas à guarda responsável, dos tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Quando questionados sobre o conhecimento da cinomose, 49,40% (247/500) dos tutores afirmaram ter conhecimento da doença e 31,71% (163/514) dos entrevistados responderam que seus cães haviam sido vacinados. Ao associar o histórico de vacinação contra cinomose com o conhecimento da doença pelos tutores, o percentual de animais vacinados foi maior (72,78%;115/158) entre os tutores que conheciam a doença (Tabela 4). Variáveis N (%) Contato com cão 391 77,58 Contato com felino 160 31,25 Contato com ovino 3 0,62 Contato com bovino 16 3,14 Contato com suíno 8 1,58 Contato com aves 68 13,55 Conhece a doença 247 49,40 Vacinado contra cinomose 163 31,71 Vacina ética* 122 60,10 Qual vacina utilizada? AR 93 45,37 Polivalente 85 41,46 AR e Polivalente 4 1,95 NR 23 11,22 Data da última vacinação 2013 22 11,22 2012 103 52,55 Antes de 2012 71 36,22 Data da última desvermifugação 2013 174 57,62 2012 97 33,90 Antes de 2012 21 8,47 *Vacina ética: vacina importada e administrada por veterinário. AR: antirrábica; NR: não registrado. 32 Tabela 4: Associação do histórico de vacinação contra cinomose e o conhecimento da doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Foi vacinado contra cinomose? Conhece a doença Vacinado N (%) Não Vacinado N (%) Sim 115 (72,78) 132 (38,94) Não 43 (27,22) 207 (61,06) Total 158 (100) 339 (100) A frequência relativa de cães vacinados entre os tutores que conheciam a doença foi estatisticamente diferente em relação aos tutores que relataram não conhecer (Tabela 5). Tabela 5: Histórico de vacinação contra cinomose de acordo com o conhecimento da doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Quando questionados sobre a realização de vacina ética, 60,10% (122/203) dos tutores afirmaram ter realizado. Ao associar a realização de vacina ética com o conhecimento da doença pelos tutores, o percentual de animais vacinados com vacina considerada ética foi maior (63,64%;77/121) entre os tutores que a conheciam (Tabela 6). Variável Percentual de animais vacinados contra cinomose Valor P* Conhece a doença 0,00001 Sim 46,56 (115/247) Não 17,02 (43/250) N: número de animais. Valor P*: Teste Exato de Fischer. 33 Tabela 6: Associação da realização de vacina ética e o conhecimento da doença, reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. A frequência relativa de cães vacinados com vacina considerada ética entre os tutores que conheciam a doença não apresentou diferença estatística entre os que não conheciam (Tabela 7). Tabela 7: Uso de vacina considerada ética de acordo com o conhecimento da doença reportado por tutores participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. No inquérito aplicado durante a campanha, o tipo de vacina utilizada foi registrado em 205 entrevistas. A especificação no questionário sobre qual produto havia sido utilizado se referia à cinomose, no entanto, alguns tutores registraram no local o uso de vacina antirrábica. Ao avaliar o tipo de vacina utilizada entre os tutores que relataram não ter vacinado seus cães contra cinomose, 86,67% (91/105) haviam utilizado vacina antirrábica e entre os que relataram ter vacinado contra cinomose, 84% (84/100) especificaram o uso da vacina polivalente (Figura 1). Foi realizada vacina ética* Conhece a doença Sim N (%) Não N (%) Sim 77 (63,64) 41 (51,25) Não 44 (36,36) 39 (48,75) Total 121(100) 80 (100) Variável Percentual do uso de vacina ética Valor P* Conhece a doença 0,1072 Sim 65,25 (77/118) Não 53,01 (44/83) *vacina importada e realizada com veterinário 34 Figura 1: Vacinas administradas previamente nos cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, segundo o histórico vacinal reportado pelos tutores. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Foram observados respostas de tutores que relataram não ter vacinado seus cães contra cinomose, mas que registraram uso de vacina polivalente (0,95%; 1/105) e tutores que relataram ter vacinado, mas que registraram somente uso da vacina anti-rábica (2%;2/100). Ao associar o tipo de vacina utilizada com o ano da útlima vacina aplicada, o percentual de animais com vacina antirrábica atualizada (realizada até 2012) foi maior (90,91%; 50/55) do que o percentual de animais com vacina polivalente atualizada (49,38%; 40/81) (Tabela 8). 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% 100,00% 0 1 AR AR e Polivalente Não soube informar Polivalente 10% 0: não vacinado contra cinomose (N=105); 1: vacinado contra cinomose(N=100); AR: vacina anti-rábica. 84% 4% 2% 86,67% 12,38% 0,95% 35 Tabela 8: Associação da vacina administrada previamente nos cães e o ano da última dose administrada, segundo o histórico vacinal reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. A frequência relativa de cães com vacina antirrábica atualizada foi estatisticamente diferente em relação aos animais com vacina desatualizada (realizada antes de 2012) (Tabela 9). Tabela 9: Uso de vacina antirrábica de acordo com o ano da última dose administrada, segundo o histórico vacinal reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Qual vacina foi administrada? Vacina atualizada* Antirrábica (0) Polivalente (1) Sim 50 (90,91) 40 (49,38) Não 5 (9,09) 41 (50,62) Total 55(100) 81 (100) Variável Percentual do uso de vacina AR Valor P* Vacina atualizada* 0,00001 Sim 55,55 (50/90) Não 10,87 (5/46) Vacina atualizada*:realizada até 2012; 0: não vacinado contra cinomose; 1: vacinado contra cinomose. Vacina atualizada*:realizada até 2012; 0: não vacinado contra cinomose; 1: vacinado contra cinomose. 36 Quanto ao controle de endoparasitas, entre os tutores que relataram ter desvermifugado seus animais, o percentual de cães com desvermifugação atualizada (realizada em 2013) foi de 59,59% (174/271) (Tabela 10). Tabela 10: Associação dos animais desvermifugados e o ano de realização da última dose de antiparasitário, reportado pelos tutores durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Em relação aos hábitos alimentares, 6,43% (33/513) relataram fornecer apenas comida aos seus animais. A maioria dos tutores (52,05%; 267/513) relatou fornecer ração e comida caseira (Tabela 11). Tabela 11: Tipo de alimento fornecido, reportado pelos tutores, aos animais participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Variável N % Alimentação Caseira 33 (6,43) Caseira e industrializada 267 (52,96) Industrializada 213 (41,52) Tipos de alimentação 1 tipo (caseira ou industrializada) 246 47,95 2 tipos (caseira e industrializada) 267 52,05 Total 513 100 Animal desvermifugado Data da última desvermifugação Sim N (%) Não N (%) 2013 174 (59,59) 0 (0) 2012 97 (33,22) 3 (100) Antes de 2012 21 (7,19) 0 (0) Total 292(100) 3 (100) N: número de animais. N: número de animais. 37 5.3. Perfil sorológico de anticorpos contra Leptospira spp, T. gondii, E. canis, CDV e CPV Foram observados cães sororreagentes para leptospirose, toxoplasmose, erliquiose, cinomose e parvovirose. A descrição e o resumo do conjunto de variáveis contínuas relativas ao título de anticorpos são apresentados na tabela 12, incluindo as medidas de tendência central (média, mediana), dispersão (valor máximo e mínimo) e desvio padrão. A representação gráfica desses valores é visualizada na figura 2. Tabela 12: Variáveis contínuas dos títulos de anticorpos dos cães submetidos à colheita de sangue durante a campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. N= nº de animais avaliados; HI= Teste de Inibição de Hemaglutinação; SN= Teste de Soroneutralização; SAM= Soroaglutinação Microscópica; RIFI= Reação de Imunofluorescência; Variável N Média Desvio Padrão Mediana Mínimo Máximo Titulação anti- Leptospira spp. (SAM) 120 481,6 1471,86 0 0 12.800 Titulação anti- T. gondi (RIFI) 336 35,7 108,5 16 0 1024 Titulação anti- E. canis (RIFI) 438 38.946,6 61.972,7 2.560 0 163.840 Titulação anti- Vírus da Cinomose Canino (SN) 545 15,09 27,26 <8 <8 256 Titulação anti- Parvovirus canino pré- vacinação (HI) 332 211,98 266,73 128 2 2048 38 N= 563 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 CDV Ti tu lo d e an tic or po s (U SN ) N= 480 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 CPV Ti tu lo d e an tic or po s (U H I) N= 438 1 4 16 64 256 1024 4096 16384 65536 262144 E. canis Ti tu lo d e an tic or po s (R IF I) N= 336 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 T. gondii Ti tu lo d e an tic or po s (R IF I) N= 120 1 4 16 64 256 1024 4096 16384 Leptospira spp. Ti tu lo d e an tic or po s (S AM ) Figura 2: Representação gráfica dos valores de mediana, 1° e 3° quartis, valores mínimos, máximos do título de anticorpos contra Leptospira spp.,T. gondiiE. canis Virusa Canino da Cinomose (CDV)e Parvovirus Canino (CPV)pré-vacinação em cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose, Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. 0 0 0 0 0 N=332 N=545 N=336 N=438 N=120 39 Anticorpos contra Leptospira spp. foram detectados em 43,33% (52/120), em 52,97% (178/336) contra T. gondii e em 72,14% (316/438) contra E. canis. Anticorpos contra Vírus da Cinomose Canino (CDV- Canine Distemper Virus) foram detectados em 17,24% (94/545) das amostras, com níveis protetores em 2,84% (16/545) e contra Parvovírus Canino (CPV- Canine Parvovirus), em 91,86% (305/332), apresentando níveis protetores de anticorpos em 64,15% (213/332) das amostras. A figura 5 apresenta o resultado integrado dos testes sorológicos e a frequência dos títulos de anticorpos para cada agente pesquisado em todas as amostras avaliadas, incluindos os resultados soronegativos. A soropositidade para cada agente foi descrita em associação com as seguintes categorias: sexo, idade e contato com outros cães. Também foram realizadas associações da soroprevalência com demais variáveis disponíveis no inquérito, convenientes para cada enfermidade. A saber, leptospirose associada à presença de roedores; toxoplasmose associada ao contato com felinos; cinomose e parvovirose associados ao histórico de vacinação contra cinomose e ano de última dose. 40 5.3.1. Distribuição de anticorpos contra leptospirose Figura 3: Distribuição do título de anticorpos contra Leptospira spp., T. gondii, E. canis, CDV e CPV em cães participantes da campanha de vacinação contra a cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. 41 Os exames de SAM para leptospirose detectaram 43,33% de animais reagentes (52/120) com títulos variando de 200 a 12800. A média de idade de cães sororreagentes foi de 3,16 ±2,89 anos. Os possíveis fatores de risco analisados não demonstraram associação com os cães sororreagentes na SAM (valor p>0,05) (Tabela 13). Na investigação das sorovariantes mais frequentes entre as 52 amostras soropositivas, 86,53% (45/52) dos animais apresentaram um sorovar com título dominante. O sorovar identificado com maior frequência foi o Canicola, em 67,30% (35/52) das amostras, seguido do Pyrogenes, em 9,62% (5/52). Coaglutinações foram observadas entre as variantes sorológicas Canicola, Pyrogenes, Copenhageni, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Gryppotyphosa, sendo a combinação observada mais frequente entre Canicola e Pyrogenes em 5,77% (3/52) dos soropositvos (Tabela 14). Variável Percentual de animais sororreagentes na SAM Valor P Teste estatístico Sexo 1,00 Exato de Fischer Macho 36,07 (22/61) Fêmea 36,96 (17/46) Idade 0,21 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 44,44 (12/27) 1 ⎯⎯| 2 anos 44,44 (8/18) 2 ⎯⎯| 5 anos 37,50 (9/24) > 5 anos 25,58 (7/31) Contato com cães 0,64 Exato de Fischer Sim 38,27 (31/81) Não 32,00 (8/25) Presença de roedores 0,54 Exato de Fischer Sim 33,33 (16/48) Não 41,07 (23/56) Tabela 13: Associação de possíveis fatores de risco de leptospirose, em amostras sororreagentes (N=52) para Leptospira spp. de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. SAM: Soroaglutinação Microscópica. 42 Tabela 14: Distribuição dos títulos máximos dos sorovares dominantes e das co-aglutinações anti- Leptospira na prova de soroaglutinação microscópica (SAM) em 52 amostras sorreagentes de cães participantes da campanha de vacinação conta cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. Sorovar Titulo Total N (%) 200 400 800 1600 3200 6400 12800 Canicola 10 5 8 8 1 2 1 35 (67,30) Pyrogenes 4 1 - - - - - 5 (9,62) Copenhageni 2 - 1 - - - - 3 (5,77) Butembo 1 1 - - - - - 2 (3,86) Canicola/ Pyrogenes 2 1 - - - - 3 (5,77) Copenhageni/ Pyrogenes 1 - - - - - - 1 (1,92) Icterohaemorrhagiae/ Pyrogenes 1 - - - - - - 1 (1,92) Pomona/ Grippotyphosa - - 1 - - - - 1 (1,92) Canicola/ Pomona/ Grippotyphosa - - 1 - - - - 1 (1,92) TOTAL 21 8 11 8 1 2 1 52 (100) 43 5.3.2. Distribuição de anticorpos contra toxoplasmose Os exames de RIFI resultaram positivos para anticorpos anti-T. gondii em 52,97% (178/336) dos cães, com títulos variando de 16 a 1024. A idade média de idade dos cães reagentes foi de 3,39 ±3,39 anos. Quanto aos possíveis fatores de risco analisados, a idade demonstrou associação com a soroprevalência de toxoplasmose nos cães, apresentando maior frequência em animais de 2 a 5 anos (62,66;47/75) (p<0,05) (Tabela 15). Variável Percentual de animais sororreagentes na RIFI Valor P Teste estatístico Sexo 0,002 Exato de Fischer Macho 60,43(110/182) Fêmea 43,04(65/151) Idade 0,02 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 42,35 (36/85) 1 ⎯⎯| 2 anos 58,62 (34/58) 2 ⎯⎯| 5 anos 62,66 (47/75) > 5 anos 62,16 (69/111) Contato com cães 0,68 Exato de Fischer Sim 52,54 (134/255) Não 55,55 (40/72) Contato com felinos 0,46 Exato de Fischer Sim 56,12 (55/98) Não 51,54 (117/227) Tabela 15: Associação de possíveis fatores de risco de toxoplasmose em amostras sororreagentes (N=178) para T. gondii, de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. RIFI: Reação de Imunfluorescência Indireta. 44 5.3.3. Distribuição de anticorpos contra erliquiose Os exames de RIFI para anticorpos anti- Ehrlichia foram reagentes em 72,14% (316/438) amostras com títulos variando de 40 a 163.840. A idade média de idade dos cães reagentes foi de 3,31 ±3,86 anos. Os possíveis fatores de risco analisados não demonstraram associação com os cães sororreagentes na RIFI (valor p>0,05) (Tabela 16). Variável Percentual de animais sororreagentes na RIFI Valor P Teste estatístico Sexo 0,51 Exato de Fischer Macho 70,92 (161/227) Fêmea 73,76 (149/202) Idade 0,84 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 69,44 (75/108) 1 ⎯⎯| 2 anos 71,62 (53/74) 2 ⎯⎯| 5 anos 73,26 (74/101) > 5 anos 74,77(83/111) Contato com cães 1,00 Exato de Fischer Sim 72,04 (232/322) Não 72,52 (66/91) Tabela 16: Associação de possíveis fatores de risco de erliquiose em amostras sororreagentes (N=316) para E. canis, de cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. RIFI: Reação de Imunfluorescência Indireta. 45 O exame de PCR foi realizado em 210 amostras, com positividade em 13,33% (28/210). Anticorpos anti-E. canis foram detectados em 90% (189/210) das amostras submetidas à PCR. A distribuição dos títulos de anticorpos anti- E. canis dentre as amostras submetidas ao exame molecular é apresentado na tabela 17. Tabela 17: Associação entre os títulos de anticorpos contra E. canis na prova de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) (N=189) e o exame de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. PCR Título anti- E. canis Positivo Negativo Total (%) N (%) N (%) 0 4 (16,00) 44 (26,83) 48 (25,40) 40 - 9 (5,49) 9 (4,76) 160 - 6 (3,66) 6 (3,17) 640 1 (4,00) 11 (6,71) 12 (6,35) 2560 4 (16,00) 18 (10,98) 22 (11,64) 10240 6 (24,00) 31 (18,90) 37 (19,58) 40960 6 (24,00) 19 (11,59) 25 (13,23) 163840 4 (16,00) 26 (15,85) 30 (15,87) TOTAL 25 (100) 164 (100) 189 (100) PCR: Reação em Cadeia Polimerase (Polymerase Chain Reaction). 46 5.3.4. Distribuição de anticorpos contra cinomose Os soros submetidos a soroneutralização foram sororreagentes (títulos ≥8USN) para anticorpos anti-CDV em 17,24% (94/545) das amostras, apresentando níveis protetores (título≥100USN) em 2,93% (16/545). Os animais apresentaram, em sua maioria, anticorpos com títulos ≤8UISN (82,75%; 451/545). A idade média dos cães reagentes foi de 3,49 ±3,27 anos. Os possíveis fatores de risco analisados não apresentaram associação com os animais sororreagentes para cinomose nos cães (p>0,05) (Tabela 18). Variável Percentual de animais sororreagentes na SN Valor P Teste estatístico Sexo 0,79 Exato de Fischer Fêmea 15,19 (31/204) Macho 16,37 (38/232) Idade 0,14 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 16,66 (18/108) 1 ⎯⎯| 2 anos 21,92 (16/73) 2 ⎯⎯| 5 anos 15,38 (16/104) > 5 anos 9,64 (11/114) Contato com cães 0,63 Exato de Fischer Sim 16,45 (53/322) Não 13,54 (13/96) Vacinado contra cinomose? 0,26 Exato de Fischer Sim 18,24 (27/148) Não 14,02 (39/278) Ano da última dose 0,43 Qui-quadrado 2013 15,78 (3/19) 2012 23,80 (20/84) Antes de 2012 15,87 (10/63) Tabela 18: Associação de possíveis fatores de risco de cinomose em amostras sororreagentes (N=94) para o Vírus da Cinomose canino em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. SN: soroneutralização. 47 5.3.5. Distribuição de anticorpos contra parvovirose Resultaram reantes pela prova de inibição da hemaglutinação (títulos >20UIH) para anticorpos anti-CPV 91,86% (305/332) das amostras, apresentando níveis protetores (título≥80UIH) 64,15% (213/332). Os animais apresentaram, em sua maioria, anticorpos com títulos de 256/UIH (23,79%; 79/332). A idade média dos cães reagentes foi de 3,49 ±3,27 anos. Os possíveis fatores de risco analisados não apresentaram associação com os aniamais soorreagentes para parvovirose nos cães (p>0,05) (Tabela 19). Variável Percentual de animais sororreagentes na IH Valor P Teste estatístico Sexo 0,82 Exato de Fischer Fêmea 95,53 (124/134) Macho 91,53 (119/130) Idade 0,60 Qui-quadrado 0 ⎯⎯| 1 ano 91,80 (56/61) 1 ⎯⎯| 2 anos 86,95 (40/46) 2 ⎯⎯| 5 anos 92,42 (61/66) > 5 anos 93,93 (62/66) Contato com cães 1 Exato de Fischer Sim 92,30 (180/195) Não 91,80 (56/61) Vacinado contra cinomose? 0,62 Exato de Fischer Sim 91,40 (85/93) Não 93,41 (156/167) Ano da última dose 0,73 Qui-quadrado 2013 92,86 (13/14) 2012 93,18 (41/44) Antes de 2012 88,63 (39/44) Tabela 19: Associação de possíveis fatores de risco de parvovirose em amostras sororreagentes (N=305) para o Parvovirus canino em cães participantes da campanha de vacinação contra cinomose. Distrito de Rubião Júnior, Botucatu, SP, 2013. IH