MÁRCIO CESAR CHIACHIO DDoouuttoorraaddoo EEstudos FFilogenéticos na SSubfamília HHypoptopomatinae (Teleostei: Siluriformes: Loricariidae) CCom BBase em SSequências de DDNNAA Orientador: Prof. Dr. Claudio de Oliveira Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, campus de Botucatu, como parte dos requisitos para obtenção do título de DDOOUUTTOORR em Ciências Biológicas, Área de Concentração: Genética. Botucatu / SP Junho de 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Departamento de Morfologia - Instituto de Biociências de Botucatu Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas – AC: GENÉTICA FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Chiachio, Márcio Cesar. Estudos filogenéticos na subfamília Hypoptopomatinae (Teleostei: Siluriformes: Loricariidae) com base em sequências de DNA / Márcio Cesar Chiachio. – Botucatu: [s.n.], 2009. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu 2009 Orientador: Cláudio de Oliveira Assunto CAPES: 20204000 1. Peixe - Genética 2. Filogenia CDD 597.55 Palavras-chave: Filogenia; Hypoptopomatinae: Peixes; Sistemática molecular Processo FAPESP 04-11693-8 “OO que faz a vida valer a pena é essa constante incerteza quanto ao momento seguinte. ÉÉ isso que nos estimula a inventar, a criar, a realizar, a tentar melhorar o nosso mundo. OO que faz a gente ser grande é não perder o futuro de vista. É chegar a uma porta, fincar a bandeira da conquista e nesse mesmo instante começar a buscar outros portos. ÉÉ criar desafios, calcular riscos, avançando sempre. Porque a grande aventura é viver. E a vida, assim como as ondas, abriga todos os tipos de sonhos e embarcações. OO que faz a gente ser grande é ser como o mar: incansável na sua procura pela onda perfeita, até descobrir que a perfeição está na própria busca”. “AAgora já posso contemplar um horizonte. Não que isso signifique a finalização dos meus sonhos. ÉÉ, sem dúvida, uma conquista: mas jamais será tudo! Serei, sempre, eterno sonhador a vislumbrar o futuro. EEnvelheço sem, contudo, alcançar as estrelas do céu...” CCaattffiisshh CCom todo meu amor e carinho, à minha avó DD.. LLuuzziiaa, que durante essa minha caminhada, resolveu ir para longe dos olhos, mas para dentro do coração. DDeeddiiccoo eessttee ttrraabbaallhhoo...... Nesse momento em que chego ao final de mais uma etapa em minha vida, mais do que necessário, é muito gratificante poder vir agradecer a tantas pessoas que participaram comigo de toda essa caminhada. Em muitos momentos de angústias, aflições ou grandes realizações, diferentes pessoas, com pensamentos e atitudes variadas, sempre se mostraram dispostas a opinar em algo (profissionalmente e/ou psicologicamente), ou simplesmente a me ouvir. Gostaria de agora citar, em especial, algumas que de uma forma direta, ou nem tanto, puderam estar comigo em momentos de que necessitei... Primeiramente a meu bom DDEEUUSS, companheiro RREEAALL de todos os meus momentos. Angústias e alegrias se tornam diferentes quando assumimos que uma força maior nos guia pelos caminhos que escolhemos. Agradeço ao Dr. CCllaauuddiioo ddee OOlliivveeiirraa, que me deu a oportunidade de trabalhar ao seu lado nesses anos que fiz parte de seu grupo de pesquisa. Pela confiança, pelos ensinamentos, pela paciência, pela amizade, pelos momentos divertidos e por todas as outras demonstrações que o tornaram um grande orientador. Pela concessão da bolsa de Doutorado, quero agradecer à FFAAPPEESSPP (Proc. 04/11693-8). Ajuda primordial para que eu pudesse me manter em Botucatu conseguindo realizar meu trabalho de uma forma um pouco mais ”tranquila”. Ao Dr. FFaauussttoo FFoorreessttii, que nos dá chances de aprender sempre ao seu lado, quer seja nos momentos de descontração ou de seriedade. Um bate-papo pelos corredores, pelas salas de aulas, ou até mesmo no ”café”, sempre foram oportunidades de ouvir grandes histórias, experiências de vidas ou lições para levarmos em nossas recordações. Ao Dr. JJuuaann MMoonnttooyyaa--BBuurrggooss, da Université de Genève – Faculté des Sciencies, em Genebra, na Suíça, por ter me recebido com tanta simpatia para que eu pudesse desenvolver parte do meu trabalho em seu laboratório. Agradeço muito por todos os momentos, por ter sido tão agradável enquanto lá estive e, principalmente, por ter me ensinado TANTO em tão pouco tempo. Experiências únicas vividas dentro e fora de seu laboratório. Agradeço aos companheiros do Molecular Phylogeny Laboratory and Evolution in Vertebrates do Département de Zoologie et Biologie Animale, da Université de Genève, pela troca de experiências, pela troca de culturas e pelos momentos tão divertidos que passamos por lá em meio a tanto frio. YYaammiillaa CCaarrddoossoo, por ter sido tão querida e prestativa, pessoa que certamente vou me lembrar para sempre com muito carinho, por me socorrer tantas vezes dentro e fora do laboratório. SSoopphhiiee DDee CChhaammbbrriieerr e TThhiieerrrryy CChhââtteellaaiinn,, por me deixarem ”invadir” as suas bancadas de trabalho. IIllhhaamm BBaahheecchhaarr,, por me ensinar sempre com tanta paciência, repetindo no bom francês vezes e vezes, onde estava e como usava cada coisa, e, principalmente, onde guardá-las depois. Pelas pacientes lições de cálculos e mais cálculos de concentrações, molaridades, etc. Obrigado por ter sido simpática em todo o tempo! À SSlliimm CChhrraaiittii, meu divertido (primeiro) colega de residência. Obrigado pela simpatia constante e por me ajudar em tantos momentos. Obrigado pelo auxílio nas fantásticas (e caras) análises de raio-x. Quero agradecer aos colegas do Muséum d'histoire naturelle de Genève: RRaaffaaëëll CCoovvaaiinn, pelo auxílio nas análises, pelos diversos momentos divertidos e pelas sugestões do manuscrito; à SSoonniiaa FFiisscchh--MMuulllleerr pela simpatia, por abrir as portas de sua coleção e pela doação de amostras importantes em minhas análises. À família AARRIIAASS que me recebeu em sua casa durante todo o tempo em Genébra. Por ter me permitido fazer parte de sua família e me sentir tão à vontade. Ao Dr. LLuuiiss RRoobbeerrttoo MMaallaabbaarrbbaa,, pela simpatia com que me recebeu em seu laboratório na Universidade Federal do Rio Grande do Sul, em Porto Alegre. Por ter sido tão prestativo na temporada que fiquei por lá. Além, é claro, pela doação de importantes amostras. Agradeço aos alunos de Porto Alegre, especialmente a FFeerrnnaannddoo CCaarrvvaallhhoo (UFRGS), FFeerrnnaannddoo JJeerreepp (PUC-RS), JJuulliiaannoo ddooss SSaannttooss (UFRGS) e TThhiiaaggoo CCaarrvvaallhhoo (PUC-RS), pelo auxílio nas coletas, identificação dos exemplares e sugestões. MMeeuuss aaggrraaddeecciimmeennttooss...... Agradeço ao amigo (e técnico) do nosso laboratório, RReennaattoo DDeevviiddéé,, que muitas vezes fazia do nosso trabalho, também o seu trabalho. Agradeço pela disponibilidade em sempre ”bater uma peneira” ou então ”chutar umas pedras” em busca de nossos simpáticos Loricariídeos. Grandes momentos aconteceram dentro do nosso Laboratório de Biologia e Genética de Peixes da UNESP de Botucatu, momentos esses divididos por grandes companheiros, que sabiam a hora da brincadeira e também da ajuda necessária. Agradeço especialmente à GGlleeiissyy ddooss SSaannttooss, KKeellllyy AAbbee e LLuuííss GGaarrcciiaa PPeerreeiirraa por toda ajuda nos ”encaixes” na agenda do sequenciamento. Deixo um agradecimento especial àqueles que mais do que colegas de trabalho souberam se tornar amigos: Ao PPrrooff.. CCeellssoo BBeenniitteess, pessoa que sempre nos divertia e nos presenteava com uma excelente gastronomia; GGuuiillhheerrmmee LLooppeess,, pelas esticadas até um ”buteko” mais próximo depois do trabalho e pela abertura de sua casa para que pudéssemos nos divertir como nunca no ”Barretão”; ZZeeccaa, um cara de conversa sincera e agradável em toda hora que eu ”passava” pela Citogenética; aos recém-chegados VVííccttoorr TTaagglliiaaccoolllloo, BBrruunnoo ddee MMeelloo e RRiiccaarrddoo BBrriittzzkkee,, amigos divertidos pra jogar conversa fora ou trocar idéias ictiológicas; ao grande EErrnneessttoo RRoonn, venezuelano gente boa demais!!! FFeerrnnaannddoo FFeerrnnaannddeess (grande ”Konrado”), amigo que sempre tinha algo legal para falar (na maioria das vezes via MSN, mesmo estando do nosso lado). Cara, você é um grande companheiro, ainda vamos esquematizar muitas coisas por aí afora. Agradeço a TTaattiiaannee MMaarriigguueellaa,, pelas divertidas conversas e por dividir comigo as dificuldades e ”alegrias” durante a estadia em Porto Alegre. À Dra. CCrriissttiiaannee SShhiimmaabbuukkuurroo--DDiiaass que, desde que cheguei ao laboratório, sempre teve palavras amigas e conhecimentos para me transmitir. Agradeço de coração por toda amizade nesse tempo todo. Agradeço de coração à AAddrriiaannaa TTaakkaakkoo,, por todo companheirismo e bondade que sempre ”sobram” em sua pequena pessoa. À mais ”antiga” companheira de trabalho, (Dra.) DDaanniieellaa FFeerrrreeiirraa, quero deixar um agradecimento especial por todos esses mais de 10 anos de convivência diária, iniciada lá atrás nos primeiros anos da graduação em Rio Preto. Por estar comigo em marcantes acontecimentos, pessoais e profissionais, pela troca de cidade juntos, pelas viagens, conselhos, companheirismo e tantos outros acontecimentos. Quero agradecer também aos outros amigos do Departamento de Morfologia: AAnnddrrééiiaa PPoolllleettoo, vai ser muito ruim não ouvir suas conversas animadas todo dia; DDaanniilllloo PPiinnhhaall grande companheiro de mesa de bar, viagens e roda de violão; sertaneja, funkeira e Barbie-workshop JJuulliiaannaa MMaazzzzuucchheellllii, vou sentir demais a sua falta Jú!!! Pequena IIrraannii FFeerrrreeiirraa, é até difícil pensar em algo pra te escrever, você é uma pessoa que a gente conhece e já não larga mais. Irânis gosto muito de você, obrigado pela amizade e carinho nesse tempo todo! Depois de tantos anos longe, é muito gratificante saber que ainda possuo grandes irmãos em minha ”terra-natal”. AAlleessssaannddrraa GGaarruuttttii, FFeerrnnaannddoo DDiiaass, FFaabbiiaannaa GGaarruuttttii, EElliiaannee FFáávvaarroo,, LLuuiizz SSéérrggiioo JJúúnniioorr e AAnnddrréé LLuuiiss RRooddrriigguueess, que participaram comigo da minha formação pessoal desde minha infância e que hoje dividem também mais essa conquista em minha vida. AAnnaa PPaauullaa VVeeiiggaa, RRaaffaaeell PPiieerriinnii, AAnnaa CCaarroolliinnaa, PPaattyy e JJeeaann, amigos de pouco tempo, mas que se fazem especiais e essenciais em minha vida. KKaarriinnaa FFuurrllaanneettttoo, obrigado por acreditar sempre em mim, por me dar tanta força, por estar ao meu lado em todos os momentos. Hoje eu já não saberia o que seria não poder contar com sua amizade. Você é muito importante para mim. Às minhas tias, TTaattaa, BBiiccaa, MMáá e JJúú... Pessoas queridas e fundamentais em minha vida. AAo meu irmão MMaarrccuuss (Kako), minha cunhada GGiisseellii e minha afilhada MMaarriiaa LLuuiizzaa, agradeço pelo carinho, admiração e amor sempre presentes. À minha irmã AAnnddrreeaa, meu cunhado AAnnddrréé, meu sobrinho PPaauulloo CCeessaarr e minha afilhada MMaarriiaa FFeerrnnaannddaa. Obrigado por tornarem cada dia vivido ao lado de vocês, único! Agradeço de coração por estarem ao meu lado quer sejam minhas decisões. E finalmente quero agradecer aos meus pais, FFrraanncciissccoo CCeezzaarr e MMaarriiaa JJoosséé. Hoje deixo bem claro que tudo isso realmente foi dedicado a vocês. Mais do que uma conquista pessoal, tudo foi feito para que vivessem esse momento de conquista em suas vidas. i A subfamília Hypoptopomatinae, considerada monofilética desde a sua descrição, incluí cerca de 100 espécies distribuídas em 17 gêneros que se dividem atualmente em duas tribos, Hypoptopomatini e Otothyrini. A tribo Hypoptopomatini é composta pelos gêneros Acestridium, Hypoptopoma, Oxyropsis, Niobichthys, Nannoptopoma e Otocinclus e a tribo Otothyrini por Corumbataia, Eurycheilichthys, Epactionotus, Hisonotus, Microlepidogaster, Otothyris, Otothyropsis, Parotocinclus, Pseudotocinclus, Pseudotothyris e Schizolecis. Os Hypoptopomatinae apresentam tamanho pequeno a moderado e geralmente compartilham uma fisionomia adulta distinta para Loricariidae. Diferentes estudos realizados nos últimos anos apontam a necessidade de novas reconstruções filogenéticas para a subfamília, devido a evidências levantadas por diferentes metodologias de análises que não corroboram o monofiletismo para o grupo em questão. Baseado nesses questionamentos, o presente trabalho objetivou realizar uma análise filogenética baseada em caracteres moleculares englobando o maior número de gêneros da subfamília Hypoptopomatinae, e de seus gêneros diretamente relacionados, a fim de se testar o monofiletismo para o grupo. Nossos resultados, baseados em sequências parciais do gene nuclear F-Reticulon4 e dos genes mitocondriais Citocromo oxidase I e 16S rRNA, não corroboram a hipótese de que Hypoptopomatinae é um grupo monofilético, quando os dados foram analisados por Máxima Parcimônia e Análise Bayesiana, devido a inclusão dos representantes de Neoplecostominae entre as duas tribos Otothyrini e Hypoptopomatini. Analisando as topologias obtidas para as tribos de Hypoptopomatinae, evidenciamos o monofiletismo para Hypoptopomatini, tendo Otocinclus como gênero basal para o grupo. O mesmo não pôde ser encontrado para Otothyrini devido à exclusão do gênero Pseudotocinclus que aparece mais relacionado à Neoplecostominae em todas as análises realizadas. Se admitirmos o nível de subfamília para Neoplecostominae, automaticamente estamos negando o mesmo estado para Hypoptopomatinae e assim se torna necessário elevar o nível de tribo de Hypoptopomatini e Otothyrini a subfamília. Nossos resultados estatísticos suportam tal alteração taxonômica. Palavras-chave: Peixes; Hypoptopomatinae; Sistemática Molecular; Filogenia. RReessuummoo ii 1. INTRODUÇÃO 1 2. OBJETIVOS 20 3. MATERIAIS 21 3.1 Grupo Interno 21 3.2 Grupo Externo 21 4. MÉTODOS 25 4.1 Extração de DNA Genômico 25 4.1.1 Extração por Fenol-Clorofórmio 25 4.1.2 Extração por Tampão de extração 26 4.1.3 Extração por Kit comercial 27 4.2 Amplificação dos segmentos de DNA 28 4.2.1 Genes mitocondriais 30 4.2.2 Gene nuclear 30 4.3 Purificação das amostras amplificadas 33 4.4 Reação de PCR para sequenciamento 34 4.5 Limpeza do PCR de sequenciamento 35 4.6 Sequenciamento de DNA 35 4.7 Obtenção das sequências consenso 35 4.8 Análise filogenética 36 4.8.1 Alinhamento das sequências 36 4.8.2 Análise dos dados 37 4.8.2.1 Máxima parcimônia 39 4.8.2.2 Inferência Bayesiana 41 5. RESULTADOS 43 5.1 Análise filogenética baseada em sequências de genes mitocondriais 45 5.2 Análise filogenética baseada em sequências do gene nuclear F-Reticulon 4 49 5.3 Análise filogenética baseada na combinação de genes 52 6. DISCUSSÃO 56 7. CONCLUSÃO 62 8. REFERÊNCIAS 64 9. ANEXOS 73 SSuummáárriioo CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 A Sistemática Filogenética O conhecimento da diversidade biológica parece ser tão antigo quanto o próprio conhecimento humano. Desde tempos remotos na história da humanidade, já existia uma preocupação de descrever e classificar tal diversidade, isto é, compreender as diferenças entre grupos de animais, plantas, fungos, organismos unicelulares e procariotos. Dentro da biologia comparada existe uma preocupação em analisar as características de espécies diferentes, procurando claramente as semelhanças e diferenças entre os grupos. Entretanto, apenas nos anos 50 foi proposto um sistema de classificação biológica, baseado na idéia de que os organismos constituem sistemas contínuos e modificados. Willi Hennig, entomólogo alemão, fundava então uma nova corrente de classificação para os seres vivos, a Cladística ou Sistemática Filogenética (Hennig, 1950). Escola esta pouco difundida no mundo científico em sua primeira década de existência até que, em 1966, a obra original do autor é traduzida do alemão para o inglês. Após esse período, observa-se significativos avanços conceituais e metodológicos em Sistemática Filogenética, e essa, passa a ser aplicada não apenas em questões relacionadas à classificação da biodiversidade mas também nos mais diversos ramos das Ciências Biológicas, buscando auxiliar na compreensão da diversidade biológica, na evolução dos táxons e na modificação dos caracteres morfológicos, comportamentais, fisiológicos e moleculares. Quando é levantada a questão da diversidade biológica, torna-se necessário o conhecimento de dois aspectos distintos. A Diversidade Biológica implica em um certo número de grupos diferentes. Ou seja, táxons, que de alguma maneira CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 2 podem ser distinguidos uns dos outros. Outro aspecto refere-se ao número de caracteres diferentes dessas entidades, cada organismo possuindo características que podem ser iguais ou diferentes aos de outros grupos (Amorim, 2002). Ao mesmo tempo que a teoria filogenética passa a ser mais amplamente empregada após a metade do século passado, o surgimento de técnicas de análise de DNA como a análise de produção de fragmentos gerados por enzimas de restrição, a clonagem gênica, a reação em cadeia da polimerase (PCR), e o sequenciamento de DNA, permitiu se compreender melhor a estrutura molecular dos genes e genomas. Assim, estas técnicas de estudo do DNA permitiram ampliar os estudos de evolução molecular em duas áreas principais que se encontram relacionadas intimamente: (1) o estudo dos mecanismos e padrão de evolução de ácidos nucléicos e de proteínas, de fundamental importância para idealizar modelos para a inferência das relações entre os organismos e (2) a reconstrução da história evolutiva dos organismos, também conhecida como filogenia molecular, aliada a outras disciplinas como biogeografia, geologia e paleontologia, permite traçar hipóteses de origem, datação e evolução dos organismos e possibilita determinar e compreender a ordem das mudanças dos caracteres (Nei & Kumar, 2000). Estimar relações de ancestralidade para determinados grupos taxonômicos é o intuito dessa reconstrução filogenética, baseando-se em unidades (famílias, gêneros, espécies e/ou populações) do qual se pretende determinar a sua história evolutiva (Amorim, 2002). Esses táxons recebem a designação de Unidades taxonômicas operacionais (OTU – “Operational Taxonomic Unit”). Como resultado, obtemos as chamadas Árvores filogenéticas que são representações gráficas das relações taxonômicas encontradas para as OTUs, mostradas através de ramos, nós internos e terminais. Nós terminais representam as CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 3 OTUs estudadas, que são unidas por ramos cujo nó interno representam o ancestral comum destes táxons. Dentro da metodologia de análise filogenética, alguns termos definidos inicialmente para caracteres morfológicos, também são aplicados nas reconstruções genéticas. Quando tratamos de análises evolutivas de genes, conceitos de Homologia e Homoplasia tornam-se um pouco mais complexos. A Sistemática Filogenética baseia-se no conceito de Homologia de caracteres para desenhar a história evolutiva das unidades taxônomicas em questão. Uma estrutura ou um órgão é chamado de homólogo se apresentar uma origem ancestral comum para diferentes táxons, independente da sua função. Em um par de condições homólogas, a condição pré-existente (mais antiga) é uma Plesiomorfia e a condição modificada (mais recente) é uma Apomorfia. Apomorfias de um táxon terminal são denominadas Autapomorfias (Amorim, 2002). Estruturas morfológicas que não possuem uma origem comum, mesmo apresentando semelhanças funcionais e morfológicas, são designadas como análogas (asas de insetos e morcegos) e, o fenômeno que leva a formação dessas estruturas análogas é denominado Homoplasia. Distinguir a falsa evidência da homoplasia da evidência confiavel de homologia, é o problema fundamental da inferência filogenética. Quando analises utilizando-se os mesmos caracteres apresentam mais de uma árvore filogenética resultante, sabemos que existe evidências de homoplasia entre tais caracteres. Em análises genéticas, dois genes são considerados Ortólogos quando a sua homologia tenha ocorrido através de processos de especiação, apresentando portanto um mesmo ancestral comum. Em contrapartida, chamamos de Parálogos àqueles genes homólogos que resultaram de um evento de duplicação gênica dentro de um único genoma, podendo apresentar funções diferenciadas (Nei & Kumar, 2000). CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 4 A homologia é dada através do alinhamento de diferentes sequências de determinado grupo de táxons comparativos. O alinhamento dessas sequências nada mais é do que uma hipótese de homologia, onde, cada posição da base é tratada como um caráter, presumindo que essas posições sejam homólogas entre si (Amorim, 2002). Quando desejamos inferir relações de determinados grupos taxônomicos partimos da idéia de que tal grupo em análise sempre seria monofilético, ou seja, as OTUs estudadas apresentam um mesmo ancestral comum. Esse é um ponto importante dentro das reconstruções filogenéticas, o conceito de Monofilia. A definição indica que um grupo monofilético é formado por uma espécie ancestral e todas as suas descendentes. Assim, podemos concluir que um grupo monofilético é reflexo do processo evolutivo pelo qual o grupo passou. Dessa maneira, entendemos que se trata de um grupo natural, ou seja, um produto do processo natural, evolutivo. Esses grupos incluiriam aqueles táxons que apresentam sinapomorfias, isto é, os caracteres derivados de um mesmo ancestral comum. Grupos não monofiléticos são denominados Parafiléticos ou Polifiléticos. Os Parafiléticos possuem suas unidades taxônomicas com caracteres plesiomórficos (primitivos) e nem todos os descendentes do ancestral comum deste grupo estão incluídos no grupo interno. Já os Polifiléticos apresentam táxons com caracteres diagnósticos homoplásicos, não sendo descendentes de um mesmo ancestral (Amorim, 2002). A maneira mais empregada para se testar o monofiletismo de algum grupo em questão se dá através da inclusão de grupos externos, ou seja, unidades taxônomicas relativamente próximas, porém não pertencente ao grupo de análise, o chamado grupo interno. Por esse método, a polaridade do caráter é estabelecida por comparação com o seu estado em um ou mais grupos fora do conjunto investigado, e parte-se da idéia de que, se dentro do grupo interno, ocorrem dois ou mais estados de CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 5 um caráter, o estado ancestral é aquele encontrado também no grupo externo, enquanto que o estado derivado não, resultantes ou não de homoplasias. 1.2 A Ordem Siluriformes A região Neotropical possui uma fauna de peixes extremamente diversificada. Estima-se, atualmente, a existência de cerca de 6.000 espécies em água doce apenas nessa região, quando, englobando todo o restante do mundo, teríamos algo em torno de 13.000 espécies nesse mesmo tipo de ambiente (Reis et al., 2003). Na região Neotropical, encontramos 71 famílias, num total de 4.475 espécies consideradas válidas e outras 1.550 ainda não descritas (Reis et al., 2003). Schaefer (1998), em um levantamento das tendências históricas de descrição de espécies em Characidae e Loricariidae, calculou que podiam existir cerca de 8.000 espécies de peixes de água doce neotropicais correspondendo a 25% de todas as espécies de peixes do mundo. Este número foi discutido e aceito por Vari e Malabarba (1998), que acrescentam que toda essa diversidade de peixes de água doce neotropicais ocorre em menos de 0,003% da água do planeta. A superordem Ostariophysi, com cinco ordens, cerca de 63 famílias, aproximadamente 1.000 gêneros e 6.500 espécies (Nelson, 2006), engloba aproximadamente 25% das espécies de teleósteos e 75% das espécies de água doce de todo o mundo (Fink e Fink, 1981). Esse é o grupo de peixes dominante na região Neotropical, onde são encontrados representantes das ordens Siluriformes, Gymnotiformes e Characiformes. Os peixes da ordem Siluriformes, conhecidos popularmente como bagres e cascudos, formam o grupo natural melhor diagnosticado de peixes primariamente de água doce. Muitos representantes são aparentemente tolerantes apenas a tais CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 6 ambientes, porém, diversas espécies se extendem a águas levemente salinas, regiões estuarinas ou até mesmo pelos oceanos. Dentro de Ostariophysi, Siluriformes é a ordem mais diversificada e bem distribuída, incluindo 36 famílias, cerca de 477 gêneros e mais de 3.088 espécies, refletindo a sua complexidade taxonômica (Teugels, 1996; de Pinna, 1998; Diogo, 2003; Ferraris, 2007). Entre os Siluriformes neotropicais, foram descritas 1.648 espécies, divididas em 15 famílias (Reis et al., 2003). Devido à contínua descoberta de novos táxons, estes números devem ser significativamente incrementados a fim de se ter um melhor e maior conhecimento do grupo e de suas relações filogenéticas. Ferraris (2007) afirma em seus estudos que existem cerca de 230 espécies com problemas de posição taxonômica necessitando de estudos adicionais. Sabaj et al. (2004) já sugeríam que podíamos estimar a existência de cerca de 1.750 espécies ainda não descritas dentro de Siluriformes. A ampla diversidade ecológica e evolutiva observada nesta ordem a faz foco de muitos estudos (Burgess, 1989; Fink e Fink, 1981, 1996; de Pinna, 1998; Arratia et al., 2003; Britto, 2003). Embora tal diversidade e distribuição atraiam grande interesse, esses dois fatores provavelmente respondem pelo pequeno número de estudos sobre as relações entre os grandes grupos de Siluriformes (Britto, 2003). Segundo Diogo (2003), muitos dos estudos pré-cladísticos sobre os relacionamentos entre os Siluriformes são confusos e questionáveis, com propostas de agrupamentos dos táxons tendo por base caracteres plesiomórficos e altamente homoplásticos ou embasamento pobre. Entretanto, o autor ressalta que tais trabalhos não devem ser ignorados. Embora nos últimos anos notem-se progressos, a grande maioria dos estudos cladísticos sobre a filogenia dos Siluriformes é dedicada aos inter- relacionamentos em suas famílias (Diogo, 2003). Contudo, dois importantes trabalhos que atentam para uma análise filogenética mais global entre as famílias de Siluriformes CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 7 são o de de Pinna (1998) e o de Britto (2003), os quais se baseiam em uma grande quantidade de novos caracteres. Entre os tópicos abordados por de Pinna (1998), em seu estudo sobre as relações filogenéticas dos Siluriformes neotropicais, há uma comparação entre os resultados obtidos por de Pinna (1993), concluindo que existe concordância em alguns pontos destes trabalhos, que podem ser vistos como uma evidência de corroboração independente, apresentada em ambos, sobre as relações entre as famílias de Siluriformes. A análise realizada por Britto (2003), com base em 331 caracteres morfológicos de representantes dos principais grupos da ordem Siluriformes indicou que algumas famílias formam agrupamentos polifiléticos e vários grupos tradicionais tiveram seu monofiletismo corroborado, concordando com as hipóteses previamente propostas por de Pinna (1993, 1998). Como exemplo, tem-se a posição basal da família Diplomystidae dentro da ordem, o monofiletismo da superfamília Loricarioidea e a relação entre suas familílias. Dentre as novas hipóteses, não foi confirmada a relação da família Pseudopimelodidae com o grupo formado por Sisoroidea, Loricarioidea e Amphiliidae, que se mostra agora mais relacionado a Heptapteridae e outros Siluriformes (Britto, 2003). Entre os grupos apresentados, os que possuem representantes na região neotropical são: Diplomystidae, Cetopsidae, Aspredinidae, Loricarioidea, Pseudopimelodidae, Heptapteridae, Doradoidea, Pimelodidae e Ariidae. O grupo-irmão de cada uma destas linhagens inclui alguns membros com distribuição fora da região neotropical (de Pinna, 1998; Britto, 2003). Possivelmente isto indica que a diversificação dos Siluriformes na região neotropical precede a separação entre a América do Sul e os outros blocos continentais, justificando, por exemplo, os componentes afro-neotropicais presentes em Siluriformes (de Pinna, 1998). Poucos trabalhos baseados em dados moleculares objetivaram resoluções entre as famílias de Siluriformes (Hardman, 2005; Sullivan et al., 2006). CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 8 Hardman (2005), utilizando sequências do gene mitocondrial CytB de 170 espécies de 29 famílias, obteve uma grande politomia como resultado de sua análise. Tal topologia se deve, possivelmente, a escala de variação desta região genômica. A única exceção deu-se pelo reconhecimento de Heptapteridae como grupo-irmão de Pimelodidae e Pseudopimelodidae. A análise de Sullivan et al. (2006), baseada em sequências dos genes nucleares RAG-1 e RAG-2, obteve a maior divergência com as hipóteses previamente conhecidas para Siluriformes (de Pinna 1993, 1998) devido ao posicionamento da superfamília Loricarioidea como grupo-irmão dos demais Siluriformes (Diplomystidae + Siluroidei). Mesmo definindo alguns grandes grupos dentro da ordem, as relações interfamiliares ainda permaneceram sem resolução (Sullivan et al., 2006) 1.3 A Família Loricariidae A superfamília Loricarioidea é um dos grupos de Siluriformes mais bem estudado, onde encontramos três das famílias mais especiosas desta ordem, Loricariidae (716 espécies), Callichthyidae (194 espécies) e Trichomycteridae (207 espécies), entre outras (de Pinna, 1998; Britto, 2003; Reis, 2003; Ferraris, 2007). Assim, Loricarioidea corresponde a cerca de 60% dos Siluriformes neotropicais, sendo considerado o maior grupo monofilético de bagres neotropicais (de Pinna, 1998). Dentro desse grupo estão os três maiores gêneros de Siluriformes: Hypostomus, Corydoras e Trichomycterus, possuindo um grande número de espécies, muitas delas apresentando interesse econômico, principalmente como espécies ornamentais. As hipóteses de relacionamento entre as famílias constituintes de Loricarioidea proposta por de Pinna (1998) e Britto (2003) mostram que as famílias Callichthyidae, Scoloplacidae, Astroblepidae e Loricariidae divergem de CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 9 Nematogenyidade e Trichomycteridae, com a formação de dois grupos, um com Nematogenyidae como grupo-irmão de Trichomycteridae e outro grupo os demais membros da superfamília, tendo Loricariidae e Astroblepidae como grupos-irmãos. Várias transformações de caracteres são conhecidas para os diferentes clados de Loricarioidea. Por outro lado, as filogenias apresentadas em de Pinna (1998) revelam que são relativamente poucas as hipóteses de relacionamento dentro das famílias de Loricarioidea. A família Loricariidae, com aproximadamente 716 espécies (Ferraris, 2007), é a maior em número de espécies entre os Siluriformes e também uma das maiores famílias da ictiofauna mundial (Nelson, 2006). Essa família está distribuída na América do Sul e na América Central, ocorrendo numa grande variedade de habitats, incluindo corredeiras em riachos a 3.000 metros de altitude até ambientes lênticos. A grande maioria das espécies de loricariideos são peixes primários de água doce, ou seja, não toleram ambientes salobros e marinhos (Nelson, 2006). Pela alta especialização encontrada em sua morfologia, os Loricariidae compõem um dos grupos melhor caracterizados dentro de Siluriformes, sendo reconhecido como táxon válido já nas classificações mais antigas dentro dessa ordem. Apesar dos loricariideos terem ampla distribuição, muitas espécies são características por formarem populações restritas a pequenas áreas. Isto provavelmente faz com que esta família apresente uma das maiores diversidades de formas de todos os peixes do mundo e com uma das maiores complexidades taxonômicas. Isso é evidenciado pela diversidade encontrada em cada nova captura de exemplares em ambiente natural. Baseando-se principalmente em musculatura cranial (Figura 1), Howes (1983) apresenta uma primeira classificação filogenética para Loricariidae, reconhecendo Neoplecostominae, Chaetostominae, Loricariinae, Hypoptopomatinae e CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 10 Hypostominae como subfamílias. De acordo com Reis et al. (2003) existem seis subfamílias em Loricariidae: Hypoptopomatinae, Loricariinae, Hypostominae, Ancistrinae, Neoplecostominae e Lithogeneinae. Schaefer (1987) apresentou uma filogenia das subfamílias quando definiu seis grupos monofiléticos: Ancistrinae; Ancistrinae mais Hypostominae; Loricariinae; Ancistrinae, Hypostominae e Loricariinae; Hypoptopomatinae; Hypoptopomatinae, Loricariinae, Hypostominae mais Ancistrinae. Um recente estudo realizado por Armbruster (2004) mostrou que essa divisão deve ser reavaliada uma vez que Lithogeninae pode ser mais relacionado com Astroblepidae e as únicas subfamílias demonstradas monofiléticas foram Hypoptopomatinae e Loricariinae (Figura 4). Com o objetivo de estabelecer grupos naturais a subfamília Hypostominae foi redefinida com a exclusão de vários gêneros e a incorporação da antiga subfamília Ancistrinae. Assim, Hypostominae é agora divida em cinco tribos: Corymbophanini, Rhinelepini, Hypostomini, Pterygoplichthini e Ancistrini (Armbruster, 2004). CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 11 1.4 A Subfamília Hypoptopomatinae A subfamília Hypoptopomatinae foi considerada monofilética por Schaefer (1998) incluíndo cerca de 70 espécies distribuídas em 12 gêneros. O autor, baseando- se em características morfológicas, divide tais gêneros em duas tribos, Hypoptopomatini e Otothyrini. Uma revisão mais recente aponta 17 gêneros presentes na subfamília Hypoptopomatinae e aproximadamente 100 espécies (Ferraris, 2007). A tribo Hypoptopomatini é composta pelos gêneros Acestridium, Hypoptopoma, Oxyropsis, Niobichthys, Nannoptopoma e Otocinclus e a tribo Otothyrini por Eurycheilichthys, Epactionotus, Microlepidogaster, Hisonotus, Pseudotocinclus, Otothyris, Pseudotothyris, Schizolecis e Parotocinclus (Schaefer, 1998). Corumbataia (Britski, 1997) e Otothyropsis (Ribeiro et al., 2005), novos gêneros de Hypoptopomatinae recentemente descritos e não incluídos na filogenia de Schaefer (1998) (Figura 2), foram sugeridos como pertencentes à tribo Otothyrini (Britski, 1997, Gauger & Buckup, 2005, Ribeiro et al., 2005). Baseando-se na grande quantidade de trabalhos de descrições taxonômicas publicados na década de 90, Reis e Schaefer (1998) afirmam que a diversidade a nível genérico e específico dos Hypoptopomatinae é muito maior do que conhecemos atualmente e que a classificação conhecida, até o presente momento, não é um reflexo satisfatório de toda a história evolutiva dentro desse grupo. Os representantes dessa subfamília estão distribuídas ao longo das terras baixas da América do Sul cis-andina, da Venezuela até o norte da Argentina. Estes peixes geralmente são conhecidos como “cascudinhos” ou “limpa-vidros” no Brasil, onde o grupo é mais diversificado. Os Hypoptopomatinae, como outros membros da família, são primariamente herbívoros, mas, ao contrário de outros loricariídeos, encontrados primariamente junto ao fundo, os Hypoptopomatinae são encontrados em, CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 12 ou próximo, da porção superior da coluna d’água em associação direta com galhos de árvores submersos, macrófitas aquáticas e gramas crescendo ao longo das margens correntes e estendendo-se dentro da água (Schaefer, 1998). Os Hypoptopomatinae apresentam tamanho pequeno a moderado [Comprimento padrão (SL) = 30-130 mm] e geralmente compartilham uma fisionomia adulta distinta para Loricariidae. De corpo alongado em sua maioria, poucos são fortemente deprimidos, compartilhando todos, uma morfologia peculiar no raio da peitoral, diagnóstico para a subfamília (Schaefer, 1991). A parte externa, lateral, do esqueleto da cintura peitoral em sua porção ventral pode ser comparável à porção lateral exposta do cleitro até a margem posterior do opérculo, encontrada em todos os membros da família, isto é, ao menos a porção ventro-lateral da cintura peitoral é exposta e não recoberta por pele. Este caráter era incluído e discutido na análise original de Schaefer (1991), mas foi excluído como autapomorfia para a subfamília e, consequentemente, não informativo para análises de relações entre Hypoptopomatinae com outros Loricariidae (Schaefer, 1998). Schaefer (1998) adiciona outras seis sinapomorfias para os hypoptopomatíneos em sua última análise para o grupo: (1) presença de cápsula nasal ventralmente aberta; (2) osso pterótico perfurado por númerosas fendas; (3) presença de canal no metapterigóide; (4) fossas arretoras fechadas no esqueleto peitoral ventral; (5) presença de placa rostral medial no focinho; (6) odontóides espalhados nas margens ventral e dorsal do focinho. O monofiletismo da tribo Hypoptopomatini é suportado por oito sinapomorfias, cinco das quais são caracteres usados na análise original de Schaefer (1991) e, duas dessas, não revertidas (Schaefer, 1998). Quatro caracteres não ambíguos suportam o monofiletismo da tribo Otothyrini, sendo que, a presença de CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 13 margem ventral do preopérculo refletida ventromedialmente é o único caráter mantido na última topologia de Schaefer (1998). A família Loricariidae apresenta inúmeros problemas de classificação principalmente quando se trata das subfamílias (Schaefer, 1987; Armbruster, 1997). Montoya-Burgos et al. (1998) estudaram a família Loricariidae utilizando sequências parciais dos genes mitocondriais 12S e 16S rRNA de 58 espécies, sendo 12 gêneros de Hypostominae, 14 de Ancistrinae, 9 de Loricariinae, 5 de Hypoptopomatinae e 1 de Neoplecostominae, associadas a um método proposto pelos autores para reduzir os ruídos filogenéticos, causado pela ocorrência de múltiplas substituições. Como resultado desse trabalho, confirmou-se apenas o monofilestismo de Loricariinae, além de revalidar a maneira ampla de definir os Neoplecostominae (Figura 3). As filogenias geradas mostraram também que parte dos Hypostominae e provavelmente de Loricariinae se separaram de um grupo primitivo de Ancistrinae. Dentre todas as espécies estudadas, a primeira a divergir foi Hemipsilichthys gobio, e os gêneros Hypostomus e Hemipsilichtys não formaram grupos monofiléticos. Tratando especificamente da posição do gênero Pseudotocinclus, o mesmo apresenta-se na filogenia bem próximo de Pareiorhina e formando um grupo irmão com o clado que inclui Neoplecostomus mais cinco espécies de Hypostominae. Tal resultado estaria de acordo com a sugestão expressa por Nichols (1919), que propôs Pseudotocinclus como intermediário entre Hypoptopomatinae e Hypostominae. Porém, ao mesmo tempo, causou espanto aos autores, já que se pensava que Pareiorhina era mais relacionado a Isbrueckerichthys (Derijst, 1996). Tal resultado fez também com que o monofilestismo de Hypoptopomatinae não pudesse ser corroborado (Montoya-Burgos et al., 1998). Armbruster (2004), em um trabalho com caracteres de morfologia externa, osteologia e anatomia do trato digestivo da família Loricariidae, com ênfase nas CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 14 subfamílias Hypostominae e Ancistrinae, apresentou uma nova hipótese de relacionamento para Loricariidae (Figura 4). Seus dados sugerem, entre outras coisas, que a família Hypoptopomatinae, apesar de monofilética, está intimamente relacionada com espécies da subfamília Neoplecostominae (sensu Armbruster, 2004), e seu status de subfamília deve ser reavaliado pois se admitirmos Hypoptopomatinae como subfamília, a subfamília Neoplecostominae torna-se parafilética. Armbruster (2004) não encontra o monofilestismo das tribos de Hypoptopomatinae, como proposto por Schaefer (1998), indicando o parafiletismo de Otothyrini devido a inclusão da monofilética Hypoptopomatini. Gauger & Buckup (2005) também questionam o monofiletismo de Otothyrini (Figura 5). Estes resultados indicam uma necessidade de novas reconstruções filogenéticas para Hypoptopomatinae baseadas em dados independentes. O estudo filogenético empregando sequências parciais de DNA mitocondrial em peixes é uma realidade bastante atual, o que pode ser confirmado pelo grande número de trabalhos publicados com essa abordagem (Cichlidae em Pérez et al., 2006; Clupeiformes em Lavouè et al., 2007; Cyprinidae em Pramuk et al., 2006 e Costedoat et al., 2006; Cotidae em Yokoyama e Goto, 2005; Gobioidei em Keith et al., 2005; Characiformes em Hubert et al., 2005; Cobitoidea em Tang et al., 2005; Perciformes em Doiuchi e Nakabo, 2006 e Sloss et al., 2004; Callichthyidae em Shimabukuro-Dias et al., 2004; Siganidae em Kuriiwa et al., 2007, dentre muito outros). Uma outra abordagem baseada em sequências de DNA vem sendo utilizada em reconstruções filogenéticas para diversos grupos, onde o genoma mitocondrial completo tem sido sequenciado para diversos vertebrados, incluindo muitos peixes, onde podemos citar: Cyprinus carpio, “carpa comum” (Chang et al., 1994); Petromyzon marinus, “lampréia” (Lee e Kocher, 1995); Gadus morhua, “bacalhau” (Johansen e Bakke, 1996); Latimeria chalumnae, “celacanto” (Zardoya e CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 15 Meyer, 1997); Pangasianodon gigas, “catfish” (Jondeung et al., 2007), entre muitos outros. Em tais estudos moleculares em peixes, dois grupos de genes mitocondriais costumam ser mais amplamente utilizados, os que codificam os rRNA ribossômicos e os que codificam as proteínas. Os genes ribossomais geralmente são muito conservados, mesmo contendo regiões que possuem variação que são suficientes para ser utilizadas em reconstruções filogenéticas no nível de espécie. Já nos genes mitocondriais que codificam proteínas, encontramos uma grande variedade de níveis de conservação. Por exemplo, o gene COI (Citocromo Oxidase I) é altamente conservado, enquanto os para ATPase 6 e 8 são altamente variáveis (Hillis et al., 1996). O número de estudos publicados que usam genes nucleares em estudos filogenéticos ainda é pequeno em relação ao número daqueles que utilizam genes mitocondriais. Contudo, diversos trabalhos têm sido publicados nos últimos anos mostrando a utilidade desses genes em estudos de diversos grupos de peixes (Lovejoy e Collete, 2001; Lavoué et al., 2003; Crespi e Fulton, 2004; Hardman, 2004; Near et al., 2004; Moyer et al., 2004; Quenouille et al., 2004; Rüber et al., 2004; Calcagnotto et al., 2005; Sullivan et al., 2006; Chiachio et al., 2008) e espera-se que nos próximos anos muitas filogenias baseadas em genes nucleares estejam disponíveis. A elaboração de filogenias moleculares permite também testar hipóteses de relacionamento construídas com base em outros caracteres como os caracteres morfológicos. Baseando-se na filogenia atual proposta por Armbruster (2004), onde é levantanda a hipótese dos hypoptopomatíneos não formarem um grupo natural dentro de Loricariidae, um estudo molecular desses indivíduos pode ser bastante útil para elucidar as reais relações do grupo com os demais loricariídeos e confirmar, ou não, a idéia do monofiletismo para o grupo em questão. CHIACHIO, Márcio Cesar Figura 1. Howes (1983) para as subfamílias de Loricariidae. Figura 2. Cladograma mostrando as relações entre os gêneros de Hypoptopomatinae, segundo Schaefer Figura 1. Relações filogenéticas proposta por Howes (1983) para as subfamílias de Loricariidae. Cladograma mostrando as relações entre os gêneros de Hypoptopomatinae, segundo Schaefer (1998). Introdução 16 Relações filogenéticas proposta por Howes (1983) para as subfamílias de Loricariidae. Cladograma mostrando as relações entre os gêneros de CHIACHIO, Márcio Cesar Figura 3. Relações filogenéticas proposta por Loricariidae utilizando sequências Relações filogenéticas proposta por Montoya-Burgos et al. (1998) sequências parciais dos genes mitocondriais 12S e 16S Introdução 17 (1998) para a família parciais dos genes mitocondriais 12S e 16S rRNA. CHIACHIO, Márcio Cesar Figura 4. Filogenia da família Loricariidae baseada em caracteres segundo Armbruster (2004). Filogenia da família Loricariidae baseada em caracteres morfológicos, segundo Armbruster (2004). Introdução 18 morfológicos, CHIACHIO, Márcio Cesar Introdução 19 Figura 5. Filogenia da subfamília hypoptopomatinae baseada em caracteres morfológicos, segundo Gauger & Buckup (2005). CHIACHIO, Márcio Cesar Objetivos 20 2. OBJETIVOS O presente trabalho está inserido em um amplo estudo das relações dentro e entre os membros da superfamília Loricarioidea. Como objetivos específicos temos: 1- Sequênciar segmentos do genoma mitocondrial e nuclear de representantes dos gêneros da subfamília Hypoptopomatinae e de gêneros relacionados, com o propósito de construir uma árvore filogenética para as espécies analisadas. 2- Realizar uma análise combinada dos dados obtidos no presente estudo para elaboração de uma árvore de consenso para os táxons analisados. CHIACHIO, Márcio Cesar Materiais 21 3. MATERIAIS 3.1 Grupo Interno A lista de todos os 53 exemplares (16 gêneros) de Hypoptopomatinae analisados no presente trabalho é mostrada na Tabela 1. Suas localidades de coleta e dados de registro de tombo também estão relacionados nessa tabela. Após o processamento, os peixes foram devidamente identificados e encontram-se depositados nas coleções de peixes do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP) do Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP, Brasil; da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil; do Laboratório de Ictiologia da UNESP (DZSJRP), São José do Rio Preto, SP, Brasil; e Muséum d’Histoire Naturelle de Genève (MHNG), Genébra, Suiça. A Figura 6 apresenta imagens de espécies representantes dos gêneros constituintes da subfamília Hypoptopomatinae. 3.2 Grupo Externo Paralelamente, a fim de se testar as reais relações dos representantes de Hypoptopomatinae com a subfamília Neoplecostominae, foram utilizados 11 indivíduos de quatro gêneros de Neoplecostominae em nossas análises. Para enraizarmos as árvores utilizamos amostras de duas espécies do gênero Hemipsilichthys pertencentes a subfamília Delturinae. Tais exemplares encontram-se listados na Tabela 2 onde encontramos também suas localidades de coleta e dados sobre o seu tombamento. Os animais encontram-se depositados nas coleções de peixes do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP) do Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP, Brasil e Muséum d’Histoire Naturelle de Genève (MHNG), Genébra, Suiça. CHIACHIO, Márcio Cesar Materiais 22 Tabela 1. Indivíduos da subfamília Hypoptopomatinae utilizados no presente trabalho. Espécie Número de Catálogo Número do espécime Localidade Acestridium discus LBP-3165 19315 Rio Preto da Eva, Rio Preto da Eva, AM, Brasil Acestridium sp. LBP-7204 35332 Igarapé Ya-Mirim, São Gabriel da Cachoeira, AM, Brasil Corumbataia cuestae LBP-2001 12191 Rio Alambari, Botucatu, SP, Brasil Corumbataia tocantinensis LBP-1653 11477 Rio Vermelho, Goiás, Goiânia, Brasil Epactionotus bilineatus LBP-4871 24919 Rio Carvalho, São Francisco de Paula, RS, Brasil Eurycheilichthys sp. LBP-4723 24951 Arroio Jabuticaba, Veranópolis, RS, Brasil Hisonotus charrua LBP-4720 24941 Arroio Cuaró Grande, Artigas, Uruguai Hisonotus luteofrenatus LBP-7848 35749 Rio dos Patos, Nova Mutum, MT, Brasil Hisonotus luteofrenatus LBP-7848 35750 Rio dos Patos, Nova Mutum, MT, Brasil Hisonotus luteofrenatus LBP-7848 35752 Rio dos Patos, Nova Mutum, MT, Brasil Hisonotus francirochai LBP-5529 25381 Ribeirão Cubatão, Marapoama, SP, Brasil Hisonotus insperatus LBP-1412 311/03 Ribeirão Araquá, Botucatu, SP, Brasil Hisonotus leucofrenatus LBP-760 18218 Rio Passa Sete, Morretes, PR, Brasil Hisonotus nigricauda LBP-4719 25636 Arroio do Nariz, Rosário do Sul, RS, Brasil Hisonotus ringueleti LBP-4863 24930 Arroio Cuaró Grande, Artigas, Uruguai Hisonotus sp. LBP-5624 35326 Rio Maravilha, Balsas / MA Hisonotus sp. LBP-5624 35327 Rio Maravilha, Balsas / MA Hypoptopoma guentheri LBP-693 7084 Afluente rio Pirai, Poconé, MG, Brasil Hypoptopoma gulare LBP-3081 19713 Rio Orinoco, Caicara, Bolivar, Venezuela Hypoptopoma inexpectatum MHNG PR-12 Rio Paraná, Santa Fé, Argentina Hypoptopoma sp. LBP-1693 12792 Lago do Vanico, Carero, AM, Brasil Hypoptopoma sp. LBP-4042 22905 Rio Moa, Cruzeiro do Sul, AC, Brasil Microlepidogaster LBP-7253 33309 Córrego sem nome (Dre. Rio Paranaíba / Bacia La Plata),Pires do Rio, GO, Brasil Microlepidogaster sp.2 LBP-7244 33301 Afluente Rio Araguari, Perdizes, MG, Brasil Microlepidogaster sp.2 LBP-7244 33302 Afluente Rio Araguari, Perdizes, MG, Brasil Microlepidogaster sp.1 LBP-7245 33304 Afluente Rio Arapuca, Bela Vista de Goiás, GO, Brasil Microlepidogaster sp.1 LBP-7245 34405 Afluente Rio Arapuca, Bela Vista de Goiás, GO, Brasil Nannoptopoma sp. MHNG MUS-388 Export Iquitos, Upper Amazon basin, Peru Otocinclus cf. mariae MHNG BR98-040 Rio Acará, PA, Brasil Otocinclus cf. mariae MHNG SU07-350 Witoto Ecu creek, Sipaliwini, Suriname Otocinclus cocama MHNG MUS-282 Bacia alto Rio Amazonas , Perú Otocinclus flexilis LBP-877 8564 St. Antônio da Patrulha, RG, Brasil Otocinclus gibbosos LBP-2652 17407 Rio Carombé, Campinhos, PR, Brasil Otocinclus hoppei MHNG CA-25 Arroio Huangana, Alto Pisqui, Loreto/Ucay. Peru Otocinclus hoppei LBP-5310 26831 Igarapé Uiratapuru, Laranjal do Jari, AM, Brasil Otocinclus vittatus LBP-5132 26233 Lagoa Bairro Caiçara, Cáceres, MG, Brasil Otothyris juquiae LBP-2094 13851 Riacho Descoberto, Guaratuba, PR, Brasil Otothyris travassossi LBP-1971 13685 Riacho Rosário, Canavieiras, BA, Brasil Otothyropsis marapoama LBP-5528 25343 Ribeirão Cubatão, Marapoama, SP, Brasil Oxyropsis acutirostra LBP-4300 23945 Igarapé Zamula, Barcelos, AM, Brasil Oxyropsis sp. LBP-6973 35324 Igarapé Demuriari, São Gabriel da Cachoeira, AM, Brasil CHIACHIO, Márcio Cesar Materiais 23 (continua…) Espécie Número de Catálogo Número do espécime Localidade Parotocinclus britskii MHNG GY04-351 Bacia Rio Orinoco, Drenagem Costeira, Guianas Parotocinclus eppleyi LBP-4787 25579 Caño Tama Tama, AM, Venezuela Parotocinclus maculicauda LBP-2869 18571 Rio Fau, Miracatu, SP, Brasil Parotocinclus sp. LBP-6950 35328 Igarapé Nouba-Uba, São Gabriel da Cachoeira, AM, Brasil Pseudotocinclus juquiae LBP-1160 9664 Rio Ribeira de Iguape, Juquitiba, SP, Brasil Pseudotocinclus tietensis LBP-2931 18994 Rio Paraitinga, Salesópolis, SP, Brasil Pseudotothyris obtusa LBP-4722 24946 Lago Acaraí, São Francisco do Sul, SC, Brasil Schizolecis guntheri LBP-3238 19471 Rio Garuva, Garuva, SC, Brasil Schizolecis guntheri LBP-2401 15272 Rio São Pedro, Glicério, RJ, Brasil Schizolecis guntheri LBP-2513 15240 Rio Macacu, Itaboraí, RJ, Brasil Schizolecis guntheri LBP-2514 13846 Rio Sagrado, Morretes, PR, Brasil Schizolecis guntheri LBP-2988 19646 Rio Indaiá, Ubatuba, SP, Brasil Tabela 2. Indivíduos das subfamílias Neoplecostominae e Delturinae utilizados no presente trabalho como grupo externo. Espécie Número de Catálogo Número do espécime Localidade Subfamília Neoplecostominae Neoplecostomus microps LBP-645 7593 Ribeirão Cajarana, Pidamonhangaba, SP, Brasil Neoplecostomus microps MHNG 2588.002 BR1283 Ribeirão Benfica, São Paulo, Brasil Isbrueckerichthys duseni LBP-2650 17404 Rio Pulador, Campinhos, PR, Brasil Isbrueckerichthys alipionis MHNG 2586.80 BR1187 Rio Betari, Iporanga, SP, Brasil Isbrueckerichthys alipionis LBP-7373 34853 Rio Betari, Iporanga, SP, Brasil Pareiorhaphis splendens MHNG 2586.47 BR1148 Rio Araraquara, Santa Catarina, Brasil Pareiorhaphis steindachneri LBP-902 7989 Rio Itapocu, Jaraguá do Sul, SC, Brasil Pareiorhaphis azygolechis MHNG 2586.49 BR1152 Rio Araraquara, Santa Catarina, Brasil Pareiorhina rudolphi MHNG 2587.22 BR1229 Ribeirão Benfica, São Paulo, Brasil Pareiorhina sp LBP-4391 24188 Ribeirão Guaxinduva, São Paulo, Brasil Pareiorhina sp LBP-4391 24189 Ribeirão Guaxinduva, São Paulo, Brasil Subfamília Delturinae Hemipsilichthys gobio LBP-2368 15363 Rio Macaquinho, Bairro dos Macacos, SP, Brasil Hemipsilichthys papillatus LBP-4956 10241 Ribeirão da Jacutinga, B.Jd. de Minas, Minas Gerais, Brasil CHIACHIO, Márcio Cesar Materiais 24 Figura 6. Imagens de espécies representativas para os 17 gêneros da subfamília Hypoptopomatinae. Fonte: Evers & Seidel (2005) e Ribeiro et al., 2005 (Otothyropsis). CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 25 4. MÉTODOS 4.1 Extração de DNA Genômico O DNA foi obtido a partir de amostras de músculo preservadas em etanol 95%, seguindo diferentes metodologias: 4.1.1 Extração por Fenol-Clorofórmio (Sambrook et al., 2001) 1. Prepara-se uma solução MIX contendo: Soluções Volume / 1 amostra EDTA 0,5M 25,0 µl SDS 10% 25,0 µl NaCl 5M 10,0 µl Proteinase 5,0 µl Tris HCl 2M 2,5 µl H2O (completar para 500 µl) 432,5 µl Volume Final 500 µµµµl 2. Em um cadinho, dissocia-se a amostra juntamente com a solução MIX e transfere-se a solução obtida para um tubo 1,5 ml; 3. Deixa-se em banho-maria (50°C) por 2 horas, vertendo-os esporadicamente; 4. Em uma Capela, realiza-se a primeira lavagem com Fenol, adicionando 500 µl de Fenol em cada tudo, dobrando o volume inicial; 5. Verte-se o tubo por aproximadamente 15 minutos; 6. Centrifuga-se por 15 minutos a 14.000 rpm; 7. Com cuidado, retira-se o sobrenadante e transfere-se para outro tubo e então se realiza a segunda lavagem repetindo os passos 5, 6 e 7; 8. Na terceira lavagem, adiciona-se 250 µl de Fenol e 250 µl de Clorofórmio; 9. Centrifuga-se por 15 minutos a 14.000 rpm; 10. Precipita-se com 1/10 do volume inicial (50µl) de NaCl 5M + 2X o volume (1000µl) de Etanol gelado 100%; 11. Se houver a formação de nuvens, coleta-se o material e coloca-se em outro tubo com 1000µl de Etanol 70% gelado, ou senão; 12. Deixa-se por uma noite (“overnight”) no freezer –20°C; 13. Centrifuga-se por 30 minutos e descarta-se o sobrenadante; 14. Adiciona-se 800 µl de Etanol 70% gelado; CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 26 15. Centrifuga-se por 15 minutos e descarta-se o sobrenadante; 16. Deixa-se secar durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente; 17. Elui-se com TE ou H2O adicionando cerca de 300 µl, de acordo com o tamanho do pellet formado no fundo do tubo; 18. Trata-se com 1,5 µl de RNAse em banho-maria 1h à 37°C, depois novamente por 10 minutos à 65°C. 4.1.2 Extração por Tampão de extração (Aljanabi & Martinez, 2001) 1. Prepara-se uma solução MIX contendo: Soluções Volume / 1 amostra Tampão de Extração (Tris-HCl + EDTA + SDS 1%) 290,0 µl Proteinase K (10 mg/ml) 10,0 µl 2. Em um cadinho, dissocia-se a amostra juntamente com a solução MIX (sem a Proteinase K) e transfere-se a solução obtida para um tubo 1,5 ml; 3. Adciona-se a Proteinase K e deixa-se em banho-maria (55°C) por 2 a 3 horas, vertendo-os esporadicamente; 4. Colocar 100 µl de solução de NaCl 5M e misturar bem vertendo o tubo vagarosamente; 5. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente; 6. Remover 300 µl de sobrenadante e transferir para um novo tubo de 1,5 ml; 7. Adicionar 600 µl de etanol 100% gelado; 8. Deixar no ultrafreezer (-70ºC) por 20 minutos; 9. Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4ºC; 10. Remover o sobrenadante; 11. Secar bem (pode-se deixar em estufa a 37ºC por até 30 minutos ou então por uma noite em temperatura ambiente). 12. Adicionar 200 µl de água ultrapura autoclavada. Aguardar por pelo menos 24 horas para hidratação; 13. Aliquotar o DNA e guardar cerca de 150 µl no freezer (-20ºC) para solução estoque e o restante na geladeira (4ºC) para a solução de trabalho. CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 27 4.1.3 Extração por Kit Comercial (“DNeasy Tissue Kit” – Qiagen Peqlab) 1. Coloque a amostra em um tubo 1,5 ml e transfira o mesmo a um “banho seco” (Block) à 55°C por cerca de 25 minutos até a secagem completa de todo o álcool presente na amostra; 2. Com o auxílio de um pequeno bastão plástico (piston) macere toda a amostra; 3. Adicione 200 µl de Tampão de Extração (Tris HCl pH8.0 10mM + EDTA pH8.0 10mM + NaCl 50mM + SDS 0,5%) à amostra; 4. Macere novamente o tecido com o bastão; 5. Adicione 25 µl de Proteinase K (20 mg/ml) e passe o tubo no vórtex ligeiramente; 6. Coloque o tubo num block aquecido a 55°C e deixe por uma noite para a digestão completa do tecido; 7. Após a digestão retire o tubo do Block e Centrifugue a 6.000 rpm por 5 segundos (spin); 8. Adicione 220 µl de Tampão BL e passe no vórtex ligeiramente; 9. Transfira o tubo para um block programado a 70°C e deixe por 10 minutos; 10. Centrifugue a 6.000 rpm por 5 segundos (spin); 11. Adicione 220 µl de EtOH 100% e passe no vórtex; 12. Centrifugue a 6.000 rpm por 5 segundos (spin); 13. Transfira o conteúdo do tubo (digestão) para uma coluna acoplada a um tubo coletor, ambos devidamente identificados; 14. Centrifugue por 1 minuto a 10.000 rpm; 15. Transfira a coluna para um novo tubo coletor e descarte o anterior; 16. Adicione 600 µl de Wash Buffer (preparado com EtOH) na coluna; 17. Centrifugue por 1 minuto a 10.000 rpm. Descarte o líquido do tubo coletor e o acople novamente à coluna; 18. Adicione novamente 600 µl de Wash Buffer (preparado com EtOH) na coluna; 19. Centrifugue por 1 minuto a 10.000 rpm. Descarte o líquido do tubo coletor e o acople novamente à coluna; 20. Prepare o Elution Buffer aquecendo-o à 70°C; 21. Centrifugue a coluna (vazia) acoplada ao mesmo tubo coletor por 2 minutos a 13.000 rpm, para a secagem completa da coluna; 22. Transfira a coluna para um novo tubo 1,5 ml e descarte o tubo coletor; 23. Adicione à coluna 200 µl de Elution Buffer pré-aquecido; 24. Coloque o tubo 1,5 ml com a coluna num block a 70°C por 3 minutos; 25. Centrifugue por 1 minuto a 10.000 rpm; 26. Aliquotar o DNA e guardar cerca de 150 µl no freezer (-20ºC) para solução estoque e o restante na geladeira (4ºC) para a solução de trabalho. CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 28 4.2 Amplificação dos Segmentos de DNA As amostras utilizadas no presente trabalho tiveram suas regiões parciais dos genes mitocondriais 16S rRNA e Citocromo Oxidase I e a região correspondente ao gene nuclear F-Reticulon4 amplificadas pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). O gene F-Reticulon4, também conhecido como RTN4 ou Nogo, possui duas regiões exônicas e duas intrônicas. Codifica para uma proteína integrante da membrana predominantemente presente no sistema nervoso e foi analisado intensivamente em mamíferos (Yan et al., 2006) e em peixes (Diekmann et al., 2005). O gene 16S rRNA, componente da subunidade ribossomal maior do mtDNA juntamente com o 12S rRNA, possui suas sequências razoavelmente conservadas, com uma evolução mais lenta em comparação com o genoma mitocondrial como um todo (Palumbi et al., 1996). Porém, o autor afirma a existência de uma variação considerável, fazendo com que tais sequências possam ser utilizadas em reconstruções a nível de população. O gene da subunidade citocromo oxidase, participante também da cadeia transportadora de elétrons (Palumbi et al., 1996), tem suas sequências de nucleotídeos altamente conservadas, característica importante, pois o torna de fácil alinhamento e com simplicidade também para o desenho de primers universais. O desenho dos primers utilizados possuem as sequências mostradas na tabela abaixo (Tabela 3). CHIACHIO, Márcio Cesar TABELA 3: Lista de primers e respectivos sítios de anelamento utilizados no presente trabalho. O gene de F-reticulon4 de PCR; a primeira PCR foi executad R e a segunda PCR foi executada com os como determinado em Montoya produto obtido apresentou ligeiramente internos com a seguinte TRR CGC AYG CA-3’). FIGURA 7: Representação d anelamento dos primers que foram utilizados para amplificação e posterior sequenciamento desse gene. (Primers iD2 e iR foram utilizados apenas para a reação de sequenciamento). Para as reações Taq Polimerase já possui o tampão reação. Os procedimentos foram: Região Nome 16S rRNA 16S F 16S R Citocromo Oxidase I L5698-Asn F H7271-COI R F-Reticulon4 Freticul4 Freticul4 Freticul4 D2 Freticul4 R2 : Lista de primers e respectivos sítios de anelamento utilizados no presente reticulon4 (Figura 7) foi amplificado utilizando duas roda PCR foi executada com os primers externos Freticul4 PCR foi executada com os primers internos Freticul4 como determinado em Montoya-Burgos et al. (em preparação). obtido apresentou-se fraco, utilizamos um novo conjunto de primers com a seguinte sequência: FReticul4-D2.1 (5 epresentação de um segmento do gene F-reticulon4, com a região de ento dos primers que foram utilizados para amplificação e posterior enciamento desse gene. (Primers iD2 e iR foram utilizados apenas para a reação Para as reações de PCR foi utilizado o kit GoTaq Promega. Nesse kit a já possui o tampão Buffer e dNTP em concentrações ótimas para a Os procedimentos foram: Nome Referência Sequência do Primer KOCHER et al., 1989 5' ACG CCT GTT TAT CAA AAA CAT 3' 5' CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T 3' Asn F Dr. Claudio de Oliveira 5' AGG CCT CGA 3' COI R 5' GTG GTG GGC TCA TAC AAT AAA 3' Freticul4-D Dr. Juan Montoya-Burgos 5' AGG CTA ACT CGC TYT SGG CTT TG 3' Freticul4-R 5' GGC AVA GRG CRA ART CCA TCT C 3' Freticul4- 5' CTT TGG TTC GGA ATG GAA AC Freticul4- 5' AAR TCC ATC TCA CGC AGG A 3' Métodos 29 : Lista de primers e respectivos sítios de anelamento utilizados no presente foi amplificado utilizando duas rodadas externos Freticul4-D e Freticul4- internos Freticul4-D2 e Freticul4-R2, Burgos et al. (em preparação). Nos casos onde o um novo conjunto de primers D2.1 (5’-GAA GCT CCA reticulon4, com a região de ento dos primers que foram utilizados para amplificação e posterior enciamento desse gene. (Primers iD2 e iR foram utilizados apenas para a reação foi utilizado o kit GoTaq Promega. Nesse kit a e dNTP em concentrações ótimas para a ência do Primer 5' ACG CCT GTT TAT CAA AAA CAT 3' CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T 3' TCC TAC AAA GKT TTA GTT AAC 5' GTG GTG GGC TCA TAC AAT AAA 3' ACT CGC TYT SGG CTT TG 3' 5' GGC AVA GRG CRA ART CCA TCT C 3' CTT TGG TTC GGA ATG GAA AC 3' 5' AAR TCC ATC TCA CGC AGG A 3' CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 30 4.2.1 Genes mitocondriais 1. Em um tubo 1.5 ml prepara-se uma reação MIX, descrita abaixo. Multiplicam-se os valores de acordo com o número de reações a serem amplificadas. O volume para cada reação é: Soluções Volume GoTaq 6.5 µl Primer F 1,0 µl Primer R 1,0 µl H2O Autoclavada 5,5 µl DNA genômico 1,0 µl Volume Final 15,0 µl 2. Leva-se os tubos a um termociclador e realiza-se o seguinte programa: Passo Processo Temperatura Tempo 1 Desnaturação Inicial 94º C 3′ 2 Desnaturação 94°C 30′′ 3 Anelamento 48-56°C 1′ 4 Extensão 72°C 2′ 5 Volta para o passo 2 - 35X 6 Extensão Final 72°C 5′ 3. As amostras, após a amplificação, são checadas em gel de agarose 1%. 4.2.2 Gene nuclear 1. Em um tubo de 1,5 ml prepara-se uma reação MIX, descrita abaixo. Multiplicam-se os valores de acordo com o número de reações a serem amplificadas. O volume para cada reação é: Soluções Volume GoTaq 6.5 µl Primer F 1,0 µl Primer R 1,0 µl H2O Autoclavada 5,5 µl DNA genômico 1,0 µl Volume Final 15,0 µl CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 31 2. Leva-se os eppendorfs a um termociclador e realiza-se o seguinte programa: Passo Processo Temperatura Tempo 1 Desnaturação Inicial 95ºC 3′ 2 Desnaturação 95°C 30′′ 3 Anelamento 48°C 30′′ 4 Extensão 72°C 2′:15′′ 5 Volta para o passo 2 - 37-45X 6 Extensão Final 72°C 5′ 3. As amostras, após a amplificação, são checadas em gel de agarose 1%. Um exemplo de resultado padrão obtido nessa primeira reação de PCR está apresentado na Figura 8A. Após essa etapa uma nova amplificação foi realizada com uma temperatura de anelamento mais elevada, utilizando-se os primers F-Reticul-D2 e F-Reticul-R2 (representados com suas regiões de anelamento na Figura 7), seguindo o seguinte protocolo de reação: Soluções Volume GoTaq 6.5 µl Primer F 1,0 µl Primer R 1,0 µl H2O Autoclavada 5,5 µl Produto de PCR da primeira reação - Diluído 1/20 1,0 µl Volume Final 15,0 µl 1. Leva-se os eppendorfs a um termociclador e realiza-se o seguinte programa: Passo Processo Temperatura Tempo 1 Desnaturação Inicial 94º C 3′ 2 Desnaturação 94°C 30′′ 3 Anelamento 54°C 30′′ 4 Extensão 72°C 2′:15′′ 5 Volta para o passo 2 - 37-45X 6 Extensão Final 72°C 5′ 2. As amostras, após a amplificação, são checadas em gel de agarose 1%. Um exemplo de resultado padrão obtido nessa segunda reação de PCR está apresentado na Figura 8B. CHIACHIO, Márcio Cesar FIGURA 8: Fotografia do gel de agarose 1.0% após a eletroforese, representando com bandas o resultado positivo de amplificações: “L” representa a região de “corrida” do Ladder. amplificação do gene nuclear F muitas amplificações inespecíficas, arrastos ou até mesmo banda alguma. B. Segunda reação de amplificação do gene nuclear F Reticulon4, onde evidenciam com bandas de aproximadamente 2000 pb. Os números representam amostras. Fotografia do gel de agarose 1.0% após a eletroforese, esentando com bandas o resultado positivo de amplificações: “L” representa a região de “corrida” do Ladder. A. Primeira reação de amplificação do gene nuclear F-Reticulon4, onde apresentam muitas amplificações inespecíficas, arrastos ou até mesmo banda Segunda reação de amplificação do gene nuclear F Reticulon4, onde evidenciam-se apenas amplificações específicas, com bandas de aproximadamente 2000 pb. Os números representam amostras. Métodos 32 Fotografia do gel de agarose 1.0% após a eletroforese, esentando com bandas o resultado positivo de amplificações: “L” Primeira reação de Reticulon4, onde apresentam-se muitas amplificações inespecíficas, arrastos ou até mesmo banda Segunda reação de amplificação do gene nuclear F- se apenas amplificações específicas, com bandas de aproximadamente 2000 pb. Os números CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 33 4.3 Purificação das Amostras Amplificadas Após checagem da amplificação, o produto de PCR (MITOCONDRIAL) passou por reação de limpeza através da enzima ExoSap-IT (Exonuclease I: Recombinant SAP: Pandalus borealis - USB Corporation) seguindo o seguinte procedimento: 1. Em um tubo 0,2 ml prepara-se uma reação contendo 5,0 µµµµl do DNA amplificado juntamente com 2,0 µµµµl da enzima ExoSap-IT e leva-se para o termociclador para a realização do seguinte programa: Passo Temperatura Tempo 1 37º C 15′ 2 80°C 15′ As amplificações das regiões NUCLEARES foram purificadas utilizando o Kit comercial High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) seguindo o procedimento: 1. Transfira 25 µl de produto de PCR amplificado para a coluna (High Pure Filter Tube) e acople a coluna num tubo coletor (Collection Tube); 2. Adicione em cada coluna 250 µl de Binding Buffer (Tampão de captura); 3. Centrifugue por 1 minuto em 13.000 rpm em temperatura ambiente; 4. Descarte o liquido do tubo coletor e acople o mesmo novamente a coluna; 5. Adicione 250 µl de Wash Buffer (Tampão de Lavagem); 6. Centrifugue por 1 minuto em 13.000 rpm em temperatura ambiente; 7. Descarte o liquido do tubo coletor e acople o mesmo novamente a coluna; 8. Adicione 100 µl de Wash Buffer (Tampão de Lavagem); 9. Centrifugue por 1 minuto em 13.000 rpm em temperatura ambiente; 10. Descarte o liquido do tubo coletor e acople a coluna num tubo 1,5 ml; 11. Adicione 25 µl de Elution Buffer (Tampão de Eluição); 12. Centrifugue por 1 minuto em 13.000 rpm em temperatura ambiente. CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 34 4.4 Reação de PCR para Sequenciamento Para a reação de PCR foi utilizado o Kit “Big DyeTM Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction” (Applied Biosystems). O procedimento utilizado foi o seguinte: 1. Prepara-se uma amostra e duas réplicas para cada região a ser sequenciada e para isso, prepara-se uma solução MIX, para cada um dos primers, contendo: Soluções Volume DNA (Amplificado e limpo) 2,0 µl Primer (Diluído na proporção 3:1) 2,0 µl Solução Pré-MIX (nucleotídeos marcados com fluorescência) 2,0 µl H2O Autoclavada 3,0 µl Volume Final 9,0 µl OBS: para o gene nuclear F-Reticulon4 o produto da segunda reação de amplificação limpo pela ExoSap-IT foi diluído novamente na proporção 1/20 para posterior reação de sequenciamento. 2. Leva-se os tubos a um termociclador e realiza-se o seguinte programa: Passo Processo Temperatura Tempo 1 Desnaturação 94º C 3′ 2 Desnaturação 94°C 30′′ 3 Anelamento 56°C 1′ 4 Extensão 72°C 2′ 5 Volta para o passo 2 35X 6 Extensão Final 68°C 4′ CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 35 4.5 Limpeza do PCR de Sequenciamento 1. Adiciona-se em cada tubo 0.7 µl de EDTA (125mM); 2. Adiciona-se 0.7 µl de Acetato de Sódio (3 M); 3. Homogeneizar e passar numa microcentrifuga (spin) brevemente; 4. Adicionar 17,5 µl de Etanol 100%; 5. Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente; 6. Centrifuga-se por 15 min, 13.000 rpm à 25°C; 7. Descartar o Etanol em papel toalha; 8. Adiciona-se 24,5 µl de Etanol 70% Gelado; 9. Centrifuga-se por 10 minutos, 13.000 rpm à 25°C; 10. Descartar o Etanol em papel toalha; 11. Repetir passo 8 a 10 (lavagem com Etanol 70%); 12. Secar em termociclador por 2 minutos a 96°C; 13. Guarda-se os tubos, já secos, no freezer à 4°C envolto em papel alumínio, até o momento do sequenciamento; 4.6 Sequenciamento de DNA As sequências dos genes utilizados no presente trabalho foram obtidas através da técnica de sequenciamento por capilaridade num sequenciador Modelo ABI 3130 – Applied Biosystems, no Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da UNESP, campus de Botucatu e no MolBioAni Laboratory – Molecular Systematic Group, na Université de Genève – Faculté des Sciencies, técnico responsável Dr. José Fahrni, em Genébra, Suiça. 4.7 Obtenção das sequências consenso Após o sequenciamento das amostras e suas réplicas, as sequências obtidas para o conjunto de primers para cada gene foram analisadas com a visualização simultânea do eletroferograma originário do processo de sequenciamento CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 36 automático. Isso possibilita que as sequencias consenso de cada gene sejam obtidas com um maio grau de precisão. Tais sequências foram então passadas para um editor de texto, nomeadas separadamente e salvas em um único arquivo em formato de texto sem formatação (extensão .txt). 4.8 Análise Filogenética 4.8.1 Alinhamento das sequências Diferentes programas e algoritmos foram testados a fim de se obter um alinhamento mais próximo do final, para que a matriz sofresse a menor interferência possível. Foram testados o programa DAMBE 4.1.27 (Xia e Xie, 2001), BioEdit (Hall, 1999) com o algoritmo ClustalW (Thompson et al., 1994), Geneious 3.8.5 (Biomatters Ltd.) e CLC Sequencer Viewer 5.0 (CLC Bio A/S) também com o algoritmo ClustalW (Thompson et al., 1994). No Geneious 3.8.5 e CLC também foi testado o alinhamento a partir dos algoritmos dos próprios programas. O algoritmo MUSCLE gerou os melhores resultados tanto acoplado aos programas CLC e Geneious quanto o disponível no link “http://www.ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html”, que foi o utilizado na análise final devido a sua praticidade. Posteriormente, o alinhamento foi exportado numa matriz salva como arquivo FASTA e importada no programa BIOEDIT efetuando, quando necessário, as correções manuais do alinhamento. O BioEdit é um programa de edição de sequências biológicas que permite edição, alinhamento, manipulação e análise tanto de sequências de nucleotídeos como de proteínas. Possibilita a fácil visualização do resultado do alinhamento através da utilização de códigos de cores para cada nucleotídeo e possibilita a edição manual das sequências, tanto de forma isolada como em grupos, simplificando o processo de correção, quando necessário, das mesmas, já que, a qualidade do alinhamento é fundamental para as análises, uma vez que a comparação CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 37 é feita em função das posições dos nucleotídeos nas sequências. Os algoritmos descritos anteriormente são largamente utilizadas em biologia molecular e facilitam esse processo de preparação dos dados isolados, que constitui um fundamental passo para a obtenção de um resultado confiável. 4.8.2 Análise dos dados Três matrizes independentes contendo sequências separadas e conjuntas de genes foram elaboradas para as análises. A primeira matriz com apenas as sequências parciais dos genes mitocondriais 16S rRNA e Citocromo Oxidase I para os representantes das subfamílias Hypoptopomatiane e Neoplecostominae. A matriz de número dois continha apenas as sequências referentes ao gene nuclear F-Reticulon4 para as mesmas amostras da primeira matriz. A última matriz apresenta de maneira conjunta, sequências de todos os três genes analisados no presente trabalho. Em todas as matrizes, espécies do gênero Hempsilichthys foram utilizadas como grupo externo em nossas análises. Para verificar se o número de transições e de transversões de nossas matrizes de dados atingiram o nível de saturação, isto é, se ocorreu mais do que uma substituição em determinados sítios, foram construídos gráficos, onde o eixo X representa os valores das distâncias de cada par de táxons usados e o eixo Y o número de transição (TS) ou de transversão (TV) presentes em cada par. No caso de não haver saturação, a relação entre estes parâmetros é linear, isto é, com o aumento da distância, há o aumento do número de TS ou TV. Se houver substituições múltiplas, o gráfico atinge uma situação no qual aumentando-se a distância, não há o aumento no número de TS ou TV. Tal análise foi estimada pelo modelo Kimura-2-parâmetros com o auxílio do programa DAMBE (Xia e Xie, 2001). A escolha do melhor modelo de substituição nucleotídica (evolução CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 38 genética) para cada matriz foi realizada com o programa Modeltest 3.06 (Posada e Crandall, 1998) e estão listados abaixo (Tabela 4). O modelo de substituição de nucleotídeos nos permite estimar como ocorreram as mudanças entre as sequências ao longo do tempo. Esse modelo envolve a estimativa do número de mudanças de caracteres que foram necessárias para a geração das sequências observadas e da probabilidade de ocorrência de cada um desses passos. Esse processo visa captar o processo evolutivo envolvido na geração das sequências. Para auxiliar na escolha de qual modelo se enquadra em nossa matriz de dados existem testes estatísticos que comparam os modelos, definindo qual o mais adequado para os dados em questão. O Modeltest utiliza os testes de verossimilhança (Likelihood Ratio Test – LRT) e do critério de informação de Akaike (Akaike Information Criterion – AIC) para realizar diferentes comparações entre modelos hierárquicos, um mais simples e um mais complexo, de forma a encontrar o modelo mais simples que melhor represente os dados analisados. Como resultado, fornece o modelo ideal para as amostras que se deseja analisar, como também os parâmetros que serão utilizados no programa que construirá a filogenia. TABELA 4: Resultado das análises efetuadas com o programa Modeltest 3.06 para as diferentes matrizes. Matriz Genes Modelo Matriz 01 16S rRna + Citocromo Oxidase I GTR – General time-reversible model (Rodriquez et al. 1990) + Invariantes e distribuição Gama. Matriz 02 F-Reticulon4 GTR – General time-reversible model (Rodriguez et al. 1990) + Invariantes e distribuição Gama. Matriz 03 16S rRna + Citocromo Oxidase I + F-Reticulon4 TVM – Modelo Transversional (Rodriguez et al., 1990) + Invariantes e distribuição Gama. CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 39 O modelo TVM (Rodríguez et al., 1990), sigla do inglês Transversional Model, é bem semelhante ao modelo GTR (General time-reversible), porém um pouco mais simplificado. Ele considera apenas uma taxa para transição e quatro taxas para transversão, além de quatro diferentes frequências de bases, totalizando sete parâmetros livres. Para nossas matrizes de dados o Modeltest indicou, além dos modelos TVM ou GTR, que fossem consideradas proporção de sítios invariáveis (I) e uma distribuição gama (G) para modelar as variações nas taxas de substituição entre os sítios. Tais valores (I e G) para cada matriz também são fornecidos pelo programa Modeltest. As análises filogenéticas foram efetuadas utilizando-se métodos de parcimônia máxima e inferência bayesiana, que permitem o uso de modelos de evolução complexos no intuito de captar ao máximo as informações fornecidas pela matriz de dados. Os diferentes protocolos de análises foram usados, de maneira geral, para todos os três conjuntos de dados. 4.8.2.1 Máxima Parcimônia A máxima parcimônia é um método de reconstrução filogenética que presume que a melhor hipótese filogenética é aquela que envolve o menor número de passos evolutivos, ou seja, de mudanças que expliquem toda a variação de uma matriz de dados. Como explicitado em seu próprio nome, a melhor árvore é aquela que requer o menor número de mudanças, ou seja, a hipótese mais parcimoniosa, assumindo que o processo evolutivo ocorreu da forma mais curta possível. Apresenta-se diretamente ligada ao conceito de ancestralidade, isto é, na presença de um estado de caráter compartilhado por dois ou mais táxons que foram potencialmente herdados de um ancestral comum. Desta forma, todos os sítios informativos por parcimônia devem ter uma hipótese de ancestralidade comum entre CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 40 táxons, ou seja, um sítio informativo por parcimônia é aquele que apresenta variação e que os estados de caráter são compartilhados por pelo menos dois táxons. A árvore que menos requerer mudanças para explicar as substituições nesses sítios informativos, é considerada a melhor hipótese filogenética para os dados em questão. As árvores resultantes de máxima parcimônia foram encontradas com o auxílio do programa PAUP* 4.0b10 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) que, como definido por seu próprio onme, foi criado para inferir filogenias a partir de dados discretos usando o método de máxima parcimônia, no entanto, além dessa possibilidade, ele oferece outros dois métodos de resconstrução (verossimilhança e distância) na escolha das árvores (Swofford 2002). Em nosso trabalho as árvores foram encontradas através do método Heurístico, onde os Gaps foram tratados como “perdas” (“missing data”). A árvore inicial foi construída via Stepwise-addition, que é um algoritmo bastante simples, onde inicialmente três táxons são escolhidos para compor uma árvore inicial, posteriormente, um quarto táxon é unido a eles em todas as posições possíveis e aquela árvore que representar a árvore ótima é considerada no passo seguinte. Isso se procede até que todas as unidades taxonômicas tenham sido inseridas e uma árvore tenha sido escolhida entre as possíveis árvores finais. Conjuntamente, o algoritmo Branch-swapping foi utilizado caso o sinal filogenético das sequências fosse baixo, o que levaria o algoritmo Stepwise-addition encontrar árvores “subótimas”. Para tanto, foi utilizado o método TBR (tree-bisection- reconnection – “bisecção de árvore”) que quebra a árvore em duas subárvores disjuntas e as une por meio de um par de ramos diferentes daqueles que foi originada. O procedimento é repetido até que todos os pares possíveis de ramos destas duas subárvores sejam unidos e a melhor árvore seja definida. Foram calculados ainda os CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 41 índices de consistência (IC), índice de retenção (IR) e índice de consistência rescalonado (RC) das ávores mais parcimoniosas encontradas. Ao assumirmos relações filogenéticas, temos a preocupação de avaliar a confiabilidade das árvores, ou mais ainda, mostrar qual a confiança nos agrupamentos formados por cada um dos nós mostrados em nossa topologia final. O bootstrap é uma técnica computacional de reamostragem que pode ser utilizada para estimar distribuições implícitas desconhecidas ou difíceis de serem descobertas analiticamente (Efron, 1979). Sua utilização em estudos filogenéticos foi feita por Felsenstein (1985) e desde então se tornou um método popular. O teste de bootstrap serve como uma forma de calcular índices que indiquem o grau de confiança dos ramos internos da árvore. Valores altos de bootstrap encontrados, claramente indicam uma boa estimativa e valores baixos devem ser avaliados com cautela. A utilização de um número maior de réplicas geralmente aumenta o grau de confiança dos resultados. 4.8.2.2 Inferência Bayesiana Filogenias baseadas em inferência Bayesiana são relativamente recentes (Rannala e Yang, 1996), porém baseiam-se no teorema de Bayes, proposto pelo matemático Thomas Bayes em 1763. É usado para combinar a probabilidade a priori de uma filogenia com a verossimilhança produzindo uma distribuição da probabilidade posterior nas árvores. A probabilidade posterior de uma árvore pode ser interpretada como a possibilidade de que uma árvore seja correta. Normalmente, todas as árvores são consideradas igualmente prováveis a priori, e a verossimilhança é calculada sob um modelo de Markov padrão de evolução de caracteres. Para calcular a probabilidade posterior é usado um modelo numérico, conhecido com Markov Chain Monte Carlo (MCMC) que permite que a probabilidade posterior seja aproximada, já que a sua formulação envolve o somatório de todas as árvores, integração de todas as CHIACHIO, Márcio Cesar Métodos 42 combinações possíveis de tamanho de ramo e valores de parâmetros de modelos de substituição, o que não pode ser resolvido analiticamente (Huelsenbeck et al. 2001). Através da análise Bayesiana é possível se estimar filogenias de uma grande quantidade de organismos em espaços de tempo relativamente pequenos quando comparado a outros métodos, além de calcular uma estimativa de confiabilidade dos ramos ao mesmo tempo em que realiza a inferência das árvores. As análises Bayesianas foram realizadas em nosso conjunto de dados com o programa MrBayes-3.1.2 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist and Huelsenbeck, 2003). Os parâmetros iniciais para cada conjuntos de dados foram estimados pelo AIC (Akaike Information Criterion) implementado no programa MrAIC (Nylander 2004). O modelo “General Time Reversible” (GTR) foi o selecionado para as nossas três diferentes matrizes. A forma da distribuição gama (G), a proporção de sítios invariáveis (I) e os valores dos parâmetros de substituição nucleotídica foram estimados. Foram usadas 3.000.000 de gerações, com quatro cadeias, com uma amostragem a cada 100 gerações. Foram excluídas as gerações anteriores à convergência das cadeias (burn in = 1.000.000) e uma árvore de consenso de maioria (50%) foi computada a partir das árvores amostradas depois da estabilidade encontrada. As probabilidades posteriores foram usadas como valores de suporte para os agrupamentos. CHIACHIO, Márcio Cesar Resultados 43 5. RESULTADOS Foram sequenciados um dos genes mitocondriais da subunidade do RNA ribossômico, o gene 16S, o gene codificador de uma das subunidades da citocromo oxidase I (COI) e o gene nuclear F-Reticulon4 (Tabela 3). Tais genes foram utilizados por apresentarem, além de um grande número de caracteres, uma taxa de evolução compatível com uma análise em nível de gênero. As transições/transversões (Ti/Tv) foram plotadas versus a distância genética segundo o modelo de Kimura-2-parâmetros para cada conjunto de genes (Mitocondriais; Nuclear; Mitocondriais + Nuclear), considerando como relações lineares, aquelas que possuíam o coeficiente de correlação (r) maior que 0.75, indicando que não houve saturação dos nucleotídeos (Figura 9). Os resultados obtidos em cada matriz de dados serão apresentados separadamente a seguir. CHIACHIO, Márcio Cesar Figura 9. Gráficos mostrando a frequência observada de transições (s) e transversões (v) em relação à distância genética estimada pelo modelo mitocondriais apenas (16S rRN Reticulon4; (C) Análise combinada de genes mitocondriais e nuclear. Gráficos mostrando a frequência observada de transições (s) e transversões (v) em relação à distância genética estimada pelo modelo Kimura-2-parâmetros. (A) Genes mitocondriais apenas (16S rRNA + COI); (B) Gene nuclear F ) Análise combinada de genes mitocondriais e Resultados 44 Gráficos mostrando a frequência observada de transições (s) e transversões (v) em relação à distância genética ) Genes ) Gene nuclear F- ) Análise combinada de genes mitocondriais e CHIACHIO, Márcio Cesar Resultados 45 5.1 Análise filogenética baseada em sequências de genes mitocondriais Na presente análise 60 exemplares foram incluídos em nossa matriz de dados, sendo que 53 pertencentes à subfamília Hypoptopomatinae, 5 à subfamília Neoplecostominae e dois representantes de Delturinae, como grupo externo. As informações sobre as características da sequência e alinhamento e as estatísticas da análise de parcimônia são sumarizadas na Tabela 5. A Figura 10 apresenta a árvore com o menor comprimento obtido (TL=3132) dentre as quatro árvores mais parcimoniosas encontradas a partir da matriz de dados. As topologias obtidas através das análises de máxima parcimônia (MP) e análise bayesiana (AB) apresentaram-se iguais mostrando apenas que, na segunda análise, todos os suportes estatísticos apresentaram-se relativamente superiores, porém, para a construção da árvore consenso (englobando as duas análises) optamos pelo corte referente aos valores de bootstrap (50%) e não pelos valores de probabilidades posteriores oriundos da análise bayesiana. Na topologia final notamos a presença de um grande clado polifilético formado por nossas amostras. Em Hypoptopomatinae nenhuma das duas tribos permanece monofilética, sendo que os gêneros da tribo Hypoptopomatini Acestridium, Oxyropsis, Hypoptopoma e Nannoptopoma aparecem formando um clado irmão dos demais Hypoptopomatini, Otothyrini e Neoplecostominae. Nesse primeiro clado, os gêneros Acestridium e Oxyropsis aparecem monofiléticos com alto suporte estatístico (MP 100/ AB 100), irmãos do clado formado pelos gêneros Hypoptopoma e Nannoptopoma (66/70). A subfamília Neoplecostominae não aparece monofilética devido a inclusão das duas espécies do gênero Pseudotocinclus, pertencentes à CHIACHIO, Márcio Cesar Resultados 46 Hypoptopomatinae, que apresentam-se estritamente relacionados à Pareiorhina com valor de bootstrap alto (85/100) (Figura 10, seta). Ainda em Neoplecostominae, o gênero Isbrueckerichthys também não aparece monofilético pela presença de Pareiorhaphis dentro de seus representantes. O clado formado por Neoplecostominae mais Pseudotocinclus apresenta-se irmão do restante do grupo. O gênero Otocinclus apresenta-se monofilético com moderado suporte estatístico, onde encontramos O. gibosus como basal para as espécies amostradas. O gênero Schizolecis mostra-se polifilético pela inclusão da espécie Otothyris travassosi que não se encontra irmã de O. juquiae. Encontramos também um clado moderadamente suportado (62/68) formado por Hisonotus, Microlepidogaster, Otothyropsis, Epactionotus e Eurycheilichthys. Porém o gênero Hisonotus não é encontrado como monofilético devido a ruptura de suas espécies em diferentes clados. Para relações interespecíficas e intergenéricas os genes mitocondriais utilizados na presente análise apresentaram valores estatísticos relativamente altos e suficientes para suportar a maioria das relações, porém em níveis superiores, tais como as tribos e inter-subfamíliais, os valores encontrados não foram suficientes para levantar alguma possível hipótese de relacionamento ou ancestralidade. CHIACHIO, Márcio Cesar Resultados 47 Tabela 5. Sumário das características das sequências e das estatísticas da árvore de Máxima Parcimônia inferidas para a investigação das relações filogenéticas baseadas na matriz combinada formada por genes mitocondriais de Hypoptopomatinae, Neoplecostominae e Delturinae. Característica Análise Combinada 16S rRNA + COI Número de Táxons Analisados 60 Características das Sequências Tamanho das sequências (faixa) 1136-1473 Tamanho do alinhamento 1522 Sítios constantes 859 Sítios variáveis 148 Sítios informativos para parcimônia 515 Estatísticas da Árvore Número de árvores mais parcimoniosas 4 Número de passos (Tree length) 3132 Índice de Consistência (IC) 0.3282 Índice de Homoplasia (HI) 0.6718 Índice de Retenção (IR) 0.6546 Índice de Consistência Rescalonado (RC) 0.2148 CHIACHIO, Márcio Cesar Figura 10. Árvore consenso por maioria derivada a partir da análise de Máxima Parcimônia e análise bayesiana inferida para as es em sequências parciais dos genes 16S rRNA e Citocromo Oxidase I. Os valores acima dos ramos representam os valores de bootstrap (1.000 réplicas) para a análise de Máxima Parcimônia e o núm abaixo as probabilidades posteriores (Inferência Bayesiana), que também servem de suporte aos clados. Seta mostra a relação de Árvore consenso por maioria derivada a partir da análise de Máxima Parcimônia e análise bayesiana inferida para as espécies das subfamílias Hypoptopomatinae e Neoplecostominae com base em sequências parciais dos genes 16S rRNA e Citocromo Oxidase I. Os valores acima dos ramos representam os valores de bootstrap (1.000 réplicas) para a análise de Máxima Parcimônia e o núm abaixo as probabilidades posteriores (Inferência Bayesiana), que também servem de suporte aos clados. Seta mostra a relação de Pseudotocinclus com Pareiorhina. Resultados 48 Árvore consenso por maioria derivada a partir da análise de Máxima Parcimônia e análise pécies das subfamílias Hypoptopomatinae e Neoplecostominae co