UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE QUÍMICA DE ARARAQUARA Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia WILQUER CASTRO LAURINDO Avaliação do potencial vacinal de derivados de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral Araraquara 2021 WILQUER CASTRO LAURINDO Avaliação do potencial vacinal de derivados de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Profª Drª Márcia Graminha Coorientadora: Profª Drª Danielle Pedrolli Araraquara 2021 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA L384a Laurindo, Wilquer Castro Avaliação do potencial vacinal de derivados de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral / Wilquer Castro Laurindo. – Araraquara : [s.n.], 2021 97 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Márcia Aparecida Silva Graminha Coorientador: Danielle Biscaro Pedrolli 1. Doenças negligenciadas. 2. Peptídeos. 3. Vacinação. 4. Imunização. 5. Tripanossomatídeo. I. Título. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: “Avaliação do potencial vacinal de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral” AUTOR: WILQUER CASTRO LAURINDO ORIENTADORA: MÁRCIA APARECIDA SILVA GRAMINHA COORIENTADORA: DANIELLE BISCARO PEDROLLI Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em BIOTECNOLOGIA, pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. MARCIA APARECIDA SILVA GRAMINHA (Participação Virtual) Departamento de Analises Clinicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP Araraquara Prof. Dr. PAULO LEE HO (Participação Virtual) Centro de Biotecnologia / Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo - Instituto Butantan - São Paulo Profa. Dra. ROSANGELA ZACARIAS MACHADO (Participação Virtual) Departamento de Patologia Veterinária / Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal Araraquara, 24 de setembro de 2021 Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. DADOS CURRICULARES Nome: Wilquer Castro Laurindo Filiação: José Anatólio Laurindo e Maria Aparecida Castro Laurindo Nascimento: 19/01/1995 - Timóteo - MG Endereço Profissional: Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Tripanossomatídeos (LabBioqBioMolTrip), Departamento de Análises Clínicas da FCF-UNESP. Endereço: Rodovia Araraquara-Jaú, Km 01, Campus Ville, S/N, Araraquara SP. CEP: 14800-903 email: w.laurindo@unesp.br Formação Acadêmica: 2013 - 2018 Graduação: Bacharel em Engenharia de Bioprocessos. Instituição: Universidade Federal de São João del-Rei, Campus de Alto Paraopeba, Ouro Branco - MG. 2019 - 2021 Mestrado: Biotecnologia, Área de concentração: Biotecnologia Celular e Molecular Instituição: Instituto de Química (IQ) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Araraquara - SP. Dissertação: Avaliação do potencial vacinal de derivados de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral Orientadora: Profª Drª Marcia Graminha. Coorientadora: Profª Drª Danielle Pedrolli Bolsa: CAPES Produção bibliográfica: Trabalhos publicados em eventos: Clementino, L.C.C.; Teixeira, T.R., Santos, G. S.; Laurindo, W.C.; Debonsi, H. M.; Colepicolo, P.; Graminha, M.A.S. Endophytic fungi of brown Antarctic macroalgae: Identification of antileishmanial metabolities and its possible molecular target. Apresentação oral no VII REDEALGAS Workshop, Biotechnology for Wellness. Arraial do Cabo, Rio de Janeiro. 2019. mailto:w.laurindo@unesp.br Laurindo, W.C.; Fuentes, D.L.P.; Pedrolli, D.B.; Graminha, M.A.S. Mapeamento de epítopos, in sílico, de uma proteína hipotética de Leishmania infantum para o desenvolvimento de uma vacina peptídica. Apresentação oral no I BiotecFarma. Araraquara, São Paulo. 2020. Participação em reuniões científicas e cursos de curta duração: Minicurso: Fundamentos de qPCR para análise de expressão gênica e quantificação de carga viral. 19 a 22 de maio. Ministrada pela Msc. Mariana Marchi Santoni Biasioli na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” com carga horária de 30 horas. 2020. Congresso Biotecnologia Brasil, 24 a 28 de agosto. Movimento Biotecnologia Brasil Evento Online com carga horária de 15 horas. 2020. I Semana de Proteômica e Bioquímica de Proteínas, 10 a 14 de agosto. Universidade Federal de Viçosa. Evento Online com carga horária de 10 horas. 2020. Minicurso: Desenho de proteínas sintéticas aplicadas no diagnóstico imunológico, realizado durante a I Semana de Proteômica e Bioquímica de Proteínas. Universidade Federal de Viçosa. Evento Online com carga horária de 10 horas. 2020. Minicurso: Sequenciamento de Sanger, 5 a 8 de abril. Ministrada pela Msc. Mariana Marchi Santoni Biasioli na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” com carga horária de 8 horas. 2021. Webinar Corporate Venture, 24 de junho. Agência de Inovação da Unicamp. Evento Online com carga horária de 2 horas. 2021. Workshop Mecanismos Moleculares de Ação de Drogas Tripanocidas, 8 e 9 de setembro pelo Instituo Oswaldo Cruz. Evento Online com carga horária de 11 horas. Agradecimentos Primeiramente, agradeço a Deus por me dar forças para prosseguir minha jornada. Quero citar um hino da igreja que reflete o que eu sinto neste momento: “Cantarei quando a dor chegar, quando sorrir; Cantarei quando eu vacilar, cantarei só a ti; Cantarei pois me erguerás, com Tua mão”, só ele é capaz de me erguer, me por de pé seja no momento que for. Agradeço à minha família, em especial aos meus pais por sempre me aconselhar, orientar e me apoiar em Tudo! Ainda quero agradecer a mim mesmo, pois eu trabalhei... como trabalhei!! Eu olho para trás e não sei como consegui percorrer todo esse caminho, não foi fácil, mas eu consegui! Agradeço à Professora Drª. Márcia Graminha por ter me aceitado como aluno, um menino lá do interior de MG, do qual ela nunca havia ouvido falar. Agradeço por ter confiado este projeto a mim, por ter investido em mim, mas principalmente pelo incentivo e paciência ao longo desses dois anos e meio. Aprendi muito! E levarei todos os aprendizados sempre comigo. Agradeço ao Dr. Deivys Leandro Portuondo Fuentes por ter tido a paciência durante todo o tempo que realizamos experimentos juntos, pelos ensinamentos e orientações, além, de me ensinar a realizar aplicação via subcutânea, já que eu “tinha” certo medo em manipular os camundongos. Agradeço à Professora Drª Danielle Pedrolli que conseguiu me passar muito conhecimento num curto período de tempo. Também por todo o investimento feito. Ainda, aos alunos da professora: Gabriela, Milca, Gracy, Nathan e Rafael, e ao Laboratório de Enzimologia do Departamento de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Agradeço ao Professor Dr. Eduardo Maffud por gentilmente permitir que eu realizasse as sínteses em seu laboratório. Também por todo o investimento feito. Ainda, aos alunos do professor e ao Laboratório de Síntese e Estudos de Biomoléculas. Agradeço à Mariana Marchi Santoni, Técnica do Laboratório de Análises Biomoleculares – Multiusuários da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Unesp, pelos sequenciamentos realizados. Agradeço ao João Luiz Bronzel Junior, Técnico do Núcleo de Bioensaios, Biosíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais – Instituto de Química, Unesp pelas análises de espectrometria de massas. Agradeço às minhas amigas: Raissa, Camila, Priscila e Tatiana que me aturam por vários anos! Elas que sempre me escutam reclamar ou falar de alguma série coreana mesmo que não assistam e que gostam de uma fofoca edificante. Além disso, muito importante, à Raissa por compartilhar do mesmo gosto por Reality Show, à Camila por discutir comigo teorias do universo Marvel (que a Raissa não aguenta mais ouvir falar), à Priscila que mesmo ocupada, sei que está sempre observando e à Tatiana pelas discussões sobre a vida dos famosos e pelas receitas compartilhadas. Agradeço aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Tripanossomatídeos da FCF-UNESP: ao Leandro por ter me passado seu conhecimento de Biologia Molecular e ainda me aconselhar durante todos esses anos. À Natália por me ensinar a arte da síntese, sem você não conseguiria terminar esse projeto. À Michele por ter se disposto a me ajudar na determinação da carga parasitária e por ter se tornado minha amiga para toda hora. À Juliane por ser minha parceira de “biomol”, apesar de nossos projetos não serem correlatos, pelos conselhos e pela sinceridade. À Angela pelo conhecimento compartilhado e pelo investimento feito neste projeto. À Eduarda por ser quase uma irmã, “a irmã perdida em Araraquara”. À Maricely pelo carinho e preocupação, já que eu sou o próprio “irmão da Elsa”. À Alessandra que mesmo sendo “na dela” sempre foi carinhosa. E ao Gabriel, a.k.a. “a gata”, pela alegria contagiante. A todos pelo apoio, momentos de descontração e convívio Agradeço às meninas da Limpeza: Rose, Andrea, Vitória e Samira. E às meninas da portaria do DAC: Rosemira e Viviane, por sempre nos receber com um sorriso no rosto e uma boa conversa para começar bem o dia; Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Instituto de Química da UNESP de Araraquara, assim como, aos funcionários deste Instituto de Química e da Seção Tecnica de Pós Graduação: Wênia e Robson; O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoas de Nível Superior – Brasil (CAPES) – 88887.341829/2019-00; Agradeço à FAPESP pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho: Processo nº 2017/03552-5, nº 2016/06931-4 e INCT 2014/50926-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo; RESUMO A Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) é o principal agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, sendo os cães reservatórios do parasita. Como casos caninos, geralmente, precedem casos humanos, é importante o controle da doença na população canina. Considerando que há poucas opções de controle, tanto por via terapêutica quanto por medidas sanitárias (combate ao vetor ou população canina afetada), é importante o desenvolvimento de novas drogas ou vacinas para um controle efetivo dessa parasitose. Duas proteínas hipotéticas de L. infantum, denominadas LC36 e LC06, anteriormente caracterizadas quanto às suas propriedades antigênicas pelo nosso grupo de pesquisa, foram alvos de estudo deste trabalho. Inicialmente, investiu-se na tentativa de produção destas proteínas nos sistemas de expressão heterólogos Bacillus subtilis ou Escherichia coli. Para isso, realizou-se a clonagem da ORF lc36 em vetores de expressão adequados, como pBS0EXylRPxulA_V2-[RFP] para indução da expressão em B. subtilis (KO7 e Δ6) e pMAL-p5x para expressão, em E. coli, da proteína fusionada à "Proteína ligadora de maltose", com o intuito de diminuir problemas de solubilização. Devido às dificuldades experimentais, partiu-se para a síntese de peptídeos. Para LC36, após mapeamento in sílico visando a predição de epítopos ligantes para linfócitos B, sintetizou-se com sucesso o peptídeo WC2025 e, para LC06, investiu-se na síntese do peptídeo EV0410, previamente caracterizado quanto às suas propriedades antigênicas. Estes peptídeos foram analisados em relação a sua capacidade de elicitar uma resposta humoral e proteção em camundongos BALB/c desafiados com o parasita L. infantum. Os peptídeos foram administrados por via subcutânea com três doses (dias 0, 14 e 21) da formulação vacinal, tendo como adjuvante a saponina. No 28° dia, metade dos animais foram eutanasiados para as análises de resposta humoral e o restante, infectados com L. infantum. Quinze dias após a infecção, determinou-se a carga parasitária destes animais. Verificou-se a presença, predominantemente, de IgG1 e, também, de IgG2a em menor nível. A carga parasitária nos animais que receberam a vacina foi, significativamente, menor que nos grupos controle, com redução de 37,8 % no fígado e 27,6 % no baço. Paralelamente, avaliou-se, em um ensaio de desafio, o potencial protetor do soro dos animais imunizados com os peptídeos (imunização passiva), sendo observada redução de ~40% na carga parasitária no fígado e no baço dos animais que receberam este soro. Esses resultados são promissores e abrem novas perspectivas de investigação destes peptídeos em outras formulações e a possibilidade de se explorar a via da imunoterapia. Palavras Chave: Leishmaniose visceral; Peptídeos imunológicos; Vacina; Peptídeos sintéticos; Vacina peptídica. ABSTRACT Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) is the etiological agent of visceral leishmaniasis in the Americas, and dogs are reservoirs of the parasite. Since canine cases often precede human cases, it is important to control the disease in the canine population. Considering that there are few control options, either therapeutically or by sanitary and phytosanitary measures (vector’s elimination or control of infected canine population), it is important to develop new drugs and vaccines for an effective control of this parasitic disease. Two L. infantum hypothetical proteins, LC36 and LC06, which were previously evaluated regarding their antigenicity properties were investigated about their potential immunogenicity. Initially, due to experimental difficulties to produce these two proteins using the heterologous expression systems Bacillus subtilis and Escherichia coli, the strategy of peptide chemical synthesis was adopted. After in silico mapping of LC36 epitopes for B cells, a peptide, the WC2025, was successfully synthesized as well as the peptide EV0410 derived from LC06 that has its immunoreactivity against sera from L. infantum - infected dogs successfully demonstrated, was also synthesized. These peptides were investigated for their ability to elicit a humoral response and protection in BALB/c immunized mice, soon after challenged with L. infantum parasites. A combination of WC2025 and EV0410, and saponin as adjuvant, were subcutaneously administered (Days 0, 14 and 21). At day 28 post immunization, half of mice were euthanized and the collected sera analyzed for humoral response development, which was observed predominantly the presence of high levels IgG1 and low levels of IgG2a. The other group of animals were challenged with L. infantum. promastigotes and after fifteen days post-infection, parasite load determination in the liver and the spleen showed a significant parasite reduction in the immunized animal for both liver (37.8%) and spleen (27.6%). At the same time, the vaccinated animals’ serum was inoculated in healthy mice and 48hs later, infected with L. infantum. It was observed a ~40% reduction in the parasite load in both liver and spleen. The results herein presented are original and open up new perspectives for the evaluation of new formulations containing these peptides combined or not with other epitopes as well as the use of other adjuvants to burst the immune response. It is also important to emphasize the new perspective to gain the path of immunotherapy considering the success of the passive immunization herein obtained. Keywords: Visceral leishmaniasis; Immune peptides; Vaccine; Synthetic peptides; Peptide-based vaccine. 1 INTRODUÇÃO 11 1.1 Leishmanioses 11 1.2 A resposta imune nas leishmanioses 13 1.3 Vacinas e leishmaniose 14 1.4 Vacinas de peptídeos 17 1.5 Vacinas para cães 19 2 OBJETIVO 20 3 MATERIAL E MÉTODOS 21 3.1 Animais 21 3.2 Linhagens de L. infantum 21 3.3 Linhagens de bactérias 21 3.4 Meios de cultura 22 3.5 Sequências 23 3.6 Extração de DNA genômico (gDNA) 23 3.7 Amplificação de DNA 23 3.8 Manipulação de DNA 25 3.9 Transformação bacteriana 25 3.10 Extração de DNA plasmidial (pDNA) 26 3.11 Sequenciamento 27 3.12 PCR de colônia 27 3.13 Expressão de proteínas recombinantes 27 3.14 Extração de proteína 27 3.15 Western Blot 28 3.16 Obtenção do EV0410 para clonagem 28 3.17 Predição de epítopos para células B 29 3.18 Síntese de peptídeos 29 3.19 Reação de clivagem dos peptídeos 30 3.20 Purificação e caracterização dos peptídeos 30 3.21 Ensaio de Imunização e Imunoproteção 31 3.22 Obtenção do soro dos camundongos 31 3.23 Imunização passiva 31 3.24 Resposta humoral 32 3.25 Quantificação da cara parasitária 32 3.26 Análise estatística 33 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 4.1 Um fragmento de 2396pb contendo toda a ORF lc36 foi clonada no vetor pBS0EXylRPxylA_V2 34 4.2 A fusão de Maltose Binding Protein na porção amino terminal da LC36 não contribuiu para sua expressão em E coli ou em B. subtilis 39 4.3 Fragmento de 774pb da ORF lc36 foi clonada em pMAL-p5x para expressão em E. coli 46 4.4 Ampliação ORF lc06 para clonagem e expressão nos sistemas heterólogos B. subtillis e E. coli 49 4.5 Mapeamento e síntese em fase sólida de peptídeos ligantes de linfócitos B 52 4.6 Imunização de camundongos BALB/c com uma mistura dos peptídeos EV0410 e WC2025 61 4.6.1 Resposta humoral 62 4.6.2 Carga Parasitária 67 4.7 Imunização passiva 70 5 CONCLUSÃO 71 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72 ANEXO 87 APÊNDICE A — Aprovação do comitê de Ética 97 11 1 INTRODUÇÃO 1.1 Leishmanioses Endêmica em 98 países, sobretudo, nas regiões tropicais e subtropicais do globo, as leishmanioses são um conjunto de doenças parasitárias causadas por pelo menos vinte espécies diferentes de Leishmania (ALVAR; VELEZ; BERN; HERRERO et al., 2012; ORGANIZATION, 2010). Por afetar, principalmente, pessoas de baixo nível socioeconômico e consequentemente, atrair poucos investimentos do setor farmacêutico, além de não ser politicamente reconhecida e priorizada, essa parasitose tornou-se um fardo para a saúde mundial (JAIN; JAIN, 2015; MONGUI; PÉREZ-LLANOS; YAMAMOTO; LOZANO et al., 2015). A disseminação da doença ocorre durante o repasto sanguíneo da fêmea do flebotomíneo, popularmente conhecido como mosquito palha, para o desenvolvimento dos ovos (KILLICK-KENDRICK, 1999). Neste processo, formas promastigotas presentes no tubo digestivo do inseto são inoculadas no local da picada. Estes parasitas são fagocitados por células do sistema fagocítico mononuclear, especialmente os macrófagos, onde ocorre a diferenciação em amastigotas (GONTIJO; DE CARVALHO, 2003; SRIVASTAVA; SHANKAR; MISHRA; SINGH, 2016). O tipo de manifestação clínica é consequência de diferentes fatores, como o grau de patogenicidade e infectividade da espécie; e genética, idade e resposta imune do hospedeiro mamífero (MURRAY; BERMAN; DAVIES; SARAVIA, 2005). Por outro lado, existem indivíduos que, naturalmente, apresentam resistência à infecção por Leishmania spp. e não apresentam sintomas (SILVEIRA; LAINSON; CORBETT, 2004). Há três formas predominantes da doença: a mais comum é a leishmaniose cutânea (LC), manifestada pela formação de lesões na pele; a leishmaniose mucocutânea (LMC), que afeta as regiões de mucosa; e a leishmaniose visceral (LV), forma mais grave da doença, caracterizada por febre, anemia e hepatoesplenomegalia (aumento demasiado do fígado e baço), que pode ser fatal se não tratada (HAILU; DAGNE; BOELAERT, 2016). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) (2021a), estima-se que o número de novos casos da LV esteja entre 50.000 e 90.000 por ano. A baixa disponibilidade de fármacos, elevada toxicidade e eficácia reduzida, torna o tratamento longe de ser o ideal (LAMOTTE; SPATH; RACHIDI; PRINA, 2017). Em 2019, 90% dos casos de LV relatados no mundo ocorreram em dez países, incluindo o Brasil (ORGANIZATION, 2021b). Além 12 disso,, Segundo o Informe Epidemiológico das Américas (2020), de todos os casos relatados na América Latina, 97 % deles ocorreram no Brasil. A doença, anteriormente considerada como tipicamente rural, agora passa por um processo de urbanização causado por grandes desmatamentos e migrações humanas (CARNEIRO CASTRO COSTA; MORALEJO BERMUDI; COLEBRUSCO RODAS; NUNES et al., 2018). Além das contribuições humanas para a propagação e urbanização da doença, ainda é importante considerar o papel epidemiológico dos cães na cadeia de transmissão da LV, em que os cães domésticos apresentam-se como reservatórios do parasita, tanto nas áreas urbanas como nas periurbanas (SOLANO-GALLEGO; CARDOSO; PENNISI; PETERSEN et al., 2017). Assim como em humanos, a infecção em cães por Leishmania não obrigatoriamente levará ao aparecimento de sintomas, pois esses animais podem permanecer assintomáticos por longos períodos de tempo ou nunca apresentar sinais clínicos (SOLANO- GALLEGO; MIRÓ; KOUTINAS; CARDOSO et al., 2011). Segundo Esteva et al. (2017), um em cada cinco cães infectados, nas regiões endêmicas, não manifestam a doença, além de existirem coinfecções que mascaram os sintomas da LV nesses animais, dificultando o diagnóstico (CHIN, 2000) e, consequentemente, o controle da doença. Desta forma, a OMS, entre outas ações, preconiza o uso de profilaxia nos animais como medida de proteção contra a doença. (ORGANIZATION, 1982). Como medidas de controle, no Brasil, o Ministério da Saúde destaca o diagnóstico, o tratamento precoce dos indivíduos doentes, bem como o uso de coleiras impregnadas com inseticidas em cães e, finalmente, o combate ao vetor. Entretanto a efetividade destas ações é ainda limitada (CARNEIRO CASTRO COSTA; MORALEJO BERMUDI; COLEBRUSCO RODAS; NUNES et al., 2018). Para o tratamento de cães no Brasil, apenas em 2016 o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento autorizou o uso da miltefosina, algo que já é feito na Europa desde 2002. O uso da eutanásia, porém, ainda é recomendado, principalmente, para os animais de rua, pelo bem estar do animal, e dependendo das condições financeiras do dono para a realização do tratamento (BRASIL, 2016; COSTA; CODEÇO; BERMUDI; RODAS et al., 2020; DOS SANTOS NOGUEIRA; AVINO; GALVIS- OVALLOS; PEREIRA-CHIOCCOLA et al., 2019), o qual apresenta custo elevado, podendo alcançar o valor médio de R$ 2000,00 (tratamento completo), considerando um animal de médio porte (30 a 40kg). Desta forma, tendo em mente que a doença acomete, principalmente, pessoas de baixa renda e as dificuldades inerentes ao próprio tratamento, a vacinação torna-se 13 mais uma alternativa essencial para o combate à doença, o que pode ser estendido aos cães como uma forma mais econômica de controle da infecção na população canina, consequentemente, diminuindo a dispersão da doença na população humana. Para isso, é importante conhecer os aspectos imunológicos da infecção para o desenvolvimento de vacinas. 1.2 A resposta imune nas leishmanioses Em infecções causadas por Leishmania, para que um hospedeiro seja capaz de resolver a infecção, é necessário que ele consiga ativar tanto o sistema imune inato quanto o adquirido. Embora o primeiro seja o agente efetor da ação leishmanicida, é por meio do estímulo do segundo que ele consegue ser ativado (SHARMA; SINGH, 2009; TSAGOZIS; KARAGOUNI; DOTSIKA, 2005). A resposta imune baseada em linfócitos Th1 é considerada necessária para se combater as leishmanioses, pois essas células produzem IFN-γ, TNF-α e IL- 12 que auxiliam na ativação de macrófagos. Belosevic et al. (1989) conseguiram transformar camundongos, inicialmente resistentes à infecção, em animais susceptíveis pela neutralização do IFN-γ com anticorpos. O mesmo foi observado ao inativar o gene codificador do IFN-γ, favorecendo o desenvolvimento de resposta Th2 em camundongos (WANG; REINER; ZHENG; DALTON et al., 1994), tornando-os susceptíveis à infecção via produção de citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 (AWASTHI; MATHUR; SAHA, 2004). Analisando a progressão da infecção por L. major em BALB/c, Locksley et al. (1987) observaram a produção de IL-4, enquanto C57BL/6 apresentou produção de INF- γ, mas não IL-4, o que segundo os autores justificaria a resistência à infecção por esse animal. Outros autores demonstraram que a diferença de susceptibilidade entre estas duas linhagens de camundongos estão ligadas à produção de IL-12 pelas células dendríticas e à reatividade das células T à essa citocina. Enquanto em BALB/c a produção de IL-12 é menor, além de apresentar linfócitos T pouco responsivos a ela, o oposto é observado na linhagem resistente C57BL/6 (HIMMELRICH; PARRA-LOPEZ; TACCHINI-COTTIER; LOUIS et al., 1998; LOUIS; HIMMELRICH; PARRA-LOPEZ; TACCHINI-COTTIER et al., 1998; LOUIS; CONCEIÇAO-SILVA; HIMMELRICH; TACCHINI-COTTIER et al., 1998). A citocina IL-10, identificada em amostras de pacientes com LV ativa (BELKAID; HOFFMANN; MENDEZ; KAMHAWI et al., 2001; GOTO; LINDOSO, 2004; MURPHY; WILLE; VILLEGAS; HUNTER et al., 2001), apresenta como mecanismo de ação a supressão da produção de IFN-γ, favorecendo a resposta Th2 e, consequentemente, o parasita 14 numa batalha injusta (GHALIB; WHITTLE; KUBIN; HASHIM et al., 1995; NYLÉN; MAURYA; EIDSMO; MANANDHAR et al., 2007). Apesar de o curso da infecção, geralmente, recair sobre os linfócitos T auxiliares (CD4+), os linfócitos T citotóxicos (CD8+) também podem ter participação neste processo (HOLADAY; SADICK; WANG; REINER et al., 1991; NYLÉN; GAUTAM, 2010), como descrito por Belkaid et al. (2002) e Stern et al. (1988), que também demonstraram a participação de células CD8+ no controle tanto da LC quanto da LV. Tsagozis et al. (2003) identificaram uma ação dual dos linfócitos CD8+ em modelo experimental de camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum, os quais atuaram tanto produzindo citocinas IFN-γ e TNF-α quanto elevando a atividade citotóxica. Quanto aos linfócitos B, sua atuação está ligada à interação com os linfócitos T auxiliares, agindo como células apresentadoras de antígeno nos estágios iniciais da resposta imune, como mecanismo facilitador da sua própria ativação e diferenciação. Dessa forma, essa interação contribui para a produção de citocinas e outros fatores que facilitam a polarização para a resposta Th1 ou Th2 (CRAWFORD; MACLEOD; SCHUMACHER; CORLETT et al., 2006; RODRIGUEZ-PINTO, 2005). No entanto, apesar de alguns autores afirmarem que o papel dos anticorpos na proteção contra leishmaniose ainda não é certo (BROWN; REINER, 1999; CALDAS; FAVALI; AQUINO; VINHAS et al., 2005; DEAK; JAYAKUMAR; CHO; GOLDSMITH-PESTANA et al., 2010), sua participação na proteção não pode ser excluída, já que pessoas soropositivas e moradoras de áreas endêmicas são mais resistentes para desenvolver a doença novamente (COSTA; STEWART; GOMES; GARCEZ et al., 2002). De fato, em um estudo desenvolvido em Bihar, na Índia, de um grupo de 33% de pessoas soropositivas para LV, apenas 3,5% desenvolveram a doença (OSTYN; GIDWANI; KHANAL; PICADO et al., 2011). Além disso, Scott (1986) e Woelbing (2006) observaram o favorecimento da leishmaniose cutânea, causada por L. major, ao tratar animais resistentes C3H/HeN e C57BL/6 com anticorpos anti-IgM e pela deleção do gene para cadeia pesada dos anticorpos. Ambos observaram a dependência dos linfócitos T das células B para ativação, havendo, inclusive, redução na produção de IFN-γ. 1.3 Vacinas e leishmaniose A vacinação visa a redução da morbimortalidade de doenças e ajuda na diminuição da circulação de patógenos, consequentemente, é uma ferramenta muito eficaz para o controle de doenças (BARBIERI; COUTO; AITH, 2017). Ao se tratar das leishmanioses, as 15 pesquisas com vacinas se fundamentam na proteção contra a reinfecção após a resolução da infecção (ALVAR; CROFT; KAYE; KHAMESIPOUR et al., 2013; BEAUMIER; GILLESPIE; HOTEZ; BOTTAZZI, 2013). Desta forma, por anos, diversas pesquisas foram conduzidas com o propósito de desenvolver uma vacina capaz de apresentar proteção contra a infecção por Leishmania. A primeira geração de vacinas envolveu o uso de Leishmania viva e virulenta na formulação. Essas metodologias, conhecidas como leishmunização, são datadas desde 1911 e foram utilizadas por mais de 60 anos (SALJOUGHIAN; TAHERI; RAFATI, 2014). A leishmunização foi abandonada ao longo dos anos para dar espaço a outras formas de imunização mais seguras. O uso de patógenos atenuados foi, a seguir, outra estratégia adotada. Essa atenuação pode ser realizada via ação física (temperatura e irradiação), química (compostos mutagênicos, antibiótico) ou genética (cultivo por longas passagens ou manipulação genética), enquanto a obtenção do patógeno morto, por autoclavagem, pasteurização ou rompimento por merthiolate ou fenol (NAGILL; KAUR, 2011; SALJOUGHIAN; TAHERI; RAFATI, 2014). Bruhn et al. (2012) utilizaram L. infantum atenuada por processos físicos para imunizar camundongos, os quais mostraram-se parcialmente protegidos contra posterior desafio. Resultado semelhante foi observado por Anand & Madhubada (2015) ao modificar, geneticamente, L. donovani, tornando-a deficiente para a enzima arabino-1,4-lactone oxidase ligada à síntese de ácido ascórbico. Os animais imunizados e, posteriormente, desafiados, apresentaram redução significativa na carga parasitária (90%) e produziram uma resposta Th1. Fiuza et al. (2015) ), por uma abordagem genética, deletou o gene da centrina de L. donovani e demonstrou as propriedades imunogênicas desta cepa em Beagles, os quais produziram citocinas IL-12 e IFN-γ associadas a elevados níveis de IgG2a. É interessante destacar que Zhang e colaboradores (2020) geraram uma linhagem de L. major também geneticamente modificada para o gene da centrina, porém, utilizando a ferramenta de edição gênica CRISPR-CAS9 para produzir células nocauteadas sem carregar marcadores de resistência a drogas comuns neste tipo de abordagem, possibilitando a aplicação futura desta estratégia de leishmanização em ensaios clínicos em humanos. Já as vacinas de segunda geração, compreendem frações purificadas de extrato de Leishmania ou subunidades do parasita, podendo ser peptídeos/proteínas recombinantes ou sintéticos (DAS; ALI, 2012). A aplicação da tecnologia do DNA recombinante permitiu superar problemas de segurança relacionados às vacinas de primeira 16 geração (virulência em hospedeiros susceptíveis e a reversão da atenuação) (NASCIMENTO; LEITE, 2012), assim como a possibilidade de trabalhar com uma ou mais proteínas expressas nos estágios dos patógenos relevantes para o desenvolvimento da infecção (JOSHI; RAWAT; YADAV; KUMAR et al., 2014). O primeiro antígeno recombinante testado foi a glicoproteína GP63, altamente conservada entre as diferentes espécies de Leishmania, a qual gerou um efeito protetor tanto para LV quanto para LC quando utilizada em sua forma nativa. Entretanto, a sua forma recombinante produzida em Escherichia coli não foi capaz de gerar a mesma resposta (BHOWMICK; RAVINDRAN; ALI, 2008; HANDMAN; BUTTON; MCMASTER, 1990; KAHL; LELCHUK; SCOTT; BEESLEY, 1990), embora estudos posteriores mostraram resultados mais promissores com a forma recombinante da GP63, obtidos pela mudança na via de administração do antígeno e do adjuvante utilizado (ABDELHAK; LOUZIR; TIMM; BLEL et al., 1995; JAAFARI; BADIEE; KHAMESIPOUR; SAMIEI et al., 2007; JAAFARI; GHAFARIAN; FARROKH-GISOUR; SAMIEI et al., 2006; MAZUMDER; MAJI; DAS; ALI, 2011). Kumar et al. (2010) testaram as proteínas KPM11, A2, CPB, K26/HASPB, NH e SMT de L. infantum como alvo vacinal. Das seis proteínas, apenas A2 e KPM11 tiveram baixa eficiência na redução da carga parasitária em camundongos, apesar de aproteína A2 ter sido capaz de estimular a produção de IFN-γ. A proteína A2 presente no retículo endoplasmático de várias espécies de Leishmania é alvo de estudo desde o início dos anos 2000 (MCCALL; MATLASHEWSKI, 2010). Oliveira et al (2011) também mostraram a presença de outros alelos deste gene. Ghosh et al. (2001) e Celho et al.(2003) demonstraram a capacidade da A2 em induzir resposta Th1 para o controle de infecções causadas por L. donovani ou L. amazonensis, assim como a produção de IFN-γ e resposta humoral consistente. No Brasil, estudos com a A2 foram realizados por Fernandes et al. (2008) ao investigar a imunogenicidade desta proteína, usando saponina como adjuvante no controle da LV. Tal trabalho resultou na vacina Leish-Tec®, que provou ter aumento na produção de IFN-γ em cães e redução de IL-10 (FERNANDES; COELHO; MACHADO-COELHO; GRIMALDI et al., 2012). Maroof et al. (2012) propuseram o desenvolvimento de uma vacina para LV, usando com sucesso adenovírus como vetor para "delivery" de fragmentos das proteínas KMP11 e HASPB, sendo esta última associada à produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10. Posteriormente, Cecílio et al. (2017) estimularam células da medula óssea de pacientes de 17 regiões endêmicas para LV com infecção ativa ou curados com as proteínas KMP11 e LeishF3, verificando maior produção de IFN-γ, TNF-α e IL-10 após o estímulo com KMP11. Entretanto, após imunização de BALB/c com essas proteínas, houve resposta imune apenas contra a proteína LeishF3, não havendo produção de anticorpos contra KMP11, demonstrando que, apesar de ser reconhecida por células que já estiveram em contato com Leishmania, a proteína por si só não é capaz de elicitar uma resposta imunológica eficaz. Sendo assim, torna-se importante buscar alternativas, como outros adjuvantes para impulsionar a resposta imune. Ainda dentro da segunda geração de vacinas, há a estratégia da imunoproteômica em identificar novas proteínas, cuja função e características ainda não foram estudadas (proteínas hipotéticas), como possíveis antígenos vacinais (COELHO; OLIVEIRA; VALADARES; CHÁVEZ-FUMAGALLI et al., 2012). Lage et al. (2016) utilizaram proteína hipotética específica de L. infantum (LiHyD) na imunização de camundongos BALB/c tendo como adjuvante saponina de Quillaja saponária. Os animais imunizados apresentaram resposta Th1, com aumento na produção de IFN-γ e IL-12, mas baixos níveis de IL-4 e IL-10. Para a avaliação daproteção cruzada, os animais foram desafiados com L. braziliensis e L. major, apresentando redução significativa da carga parasitária para as duas infecções, além de redução no inchaço na pata destes. Curiosamente, Duarte et al. (2016) realizou o contrário e avaliou a capacidade de proteção cruzada das proteínas de L. brasiliensis contra a infecção por L. infantum. A proteína EiF5a e a proteína hipotética de L. brasiliensis, LbHyp, foram expressas purificadas e usadas como antígenos em BALB/c, tendo saponina como adjuvante. Observaram-se a polarização da resposta para Th1 com produção maior de IgG2a que IgG1 e aumento na expressão de IL-12 e IFN-γ. Ainda, os grupos imunizados com a combinação das proteínas apresentaram carga parasitária menor que aqueles que receberam apenas uma proteína. Martins et al. (2017) construíram uma proteína recombinante quimérica a partir de epítopos de proteínas LiHyp1, LiHyp6, HRF e LiHyV, anteriormente avaliadas quanto à imunogenicidade e que apresentaram capacidade protetora em camundongos. A quimera causou redução na carga parasitária dos animais imunizados, aumento das citocinas Th1, IL-12, IFN-γ, supressão de IL-4 e IL-10 e significativa presença de IgG2a tanto antes quanto após o desafio. 1.4 Vacina de peptídeos A vacinologia reversa é uma técnica que associa biologia molecular e bioinformática para fazer predições com modelos matemáticos e computacionais, além de 18 possibilitar o desenvolvimento mais estratégico de vacinas, pois a seleção in sílico permite identificar, diretamente, epítopos que são mais prováveis de desenvolver resposta protetora e conseguinte exclusão de sequências desnecessárias (MOXON; RECHE; RAPPUOLI, 2019). As principais vantagens dessa estratégia são sensibilidade, não necessidade de cultivo do patógeno e identificação de qualquer antígeno independentemente da quantidade de material para testes vacinais (DALSASS; BROZZI; MEDINI; RAPPUOLI, 2019). Desta forma, a síntese química de peptídeo torna-se uma ferramenta facilitadora na produção de porções proteicas mínimas. Ela se baseia na formação da ligação peptídica entre o grupo amino e carboxílico de dois aminoácidos permitindo a extensão da sequência por processos repetitivos (MERRIFIELD, 1963). Relatada desde 1903 por Emil Fischer, a síntese química de peptídeo evoluiu, tornando-se vantajosa pelo baixo custo no escalonamento da produção, pela boa reprodutibilidade rapidez, principalmente, através da técnica de síntese em fase sólida, e pela automatização do processo (FISCHER; OTTO, 1903; JOSHI; RAWAT; YADAV; KUMAR et al., 2014; MERRIFIELD, 1963; SKWARCZYNSKI; TOTH, 2016). Quanto às vacinas peptídicas, por serem quimicamente produzidas, os peptídeos podem ser totalmente caracterizados. Assim como uma droga química comum, são, geralmente, solúveis em água, estáveis em condições de armazenamento simples e a estabilidade e pureza podem ser conferidas via técnicas analíticas. Além disso, problemas associados a contaminantes biológicos são removidos, são menos prováveis a induzir respostas alérgicas ou doenças autoimunes, assim como não há risco de integração genética ou recombinação (problema enfrentado por vacinas de DNA) (PURCELL; MCCLUSKEY; ROSSJOHN, 2007; SKWARCZYNSKI; TOTH, 2016). Vijayamahantesh et al. (2017) investigaram a produção de IL-12, IL-2, IFN-γ e IL-10 por PBMC em resposta ao estímulo de cinco imuno-peptídeos selecionados in silico e derivados da enzima 3′-Nucleotidase de L. infantum. Estes foram capazes de estimular a produção de IL-12, IL-2 e IFN-γ nas células e de aumentar a proliferação dos linfócitos T. Outros estudos valeram-se de trabalhos prévios de proteínas já caracterizadas quanto as suas propriedades imunogênicas. De fato, Agallou et al. (2014) identificaram peptídeos derivados de KMP-11, H1, CPA e LeIF, mostrando a capacidade de gerar a proliferação das células do baço, assim como induzir o aumento de IFN-γ. 19 1.5 Vacinas para cães Até 2020, quatro vacinas para cães eram comercializadas no mundo, sendo duas no Brasil (Leishmune® e Leish-Tec®) e duas na Europa (CaniLeish® e LetiFend®). No entanto, a eficiência dessas vacinas continua em análise apesar da comercialização (VELEZ; GALLEGO, 2020). Dentre as vacinas comercializadas no Brasil, a Leishmune®, licenciada em 2004, produzida pela Zoetis, foi retirada do mercado 10 anos após aprovação pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) devido à insuficiência nos dados obtidos pela fase III do estudo clínico, não atendendo aos requisitos da Instrução Normativa Interministerial nº 31 de 09 de julho de 2007 (MAPA, 2019). A vacina Leishmune® possuía em sua formulação a glicoproteína FML (ligante de fucose manose), isolada de L. donovani, que está presente na superfície da Leishmania durante o ciclo celular, além de saponina como adjuvante(DANTAS-TORRES, 2006). A segunda, Leish-Tec®, licenciada em 2007, produzida pelo laboratório Ceva, é atualmente a única vacina disponível para cães na prevenção da LV, composta da proteína recombinante A2 de L. donovani e saponina como adjuvante. Apesar de já estar no mercado, não apresentou eficácia adequada quando avaliada em estudos de campo, implicando na não redução da doença em áreas endêmicas (GRIMALDI; TEVA; DOS-SANTOS; SANTOS et al., 2017; VELEZ; GALLEGO, 2020). Deste modo, diante dos resultados pouco conclusivos sobre a resposta imune protetora das diferentes vacinas de primeira ou segunda gerações apresentadas acima, verifica-se a necessidade de continuar a busca por antígenos capazes de, efetivamente, controlar a doença no hospedeiro mamífero, ao mesmo tempo em que possa atuar como bloqueador da transmissão do reservatório mamífero para o flebotomíneo. Isto posto, este trabalho visa avaliar peptídeos originados de duas proteínas hipotéticas de L. infantum como candidatos à vacina contra a LV, a proteína LC36 (LINF_360049000) e a LC06 (LINF_220009200), cujas características de antigenicidade foram demonstradas, anteriormente, por estudos conduzidos em nosso laboratório (LIMA, 2015b; NOGUEIRA; DEL CISTIA; URBACZEK; JUSI et al., 2018). A análise in sílico baseada no banco de dados Bcipep (SAHA; RAGHAVA, 2006) indicou, como potencial epítopo para células B, uma região contendo os primeiros 256 aminoácidos da proteína LC36, a qual foi expressa em E. coli fusionada a uma cauda de histidina. Apesar da baixa solubilidade da proteína, o que afetou negativamente o rendimento da proteína expressa em E. coli, Nogueira et al.(2018) demonstraram a 20 imunorreatividade deste epítopo em ensaios de ELISA utilizando soro de cães positivos para LV, mostrando boa performance para aplicação no diagnóstico de LV canina (85% de sensibilidade e 71% de especificidade). A proteína LC06 apresenta repetições em tandem, geralmente associadas como alvos de reconhecimento para resposta imune produzida pelos linfócitos B (GOTO; COLER; GUDERIAN; MOHAMATH et al., 2006). Lima (2015), durante o desenvolvimento de seu trabalho de conclusão de curso, utilizou a estratégia de síntese química, visando a obtenção da proteína para os testes de imunorreatividade frente a soros de cães positivos para LV, ao invés de utilizar sistemas de expressão heterólogos, visto que as repetições presentes em LC06 (183 nucleotídeos que se repetem 31 vezes na sequência) dificultaram a etapa de amplificação do gene. Foi obtida, com sucesso, a síntese de dois peptídeos com 20 e 30 resíduos, os quais apresentaram-se imunorreativos em testes de ELISA frente a soros de cães positivos para LV. 2 OBJETIVO Avaliação do potencial imunogênico e protetor das proteínas LC36 e LC06 de L. infantum em estudos pré-clínicos para o desenvolvimento de uma vacina para controle da leishmaniose visceral. Os objetivos específicos do projeto são: • Avaliar estratégias de expressão para produção das proteínas recombinantes LC36 e LC06: o Amplificar e clonar LC36 e LC06 no vetor pMAL-p5x para expressão em fusão com proteína Maltose Binding Protein (MBP) em E. coli; o Amplificar e clonar LC36 e LC06, fusionada ou não à MBP, no vetor pBS0EXylRPxylA_V2 para expressão em diferentes linhagens de B. subtilis; • Síntese química de peptídeos derivados de LC36 e LC06; o LC06: síntese do peptídeo EV0410; o LC36: mapeamento e seleção de epítopos para síntese de peptídeos derivados da proteína LC36; • Identificação e seleção de peptídeos imunogênicos; 21 • Avaliação do potencial imunogênico e protetor de antígenos derivados de LC36 e LC06 utilizando o modelo experimental BALB/c; o Imunização de camundongos com os peptídeos derivados de LC36 e LC06; o Determinação de níveis de IgG específicos e subclasses IgG1 e IgG2a; o Infecção dos camundongos imunizados para realização de ensaio de desafio; o Determinação da carga parasitária. • Avaliação do potencial protetor de anticorpos murino contra L. infantum. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Foram utilizados camundongos BALB/c machos, com cinco a seis semanas de idade, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação na Área de Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB), UNICAMP, Campinas, São Paulo. Grupos de cinco animais foram mantidos em caixas individuais, em grupos de cinco, em condições ambientais estáveis (23°C ± 2°C de temperatura e 56% de umidade relativa do ar) e ciclos claro/escuro de 12 horas. Água e ração foram oferecidas ad libitum. Todos os procedimentos realizados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP (CEUA/FCF/CAr n° 19/2020). 3.2 Linhagens de L. infantum Foram utilizadas as cepas de L. infantum MHOM/BR/1972/LD e MHOM/MA67ITMAP263, gentilmente cedidas pelos Drs. José Angelo Lindoso (Instituto de Medicina Tropical, USP) e André Gustavo Tempone Cardoso (Instituto Adolfo Lutz) e mantidas no Laboratório de Bioquímica e Biologia molecular de Tripanossomatídeos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, Araraquara. 3.3 Linhagens de bactérias As linhagens e os genótipos de E. coli e B. subitilis utilizadas neste estudo estão descritas no quadro abaixo: 22 Quadro 1— Linhagens e genótipos de bactérias. Fonte: Elaborada pelo autor Linhagem Genótipo Referência E. coli TOP10 hsdR, mcRA, lacZΔM15, endA1, recA1 *E. coli genotypes- Open Wet Ware. E. coli BL21(DE3) B F– dcmompThsdS(rB– mB–) galλ(DE3) E. coli BL21 Codon Plus F–ompThsdS (rB–mB–) dcm+TetrgalendAHte [argUproLCamr] E. coli Rosetta F- ompThsdSB(RB- mB-) gal dcmλ(DE3 [lacIlacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) pLysSRARE (Camr) B. subtilis KO7 ΔnprE ΔaprE Δepr Δmpr ΔnprB Δvpr Δbpr Dr. Zeigler, Bacillus Genetic Stock Center B. subtilis Δ6 trpC2 ΔSPβ Δskin ΔPBSX Δproϕ1 Δpks::CmR, Δproϕ3 Westers (2003) * https://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes 3.4 Meios de cultura Schneider completo (Sigma-Aldrich) pH 6,9; suplementado com bicarbonato de sódio 4,7 mmol.L- 1; cloreto de cálcio hidratado 5,5 mmol.L- 1; tampão Hepes 5 mmol.L- 1; Soro fetal bovino 10%; gentamicina 10 mg.mL-1; estreptomicina 100 μg.mL-1, penicilina100 U.mL-1. Filtrado em membrana de 0,22 µm (Kasvi®) e armazenado a 4°C. LB (Luria Bertani) pH 7,5; Triptona 10 g.L-1; extrato de levedura 5 g.L- 1; e NaCl 5 g.L-1; quando necessário meio sólido, adição de ágar 15g.L-1. O meio foi autoclavado a 121ºC por 20 minutos. Quando necessário, antibióticos foram acrescentados de acordo com a requisição dos protocolos de transformação bacteriana. RPMI completo (Roswell Park Memorial Institue medium)(Gibco®) pH 7,2; bicarbonato de sódio 23,8 mmol.L- 1; tampão Hepes 9,9 mmol.L- 1; Soro fetal bovino 10%; estreptomicina 100 μg.mL-1, penicilina 100 U.mL-1. Filtrado em membrana de 0,22 µm (Kasvi®). https://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes 23 SpII+EGTA pH 7,2; 200 mL de T base ((NH4)2SO4 2 g.L-1, K2HPO4·3H2O 18,3 g.L-1, KHPO 6 g.L-1, citrato de sódio·2H2O 1 g.L-1), glicose 50% (m/v), MgSO4·3H2O 1,2% (m/v), Extrato de levedura 10% (m/v), casamino acids 1% (m/v) e EDTA 1 mmol.L-1. 3.5 Sequências As sequências completas de nucleotídeos e de aminoácidos referentes as ORFs hipotéticas lc36 (número de acesso LINF_360049000) e lc06 (número de acesso LINF_220009200) (Anexo) foram obtidas da base de dados TriTrypDB, Kinetoplastid Genomics Resource (https://tritrypdb.org/tritrypdb/), acesso em 03 de julho de 2020. 3.6 Extração de DNA genômico (gDNA) DNA genômico (gDNA) de L. infantum foi extraído utilizando o kit de extração de DNA genômico Invitrogen™ PureLink™, de acordo com as recomendações do fabricante, seguido de quantificação em espectrofotômetro NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo Scientific) e mantido a 4°C até o momento do uso. 3.7 Amplificação de DNA Para amplificação de DNA, a composição do mix para reação de PCR foi 500 ng de gDNA; tampão Taq DNA polimerase 1X; dNTP 0,2 mmol.L-1; oligonucleotídeos iniciadores 0,5 µmol.L-1 (tabela 2); MgCl2 1,5 mmol.L- 1 e Taq DNA Polimerase High Fidelity 1,25 U (Cellco Biotecnologia®), seguindo o seguinte padrão de ciclagem: 94°C por 3 min; 35 ciclos de 94°C por 1 min; 55°C por 30 s e 72°C por 3 min; 72°C por 7 min; e mantidos a 4°C até o momento do uso em termociclador Amplitherm Thermal Cyclers (Ideal Lab®). 24 Quadro 2 — Oligonucleotídeos iniciadores para a PCR performada em todas as estratégias de clonagens. Fonte: Elaborado pelo Autor (2021) (Continua) Oligonucleotídeos Sequência 5´→ 3´ Produto LC36-Completa-RBS (BBp)_fw LC36-Completa-Histag (BBs)_rv CTGAGGAATTCAAAAAAAAATTCTAGAGAGCTGAT TAACTAATAAGGAGGACAAACAT GGGGCGAATCGACTCCTC ORF lc36 TTAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTATTATTAGTGAT GGTGATGATGATGATGGCCGCTGCTGCTGCCGCGC GGCACCAGAGAGTTAGTCGGCAGCCGAGG Fw_Thrombin-LC36 Rv_Thrombin-Lc36 AAACCATGGAACTGGTGCCGCGCGGCAGCATGGG GCGAATCGAC ORF lc36 AAAGATATCAAGAGTTAGTCGGCAGCCGA Fw_pBS0E-MBP- Thrombin-LC36 Rv_pBS0E-MBP- Thrombin-LC36 AAAGAATTCAAAAAAAAATTCTAGAGAGCTGATTA ACTAATAAGGAGGACAAACATGAAAATCGAAGAA GGTAAACTGGTAATCTGGATTAAC MBP::lc36 TTAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTATTATTAAG AGTTAGTCGGCAGCCGAGG P. Fw- LinJ22.0300_Trombin_ 10/2019 Rv_Thrombin-Lc06 AAACCATGGAACTGGTGCCGCGCGGCAGCGACGC AGAGTTCTTTCCCAAGAACC ORF lc06 AAAGATATCAGCGATTCGAACGAACCCAC Fw_Thrombin-LC36 _774pb AAACCATGGAACTGGTGCCGCGCGGCAGCGGGCG AA TCGACTCCTCTTGTG LC36 Fragmento 774 pb Rv_Thrombin-LC36 _774pb AAAGATATCACGCGACGTCCACCTGCT Fw_402 GCGATATCCACTTCATCCACTC Sequenciamento do pBS0EXylRPxylA_ V2- [RFP] Rv_403 CGTTGGCCGATTCATTAATG Azul – Biobrick Prefixo (EcoRI e XbaI); Lilás – Biobrick Sufixo (SpeI e PstI); Verde – Síto de Trombina; Laranja – HisTag7; Marrom – Região de ligação ao ribossomo; Sítio NcoI e Sítio EcoRV. Região para anelar à ORF. 25 Quadro 2 — Oligonucleotídeos iniciadores para a PCR performada em todas as estratégias de clonagens. Fonte: Elaborado pelo Autor (2021) (Conclusão) Oligonucleotídeos Sequência 5´→ 3´ Produto Fw_472 GCGTATTGCCGCCACTATG Sequenciamento do pMAL-p5x Rv_473 TGTCCTACTAGGAGAGCGTTCAC Fw_EV0410 CTGAGGAATTCAAAAAAAAATTCTAGAGAGCTGAT TAACTAATAAGGAGGACAAACATGGCGCAAGCGGT GTCATCAGCGGAAGGAGGATCAAGAGCGGCGCTG GAAGCGACAGAAGCGGCGGAAAGAGCGGA EV0410 Rv_EV0410 TTAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTATTATTAGTGAT GGTGGTGATGATGATGATGGCCGCTGCTGCTGCCG CGCGGCACCAGCGCTCTTTCTTGTTCCGCTCTTTCC GCCGCTTCTGTCGCTTCCAGCGCCGCTC Azul – Biobrick Prefixo (EcoRI e XbaI); Lilás – Biobrick Sufixo (SpeI e PstI); Verde – Síto de Trombina; Laranja – HisTag7; Marrom – Região de ligação ao ribossomo; Sítio NcoI e Sítio EcoRV. Região para anelar à ORF. 3.8 Manipulação de DNA As análises dos DNAs foram feitas por eletroforese em gel de agarose 1% corado com Brometo de Etídeo (10 mg.mL-1), em tampão TAE 1X (Tris-Acetato 40 mmol.L- 1; EDTA 2 mmol.L-1, pH 8,5), sob tensão de 3 V.cm-1 (Fonte BioRad), e visualização sob luz ultravioleta (UV). As imagens foram capturadas utilizando-se fotodocumentador “Capturador de Imagens” (Loccus Biotecnologia molecular Imaging). Os fragmentos de amplificação/ restrição foram purificados utilizando-se os kits PCR Purification Kit ou Agarose Gel Extraction Kit (Cellco Biotecnologia®), seguindo as instruções do fabricante. As Reações de digestão, desfosforilação e ligação de DNA seguiram as especificações dos fabricantes das enzimas. 3.9 Transformação bacteriana E. coli: Para obtenção de E. coli Top 10, BL21, BL21 Códon Plus ou Rosetta eletrocompetentes, o processo se deu como previamente descrito, mas com algumas modificações (MILLER; NICKOLOF, 1995). Resumidamente, 2 mL de uma cultura, crescida durante a noite, foram inoculadoss em 250 mL de LB sob agitação a 37°C até alcançar Densidade Ótica, a 600 nm (OD600nm), de 0,4-0,5. Seguidamente, são realizados três processos 26 de lavagens e centrifugações com água mili-Q gelada estéril, sendo o pellet da última centrifugação ressuspenso em glicerol 10% e a suspensão aliquotada em microtubos. A alíquota de 35 μL de bactéria eletrocompetentes, após adição do produto da ligação, foi transferida para uma cubeta de eletroporação com abertura de arco de 0,1 cm previamente resfriada no gelo. Após a eletroporação, realizada (“Programa 3”) no equipamento NucleofectorTM 2b Device (Lonza Biosciences), indicado para bactérias, o conteúdo da cubeta foi transferido para o meio LB, seguida de incubação em banho-maria a 37ºC por uma hora. As bactérias foram, então, plaqueadas em meio sólido LB + ampicilina (100 µg.mL-1) e incubadas em estufa a 37ºC durante a noite. B. subtilis: As cepas KO7 e Δ6 foram transformadas como descrito a seguir: B. subtilis quimio-competentes, previamente preparadas de acordo com Bron et al. (1999), foram retiradas do freezer e deixadas em banho maria a 37°C por trinta minutos; o mesmo se fez com o meio SpII+EGTA. A bactéria quimio-competente foi diluída com o meio (proporção 1:1), seguido de adição de 1 µL do DNA recombinante, e colocada para crescer por 1 hora em shaker a 250 rpm. Após este período de incubação, as bactérias foram plaqueadas em meio LB + eritromicina (1 µg.mL-1). 3.10 Extração de DNA plasmidial (pDNA) Minipreparação: Colônias bacterianas transformantes foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo 100 µg.mL-1 de ampicilina, sendo incubadas, em seguida, por 16 horas em Shaker a 37ºC e 250 rpm para a extração de pDNA. Recolheu-se 1,5 mL do pré- inóculo em microtubo, e a extração do pDNA foi realizada utilizando o kit QIAGEN® Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) e PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega) conforme as especificações dos fabricantes. O pDNA foi eluído em água mili-Q estéril, quantificado em NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo Scientific) e armazenado a -20ºC. Midipreparação: Pipetou-se 25 µL de um pré-inóculo das colônias transformantes em 50 mL de meio LB contendo 100 µg.mL-1 de ampicilina, seguido por incubação em Shaker, durante a noite, à 37ºC sob agitação constante a 250 rpm. A extração do pDNA foi realizada utilizando o kit QIAGEN® Plasmid Midiprep Kit (Qiagen) conforme especificações do fabricante e eluído em 100 µL de água mili-Q estéril, quantificado em espectrofotômetro NanoDrop Lite Spectrophotometer (Thermo Scientific) e armazenado a - 20ºC. 27 3.11 Sequenciamento As sequências dos plasmídeos recombinantes obtidos neste trabalho foram confirmadas por sequenciamento no equipamento ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer do Laboratório de Análises Biomoleculares Multiusuários da Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. As amostras previamente preparadas com o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) utilizando oligonucleotídeos adequados. 3.12 PCR de colônia Colônias transformantes, cultivadas durante a noite, foram ressuspensas em tampão Tris-HCl 0,1 mol.L-1, mantidas por cinco min em gelo e, posteriormente, lisadas em cinco ciclos de: aquecimento por um minuto em micro-ondas e incubação em gelo por trinta segundos. Um volume de 2 µL deste lisado foi utilizado como molde em reação de PCR. 3.13 Expressão de proteínas recombinantes B. subtilis: para a expressão das proteínas LC36 e MBP::LC36, foi preparado um pré-inóculo (10 mL) cultivado durante a noite a 37°C sob agitação constante a 250 rpm e, posteriormente, transferido para 100 mL de meio LB, o qual foi incubado a 37°C a 250 rpm até a DO600nm atingir 0,7 (~ 6 horas). Neste ponto, adicionou-se xilose 0,5 % (estoque 50% m/v) para indução da expressão a 37°C, 30°C ou 25°C por 18 horas. As culturas induzidas foram centrifugadas a 6000 g por vinte minutos e os precipitados, armazenados a -20°C até o momento do uso. E. coli: para a expressão das proteínas MBP::LC36 e LC36_774pb, foi preparado um pré-inóculo (10 mL) cultivado durante a noite a 37°C sob agitação constante a 250 rpm e, posteriormente, transferido para 100 mL de meio LB suplementado com Glicose 20% m/v), o qual foi incubado a 37°C a 250 rpm até a DO600nm atingir 0,5 ou acima (~ 4 horas). Neste ponto, adicionou-se IPTG 0,3 mmol.L-1 para indução da expressão. Realizou-se a indução a 37°C por 18 horas. As culturas induzidas foram centrifugadas a 6000 g por vinte minutos e os precipitados, armazenados a -20°C até o momento do uso. 3.14 Extração da proteína 28 Para o rompimento das bactérias recombinantes, os precipitados obtidos e descritos em 3.13 foram homogeneizados em tampão PBS (NaCl 137 mmol.L-1, KCl 2,7 mmol.L-1, Na2HPO4 10 mmol.L-1, KH2PO4 1,8 mmol.L-1). As células de B. subtilis foram rompidas em sonicador (Ultronique, Eco-sonics Modelo: DESRUPTOR) por meio de 90 ciclos, enquanto as células de E. coli foram rompidas com oito ciclos, sendo cada ciclo composto de 15 segundos em sonicador e 10 segundos de repouso em gelo. Todos os extratos foram centrifugados a 6000 g por 20 minutos e tanto os sobrenadantes quanto os precipitados foram armazenados a -20°C até o momento do uso. Para averiguar a expressão da proteína, os lisados foram resolvidos em gel SDS-PAGE 10% acrilamida/bisacrilamida (SAMBROOK et al. 2001). Após a corrida, os géis foram armazenados a 4-8°C (geladeira) até o momento do uso. 3.15 Western Blot Para a transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose, utilizou-se o Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (Bio Rad) a 2,5 A e tensão crescente até 25 V por três minutos. Posteriormente, foi realizado o bloqueio da membrana por uma hora, com solução PBST (NaCl 137mol.L-1, KCl 2,7 mmol.L-1, Na2HPO4 10 mmol.L-1, KH2PO4 1,8 mmol.L-1 e Tween20 0,05% v/v) BSA 3% m/v e incubação a temperatura ambiente com anticorpo anti-6His (Sigma-Aldrich) (1:1500) por uma hora. Emseguida, foi realizada a lavagem com solução PBST BSA 3% m/v por três vezes e incubação com anti-IgG de camundongo conjugado com Horseradish Peroxidase (HRP) (Thermo Scientific™) (1:40000) por uma hora. Finalmente, a membrana foi lavada três vezes com solução PBST e revelada com solução One-Step Ultra TMB-Blotting (Bio Rad). 3.16 Obtenção do EV0410 para clonagem Dois oligonucleotídeos de 40 pb, complementares e correspondentes, desenhados para codificarem o peptídeo EV0410 (30 resíduos de aminoácidos), foram diluídos em tampão pH 8 Tris-HCl 10 mmol. L-1 e EDTA 0,1 mmol.L-1,combinados em microtubo na proporção 1:1,aquecidos a 98°C por 10 min e resfriados até a temperatura ambiente para permitir o anelamento das duas fitas de DNA. Em seguida, para a extensão das extremidades 5’ overhang, misturou-se aos oligonucleotídeos 12,5 mM a seguinte solução: 0,2 mmol.L-1 de dNTP; 1,5 mmol.L- 1 de MgCl2 e 2,5 U de Taq Pfu. A reação ocorreu a 72°C por duas horas em 29 termociclador Amplitherm Thermal Cyclers (Ideal Lab®) seguida de purificação e digestão para os procedimentos de clonagem. 3.17 Predição de epítopos para células B Para os epítopos de células B, utilizou-se o servidor IEDBB Cells (http://tools.iedb.org/bcell/, acessado em 06/06/20) e Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0. O primeiro prevê epítopos usando combinação do método oculto de Markov e escala de propensão, calculando a possibilidade de a sequência de aminoácidos ser reconhecida pelas células B, (threshold igual a 0,35) (ANDERSEN; NIELSEN; LUND, 2006; JE.; O; M., 2006; LARSEN; LUND; NIELSEN, 2006; PONOMARENKO; BOURNE, 2007). O segundo utiliza o algoritmo Random Forest, treinado com sequências peptídicas experimentalmente determinadas, como epítopos e não-epítopos, sendo selecionadas aquelas sequências a partir do threshold igual a 0,5 (JESPERSEN; PETERS; NIELSEN; MARCATILI, 2017). Utilizou-se, também, o servidor ABCpep (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html, acessado em 06/06/20), o qual utiliza um banco de dados e uma rede neural artificial para predição de possíveis epítopos para células B (SAHA; RAGHAVA, 2006). Em seguida, os epítopos obtidos foram avaliados no Vaxjen 2.0 (www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html, acessado em 06/06/20), o qual avalia antígenos pelas propriedades físico-químicas organismo- específicas, havendo valor mínimo de threshold igual a 0,5 (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2007a; b; DOYTCHINOVA; FLOWER, 2008). 3.18 Síntese de Peptídeos Para o presente estudo, três peptídeos foram sintetizados: o primeiro foi nomeado EV0410 (MAQAVSSAEGGSRAALEATEAAERAEQERA-NH2) e derivado da proteína LC06, alvo de estudo por Lima (2015a), enquanto o segundo WC2013 (AQVMLYGSYALGLSLPS-NH2) e o terceiro WC2025 (PPLVMGDGTGGEDHAQ-NH2) foram derivados da proteína LC36 (NOGUEIRA; DEL CISTIA; URBACZEK; JUSI et al., 2018). A síntese foi realizada em Laboratório de Síntese e Estudos de Biomoléculas, sob responsabilidade do Professor Eduardo Maffud, utilizando a metodologia descrita por Merrifield (1963) em resina Rink Amide e os Fmoc–aminoácidos acoplados pela ativação dos grupos carboxilas com diisopropilcarbodiimida (DIC) e N-Hidroxibenzotriazol (HOBt), sendo que os reagentes citados foram utilizados com duas vezes de excesso em relação à quantidade 30 de grupos reativos na resina inicial. O grupo Fmoc foi retirado pela lavagem em 20% v/v 4- metilpiperidina/DMF (dimetilformamida) durante 1 e 20 minutos. Entre as etapas de acoplamento e desproteção e vice-versa, a resina foi lavada com DMF, assim como realizado o teste de ninhidrina (KAISER; COLESCOTT; BOSSINGER; COOK, 1970) para detectar a presença de grupos amino livres, visto que, em temperaturas elevadas, há reação entre a ninhidrina e o grupo amino livre gerando um composto de coloração azul, indicativo da eficiência da síntese. 3.19 Reação de clivagem dos peptídeos Para a clivagem do peptídeo da resina ao final da síntese, foi necessário adição do ácido triflu-oracético (TFA), 1,2-etanoditiol (EDT), triisopropilsilano (TIS) e água ultrapura (TFA 94%, TIS 1%, EDT 2,5% e H2O Mili-Q 2,5 % v/v) em frasco de cintilação sob agitação branda por 2 h. A relação entre volume da solução de clivagem e a massa de peptidil- resiana foi de 1 mL de solução para cada 100 mg. A precipitação do peptídeo e da resina foi realizada em éter etílico gelado e o sobrenadante foi descartado, repetindo-se esse procedimento por três vezes. A separação entre o peptídeo e a resina se deu por solubilização do peptídeo em solução de água mili-Q contendo TFA 0,045% v/v e acetonitrila contendo TFA0,036% v/v, sendo centrifugado para separar o peptídeo da resina. O sobrenadante resultante contendo o peptídeo foi liofilizado. 3.20 Purificação e caracterização dos peptídeos Os produtos obtidos da clivagem foram purificados em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE), em modo semi-preparativo, com solvente A (H2O, TFA 0,045%) e solvente B (ACN, TFA 0,036%); fluxo de 5 mL.min-1; comprimento de onda para detecção a 220 nm; coluna C18, 250 mm x 10 mm, 300 Å; e tamanho da partícula de 5 μm (Phenomenex). Para a purificação do peptídeo EV0410, foi usado o gradiente de 15-45% de solvente B em 90 min; e o peptídeo WC2025 foi purificado com gradiente de 10-45% de solvente B em 90 min. Após purificação e liofilização, a análise do grau de pureza de cada fração foi realizada em CLAE, em modo analítico acoplado a um espectrômetro Shimadzu, com coluna Ultraspehere Phenomenex de fase reversa C18 (4,6 mm x 150 mm, 300 Å, tamanho da 31 partícula de 5 μm) e detecção a 220 nm, utilizando método gradiente de 5 a 95% de solvente B em 30 min com fluxo de 1 mL.min-1. As análises das massas moleculares dos peptídeos foram realizadas por espectrometria de massas, em espectrômetro de massa Bruker, injeção ion trap e modo eletrospray positivo (M+H)+, na faixa de 200-2000 g.mol-1, para confirmar a obtenção do material desejado. O processo foi realizado no Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais do Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista. 3.21 Ensaio de Imunização e Imunoproteção Camundongos BALB/c foram divididos em 4 grupos contendo dez animais cada para imunização via subcutânea. Animais do grupo I receberam PBS; do grupo II, 50 µg de saponina (Saponin from quillaja bark - S7900 - Sigma-Aldrich); do grupo III, PBS + 75 µg de cada peptídeo (EV0410 e WC2025); e do grupo IV, 50 µg de saponina + 75 µg de cada peptídeo (EV0410 e WC2025). A imunização se deu por três doses (volume total = 100 µL), sendo a primeira dose no dia zero, a segunda, no dia 14 e a terceira, no dia 21. Sete dias posteriores à terceira dose, cinco animais foram eutanasiados e, os cinco restantes, infectados via intraperitoneal com 1x108 promastigotas de L. infantum, na fase estacionária de crescimento, e, finalmente, eutanasiados no 15º dia pós-infecção. 3.22 Obtenção do soro dos camundongos Após a eutanásia, a sangria de cada camundongos se deu por punção cardíaca com seringas e agulhas estéreis/descartáveis. O sangue foi acondicionado em microtubo estéril de 1,5mL, mantido a temperatura ambiente para que a coagulação ocorresse e, em seguida, incubado em estufa a 37°C por 20 min. O coágulo foi separado e o restante centrifugado a 300 g por 10 minutos. Então, os soros foram colhidos e transferidos para novos microtubos estéreis e armazenados a -20°C até o momento do uso para a quantificação de anticorpos IgG e subclasses. 3.23 Imunização Passiva 32 Camundongos BALB/c foram divididos em três grupos contendo sete animais cada e imunizados passivamente com 100µL do soro (diluídos 1:2 em PBS) dos animais imunizados descrito no item 3.23. Os animais do grupo I receberam soro de BALB/c sadio; animais do grupo II, soro de BALB/c imunizado com PBS; e animais do grupo III, soro de BALB/c imunizado com Saponina+Peptídeos. 48 horas pós-imunização, os animais foram infectados via intraperitoneal com 1x108 promastigotas L. infantum na fase estacionária e eutanasiados quinze dias pós-infecção (MCNOLTY; ANDERSON; STRYKER; DONDJI, 2021). 3.24 Resposta Humoral Placas de 96 poços Nunc MaxiSorp™ foram sensibilizadas com os peptídeos à concentração de 10 µg.mL-1 em tampão carbonato (0,1 mol.L-1, pH 9,5) por 16 horas a 4ºC. A seguir, lavada três vezes com solução PBST e bloqueada com solução PBST 5% m/v Molico sob agitação (20 rpm) por uma hora em temperatura ambiente. Os anticorpos obtidos dos camundongos imunizados foram diluídos em solução PBST 2,5% m/v Molico na razão 1:100 e incubados por 2 horas à temperatura ambiente sob agitação. As placas foram, novamente, lavadas com PBST cinco vezes para proceder a incubação dos anticorpos secundários IgG, IgG1 e IgG2a de camundongos, produzidos em cabra, os quais foram conjugados com HRP (Abcam) por uma hora em temperatura ambiente sob agitação e, em seguida, foi realizada a revelação com solução reagente A e B (BD OptEIA™) na proporção 1:1 por 30 minutos na ausência de luz, seguida de leitura da absorbância, a 450 nm, em leitor de microplacas multimodal de absorbância Infinite® M200 PRO (Tecan). 3.25 Quantificação da carga parasitária Para a determinação da carga parasitária, foi utilizado o índice de LDU (Leishman-Donovan Units), que consiste na relação entre número de amastigotas intracelulares por células nucleadas do hospedeiro e o peso do órgão parasitado (STAUBER, 1958). Para isso, após a eutanásia dos animais, foram realizadas impressões do fígado e baço em lâmina de microscopia, seguidas de fixação em metanol (8 minutos) e coloração pelo método do Giemsa. Sob microscopia óptica comum utilizando objetiva de imersão, observou-se a presença de células nucleadas infectadas ou não por Leishmania. O fragmento do órgão foi pesado para 33 posterior cálculo do índice de LDU (número de amastigotas de Leishmania por 1000 células nucleadas por peso do órgão). 3.26 Análise estatística Para realização da análise estatística, foi utilizado o programa GraphPad Prism 8. Foram realizadas a análise de variância (ANOVA) e a prova de Tukey para comparar as diferenças estatísticas entre os diferentes grupos experimentais. Foram considerados significativos os valores com p<0,05. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Nogueira (2014), no desenvolvimento de tese de doutorado, demonstrou a imunorreatividade de uma forma truncada de LC36 contendo os primeiros 256 aminoácidos (LC_256), cuja análise in sílico revelou propriedades antigênicas interessantes para aplicação em imunodiagnóstico das leishmanioses. Na primeira parte do trabalho, conduzido durante o desenvolvimento deste projeto de mestrado, serão apresentadas as diferentes estratégias de clonagem da ORF lc36 (2396 pb) para expressão das proteínas LC36 e/ou de sua forma truncada (LC36_256) em sistemas heterólogos. O planejamento inicial baseou-se no desenvolvimento de uma vacina viva, tendo bactérias como sistemas heterólogos de expressão de proteínas de Leishmania e agentes transmissores dos antígenos para o hospedeiro alvo. Segundo Ding et al. (2018), uma formulação vacinal deve, além de induzir a resposta do sistema imune inato, desencadear uma forte resposta do sistema imune adaptativo para, efetivamente, proteger o hospedeiro contra determinada infecção. No entanto, de acordo com os autores, as respostas mais duradouras e específicas são estimuladas por microrganismos vivos, que devido a composição de suas células, são naturalmente capazes de atuar como agentes adjuvantes quando em conjunto de antígenos alvos. Por outro lado, a administração de organismos vivos para mecanismo de entrega de antígenos requer atenção quanto à saúde humana ou animal, pois determinadas células bacterianas, como Listeria monocytogenes e Salmonela, que são usadas como vacinas vivas, são patogênicas e, por isso, estudos devem ser cuidadosamente realizados para que não haja quaisquer riscos para o público alvo (DING; MA; DONG; LIU, 2018). Desta maneira, o uso de microrganismo não patogênicos, como exemplo, B. subtilis, vem sendo alvo de estudo. 34 Os B. subtilis são bactérias gram-positivas consideradas como GRAS (Generally Recognized As Safe) pelo FDA (Food and Drug Administration) e, por esse motivo, são seguras para o ser humano e para os animais (HONG; DUC; CUTTING, 2005). Dentre as estratégias para o uso dessas bactérias como veículo de antígenos, tem-se a exposição de proteínas heterólogas na superfície dos esporos, que não requer a secreção via membrana, mas a expressão no momento da esporulação da bactéria (ISTICATO; CANGIANO; TRAN; CIABATTINI et al., 2001). Durante a esporulação, pelo menos 70 proteínas são produzidas para compor a estrutura do esporo, dentre elas, algumas são essenciais para a formação da estrutura (MCKENNEY; DRIKS; ESKANDARIAN; GRABOWSKI et al., 2010), enquanto outras participam da morfogêneses da crosta, a última camada do esporo, e são tipicamente usadas para ancorar antígenos, CotB (ISTICATO; CANGIANO; TRAN; CIABATTINI et al., 2001), CotC (MAURIELLO; DUC; ISTICATO; CANGIANO et al., 2004), CotG (KIM; LEE; KIM, 2005) e CotX (LI; NING; WU, 2010). Sendo assim, as principais vantagens do B. subtilis são: administração oral, atuação dos esporos como adjuvantes, baixo custo de produção, geneticamente manipuláveis e termoestabilidade dos esporos (ROSALES-MENDOZA; ANGULO, 2015). Por esta razão, diferentes estratégias foram testadas na tentativa de expressar as proteínas LC36 MBP::LC36 e MBP::LC_256aa em B. subtilis como método inicial para identificação da capacidade dessas células em expressar, no citoplasma, proteínas de L. infantum, e, posteriormente, migrar para a exposição dessas mesmas proteínas na superfície dos esporos. 4.1 Um fragmento de 2396pb contendo toda a ORF lc36 foi clonada no vetor pBS0EXylRPxylA_V2 Nesta etapa do trabalho, utilizou-se a estratégia “BioBrick”, aplicada em Biologia Sintética, para clonagem da ORF lc36 (PEDROLLI; RIBEIRO; SQUIZATO; DE JESUS et al., 2019). Para isso, as clonagens foram planejadas pautando-se em apenas quatro sítios de restrição na região de clonagem do plasmídeo pBS0EXylRPxylA_V2: EcoRI e XbaI na região upstream (prefixo) e SpeI e PstI na região downstream (sufixo) ao gene marcador da proteína de fluorescência vermelha (RFP) (SHETTY; ENDY; KNIGHT, 2008). A ORF lc36 foi amplificada utilizando-se os oligonucleotideos LC36-Completa-RBS (BBp)_fw e LC36- Completa-Histag (BBs)_rv (Quadro 2), obtendo-se um amplicom de 2.4 Kpb (Figura 1), o qual foi, posteriormente, digerido com EcoRI e SpeI e ligado ao vetor pBS0EXylRPxylA_V2- [RFP], também aberto em EcoRI e SpeI para posterior transformação da linhagem de E. coli TOP10. 35 Figura 1 — Amplificação da ORF lc36 (2396 pb). Fotografia dos produtos de eletroforese em gel de agarose 1% corado e com brometo de etídio. O amplicom (1) indicado pela seta foi obtido a partir da amplificação do gDNA de L. infantum com os oligonucleotídeos LC36-Completa-RBS (BBp)_fw e LC36-Completa-Histag (BBs)_rv, com a enzima Taq Dream (Thermo Scientific™) e Marcador de pares de bases λ-HindIII (New England) (M) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Uma colônia de E. coli ampicilina resistente foi selecionada. O pDNA extraído foi digerido com PstI, gerando fragmentos de 8,6 e 1,7 Kpb (coluna 1 da Figura 2), e EcoRI/SpeI, gerando fragmentos de 8,3Kpb (plasmídeo) e 2,3Kpb (inserto) (coluna 2 da Figura 2) como esperado, indicando o sucesso desta primeira etapa. A sequência do vetor recombinante revelou a manutenção da fase aberta de leitura (Figura 3). Figura 2 — Análise de restrição do pDNA obtido a partir de uma colônia de E. coli ampicilina resistente. Após a extração do pDNA com Kit QIAGEN Plasmid Miniprep (Qiagen), realizou-se a análise de digestão com a enzima PstI (1), bandas esperadas de 8,6 Kbp e 1,7 Kbp (indicado pela seta), e EcoRI e SpeI (2), bandas esperadas de 8,0 Kbp e 2,3 Kbp (indicado pela seta). (M) Marcador de pares de bases λ-HindIII (New England) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 36 Figura 3 — Alinhamento das sequências nucleotídicas obtidas a partir do sequenciamento do clone pBS0EXylRPxylA_V2-LC36HisTag. Para a reação de sequenciamento, utilizou-se os oligonucleotídeos 403 e 402 e o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). No alinhamento entre a sequência LC36 (superior) e aquela obtida no sequenciamento (inferior), estão destacados os sítios de restrição. (A) Região 5', com destaque para os sítios EcoRI e XbaI e (B) Região 3', com destaque para os sítios SpeI e PstI Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Após a confirmação da fase aberta de leitura, o plasmídeo recombinante, denominado pBS0EXylRPxylA_V2-LC36HisTag (Figura 41, Anexo), foi utilizado para transformar as cepas KO7 e Δ6 de B. subtilis, sendo a primeira, não expressora de sete proteases extracelulares, muito comuns em cepas selvagens, enquanto a segunda, possui parte do genoma deletado, direcionando todo o gasto energético para a expressão de genes essenciais e proteínas heterólogas. Colônias eritromicina resistentes foram selecionadas para extração e análise de pDNA (Figura 4 e 5). Figura 4 — Análise de restrição dos pDNAs obtidos a partir de colônias B. subtilis KO7 eritromicina- resistentes. Após a extração do pDNA com Kit QIAGEN Plasmid Miniprep (Qiagen) das colônias eritromicina resistentes, realizou-se análise de restrição com as enzimas EcoRI e SpeI (colunas 1, 2, 3 e 4). A seta indica o fragmento linearizado de 2,4 Kpb. (M) Marcador de pares de bases λ-HindIII (New England). (1) Clone 1, (2) Clone 2, (3). Clone 3, (4) Clone 4 Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 37 Figura 5 — Análise da amplificação do fragmento de 2775 pb dos pDNAs obtidos a partir de colônias B. subtilis Δ6 eritromicina-resistentes. Após o cultivo das colônias de B. subtilis Δ6 eritromicina resistentes em meio LB, as culturas foram centrifugadas e rompidas por ciclos de aquecimento e resfriamento e, então, o sobrenadante do rompimento foi usado para PCR com os oligonucleotídeos 402 e 403. (M) Marcador de pares de bases λ-HindIII (New England). (1 a 12) Clone 1 a 12. Apenas o clone 1 era positivo com banda de 2,7 Kbp indicada pela seta Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Para expressão da proteína LC36, uma colônia de B. subtilis KO7 albergando o plasmídeo recombinante pBS0EXylRPxylA_V2-LC36HisTag foi cultivada a 25, 30 e 37ºC durante a noite na presença de xilose para indução da expressão de LC36. A figura 6 mostra a análise do extrato proteico após a lise celular em gel SDS-PAGE, após 18hs de indução a 37ºC, não sendo observada a banda de interesse de 80 KDa. Isso também foi observado para as demais condições de indução (dados não mostrados), o que foi, posteriormente, confirmado por análise de western blot utilizando-se o anticorpo de camundongo anti-His (Sigma-Aldrich), figura 7. 38 Figura 6 — Análise da expressão da proteína LC36 em B. subtilis KO7. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas do B. subtilis KO7 induzido a 37°C por 18 horas. (M) Marcador PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific™). (1) Fração insolúvel- Clone 1, induzido. (2) Fração solúvel- Clone 1, não induzido. (3) Fração solúvel- Clone 1, induzido. (4) Fração insolúvel- Clone 4, induzido. (5) Fração solúvel- Clone 4, não induzido. (6) Fração solúvel- Clone 4, induzido. (7) Fração insolúvel- KO7 não transformado, induzido. (8) Fração solúvel- KO7 não transformado, não induzido. (9) Fração solúvel- KO7 não transformado, induzido Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Figura 7 — Detecção da cauda de histidina. Membrana de nitrocelulose após revelação do Western Blot para B. subtilis KO7 induzido a 37°C para o clone 1. Como controle positivo, usou-se CPB-HisTag, proteína em trabalho no laboratório. (M) Marcador PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific™). (1) Clone 1 - Fração insolúvel. (2) Controle não induzido Clone 1 - Fração solúvel. (3) Clone 1- Fração solúvel. (4) KO7 – Fração insolúvel. (5) Controle não induzido KO7 – Fração solúvel. (6) KO7 – Fração solúvel. (7) Controle positivo (cisteíno protease de Leishmania mexicana fusionada à cauda de histidina) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). O mesmo procedimento foi realizado com a cepa Δ6 transformante (Figura 8) e, também, a expressão de LC36 não foi obtida. 39 Figura 8 — Análise da expressão da proteína LC36 em B. subtilis Δ6. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas do B. subtilis Δ6 induzido a 37°C durante a noite. (M) Marcador Full Rage Rainbow™ (GE Healthcare). (1) Fração insolúvel- Clone 1, induzido. (2) Fração solúvel- Clone 1, não induzido. (3) Fração solúvel- Clone 1, induzido. (4) Fração insolúvel- Δ6 não transformado, induzido. (5) Fração solúvel- Δ6 não transformado, não induzido. (6) Fração solúvel- Δ6 não transformado, induzido Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 4.2 A fusão de Maltose Binding Protein na porção amino terminal da LC36 não contribuiu para sua expressão em E coli ou em B. subtilis Trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório mostraram que a expressão da forma truncada da LC36 em E. coli resultou na formação de corpos de inclusão (NOGUEIRA, 2014). Desta forma, desenvolveu-se uma nova estratégia para expressão de LC36 fusionada à proteína Maltose Binding Protein (MBP), anteriormente demonstrada quanto à sua capacidade de promover a solubilidade de diferentes proteínas pouco solúveis e expressas em diferentes linhagens de E. coli, como laminina β2 humana (REUTEN; NIKODEMUS; OLIVEIRA; PATEL et al., 2016), aquaporina Z de E. coli (HANG; PAN; NI; ZHENG et al., 2016), Me2 do vírus influenza (YANG; YANG; WANG; HUANG et al., 2017) e SIR2RP2 de Leishmania donovani (MITTAL; MUTHUSWAMI; MADHUBALA, 2017), todas alcançando bons níveis de expressão. Desta forma, optou-se por fusionar MBP na região N-terminal da LC36 e avaliar sua expressão tanto em B. subtilis quanto em E. coli. Para isso, a ORF lc36 foi amplificada utilizando-se os pares de oligonucleotídeos Fw_Thrombin-LC3 e Rv_Thrombin-LC3 contendo o sítio de restrição NcoI e EcoRV, assim como o sítio para trombina, para clonagem no plasmídeo pMAL-p5x (Quadro 2). Um amplicom de 2,2 Kpb foi, primeiramente, ligado ao vetor de clonagem pGEM® T-Easy, dando origem ao plasmídeo recombinante pGEM-Trombina-LC36 (Figura 42, Anexo), o qual foi confirmado por análise de restrição com as enzimas de restrição NcoI/EcoRV, gerando um 40 fragmento de 2,2 Kpb e outro, de 3,0 Kpb (coluna 2 figura 9). O pDNA pGEM-Trombina-LC36 foi, então, digerido com NcoI/EcoRV, e o fragmento de 3 Kpb extraído de gel de agarose e purificado para clonagem no vetor pMAL-p5x, também aberto em NcoI/EcoRV (Figuras 10). Utilizando como molde o pDNA pMAL-p5x-LC36 (Figura 43, Anexo) e oligonucleotídeos Fw_pBS0E-MBP-Thrombin-LC3 e Rv_pBS0E-MBP-Thrombin-LC3 (Quadro 2), obteve-se um amplicom contendo LC36 fusionada a MBP (MBP::LC36). Este fragmento foi digerido com SpeI e EcoRI e ligado ao vetor pBS0EXylRPxulA_V2-[RFP], também aberto em SpeI e EcoRI, (Figuras 15). Figura 9 — Análise de restrição do pGEM-Trombina-LC36 obtido a partir de colônias E. coli TOP10 ampicilina-resistentes. Após a extração do pDNA recombinante com MiniPrep (PureYield™ Plasmid Miniprep System), realizou-se a digestão nos sítios de restrição adequados, NcoI e EcoRV, em seguida revelado em gel de agarose para avaliação da clonagem do ORF lc36 de L. infantum em vetor pGEM® T-Easy. (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). (1 a 14). Digestão do pDNA com as enzimas de restrição NcoI e EcoRV, sendo esperados duas bandas (indicadas pelas setas) uma de 3,0 Kpb e outra de 2243pb (Clone 2) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 41 Figura 10 — Análise de restrição do pMAL-p5x-LC36 obtidos a partir de colônias E. coli TOP10 ampicilina-resistentes. Após extração do pDNA recombinante com Kit de MiniPrep (PureYield™ Plasmid Miniprep System, realizou-se a digestão com a enzima PstI e revelado em gel de agarose para avaliação da clonagem da ORF lc36 de L. infantum em pMAL-p5x, sendo esperados duas bandas (indicadas pelas setas) uma de 6,3 Kpb e outra de 1,7 Kpb. (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). (1 a 20) Clones. 1, 2, 3, 4, 6, 9, 11, 18 e 20 são clones positivos Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Após sequenciamento dos clones recombinantes, apenas 1 e 11 foram confirmados por sequenciamento e, posteriormente, utilizados para transformar E. coli (Figura 11). Figura 11 — Alinhamento das sequências nucleotídicas obtidas a partir do sequenciamento dos clones pMAL-p5x-LC36. Dois dos oito clones obtidos foram confirmados: clones 1 (Imagem da Esquerda) e 11 (Imagem da Direita). Para reação de sequenciamento, utilizou-se os oligonucleotídeos 473 e 472 e o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). No alinhamento entre a sequência LC36 (superior) e aquela obtida no sequenciamento (inferior) estão destacados os sítios de restrição. (A) Região 5’, com destaque para o sítio NcoI e (B) Região 3’, com destaque para o sítio EcoRV Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 42 Considerando as dificuldades experimentais anteriormente relatadas para expressão em B. subtilis e o fato de pMAL-p5x ser um plasmídeo para expressão de proteínas em E. coli, aproveitou-se a construção pMAL-p5x-LC36 para também transformar as linhagens BL21 e Rosetta (Figura 12). Figura 12 —Análise de restrição dos pDNAs obtidos a partir de colônias E. coli BL21 e Rosetta ampicilina-resistentes. Eletroforese em gel de agarose da digestão do pDNA extraído para confirmação da clonagem em E. coli BL21 e Rosetta, com a enzima PstI, sendo esperadas duas bandas, uma de 6,3 Kpb e outra de 1,7 Kpb. (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). (BL21 1 e 2) Clone para a cepa BL21. (Rosetta 1 e 2) Clone para a cepa Rosetta Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). A figura 13 apresenta os géis de SDS-PAGE para ambas as cepas de E. coli, após indução da expressão da proteína MBP::ORFlc36 de 125KDa e rompimento celular. Figura 13 — Análise da expressão da proteína LC36 fusionada à MBP em E. coli BL21 e Rosetta. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas de E. coli BL21 (A) e Rosetta (B). A proteína fusionada possui 125 KDa. (M) Marcador Full Rage Rainbow™ (GE Helthcare). (1) Fração insolúvel- induzido. (2) Fração solúvel- não induzido. (3) Fração solúvel- induzido Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 43 Observa-se na figura 13 que, para ambas as bactérias, não foi possível visualizar a banda referente à proteína de interesse. A eficiência na expressão pode ter sido baixa, já que esta pode ser de 1 a 20% da proteína total (pMAL Protein Fusion & Purification System Instruction Manual, New England Biolabs). Assim, alternativamente, considerando a capacidade de interação da MBP com amilose, utilizou-se também uma resina de amilose para purificação da proteína de fusão, utilizando-se como controle positivo clones de E. coli albergando apenas o vetor vazio, i.e., expressores apenas de MBP (Figura 14). Figura 14 — Análise da expressão da proteína LC36 fusionada à MBP após purificação em resina de amilose. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas de E. coli BL21 (A) e Rosetta (B) e purificação em resina de amilose. Proteína fusionada 125 KDa e MBP 42 KDa. (M) Marcador Full Rage Rainbow™ (GE Helthcare™). (1) Fração não adsorvida à coluna. (2) Fração da primeira lavagem. (3) Fração da eluição Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). É possível observar que, após a indução e utilizando o método de purificação baseado na amilose, também não obtivemos a expressão da proteína, embora o sistema de expressão esteja funcionando corretamente, já que foi possível verificar a expressão da MBP (Figura 14). Por outro lado, também foi possível observar a expressão da MBP na bactéria sem plasmídeo, o que pode ser devido à sua expressão basal, já que MBP é uma proteína bacteriana e faz parte do sistema maltose/maltosedextrina (DAHL; MANSON, 1985). Paralelamente à tentativa de expressão de MBP::LC36 em E. coli, também se trabalhou na clonagem do inserto MBP::LC36 no plasmídeo pBS0EXylRPxulA_V2-[RFP] para nova tentativa de expressão em B. subtilis. Após a clonagem, as colônias ampicilina resistentes foram confirmadas por PCR de colônia (Figura 15) e, posteriormente, sequenciados para confirmação da fase aberta de leitura (Figura 16). 44 Figura 15 — Análise da amplificação do fragmento de 3499 pb dos pDNAs obtidos a partir de colônias E. coli TOP 10 ampicilina-resistentes. Após o cultivo das colônias de E. coli TOP10 ampicilina resistentes em meio LB, as culturas foram centrifugadas e rompidas por ciclos de aquecimento e resfriamento e, então, o sobrenadante do rompimento foi usado para PCR utilizando os oligonucleotídeos Fw_pBS0E-MBP-Thrombin-Lc36 e Rv_pBS0E-MBP-Thrombin-Lc36. (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). (1 a 7) PCR dos clones obtidos na transformação (3499pb). Apenas os clones 2 e 6 eram positivos Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). A reação de sequenciamento dos clones confirmou a correta ligação dos insertos no clone 2. Figura 16 — Alinhamento das sequências nucleotídicas obtidas a partir do sequenciamento do clone pBS0EXylRPxylA_V2-MBP-Thrombin-LC36. Um dos dois clones obtidos foi confirmado, clone 2. Para a reação de sequenciamento, utilizou-se os oligonucleotídeos 403 e 402 e o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). No alinhamento entre a sequência MBP::LC36 (superior) e aquela obtida no sequenciamento (inferior), estão destacados os sítios de restrição. (A) Região 5', com destaque para os sítios EcoRI e XbaI e (B) Região 3', com destaque para os sítios SpeI e PstI Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 45 Para avaliação da expressão, utilizou-se as cepas Δ6 e KO7 de B. subtilis. Após transformação com o plasmídeo recombinante pBS0EXylRPxylA_V2-MBP-Thrombin- LC36 (Figura 43, Anexo), obteve-se apenas colônias transformantes para a linhagem Δ6 (Figura 17). Figura 17— Análise da amplificação do fragmento de 3499 pb do pDNA pBS0EXylRPxylA_V2-MBP- Thrombin-LC36 obtidos a partir de colônias B. subtilis Δ6 eritromicina-resistentes. Após o cultivo das colônias de Δ6 eritromicina resistentes em meio LB, as culturas foram centrifugadas e rompidas por ciclos de aquecimento e resfriamento e, então, o sobrenadante do rompimento foi usado para PCR utilizando os oligonucleotídeos 402 e 403. (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). 1, 2, 3, 4 e 5 são clones positivos Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Para ser usado para indução, escolheu-se os clones 1 e 4, como descrito anteriormente. A figura 18 mostra os extratos proteicos obtidos e separados em gel SDS-PAGE, sob indução por 12 horas à temperatura de 37°C. É possível concluir que, novamente, não houve expressão a 37ºC nem em outras temperaturas estudadas (dados não mostrados) pela bactéria B. subtilis Δ6. Figura 18 — Análise da expressão da proteína LC36 fusionada à MBP em B. subtilis Δ6. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas do B. subtilis Δ6 induzido a 37°C durante a noite. Tamanho da banda esperada 125KDa. (M) Marcador Full Range Rainbow™ (GE Helthcare). (1) Fração insolúvel- induzido. (2) Fração solúvel- não induzido. (3) Fração solúvel – induzido. Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 46 4.3 Fragmento de 774pb da ORF lc36 foi clonada em pMAL-p5x para expressão em E. coli Como mencionado anteriormente, o nosso grupo de pesquisa tem trabalhado com a investigação da antigenicidade da proteína LC36. Neste sentido, Nogueira (2014) expressou um fragmento de 256 aminoácidos dessa proteína com o intuito de aplicá-la em diagnóstico de LV. Sendo assim, como esta proteína foi anteriormente expressa, embora majoritariamente em corpos de inclusão, Nogueira idealizou sua expressão fusionada à MBP. Para tanto, realizou-se à amplificação (Figura 19) do fragmento de 774 pb utilizando-se os oligonucleotídeos Fw_Thrombin-LC36_774pb e Rv_Thrombin-LC36 _774pb (Quadro 2) para adição dos sítios NcoI e EcoRV à sequência. Após eletroforese e purificação do inserto, este foi ligado ao vetor pMAL-p5x também aberto com as mesmas enzimas. A figura 20 apresenta a análise de restrição do pDNA extraído de duas colônias de E. coli TOP10 ampicilina-resistentes com as enzimas NcoI e EcoRV. Figura 19 — Amplificação do fragmento de 774pb da ORF lc36. Eletroforese do produto de amplificação de 774 pb da ORF lc36 em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio a partir dos oligonucleotídeos Fw_Thrombin-LC36 _774pb e Rv_Thrombin-LC36 _774pb, indicado pela seta. (1) a partir do gDNA de L. infantum como molde, (2) pMAL-LC36 como molde, (3) pBS0EXylRPxylA_V2-LC36HisTag como molde e (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 47 Figura 20 — Análise de restrição dos pDNAs obtidos a partir de colônias de E. coli TOP10 ampicilina- resistentes. Após a extração do pDNA recombinante com MiniPrep™ (PureYield Plasmid Miniprep System), realizou-se a digestão nos sítios de restrição adequados, NcoI e EcoRV, em seguida revelada em gel de agarose para avaliação da clonagem do fragmento de 774 pb da ORF lc36 de L. infantum em vetor pMAL-p5x. (1 e 2) Clones e (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life) Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Após confirmação do clone 2 por sequenciamento (Figura 21), este DNA foi utilizado para transformar as linhagens de E. coli Rosetta, BL21 e BL21 Codon Plus (Figura 22). Em seguida, um clone de cada cepa bacteriana foi induzido com IPTG por 18 horas, rompido com disruptor ultrassônico e analisado via gel SDS-PAGE (Figura 23), verificando-se que não houve aparecimento da banda de 73 KDa como esperado. Figura 21 — Alinhamento das sequências nucleotídicas obtidas a partir do sequenciamento do clone pMAL-p5x_Fragmento774 pb LC36. Um dos dois clones obtidos foi confirmado, clone 2. Para a reação de sequenciamento, utilizou-se os oligonucleotídeos 473 e 472 e o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems). No alinhamento entre a sequência Lc36 e aquela obtida no sequenciamento, estão destacados os sítios de restrição. (A) Região 5', com destaque para o sítio NcoI e (B), região 3', com destaque, para o sítio EcoRV Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 48 Figura 22 — Análise de restrição dos pDNA pMAL-p5x_Fragmento774 pb LC36 obtidos a partir de colônias E. coli Rosetta, BL21 Codon Plus e BL21 ampicilina-resistentes. Eletroforese em gel de agarose da digestão do pDNA extraído para confirmação da clonagem em E. coli Rosetta, BL21 Codon Plus e BL21, com as enzimas NcoI e EcoRV, sendo esperadas duas bandas, uma de 5,7 Kpb e outra de 774 pb (indicado pelas setas). (M) Marcador de pares de bases 1Kb Plus (Life). (Rosetta 1 e 2) Clone para a cepa Rosetta, (BL21 CP 1 e 2) Clone para a cepa BL21 Codon Plus e (BL21 1 e 2) Clone para a cepa BL21. Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Figura 23 — Análise da expressão do fragmento de 774pb da proteína LC36 fusionada à MBP em E. coli Rosetta, BL21 Codon Plus e BL21. Eletroforese em gel SDS-PAGE após extração das proteínas de E. coli BL21 (A), BL21 Codon Plus (B) e BL21 (C). A proteína fusionada possui 73 KDa. (M) Marcador Full Rage Rainbow™ (GE Helthcare). (1) Fração insolúvel- induzido. (2) Fração solúvel- não induzido. (3) Fração solúvel- induzido Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). 49 4.4 Ampliação ORF lc06 para clonagem e expressão nos sistemas heterólogos B. subtillis e E. coli Outra proteína que este trabalho visa avaliar suas propriedades vacinais é aquela denominada LC06, previamente caracterizada quanto ao seu potencial antigênico (LIMA, 2015b). LC06 apresenta motivos de repetição em tandem, muito interessante devido às propriedades antigênicas (GOTO; CARTER; REED, 2008; GOTO; COLER; REED, 2007), como a A2 de L. donovani, a qual foi inicialmente identificada como fator de virulência e, hoje, é o antígeno utilizado na vacina Leish-Tec® (ZHANG; MATLASHEWSKI, 1997; ZHANG; MENDEZ; GHOSH; MYLER et al., 2003). Com base nestes achados e, considerando as dificuldades de amplificar sequências com muitas repetições, Evelin Costa Lima, durante o desenvolvimento de seu trabalho de conclusão de curso (LIMA, 2015b), sintetizou peptídeos de 20 a 40 resíduos contendo as repetições em tandem e demonstrou suas propriedades antigênicas. Interessante notar que estas propriedades podem evidenciar um papel imunogênico, pois segundo Crumpton (1974) o primeiro evento da resposta imune celular estaria envolvido na combinação entre aspectos antigênicos de uma proteína e a complementaridade com receptores antigênicos de superfície. Desta forma, leva a pensar que um imunógeno é um antígeno, mas nem sempre o oposto é verdadeiro. Wu et al. (2007) demonstra esta relação entre duas proteínas homólogas do vírus da hepatite E, as proteínas HEV 239 e E2, as quais possuem antigenicidades similares, porém imunogenicidades distintas. Dessa forma, a investigação das propriedades imunogênicas de LC06 foi realizada com base nos achados anteriores sobre a comprovada antigenicidade de peptídeo (LIMA, 2015b), porém, utilizando o sistema heterólogo de expressão bacteriana neste estudo. A estratégia adotada foi a mesma descrita para LC36, baseada na construção dos vetores de expressão para E. coli e B subtilis. Assim, após a amplificação da sequência nucleotídica correspondente à LC06 (3918pb), esta seria utilizada para clonagem em pMAL-p5x e pBS0EXylRPxylA_V2-[RFP], como descrito para LC36. No entanto, mesmo após aplicação de vários protocolos de amplificação, obteve-se bandas inespecíficas (Figura 24). Esta dificuldade experimental pode ser explicada pela presença das repetições em tandem características destas sequências. Assim, nova estratégia de amplificação foi adotada, agora, restringindo o amplicom para a sequência codificadora do antígeno EV0410. 50 Figura 24 — Análise da amplificação da ORF lc06. Eletroforese em gel de agarose para avaliar a amplificação da ORF lc06 (~3918pb) de L. infantum com os oligonucleotídeos P. Fw- LinJ22.0300_Trombin_10/2019 e Rv_Thrombin-Lc06. (M) Marcador de pares de bases λ-HindIII (New England). (1) Amplificação da ORF lc06 com 3918pb esperados. Fonte: Elaborado pelo Autor (2021). Alternativamente, desenhou-se dois oligonucleotídeos direto e reverso de 133 e 135 pb contendo a região codificadora do peptídeo EV0410, baseada no codon usage de B. subtilis, sendo, ainda, adicionados às extremidades de cada um, sítios de restrição adequados para clonagem do inserto no vetor e, também, região de ligação ao ribossomo. No oligonucleotídeo reverso, além dos sítios de restrição, uma sequência codificadora para sete resíduos de histidina também foram acrescidas. O oligonucleotídeo direto contém 40 nucleotídeos complementares à sequência do oligonucleotídeo reverso (Figuras 25 e 26). Os oligonucleotídeos foram, então, aquecidos a 98ºC e, depois, transferidos para a temperatura ambiente, para permitir o processo de anelamento das regiões complementares. Para o alongamento das extremidades fita simples 5’ overhang, esse substrato foi utilizado como molde em uma reação de PCR em termociclador. 51 Figura 25— Esquema dos oligonucleotídeos Fw_EV0410 e Rv_EV0410 desenhados com base na sequência do peptídeo EV0410. Em destaque, está a região de complementariedade com 40 nucleotídeos de extensão, flanqueada pelos componentes BioBricks upstream: prefixo e sítios de restrição EcoRI e XbaI; região de ligação ao ribossomo (RBS) e downstream: trombina, His-Tag e sufixo contendo so sítios de restrição SpeI e PstI Fonte: Elaborado pelo Autor