UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO LEILA MIGUEL STAVALE CARIÓTIPO, COMPORTAMENTO DOS CROMOSSOMOS NA MEIOSE E REGIÃO ORGANIZADORA DE NUCLÉOLO DE ARANHAS PERTENCENTES ÀS FAMÍLIAS OXYOPIDAE E THERIDIIDAE (ARANEOMORPHAE, ENTELEGYNAE) Rio Claro 2009 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NOTURNO LEILA MIGUEL STAVALE CARIÓTIPO, COMPORTAMENTO DOS CROMOSSOMOS NA MEIOSE E REGIÃO ORGANIZADORA DE NUCLÉOLO DE ARANHAS PERTENCENTES ÀS FAMÍLIAS OXYOPIDAE E THERIDIIDAE (ARANEOMORPHAE, ENTELEGYNAE) Orientador: Marielle Cristina Schneider Co-orientador: Doralice Maria Cella Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel e Licenciado em Ciências Biológicas. Rio Claro 2009 Stavale, Leila Miguel Cariótipo, comportamento dos cromossomos na meiose e região organizadora de nucléolo de aranhas pertencentes às famílias Oxyopidae e Theridiidae (Araneomorphae, Entelegynae) / Leila Miguel Stavale. - Rio Claro : [s.n.], 2009 59 f. : il., figs. Trabalho de conclusão de curso (Licenciatura e Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Marielle Cristina Schneider Co-Orientador: Doralice Maria Cella 1. Aracnídeos. 2. Citogenética. 3. Evolução. 4. Número diplóide. 5. Quiasma. 6. Sistema cromossômico sexual. I. Título. 595.44 S798c Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP Dedico este trabalho aos meus pais, Márcia de Lourdes Miguel Stávale e Maurício Stávale, pelo amor e apoio incondicionais. AGRADECIMENTOS A Deus, por tudo que tem me proporcionado. Aos meus pais, pelo amor, dedicação e apoio em todos os momentos. À minha família, pelo incentivo e carinho constantes. Às minhas orientadoras, Marielle Cristina Schneider e Doralice Maria Cella, pelos ensinamentos, dedicação, paciência e confiança que depositaram em mim. Aos meus amigos, Hellen Maria Soares, Cynthia Renata de Oliveira Jacob e Wagner Paschoal de Andrade Antonio, pela amizade, ajuda e risadas. Sentirei falta de encontrá-los todos os dias e das longas conversas. Às minhas amigas de República, Jéssica, Amanda(s), Marcinha e Keila, que se tornaram irmãs para mim e por terem feito esses os melhores anos de minha vida. Aos meus amigos de laboratório, Emygdio de Paula Neto, Milena de Julio e André M. Giroti, pela amizade e auxílio durante minha Iniciação Científica. Ao meu namorado Rodrigo Luiz Mazzali Gallo, pelas palavras carinhosas e por estar ao meu lado em todos os momentos. A todos os colegas do curso de Ciências Biológicas Noturno 2005, por terem contribuído de alguma forma para meu crescimento pessoal e profissional. A todos os professores que ofereceram oportunidades para eu conquistar meu objetivo de ser bióloga. À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pela concessão da bolsa de Iniciação Científica. “A história da Terra está gravada em sua crosta, mas a história de todos os organismos está escrita em seus cromossomos.” KIHARA, 1975. SUMÁRIO Página 1. RESUMO ............................................................................................................... 6 2. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................... 8 2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARANEAE ......................................................... 8 2.2. INFORMAÇÕES CITOGENÉTICAS EM ARANEAE ...................................................... 9 3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS ............................................................................ 12 4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 13 4.1. MATERIAL ........................................................................................................... 13 4.2. MÉTODOS ........................................................................................................... 13 4.2.1. Obtenção das preparações cromossômicas ........................................... 13 4.2.2. Coloração convencional (Giemsa) .......................................................... 14 4.2.3. Impregnação pelo íon prata .................................................................... 15 4.2.4. Coloração seqüencial .............................................................................. 15 4.2.5. Análises cromossômicas ......................................................................... 15 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 16 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 53 6 1. RESUMO No presente trabalho, seis espécies de aranhas pertencentes às famílias Oxyopidae e Theridiidae foram examinadas citogeneticamente, através de técnicas de coloração convencional e impregnação pelo íon prata. A análise de células mitóticas e meióticas coradas com Giemsa de quatro espécies de Oxyopidae, Hamataliwa sp., Peucetia flava, Peucetia rubrolineata e Oxyopes salticus revelou informações citogenéticas inéditas para a família. Metáfases espermatogoniais de Hamataliwa sp. mostraram o cariótipo 2n=26+X1X2, o qual corresponde ao maior número diplóide já descrito para a família. Células mitóticas de P. flava e P. rubrolineata exibiram 2n♂=20+X1X2 e 2n♂=20+X, respectivamente, indicando a ocorrência de uma variabilidade cariotípica dentro desse gênero. Os cromossomos dessas três espécies apresentaram morfologia acro/telocêntrica. Os resultados obtidos em O. salticus foram surpreendentes, pois revelaram 2n♂=10+X, o menor número cromossômico encontrado para Oxyopidae e o segundo menor registrado para aranhas do grupo Entelegynae, bem como morfologia meta/submetacêntrica da maioria dos cromossomos. Além disso, um indivíduo da amostra de O. salticus examinada apresentou um heteromorfismo nos elementos que constituem o primeiro par do cariótipo e um cromossomo B em algumas células. Em Hamataliwa sp. e O. salticus, as regiões organizadoras de nucléolo estavam localizadas sobre dois e três pares autossômicos, respectivamente. Em relação às duas espécies de Theridiidae, Argyrodes elevatus apresentou um cariótipo totalmente discrepante, quando comparado com aqueles já descritos para a família, uma vez que mostrou o número diplóide 2n♂=21, sistema cromossômico sexual do tipo X/XX e morfologia cromossômica meta/submetacêntrica. No entanto, as características cariotípicas verificadas na maioria dos exemplares de Nesticodes rufipes foram semelhantes aquelas mais freqüentes em aranhas Theridiidae, ou seja, número diplóide 2n♂=22, 7 incluindo o sistema cromossômico sexual do tipo X1X2/X1X1X2X2 e cromossomos com morfologia subtelo/acrocêntrica. Além disso, um exemplar macho apresentou 2n♂=24, devido a presença de um par adicional de cromossomos autossômicos, o qual exibiu um comportamento regular durante a meiose. Células mitóticas impregnadas pelo íon prata revelaram RONs sobre a região terminal do braço curto dos pares 2, 3 e 4 em A. elevatus e região terminal do braço longo do par 4 em N. rufipes. Através dos resultados obtidos no presente estudo, dos dados citogenéticos existentes na literatura e das hipóteses filogenéticas propostas para aranhas Oxyopidae e Theridiidae foi possível traçar os principais mecanismos de evolução cromossômica que tem ocorrido em espécies dessas duas famílias. Palavras-chave: citogenética, evolução, número diplóide, quiasma, sistema cromossômico sexual 8 2. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARANEAE A ordem Araneae é o segundo táxon mais diversificado da classe Arachnida, incluindo 40.998 espécies (Platnick, 2009). No entanto, estimativas recentes indicam que apenas um terço do total de espécies de aranhas existentes é conhecido atualmente (Brescovit, 1999). As aranhas estão divididas em três grandes grupos monofiléticos, Mesothelae, Mygalomorphae e Araneomorphae (Coddington e Levi, 1991). De acordo com caracteres morfológicos, a subordem Mesothelae ocupa uma posição basal na ordem Araneae (Coddington e Levi, 1991). Essa subordem é constituída por somente 87 espécies pertencentes a uma única família, Liphistiidae, e apresenta uma distribuição restrita às regiões Oriental e Paleártica (Coddington e Levi, 1991; Platnick, 2009). A subordem Opisthothelae engloba as duas infra-ordens Mygalomorphae e Araneomorphae, as quais formam um grupo-irmão. As Mygalomorphae, aranhas conhecidas popularmente como caranguejeiras ou tarântulas, possuem aproximadamente 1.400 espécies, distribuídas nas regiões Australiana, Neotropical e Paleotropical. As Araneomorphae, freqüentemente denominadas de aranhas-verdadeiras, incluem 90% das espécies descritas e ocorrem em quase todas as regiões biogeográficas (Coddington e Levi, 1991; Brescovit, 1999; Platnick, 2009). A grande maioria dos representantes dessa última infra-ordem está subdividida nos clados Haplogynae e Entelegynae. As haploginas são Araneomorphae basais e estão representadas por 2.665 espécies, enquanto as enteleginas, o grupo mais derivado, retém o maior número de aranhas conhecidas, cerca de 38.300 espécies pertencentes a 73 famílias (Coddington e Levi, 1991; Platnick, 2009). 9 2.2. INFORMAÇÕES CITOGENÉTICAS EM ARANEAE Citogeneticamente, 644 espécies de aranhas foram analisadas (Araújo, 2007, Araújo et al., 2008; Král, 2007; Oliveira et al., 2007; Rodriguez-Gil et al., 2007); porém, esse número ainda é pequeno e corresponde a menos que 2% das espécies descritas sob o ponto de vista taxonômico. As informações cariotípicas revelam que em Araneae, o número diplóide é bastante diversificado, variando entre 2n♂=7 a 2n♂=96 (Suzuki, 1952, 1954). No entanto, o sistema cromossômico sexual do tipo X1X2 nos machos é o mais freqüente, ocorrendo em 77% das espécies examinadas até o presente momento (Araújo et al., 2005), e a morfologia acrocêntrica dos cromossomos é predominante (Rowell, 1990). O maior número cromossômico já descrito para uma aranha, 2n♂=96, foi para um representante da subordem basal Mesothelae. Adicionalmente, o sistema cromossômico sexual X1X2 foi registrado neste grupo (Suzuki, 1954). Considerando essas características, a evolução cariotípica das aranhas parece ter ocorrido através da redução do número diplóide, manutenção do sistema cromossômico sexual X1X2 ou alteração para outros sistemas do tipo simples, como o XY e X, ou do tipo múltiplo, como o X1X2X3 e X1X2X3X4 (Suzuki, 1954; Král et al., 2006; Král, 2007). Cromossomos com morfologia meta/submetacêntrica são comumente encontrados em clados basais da ordem Araneae e ocorrem em espécies de Mygalomorphae (Řezáč et al., 2006), o que indica que este pode ser um caráter ancestral do cariótipo das aranhas (Král et al., 2006). Entelegynae é o grupo mais amplamente estudado com relação às características cromossômicas, visto que existem dados de 578 espécies incluídas em 37 famílias diferentes (Araújo, 2007). Nas enteleginas, o número diplóide mais baixo, 2n♂=10, foi descrito para um representante da família Uloboridae (Parida e Sharma, 1987), enquanto que o mais alto, 2n♂=52, foi registrado para uma espécie de Agelenidae (Wallace, 1909). Embora ocorra essa variação do número cromossômico, Král et al. (2006) sugeriram que o cariótipo 2n♂=42=40+X1X2, com cromossomos acrocêntricos, poderia ser representativo de um estado ancestral para as aranhas enteleginas. Essa hipótese foi baseada no fato que a fórmula cariotípica acima mencionada está presente em diversas famílias não relacionadas de Entelegynae bem como em clados basais desse grupo. No entanto, análises 10 citogenéticas adicionais, utilizando técnicas de coloração cromossômica convencional e diferencial, precisam ser realizadas nas enteleginas para confirmar essa hipótese e entender os processos de evolução cromossômica que têm ocorrido em cada família. Dentro de Entelegynae encontram-se as famílias Oxyopidae e Theridiidae, as quais são derivadas e pertencem às superfamílias Lycosoidea e Araneoidea, respectivamente (Coddington e Levi, 1991). Lycosoidea possui 149 espécies das famílias Ctenidae, Lycosidae, Miturgidae, Oxyopidae, Pisauridae, Psechridae e Zoridae examinadas citogeneticamente (Araújo, 2007). Em representantes de todas essas sete famílias, com exceção de Oxyopidae, o cariótipo 2n♂=28=26+X1X2, com cromossomos acrocêntricos, é prevalecente. Em contraste, na família Oxyopidae, o número diplóide 2n♂=21 e o sistema cromossômico sexual do tipo X foram observados na maioria das espécies. Porém, outras fórmulas cariotípicas também ocorrem nesse táxon como, por exemplo, 2n♂=22=20+X1X2 em Oxyopes salticus, 2n♂=23=22+X em Oxyopes javanus e Oxyopes macilentus, e 2n♂=28=26+X1X2 em Peucetia viridiana. Com relação à morfologia cromossômica, somente 11 espécies foram caracterizadas, as quais mostraram cromossomos principalmente do tipo acro/telocêntricos (Araújo, 2007). A superfamília Araneoidea é um dos grupos mais conhecidos citogeneticamente, com dados de 185 espécies distribuídas nas famílias Araneidae, Linyphiidae, Nephilidae, Nesticidae, Theridiidae e Tetragnathidae (Araújo, 2007). Nas espécies dessa superfamília, a fórmula cariotípica 2n♂=24=22+X1X2 é bastante conservada, sendo predominante em todas as famílias, exceto em Theridiidae. As informações citogenéticas existentes para Theridiidae mostraram que o cariótipo 2n♂=22=20+X1X2 é compartilhado por 23 espécies dentre as 29 já analisadas, ocorrendo em 11 gêneros diferentes, com exceção de Chrysso e Latrodectus (Araújo, 2007). Os quatro representantes de Latrodectus estudados revelaram uma grande diversidade cariotípica, com número diplóide variando entre 2n♂=16 a 2n♂=28, os quais representam, respectivamente, os mais baixos e altos números cromossômicos verificados para a família. De modo similar ao que ocorre em outras 11 aranhas Entelegynae, todas as 16 espécies de Theridiidae, cujos cromossomos foram classificados, exibiram invariavelmente morfologia acro/telocêntrica. Os cromossomos de todas as espécies das famílias Oxyopidae e Theridiidae foram analisados principalmente com técnicas de coloração convencional, existindo um único relato sobre a ocorrência de região organizadora de nucléolo (RON) sobre um par autossômico em uma espécie de Oxyopidae (Barrion et al., 1989). A identificação das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) é de grande importância para comparações cariotípicas de espécies relacionadas e em estudos evolutivos (Petitpierre, 1996). Adicionalmente, a determinação do número e localização das RONs constitui um critério adicional na caracterização cromossômica das espécies, pois essas regiões estão sempre presentes nos cromossomos e podem apresentar um padrão de distribuição conservado evolutivamente para um determinado grupo de espécies. Alterações na distribuição das RONs podem ser indicativas de ocorrência de rearranjos cromossômicos e fornecer dados sobre os processos de diferenciação cariotípica entre espécies relacionadas (Oliveira, 2004). Em algumas poucas espécies de aranhas cujo padrão de RON foi estabelecido, aproximadamente 15, verifica-se que essa região pode estar localizada sobre os cromossomos sexuais e autossomos em representantes de Haplogynae e em pares autossômicos de Entelegynae (Wise, 1983; Král et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Rodriguez-Gil et al., 2007; Araújo et al., 2008). 12 3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em espécies das famílias Oxyopidae e Theridiidae, cujos cromossomos foram predominantemente investigados com técnicas de coloração convencional, o fato de apenas 5% das aranhas Oxyopidae e 1.5% dos representantes de Theridiidae terem sido analisados sob o ponto de vista citogenético e de não existirem registros cariotípicos para representantes da fauna brasileira, o presente estudo tem como objetivos caracterizar citogeneticamente seis espécies de aranhas Oxyopidae e Theridiidae, visando traçar os principais mecanismos de evolução cariotípica. Para tal, foi determinado: - o número e a morfologia dos cromossomos, o tipo de sistema cromossômico sexual, e o comportamento dos cromossomos durante a meiose quanto à heteropicnose, número e localização de quiasmas, configuração dos cromossomos sexuais e segregação anafásica; - o padrão de distribuição das RONs. 13 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. MATERIAL Neste trabalho, uma amostra de 85 indivíduos da fauna brasileira foi analisada, sendo 27 exemplares pertencentes à família Oxyopidae e 58 à família Theridiidae (Tabela 1). Os espécimes foram identificados taxonomicamente pelo Dr. Antonio Domingos Brescovit, do Laboratório de Artrópodes, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil. Tabela 1 – Espécies das famílias Oxyopidae e Theridiidae, com seus respectivos número de exemplares analisados neste trabalho e locais de coleta. Espécies Adultos Embriões Procedência Oxyopidae Hamataliwa sp 2♂ e 1♀ ----- Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP Peucetia flava 1♂ e 3♀ ----- Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP Peucetia rubrolineata 9♂ ----- Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP Oxyopes salticus 7♂ e 4♀ ----- Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP Theridiidae Argyrodes elevatus 13♂ 12♂ e 11♀ Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP e Tupã (21º56’S, 50º30’W), SP Nesticodes rufipes 6♂ e 7♀ 6♂ e 3♀ Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), SP e Viçosa (20º45'S 42º52'W), MG 4.2. MÉTODOS 4.2.1. Obtenção das preparações cromossômicas As preparações citológicas, para o estudo dos cromossomos mitóticos e meióticos, foram obtidas de testículos e/ou ovários de indivíduos adultos, conforme descrito abaixo: a) dissecar o animal em solução fisiológica para insetos (128.3 mM de NaCl, 16.7 mM de Na2HPO4, 19.9 mM de KH2PO4), retirar as gônadas e transferi-las para 14 um recipiente contendo colchicina 0.16% (em solução fisiológica para insetos), deixando por duas horas; b) acrescentar um volume de água de torneira igual ao de colchicina e deixar por 15 minutos; c) adicionar 10 gotas de fixador Carnoy I (metanol e ácido acético – 3:1) e deixar por 1 minuto; d) transferir as gônadas para um recipiente contendo fixador Carnoy I e deixar por 30 minutos, no mínimo; e) macerar, sobre uma lâmina, uma das gônadas, juntamente com uma gota de ácido acético 45%; f) secar a lâmina em uma placa de metal à temperatura de 35 a 40ºC. Alternativamente, algumas preparações cromossômicas foram obtidas a partir de células embrionárias, de acordo com a técnica descrita a seguir: a) dissecar o ovo em solução fisiológica para insetos, remover o embrião e transferi-lo para uma placa escavada contendo colchicina 0.05% (em solução fisiológica para insetos), deixando por 2 horas; b) adicionar um volume de água de torneira igual ao volume de colchicina e deixar durante 15 minutos; c) remover cuidadosamente toda a solução (colchicina e água de torneira) e fixar o material em Carnoy I por 1 minuto. Esse processo de fixação deve ser repetido por três vezes, sendo que na última fixação o embrião deve ser mantido por 30 minutos, no mínimo; d) transferir o embrião para uma lâmina e macerá-lo, com o auxílio de um bastão de metal, em algumas gotas de ácido acético 60%; e) secar a lâmina em uma placa de metal, à temperatura de 35 a 40ºC. 4.2.2. Coloração convencional (Giemsa) a) corar a lâmina com solução de Giemsa a 3% (47mL de água destilada, 1.5mL de solução comercial de Giemsa e 1.5mL de tampão fosfato pH 6.8) durante 15 minutos; b) lavar a lâmina em água destilada e secá-la ao ar. 15 4.2.3. Impregnação pelo íon prata para detecção das RONs, segundo Howell e Black (1980) a) colocar sobre a lâmina uma gota de solução coloidal reveladora (1g de gelatina Merck dissolvida em 50 mL de água destilada + 0.5 mL de ácido fórmico) duas gotas de solução de nitrato de prata 50% e cobrir com lamínula; b) incubar a lâmina em câmara úmida, durante 3-5 minutos, à temperatura de 67ºC; c) remover a lamínula com um jato de água destilada, lavar a lâmina e secar ao ar. 4.2.4. Coloração seqüencial Algumas preparações cromossômicas foram analisadas com coloração seqüencial, a qual consiste em submeter os cromossomos à técnica de coloração convencional e posteriormente, à técnica de impregnação pelo íon prata. 4.2.3. Análises cromossômicas As análises dos cromossomos foram realizadas em microscopia de luz. As células mitóticas e meióticas foram capturadas em um fotomicroscópio Olympus BX51, com objetiva 100x de imersão, optovar 1.6, utilizando o software DP Controller. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964). 16 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos através da análise citogenética de quatro espécies de Oxyopidae e duas de Theridiidae são apresentados na forma de dois artigos científicos. 17 Chromossomal characteristics and karyotype evolution of Oxyopidae spiders (Araneae, Entelegynae) Leila Miguel Stavale1, Marielle Cristina Schneider1, Antonio Domingos Brescovit2, Doralice Maria Cella1 1 Departamento de Biologia, UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brazil 2 Laboratório de Artrópodes, Instituto Butantan, São Paulo, São Paulo, Brazil Key words: Hamataliwa, Peucetia flava, Peucetia rubrolineata, Oxyopes salticus, meiosis, nucleolar organizing region, sex chromosome system 18 Introduction The spiders constitute one of the most diverse orders of animals and are certainly the most abundant terrestrial predators (Coddington & Levi 1991). Cytogenetically, only about 1.5% (Král et al. 2006) among the 40.998 species belonging to the order Araneae (Platnick 2009) were analyzed, which showed a wide diversity of diploid chromosome number, ranging from 2n♂=7 to 2n♂=96, and types of sex chromosome system, e.g., XY, X, X1X2, X1X2Y, X1X2X3, X1X2X3X4 (Araújo 2007). In species of the monophyletic basal groups, the highest chromosome numbers were verified, such as 2n♂=96 in Mesothelae and 2n♂=86 in Mygalomorphae (Suzuki 1954; Srivastava & Shukla 1986). Among the derivative groups included in the infraorder Araneomorphae, the spiders of the Haplogynae lineage present a predominance of low diploid chromosome numbers that vary between 2n♂=7 and 2n♂=37, sex chromosome system of the X type, and meta/submetacentric chromosomes. These features contrast with those of the sister- group Entelegynae that possesses the highest number of species taxonomically described and cytogenetically investigated (Araújo 2007; Platnick 2009). In entelegyne spiders there is conservation of the diploid number 2n♂=42, sex chromosome system of the X1X2 type, and chromosomes with acro/telocentric morphology (Araújo et al. 2005; Král et al. 2006). After comparing the karyotype characteristics of basal and derived Araneae species, Suzuki (1954) proposed that chromosomal evolution in this order has occurred through reduction in the chromosome number. Later, Rowell (1990) suggested that in spiders there is a peculiar form of karyotype evolution via "all or nothing" fusions. This proposition was based on the fact that intermediate karyotypes that include both acro/telocentric chromosomes and meta/submetacentric fused chromosomes are rarely encountered in this group. Recently, Král et al. (2006) verified that certain related species of entelegyne differ with regard the diploid number but no in relation to chromosome morphology that is maintained as acro/telocentric. Thus, the authors attributed the reduction in the chromosome number in these spiders to tandem fusions. Within Entelegynae lineage, the family Oxyopidae is very interesting because of its predominance of the 2n♂=22+X. This karyotype includes a diploid chromosome 19 number that is relatively lower when compared with those of other families of this group and a sex chromosome system that was observed in only 12% of the entelegyne spiders. The chromosome morphology, however, described for the 11 species among a total of 21 studied is conserved as acro/telocentric (Table 1). Oxyopidae belongs to the group of spiders known as true lycosoids, whose monophyly is well-supported by morphological and molecular characters (Silva Davila 2003). The families that constitute this group form the clade (((Psechridae (Oxyopidae + Senoculidae)) + ((Trechaleidae (Lycosidae + Pisauridae))). In order to increase the knowledge about the chromosomal characteristics and understand the processes of karyotype evolution of Oxyopidae, four species belonging to three different genera were cytogenetically analyzed with standard staining and silver impregnation. It is worth emphasizing that this is the first chromosome record of oxyopids from Brazilian fauna. 20 T ab le 1 – O xy op id ae s pe ci es c yt og en et ic al ly a na ly ze d. A =a cr oc en tr ic ; M =m et ac en tr ic ; S M =s ub m et ac en tr ic ; T =t el oc en tr ic ; H =h ol oc en tr ic S p ec ie s C h ro m o so m al fo rm u la ( 2n m al es ) C h ro m o so m al m o rp h o lo g y C o lle ct io n lo ca lit y R ef er en ce H am at al iw a sp . 28 =2 6+ X 1X 2 26 T +X 1X 2T B ra zi l P re se n t w o rk N is hi na g en er os a K om at su ( no ne m n ud um ) 21 =2 0+ X 20 A +X A Ja pa n S uz uk i ( 19 52 ) O xy op es h in do st an ic us P oc oc k, 1 90 1 21 =2 0+ X 20 A +X A In di a B ol e- G ow da ( 19 50 ), M itt al ( 19 61 , 1 97 0) O xy op es ja va nu s T ho re ll, 1 88 7 23 =2 2+ X 22 H +X H P hi lip pi ne s B ar rio n et a l. (1 98 9) O xy op es le pi du s (B la ck w al l, 18 64 ) un de r O xy op es s im ila ris 21 =2 0+ X 20 A +X A In di a B ol e- G ow da ( 19 58 ) O xy op es m ac ile nt us L . K oc h, 1 87 8 21 =2 0+ X 23 =2 2+ X 20 T +X T 22 T +X T T ai w an C he n (1 99 9) O xy op es p an da e T ik ad er , 1 96 9 21 =2 0+ X -- -- - In di a S riv as ta va & S hu kl a (1 98 6) O xy op es r am os us ( M ar tin i & G oe ze , 1 77 8) 21 =2 0+ X 20 A +X M F in la nd H ac km an ( 19 48 ) O xy op es r at na e T ik ad er , 1 97 0 21 =2 0+ X 20 T +X T In di a D at ta & C ha tte rje e (1 98 3, 1 98 9) , P ar id a & S ha rm a (1 98 7) , S ha rm a & P ar id a (1 98 7) O xy op es r uf is te rn is P oc oc k, 1 90 1 21 =2 0+ X 20 A +X A In di a M itt al ( 19 61 , 1 97 0) O xy op es r yv es i P oc oc k, 1 90 1 21 =2 0+ X -- -- - In di a S ha rm a et a l. (1 96 0) O xy op es s al tic us H en tz , 1 84 5 22 =2 0+ X 1X 2 -- -- - -- -- - P ai nt er ( 19 14 ) O xy o p es s al ti cu s H en tz , 1 84 5 11 =1 0+ X 12 =1 1+ X / 13 =1 1+ X +B 6M +2 S M +2 A +X S M 5M +2 S M +4 A +X S M / 5M +2 S M +4 A +X S M +B S M B ra zi l P re se n t w o rk O xy op es s ca la ris H en tz , 1 84 5 21 =2 0+ X -- -- - U ni te d S ta te s T ug m on e t a l. (1 99 0) O xy op es s er ta tu s L. K oc k, 1 87 7 21 =2 0+ X 20 A /T +X A /T Ja pa n, T ai w an S uz uk i ( 19 50 , 1 95 2) , I ga ra sh i & K on do ( 19 77 ), C he n (1 99 9) O xy op es s hw et a T ik ad er , 1 97 0 21 =2 0+ X -- -- - In di a P ar id a & S ha rm a (1 98 7) , S ha rm a & P ar id a (1 98 7) O xy op es s us hi la e T ik ad er , 1 96 5 21 =2 0+ X -- -- - In di a S riv as ta va & S hu kl a (1 98 6) O xy op es s p 21 =2 0+ X -- -- - In di a S ha rm a et a l. (1 96 0) O xy op es s p. 22 =2 0+ X 1X 2 -- -- - In di a M itt al ( 19 61 ) O xy op es s p. 22 =2 0+ X 1X 2 20 A +X 1X 2A In di a M itt al ( 19 70 ) O xy op es s p. 21 =2 0+ X -- -- - In di a S riv as ta va & S hu kl a (1 98 6) O xy op es s p. 21 =2 0+ X -- -- - In di a S riv as ta va & S hu kl a (1 98 6) P eu ce ti a fl av a K ey se rl in g , 1 87 7 22 =2 0+ X 1X 2 20 T +X 1X 2T B ra zi l P re se n t w o rk P eu ce ti a ru b ro lin ea ta K ey se rl in g , 1 87 7 21 =2 0+ X 20 T +X T B ra zi l P re se n t w o rk P eu ce tia v iri da na ( S to lic zk a, 1 86 9) 28 =2 6+ X 1X 2 26 A +X 1X 2A In di a B ol e- G ow da ( 19 50 ), P ar id a & S ha rm a (1 98 7) , S ha rm a & P ar id a (1 98 7) 21 Materials and Methods In this work, a sample of 27 individuals was analyzed, which included: two males and one female of Hamataliwa sp., one male and three females of Peucetia flava Keyserling, 1877, nine males of Peucetia rubrolineata Keyserling, 1877, and seven males and four females of Oxyopes salticus Hentz, 1845. All individuals were collected in Rio Claro (22º24'S, 47º33'W), state of São Paulo (SP), Brazil. The voucher specimens were deposited in the Laboratório de Artrópodes, Instituto Butantan (IBSP), São Paulo, SP, Brazil. The chromosomal preparations were obtained according to the procedure by Araujo et al. (2008). Chromosome spreads were stained with Giemsa solution (3% of commercial Giemsa and 3% of phosphate buffer, pH 6.8, in distilled water) for 15 min and subsequently silver-impregnated (Howell & Black 1980) to detect the nucleolar organizer regions (NORs). Mitotic and meiotic nuclei records were performed using an Olympus BX51 microscope. The morphology of the chromosomes was determined according to the nomenclature proposed by Levan et al. (1964). Results Mitotic metaphase cells of Hamataliwa sp. stained with Giemsa showed the diploid numbers 2n=28 for males and 2n=30 for female, consistent with a X1X2/X1X1X2X2 sex chromosome system (Figure 1A). All chromosomes revealed acro/telocentric morphology and decreased gradually in size. The sex chromosomes presented a high degree of condensation; the X1 sex chromosome was slightly larger than the X2 chromosome, but both chromosomes possessed medium size. Early prophase I cells of male Hamataliwa sp. revealed two blocks highly condensed and positively heteropycnotic, which were interpreted as sex chromosomes (Figure 1B). Diplotene and diakinesis nuclei showed 13II+X1X2 (Figure 1C-D), confirming the diploid number and type of sex chromosome system established through analyses of mitotic cells. In these meiosis-phases, the autosomal bivalents showed one interstitial or terminal chiasma and the X1 and X2 chromosomes always appeared as univalents and arranged side by side. In metaphase II cells, the haploid sets with n=13+X1X2 and n=13 chromosomes were observed (Figure 1E-F). All chromosome preparations 22 of Hamataliwa sp. were subjected to silver impregnation but only diplotene and diakinesis nuclei revealed NORs, which were located on the terminal region of one medium-sized bivalent and interstitial region of one small–sized bivalent (Figure 1G- H). Giemsa-stained spermatogonial metaphases of P. flava and P. rubrolineata demonstrated the diploid chromosome numbers 2n=22 and 2n=21, respectively. The former species presented a sex chromosome system of the X1X2 type while the latter showed a system of the X type (Figure 2A-B). The karyotypes of both species were composed of acro/telocentric chromosomes that gradually varied in size and sex chromosomes with similar size to smallest elements of the diploid complement. In pachytene cells of P. flava and P. rubrolineata, the autosomal bivalents were fully synapsed and the sex chromosomes appeared as highly condensed and positively heteropycnotic univalents (Figure 2C and G). In diplotene and diakinesis nuclei, the meiotic formula 10II+X1X2 for P. flava and 10II+X for P. rubrolineata was observed (Figure 2D, E, H and I). In both species, all autosomal bivalents showed one interstitial or terminal chiasma, with the exception of some cells of P. flava that presented one bivalent with two terminal and/or interstitial chiasmata. Metaphase II cells exhibited n=10+X1X2 and n=10 in P. flava (Figure 2F) and n=10+X and n=10 in P. rubrolineata (Figure 2J), confirming the regular segregation of all chromosomes during preceding anaphase. Although the chromosome preparations of the two Peucetia species have been silver-impregnated, the presence of an argentophilic material corresponding to the NORs was not verified in the sample of cells examined. Mitotic metaphase cells of six males O. salticus after standard stained with Giemsa showed the diploid number 2n=11, sex chromosome system of the X type, and chromosomes with metacentric (pairs 1, 3 and 4), submetacentric (pair 2 and X chromosome) and acro/telocentric (pair 5) morphology (Figure 3A). In relation to the size, the chromosomes could be classified in large (pair 1), medium (pairs 2-4 and X chromosome) and small (pair 5). Spermatogonial cells of one individual of the sample examined of O. salticus showed discrepant characteristics to those above mentioned (Figure 3B), i.e., the karyotype was composed of 2n=12 chromosomes, including three heteromorphic chromosomes (one metacentric of large size and two acro/telocentric of different sizes), four pairs of homomorphic chromosomes that 23 correspond to pairs 2 to 5, and one submetacentric element identified as X sex chromosome. The three unpaired autosomes represented the heterozygous condition for the centric fusion between the chromosomes that originated the largest pair of the diploid complement. Moreover, in some cells of this specimen with 2n=12, the presence of one extra chromosome possessing submetacentric morphology and extremely small size was detected (Figure 3C). This element was interpreted as B chromosome. Thus, the spermatogonial cells of this individual exhibited 2n=12=11+X or 2n=13=11+X+B. Description of male meiosis of O. salticus was only based on the individuals that presented 2n=11 chromosomes. Pachytene nuclei exhibited 10 double filaments and one positively heteropycnotic block that was representative of the X chromosome (Figure 3D). Diplotene cells revealed the meiotic formula 5II+X. Most autosomal bivalents presented a variable number of interstitial and/or terminal chiasmata from two to four, except the smallest bivalent that invariably showed one interstitial or terminal chiasma (Figure 3E). During the prophase I, the X sex chromosome was easily identified due to its high degree of condensation in relation to the autosomes. Metaphase II spermatocytes showed two different haploid numbers n=5+X and n=5 (Figure 3F-G). Silver-impregnated spermatogonial metaphases revealed six NORs on the long arm terminal region of pairs 2 and 5 and short arm terminal region of pair 3. However, only up to four NORs per cell were active (Figure 3H-K). 24 Figure 1 - Testicular cells of Hamataliwa sp. Giemsa-stained (A-G) and silver-impregnated (H). A. Mitotic metaphase with 2n=26+X1X2 and telocentric chromosomes. B. Pachytene, showing positively heteropycnotic sex chromosomes. C-D. Diplotene and diakinesis, exhibiting one interstitial (large arrow) or terminal (small arrow) chiasma per bivalent. E-F. Metaphase II nuclei with n=13+X1X2 and n=13, respectively. G. Diakinesis. H. The same cell as in G, revealing NORs (arrowhead) on terminal and interstitial regions of two bivalents. In detail, bivalents with one terminal and interstitial NORs. Scale=10µm. 25 Figure 2 - Testicular cells of Peucetia flava (A, C-F) and Peucetia rubrolineata (B, G-J) stained with Giemsa. A and B. Karyotypes, showing 2n=20+X1X2 and 2n=20+X, respectively. Note the telocentric morphology of all chromosomes. C and G. Pachytene with completely synapsed autosomal bivalents and highly condensed and stained sex chromosomes. D and H. Diplotene. E and I. Diakinesis. Large arrows point to interstitial chiasma and small arrows indicate terminal chiasma. F and J. Two cells in late metaphase II whose sister-chromatids are separated. Scale=10µm. 26 Figure 3 - Testicular cells of Oxyopes salticus after staining with Giemsa (A-H, J) and silver impregnation (I and K). A. Karyotype with 2n=10+X and metacentric, submetacentric, and acrocentric chromosomes. B. Karyotype with 2n=11+X. Note the heterozygous condition for the centric fusion between chromosomes that constitute the pair 1. In detail, the heteromorphic pair 1. C. Mitotic metaphase, 2n=11+X+B, revealing the presence of one B chromosome. In detail, the submetacentric B chromosome. D. Pachytene. E. Diplotene, 2n=5II+X, showing autosomal bivalents with interstitial (large arrow) and/or terminal (small arrow) chiasmata. In details, bivalents with three and four chiasmata. F-G. Metaphase II cells with n=5+X and n=5, respectively. H. Mitotic metaphase, 2n=10+X. I. The same cells as in H, revealing NORs (arrowhead) on the terminal region of pairs 2, 3 and 5. J. Incomplete mitotic metaphase with 2n=10. K. The same cells as in J, exhibiting NORs (arrowhead) on the terminal region of pairs 2 and 3. Scale=10µm. 27 Discussion The family Oxyopidae possesses 425 species subdivided into nine genera (Platnick 2009). Until now, a total of 21 species of the genera Nishina, Oxyopes, and Peucetia were cytogenetically investigated. Among the four oxyopids studied here, only O. salticus have previously been examined by Painter (1914). Additionally, this is the first chromosome record for a representative of the Hamataliwa genus. The 2n♂=26+X1X2 with acro/telocentric chromosomes observed in Hamataliwa sp. was similar to the karyotype found in only one other species of this family, Peucetia viridana (Bole-Gowda 1950; Parida & Sharma 1987; Sharma & Parida 1987). It is worth pointing out that 2n♂=28 represents the highest diploid number already described for Oxyopidae. The karyotype characteristics verified in the two Peucetia species, 2n♂=20+X1X2 in P. flava and 2n♂=20+X in P. rubrolineata, as well as the karyotype registered for P. viridana, 2n♂=26+X1X2, revealed that in this genus there is a heterogeneity with regard the diploid number and type of sex chromosome system. The acro/telocentric chromosomal morphology encountered in the three species here investigated is however, similar to that predominant in Oxyopidae spiders (Table 1). In relation to the size of the chromosomes, the only data is referent to the sex chromosome of three species of the genus Oxyopes, in which the X chromosome can be the largest or smallest element of the diploid complement. This interspecific discrepancy regarding the size of the X chromosome could be related to variations in the quantity of constitutive heterochromatin and probably did not indicate independent origin of this sex chromosome. The results obtained in most individuals of the sample of O. salticus examined in the present work were surprisingly due to the occurrence of the diploid chromosome number 2n♂=11. This diploid number is the lowest already encountered in Oxyopidae and is the second lowest registered for Entelegynae spiders as a whole. The predominance of biarmed chromosomes is also very rare in entelegynes and has been verified in only 14 non-related species among a total of approximately 590 analyzed about the cytogenetic point of view (Hackman 1948; Suzuki 1951, 1954; Bole-Gowda 1952; Mittal 1966; Rowell 1985, 1988, 1990, 1991; Sharma & Parida 1987; Hong et al. 1992; Amalin et al. 1993; Tsurusaki et al. 1993; Hancock & Rowell 1995; Král 1995; Qingtao et al. 1996; Gorlova et al. 1997; Araújo 2007). In addition, 28 the chromosome characteristics of O. salticus from the Rio Claro population differed in relation to the karyotype already described for this same species, 2n♂=20+X1X2, and for other 18 species of the Oxyopes genus that showed 2n♂=22+X and 2n♂=20+X (Table 1). Within the Oxyopidae, the great diversity of diploid number and type of sex chromosome system has probably origin from the karyotype 2n♂=26+X1X2 with acro/telocentric chromosomes. This karyotype certainly constitutes the basal type for this family, considering that it occurred in Senoculidae that is sister-group to Oxyopidae and is commonly encountered in species of others families closely related to Oxyopidae, such as Trechaleidae, Lycosidae, and Pisauridae (Araújo 2007; A. M. Giroti, pers. comm. 2008). Therefore, chromosomal rearrangement of the tandem fusion type between the autosomes was the mechanism responsible for the reduction of the diploid number, and tandem fusion between the X1 and X2 chromosome give rise to X sex chromosome system. Moreover, the karyotypes observed in the individuals of O. salticus examined in this work revealed that centric fusions involving the autosomes and the sex chromosomes also occurred during the karyotype evolution of Oxyopidae spiders. Král et al. (2006) analyzed certain species of Haplogynae spiders and also proposed that the X sex chromosome system is derived from a multiple sex chromosome system. In contrast with the hypothesis formulated by us, i.e., that the X sex chromosome system arose by tandem or centric fusion between the X1 and X2 of the X1X2 system, Král et al. (2006) proposed that X system has origin of the X1X2Y system. According to the authors, the conversion of the X1X2Y into an X system was a gradual process and has the XY system as an intermediate stage. The unusual karyotype 2n♂=10+X, with a predominance of meta/submetacentric chromosomes, encountered in the sample of O. salticus here studied is certainly a derived type and evolved from 2n♂=20+X1X2 described by Painter (1914) through "all or nothing" fusions as shows the Figure 4. We suggested that karyotype of O. salticus from Rio Claro have origin by three main events: 1) centric fusion between eight autosomal pairs, producing four pairs of meta/submetacentric chromosomes; 2) centric fusion between the acro/telocentric X1 and X2 chromosomes, converting the sex chromosome system into an X system; 3) tandem fusion between one ancestral 29 autosomal pair of small size and the 1st derived autosomal pair, originating an asymmetry in the derived karyotype due to the presence of one large and one small autosomal pair. Furthermore, the sympatric occurrence of one individual of O. salticus with the karyotype 2n♂=11+X, including the heterozygous state of the centric fusion that originated the pair 1, revealed that the chromosome constitutions of O. salticus with all chromosomes in a fused state is not totally established in the population from Rio Claro. The chromosome characterization of a higher number of specimens from population of Rio Claro and other localities is very interesting to be realized and can reveal the presence of other karyotypes for this species. Surprisingly, the diploid number variability in O. salticus was not only related to the occurrence of autosomal heteromorphism but also due to the presence of B chromosome. In spiders, the description of B chromosome is extremely sporadic and was only registered for six species of the families Amaurobiidae, Clubionidae, Lycosidae, Salticidae, Theridiidae, and Thomisidae (Montgomery 1905; Painter 1914; Avillés & Maddison 1991; Rowell & Main 1992; Qingtao et al. 1996). Unfortunately, in the specimen of O. salticus carrier of the B chromosome, the meiotic cells presented a low resolution due to chromosomal superposition, making it impossible to verify the synaptic and segregational behavior of this additional chromosome. The analysis of meiotic cells of Hamataliwa sp., P. flava, P. rubrolineata, and O. salticus permitted us to confirm the diploid number, chromosomal morphology, and mainly the type sex of chromosome system established through the study of mitotic cells in the four species. Additionally, the investigation of diplotene and diakinesis nuclei showed that one chiasma per bivalent that is frequently observed in other oxyopids also occurred in Hamataliwa sp., P. flava, P. rubrolineata. In contrast, the high number of chiasmata per bivalent was verified in all large-sized bivalents of O. salticus. Similarly to this last species, the presence of more than one chiasma per bivalent was also observed in some beetles whose diploid complement seems to be evolved by fusions (Schneider et al. 2007). According to John (1990) the number of chiasma per bivalent is partially dependent of the chromosome size. In O. salticus, a clear relationship between the chromosome size and the number of chiasmata per bivalent was noticed, since the small bivalent invariably exhibited only one interstitial or terminal chiasma. 30 The information about NOR in spiders is very scarcity. Within Entelegynae the analysis of this specific chromosome region was performed only in one species of Lycosidae, Nephillidae, Oxyopidae, and three species of Sparassidae, which revealed NORs on terminal region of one, two, or up to three autosomal pairs (Wise 1983; Barrion et al. 1989; Araújo et al. 2005; Rodriguez-Gil et al. 2007). Although Hamataliwa sp. and O. salticus differed regarding the number of carrier pairs of NOR, these two species always presented argentophilic material on autosomal chromosomes. The occurrence of NOR only on autosomal chromosomes could be a shared characteristic to Entelegynae spiders, differing from Haplogynae, in which Oliveira et al. (2007) proposed that NORs on both autosomes and sex chromosomes seems to be the ancestral pattern for the group. The analysis of the four Oxyopidae spiders and available data of the literature permitted us to suggest the trends of chromosome evolution for this family. Despite certain species to retain the ancestral chromosome constitutions 2n♂=26+X1X2 with acro/telocentric chromosomes, the vast majority of the oxyopids have their karyotype differentiated by both reduction in diploid chromosome number and change of the sex chromosome system to X type. These mechanisms of chromosome evolution resulted in an interspecific and intraspecific karyotype variability within the family Oxyopidae. The most remarkable karyotype differentiation occurred in the specimens of O. salticus studied here that showed one of the lowest diploid number already recorded for Entelegynae spiders. The use of techniques to highlight specific chromosome regions in a high number of species certainly will be very useful to reveal more detail of the chromosome evolution in oxyopids. 31 Figure 4 – Schematic drawing, showing a probably origin of the different chromosome constitutions observed in Oxyopes salticus. A. Ancestral karyotype with 2n♂=20+X1X2 and acro/telocentric chromosomes. B. Karyotype with 2n♂=11+X originated by centric fusion between 14 autosomal chromosomes and tandem fusion between one autosomal pair and the long arm of pair 1. A centric fusion between the X1 and X2 sex chromosomes converted the sex chromosome system into a X type. Observe the heterozygous state of the centric fusion that originated the chromosomes of pair 1. C. Karyotype with 2n♂=10+X, revealing the homozygous condition of the centric fusion of pair 1. 32 References Amalin, D.M., Barrion, A.A., Jayoma, M., 1993. Comparative karyomorphology of two Neoscona species (Araneae: Araneidae). Philippine Entomologist 9, 1-6. Araújo, D., 2007. Citogenética de 13 espécies de aranhas haploginas pertencente às famílias Pholcidae, Sicariidae e Scytodidae (Araneomorphae): evolução cromossômica, sistema cromossômico de determinação sexual e citotaxonomia. 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A grande diversidade de estratégias de forrageamento e de estilo de vida, que varia de espécies solitárias que não constroem teias a espécies sociais que exibem cuidado parental, certamente foram alguns dos fatores que contribuíram para o sucesso adaptativo das aranhas theridiidae (Agnarsson, 2004; Arnedo et al., 2004). Dentro dessa família, as espécies do gênero Argyrodes são conhecidas por seu hábito cleptoparasita, no qual os indivíduos invadem teias de aranhas não relacionadas, geralmente de tamanho grande, como aquelas do gênero Nephila, em busca de alimento e proteção (Whitehouse et al., 2002; Agnarsson, 2004). Ainda dentro dessa família, a maioria das espécies do gênero Nesticodes são sinantrópicas, vivendo associadas a habitações humanas devido à relativa facilidade para obtenção de alimento (Cushingi e Lebeck, 1994). As famílias Theridiidae e Nesticidae formam o clado das teridioideas, o qual constitui um ramo derivado dentro de Araneoidea (Griswold et al., 1998). Citogeneticamente, apenas 29 espécies de Theridiidae pertencentes a 13 gêneros foram analisadas (Araújo, 2007). Com exceção de Argyrodes gazingensis, Chrysso scintillans e Parasteatoda tepidariorum que exibiram 2n♂=24 e de quatro representantes do gênero Latrodectus que apresentaram número cromossômico variando entre 2n♀=16 a 2n♀=28, as outras espécies investigadas mostraram o número diplóide 2n♂=22, incluindo um sistema cromossômico sexual do tipo X1X2 e cromossomos com morfologia acro/telocêntrica (Montgomery, 1907; Hackman, 1948; Suzuki, 1950, 1954; Sokolov, 1960; Diaz e Saez, 1966; Igarashi e Kondo, 1977; Kageyama e Seto, 1979; Martindale, 1980; Datta e Chatterjee, 1983; Srivastava e Shukla, 1986; Tugmon et al., 1990; Avilés e Maddison, 1991; Gorlov et al., 1995; Yonju et al., 1995; Chen, 1999; Avilés et al., 2000). Levando-se em conta a enorme diversidade de aranhas Theridiidae e o fato de nenhuma espécie da fauna Neotropical ter sido examinada sob o ponto de vista citogenético, o objetivo deste trabalho foi determinar o número diplóide, o tipo de sistema cromossômico sexual, a morfologia dos cromossomos, o comportamento 39 dos cromossomos durante a meiose e o padrão de distribuição das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) de Argyrodes elevatus Exline & Levi, 1962 e Nesticopes rufipes (Lucas, 1846). As informações obtidas foram comparadas com aquelas de espécies filogeneticamente relacionadas descritas na literatura, visando estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica que tem ocorrido nesta família. Material e métodos Neste trabalho, uma amostra de 58 indivíduos foi analisada, a qual compreendeu: 13 machos adultos e 13 embriões (oito machos e cinco fêmeas) de A. elevatus de Rio Claro (22º24’S, 47º33’W), São Paulo (SP), Brasil, 10 embriões (quatro machos e seis fêmeas) de A. elevatus de Tupã (21º56’S, 50º30’W), SP, 12 adultos (cinco machos e sete fêmeas) e quatro embriões machos de N. rufipes de Rio Claro, e um macho adulto e cinco embriões (dois machos e três fêmeas) de N. rufipes de Viçosa (20º45’S, 44º52’W), Minas Gerais (MG), Brasil. Os indivíduos foram identificados taxonomicamente pelo Dr. Antonio Domingos Brescovit, do Laboratório de Artrópodes, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil. As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de gônadas de indivíduos adultos e de células de embriões, utilizando solução de colchicina 0.16% e 0.05% respectivamente, de acordo com a metodologia descrita por Araújo et al. (2008). Os cromossomos foram corados convencionalmente com solução de Giemsa 3% (47 mL de água destilada, 1.5 mL de solução comercial de Giemsa e 1.5 mL de tampão fosfato pH 6.8) por 15 minutos e posteriormente, impregnados pelo íon prata (Howell e Black, 1980), para a identificação das RONs. A análise dos cromossomos foi realizada em microscopia de luz e a imagem das células mitóticas e meióticas foi capturada em um fotomicroscópio Olympus BX51, com objetiva 100x de imersão, optovar 1.6, utilizando o software DP Controller. A morfologia dos cromossomos foi determinada de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964). 40 Resultados Coloração com Giemsa Células metafásicas mitóticas de A. elevatus apresentaram o número diplóide 2n=21 para os machos e 2n=22 para as fêmeas, o sistema cromossômico sexual do tipo X/XX e a morfologia meta/submetacêntrica de todos os cromossomos do complemento (Figura 1A-B). Os cromossomos autossômicos decresceram gradualmente em tamanho e o cromossomo sexual X exibiu um tamanho extremamente grande. Células paquitênicas mostraram 10 bivalentes autossômicos completamente sinapsados e um bloco muito condensado e corado, interpretado como cromossomo sexual X univalente (Figura 1C). Núcleos em diplóteno e diacinese exibiram até três bivalentes autossômicos com dois quiasmas terminais, sendo que os demais bivalentes apresentaram apenas um quiasma intersticial ou terminal. Nessas fases, o cromossomo X também apresentou um alto grau de condensação e coloração (Figura 1D-E). A análise cariotípica de 11 indivíduos adultos e 11 embriões de N. rufipes revelou o número diplóide 2n=22 para os machos e 2n=24 para as fêmeas, o qual é condizente com um sistema cromossômico sexual do tipo X1X2/X1X1X2X2 (Figura 2A- B). Nessa espécie, todos os cromossomos apresentaram morfologia subtelo/acrocêntrica e uma variação gradual em tamanho. Os cromossomos sexuais foram identificados como elementos de tamanho mediano e com um grau de condensação um pouco mais elevado que os demais cromossomos do complemento. Células testiculares em paquíteno exibiram dois blocos muito condensados, corados e dispostos lado a lado, confirmando a ocorrência do sistema cromossômico sexual do tipo X1X2 para esta espécie (Figura 2C). Nos diplótenos, a fórmula meiótica 10II+X1X2 foi observada e todos os bivalentes mostraram apenas um quiasma intersticial ou terminal. Células em metáfase II exibiram n=10+X1X2 e n=10 (Figura 2E). Um indivíduo macho adulto de N. rufipes da população de Viçosa mostrou número cromossômico diplóide discrepante daquele encontrado nos outros exemplares da amostra examinada, ou seja, 2n=24 com cromossomos subtelo/acrocêntricos (Figura 3A). Nessas células, os cromossomos sexuais não apresentaram características que permitissem diferenciá-los dos autossomos. 41 Núcleos em diplóteno e diacinese revelaram a presença de 11 bivalentes autossômicos e dois cromossomos sexuais X1 e X2 arranjados lado a lado (Figura 3B). Metáfases II exibiram dois conjuntos haplóides diferentes n=11+X1X2 e n=11 (Figura 3C-D). Impregnação pelo íon prata Metáfases mitóticas de A. elevatus submetidas à impregnação pelo íon prata revelaram RONs sobre a região terminal do braço curto dos pares 2, 3 e 4 (Figura 4A-B). Em N. rufipes, as marcações correspondentes as RONs estavam localizadas sobre a região terminal do braço longo do par 4 (Figura 4C-D). 42 Figura 1 – Células mitóticas (A-B) e meióticas (C-E) de Argyrodes elevatus coradas com Giemsa. A- B. Cariótipos de embriões macho (A) e fêmea (B), com 2n=20+X e 2n=20+XX, respectivamente. Observe que o cromossomo X possui tamanho extremamente grande em relação aos autossomos. C. Paquíteno com cromossomo sexual X bem condensado e corado. D. Diplóteno, 10II+X, evidenciando bivalentes com um quiasma intersticial (seta grande) ou terminal (seta pequena). E. Diacinese, mostrando bivalentes com dois quiasmas terminais (seta). Escala=10µm. 43 Figura 2 – Células mitóticas (A-B) e meióticas (C-E) de Nesticodes rufipes coradas com Giemsa. A- B. Cariótipos de embriões macho (A) e fêmea (B), com 2n=20+X1X2 e 2n=20+X1X1X2X2, respectivamente. C. Paquíteno, mostrando cromossomos sexuais X1 e X2 heteropicnóticos positivos. D. Diplóteno, 10II+X1X2, exibindo bivalentes com um quiasma terminal (seta). E. Metáfases II com n=10+X1X2 e n=10. Escala=10µm. 44 Figura 3 - Células testiculares mitótica (A) e meióticas (C-D) de Nesticodes rufipes coradas com Giemsa. A. Metáfase com 2n=24. B. Diplóteno, 11II+X1X2, exibindo bivalentes com um quiasma intersticial (seta grande) ou terminal (seta pequena). C-D. Metáfases II com n=11+X1X2 e n=11, respectivamente. Escala=10µm. 45 Figura 4 – Células mitóticas de Argyrodes elevatus (A-B) e Nesticodes rufipes (C-D) coradas com Giemsa (A e C) e impregnadas pelo íon prata (B e D). A. Fêmea com 2n=20+XX. B. A mesma célula apresentada em A, evidenciando RONs sobre a região terminal do braço curto dos pares 2, 3 e 4 (cabeça de seta). C. Fêmea com 2n=20+X1X1X2X2. D. A mesma célula mostrada em C, revelando RONs sobre a região terminal do braço longo do par 4. Em detalhe, cromossomos do par 4, exibindo marcações de RONs bem evidentes. Escala=10µm. 46 Discussão As características cromossômicas observadas em A. elevatus foram totalmente discrepantes daquelas descritas para as 29 espécies da família Theridiidae previamente estudadas, dentre as quais estão cinco outras espécies do gênero Argyrodes (Araújo, 2007). Dessa forma, o presente trabalho apresenta pela primeira vez um registro do número diplóide 2n♂=21, sistema cromossômico sexual do tipo X, e todos os cromossomos do complemento com morfologia meta/submetacêntrica para uma aranha Theridiidae. Em contraste, o cariótipo 2n♂=20+X1X2 com cromossomos subtelo/acrocêntricos verificado na maioria dos exemplares da amostra de N. rufipes, o primeiro representante desse gênero examinado, foi similar aquele que é predominante para a família. Theridiidae pertence ao clado Araneoidea (Griswold et al., 1998), o qual engloba 12 famílias das quais apenas seis foram investigadas citogeneticamente. As aranhas desse grupo apresentam um cariótipo bastante conservado, uma vez que 2n♂=22+X1X2 com cromossomos acro/telocêntricos é a formula cariotípica mais comum em espécies de Araneidae, Linyphiidae, Nephilidae, Tetragnathidae bem como Nesticidae que é grupo-irmão de Theridiidae (Araújo, 2007). Essa última família, uma das mais derivadas dentro de Araneoidea, apresenta 80% de suas espécies com o cariótipo 2n♂=20+X1X2 que é diferenciado em relação aos outros grupos do clado. Essas informações parecem indicar que a principal tendência de evolução cromossômica, dos grupos basais para os derivados de Araneoidea, foi através de redução do número de autossomos e manutenção do sistema cromossômico sexual. Em Theridiidae, números diplóides mais altos, como 2n♂=24 verificado em uma espécie de Argyrodes, Chrysso e alguns indivíduos de Parasteatoda radiata, 2n♀=28, 2n♀=26, 2n♀=24 observados em aranhas do gênero Latrodectus, e números diplóides mais baixos, como 2n♀=16 e 2n♀=18 também presentes em Latrodectus e 2n♂=21 encontrado em A. elevatus, provavelmente tiveram origem a partir do 2n♂=22. Em A. elevatus, o sistema cromossômico sexual do tipo X pode ter sido diferenciado a partir do sistema X1X2 através de translocações Robertsonianas entre os cromossomos X1 e X2 originalmente acrocêntricos. Essa hipótese é reforçada pelo fato de que o cromossomo X apresenta dois braços e corresponde ao maior 47 elemento do cariótipo. Além disso, a conversão da morfologia dos autossomos de acro/telocêntrica para meta/submetacêntrica provavelmente foi resultado de inversões pericêntricas envolvendo todos os cromossomos do complemento. Por outro lado, a hipótese de adição de material heterocromático constitutivo como mecanismo responsável por essa conversão da morfologia dos autossomos não pode ser excluída. Na ordem Arachnida, a redução do número diplóide parece ser o principal mecanismo de evolução cariotípica (Suzuki, 1954). Tal evento deve ter ocorrido repetidas vezes durante o processo evolutivo, visto que diferenças inter e intra- específicas no número de cromossomos foram registradas em famílias não- relacionadas, como Araneidae, Dictynidae, Lycosidae, Oecobiidae, Salticidae, Sparassidae, entre outras (Araújo, 2007). A conversão do sistema X1X2 para o sistema X também parece ser um fato recorrente, pelo menos nas aranhas Entelegynae, nas quais esse último sistema de determinação sexual é o segundo mais freqüente, ocorrendo em cerca de 10% dentre as 590 espécies já estudadas sob o ponto de vista citogenético (Araújo et al., 2005). Em contraste, a presença de cromossomos meta/submetacêntricos em entelegine é bastante esporádica e geralmente tem sido atribuída a rearranjos cromossômicos do tipo fusões cêntricas que envolveram todos os cromossomos do complemento. Essa proposta de evolução através de fusões do tipo “tudo ou nada” tem sido corroborada pelo fato de que espécies que apresentam cariótipo saturado por cromossomos de dois braços têm um número diplóide mais baixo quando comparadas com outras espécies intimamente relacionadas e que possuem cromossomos acro/telocêntricos (Mittal 1966; Rowell, 1988, 1990, 1991; Amalin et al., 1993; Král 1995a, b). Dessa forma, o estudo citogenético de A. elevatus revelou um mecanismo adicional de evolução cariotípica para aranhas Entelegynae, o qual possivelmente está relacionado a inversões pericêntricas ou adição de heterocromatina constitutiva em todos os cromossomos autossomos do complemento. A grande maioria dos exemplares de N. rufipes estudados exibiu cariótipo semelhante aquele que é conservado em Theridiidae. A variação do número diplóide observada em um indivíduo adulto dessa espécie provavelmente não ocorreu em virtude de fissões cromossômicas, visto que diferenças marcantes quanto ao 48 tamanho de um ou mais pares cromossômicos não foram detectadas em todas as células mitóticas e meióticas analisadas. Embora pequenas diferenças intra- específicas no número diplóide sejam comumente registradas em aranhas (Araújo, 2007), na maioria dos casos, não foram feitas especulações sobre sua origem. Em N. rufipes, a variabilidade de número diplóide certamente está relacionada à presença de um par adicional de cromossomos autossômicos, uma vez que em células em diplóteno/diacinese foi invariavelmente verificado 11 bivalentes e em metáfases II conjuntos haplóides com n=11+X1X2 e n=11. Considerando que o par cromossômico extra foi encontrado em todas as células do indivíduo analisado, é possível sugerir que sua origem foi a partir de um evento de não-disjunção cromossômica que ocorreu durante a divisão meiótica que formou os gametas de um de seus parentais. Alternativamente, esse par cromossômico adicional pode corresponder a cromossomos B que seguem um padrão de segregação mendeliana durante a meiose, característica esta confirmada pelo estudo de células em metáfase II. O emprego de técnicas de identificação de regiões cromossômicas específicas, como o bandamento C e coloração com fluorocromos base-específicos certamente fornecerão subsídios adicionais que podem auxiliar em uma melhor interpretação dessa variabilidade numérica observada em N. rufipes. A análise da distribuição das RONs em espécies de Theridiidae foi realizada pela primeira vez neste trabalho. A ocorrência de RONs sobre os autossomos, tal como verificado em A. elevatus e N. rufipes, parece ser o padrão básico para as aranhas Entelegynae (Oliveira et al., 2007). Apesar do fato de ambas as espécies estudadas aqui pertencerem a gêneros distintos e exibirem grandes diferenças cariotípicas, a presença de RONs sobre o par 4 aponta para o fato de que este seja um padrão compartilhado entre espécies desta família; no entanto, está proposta só será confirmada com a investigação de um maior número de espécies. Em A. elevatus, além dos rearranjos cromossômicos responsáveis pela mudança do sistema cromossômico sexual e morfologia dos cromossomos, um aumento do número das RONs pode ter ocorrido através de eventos de duplicações seguidos por translocações. Uma hipótese similar foi originalmente elaborada por Král (1995a, b) para explicar a presença de RONs múltiplas em espécies de aranhas Entelegynae das superfamílias Amaurobioidea e Dictynoidea. 49 Referências bibliográficas Agnarsson I (2004) Morphological phylogeny of cobweb spiders and their relatives (Araneae, Araneoidea, Theridiidae). Zoological Journal of the Linnean Society 141: 447-626. Amalin DM, Barrion AA, Jayoma M (1993) Comparative karyomorphology of two Neoscona species (Araneae: Araneidae). Philippine Entomologist 9: 1-6. Araújo D (2007) Citogenética de 13 espécies de aranhas haploginas pertencente às famílias Pholcidae, Sicariidae e Scytodidae (Araneomorphae): evolução cromossômica, sistema cromossômico de determinação sexual e citotaxonomia. Tese de Doutorado, UNESP, Instituto de Biociências de Rio Claro, São Paulo, SP. 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Doralice Maria Cella Orientadora Co-orientadora CAPA FOLHA DE ROSTO FICHA CATALOGRÁFICA DEDICATÓRIA AGRADECIMENTOS EPÍGRAFE SUMÁRIO 1. RESUMO 2. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 4. MATERIAL E MÉTODOS 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ARTIGO: Chromossomal characteristics and karyotype evolution of Oxyopidae spiders (Araneae, Entelegynae) ARTIGO: Os cromossomos de aranhas Theridiidae (Entelegynae): variabilidade cariotípica interespecífica em Argyrodes e intra-específica em Nesticodes rufipes 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS