RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 26/03/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia LUANA DE SALES LEITE Análise do efeito de VisP no transcriptoma e patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium Araraquara - SP 2021 LUANA DE SALES LEITE Análise do efeito de VisP no transcriptoma e patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre, área de pesquisa em Bacteriologia. Orientador: Prof. Dr. Cristiano Gallina Moreira Coorientadora: Profa. Dra. Vânia Santos Braz Araraquara - SP 2021 Leite, Luana de Sales. L533a Análise do efeito de VisP no transcriptoma e patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium / Luana de Sales Leite. – Araraquara: [S.n.], 2021. 74 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Área de Pesquisa em Bacteriologia. Orientadora: Cristiano Gallina Moreira. Coorientadora: Vânia Santos Braz. 1. S. Typhimurium. 2. Patogenicidade. 3. Transcriptoma. 4. VisP. 5. 1,2 propanodiol. I. Moreira, Cristiano Gallina, orient. II. Braz, Vânia Santos, coorient. III. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030081P7 Esta ficha não pode ser modificada UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Análise do efeito de VisP no transcriptoma e patogenicidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTORA: LUANA DE SALES LEITE ORIENTADOR: CRISTIANO GALLINA MOREIRA COORIENTADORA: VÂNIA SANTOS BRAZ Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA, área: Análises Clínicas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. CRISTIANO GALLINA MOREIRA (Participaçao Virtual) Departamento de Ciências Biológicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP Profa. Dra. JULIANA PFRIMER FALCÃO (Participaçao Virtual) Análises Clínicas Toxicológicas e Bromatológicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da USP Profa. Dra. CARLA RAQUEL FONTANA MENDONÇA (Participaçao Virtual) Departamento de Análises Clínicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara - UNESP Araraquara, 26 de março de 2021 Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Câmpus de Araraquara - RODOVIA ARARAQUARA-JAÚ, KM 1 - CP 502, 14800903, Araraquara - São Paulo http://www2.fcfar.unesp.br/#!/pos-graduacao/biociencias-e-biotecnologias-aplicadas-a-farmacia/CNPJ: 48.031.918/0025-00. Dedico esse trabalho à minha mãe (In memoriam), como reconhecimento por tudo o que fez por mim durante sua vida, todos os seus esforços para que eu conquistasse meus sonhos e conseguisse alcançar meus objetivos. Mesmo não estando presente na conclusão desse trabalho, esteve no início dessa minha jornada me apoiando e torcendo por mim. Obrigada por estar sempre ao meu lado e por todo apoio e incentivo dedicados a mim. Por você, com sua força e sua memória, concluí essa etapa da minha vida da melhor maneira possível, como você sempre me ensinou. AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Cristiano Gallina Moreira por todo auxílio, incentivo e confiança para o desenvolvimento deste trabalho. À minha coorientadora Dra Vânia Santos Braz, por toda paciência, dedicação e ensinamentos, fundamentais para que eu pudesse encerrar esse trabalho da melhor maneira possível. À toda equipe do Laboratório PASIQUIBAC pela cooperação sempre que necessário e por todos os momentos de descontração que sempre tornava os dias de trabalho mais leves e felizes. Em especial ao Patrick, o qual sem a ajuda nenhuma etapa desse trabalho teria se concretizado. Ao apoio técnico da Mariana Santoni, essencial para a realização da técnica de RNAseq realizada durante esse estudo e resolução de problemas que surgiram durante esse período. À FCFar/UNESP, à FAPESP e à CAPES pelo apoio institucional e financeiro que viabilizaram a realização deste projeto. E, aos meus familiares e amigos por todo suporte, apoio e encorajamento. A todos que contribuíram ou me apoiaram de alguma forma, minha gratidão! RESUMO As espécies de Salmonella são as que mais causam doenças de origem alimentar no mundo sendo uma das principais causas bacterianas de gastroenterite. S. Typhimurium é comumente utilizada para estudo de interações com células hospedeira, pois bactérias intestinais são extremamente eficientes em orquestrar uma comunicação intraespecíficas e interespecíficas, através de complexos sistemas de sinalização química. Estudos mostram a importância da proteína VisP no periplasma da célula bacteriana, integrando os cuidados com a homeostase da membrana, aos processos de virulência bacteriana e resposta ao estresse em S. Typhimurium. O intestino possui uma densa e diversificada microbiota, além de uma ampla variedade de nutrientes. A microbiota intestinal possui a capacidade de disponibilizar diferentes açúcares através de atividade enzimática, assim como outros tipos de metabólitos. A exploração desses subprodutos derivados da microbiota como nutrientes e outros sinais é crucial para o sucesso da infecção por patógenos entéricos. Portanto, o presente estudo buscou elucidar o papel que VisP poderia desempenhar na virulência de S. Typhimurium e a sua relação com a expressão de outros genes, como os relacionados a vias metabólicas envolvidas no processo de infecção por esse patógeno. Para tanto, foi realizado o estudo do padrão de expressão gênica para definir a influência de açúcares na regulação do operon visP/ygiV e também ensaios fenótipos em diferentes condições. Os resultados obtidos indicam que o operon visP/ygiV possa sofrer influência de alguns açúcares na sua regulação. O transcriptoma da linhagem mutante ΔvisP foi obtido através da técnica de RNAseq, o que demostrou a importância dessa proteína para S. Typhimurium, visto grande número de transcritos diferencialmente expressos comparados à linhagem selvagem. Ensaios de expressão gênica e fenotípicos foram realizados em diferentes condições (disponibilidade de nutrientes e oxigênio), afim de relacionar a ausência de VisP com a redução na expressão de genes relacionados ao mecanismo de invasão e metabolismo de 1,2 propanodiol. Os resultados mostram que a mudança na disponibilidade de nutriente e oxigênio altera o padrão de expressão de ambos os genes testados. Assim como, a presença de 1,2 propanodiol reduz a capacidade de invasão in vitro na ausência de VisP. Os dados apresentados nesse estudo reforçam a importância de VisP durante o processo infeccioso no lúmem intestinal, onde a disponibilidade de nutrientes é restrita e a capacidade de utilizá-los é de grande importância. Palavras-chave: S. Typhimurium; patogenicidade; transcriptoma; VisP; 1,2 propanodiol Abstract Salmonella species are the ones that cause the most foodborne diseases in the world, being one of the main bacterial causes of gastroenteritis. S. Typhimurium is commonly used to study interactions with host cells, because intestinal bacteria are extremely efficient in orchestrating intraspecific and interspecific communication, through complex chemical signaling systems. Studies show the importance of VisP protein in the bacterial cell periplasm, integrating care with membrane homeostasis, bacterial virulence processes and stress response in S. Typhimurium. The intestine has a dense and diverse microbiota, in addition to a wide variety of nutrients. The intestinal microbiota has the ability to make different sugars available through enzymatic activity, as well as other types of metabolites. The exploitation of these by- products derived from microbiota as nutrients and other signs is crucial for the success of infection by enteric pathogens. Therefore, the present study sought to elucidate the role that VisP could play in the virulence of S. Typhimurium and its relationship with the expression of other genes, such as those related to metabolic pathways involved in the infection process by this pathogen. For this purpose, a study of the gene expression pattern was carried out to define the influence of sugars on the regulation of the visP/ygiV operon and phenotype tests under different conditions. The results obtained indicate that the visP/ygiV operon may be regulated by some sugars. The transcriptome of the ΔvisP mutant strain was obtained using the RNAseq technique, which demonstrated the importance of this protein for S. Typhimurium, given the large number of differentially expressed transcripts compared to the wild-type. Gene expression and phenotypic assays were performed under different conditions (availability of nutrients and oxygen), in order to relate the VisP absence with the reduction in the expression of genes related to the 1,2 propanediol invasion and metabolism mechanism. The results show that the change in nutrient and oxygen availability alters the expression pattern of both genes tested. Likewise, the presence of 1,2 propanediol reduces the capacity for invasion in vitro in VisP absence. The data presented in this study reinforce the importance of VisP during the infectious process in the intestinal lumen, where the availability of nutrients is restricted and the ability to use them is of great importance. Key words: S. Typhimurium; pathogenicity; transcriptome; VisP; 1,2 propanediol Lista de Figuras Figura 1: Modelo de patogênese de S. Typhimurium. .............................................. 14 Figura 2: Modelo da regulação por Al-3/epinefrina/noraepinefrina Salmonella enterica sorovar Typhimurium via QseEF e QseBC. ................................................. 17 Figura 3: Organização dos operons de visP/ygiV e qseBC. ..................................... 18 Figura 4: Modelo de VisP de S. Typhimurium. ......................................................... 19 Figura 5: Mecanismo da regulação transcricional de AraC. .................................... 20 Figura 6: Colonização de S. Typhimurium frente à resistência mediada pela microbiota intestinal. .................................................................................................. 22 Figura 7: Modelo para o controle de SPI-1 por propionato e reguladores genéticos. .................................................................................................................................. 26 Figura 8: Catabolismo de 1,2 propanodiol e propionato em S. Typhimurium. .......... 27 Figura 9: Esquematização da utilização de 1,2-propanodiol por S. Typhimurium durante o processo de infecção. ............................................................................... 28 Figura 10: Sequência das regiões regulatórias do operon visP/ygiV. ...................... 33 Figura 11: Esquema das construções contendo os dois promotores do operon visP/ygiV.................................................................................................................... 34 Figura 12: Avaliação da influência de D-glicose e D-maltose no crescimento e sobrevivência das linhagens SL1344 selvagem (WT) e mutante ΔvisP. ................... 41 Figura 13: Avaliação da influência de L-arabinose e D-manose no crescimento e sobrevivência das linhagens SL1344 selvagem (WT) e mutante ΔvisP. ................... 42 Figura 14: Análise do padrão de expressão do operon visP/ygiV através do ensaio de atividade de β-galactosidase, na presença dos açúcares como fonte de carbono em aerobiose. ............................................................................................................ 44 Figura 15: Avaliação da influência dos açúcares no crescimento e sobrevivência da linhagem SL1444 selvagem (WT) e mutante ΔvisP em baixas concentrações de oxigênio. .................................................................................................................... 46 Figura 16: Análise do padrão de expressão do operon visP/ygiV através do ensaio de atividade de β-galactosidase, na presença dos açúcares como fonte de carbono com restrição de oxigênio.......................................................................................... 48 Figura 17: Transcritos diferencialmente expressos comparando a linhagem mutante ΔvisP com a SL1344 WT........................................................................................... 50 Figura 18: Volcano plot de 4577 transcritos identificados no RNAseq. .................... 50 Figura 19: Ontologia gênica dos transcritos com expressão reduzida no mutante ΔvisP relativo à amostra selvagem. .......................................................................... 52 Figura 20: Ontologia gênica dos transcritos com expressão aumentada no mutante ΔvisP relativo à amostra selvagem. .......................................................................... 52 Figura 21: Heatmap dos níveis de expressão dos genes relacionados pertencentes à SPI-1 e genes da via de degradação de 1,2 PD. ................................................... 53 Figura 22: Efeito do 1,2 PD como fonte de carbono na sobrevivência das linhagens. .................................................................................................................................. 55 Figura 23: Padrão de expressão dos genes pdu em diferentes condições de crescimento. .............................................................................................................. 57 Figura 24: Perfil de expressão gênica de genes relacionados ao mecanismo de invasão nas linhagens cultivadas com LB em aerobiose. ......................................... 59 Figura 25: Padrão de expressão de genes relacionados ao mecanismo de invasão em diferentes condições de crescimento. ................................................................. 62 Figura 26: Invasão em células epiteliais HeLa em diferentes condições. ................ 64 Lista de Tabelas Tabela 1: Linhagens bacterianas utilizadas nos ensaios de caracterização fenotípica e análise de expressão gênica. ................................................................................. 29 Tabela 2: Sequências dos primers utilizados no presente estudo. ........................... 36 Sumário 1. Introdução ......................................................................................................... 13 1.1 Gênero Salmonella ..................................................................................... 13 1.2 Mecanismos de patogenicidade de S. Typhimurium .............................. 13 1.3 Sinalização química ................................................................................... 15 1.4 Operon visP/ygiV........................................................................................ 17 1.5 Interação Salmonella - microbiota intestinal e utilização de nutrientes 20 1.5.1 Fontes de carbono e energia .............................................................. 22 1.5.2 Ácidos graxos de cadeia curta e utilização de 1,2 propanodiol ...... 25 2. Objetivos ........................................................................................................... 28 2.1 Objetivo geral ............................................................................................. 28 2.2 Objetivos específicos ................................................................................ 28 3. Material e Métodos............................................................................................ 29 3.1 Cultivo das linhagens para os ensaios .................................................... 29 3.2 Distintos açúcares como fonte de carbono em aerobiose ..................... 30 3.3 Distintos açúcares como fonte de carbono em microaerofilia .............. 30 3.4 Composto 1,2 PD como fonte de carbono ............................................... 31 3.5 Cultivo de célula epitelial Hela .................................................................. 31 3.6 Análise do padrão de expressão da região promotora do operon visP/ygiV ............................................................................................................... 32 3.6.1 Ensaio de atividade de β-Galactosidase ........................................... 34 3.7 Extração de RNA ..................................................................................... 34 3.8 Análise de expressão gênica por qRT-PCR ............................................. 35 3.9 RNAseq do mutante ΔvisP ........................................................................ 37 3.9.1 Construção de biblioteca e sequenciamento .................................... 37 3.9.2 Análise dos dados transcriptômicos ................................................. 38 3.9.3 Ontologia gênica .................................................................................. 38 3.10 Análise Estatística...................................................................................... 39 4. Resultados e Discussão ................................................................................... 39 4.1 Diferentes açúcares como única fonte de carbono em aerobiose ........ 39 4.2 Diferentes açúcares como única fonte de carbono em baixas concentrações de oxigênio ................................................................................. 45 4.3 Transcriptoma do mutante ΔvisP via RNAseq ........................................ 48 4.4 Relação de visP com a expressão de genes relacionados ao metabolismo de 1,2 PD ........................................................................................ 53 4.5 Influência de VisP no mecanismo de invasão de S. Typhimurium em diferentes condições ........................................................................................... 58 Conclusão ................................................................................................................ 66 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 68 13 1. Introdução 1.1 Gênero Salmonella O gênero Salmonella composto por bacilos entérico Gram-negativo, patogênico, pertencente à família Enterobacteriaceae, que consiste em duas espécies: Salmonella bongori e Salmonella enterica (FÀBREGA; VILA, 2013; ISSENHUTH-JEANJEAN; ROGGENTIN; MIKOLEIT; GUIBOURDENCHE et al., 2014). Dentre as subespécies, a Salmonella enterica subespécie enterica é a cepa mais comumente relacionada às doenças em seres humanos, mas também pode infectar uma ampla gama de hospedeiros (FOOKES; SCHROEDER; LANGRIDGE; BLONDEL et al., 2011). E entre estas destaca-se, pelo interesse clínico, as sorovariedades não tifoidais (NTS) S. Enteritidis e S. Typhimurium, que causam as gastroenterites, e as sorovariedades tifoidais S. Typhi e S. paratyphi, que causam a febre tifoide (FÀBREGA; VILA, 2013; LAROCK; CHAUDHARY; MILLER, 2015). As espécies de Salmonella estão entre as que mais causam doenças de origem alimentar no mundo e uma das principais causas bacterianas de gastroenterite, que podem ser casos leves ou moderados e não necessita de tratamento, ou casos severos, que geralmente acomentem pacientes imunocomprometidos, crianças e idosos (FÀBREGA; VILA, 2013). São adquiridas pela ingestão de alimentos como também por água contaminados e são capazes de sobreviver à acidez gástrica para obter acesso ao epitélio intestinal (LAROCK; CHAUDHARY; MILLER, 2015). 1.2 Mecanismos de patogenicidade de S. Typhimurium S. Typhimurium pode resistirao suco gástrico, aos sais biliares e possui habilidade de replicação intracelular, o que concede vantagens de crescimento no lúmen intestinal e evasão do sistema imunológico do hospedeiro. Por isso, é uma bactéria utilizada como modelo para estudo de interações com células hospedeiras (FÀBREGA; VILA, 2013; LAROCK; CHAUDHARY; MILLER, 2015). Para invadir as barreiras da mucosa intestinal do hospedeiro, essas bactérias podem ser englobadas por fagócitos no lúmen intestinal. Elas geralmente utilizam como porta 14 de entrada as células M e enterócitos, mas também podem induzir a sua própria absorção pelas células epiteliais, como mostra a figura 1 (FÀBREGA; VILA, 2013; SANTOS; TSOLIS; BÄUMLER; ADAMS, 2003). S. Typhimurium tem a capacidade de se replicar dentro de vacúolos em macrófagos, o que também é uma característica da sua patogênese. Esses mecanismos de invasão, assim como colonização, sobrevivência e multiplicação no interior das células do hospedeiro são dependentes de uma variedade de fatores de virulência que são codificados por genes específicos (LAROCK; CHAUDHARY; MILLER, 2015). Figura 1: Modelo de patogênese de S. Typhimurium. 1) As células de Salmonella se ligam ao epitélio intestinal por meio de adesinas. 2 e 3) Então, segue o processo de invasão e fagocitose das bactérias mediados por fatores de virulência codificados na SPI-1 e SPI-5. 4) Alternativamente, as células bacterianas também podem ser fagocitadas diretamente pelas células dendríticas. 5) Dentro do citoplasma, Salmonella se localiza dentro do SCV, onde se replica. 6) Os SCVs transitam para a membrana basolateral e liberam as células internas para a submucosa. 7) As bactérias são internalizadas nos fagócitos e novamente localizadas em um SCV. Fonte: FÀBREGA; VILA (2013). Os genes de virulência podem estar presentes em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, ou fazer parte de regiões especificas do cromossomo da bactéria. Essas regiões do genoma de Salmonella são conhecidas como Ilhas de 15 Patogenicidade, caracterizadas por grandes regiões do DNA que conferem virulência e podem, por exemplo, codificar proteínas efetoras (FÀBREGA; VILA, 2013; HARAGA; OHLSON; MILLER, 2008). Diversas Ilhas de Patogenicidade de Salmonella (SPI - “Salmonella Pathogenicity Islands”) são descritas na literatura, e nem todas têm suas funções totalmente elucidadas. As duas principais Ilhas de Patogenicidade ligadas ao processo patogênico de S. Typhimurium são SPI-1, relacionada à invasão celular (GALÁN; CURTISS, 1989) e SPI-2, relacionada à sobrevivência intracelular, sobrevivência em macrófagos e infecção sistêmica em camundongos (CIRILLO; VALDIVIA; MONACK; FALKOW, 1998; OCHMAN; SONCINI; SOLOMON; GROISMAN, 1996). A patogênese de S. Typhimurium é altamente dependente de dois Sistemas de Secreção do Tipo 3 (T3SS) codificados nas ilhas SPI-1 e SPI-2, que auxiliam na invasão e sobrevivência na célula do hospedeiro. Os T3SS são estruturas em forma de agulha molecular que injetam as proteínas efetoras essenciais durante esses dois momentos do processo infeccioso, invasão e sobrevivência (GALÁN, 1996; SHEA; HENSEL; GLEESON; HOLDEN, 1996; ZHOU; CHEN; HERNANDEZ; SHEARS et al., 2001). Algumas proteínas efetoras alteram a via de sinalização da célula hospedeira, com o objetivo de promover uma alteração no citoesqueleto com consequente endocitose da Salmonella. Após a invasão inicial, o fagossomo é então formado e se funde aos lisossomos, o que origina o Salmonella Containing Vacuole (SCV), onde a bactéria utiliza a maquinaria do hospedeiro, com auxílio dos efetores secretados pelo T3SS de SPI-2, que evita a resposta imune mediada por neutrófilos (FÀBREGA; VILA, 2013; LAROCK; CHAUDHARY; MILLER, 2015). 1.3 Sinalização química As células do hospedeiro e do patógeno possuem mecanismos de comunicação, tanto intra e interespecífica ou até inter e intra-Reinos (SPERANDIO; TORRES; JARVIS; NATARO et al., 2003). Esses mecanismos estão relacionados a sinalizações químicas detectadas por sistemas que atuam como sensores do meio externo e regulam os mecanismos da célula em resposta ao estímulo. Os sensores facilitam o reconhecimento do ambiente da célula do hospedeiro, fazendo com que a 16 bactéria possa ativar a expressão de certos genes de virulência (RASKO; MOREIRA; LI; READING et al., 2008). Um importante mecanismo de sinalização química entre patógeno e hospedeiro é via hormônios adrenérgicos de estresse do hospedeiro, Epinefrina (Epi) e Norepinefrina (Nor), e uma molécula provinda da microbiota, o Autoindutor 3 (AI-3). Esses sinais são reconhecidos por um sistema de 2-componentes, que constitui de um sensor histidina quinase da membrana de bactérias patogênicas e um regulador de resposta, que detecta e promove uma resposta rápida a um estímulo ou estresse vindo do ambiente (CLARKE; HUGHES; ZHU; BOEDEKER et al., 2006; SPERANDIO; TORRES; JARVIS; NATARO et al., 2003). O sistema de 2-componentes QseBC foi descrito e reportado na participação da virulência em S. Typhimurium (MOREIRA; WEINSHENKER; SPERANDIO, 2010; PATEL; GALÁN, 2006). O sensor histidina quinase QseC fosforila o seu regulador cognato, QseB, o qual irá ativar uma cascata de regulação, resultando na expressão de fatores de virulência. Outro sistema de 2-componentes sob a regulação de Epi, mas abaixo na cascata de regulação, é o QseEF. O sensor quinase QseE reconhece além de Epi, variações nos níveis de íons de sulfato e fosfato do ambiente e fosforila seu regulador de resposta cognato QseF (READING; TORRES; KENDALL; HUGHES et al., 2007) regulando, por exemplo, a SPI-1 de S. Typhimurium promovendo sua virulência (MOREIRA; SPERANDIO, 2012). Esses sistemas de sinalização estão esquematizados na figura 2, eles são descritos para diversas espécies de bactérias patogênicas, e possuem muitas funções na virulência das mesmas (CLARKE; HUGHES; ZHU; BOEDEKER et al., 2006; SPERANDIO; TORRES; JARVIS; NATARO et al., 2003). 17 Figura 2: Modelo da regulação por Al-3/epinefrina/noraepinefrina Salmonella enterica sorovar Typhimurium via QseEF e QseBC. QseC detecta Al-3/epinefrina (Epi)/noraepinefrina (NE) para aumentar sua autofosforilação, enquanto QseE detecta PO4, SO4, Epi e NE. QseE fosforila exclusivamente QseF, enquanto QseC fosforila QseB e QseF. Além de fosforilar o QseB, o QseC também desfosforila esse regulador de resposta. A ação integrada de QseBC e QseEF com vários sistemas de dois componentes, leva à expressão de SPI-1 e sifA e ao aumento da patogênese de S. Typhimurium. Fonte: MOREIRA; SPERANDIO (2012). 1.4 Operon visP/ygiV A proteína periplasmática denominada VisP (Virulence and Stress-related Periplasmic Protein), participa das funções celulares básicas e de manutenção da membrana celular como também na sobrevivência e virulência de S. Typhimurium (MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al., 2013). Essa proteína foi identificada durante um estudo de caracterização da importância do sensor quinase QseC na patogênese de S. Typhimurium in vivo (MOREIRA; WEINSHENKER; SPERANDIO, 2010). O gene visP faz parte do regulon de QseBC e está localizado em um operon transcrito na direção oposta ao qseBC, como mostra a figura 3 (MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al., 2013). A proteína VisP também está conectada à via de sinalização química por Epi/Nor/Autoindutor-3 presentes em EHEC e S. Typhimurium via sistema QseBC, e possui participação em funções 18 celulares básicas como manunteção de membrana, metabolismo e resposta ao estresse (SPERANDIO; TORRES; JARVIS; NATARO et al., 2003). Figura 3: Organização dos operons de visP/ygiV e qseBC. Em S. Typhimurium, o gene visP apresenta-se upstream ao gene ygiV, que codifica um regulador de transcrição da família AraC, ambos são transcritos em um mesmo operon e localizados no mesmo regulon de QseBC. Fonte: MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al. (2013). VisP foi classificada in silico como uma proteína da família BOF (Oligonucleotide/oligossacaride Binding Fold). Essas proteínas ligam-se a oligossacarídeos, que são abundantes na camada de peptideoglicano (GINALSKI; KINCH; RYCHLEWSKI; GRISHIN, 2004). VisP se liga à porção de açúcar do peptidoglicano e inibe a dioxigenase (LpxO) resultando em menor modificação do lipopolissacarídeo dependente de LpxO e aumento da resistência a estressores dentro do vacúolo durante a replicação no macrófago (MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al., 2013). A estrutura de VisP em S. Typhimurium foi previamente determinada (Figura 4) e os seis resíduos de aminoácidos da bolsa de ligação de BOF são compartilhados entre S. Typhimurium e E. coli, que contem essa proteína conservada (MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al., 2013). Seu sítio de interação com açúcares de baixo peso molecular, característica das proteínas da família BOF, também foi determinado (GINALSKI; KINCH; RYCHLEWSKI; GRISHIN, 2004). Isso demonstrou a importância de VisP no periplasma da célula bacteriana, integrando os cuidados com a homeostase da membrana aos processos de virulência bacteriana e resposta ao estresse (MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al., 2013). 19 Figura 4: Modelo de VisP de S. Typhimurium. Representação in silico de VisP, classificada como uma proteína da família BOF (Oligonucleotide/oligossacaride Binding Fold). Fonte: MOREIRA; HERRERA; NEEDHAM; PARKER et al. (2013). Em S. Typhimurium, o gene visP apresenta-se upstream ao gene ygiV, que codifica um regulador de transcrição da família AraC, e ambos são transcritos em um mesmo operon (Figura 3) (MERIGHI; SEPTER; CARROLL-PORTILLO; BHATIYA et al., 2009). Em E. coli K12, YgiV foi descrito atuando como repressor da transcrição do gene mcbR, que inibe ybiM, que codifica uma proteína periplasmática, envolvida na formação de biofilme (ZHANG; GARCÍA-CONTRERAS; WOOD, 2008). Os membros da família AraC estão envolvidos na regulação de diversos processos como metabolismo de carbono, resposta a estresses e virulência. Em geral, estes reguladores apresentam dois domínios um de ligação ao DNA (HTH) e o segundo na região N-terminal pode estar envolvido na dimerização do regulador ou pode ser sítio de um ligante. O membro que deu nome à essa família, o regulador AraC, responde a arabinose e atua como ativador e repressor do operon araBAD (Figura 5). Na ausência de arabinose dois dímeros de AraC se ligam na região promotora do operon e provoca um loop no DNA impedindo a transcrição do operon, porém na presença de arabinose o dímero de AraC ligado ao DNA sofre uma alteração alostérica, que permite que o dímero AraC ocupe dois sítios proximais adjacentes, e isso leva à abertura da alça do DNA e ativação da transcrição (YANG; TAUSCHEK; ROBINS-BROWNE, 2011). 20 Figura 5: Mecanismo da regulação transcricional de AraC. (a) Representação esquemática do monômero AraC. (b) Na ausência de arabinose dois dímeros de AraC se ligam na região promotora do operon e provoca um loop no DNA impedindo a transcrição do operon. (c) Na presença de arabinose o dímero de AraC ligado ao DNA sofre uma alteração alostérica, permitindo que o dímero AraC ocupe dois sítios proximais adjacentes, levando à abertura da alça do DNA e ativação da transcrição. Fonte: YANG; TAUSCHEK; ROBINS-BROWNE (2011). 1.5 Interação Salmonella - microbiota intestinal e utilização de nutrientes A Salmonella é um dos principais patógenos do trato gastrointestinal e sabe- se que nos mamíferos esse é um ambiente complexo em que as associações bactéria-hospedeiro são fundamentais. O intestino possui uma microbiota densa e diversa, muitas vezes relacionada aos estados de saúde do hospedeiro e contém uma ampla variedade de nutrientes de várias fontes diferentes, endógenas e exógenas (ANDERSON; KENDALL, 2017; KOROPATKIN; CAMERON; MARTENS, 2012; SONNENBURG; XU; LEIP; CHEN et al., 2005). A microbiota do trato gastrointestinal, além de fornecer nutrientes e vitaminas, pode afetar o metabolismo, o sistema digestivo e outros sistemas do hospedeiro 21 (FERREYRA; NG; SONNENBURG, 2014; SHARON; GARG; DEBELIUS; KNIGHT et al., 2014). As bactérias que fazem parte dessa microbiota são, em grande parte, dos filos Bacteroidetes e Firmicutes, em sua maioria anaeróbios facultativos (KHAN, 2014). Essa microbiota pode conferir uma barreira aos patógenos entéricos, promovendo uma resistência à colonização (BOHNHOFF; DRAKE; MILLER, 1954). Estudos em que foram utilizados camundongos com sua microbiota gastrointestinal depletada (ou pelo uso de antibióticos ou camundongos “germ free”), esses animais se mostraram mais suscetíveis às infecções causadas por enterobactérias patogênicas como Shigella flexneri, Citrobacter rodentium, Listeria monocytogenes e Salmonella enterica serovar Typhimurium (BOHNHOFF; DRAKE; MILLER, 1954; SASSONE-CORSI; RAFFATELLU, 2015). A composição da microbiota de cada indivíduo difere em diversidade de gênero e espécies, isso pode ser variável dependendo de fatores ambientais, hábitos alimentares, genética do hospedeiro, entre outros. Levando a uma suscetibilidade variável a doenças infecciosas entre os indivíduos, e algumas dessas composições podem levar à expansão ou virulência aumentada de alguns patógenos (BOHNHOFF; DRAKE; MILLER, 1954; CAMERON; SPERANDIO, 2015; SASSONE-CORSI; RAFFATELLU, 2015). Os diferentes fatores que podem ser produzidos pelas variadas composições de microbiota e os produzidos pelo próprio hospedeiro podem moldar o resultado da interação patógeno-hospedeiro no lúmen intestinal, influenciando a patogênese de algumas enterobactérias, como a S. Typhimurium. A figura 6 esquematiza a interação da Salmonella com a microbiota no processo de estabelecimento da infecção e os diferentes nutrientes disponíveis no ambiente intestinal durante essa colonização (ANDERSON; KENDALL, 2017). Esse patógeno se adapta a diferentes ambientes durante a colonização e no processo de infecção, isso confere diferentes disponibilidades de nutrientes e moléculas, que podem ser providas da microbiota ou do hospedeiro. Sendo assim, há uma diversidade de interações dinâmicas entre a Salmonella e a microbiota intestinal, pois ambos competem por nutrientes essenciais (ANDERSON; KENDALL, 2017; CAMERON; SPERANDIO, 2015). 22 Figura 6: Colonização de S. Typhimurium frente à resistência mediada pela microbiota intestinal. (A) Os efeitos cumulativos da inflamação induzida por T3SS-1 e T3SS-2 levam a colonização robusta do intestino. (B) S. Typhimurium utiliza o T3SS-1 e T3SS-2 para gerar resposta imune do hospedeiro no intestino, eliminando membros da microbiota. (C) A inflamação induzida pelos efetores secretados por T3SS-1 / T3SS-2 leva à produção de metabólitos, como aceptores de elétrons, incluindo oxigênio, nitrato e tetrationato, que promovem a respiração aeróbia e anaeróbia. T3SS, sistema de secreção tipo III; T6SS, sistema de secreção tipo VI. Fonte: ANDERSON; KENDALL (2017). Devido à alta densidade e diversidade da microbiota do trato gastrointestinal é essencial que ocorra algum tipo de comunicação para coordenação dos processos entre essa comunidade e o hospedeiro. Essa coordenação ocorre através de uma variedade de produtos que variam de moléculas de sinalização a metabólitos (MARCOBAL; SOUTHWICK; EARLE; SONNENBURG, 2013). Essa sinalização é explorada por patógenos entéricos para reconhecerem o ambiente, podendo assim ativar seus mecanismos de virulência e ajustar seu metabolismo para garantir uma competição bem-sucedida por nutrientes e um nicho de colonização (CLARKE; HUGHES; ZHU; BOEDEKER et al., 2006). 1.5.1 Fontes de carbono e energia 23 O trato gastrointestinal é um ambiente rico em diversos nutrientes, entretanto os substratos capazes de permitir o crescimento fermentativo no ambiente anaeróbio são limitados. Os nutrientes presentes no intestino têm efeitos profundos na composição da microbiota, mas também podem atuar como sinais para influenciar a fisiologia dos patógenos. Um dos papéis da microbiota é a manipulação de fontes de carboidratos presentes nesse ambiente. Os membros da comunidade da microbiota são fermentadores com uma ampla capacidade metabólica, sendo capazes de digerir estruturas glicanas complexas originárias da dieta do hospedeiro, e estruturas do próprio hospedeiro como muco e glicanos associados às células, que não são digeridos por micróbios invasores. Essa capacidade metabólica permite à microbiota explorar nichos únicos e sobreviver no intestino humano na homeostase (MARTENS; CHIANG; GORDON, 2008; SONNENBURG; XU; LEIP; CHEN et al., 2005). O epitélio intestinal possui uma camada de muco para sua proteção, composta proteínas glicosiladas, as mucinas. Os glicanos da mucosa contêm vários resíduos de açúcar diferentes que são importantes fontes de nutrientes para a microbiota e também para os patógenos intestinais. Esses açúcares podem ser fucose, galactose, ácido siálico, N- acetilgalactosamina, N- acetilglucosamina e/ou manose (LARSSON; KARLSSON; SJÖVALL; HANSSON, 2009). Alguns membros da microbiota possuem a capacidade enzimática de degradar carboidratos complexos, inclusive das grandes estruturas glicanas do muco, aumentando a disponibilidade desses açúcares no intestino. Assim, outras espécies que não possuem essa capacidade podem utilizar esses açúcares liberados durante esse processo como fonte de nutrientes (CAMERON; SPERANDIO, 2015). Esses açúcares liberados pela microbiota são nutrientes importantes para patógenos entéricos ao estabelecer sua infecção, pois os mesmos não possuem essa capacidade enzimática de degradar essas estruturas glicanas, porém, muitas vezes, podem catabolizar os açúcares liberados, promovendo sua expansão (MARCOBAL; SOUTHWICK; EARLE; SONNENBURG, 2013). Portanto, a atividade enzimática da microbiota intestinal, até certo ponto, pode tornar o hospedeiro particularmente suscetível a diferentes infecções. A capacidade de catabolizar o ácido siálico, um açúcar encontrado na camada de muco, aumenta os níveis de colonização de Clostridium difficile e S. Typhimurium em um modelo de camundongo tratado com antibiótico, conferindo 24 vantagens de crescimento para os patógenos (NG; FERREYRA; HIGGINBOTTOM; LYNCH et al., 2013). Ambos não possuem capacidade enzimática de liberar esse açúcar das estruturas glicanas, portanto dependem da microbiota para que encontrem essa disponibilidade, principalmente Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), importante membro dessa comunidade, que possui atividade enzimática para liberar esse e outros açúcares no intestino. Ainda, B. theta não possui uma via catabólica para o ácido siálico (XU; BJURSELL; HIMROD; DENG et al., 2003) e presumivelmente codifica essa atividade enzimática apenas para acessar os açúcares subjacentes nos glicanos da mucosa, que são uma importante fonte de carbono para esse organismo (MARTENS; CHIANG; GORDON, 2008). Assim como o ácido siálico, B. theta libera fucose do muco, aumentando a disponibilidade desse açúcar no lúmen intestinal, essa fucose livre também pode ser usada como fonte de carbono por S. Typhimurium (NG; FERREYRA; HIGGINBOTTOM; LYNCH et al., 2013). A Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) utiliza a fucose como uma molécula sinalizadora para detectar o ambiente do lúmem intestinal e modular seu próprio metabolismo e regular a expressão de seus genes de virulência no lúmen intestinal (PACHECO; CURTIS; RITCHIE; MUNERA et al., 2012). A microbiota, além de modificar a disponibilidade de açúcares através da atividade enzimática, pode influenciar a produção de glicanos da mucosa pelo hospedeiro. Espécies de Lactobacillus podem alterar a paisagem de carboidratos da camada mucosa aumentando a expressão de mucinas pelas células epiteliais do intestino (MACK; MICHAIL; WEI; MCDOUGALL et al., 1999). Uma variedade de subprodutos metabólicos (gases, ácidos graxos de cadeia curta e ácidos orgânicos) pode ser produzido pela microbiota e utilizados por patógenos entéricos como nutrientes. O hidrogênio molecular é um desses subprodutos (abundante da fermentação anaeróbia da microbiota) e utilizado por patógenos como fonte de energia. A Hyb hidrogenase permite que a S. Typhimurium utilize esse hidrogênio para aprimorar seu crescimento durante o estágio inicial da invasão, e esse processo é dependente da microbiota (MAIER; VYAS; CORDOVA; LINDSAY et al., 2013). A utilização desses subprodutos e outras estratégias podem ser importantes para a expansão dos patógenos através da competição com a própria microbiota. S. Typhimurium pode utilizar nitrato ou tetrationato como receptores de elétrons na respiração, sendo um processo mais eficiente para geração de energia do que a 25 fermentação, o que lhe fornece uma vantagem sobre a microbiota residente e permite que o patógeno acesse novas fontes de carbono. Esse patógeno pode utilizar essa respiração para consumir etanolamina ou 1,2 propanodiol como nutriente. A etanolamina não pode ser usada pela maioria dos membros da microbiota residente, portanto esse processo também confere uma vantagem ao patógeno (THIENNIMITR; WINTER; WINTER; XAVIER et al., 2011). 1.5.2 Ácidos graxos de cadeia curta e utilização de 1,2 propanodiol Os ácidos graxos de cadeia curta, incluindo acetato, propionato e butirato, são subprodutos de fermentação produzidos pela microbiota intestinal importantes para determinação das interações com os patógenos entéricos. A composição e abundância desses ácidos graxos são distintas em diferentes partes do intestino, o que pode contribuir para o reconhecimento de nicho por bactérias patogênicas que possuem capacidade de detectar essas diferentes composições ou, também, utilizar os mesmos como fonte de energia (BÄUMLER; SPERANDIO, 2016). Concentrações de acetato, propionato e butirato que mimetizam o íleo e o cólon modulam a expressão de genes de SPI-1 por S. Typhimurium, onde as concentrações como encontradas no íleo aumentam a expressão desses genes, relacionados à invasão celular, e as concentrações encontradas no cólon inibem a invasão, diminuindo a expressão desses genes (LAWHON; MAURER; SUYEMOTO; ALTIER, 2002). Individualmente, a exposição ao acetato aumenta a expressão de genes de SPI-1 e o propionato diminui essa expressão através do regulador transcricional HilD (HUNG; GARNER; SLAUCH; DWYER et al., 2013). HilD, um regulador de transcrição da família AraC, compreende uma parte de um circuito de auto-regulação que inclui RtsA e HilC (ELLERMEIER; ELLERMEIER; SLAUCH, 2005), eles induzem a expressão de hilA, que codifica um ativador transcricional de diversos operons que codificam T3SS de SPI-1 e proteínas efetoras importantes para o rearranjo citoesquelético. HilC também pode induzir a expressão de SPI-1 independente de HilA (ALTIER; SUYEMOTO; LAWHON, 2000). O efeito repressor de propionato através de HilD é pós traducional e esse processo requer propionil- CoA (Figura 7), produto de alta energia do metabolismo do propionato. O mecanismo de regulação de SPI-1 pelos ácidos graxos de cadeia curta ainda não foi totalmente elucidado, mas sabe-se que esses subprodutos da microbiota intestinal 26 podem influenciar o modo como as bactérias patogênicas percebem o ambiente e desenvolvem o processo inflamatório. Figura 7: Modelo para o controle de SPI-1 por propionato e reguladores genéticos. As setas indicam controle positivo, enquanto as barras em forma de T indicam controle negativo. Fonte: HUNG; GARNER; SLAUCH; DWYER et al. (2013). O propionil-CoA é um metabólito essencial para a repressão da invasão pelo propionato e um intermediário comum das vias de degradação de propionato e 1,2 propanodiol (HUNG; GARNER; SLAUCH; DWYER et al., 2013; PALACIOS; STARAI; ESCALANTE-SEMERENA, 2003). O propionato, além de estar disponível como subproduto da microbiota intestinal, é o produto final da via responsável pelo catabolismo de 1,2 propanodiol mediada pelo operon pdu (BOBIK; XU; JETER; OTTO et al., 1997; WALTER; AILION; ROTH, 1997), que pode ser utilizado por Salmonella como fonte de carbono (GUTNICK; CALVO; KLOPOTOWSKI; AMES, 1969), e é um abundante produto de fermentação derivado dos açúcares L-ramnose e L-fucose, também disponíveis no intestino (BADÍA; ROS; AGUILAR, 1985; OBRADORS; BADÍA; BALDOMÀ; AGUILAR, 1988). O 1,2 propanodiol é degradado em propionaldeído e posteriormente em 1- propanol e propionato, como mostra a figura 8 (HAVEMANN; SAMPSON; BOBIK, 2002; YOO; KIM; YOON; RYU, 2017). 27 Figura 8: Catabolismo de 1,2 propanodiol e propionato em S. Typhimurium. O catabolismo de 1,2 propanodiol é mediado pelo operon Pdu, indicado em azul. O catabolismo do propionato é realizado pelo operon Prp, indicado em roxo. O propionil-CoA, intermediário comum, fornece piruvato através do ciclo de 2-metilcitrato (MCC), que pode ser usado como fonte de energia. O oxigênio ou tetrationato é usado como um aceptor de elétrons sob condições aeróbias ou anaeróbias, respectivamente. Fonte: YOO; KIM; YOON; RYU (2017). Uma combinação de respiração aeróbia e anaeróbia permite que a S. Typhimurium se expanda no intestino inflamado, consumindo 1,2-propanodiol derivado da microbiota, produzido durante a fermentação da fucose ou ramnose (Figura 9). A utilização desse subproduto promove para S. Typhimurium uma vantagem na competição nutricional com a microbiota que permite impulsionar sua expansão no lúmen intestinal (FABER; THIENNIMITR; SPIGA; BYNDLOSS et al., 2017). 66 Conclusão Com os resultados obtidos é possível concluir que os açúcares e disponibilidade de nutrientes intestinais podem modular a expressão do operon visP/ygiV. Este operon apresenta dois promotores e ambos mostraram significativas alterações no padrão de expressão na presença de alguns dos açúcares em determinadas condições. Por outro lado, não foi observado nenhuma diferença em relação aos fenótipos de crescimento e sobrevivência das linhagens ΔvisP e WT nessas condições testadas para a expressão. Provavelmente, as proteínas YgiV e VisP tenham uma participação alguma atividade da virulência ou em relação à estresse em S. Typhimurium, visto que seus genes são codificados no mesmo operon, portanto cotranscritos. Porém, são necessários mais estudos para elucidar a completa relação destas proteínas. Quanto ao transcriptoma da linhagem mutante ΔvisP, podemos concluir que esse gene é de grande importância para a S. Typhimurium, visto o expressivo número de transcritos diferencialmente expressos que foi apresentado no presente estudo. Dentre estes destacamos os relacionados ao mecanismo de invasão e relacionados a via de degradação de 1,2 propanodiol. A expressão dos genes do operon pdu apresentam perfis distintos dependendo da condição testada. Assim como os genes relacionados ao mecanismo de invasão. E, o uso de fucose como única fonte de carbono parece ter um papel regulador nessas vias. Porém, não é possível afimar até o momento qual a relação entre a proteína periplasmática VisP e a via de degradação de 1,2-PD ou de outro metabólito, bem como a utilização de fucose e o mecanismo de invasão desse patógeno. A ausência de VisP reduz a expressão dos genes de invasão, na condição com LB em aerobiose, mas esse perfil de expressão é alterado dependendo da condição testada, indicando que a mudança na disponibilidade de oxigênio e nutrientes possui importante papel na regulação desses genes. Ainda, na ausência de VisP a presença de 1,2 PD como fonte de carbono/nutriente reduz a capacidade de invasão de S. Typhimurium. Em suma, nossos resultados destacam a importância da proteína VisP para processos metabólicos essenciais de S. Typhimurium, para que esse patógeno 67 sobreviva as diferentes disponibilidades de nutrientes encontradas no lúmen intestinal, adapte-se durante o processo infeccioso e obtenha vantagens essenciais na competição com a microbiota intestinal. O mecanismo completo de VisP durante a infecção por S. Typhimurium deve incluir a proteína reguladora YgiV e todos os meandros regulatórios aqui explorados para total compreensão deste complexo sistema, ainda correlacionado com o sistema de 2-componentes QseBC. 68 REFERÊNCIAS ALTIER, C. Genetic and environmental control of Salmonella invasion. J Microbiol, v. 43 Spec No, p. 85-92, Feb 2005. ALTIER, C.; SUYEMOTO, M.; LAWHON, S. D. Regulation of Salmonella enterica serovar typhimurium invasion genes by csrA. Infect Immun, v. 68, n. 12, p. 6790- 6797, Dec 2000. ANDERS, S.; PYL, P. T.; HUBER, W. 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