2023 LETÍCIA CAVASSINI TORQUATO FIBRA DE CARBONO ATIVADA: avaliação das interações biológicas in vitro São José dos Campos 2023 LETÍCIA CAVASSINI TORQUATO FIBRA DE CARBONO ATIVADA: avaliação das interações biológicas in vitro Tese apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL. Área: Periodontia. Linha de pesquisa: Estudos sobre microbiologia, imunologia e terapia em periodontia e implantodontia. Orientadora: Profa. Assoc. Andréa Carvalho De Marco Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2024]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Torquato, Letícia Cavassini Fibra de carbono ativada: avaliação das interações biológicas in vitro / Letícia Cavassini Torquato. - São José dos Campos : [s.n.], 2023. 83 f. : il. Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em Biopatologia Bucal - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2023. Orientadora: Andréa Carvalho De Marco. 1. Fibra de carbono. 2. Viabilidade celular. 3. Osteogênese. 4. Biofilmes. 5. Engenharia Tecidual. I. De Marco, Andréa Carvalho, orient. II. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. III. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. IV. Universidade Estadual Paulista (Unesp). V. Título. BANCA EXAMINADORA Profa. Assoc. Andréa Carvalho De Marco Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Profa. Assoc. Luana Marotta Reis De Vasconcellos Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Assist. Emanuel da Silva Rovai Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) Instituto de Ciência e Tecnologia Campus de São José dos Campos Prof. Dr. Antônio Carlos Victor Canettieri Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) São José dos Campus Profa. Dra. Camila Lopes Ferreira Universidade de Taubaté (UNITAU) Taubaté São José dos Campos, 17 de novembro de 2023. DEDICATÓRIA Aos meus pais, Cleide Cavassini Torquato e Claudinei Henrique Torquato por toda dedicação, apoio e carinho. Vocês são meus exemplos de garra e superação, não há forma de agradecer por todos os sacrifícios que fizeram e fazem por mim, obrigado por me guiarem nesses anos, devo tudo a vocês. Ao meu noivo, Juliano Kazuto Chiba por toda paciência, dedicação e amor em ajudar a superar os meus obstáculos diários, tenho grande admiração pela sua força e determinação, tenho certeza que só cheguei mais longe por todo seu apoio. À minha irmã Rafaela, que me apoia em todas as decisões que venho tomando durante meu caminho e sempre estando presente em momentos difíceis. Aos meus avós paternos, Maria Luiza Batista Torquato e Lazaro Aparecido Torquato (in memorian) por sempre me verem com orgulho. À minha avó materna, Margarida Frizo Cavassini por ser meu exemplo de pessoa de fé e amor. À Deus, por ter me abençoado colocando pessoas maravilhosas em meu caminho que me ajudam a crescer diariamente. AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Instituto de Ciência e Tecnologia - Unesp, na pessoa do diretor do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, Prof. Dr. Cesar Rogério Pucci e da vice-diretora Profa. Dra. Symone Cristina Teixeira. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Saúde – CASB e ao programa de Biopatologia Bucal na pessoa do coordenador Prof. Alexandre Luiz Souto Borges. Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, Profa. Assoc. Andréa Carvalho De Marco, Prof. Assist. Emanuel da Silva Rovai, Prof. Assoc. Maria Aparecida Neves Jardini, Prof. Assoc. Mauro Pedrine Santamaria, e o Prof. Assoc. Sérgio Lúcio P. de Castro Lopes. Aos meus amigos da Pós-graduação, pelo companheirismo e ajuda diária. Especialmente à Caroline Trefiglio Rocha, Clarissa Carvalho Martins Maciel, Eduardo Antônio Chelin Suarez, Felipe Moura e Nátaly Domingues Almeida. Agradeço também aos alunos Juliani Caroline Ribeiro Araújo e Marina Fernandes, e a Profa. Dra. Camilla Magnoni Moretto Nunes pelo auxilio, amizade e companhia nos laboratórios. Aos meus amigos Andressa Pedrine Falcon, Bruna Emi Takamura Nakahara e Hugo Heiji Irie, agradeço pelo carinho e apoio. Agradeço à parceria dos professores Profa. Assoc. Luana Marotta Reis de Vasconcellos, Profa. Assoc. Luciane Dias De Oliveira, Prof. Jossano Saldanha Marcuzzo e Prof. Eduardo José de Arruda. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da Bolsa de Doutorado no período de 01/01/2022 à 01/12/2023. Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica - PIBIC, pela concessão de bolsa para Luiz Augusto Rodrigues dos Santos (3994), Bianca Aparecida dos Santos (6424) e Tainá Amorim Ono (6389), e aos alunos que participaram ativamente deste trabalho. À equipe técnica da clínica, Jacqueline Amaral Gomes Bueno, Marcia Cristina Lopes Garcia e Valeria Santos da Silva, pela ajuda e dedicação de sempre. Agradeço especialmente minha orientadora, não poderia ter escolhido alguém melhor para me guiar em todo esse processo, obrigada pela dedicação, amor e carinho em toda nossa trajetória. "Sempre que alguém cria alguma coisa com todo o coração, essa criação recebe uma alma". Hayao Miyazaki SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................ 9 RESUMO ........................................................................................................... 10 ABSTRACT ....................................................................................................... 12 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 14 2 FIBRA DE CARBONO ATIVADA INCORPORADA COM ÍONS DE PRATA (AgNO3): avaliação das interações biológicas in vitro ..................... 18 2.1 PROPOSIÇÃO ............................................................................................ 18 2.1.2 Objetivo geral ........................................................................................... 18 2.1.3 Objetivos específicos ................................................................................ 18 2.2 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 19 2.2.1 Obtenção da fibra de carbono ................................................................. 19 2.2.2 Ensaios biológicos in vitro ........................................................................ 22 2.2.3 Cultura celular .......................................................................................... 23 2.2.4 Avaliação da proliferação celular ........................................................... 26 2.2.5 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) .......................... 27 2.2.6 Interação celular com a fibra .................................................................. 27 2.2.7 Conteúdo de proteína total ...................................................................... 28 2.2.8 Atividade de fosfatase alcalina ................................................................ 29 2.2.9 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização .................... 29 2.2.10 Avaliação da formação de biofilme microbianos ................................ 30 2.2.11 Análise Estatística .................................................................................. 32 2.3 RESULTADOS ............................................................................................ 32 2.3.1 Proliferação celular .................................................................................. 32 2.3.2 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) .......................... 33 2.3.3 Interação celular ....................................................................................... 34 2.3.4 Conteúdo de proteína total ...................................................................... 36 2.3.5 Atividade de fosfatase alcalina ................................................................ 36 2.3.6 Análise da formação de nódulos de mineralização ............................... 37 2.3.7 Avaliação da formação de biofilme microbianos .................................. 39 2.4 DISCUSSÃO ................................................................................................ 42 2.5 CONCLUSÃO ............................................................................................. 47 3 FIBRA DE CARBONO ATIVADA INCORPORADA COM ÍONS DE METAIS: avaliação das interações biológicas in vitro ................................... 48 3.1 PROPOSIÇÃO ............................................................................................ 48 3.1.1 Objetivo geral ........................................................................................... 48 3.1.2 Objetivos específicos ................................................................................ 48 3.2 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................... 49 3.2.1 Preparação da fibra de carbono ativada ................................................ 49 3.2.2 Ensaios biológicos in vitro ........................................................................ 50 3.2.3 Cultura celular .......................................................................................... 50 3.2.4 Avaliação da proliferação celular ........................................................... 52 3.2.5 Interação celular com a fibra .................................................................. 53 3.2.6 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) .......................... 53 3.2.7 Conteúdo de proteína total ...................................................................... 54 3.2.8 Atividade de fosfatase alcalina ................................................................ 54 3.2.9 Avaliação da Genotoxicidade .................................................................. 55 3.2.10 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização .................. 57 3.2.11 Análise estatítica ..................................................................................... 58 3.4 RESULTADOS ............................................................................................ 58 3.4.1 Proliferação celular .................................................................................. 58 3.4.2 Interação celular ....................................................................................... 59 3.4.3 Viabilidade celular ................................................................................... 62 3.4.4 Conteúdo de Proteína Total .................................................................... 63 3.4.5 Atividade de Fosfatase alcalina ............................................................... 63 3.4.6 Genotoxicidade ......................................................................................... 64 3.4.7 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização .................... 67 3.5 DISCUSSÃO ................................................................................................ 68 3.6 CONCLUSÃO ............................................................................................. 72 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ....................................................................... 73 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 74 ANEXO A – Certificado da Comissão de Ética do Uso de Animais ............ 81 ANEXO B – Certificado da Comissão de Ética do Uso de Animais ............. 82 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ALP Fosfatase Alcalina EMS Solução de metanossulfonato de etila FCA Fibra de Carbono Ativada FCAAg Fibra de Carbono Ativada com Prata FCAAu Fibra de Carbono Ativada com Ouro FCACu Fibra de Carbono Ativada com Cobre FCAPd Fibra de Carbono Ativada com Paládio FCAPt Fibra de Carbono Ativada com Platina FCNA Fibra de Carbono Não Ativada MEV Microscopia Eletrônica de Varredura MTT Brometo de 3-4,5-dimetiltiazo MTS Meio Total Suplementado MTS-O Meio Total Suplementado Osteogênico PAN Fibra de Poliacrilonitrila PBS Tampão fosfato-salino PT Proteína Total Torquato LC. Fibra de carbono ativada: avaliação das interações biológicas in vitro [tese]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2023. RESUMO Devido a constante necessidade de desenvolver materiais biocompatíveis com propriedades osteocondutores e osteoindutoras, a presente tese conta com o desenvolvimento de dois estudos in vitro com fibra de carbono obtida a partir de fibra PAN têxtil, incorporada com diferentes íons de metais, na osteogênese com vistas à compreensão das necessidades da engenharia tecidual no desenvolvimento desse biomaterial com adequadas propriedades biológicas. As células foram obtidas dos fêmures de 09 ratos machos adultos (Wistar) pesando 300g, com 90 dias. Estudo 1: A partir da preparação da fibras foram obtidos corpos de prova de 4 mm de diâmetro e 2 mm de altura, dos seguintes grupos: fibra de carbono não ativada (FCNA), fibra carbono ativada (FCA) e fibra carbono ativada com prata (FCAAg). Após plaqueamento (n=5) em meio suplementado (MTS) e meio suplementado osteogênico (MTSO) foram analisados: viabilidade celular, conteúdo de proteína total (PT), atividade de fosfatase alcalina (ALP), interação celular e formação de nódulos de mineralização. Foi avaliada a formação de biofilme nos corpos de prova, utilizando cepas de S. aureus, P. aeruginosa e E. coli. Na viabilidade celular, houve diferença estatística entre grupo controle celular (C) e FCA-MTS, FCAAg-MTS e FCAAg-MTSO. Em PT, não houve diferença, na ALP houve diferença entre C-MTS e as fibras, C-MTSO se mostrou semelhante. Em nódulos, houve diferença entre C-MTS e C-MTSO e as fibras do MTSO. Houve redução de formação de biofilme do S. aureus na FCAAg. Estudo 2: Foram obtidos corpos de prova da mesma dimensão do estudo 1 (n=5) dos seguintes grupos: fibra carbono ativada com prata (FCAAg), fibra carbono ativada com ouro (FCAAu), fibra carbono ativada com cobre (FCACu), fibra carbono ativada com paládio (FCAPd) e fibra carbono ativada com platina (FCAPt). Foram quantificadas a proliferação celular, viabilidade celular, formação de nódulos de mineralização, conteúdo de PT e ALP. Todas as amostras mostraram-se semelhantes quanto a proliferação celular, com exceção do grupo FCAAg comparado ao grupo controle (C). Sobre viabilidade celular, C obteve maior viabilidade que os outros grupos, e FCA obteve maior taxa que os grupos FCAAg, FCACu, FCAPt, sendo semelhante aos grupos FCAAu e FCAPd. Já os grupos FCAAu e FCAPd apresentaram diferença aos grupos FCAAg e FCACu. Na análise de expressão de PT apenas houve diferença entre FCA e FCAAu, sendo FCAAu com menor expressão de produção de PT. Na avaliação da ALP os grupos FCAAg e FACu mostraram diferença estatística e inferior com os grupos C, FCAAu, FCAPd e FCAPt, além disso, o grupo FCA mostrou menor taxa que C. Conclusões: As fibras utilizadas de base para a incorporação dos íons demonstraram grande potencial para uso como scaffold para reparação óssea, isso porque em ambos os estudos, na forma ativada e não ativada, as fibras apresentaram viabilidade celular e quantificação de cálcio satisfatórias. Sendo a versão não ativada mais econômica no que diz respeito ao tempo e custo de preparação. Mais estudos devem ser empregados a fim de assegurar sua segurança clínica em relação à citotoxicidade da incorporação de íons de ouro e paládio. Palavras-chave: Fibra de carbono. Viabilidade celular. Osteogênese. Biofilmes. Engenharia Tecidual. Torquato LC. Activated carbon fiber: evaluation of biological interactions in vitro [doctorate thesis]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2023. ABSTRACT Due to the constant need to develop biocompatible materials with osteoconductive and osteoinductive properties, this thesis involves the development of two in vitro studies with carbon fiber obtained from textile PAN fiber, incorporated with different metal ions, in osteogenesis with a view to understanding the needs of tissue engineering in the development of this biomaterial with adequate biological properties. The cells were obtained from the femurs of 9 adult male rats (Wistar) weighing 300g, aged 90 days. Study 1: From the fiber preparation, specimens measuring 4 mm in diameter and 2 mm in height were obtained from the following groups: non-activated carbon fiber (FCNA), activated carbon fiber (FCA) and silver-activated carbon fiber (FCAAg). After plating (n=5) in supplemented medium (MTS) and supplemented osteogenic medium (MTSO), cell viability, total protein content (PT), alkaline phosphatase (ALP) activity, cell interaction and formation of mineralization nodules were analyzed. . Biofilm formation was evaluated in the specimens, using strains of S. aureus, P. aeruginosa and E. coli. In cell viability, there was a statistical difference between the cell control group (C) and FCA- MTS, FCAAg-MTS and FCAAg-MTSO. In PT, there was no difference, in ALP there was a difference between C-MTS and fibers, C-MTSO was similar. In nodules, there was a difference between C-MTS and C-MTSO and MTSO fibers. There was a reduction in S. aureus biofilm formation on FCAAg. Study 2: Specimens of the same size as in study 1 (n=5) were obtained from the following groups: carbon fiber activated with silver (FCAAg), carbon fiber activated with gold (FCAAu), carbon fiber activated with copper (FCACu), palladium-activated carbon fiber (FCAPd) and platinum-activated carbon fiber (FCAPt). Cell proliferation, cell viability, formation of mineralization nodules, PT and ALP content were quantified. All samples were similar in terms of cell proliferation, with the exception of the FCAAg group compared to the control group (C). Regarding cell viability, C obtained higher viability than the other groups, and FCA obtained a higher rate than the FCAAg, FCACu, FCAPt groups, being similar to the FCAAu and FCAPd groups. The FCAAu and FCAPd groups showed differences to the FCAAg and FCACu groups. In the analysis of PT expression, there was only a difference between FCA and FCAAu, with FCAAu having lower expression of PT production. In the ALP assessment, the FCAAg and FACu groups showed a lower statistical difference compared to the C, FCAAu, FCAPd and FCAPt groups, in addition, the FCA group showed a lower rate than C. Conclusions: The fibers used as the basis for the incorporation of ions demonstrated great potential for use as a scaffold for bone repair, because in both studies, in activated and non-activated form, the fibers showed satisfactory cell viability and calcium quantification. The non-activated version is more economical in terms of preparation time and cost. More studies must be carried out to ensure its clinical safety in relation to the cytotoxicity of the incorporation of gold and palladium ions. Keywords: Carbon fiber. Cell survival. Ostegonesis. Biofilms. Tissue Engeneering. 14 1 INTRODUÇÃO O tecido ósseo é um tecido conjuntivo especializado que possui funções de proteção, sustentação, reserva de cálcio e íons, sendo constituído por células e matriz calcificada (Uchoa e José, 2017), sendo caracterizado como um tecido ímpar no quesito de auto-remodelação e regeneração. Isso porque o tecido ósseo é composto por diferentes componentes celulares, osteoblastos, osteoclastos, osteócitos e células precursoras osteogênicas da medula óssea. Os osteoblastos são responsáveis pela formação óssea através da sintetização dos componentes orgânicos da matriz extracelular e no controle da mineralização da mesma. Incorporados à esta matriz, os osteócitos detectam sobrecarga mecânica e transmitem essa informação para outras células, regulando a função de osteoblastos e osteoclastos. Os osteoclastos são células especializadas multinucleadas responsáveis pela reabsorção óssea (Lindhe e Lang, 2018). Devido a essa interação celular, microfraturas podem ser reparadas sem que haja a percepção do indivíduo, devido a capacidade auto reparadora do osso (Peng et al., 2020), onde muitas vezes, apenas manobras de redução e fixação são necessárias para auxiliar de maneira secundária o processo de cicatrização próprio desse tecido. No entanto, os defeitos ósseos podem ter extensão variada devido às suas diferentes etiologias, podendo estar relacionados a: periodontite, trauma, tumores, reabsorção pós exodontia, osteomielite, e medicamentos que podem causar necrose do osso mandibular (Tüz et al., 2019). Os defeitos de tamanho crítico, apesar da estabilização cirúrgica, não se reparam espontaneamente e requerem intervenção cirúrgica adicional, como enxertos ósseos autógenos (Keating et al., 2005). 15 O enxerto ósseo autógeno, ainda é considerado o padrão ouro (Rather et al., 2019), devido a suas características de osteocondução, osteoindução e efeitos osteogênicos que promovem elevado potencial regenerativo (Klijn et al., 2010). Porém, esse tipo de enxerto possui algumas desvantagens: a necessidade de dois sítios cirúrgicos, um doador e outro receptor, disponibilidade óssea do sítio doador, tendência à remodelação parcial, desconforto pós-operatório, morbidade no local doador, risco de parestesia (Loyola et. al, 2018, Zhao et. al, 2011). A busca de materiais com características osteocondutivas, osteoindutivas e osteogênicas é constante, sendo requisitos essenciais para promover o crescimento de um novo osso, além da interação com o tecido adjacente (Bow et al., 2019). A utilização de enxertos xenogênicos, alogênicos e sintéticos aparece como uma opção atraente para suprir as limitações do enxerto autógeno (Hasan et. al, 2018). Neste cenário, a criação de materiais biológicos sintéticos vem ganhando grande enfoque para a Engenharia de tecido ósseo (Buser et al., 2016), área que tem como proposta desenvolvimento de arcabouços tridimensionais que simulam a matriz extracelular nos tecidos ósseos para formação de um tecido ósseo inédito por meio da proliferação de osteoblastos, a partir da diferenciação de células osteogênicas. O desenvolvimento de biomateriais consiste na elaboração de materiais capazes de repor ou aprimorar funções biológicas, tendo como base o estudo das propriedades específicas de cada tecido e a interação desses materiais com o meio biológico (Sergio, 2020). Comumente, os biomateriais empregados para reparação óssea apresentam somente a capacidade osteocondutora (Anthony, Karl-Erik e Lars, 2016), onde os biomateriais são usados como scaffolds (arcabouços) biocompatíveis para a reparação óssea por meio da migração e proliferação celular (Thrivikraman et al., 2017). Materiais com estruturas nanométricas à base de carbono têm sido utilizados em várias áreas por serem quimicamente estáveis, mecanicamente 16 fortes, acessíveis economicamente e biologicamente compatíveis, despertando interesse como material de arcabouço para a engenharia de tecido ósseo (Peng et al., 2020). Além disso, em comparação aos enxertos ósseos tradicionais, os arcabouços produzidos possuem certas vantagens, como maior vida útil, facilidade de esterilização e baixa chance de infecção (Peng et. al, 2020). As fibras de carbono têm demonstrado biocompatibilidade tanto in vitro quanto in vivo e tem sido usadas como biomateriais (Deng et al., 2017). Comparado a outros tipos comuns de carbono (pó ou granulado), a fibra de carbono ativada (FCA) possui características especiais. Ela proporciona uma capacidade alta e rápida de adsorção para componentes específicos, íons, metais ou componentes orgânicos, devido ao fato desses componentes possuírem pequenas dimensões e pela FCA ter estruturas de poros bem definidas (Botanni & Tascón, 2008; Marsh & Reinoso, 2000). Sua estrutura e arquitetura formam diretamente na superfície uma grande quantidade de microporos, favorecendo um mecanismo de adsorção rápido e menos energético, principalmente para gases (Mochida et al., 2000). Porém, é desafiador transformar a FCA em forma têxtil, pois apesar de ter uma alta capacidade de adsorção ela não pode ser utilizada no processo têxtil normalmente por ser um material frágil e não possuir resistência mecânica o suficiente. Então, com a finalidade de solucionar esse ponto de fragilidade, foi desenvolvida a fibra PAN têxtil oxidada, esta por sua vez a partir de processamento têxtil foi transformada em feltro, que em seguida passou a ser carbonizada e ativada para resultar fibra de carbono ativada na forma de feltro (Marcuzzo et al., 2016). A fibra de poliacrilonitrila carbonizada (cPAN) é um isomorfo de carbono que pode ser facilmente processado para a utilização em arcabouços 3D. Suas propriedades biológicas para o uso na engenharia tecidual não estão totalmente elucidadas, mas há estudos otimistas sobre sua ação osteoindutora e 17 sobre sua biocompatibilidade (Aoki et al., 2009, Ryu et. al, 2014). Comparada a outros materiais, com estruturas nanométicas, a cPAN apresentou melhor biocompatibilidade e viabilidade celular (Ryu et. al, 2014). Os feltros de fibra de carbono ativada (FFCA), são produzidos a partir de fibra PAN, que após serem oxidadas termicamente podem ser utilizadas como matéria prima para a produção de feltro, resultando no feltro de fibra PAN oxidada (Marcuzzo et al., 2016). Além do uso de carbono, há estudos promissores sobre propriedades desejáveis dos biomateriais incorporados com íons, sendo o método de incorporação simples, econômico e seguro para auxiliar no processo de reparação óssea, como por exemplo, o cobre pode contribuir para a adesão celular, proliferação, migração e diferenciação celular de células-tronco mesenquimais em células osteogênicas, além de propriedade antibacteriana e anti-infecciosa semelhante à prata, que é capaz também de acelerar o processo de osteogênese (Wang et al., 2021, O'Neill et al., 2018). Ademais, a adição de íons metálicos, como os de cobre, prata e ouro, em biomateriais vêm demonstrando resultados positivos no reparo ósseo por ter potencial de promover a indução de diferenciação celular osteoblástica (Qin et al., 2014, Zhang et al., 2019), maior número de vasos sanguíneos (Zhang et al., 2015) e ação antibacteriana (Ribeiro et al., 2017). Em relação aos íons de platina e paládio, por serem semelhantes, há estudos com esses dois íons e suas propriedades anticancerígenas (Lazarević et al., 2017, Zhang et al., 2017). Porém, ainda não há pleno conhecimento dos mecanismos específicos da efetividade da incorporação desses íons na regeneração óssea (Lin et al., 2019). Deste modo, o presente estudo tem como objetivo avaliar o feltro de fibra de carbono ativada, chamada aqui de Fibra de Carbono, nas suas diferentes apresentação com íons de prata, ouro, cobre, paládio e platina com adequadas propriedades biológicas na osteogênese de células mesenquimais osteoblásticas. 18 2 FIBRA DE CARBONO ATIVADA INCORPORADA COM ÍONS DE PRATA (AgNO3): avaliação das interações biológicas in vitro 2.1 PROPOSIÇÃO 2.1.2 Objetivo geral O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a fibra carbono ativada com prata (FCAAg) obtida a partir de fibra PAN têxtil na atividade osteogênica de células com vistas à compreensão das necessidades da engenharia tecidual no desenvolvimento desse biomaterial com adequadas propriedades biológicas. 2.1.3 Objetivos específicos Como objetivos secundários o presente estudo irá analisar: a) a citotoxicidade e a adesão; b) o conteúdo de proteína total e a atividade da fosfatase alcalina; c) a formação de nódulos de mineralização; d) a formação de biofilmes monotípicos de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. 19 2.2 MATERIAL E MÉTODOS 2.2.1 Obtenção da fibra de carbono A obtenção do material se deu pela parceria com a empresa “JMHP Consultoria em Materiais e Informática LTDA”. Fibras PAN de 5.0 dtex em cabo de 200 mil filamentos foram oxidadas termicamente e utilizadas como matéria prima para a produção de feltro. A matéria prima (feltro de fibra PAN oxidada) foi colocada em um porta amostra, especialmente desenhado, e inserido em um forno tubular elétrico para carbonização (900 °C) por 30 min, e em seguida foi ativada em atmosfera de CO2 a 1000°C durante 50 min (Figura 1). Figura 1 – Esquematização do forno tubular elétrico onde será inserido o porta amostra contendo a matéria prima que passará pelo processo de carbonização e ativação Fonte: Imagem adaptada de Marcuzzo et al., (2016). 20 Na microscopia eletrônica de varredura (MEV) é possível observar que a fibra carbono ativada (FCA) possui estrutura bidimensional desordenada (Figura 2a), suas fibras tem cerca de 10-15µm de diâmetro (Figura 2b). Na adsorção de gás nitrogênio foi indicado que a superfície das fibras é populada por microporos, sendo sua grande maioria dimensionados em torno de 1,2 nm, o diâmetro máximo apresentado foi de aproximadamente de 3,2 nm. Com relação à sua capacidade de adsorção pelo iodo e pelo azul de metileno, FCA apresentou níveis maiores do que os encontrados na literatura, sugerindo maior eficiência para pequenos compostos moleculares. Figura 2 – a) MEV da estrutura dos filamentos do FCA; b) detalhe das fibras ativadas do FCA Fonte: Imagem adaptada de Marcuzzo et al., (2016). Para a preparação da fibra de carbono ativada com prata (FCAAg), a FCA foi imersa em uma solução aquosa de nitrato de prata (0,01 M de AgNO3) 21 até saturar a adsorção, durante 24 horas. A amostra foi lavada com água deionizada e seca em estufa a vácuo a 50ºC, formando um compósito de prata no feltro fibra de carbono ativada (Rodrigues et al., 2019). A incorporação de prata ocorre em toda a superfície das fibras (Figura 3a), porém as partículas de prata não são uniformemente distribuídas, observa-se que em regiões específicas ocorre formação de aglomerados de prata na superfície das fibras (Figura 3b), o tamanho estimado do grão de prata formado na superfície da fibra de carbono é de 200 nm de diâmetro (Rodrigues et al.,2019). Figura 3 – a) MEV representando a distribuição das partículas de prata nas fibras do FCAAg; b) detalhe da superfície das fibras do FCAAg Fonte: Imagens não publicadas e cedidas pelo Prof. Dr. Jossano Saldanha Marcuzzo. A partir da preparação de fibra de carbono não ativada (FCNA), seguido da fibra carbono ativada (FCA) e fibra carbono ativada com íons prata (FCAAg) 22 foram obtidos corpos de prova de 4 mm de diâmetro e 2 mm de altura, possuindo uma estrutura 3D (Ryu et al., 2014). Os corpos de prova foram separados por grupos de acordo com as formas de apresentação do material. Todos os corpos de prova foram previamente embalados unitariamente em papel grau cirúrgico e esterilizados em autoclave (121°C durante 20 minutos) para serem encaminhados às análises in vitro. Portanto, a parte 1 do estudo teve ao todo 4 grupos experimentais: a) Grupo C: controle celular – células mesenquimais foram plaqueadas sem fibra; b) Grupo FCNA: células mesenquimais foram plaqueadas com a fibra de carbono não ativada; c) Grupo FCA: células mesenquimais foram plaqueadas com a fibra carbono ativada; d) Grupo FCAAg: células mesenquimais foram plaqueadas com a fibra carbono ativada com íons prata. 2.2.2 Ensaios biológicos in vitro Este estudo foi realizado de acordo com os Princípios Éticos para a Experimentação Animal, adotado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA e foi aprovado pelo Comitê de Ética Pesquisa do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos/UNESP (número de protocolo: 16/2020 – Anexo A). A descrição deste trabalho foi feita seguindo as diretrizes do Animal research: Reporting in vivo experiments - ARRIVE (Percie du Sert et al., 2020). 23 Todos os procedimentos biológicos in vitro foram desenvolvidos e executados no Laboratório de Estudos Interdisciplinares em Células (LEIC), localizado no Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal do Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Unesp, Campus de São José dos Campos. 2.2.3 Cultura celular A obtenção e isolamento das células mesenquimais para cultura celular foram obtidas de fêmures de 09 ratos machos adultos (Rattus norvegicus, variação albinus, Wistar) pesando cerca de 300g com aproximadamente 90 dias, estes ratos foram fornecidos pelo Biotério Central da Unesp – Campus de Botucatu-SP para realização de um projeto prévio, as células mesenquimais do presente estudo foram retiradas de fêmures que originalmente seriam descartados. Os ratos foram alocados em gaiolas apropriadas e receberam dieta e água ad libitum até o momento da eutanásia. Os animais foram eutanasiados pela aplicação de anestesia geral em dose triplicada de uma solução de cloridrato de xilazina 2% (10 mg/kg Anasedan – Ceva Brasil), substância com propriedades sedativas e analgésicas, além de relaxante muscular e de ketamina 10% (100mg/kg Dopalen – Ceva Brasil), anestésico geral, por via intramuscular, após os testes de sensibilidade os animais foram decapitados em guilhotina. Em seguida os fêmures foram removidos para a cultura celular. As células da medula óssea dos fêmures de ambas as patas dos animais foram isoladas e inseridas em frascos para cultura celular de 250 mL e 75 cm2 (TPP, Biosystems, Curitiba, PR, Brasil) com meio de cultura essencial mínimo 24 alfa MEM (Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) suplementado com 10% Soro Fetal Bovino (SBF) (Cultilab Ltda, Campinas, Brasil) e gentamicina (500 μg/mL) (Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) (MTS), e posteriormente foram incubadas em estufa à temperatura de 37°C, com umidade atmosférica contendo 5% de CO2. As células foram selecionadas pela aderência ao poliestireno e expandidas até que as células atingissem a confluência, caracterizada pela ocupação de mais de 80% do frasco, para o posterior plaqueamento celular (Figura 4). Figura 4 – Procedimentos para coleta de células mesenquimais Legenda: A) Bancada com itens para remoção dos fêmures, com três tubos de falcons para limpeza dos fêmures; B) Câmera de fluxo laminar com materiais prontos para coleta de células dos três fêmures imersos em álcool 70%; C) Remoção das células por meio de irrigação medular; D) Frascos para cultura celular contendo meio de cultura suplementado (MTS) com as células isoladas. Fonte: Imagem elaborada pelo autor. 25 Para estes procedimentos, inicialmente o meio do frasco de cultura foi aspirado com auxílio de pipeta sorológica e descartado. As células foram lavadas com Tampão fosfato-salino (PBS) e foi adicionado ao frasco 3 mL da solução de tripsina 0,25% (Cultilab Ltda, Campinas, Brasil), para que as células se desprendessem do fundo do frasco. Em seguida, o conteúdo de tripsina foi neutralizado com 6 mL de meio alfa MEM e o conjunto foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL (TTP, Biosystems, Curitiba, Brasil) que foi centrifugado em 5000 rpm por 5 minutos a 25 °C (Centrífuga Labnet– HERMLE Z 300K, NJ, Estados Unidos), com consequente formação do pellet. O sobrenadante foi desprezado e as células foram re-suspendidas em meio alfa MEM e distribuídas nos poços das placas de 96 poços. Foi realizado o plaqueamento celular com aproximadamente 10.000 células/poço, sendo que as células foram contadas por meio do contador automático Countess® (Invitrogen®, Baltimore, Estados Unidos). Para todos os grupos foram utilizados dois meios de cultura, o MTS e MTS osteogênico (MTSO). No MTSO contém 5mg/mL de ácido ascórbico (Neon®, Neon Comercial, Suzano, SP, Brasil) e 2,16g de beta glicerofosfato (Sigma-Aldrich® ref 50020, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Cada grupo experimental continha 10 poços, 5 poços em MTS e 5 poços em MTSO, ambos foram trocados a cada 48 horas até a data dos respectivos testes (Figura 5). O desenvolvimento das células foi avaliado por microscopia de fase invertida (Carl Zeiss® Microlimaging GmbH – Axiovert 40C, Alemanha). As placas foram mantidas em estufa a 37° C com 5% de CO2 até os momentos dos testes, realizados em triplicata. Todos os corpos de prova foram previamente embalados e esterilizados em autoclave (121°C durante 20 minutos) para serem encaminhados às análises in vitro, e para evitar que as amostras ficassem suspensas durante o plaqueamento celular e testes, elas foram embebidas em meio de cultura pelos 24h antes do plaqueamento celular. 26 Figura 5 – Linha do tempo dos Testes Laboratoriais com células Fonte: Imagem elaborada pelo próprio autor. 2.2.4 Avaliação da proliferação celular Para avaliação da proliferação celular, as células mesenquimais foram cultivadas nos poços das placas e as células foram quantificadas após 24h de cultura celular. Para isso, o meio de cultura foi aspirado, e as amostras foram lavadas com PBS (Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) três vezes. Após a lavagem, foi pipetado 200µl de solução de tripsina 0,25% (Cultilab Ltda, Campinas, Brasil) para que as células se desprendessem da amostra, em seguida a placa foi levada para estufa de CO2 por 15 minutos. As células foram contabilizadas por poço utilizando a câmara de Neubauer e o corante Azul de Tripan, sendo que as células que permitirem a incorporação do corante pela membrana foram consideraras inviáveis (Rosa et al., 2003, de Oliveira et al., 2007). 27 2.2.5 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) Após 7 dias de cultura celular foi realizada a avaliação de células vivas (da Silva et al., 2008), após a exposição ao agente tóxico pela incubação com o corante MTT [brometo de 3-4,5-dimetiltiazol] (Sigma Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e análise espectrofotométrica do corante incorporado. Alíquotas de MTT a 0,5 mg/mL em meio de cultura foram preparadas, procedera-se em seguida à incubação das culturas primárias com esta solução por 4 h a 37°C, em estufa contendo 5% de CO2. Após esse período, a solução de MTT foi removida e foi adicionado 500 μL da solução de DMSO (Dimethyl Sulfoxide Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) que permaneceu nos poços por 10 min em estufa de CO2 a 37°C. Em seguida, a placa foi colocada sob agitação por 10 min para solubilização completa do precipitado formado. Alíquotas de 100μL foram retiradas dos poços e transferidas para placa de 96 poços (Greiner CELLSTAR®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para medida colorimétrica em leitor de microplaca no comprimento de onda 570 nm (Biotek® EL808IU, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, Estados Unidos). Os dados foram aferidos como absorbância e armazenados para análise estatística. 2.2.6 Interação celular com a fibra Após 07 dias de cultivo, a interação celular com o biomaterial foi avaliada por FE-SEM (Field Emission Microscopia Eletrônica de Varredura) (Zeiss - EVO MA10, São Paulo, Brasil). As amostras foram lavadas três vezes 28 com PBS para remover as células não aderentes e, em seguida, fixadas quimicamente por metanol durante 20 min, em seguida, as amostras foram submetidas ao processo de desidratação com uma série de soluções de etanol de forma crescente, começando com álcool a 50% até chegar ao álcool absoluto, durando 20 min cada etapa, à temperatura ambiente. Antes da análise, as amostras foram revestidas com uma fina camada de ouro usando um sistema sputter-revestimento. 2.2.7 Conteúdo de proteína total O conteúdo de proteína total foi calculado após 07 dias de cultura (Rosa et al., 2009), de acordo com o método modificado de Lowry et al., (1951). Após a remoção do meio de cultura, os poços foram lavados três vezes com PBS, e preenchidos com 2 mL de lauril sulfato de sódio a 0,1% (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), para extração das proteínas. Após 30 min, 1 mL da solução de cada poço foi misturada com 1 mL da solução de Lowry (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e deixado por 20 min. Em seguida, foi acrescentado à mistura 1 mL de reagente de Folin e Ciocalteau (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por 30 min. A seguir, a absorbância foi aferida a 680 nm em espectrofotômetro (Micronal® AJX 1900, Micronal, S.A., São Paulo, Brasil) e o conteúdo de proteína total foi calculado a partir de uma curva-padrão determinada pela albumina bovina, e expresso em μg/mL. 29 2.2.8 Atividade de fosfatase alcalina A atividade de fosfatase alcalina foi determinada após 07 dias de cultura celular (Rosa et al., 2009), por meio da liberação de timolftaleína por hidrólise do substrato de timolftaleína monofosfato, utilizando kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (Labtest Diagnóstica®, Labtest Diagnóstica S.A, Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil). Inicialmente, 50 μL de timolftaleína monofosfato foram misturados com 0,5 mL de tampão dietanolamina a 0,3 M, pH 10,1. À solução foi acrescentada alíquota de 50 μL dos lisados obtidos de cada poço, permanecendo por 10 min a 37°C em banho-maria. Para o desenvolvimento de cor, foram adicionados 2 mL de carbonato de cálcio (Na2CO3) a 0,09 M e hidróxido de sódio (NaOH) a 0,25 M. A absorbância foi medida em espectrofotômetro (Micronal® AJX 1900, Micronal, S.A., São Paulo, Brasil) utilizando comprimento de onda de 590 nm e a atividade de fosfatase alcalina foi calculada a partir de curva-padrão usando a timolftaleína em uma escala de 0,012 a 0,4 μmol de timolftaleína/hora/μg proteína. 2.2.9 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização A formação de nódulos de mineralização foi avaliada após 10 dias de cultura (de Oliveira et a., 2007). Para tanto, as células aderidas foram fixadas em solução de formol 10% por 2 horas. Após fixação, as amostras foram desidratadas com uma série gradual de álcool e coradas com vermelho de Alizarina S 2% (Sigma- Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), pH 4,2 por 10 min. Os poços das placas foram fotografados em microscopia de luz 30 Axio HBO 100 (Carl Zeiss® Microlimaging GmbH – Axiovert 40C, Alemanha), com aumento de 200 vezes. A quantificação das formações mineralizadas foi realizada de acordo com o método descrito por Gregory et al., (2004). Para tanto, 800 μL de ácido acético 10% foram adicionados em cada um dos poços contendo as amostras e incubados em temperatura ambiente, sob agitação, durante 30 min. Após este período, cada uma das amostras foi raspada com auxílio de uma ponteira para a remoção de maior quantidade de corante. Todo conteúdo de cada um dos poços foi transferido para microtubos de centrífuga com 1,5 mL e agitados em vórtex (Vórtex QL – 901, Biomex Biotecnologia, Ribeirão Preto, SP, Brasil) por 30 s. Os microtubos foram levados ao banho-maria (Banho Metabólico Dubnoff – MA- 095/CF, Marconi Equipamentos Para Laboratórios Ltda, Piracicaba, SP, Brasil) e aquecidos por 10 min, a 85°C sendo posteriormente transferidos para um becker com gelo por 5 min. Em seguida, foram centrifugados (Centrífuga Labnet– HERMLE Z 300K, HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen, Alemanha) por 20 min e 100 μL dos sobrenadantes foram transferidos para placa de 96 poços. Em cada poço foi acrescentado 40 μL de hidróxido de amônia a 10%, para neutralização do ácido. A leitura foi realizada em leitor de microplaca (Biotek – EL808IU, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, Estados Unidos), sob o comprimento de onda de 405 nm. Os dados obtidos foram tabulados e armazenados para análise estatística. 2.2.10 Avaliação da formação de biofilme microbianos Foram utilizadas cepas de referência (ATCC - American Type Culture Collection) de Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa 31 (ATCC 15442) e Escherichia coli (ATCC 25922), provenientes do Laboratório de Microbiologia e Imunologia do Curso de Odontologia do ICT – Unesp. As cepas foram cultivadas em meio sólido (Brain Heart Infusion – BHI para bactérias e levedura) e posteriormente em meio líquido (BHI) por 24 h cada a 37 °C. Em seguida, cada caldo foi centrifugado (2000 rpm/10 min), o sobrenadante descartado e o pellet suspendido em meio líquido (BHI). As amostras esterilizadas pertencentes aos grupos foram distribuídas em poços de placas de 96 poços (n=16), na intenção de verificar potencial de reduzir formação de biofilmes em sua superfície ou no meio em que está inserido, no momento da análise, metade das amostras foram analisadas dentro do poço (P) com meio de cultura (n=8) e a outra metade analisada em um poço de cultura sem meio (B), o biofilme contabilizado seria apenas o que se aderiu à superfície do biomaterial (n=8). A seguir, foram adicionados 100 μl/poço de caldo BHI e 100 μl de suspensão microbiana padronizada a 106 UFC/ml em espectrofotômetro (Micronal, AJX-1900, São Paulo, Brasil) para que houvesse formação de biofilmes monotípicos de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli em contato com os grupos experimentais em cada poço. Após 48 h de incubação (37°C) o meio foi retirado e adicionado 200 μl de MTT [brometo de 3-4,5-dimetiltiazo] (Sigma Aldrich) na concentração de 0,5 mg/ml de PBS. Passado 1 h de incubação, sob proteção da luz, esta solução foi removida e foram adicionados 200 μl de dimetilsulfóxido (DMSO Sigma Alderich) que permaneceu nos poços por 10 min sob incubação em estufa a 37°C. Pelo mesmo período a placa foi levada para agitação em mesa orbital. Alíquotas de 200 μl de cada poço foram transferidas para outra placa de 96 poços (Greiner) e em leitor de microplaca (λ = 570 nm - Biotek EL808IU) foram verificados os valores de absorbância de cada poço. Os testes para formação de biofilme foram realizados em duplicata. 32 2.2.11 Análise Estatística A estatística descritiva consistiu no cálculo de médias e desvio padrão e a estatística inferencial foi realizada primeiramente pela aplicação do teste de Shapiro-Wilk, para a verificação da normalidade dos dados. Os dados das análises in vitro não apresentaram normalidade em sua distribuição, deste modo, foram aplicados os testes estatísticos Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn, com nível de significância convencional de 5%. Os dados apresentados pelas análises de formação de biofilme apresentaram normalidade em sua distribuição, assim, foram aplicados os testes estatísticos análise de variância (ANOVA) – one way, seguido pelo teste de Tukey com nível de significância convencional de 5%. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando o software GraphPad Prisma 7.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). 2.3 RESULTADOS 2.3.1 Proliferação celular Na proliferação celular foi possível observar que as células dos grupos controle MTS e MTS-O tiveram diferença estatística com todas as fibras presentes no estudo (p < 0,05) (Figura 6). 33 Figura 6 - Gráfico representativo com mediana e quartis dos valores apresentados de número de células Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, Kruskall-Wallis e teste de Dunn (p < 0.05). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.3.2 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) Na viabilidade celular, os grupos de controle celular (C-MTS e C-MTS- O) apresentaram diferenças estatísticas significativas com os grupos FFCA- MTS, FCAAg-MTS e FCAAg-MTS-O (p < 0.05), e foram estatisticamente semelhantes aos grupos FCNA-MTS, FCNA-MTS-O e FCA-MTS-O (p > 0.05) (Figura 7). 34 Figura 7 – Gráfico representativo com mediana e quartis dos valores apresentados de viabilidade celular (absorbância 570nm) Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, Kruskall-Wallis e teste de Dunn (p < 0.05). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.3.3 Interação celular Na microscopia eletrônica de varredura, as células, quando visíveis, apresentaram características de aderência ao biomaterial e espraiamento celular, muitas vezes conectando as fibras do feltro. Foi possível observar aderência de células em todas as fibras do presente estudo (Figura 8). 35 Figura 8 – Imagens representativas da Microscopia Eletrônica de Varredura SE, ilustrando células aderidas às fibras as amostras Legenda: a – FFCNA - MTS (magnificação 1000X); b – FCA - MTS (magnificação 1000x), c – FCAAg - MTS (magnificação 1500x); d – FCNA – MTS-O (magnificação 1000x), e – FCA – MTS-O (magnificação 500x), f – FCAAg – MTS-O (magnificação 500x). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 36 2.3.4 Conteúdo de proteína total Na avaliação de conteúdo de proteína total, não houve diferença estatística entre os grupos (Figura 9). Figura 9 - Gráfico representativo com mediana e quartis dos valores apresentados de conteúdo de proteína total Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, Kruskall-Wallis e teste de Dunn (p < 0.05). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.3.5 Atividade de fosfatase alcalina Na análise da atividade de fosfatase alcalina foi possível observar diferença estatística significativa entre o grupo C-MTS com todas as fibras do 37 estudo (p < 0.05), já o grupo C-MTS-O teve diferença estatística significativa apenas com a FCNA-MTS-O (p < 0.05) (Figura 10). Figura 10 - Gráfico representativo com mediana e quartis dos valores apresentados da atividade de fosfatase alcalina Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, Kruskall-Wallis e teste de Dunn (p < 0.05). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.3.6 Análise da formação de nódulos de mineralização Na avaliação da formação dos nódulos de mineralização, foi possível observar a presença de pequenos nódulos ao redor das fibras de carbono, isso em todos os grupos (Figura 11). 38 Figura 11 – Fotomicrografias representativas da formação de nódulos de mineralização Legenda: a – Grupo C - MTS, b – Grupo FCNA – MTS, c – Grupo FCA – MTS, d – Grupo FCAAg – MTS; e – Grupo C – MTS-O; f – Grupo FCNA – MTS-O, g – Grupo FCA – MTS-O, h – Grupo FCAAg – MTS-O, (x10). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 39 Na quantificação de cálcio as fibras do grupo MTS-O apresentaram diferença estatística em relação aos grupos de controle celular de ambos os meios de cultura, MTS e MTS-O, (p < 0.05). Apresar das fibras não terem diferenças estatísticas significativas entre si, as fibras do meio MTS se apresentaram estatisticamente semelhantes aos grupos controles (p > 0.05), demonstrando quantificação de cálcio mais discreta (Figura 12). Figura 12 - Gráfico representativo com mediana e quartis dos valores apresentados da quantificação de cálcio Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, Kruskall-Wallis e teste de Dunn (p < 0.05). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.3.7 Avaliação da formação de biofilme microbianos 40 Na análise de formação de biofilme microbiana da cepa Staphylococcus aureus, observou-se diferença estatística para redução de biofilme em relação ao controle com as fibras FCAAg (P), FCA (B) e FCAAg (B) (p < 0.05). A FCAAg (P) apresentou uma redução de 47,61 % em relação ao controle de crescimento da cepa, enquanto FCA (B) apresentou 37,20 % de redução e FCAAg (B) apresentou 48,21 % de redução (Figura 13). Figura 13 – Gráfico representativo com média e desvio padrão dos valores apresentados na avaliação de formação de biofilme microbiano da cepa Staphylococcus aureus Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA-one way e teste de Tukey (p<0.05). DO: densidade óptica; (P) – biomateriais analisados dentro do poço com meio de cultura e cepas; (B) – biomateriais analisados em poço limpo sem meio de cultura, cepas contabilizadas foram as aderidas apenas ao biomaterial. Fonte: imagem elaborada pelo autor. Na análise da cepa Pseudomonas aeruginosa, houve diferença estatística significativa apenas entre os grupos FCNA (P) e FCA (P) (p < 0.05) (Figura 14). 41 Figura 14 - Gráfico representativo com média e desvio padrão dos valores apresentados na avaliação de formação de biofilme microbiano da cepa Pseudomonas aeruginosa Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA-one way e teste de Tukey (p<0.05). DO: densidade óptica; (P) – biomateriais analisados dentro do poço com meio de cultura e cepas; (B) – biomateriais analisados em poço limpo sem meio de cultura, cepas contabilizadas foram as aderidas apenas ao biomaterial. Fonte: imagem elaborada pelo autor. Na análise de formação de biofilme da cepa Escherichia coli, observou- se diferença estatística significativa para as fibras FCA (B) e FCAAg (B) em relação aos grupos C- e FCAAg (P) (p < 0.05). Em relação ao controle de crescimento, as fibras apresentaram uma redução de formação de biofilme de 51,37 % na FCA (B) e 46,96 % na FCAAg (B) (Figura 15). 42 Figura 15 – Gráfico representativo com média e desvio padrão dos valores apresentados na avaliação de formação de biofilme microbiano da cepa Escherichia coli Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA-one way e teste de Tukey (p<0.05). DO: densidade óptica; (P) – biomateriais analisados dentro do poço com meio de cultura e cepas; (B) – biomateriais analisados em poço limpo sem meio de cultura, cepas contabilizadas foram as aderidas apenas ao biomaterial. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 2.4 DISCUSSÃO O uso de materiais a base de carbono tem demonstrado resultados positivos para auxiliar no processo de reparação de tecidos moles e duros (Petersen, 2016), demonstrando grande potencial de desenvolvimento como biomaterial para diversas aplicações clínicas (Aoki et al., 2009). Essa classe de materiais vêm sendo aplicada clinicamente em alguns setores, como válvulas artificiais e stents cardíacos, no entanto, sua aplicação como material de enxerto é relativamente recente e apesar de haver na literatura diversos estudos 43 relacionados à materiais a base de carbono, esse tipo de material ainda não está em fase de aplicação clínica (Aoki et al., 2020). Deste modo, o principal objetivo do presente estudo foi avaliar a fibra carbono ativada com prata (FCAAg), a fibra de carbono não ativada (FCNA) e a fibra carbono ativada (FCA), na osteogênese de células mesenquimais osteoblásticas com intuito de auxiliar o desenvolvimento dessas fibras como potencial biomaterial para reparação óssea. A mensuração da atividade da fosfatase alcalina (ALP) é usada como um marcador do estágio inicial da osteodiferenciação (Eivazzadeh-Keihan et al., 2019); no presente estudo, os grupos controles de ambos os meios de cultura apresentaram taxas de atividade de ALP mais altas que os grupos das fibras, portanto, foi possível observar que mesmo no meio MTS as células mesenquimais estariam se diferenciando em osteoblastos. A coloração com vermelho de alizarina é considerada um marcador do estágio final de diferenciação celular osteoblástica (Mahmood et al., 2011); no presente estudo, mesmo os grupos controles tendo maior atividade de fosfatase alcalina, os grupos com fibra apresentaram maiores níveis de quantificação de cálcio, o que poderia significar que as fibras criam um ambiente favorável para rápida diferenciação celular e deposição de matriz calcificada. Na microscopia eletrônica de varredura (MEV) observamos a forma com que as células se aderem à superfície das fibras. Assim como no estudo de Islam et al., (2021), as células além de se fixarem na superfície da fibra, elas se conectaram umas às outras, essa interconectividade das células resulta em uma colonização celular tridimensional (Islam et al., 2021). Apresar de ser um aspecto positivo, essa colonização celular tridimensional pode atrapalhar a aplicação de análises por morfologia celular indireta, a sobreposição de estruturas faz com que o biomaterial possa ser avaliado apenas com microscopia confocal. 44 A superfície do material tem grande impacto na interação celular, características como energia, carga e química da superfície podem determinar a funcionalidade do material como possível scaffold para reparação óssea. No que compete à energia de superfície, as fibras do presente estudo apresentaram resultados variados, a FCNA se apresentou hidrofóbica (Maciel et al., 2023), o que está relacionada a uma menor energia de superfície (Redey et al., 2000), enquanto a FCA e FCAAg se mostraram superhidrofílicas (Maciel et al., 2023), o que está relacionada a uma maior energia de superfície (Redey et al., 2000). A boa fixação e o bom espalhamento de osteoblastos se mostram associados à uma alta energia de superfície e molhabilidade adequadas (Redey et al., 2000), o que conferiria às fibras de FCA e FCAAg os melhores resultados no que compete à proliferação e a viabilidade celular. Contudo, isso não ocorreu no presente estudo, onde a FCNA se mostrou equiparada às outras fibras na proliferação celular e equiparada ao controle na viabilidade celular. Porém, alta energia de superfície não é sinônimo de adesão celular adequada, Price et al., (2002) observaram alta adesão de osteoblastos em nanofibras de carbono com alta energia de superfície, enquanto observaram uma redução da adesão de fibroblastos. No entanto, os resultados positivos da FCNA podem ser justificados pela sua química de superfície, o processo de ativação parece alterar a química de superfície da fibra de carbono formando uma camada de O2 e aumentando a presença de carbono na fibra (Amaral et al., 2017). Além disso, foi observado aumento da presença de grupos básicos na superfície e redução de grupos ácidos, como Carbonila, sugerindo comportamento básico em soluções aquosas. Supõe-se que as fibras de carbono ativadas tiveram seu desempenho reduzido na viabilidade celular frente à toxicidade desses grupos superficiais, principalmente os oxigenados. Com relação à carga de superfície, materiais de carga positiva tendem a 45 favorecer adesão celular por meio de interações eletrostáticas com membranas celulares de carga negativa (Montoya et al., 2021), as fibras do presente estudo tem comportamento de supercapacitor, ou seja, pode apresentar carga positiva ou negativa dependendo do meio em que está inserida (Marcuzzo et al, 2016). Levando em consideração que os meios de cultura celular são calibrados à um pH de 6,8, podemos supor que as fibras apresentaram carga neutra, o que pode ter influenciado na proliferação celular. O processo de ativação promove a formação de microporos na estrutura das fibras (Marcuzzo et al., 2016, Amaral et al., 2017), aumentando a área de superfície auxiliando no processo de adsorção de proteínas celulares, como a fibronectina, tendo potencial de auxiliar no processo de osteogênese (Pen et al., 2020), o que justificaria a maior quantificação de cálcio nos grupos de fibras ativadas, apesar de não apresentarem diferença estatística significativa com a fibra não ativada. Embora a presença de poros possa ser um fator interessante no que se refere à osteogênese, essa alteração de estrutura pode facilitar a adsorção de proteínas celulares bacterianas (Lin et al., 2012), podendo atuar como um meio para proliferação de cepas. Esse padrão foi observado apenas na cepa Pseudomonas aeruginosa, em que a FCA analisada dentro do poço apresentou diferença estatística significativa em relação a FCNA dentro do poço, apesar disso, a FCA não apresentou diferença estatística em relação ao controle de crescimento, o que nos faz supor que as fibras não promovem maior proliferação bacteriana, tendo ou não poros em sua superfície. Na cepa Escherichia coli não foi observada diferença entre as fibras, enquanto na cepa Staphylococcus aureus as fibras ativadas tiveram menor formação de biofilme. De forma geral, com base nos dados apresentados, as fibras parecem não ter efeito de estimular crescimento bacteriano, o que interpreta-se como resultado positivo, visto que as cepas do presente estudo são 46 contaminantes comuns em regiões de traumas (Lin et al., 2012). A adição de prata nas fibras foi proposta com base em suas atividades antimicrobianas (Thomas & McCubbin, 2003), no presente estudo, a prata demonstrou potencial em reduzir a formação de cepas de Staphylococcus aureus. A ação antimicrobiana da prata pode se dar pelo bloqueio da respiração celular e interrupção da função das membranas celulares bacterianas (Fong & Wood, 2006). No entanto, Aurore et al., (2018) observaram que a prata não só tem potencial antimicrobiano de forma direta como também tem potencial de reativar a função antibacteriana ainda presente nos precursores dos osteoclastos, originados de células precursoras hematopoiéticas de macrófagos/monócitos (Nishimura et al., 2016), o que torna a prata um componente interessante quando se trata de reparação óssea. O presente estudo conta com algumas limitações, os presentes resultados poderiam ser complementados e elucidados com avaliações imunológicas, para avaliar o metabolismo celular de forma imperativa, utilizando marcadores pró- inflamatórios e marcadores osteogênicos. Além disso, com a intenção de prosseguir com a evolução da fibra de carbono como scaffold, o teste de genotoxicidade, para avaliação de seu potencial carcinogênico, se faz necessário. Ademais, por se tratar de um biomaterial com estrutura tridimensional, e possibilitar interconectividade celular, inviabiliza análise da morfologia celular por fluorescência direta em microscópios que não sejam confocais. A ação dos íons de prata na redução da formação de biofilmes da cepa de Staphylococcus aureus, do presente estudo, é um aspecto promissor para área da saúde; tendo em vista que a concentração da prata utilizada no presente estudo não atuou de forma positiva para viabilidade celular, necessita-se encontrar a concentração ideal de íons prata que tenha certa ação antimicrobiana mas que não comprometa a interação celular com a fibra de carbono. 47 2.5 CONCLUSÃO Com base nos resultados apresentados, é possível concluir que as fibras de carbono na forma não ativada e ativada possuem potencial para desenvolvimento como futuro scaffold para reparação óssea com viabilidade celular e quantificação de nódulos de mineralização satisfatórios. Porém, a adsorção de prata à fibra não demonstrou resultados positivos na viabilidade celular. Com relação ao potencial antimicrobiano, a adição da prata se mostrou promissora para redução da formação de biofilmes microbianos da cepa S.aureus. 48 3 FIBRA DE CARBONO ATIVADA INCORPORADA COM ÍONS DE METAIS: avaliação das interações biológicas in vitro 3.1 PROPOSIÇÃO 3.1.1 Objetivo geral O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a fibra de carbono obtida a partir de fibra PAN têxtil, nas diferentes formas de apresentação: fibra de carbono ativada (FCA) e fibra carbono ativada com prata (FCAAg), ouro (FCAAu), cobre (FCACu), paládio (FCAPd) e platina (FCAPt), na atividade osteogênica de células mesenquimais osteoblásticas com vistas à compreensão das necessidades da engenharia tecidual no desenvolvimento desse biomaterial com adequadas propriedades biológicas. 3.1.2 Objetivos específicos Como objetivos secundários o presente estudo irá analisar: a) a citotoxicidade e a adesão; b) o conteúdo de proteína total e a atividade da fosfatase alcalina; c) a formação de nódulos de mineralização e genotoxicidade. 49 3.2 MATERIAIS E MÉTODOS 3.2.1 Preparação da fibra de carbono ativada A obtenção do material deste estudo também se deu pela parceria com a empresa “JMHP Consultoria em Materiais e Informática LTDA”. Após preparação do feltro, como descrito no item 2.2.1 da presente tese, as amostras foram subdivididas em grupos onde cada uma teve íons metálicos incorporados em suas estruturas, a incorporação ocorreu por meio de imersão em soluções aquosas dos íons metálicos na concentração de 0,1 M, concentração maior da usada no Estudo 1. Então, foram obtidos corpos de prova de 4 mm de diâmetro e 2 mm de altura (Ryu et al., 2014). Todos os corpos de prova foram previamente embalados e esterilizados em autoclave (121°C durante 20 min) para serem encaminhados às análises in vitro. Este estudo teve ao todo 7 grupos experimentais: a) Grupo C: controle celular – células mesenquimais plaqueadas sem fibra; b) Grupo FCA: células mesenquimais plaqueadas com a fibra de carbono ativada; c) Grupo FCAAg: células mesenquimais plaqueadas com a fibra carbono ativad com prata; d) Grupo FCAAu: células mesenquimais plaqueadas com a fibra carbono ativada com ouro; e) Grupo FCACu: células mesenquimais plaqueadas com a fibra carbono 50 ativada com cobre; f) Grupo FCAPd: células mesenquimais plaqueadas com a fibra carbono ativada com paládio; g) Grupo FCAPt: células mesenquimais plaqueadas com a fibra carbono ativada com platina. 3.2.2 Ensaios biológicos in vitro Este estudo foi realizado de acordo com os Princípios Éticos para a Experimentação Animal, adotado pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA, sendo aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais do Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos – ICT/UNESP (protocolo nº 11/2021, Anexo B). A descrição deste trabalho foi feita seguindo as diretrizes do Animal research: Reporting in vivo experiments - ARRIVE (Percie du Sert et al., 2020). Todos os procedimentos biológicos in vitro foram desenvolvidos e executados no Laboratório de Estudos Interdisciplinares em Células (LEIC), localizado no Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal do Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Unesp, Campus de São José dos Campos. 3.2.3 Cultura celular As células mesenquimais para cultura celular foram obtidas de fêmures 51 de 09 ratos machos adultos (variação albinus, Wistar) pesando cerca de 300g com aproximadamente 90 dias. Os ratos foram alocados em gaiolas apropriadas e receberam dieta e água ad libitum até o momento da eutanásia. Os animais foram eutanasiados pela aplicação de anestesia geral em dose triplicada de uma solução de cloridrato de xilazina 2% (10 mg/kg Anasedan – Ceva Brasil) e de ketamina 10% (100mg/kg Dopalen – Ceva Brasil), via intramuscular, os animais foram decapitados em guilhotina. Em seguida os fêmures foram removidos para a cultura celular. As células da medula óssea dos fêmures obtidos foram isoladas e cultivadas como descrito anteriormente no item 2.2.3 (Figura 4). Para os testes, foi realizado o plaqueamento celular com aproximadamente 5.000 células/poço. Levando em consideração os resultados apresentados pelo item 2.3.4 da presente tese, para a cultura celular do presente estudo foi utilizado apenas meio osteogênico (MTS-O) (n=5), contendo 5mg/mL de ácido ascóbico (Neon®, Neon Comercial, Brasil) e 2,16g de beta glicerofosfato (Sigma-Aldrich® ref 50020, Merck KGaA, Alemanha). As placas foram mantidas em estufa a 37° C com 5 % de CO2 até os momentos dos testes (Figura 16). Estes foram realizadas em triplicata, em cada leva de testes foram utilizados três ratos, deste modo cada frasco de cultura tinha células mesenquimais provenientes de três animais diferentes, caracterizando o pool de células. Todos os corpos de prova foram previamente embalados e esterilizados em autoclave (121°C durante 20 minutos) para serem encaminhados às análises in vitro, e para evitar que as amostras ficassem suspensas durante os testes, elas foram colocadas na estufa a 110ºC por 1 hora e embebidas em meio de cultura pelo menos 48h antes do plaqueamento celular. 52 Figura 16 – Linha do tempo dos Testes Laboratoriais com células Fonte: Imagem elaborada pelo autor. 3.2.4 Avaliação da proliferação celular Para avaliação da proliferação celular, as células mesenquimais foram cultivadas nos poços das placas e as células foram quantificadas após 24h de cultura celular. Para isso, o meio de cultura foi aspirado, e as amostras foram lavadas com PBS (Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) três vezes. Após a lavagem, foi pipetado 200µl de solução de tripsina 0,25% (Cultilab Ltda, Campinas, Brasil) para que as células se desprendessem da amostra, em seguida a placa foi levada para estufa de CO2 por 15 minutos. As células foram contabilizadas por poço utilizando a câmara de Neubauer e o corante Azul de Tripan, sendo que as células que permitirem a incorporação do corante pela membrana foram consideraras inviáveis (Rosa et al., 2003, de Oliveira et al., 2007). 53 3.2.5 Interação celular com a fibra Após 07 dias de cultivo, a interação celular com o biomaterial foi avaliado por FE-SEM (Field Emission Microscopia Eletrônica de Varredura) (Zeiss - EVO MA10, Brasil). As amostras foram lavadas três vezes com PBS para remover as células não aderentes e, em seguida, fixadas quimicamente com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 20 min. A seguir as amostras, foram desidratadas por meio de uma série ascendente de etanol e antes da análise, foram revestidas com uma fina camada de ouro usando um sistema sputter-revestimento. 3.2.6 Determinação da viabilidade celular (citotoxicidade) Após 7 dias de cultura celular foi realizada a avaliação quantitativa de células vivas (da Silva et al., 2008), após a exposição ao agente tóxico pela incubação com o corante MTT [brometo de 3-4,5-dimetiltiazol] (Sigma Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e análise espectrofotométrica do corante incorporado. Alíquotas de MTT a 0,5 mg/mL em meio de cultura foram preparadas, procedera-se em seguida à incubação das culturas primárias com esta solução por 4 hr a 37°C, em estufa contendo 5% de CO2. Após esse período, a solução de MTT foi removida e foi adicionado 500 μL da solução de DMSO (Dimethyl Sulfoxide Gibco® - Life Technologies, Baltimore, Estados Unidos) que permaneceu nos poços por 10 min em estufa de CO2 a 37°C. Em seguida a placa foi colocada sob agitação por 10 min para solubilização completa do precipitado formado. Alíquotas de 100μL foram retiradas dos poços 54 e transferidas para placa de 96 poços (Greiner CELLSTAR®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) para medida colorimétrica em leitor de microplaca no comprimento de onda 570 nm (Biotek® EL808IU, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, Estados Unidos). Os dados foram aferidos como absorbância e armazenados para análise estatística. 3.2.7 Conteúdo de proteína total O conteúdo de proteína total foi calculado após 10 dias de cultura (Rosa et al., 2009), de acordo com o método modificado de Lowry et al. (1951). Após a remoção do meio de cultura, os poços foram lavados três vezes com PBS, e preenchidos com 2 mL de lauril sulfato de sódio a 0,1% (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), para extração das proteínas. Após 30 min, 1 mL da solução de cada poço foi misturada com 1 mL da solução de Lowry (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e deixado por 20 min. Em seguida foi acrescentado à mistura 1mL de reagente de Folin e Ciocalteau (Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por 30 min. A seguir, a absorbância foi aferida a 680 nm em espectrofotômetro (Micronal® AJX 1900, Micronal, S.A., São Paulo, Brasil) e o conteúdo de proteína total foi calculado a partir de uma curva-padrão determinada pela albumina bovina, e expresso em μg/mL. 3.2.8 Atividade de fosfatase alcalina 55 A atividade de fosfatase alcalina foi determinada após 10 dias de cultura celular (Rosa et al., 2009), por meio da liberação de timolftaleína por hidrólise do substrato de timolftaleína monofosfato, utilizando kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (Labtest Diagnóstica®, Labtest Diagnóstica S.A, Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil). Inicialmente, 50 μL de timolftaleína monofosfato foi misturados com 0,5 mL de tampão dietanolamina a 0,3 M, pH 10,1. À solução foi acrescentada alíquota de 50 μL dos lisados obtidos de cada poço, permanecendo por 10 min a 37°C em banho-maria. Para o desenvolvimento de cor, foram adicionados 2 mL de carbonato de cálcio (Na2CO3) a 0,09 M e hidróxido de sódio (NaOH) a 0,25 M. A absorbância foi medida em espectrofotômetro (Micronal® AJX 1900, Micronal, S.A., São Paulo, Brasil) utilizando comprimento de onda de 590 nm e a atividade de fosfatase alcalina foi calculada a partir de curva-padrão usando a timolftaleína em uma escala de 0,012 a 0,4 μmol de timolftaleína/hora/μg proteína. 3.2.9 Avaliação da Genotoxicidade Aos 3 dias de cultura foi feito a avaliação de genotoxicidade dos biomateriais usados, para isso foi aplicado o teste de micronúcleo, como controle do teste foi plaqueado a analisado um grupo extra que recebeu Solução de metanossulfonato de etila (EMS). Inicialmente os poços tiveram seus meios de culturas aspirados, e as amostras foram lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, foi preparada uma solução utilizando meio de cultura suplementado com Citocalasina B (Citocalasina B obtida de Drechslera Dematioidea - Sigma Aldrich®), da qual 300µl foi pipetado em cada poço, as placas foram revestidas por papel alumínio e condicionadas na geladeira por 24h. Após período de 56 encubação na geladeira, a solução foi aspirada e as amostras foram lavadas três vezes com PBS, em seguida foi aplicado metanol durante 10min, novamente, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS, e então foi aplicado o corante DAPI (Fluorshield with DAPI – Sigma Aldrich®) por 5 min, seguido por uma última lavagem com PBS. As análises foram realizadas nas células do poço que estavam em contato com as amostras no microscópio de fluorescência (Microscópio Carl Zeiss Microlimaging GmbH – Axiovert 40C, Germany), onde os micronúcleos presentes foram quantificados (Figura 17). As imagens digitais foram analisadas com software Axio Vision 7.0. Os dados obtidos serão apresentados em proporção (%) do número de micronúcleos apresentados em relação ao número de núcleos e células. Figura 17– Fotomicrografia representativa da aplicação do teste de micronúcleos Legenda: Fotomicrografia representativa de micronúcleos (setas amarelas), (coloração DAPI, X20). Fonte: Elaborado pelo autor 57 3.2.10 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização A formação de nódulos de mineralização foi avaliada após 10 dias de cultura (de Oliveira et a., 2007). Para tanto, as células aderidas foram fixadas em solução de formol 10% por 2 horas. Após fixação, as amostras foram desidratadas com uma série gradual de álcool e coradas com vermelho de Alizarina S 2% (Sigma- Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), pH 4,2 por 10 min. Os poços das placas foram fotografados em microscopia de luz Axio HBO 100 (Carl Zeiss® Microlimaging GmbH – Axiovert 40C, Alemanha), com aumento de 200 vezes. A quantificação das formações mineralizadas foi realizada de acordo com o método descrito por Gregory et al., (2004). Para tanto, 800 μL de ácido acético 10% foram adicionados em cada um dos poços contendo as amostras e incubados em temperatura ambiente, sob agitação, durante 30 min. Após este período, cada uma das amostras foi raspada com auxílio de uma ponteira para a remoção de maior quantidade de corante. Todo conteúdo de cada um dos poços foi transferido para microtubos de centrífuga com 1,5 mL e agitados em vórtex (Vórtex QL – 901, Biomex Biotecnologia, Ribeirão Preto, SP, Brasil) por 30 s. Os microtubos foram levados ao banho-maria (Banho Metabólico Dubnoff – MA- 095/CF, Marconi Equipamentos Para Laboratórios Ltda, Piracicaba, SP, Brasil) e aquecidos por 10 min, a 85°C sendo posteriormente transferidos para um becker com gelo por 5 min. Em seguida foram centrifugados (Centrífuga Labnet– HERMLE Z 300K, HERMLE Labortechnik GmbH, Wehingen, Alemanha) por 20 min e 100 μL dos sobrenadantes foram transferidos para placa de 96 poços. Em cada poço foi acrescentado 40 μL de hidróxido de amônia a 10%, para neutralização do ácido. A leitura foi realizada em leitor de microplaca (Biotek – EL808IU, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, 58 Estados Unidos), sob o comprimento de onda de 405 nm. Os dados obtidos foram tabulados e armazenados para análise estatística. 3.2.11 Análise estatítica Após os testes, os dados foram obtidos em média e desvio padrão, foram submetidos à análise estatística utilizando o software GraphPad Prisma 7.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Inicialmente, os dados passaram pelo teste de normalidade, em seguida foi aplicado o teste ANOVA- one way, seguido pelo teste de Tukey com nível de significância de 5%. 3.4 RESULTADOS 3.4.1 Proliferação celular No teste de proliferação celular, apenas o grupo FCAAg apresentou diferença estatística significativa e foi inferior em relação ao grupo de controle celular (p < 0.05). As outras fibras apresentadas no estudo se mostraram estatisticamente semelhantes (Figura 18). 59 Figura 18 – Gráfico com média e desvio padrão do número de células por grupo Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA one-way, p<0.05. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 3.4.2 Interação celular Na microscopia eletrônica de varredura, as células, quando visíveis, apresentaram características de aderência ao biomaterial e espraiamento celular, muitas vezes conectando às fibras (Figura 19). Foi possível observar células aderidas e espraiadas em quase todas as amostras, apenas os grupos FCAAg e FCAAu não apresentaram células aderidas (Figura 20). 60 Figura 19 – Imagem de Microscopia Eletrônica de Varredura de amostra do grupo FCAPt Legenda: Magnificações de 1000x. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 61 Figura 20 – Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura representativas dos grupos de fibras de carbono Legenda: MEV SE, magnificações de 500x. A: FCA, B: FCAAg, C: FCAAu, D: FCACu, E: FCAPd, F: FCAPt. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 62 3.4.3 Viabilidade celular O grupo de controle celular obteve maior viabilidade celular do que todos os grupos de fibra de carbono com íons de metais (p < 0.05), porém estatisticamente semelhante ao grupo FCA (p > 0,05). Entre os biomateriais propostos, o grupo FCA obteve diferença estatística significativa em relação aos grupos FCAAg, FCACu e FCAPt (p < 0.05), mas estatisticamente semelhante aos grupos FCAAu e FCAPd. Por sua vez, tanto o grupo FCAAu quanto o grupo FCAPd, apresentaram diferença estatística significativa aos grupos FCAAg e FCACu (p < 0.05) (Figura 21). Figura 21 - Gráfico com média e desvio padrão de viabilidade celular Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA one-way, p<0.05. Fonte: imagem elaborado pelo autor. 63 3.4.4 Conteúdo de Proteína Total Na avaliação do conteúdo de proteína total, encontrou-se diferença estatística apenas entre o grupo FCA e FCAAu (p < 0.05), com o grupo do íon de ouro tendo menor expressão de produção de proteínas totais (Figura 22). Figura 22 – Gráfico com média e desvio padrão do conteúdo de Proteína Total Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA one-way, p<0.05. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 3.4.5 Atividade de Fosfatase alcalina No teste de avaliação da atividade de fosfatase alcalina o grupo controle demonstrou diferença estatística aos grupos FCA, FCAAg e FCACu (p < 0.05). 64 Os grupos FCAAu, FCAPd e FCAPt se apresentaram estatisticamente semelhantes ao grupo C e FCA (p < 0.05) (Figura 23). Figura 23 – Gráfico com média e desvio padrão da atividade de fosfatase alcalina Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA one-way, p<0.05. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 3.4.6 Genotoxicidade Os micronúcleos foram contabilizados por grupo, a amostra que apresentou maior proporção de micronúcleos foi a de íons paládio (Figura 24), ultrapassando a contabilização do controle EMS, os demais grupos apresentaram número inferior de micronúcleos. A contabilização das células foi feita a partir de imagens obtidas em microscópio de fluorescência (Figura 25). 65 Figura 24 – Gráfico representando proporção da contagem de micronúcleos por grupo Fonte: imagem elaborada pelo autor. 66 Figura 25 - Fotomicrografias representativas de cada grupo durante análise do teste de genotoxicidade Legenda: A: Controle celular; B: Controle EMS; C: FCA; D: FCAAg; E: FCAAu; F: FCACu; G: FCAPd; H: FCAPt (coloração DAPI, X20). Fonte: imagem elaborada pelo autor. 67 3.4.7 Formação e quantificação dos nódulos de mineralização Todos os grupos apresentaram nódulos de mineralização, que nos grupos das amostras estavam concentrados próximos às fibras do feltro (Figura 26). Figura 26 - Fotomicrografias representativas dos nódulos de mineralização impregnados com corante vermelho de Alizarina (X10) Legenda: A: Controle celular; B: FCA; C: FCAAg; D: FCAAu; E: FCACu; F: FCAPd; G: FCAPt. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 68 Após obtenção das fotomicrografias, os nódulos de mineralização foram quantificados. O grupo controle apresentou menor quantificação de cálcio que os grupos FCA, FCAAu e FCAPt (p < 0.05). Além disso, o grupo FCAAu apresentou diferença estatística aos grupos FCAAg e FCACu (p < 0.05), e o grupo FCAPt apresentou diferença com o grupo FCAAg (p < 0.05) (Figura 27). Figura 27 - Gráfico com média e desvio padrão da quantificação de nódulos de mineralização (absorbância 405nm) Legenda: Letras diferentes representam diferenças estatísticas significativas, ANOVA one-way, p<0.05. Fonte: imagem elaborada pelo autor. 3.5 DISCUSSÃO O objetivo principal desse estudo, foi avaliar as diferentes apresentações do feltro de fibra de carbono ativada obtido da fibra PAN têxtil em suas diferentes apresentações incorporadas com diferentes íons de metais, na 69 osteogênese de células mesenquimais visando obter novas informações para o desenvolvimento de um novo biomaterial pela engenharia tecidual, com adequadas propriedades biológicas. A aplicação de materiais a base de carbono na criação de novos biomateriais, foi mostrado em estudo in vitro de Crisan et al., (2015), onde observou-se biocompatibilidade de compósito de grafeno com nanopartículas de ouro e hidroxiapatita em osteoblastos, e a sua baixa citotoxicidade, semelhante ao que foi observado no presente estudo, em que os feltros de fibra de carbono apresentaram viabilidade celular satisfatória, sendo que os únicos feltros que apresentaram baixa viabilidade foram incorporados com prata e com cobre, podendo tal resultado estar mais associado aos íons do que com a fibra de carbono em si. Além da baixa citotoxicidade dos materiais a base de carbono, em um estudo de Aoki et al., (2009), utilizando uma fina teia de fibra de carbono como scaffold para regeneração óssea, verificou-se que esse material a base de carbono, de apresentação e estrutura similar aos feltros deste estudo, pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura, demonstrou-se um eficiente scaffold para reparação de defeitos ósseos em osso ilíaco de ratos, sendo um forte candidato para uso na terapia de reparação óssea. Logo, pela semelhança estrutural do feltro usado neste estudo com a teia de fibra de carbono do estudo de Aoki et al., (2009), é possível inferir, juntamente com os resultados in vitro de baixa citotoxicidade do feltro de fibra PAN têxtil, um alto potencial das amostras desse estudo para aplicação na terapia de reparação óssea. O processo de ativação, utilizado na preparação dos feltros, forma ranhuras no material aumentando a superfície exposta e o número de poros e sua distribuição, sendo essa porosidade um aspecto de interesse quando se trata de desenvolvimento de scaffolds 3D, por permitir a adesão celular, a proliferação e diferenciação osteogênica (Peng et al., 2020, Amaral et al., 2017). Nas imagens 70 de microscopia eletrônica de varredura foi possível observar a adesão celular ao material em quase todos os grupos de amostras, além de que, o teste de proliferação celular mostrou diferença estatística significativa somente entre o grupo controle e o feltro de fibra de carbono ativada com íons de prata. Levando em consideração que o grupo controle celular serve como padrão para resposta esperada dos testes, ao obtermos resultados estatisticamente semelhantes entre as amostras e o grupo controle, nos mostra que a fibra de carbono, mesmo incorporada com íons, possui potencial de interação com células mesenquimais. Em relação a incorporação dos íons de metal, foi possível ver neste estudo que o feltro incorporado com íons de ouro apresentou adequada viabilidade e indicação de indução a diferenciação celular osteoblástica, inferidos pelos resultados dos testes de quantificação de nódulos e da atividade de fosfatase alcalina. A propriedade de indução à diferenciação celular em osteoblastos dos íons de ouro foi verificada também no estudo in vitro de Crisan et al., (2015), onde a incorporação de ouro aos materiais a base de carbono foi favorável para a indução a diferenciação osteoblástica, o que demonstra uma tendência positiva à aplicação destes íons na engenharia tecidual óssea. A respeito dos íons de prata, cobre e paládio, em um estudo de Milheiro et al. (2016), sobre a citotoxicidade de diversos íons em células de fibroblastos de camundongos por meio do ensaio MTT, foi mostrado que os íons de paládio apresentam adequada viabilidade até uma concentração de 100 ppm enquanto os íons de prata e cobre, demonstraram citotoxicidade desde baixas concentrações como 10 ppm, sendo tais resultados compatíveis com os apresentados no presente estudo. As concentrações aqui utilizadas foram maiores do que Milheiro et al., (2016), sendo um pouco mais de 100 vezes maior. Na viabilidade celular o grupo de fibra de carbono ativada foi estatisticamente semelhante ao grupo controle, e concomitantemente a fibra de carbono ativada foi estatisticamente semelhante ao grupo FCAPd, dessa forma, podemos 71 observar que mesmo em concentrações elevadas o paládio não demonstrou um efeito citotóxico ao crescimento celular. O grupo FCAPd apresentou viabilidade celular satisfatória, além de baixa produção de proteínas totais, alta taxa de atividade de fosfatase alcalina e razoável quantificação de nódulos de mineralização, semelhante ao grupo FCAAu, sendo que os grupos de íons de cobre e prata, apresentaram alto conteúdo de proteína total, baixa viabilidade celular e baixa taxa de atividade de fosfatase alcalina e de quantificação de nódulos de mineralização. Os presentes resultados apresentados dos grupos com cobre e prata podem estar associados a produção de proteínas apoptóticas que foram contabilizadas pelo teste de Proteína total, enquanto a baixa viabilidade, baixa atividade de fosfatase alcalina e baixa quantificação de nódulos, podem estar associados a certa citotoxicidade dos íons (Milheiro et al., 2016) e em conjunto com a baixa indução a diferenciação osteoblástica, já que a fosfatase alcalina é um marcador de diferenciação celular (Eivazzadeh-Keihan et al., 2019). Os resultados apresentados pelo teste de genotoxicidade devem ser lidos com certa cautela; devido a toxicidade dos íons de prata e cobre, o número de células se encontrava reduzido no momento da contabilização de micronúcleos, o que pode ter gerado certo viés dos resultados apresentados, visto que a amostra incorporada com platina apresentou viabilidade celular relativamente satisfatória quando comparada às outras fibras. Como limitações, o presente estudo não fez análise imunológica das células, o que inviabiliza análise mais profunda da resposta celular frente ao biomaterial e íons metálicos. Além disso, não foi realizado análise da formação de biofilmes microbianos, portanto, não foi possível avaliar as propriedades antimicrobianas relatadas na literatura dos íons de prata, cobre e ouro (Ribeiro et al., 2017). No entanto, devido aos resultados promissores obtidos pelos íons 72 paládio, platina e ouro, recomenda-se a realização de mais estudos verificando as concentrações dos íons nas fibras, além de avaliar sua ação in vivo. 3.6 CONCLUSÃO É possível concluir que os feltros de fibra de carbono ativada possuem potencial para desenvolvimento como futuro biomaterial, com viabilidade celular adequada. As fibras de carbono incorporada com íons de ouro e paládio demonstraram potencial para futura aplicação como scaffolds para reparação óssea. 73 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Tendo em vista o pioneirismo desse estudo, pelo uso de fibra carbono ativada obtido a partir da fibra PAN têxtil como um possível biomaterial, foi desafiador encontrar na literatura estudos semelhantes in vitro, principalmente que avaliassem o material nas diferentes apresentações com as incorporações dos íons; logo, visando entender melhor os resultados obtidos nos testes, foi possível apenas correlacionar os resultados obtidos com outros estudos realizados com materiais a base de carbono de outras modalidades e com estudos que avaliaram as propriedades dos mesmos íons utilizados neste estudo. As fibras utilizadas de base para a incorporação dos íons demonstraram grande potencial para uso como scaffold para reparação óssea, isso porque em ambos os estudos, na forma ativada e não ativada, as fibras apresentaram viabilidade celular e quantificação de cálcio satisfatórios. Sendo a versão não ativada mais econômica no que diz respeito ao tempo e custo de preparação. As fibras, além de baixo custo de produção, podem ser esterilizadas em autoclave e possuem forma de feltro, o que facilitaria sua utilização clínica por ser um material fácil de adaptar ao local aonde pretende-se utilizar, características que tornam o material promissor. Com relação à incorporação de íons metálicos, apesar de termos obtidos resultados favoráveis para aplicação de ouro e paládio, mais testes devem ser empregados a fim de assegurar sua segurança clínica em relação à citotoxicidade, relacionados à concentração na fibra de carbono. A quantidade de prata deverá ser ajustada também, o ideal é que seja encontrada uma concentração que seja favorável tanto à viabilidade celular quanto às propriedades antimicrobianas. 74 _______________________ * Baseado em: International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical journals: Sample References [Internet]. Bethesda: US NLM; c2003 [cited 2020 Jan 20]. 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