UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU Vicky Balesteros da Silva Blumen Galendi Bioprospecção de compostos bioativos: descoberta de peptídeos inovadores presentes na fauna acompanhante Dissertação apresentada ao programa de Pós- graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientador: Prof. Assoc. Rui Seabra Ferreira Junior Coorientador: Prof. Dr. Daniel Carvalho Pimenta Botucatu 2022 VICKY BALESTEROS DA SILVA BLUMEN GALENDI Bioprospecção de compostos bioativos: descoberta de peptídeos inovadores presentes na fauna acompanhante Dissertação apresentada ao programa de Pós- graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais. Orientador: Prof. Assoc. Rui Seabra Ferreira Junior Coorientador: Prof. Dr. Daniel Carvalho Pimenta Botucatu 2022 Aos meus pais, os maiores incentivadores das realizações dos meus sonhos, que me dão força, afago e proteção. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Universidade Estadual Paulista (Unesp) e a Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) pela oportunidade de trabalhar com o que me move e poder correlacionar com a saúde humana. Ao Centro de Estudo de Animais peçonhentos (CEVAP) por me receber de braços abertos e ceder os meios necessários para que esse estudo fosse realizado. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 88882.432934/2019-01. Ao meu orientador Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Júnior que acreditou em mim e me proporcionou essa oportunidade ímpar. Obrigada pela confiança, paciência, apoio, conversas, compreensão e tantos ensinamentos. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Daniel Carvalho Pimenta que me recebeu de braços abertos, que sempre se fez presente e esteve disposto a ajudar e ensinar de uma maneira leve e alegre. Aos meus pais Renato Aparecido Galendi e Andréa Balesteros da Silva Galendi por todo apoio, força e amor incondicional. Sem vocês, nada disso seria possível. Às meninas dos meus olhos, Kimmy, Peta e Eva. A ingenuidade, o amor e a simplicidade de vocês são o combustível para os meus dias. Aos irmãos que o CEVAP me concedeu, Leonardo Melo, Laudicéia Oliveira, Letícia Murback, Gabriela Pinto, Francilene Capel e os agregados Isabella Lopes e Felipe Vidigal. Obrigada por tantos momentos de sanidade e insanidade, vocês são essenciais em minha vida. Às minhas companheiras de todos os momentos, Eduarda Nicolau, Carla Silva e Thaís Meneguim, por tantos sorrisos e palavras de apoio que me ajudaram resistir, acreditar e não desistir dos meus sonhos. Às minhas eternas irmãs de Santos, Barbara Romano, Bruna Medeiros, Bruna Cara, Nara Pereira, Júlia Cara, e todas as outras que direta ou indiretamente contribuíram para que esse sonho fosse possível. Obrigada, principalmente, por serem colo e calmaria em tempos tortuosos. Que sorte a minha. Ao meu grande amigo André Piazzi Genovez por muitas vezes me reerguer, mostrando o tamanho de minha força quando eu já não me lembrava mais. Aos amigos que conseguem transformar qualquer situação em sorrisos e alegria, muito obrigada por tornarem tudo mais leve. Aos imaturos Guilherme Paganini, Lucas Gurgel, Felipe Pereira, Gustavo Deléo e Romolo Borgatto. À Carolina Pinto Toguchi por ser meu lar de todos os dias e por mesmo distante se fazer tão presente em minha vida e na realização desse sonho. À Elenize Jamas, por me acolher com tanto carinho e leveza desde o começo da minha jornada no CEVAP. Obrigada por tantos ensinamentos, risadas e conselhos. Ao Prof. Dr. Benedito Barraviera, por me receber no CEVAP e ceder o laboratório para realização de parte dos meus experimentos. À Dra. Luciana Curtolo de Barros, que me aconselhou, me acolheu e me ensinou muito nesses anos todos. À Bruna Quirino e Tatiane Biondo da seção técnica de Pós-graduação pelo carinho e suporte. E a todos que de alguma maneira se fizeram presente, colaboraram e fizeram ser possível a realização deste trabalho, minha eterna gratidão! “When the last tree has fallen and the rivers are poisoned, you cannot eat money” (Aurora Aksnes) RESUMO A fauna acompanhante está presente nas atividades pesqueiras realizadas por meio da rede de arrasto e na maioria dos casos, somam cerca de 50% da captura. Por não representar valor econômico, esta é comumente descartada de volta ao mar morta ou moribunda, causando ainda um grande desequilíbrio no ecossistema marinho local. Devido ao declínio mundial das populações de peixes, ao aumento da poluição e ao reconhecimento da limitação dos recursos biológicos, a necessidade de utilizar o bycatch de forma consciente torna-se indispensável. Atualmente, este material tem fomentado o interesse biotecnológico por meio de sua utilização para a identificação de compostos bioativos com atividades analgésicas, antioxidantes, antimicrobianas, imunorreguladoras, entre outras. As amostras presentes neste estudo foram coletadas em Ubatuba, São Paulo, Brasil, e revelaram que, naquela área, o Paralonchurus brasiliensis, o Micropogonias furnieri e o Hepatus pudibundus são as espécies mais abundantes no bycatch proveniente da pesca de camarão sete-barbas. Após a hidrólise das amostras, estas apresentaram uma alta capacidade antioxidante e potencial para ser uma ferramenta biotecnológica no combate ao estresse oxidativo. Portanto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar compostos expressos em animais presentes na fauna acompanhante, a fim de identificar compostos bioativos, investigar atividades biológicas e possíveis meios de utilização dessa fauna descartada, visando potenciais farmacológicos e nutracêuticos. Para isso, foram realizadas diversas análises proteômicas. Dessa maneira a efetividade da digestão pelas hidrólises com Alcalase e Protamex foi comprovada, bem como sua eficácia na obtenção de peptídeos complexos. A maioria dos peptídeos são polares com potencial nutracêutico, já que são facilmente diluídos. Vale ressaltar que esses peptídeos possuem também um potencial de utilização como modelos para a produção de peptídeos sintéticos devido às suas ações biológicas, sendo estes peptídeos análogos – que possuem maior permeabilidade de membrana e maior sobrevida. Com o resultado obtido pelo banco de dados BioPep foi possível prever diversas atividades bioativas, como atividade antioxidante, inibidora de alfa-glicosidase, inibidora de enzima conversora de angiotensina, antiamnésica, antitrombótica, hipertensora, neuropeptídica, entre outras, ressaltando seu potencial visando questões de saúde pública. O bycatch pode, portanto, representar uma fonte de peptídeos únicos com inúmeras utilizações como bioprodutos comerciais, sendo assim, há uma ampla gama de possibilidades para trabalhar com essa fauna inexplorada. Palavras-chave: Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri, Hepatus pudibundus, peptídeos, antioxidantes, bycatch, fauna acompanhante, bioprospecção. ABSTRACT The bycatch is present in the fishing by means of the trawl and in most cases, they are about 50% of the catch. As they have no economic value, this is commonly discarded back into the sea dead or dying, causing a major imbalance in the local marine ecosystem. Due to the worldwide decline in fish populations, the increase in pollution and the recognition of the limitation of biological resources, it is essential to use bycatch consciously. Currently, this material has fostered biotechnological interest for its use in the bioprospecting of bioactive compounds with analgesic, antioxidant, antimicrobial, immunoregulatory activities, among others. The samples present in this study were collected in Ubatuba, São Paulo, Brazil, and revealed that, in that area, Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri and Hepatus pudibundus are the most abundant species in the bycatch from the seven-barb shrimp fishery. After hydrolysis of the samples, they showed a high antioxidant capacity and potential to be a biotechnological tool in the fight against oxidative stress. Therefore, the present study aimed to characterize compounds expressed in animals present in bycatch and, in order to identify bioactive compounds, investigate biological activities and possible ways of using this discarded fauna, aiming at pharmacological and nutraceutical potential. For this, several proteomic analyzes were performed. In this way, the effectiveness of the digestion performed by the hydrolysis with Alcalase and Protamex was proven, as well as its effectiveness in obtaining complex peptides. Most peptides are polar with nutraceutical potential, as they are easily diluted. It is worth mentioning that these peptides also have the potential to be used as models for the production of synthetic peptides due to their biological actions, which are analogous peptides - which have greater membrane permeability and greater survival. Several bioactive activities were found, such as antioxidant activity, alpha-glucosidase inhibitor, angiotensin- converting enzyme inhibitor, antiamnesic, antithrombotic, hypertensive, neuropeptide, among others, highlighting its potential for public health issues. Therefore, bycatch represents a source of unique peptides with numerous uses as commercial bioproducts, thus, there is a wide range of possibilities for using this unexplored fauna. Key words: Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri, Hepatus pudibundus, peptides, antioxidants, bycatch, bioprospecting, proteomics. Sumário 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 18 1.1 MEIO AMBIENTE MARINHO ....................................................................................................................... 18 1.2 A PESQUISA E O AMBIENTE MARINHO.......................................................................................................... 19 1.3 BIOPROSPECÇÃO E FÁRMACOS PROVENIENTES DO AMBIENTE MARINHO ............................................................. 20 1.4 FAUNA ACOMPANHANTE – “BYCATCH” ....................................................................................................... 25 1.5 PESQUISA E POTENCIAL DA FAUNA ACOMPANHANTE ...................................................................................... 27 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 29 2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................................................... 29 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................................... 29 3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 30 3.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS ...................................................................................................................... 30 3.1.1 HIDRÓLISE ............................................................................................................................ 30 3.1.2 ANÁLISES ANTIOXIDANTES ....................................................................................................... 32 3.1.3 ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS ........................................................................................... 35 3.2 ELETROFORESE EM SDS-PAGE ................................................................................................................. 36 3.3 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA / FASE REVERSA (CLEA) ............................................................ 37 3.4 ESPECTROMETRIA DE MASSAS MALDI-TOF ................................................................................................ 37 3.5 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS LC/MS .................................................................. 38 3.6 ESPECTROMETRIA DE MASSAS LC-MSMS ................................................................................................... 39 4. RESULTADOS ...................................................................................................... 40 4.1 ELETROFORESE EM SDS-PAGE ................................................................................................................. 40 4.2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA / FASE REVERSA (CLEA) ............................................................ 41 4.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS MALDI-TOF ................................................................................................ 46 4.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS LS/MS .................................................................. 50 4.5 ESPECTROMETRIA DE MASSAS LC-MSMS ................................................................................................... 66 4.6 SEQUENCIAMENTO DE NOVO .................................................................................................................. 67 5. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 86 6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 93 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 94 8. ANEXOS .............................................................................................................. 101 18 | P á g i n a 1. INTRODUÇÃO 1.1 MEIO AMBIENTE MARINHO O Brasil é privilegiado em termos de possíveis explorações racionais de recursos marinhos, com uma costa litorânea que se estende cerca de 8 mil quilômetros, é considerado o segundo país com a maior costa contínua do mundo1. Os oceanos cobrem cerca de 70,8% da superfície da Terra, neles se concentram a maior parte de vida do planeta, consequentemente, a maior parte das riquezas naturais2. O ambiente marinho representa cerca de 98% da biosfera e possui profundidade média de 3.800m 2. Devido às limitações técnicas, apenas 5% desse meio foi explorado e menos de 0,01% foi amostrado em detalhes, portanto, grande parte desse ambiente permanece subutilizado e inexplorado2. A biodiversidade presente nos oceanos abriga a maioria dos filos, sendo considerado o ambiente com maior número de organismos3. No Quadro 1 está a classificação da fauna e flora marinha, a qual excede um total de 230.000 espécies conhecidas3, com uma previsão de 2 milhões de espécies não descobertas4. Quadro 1 – Classificação dos organismos marinhos de acordo com Blunt e Munro3. Echinodermata Crustácea Hemichordata Phorochordata Pisces Total ~ 7000 espécies ~ 60 000 espécies ~ 100 espécies ~ 3000 espécies ~ 16 000 espécies Mais de 230 000 espécies Archea e Eubacteria Cyanobacteria Chlorophyta Rhodophyta Phaeophyta Bacillariophyta Chrysophyta, Haptophyta Fungi ~ 1000 espécies ~ 7000 espécies ~ 2000 espécies ~ 6000 espécies ~ 1500 espécies ~ 50 000 espécies ~ 1000 espécies Dinoflagellata Porifera Cnidaria Platyelmintes Annelida Bryozoa Mollusca ~ 200 espécies ~ 8000 espécies ~ 11 000 espécies ~ 18 000 espécies ~ 10 000 espécies ~ 5700 espécies ~ 90 000 espécies 19 | P á g i n a O ecossistema marinho possui uma complexa e eficiente conectividade entre os organismos, nesse meio encontra-se grandes variações de fatores bióticos e abióticos (temperatura, calor, pressão, luz, nutrientes e salinidade), diferenciando-o fundamentalmente do ambiente terrestre5. Para sobreviverem nesse ambiente específico e peculiar, os diferentes tipos de organismos marinhos realizam estreitas associações entre si, como por exemplo, as anêmonas, corais e esponjas que abrigam peixes e microrganismos, servindo de proteção uns aos outros5,6. Essas variações nos habitats influenciam diretamente na natureza química dos organismos, exigindo que estes apresentem mecanismos especiais de adaptação, como a produção de metabólitos primários e secundários biologicamente ativos2,6. Portanto, as variações interespecíficas são responsáveis por produzir diferenças nas estruturas químicas dos compostos e suas concentrações em diferentes ambientes marinhos2,7. Nos organismos marinhos, os metabólitos são utilizados para controlar as relações ecológicas, as quais envolvem funções de sinalização intra e interespecífica, supressão de competidores, dissuasão de predadores, inibição de invasão bacteriana e fúngica, proteção contra radiação UV, entre outros5,7. Por possuir uma grande variedade de macro e microrganismos que diferem em sua capacidade de adaptação e fisiologia fazendo com que deem origem a estruturas química incomparáveis, o ambiente marinho é considerado um meio promissor para a exploração de novos fármacos6,5. 1.2 A PESQUISA E O AMBIENTE MARINHO Os produtos naturais marinhos estão sendo mais explorados nas últimas décadas devido às variedades de atividades biológicas apresentadas por eles7. Tais atividades biológicas podem ter um importante papel no desenvolvimento de medicamentos voltados para a saúde pública7. Devido às peculiaridades do ambiente e dos organismos marinhos, seus compostos bioativos possuem alta atividade biológica e estruturas químicas exclusivas, se mostrando atualmente uma área de estudo que promete grandes descobertas8. 20 | P á g i n a Alguns dos organismos mais explorados nessa área desde 1990 são as esponjas, os fungos, as algas e os corais8. Os micróbios, bactérias e cianobactérias, que vivem em associações com estes e outros organismos, são considerados uma fonte prolífica de compostos naturais bioativos. Sendo assim, os estudos com esses organismos e microrganismos vem aumentando a cada ano9,10. É ampla a gama de utilização dos compostos encontrados no ambiente marinho, podendo ser nutracêuticos, cosméticos e até mesmo fármacos. Já foram encontradas bioatividades antibacterianas11,12, antioxidantes13,14, antitumorais15, anticâncer16,17, imunomoduladoras18,19, antifúngicas20–22, antiinflamatórias23, antimicrobianas24–26, analgésicas27, antimaláricas28–30, entre outros. Há ainda, em andamento, um estudo para o tratamento de Alzheimer31 e outros estudos antivirais específicos para o COVID-1932,33. Dessa maneira, pode-se dizer que a ênfase das pesquisas no ambiente marinho está na descoberta de novas moléculas – desde 2008, mais de 1200 novos compostos são relatados por ano34 – e, consequentemente, a bioprospecção de moléculas e compostos bioativos provenientes deste ambiente também está em ascensão35–37. De acordo com o banco de dados MarinLit38 (http://pubs.rsc.org/marinlit/) e com o Dicionário de Produtos Naturais Marinhos34, mais de 37.000 compostos de origem marinha estão listados no momento39. Com base nesses dados, espera-se que o ambiente marinho seja cada vez mais uma fonte de inspiração para descoberta de novos meios de pesquisas relacionadas com a área de saúde pública39. 1.3 BIOPROSPECÇÃO E FÁRMACOS PROVENIENTES DO AMBIENTE MARINHO A bioprospecção pode ser utilizada na pesquisa de vários tipos de produtos, tais como, farmacêuticos, nutracêuticos, anti-incrustantes e adesivos, biocombustíveis, biocatalizadores (enzimas), cosméticos, entre outros40. Para a 21 | P á g i n a realização de uma busca química guiada de novos compostos e detecção de atividades biológicas, são utilizadas técnicas de espectrometria de massas e cromatografia líquida combinadas com análises nos bancos de dados adequados7,41,42. O desenvolvimento de fármacos de origem marinha é bem antigo. Na década de 1940, perto de Sardenha, nas águas do mar Mediterrâneo, encontra-se o fungo Acremonium chysogenum que produz a cefalosporina C e é considerado o ponto de partida para o desenvolvimento da classe de antibióticos de cefalosporinas42. Posteriormente, com o surgimento das bibliotecas de compostos combinatórios sintéticos, que eram mais simples e econômicos para a triagem de alto rendimento, as principais empresas farmacêuticas acabaram interrompendo os investimentos em compostos marinhos por alguns anos40. Entretanto, a abordagem química combinatória não surtiu os efeitos desejados, fazendo com que surgissem empresas biotecnológicas que investem em pesquisa e comercialização de fármacos de origem marinha42. A tabela 1 foi criada por pesquisadores de Farmacologia Marinha da Universidade de Midwestern, Illinois (EUA), atualizada em 15 de setembro de 2021, possui a relação de fármacos provenientes de compostos marinhos já aprovados pela FDA (Food and Drugs Administration)43: 22 | P á g i n a Tabela 1 – Fármacos derivados de compostos marinhos já aprovados pela FDA Efermidade Nome do composto Organismo marinho Classificação química Alvo molecular Marca comercial Ano de aprovação FDA Câncer (carcinoma, gástrico, mama) Disitamab vedotin (RC48) Molusco/ Cianobactéria Conjugado anticorpo- droga HER3 AidixiTM 2021 Câncer (mieloma) Belantamab Mafodotin-blmf Molusco/ Cianobactéria Conjugado anticorpo- droga BCMA BlenrepTM 2020 Câncer (de pulmão) Lubinectedin Tunicado Alcalóide RNA Polimerase II ZepzelcaTM 2020 Câncer (urotelial metastático) Enfortumab Vedotin-ejfv Molusco/ Cianobactéria Conjugado anticorpo- droga Nectin-4 PADCEVTM 2019 Câncer (linfoma) Polatuzumab vedotin (DCDS-4501A) Molusco/ Cianobactéria Conjugado anticorpo- droga CD76b e microtúbulos PolivyTM 2019 Câncer (mieloma, leucemia, linfoma) Plitidepsin Tunicado Depsipeptídeo eEF1A2 Aplidin® 2018 Câncer (mieloma múltiplo) Panobinostat Esponja Ácido hidroxâmico Histona deacetilase Farydak® 2015 Câncer (sarcoma e ovário) Trabectedin (ET-743) Tunicado Alcalóide Sulco menor do DNA Yondelis® 2015 Hipertrigli ceridemia Omega-3- carboxilic acid Peixe Ácidos gordurosos de Ômega-3 Enzimas que sintetizam triglicerídeos Epanova® 2014 Hipertrigli ceridemia Eicosapenta enoic acid ethyl ester Peixe Ácidos gordurosos de Ômega-3 Enzimas que sintetizam triglicerídeos Vascepa® 2012 Câncer (linfoma) Brentuximab vedotin (SGN-35) Molusco/ Cianobactéria Conjugado anticorpo- droga CD30 e microtúbulos Adcetris® 2011 Câncer (de mama) Eribulin Mesylate (E7389) Esponja Macrolídeo Microtúbulos Halaven® 2010 Dor crônica Ziconotide Caracol cone Peptídeo Canal de Cálcio tipo-N Prialt® 2004 Antivírus – Herpes Vidarabine (Ara-A) Esponja Nucleosídeo DNA polimerase viral Arasena A® 1976 Câncer – Leucemia Cytarabine (Ara-C) Esponja Nucleosídeo DNA polimerase Cytosar-U® 1969 Fonte: https://www.marinepharmacology.org/ https://www.marinepharmacology.org/ 23 | P á g i n a De acordo com os dados levantados na Tabela 1, o câncer é tido como o principal alvo dos medicamentos derivados de organismos marinhos. Sendo o primeiro a ser aprovado pela FDA em 1969, com o composto Cytarabine (Ara-C) – um nucleosídeo que age no DNA polimerase, utilizado para tratamento de leucemia. O medicamento mais recente foi aprovado em 2021 e é voltado para o tratamento de câncer, utilizando o conjugado anticorpo-droga Disitamab vedotin (RC48), que age no HER343. Nas tabelas 2 e 3, também criadas pelos pesquisadores de Farmacologia Marinha da Universidade de Midwestern, Illinois (EUA), possui um levantamento dos medicamentos oriundos de compostos marinhos em fase clínica 2 e 3, respectivamente43. Tabela 2 – Fármacos derivados de compostos marinhos em fase clínica 2 Enfermidade Nome do composto Organismo marinho Classificação química Alvo molecular Esquizofrenia, Alzheimer, Déficit de Atenção, Hiperatividade GTS-21 (DMXBA) Poliqueta (verme) Alcaloide Receptor nicotínico de acetilcolina α7 Câncer (tumores sólidos) Procabulin (PM184) Esponja Policetídeos Sulco menor do DNA Câncer (de ovário, cérvix, próstata, cabeça e pescoço, pulmão) Tisotumab Vedotin Molusco/ Cianobacteria Conjugado anticorpo-droga Fator tecidual e microtúbulos Câncer de mama Ladiratuzumab vedotin (SGN-LIV1A) Molusco/ Cianobacteria Conjugado anticorpo-droga LIV-1 e microtúbulos Alzheimer Bryostatin Briozoário Macrolídeo lactona Proteina quinase C Câncer (tumores sólidos) Telisotuzumab vedotin (ABBV-399) Molusco/ Cianobacteria Conjugado anticorpo-droga c-Met Câncer (tumores sólidos) CAB-ROR2 (BA-3021) Molusco/ Cianobacteria Conjugado anticorpo-droga ROR2 Câncer (de cabeça, pescoço, pâncreas, pulmão) CX-2029 (ABBV-2029) Molusco/ Cianobacteria Conjugado anticorpo-droga CD71 Câncer (tumores sólidos com metástase avançada) W0101 Molusco/ Cianobacteria Variante de auristatina IGF-R1 Fonte: https://www.marinepharmacology.org/ https://www.marinepharmacology.org/ 24 | P á g i n a Tabela 3 – Fármacos derivados de compostos marinhos em fase clínica 3 – atualizada em 30 de abril de 2021: Enfermidade Nome do composto Organismo marinho Classificação química Alvo molecular Câncer (de pulmão e cérebro) Plinabulin (NPI-2358) Fungo Dicetopiperazina Microtúbulos Dor crônica Tetrodoxin Peixe (Baiacu) Alcaloide guanidínico Canais de sódio Câncer (de ovário e mama) Lurbinectedin (PM01183) Tunicado Alcaloide Inibidor de transcrição oncogênica Câncer (de pulmão, pâncreas, melanoma, linfoma, mieloma múltipla) Marizomib (Salinosporamide A; NPI-0052) Bactéria β-lactoma γ-lactama 20S Proteasoma Coronavirus Plitidepsin Tunicado Depsipeptídeos eEF1A2 Fonte: https://www.marinepharmacology.org/ Observa-se nas tabelas 2 e 3 que, os estudos realizados com compostos marinhos estão também abrangendo outras áreas, como neurológicas e virais. Diante deste cenário, é possível notar que, mesmo perante a algumas adversidades existentes, os estudos e a aprovação de produtos farmacêuticos provenientes do ambiente marinho vêm crescendo nos últimos anos37. O conjunto destas informações nos faz refletir e concluir que a ampla variedade das bioatividades dos metabólitos primários e secundários provenientes desse meio, bem como os produtos naturais já existentes, possuem alto valor de interesse para aplicações na indústria farmacêutica, fazendo com que o investimento neste campo cresça cada vez mais6,36. https://www.marinepharmacology.org/ 25 | P á g i n a 1.4 A FAUNA ACOMPANHANTE – “BYCATCH”: A prática de pesca de camarões é corriqueira e abundante no mundo, sendo muito comum em zonas litorâneas. Uma das maneiras de captura mais eficiente e, portanto, a mais utilizada é a rede de arrasto44. De acordo com o último Relatório Anual da Organização das Nações Unidas de Alimentação e Agricultura (FAO) foi constatado que, no mundo, 178,5 milhões de toneladas de peso vivo são capturados por ano, tal estimativa inclui a aquicultura, a pesca marinha e interior45. Deste montante, cerca de 156,4 milhões de toneladas são destinadas ao consumo humano e 22,2 milhões de toneladas para consumo indireto. O consumo indireto inclui a produção de farinha e óleo de peixe, onde os resíduos da produção de óleo são utilizados para a fabricação da farinha45. Em uma pesca do camarão sete-barbas por rede de arrasto, estima-se que cerca de 46% da captura é descartada como não comestíveis45. Esse descarte recebe o nome de subprodutos ou resíduos de processamento – carcaças, ossos, pele, entre outros45. Segundo questões logísticas, somente os subprodutos oriundos do processamento direto podem ser capturados e processados, o que leva a cerca de 60% da coleta (107,1 milhões de toneladas) a ser viável para fins alimentares, resultando em 27,85 milhões de toneladas de descartes a nível global45,46. Os animais capturados acidentalmente são chamados de fauna acompanhante ou bycatch e, por muitas vezes não possuem valor comercial, são frequentemente descartados de volta ao mar, mortos ou moribundos47,48. Por mais que a pesca por rede de arrasto seja voltada a uma espécie alvo, e essa prática seja uma atividade socioeconômica importante, sempre afetará muitas outras espécies, podendo ser problemática para o meio ambiente48. A frequência dos descartes pode causar várias alterações na biodiversidade marinha, no ecossistema e na cadeia alimentar, comprometendo também os estoques pesqueiros59,60, as relações predador-presa, além de causar a destruição de organismos e de regiões bentônicas47,49. 26 | P á g i n a Diante deste cenário, a necessidade de uma utilização mais consciente e aprimorada da fauna acompanhante e dos subprodutos da pesca, vem sendo cada vez mais ressaltada através do declínio mundial das populações de peixes, do aumento da poluição ambiental e do reconhecimento da limitação dos recursos biológicos49,51,52. Dentro dessa fauna associada à pesca camaroeira existe uma grande quantidade de biodiversidade, em sua maioria, peixes demersais – são considerados demersais os peixes que vivem a maior parte da sua vida em associação com o substrato, mesmo tendo capacidade de natação ativa44,53. No litoral brasileiro, os animais mais comuns e abundantes capturados por bycatch são o Paralonchurus brasiliensis (Steindachner, 1875)53, conhecido popularmente como Maria-Luísa50,61, o Micropogonias furnieri (Desmarest, 1823)62 e o crustáceo mais abundante é o Hepatus pudibundus (Herbst, 1785)63. O Paralonchurus brasiliensis é um peixe teleósteo, Sciaenidae, encontrado na zona litorânea, em profundidades inferiores a 100 metros – abundantes em profundidades até 20 metros – em fundos lodosos, arenosos ou lamosos. Ocorre na América Central (costa Atlântica do Panamá) até a América do Sul (Argentina, Uruguai, Venezuela e Brasil), normalmente se alimenta de poliquetas e crustáceos e é considerada uma espécie-chave associada a águas rasas53. O Micropogonias furnieri também é encontrado na zona litorânea, abundantes na faixa de 20 a 40 metros. Ocorrem do Atlântico Ocidental ao Sudoeste, passando pelas Grandes Antilhas, Costa Rica à Argentina, Nicarágua e Brasil. Alimentam-se de crustáceos, moluscos, bentos e, ocasionalmente, outros peixes54. O crustáceo Hepatus pudibundus faz parte da família Aethridae e habita águas rasas e profundas – 10 a 100 metros – comumente encontrado em fundos duros de rochas e cascalhos, são onívoros e se alimentam de sedimento, moluscos, crustáceos peneídeos e pequenos peixes. Podem ser encontrados no Atlântico Ocidental, do Caribe ao Brasil55. Mesmo sendo espécies tão frequentes na fauna acompanhante e sabendo da desestruturação que o descarte indevido causa no ecossistema marinho, existem 27 | P á g i n a poucos trabalhos sobre bioprospecção e os possíveis usos desses animais. Portanto, é de suma importância conhecer melhor seus potenciais e valores biológicos. 1.5 A PESQUISA E O POTENCIAL DA FAUNA ACOMPANHANTE: Com o objetivo de aprimorar o aproveitamento da fauna acompanhante, o setor da biotecnologia marinha vem crescendo e a obtenção de ingredientes ativos provenientes de subprodutos da pesca vem sendo de grande anseio, portanto, há um amplo potencial para essas moléculas promissoras56,57. O avanço de técnicas e da biotecnologia, tais como espectrometria de massas e cromatografia líquida têm se mostrado muito úteis na prospecção e caracterização de compostos bioativos com atividade biológica terapêutica relacionadas a várias doenças consideradas problemas de saúde pública58. Para que possa se tornar possível a produção diversificada e de produtos com diferentes finalidades, as proteínas de pescado precisam, primeiramente, ser processadas por meio de técnicas de hidrólise e análises dos componentes. Os hidrolisados enzimáticos fornecem peptídeos com uma composição bem definida, fazendo com que a absorção pelo organismo seja mais efetiva59,60. De acordo com estudos realizados, foram revelados que a fauna acompanhante pode ser fonte de diversas moléculas bioativas, tais como peptídeos, ácidos graxos poliinsaturados, colágeno, quitina, compostos antioxidantes, entre outros36. Alguns estudos realizados com essa fauna mostraram que, após serem processadas por procedimentos químicos, é possível obter compostos com efeitos antioxidantes61, antimicrobianos26, imunomoduladores19, anticâncer62, entre outros. A atividade antioxidante é de grande interesse de estudo, tendo em vista que a oxidação é um processo vital em todos os organismos vivos e, em desequilíbrio pode causar efeitos colaterais, como a produção excessiva de radicais livres18,63. As espécies reativas do oxigênio (ERO), tais como ânion superóxido, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio são normalmente produzidas nos organismos vivos durando o metabolismo, e estão relacionadas com muitas doenças como, diabetes, hipertensão, doenças cardiovasculares e câncer64. Uma das defesas mais eficazes 28 | P á g i n a contra diversas doenças é a remoção de radicais livres e das espécies reativas do oxigênio, assim, o papel dos antioxidantes naturais tem recebido muita atenção14. Outra bioatividade de grande interesse é a antimicrobiana, tendo em vista que bactérias patogênicas resistentes aos antibióticos tem se tornado um grande problema de saúde pública. Os compostos antimicrobianos são essenciais ao sistema imune inato, podendo apresentar atividade microbicida rápida e potente contra um amplo espectro de microrganismos65. Para a obtenção de informações relativas aos componentes de uma amostra, é necessária a realização de alguns processos químicos. A hidrólise é realizada em condições controladas, garantindo assim um perfil peptídico definido – de possível reprodução57. Também melhoram as propriedades funcionais e permitem a liberação de peptídeos de diversos tamanhos com diferentes bioatividades, além de garantir a manutenção da qualidade dos compostos14,64. Após a hidrólise, é realizada a liquefação, onde serão obtidas duas frações: a fração solúvel (mais aquosa, composta por polipeptídios) que contém as proteínas hidrolisadas; e a fração insolúvel retém os lipídeos e fosfolipídios, cujo rendimento pode variar de acordo com a enzima escolhida para hidrólise, e forma uma emulsão, o que sugere regiões hidrofóbicas partindo dos peptídeos produzidos66,67. Com a necessidade de caracterização, isolamento e sequenciamento dos compostos, são realizados os processos de eletroforese, cromatografia líquida e espectrometria de massas68. Esses processos são realizados para a identificação e caracterização de todas as proteínas expressas por um genoma ou tecido, auxilia a compreensão de como essas proteínas funcionam – sozinhas ou em conjunto – dentro de um organismo através do uso de um conjunto de tecnologias analíticas capazes de analisar amostras de alta complexidade simultaneamente69. O presente estudo consiste na bioprospecção de moléculas bioativas expressas no músculo de Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri e Hepatus pudibundus, a fim de identificar e investigar suas atividades biológicas, potencial bioquímico e possíveis meio de utilização. 29 | P á g i n a 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Realizar a caracterização de compostos expressos no músculo de Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri e Hepatus pudibundus, a fim de melhor compreender seus valores biológicos, bioquímicos, terapêuticos e nutricionais, visando possíveis usos correlacionados aos problemas de saúde pública. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Realizar eletroforese para comprovação da eficiência das hidrólises realizadas com Alcalase e com Protamex; • Traçar o perfil das amostras de Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri e Hepatus pudibundus a fim de caracterizar os compostos presentes nas mesmas; • Isolar e identificar os compostos utilizando análises proteômicas; • Estabelecer a existência de potencial aplicabilidade de tais compostos como nutracêuticos e/ou fármacos. 30 | P á g i n a 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS As amostras foram obtidas por meio de coletas realizadas pela doutoranda Tavani Rocha Camargo, orientanda do Prof. Dr. Wagner Cotroni Valenti do Centro de Aquicultura da Unesp (CAUnesp) de Jaboticabal, as coletas ocorreram na praia de Ubatuba, São Paulo, e foi dividida em duas partes, uma no período de 30/08 a 02/09 em 2017 e outra no período de 01 a 05/03 de 2018. O Paralonchurus brasiliensis e o Micropogonias furnieri foram os peixes mais abundantes em ambas as coletas. Foram realizadas algumas análises de composição proximal química dos músculos e brânquias das espécies coletadas (Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri, Hepatus pudibundus e Callinectes ornatus). Amostras de músculo dos peixes (100g) foram trituradas em liquidificador e homogeneizados com água destilada na proporção 1:2. Antes do processo de hidrólise, as enzimas endógenas contidas nas amostras foram inativadas em banho a 80°C por 20 min70–72. 3.1.1. HIDRÓLISE Para a realização da hidrólise, foram utilizadas, separadamente, as enzimas Alcalase e Protamex, ambas são tidas como enzimas com alto potencial de recuperação de proteínas73. A Alcalase é uma endopeptidase serina de Bacillus licheniformis, fornece informações sobre a estrutura catalítica, conhecida pela tríada catalítica clássica de aminoácidos, sendo a serina uma delas. Também cliva proteínas no meio da cadeia de aminoácidos73. A Protamex é uma endoprotease que promove uma hidrólise extensa, consiste em uma mistura de proteases microbianas produzida com enzimas de Bacillus licheniformis e Bacillus amyloliquefaciens. A reação de hidrólise se realizou em um reator de vidro, de parede dupla, conectado a um banho termostatizado (MARCONI), utilizando a enzima Alcalase e Protamex de acordo com as condições ótimas de cada enzima (Alcalase: pH 8.0; 50 31 | P á g i n a °C; Protamex: pH 7.0; 50 °C). A proporção enzima e substrato proteico foi de 1:10 (U/g de proteína). O grau de hidrólise (GH) foi monitorado ao longo do processo, e foi determinado de acordo com a fórmula abaixo: GH (%) = [(B x Nb) / MP] x (1 / α) x (1/htot) x 100 Sendo: htot é o número de ligações peptidicas (moles equiv/kg) para pescado (8,6 moles equiv/kg); B é o volume da base consumida durante a hidrólise para manter o pH constante (mL); Nb é a normalidade da base; MP é a massa de proteína (g, determinado em N x fator de Kjeldahl); e α é o grau de dissociação. O grau de dissociação α é calculado segundo a equação: α = (10pH-pK) / (1+ 10pH-pK) Sendo: pH é o pH durante a hidrólise e pK é a constante de dissociação. Quando o grau de hidrólise se tornou constante, a reação foi interrompida pela inativação da enzima (90 °C/10 min) em banho termostatizado (Marconi). Após o resfriamento, à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas (3220 x g por 20 min) (Biosystems MPW-350/350-R - Brasil) no Laboratório de Enzimologia Aplicada (LEA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal. O sobrenadante foi armazenado no ultrafreezer (-80oC) do Centro de Aquicultura da UNESP para posterior liofilização70–72. As liofilizações foram realizadas no Setor de Avicultura da Unesp, sob a coordenação da Profa. Dra. Nilva Kazue Sakomura. Após as liofilizações, os hidrolisados foram armazenados em temperatura -18 ± 2 °C. Todo o processo de hidrólise tem duração de aproximadamente quatro horas, pois optou-se por alcançar o GH máximo de cada amostra. Para as análises estatísticas os registros com resíduos studentizado menores que -3 e maiores que 3 desvios-padrão foram retirados do conjunto de dados, assim como valores influentes. Após a retirada dos valores discrepantes, os resíduos atenderam as pressuposições de homocedasticidade e a normalidade, verificadas pelos testes de boxcox e Cramer-von Mises, respectivamente70–72. A análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação de médias (Tukey) ao nível de significância média (P < 0,05) foi realizada por meio do pacote agricolae (Mendiburu, 2017) no software R (R Core Team, 2017) 70–72. 32 | P á g i n a A Figura 1 mostra um esquema visual das análises realizadas até a obtenção dos hidrolisados proteicos. Figura 1: Esquema explicativo das fases do processo de hidrólise realizada nas amostras de músculo dos peixes. 3.1.2. ANÁLISES ANTIOXIDANTES Após a hidrólise, foram realizados testes para avaliar a capacidade antioxidante dos hidrolisados através de três métodos: capacidade antioxidante total contra radicais peroxil, capacidade antioxidante total pelo método de DPPH e dosagem dos grupos sulfidrilas70–72. O método DPPH baseia-se na transferência de elétrons de um composto antioxidante para um oxidante, dessa maneira, o antioxidante em estudo reage com o radical DPPH convertendo-o em sua forma reduzida. É possível notar tal mudança pela coloração que inicialmente é violeta e torna-se mais clara, podendo chegar a tons amarelados. O grau deste descoramento indica a habilidade do antioxidante em sequestrar o radical livre. 33 | P á g i n a A capacidade antioxidante contra radicais peroxil (ACAP) baseia-se na detecção de espécies reativas de oxigênio (ERO) por flourometria e foi realizado de acordo com Amado et al. (2009)74 e Zamora-Sillero et al. (2018)75 com algumas modificações. E para a realização do teste de dosagem dos grupos sulfidrilas foram utilizados os compostos tiólicos (glutationa, cisteina e proteínas tiólicas) são antioxidantes que contêm em sua estrutura o grupamento -SH e estão envolvidos no sequestro de radicais livres, sendo capazes de quebrar íons metálicos danosos, desempenhando uma importante função na defesa antioxidante (Hermes-Lima, 2004). O teor total dos grupos sulfidrila (T-SH) foi determinado baseado em White et al. (2003)76 com modificações. Os resultados de capacidade dos hidrolisados em sequestrar o radical livre DPPH indicaram que as quatro espécies estudadas possuem capacidade de eliminar o radical DPPH, sendo assim, podem ter em sua composição peptídeos que atuam como doadores de elétrons que reagem com os radicais livres para transformá-los e moléculas estáveis. Nos hidrolisados obtidos com a enzima Protamex (Figura 2), embora sem diferenças significativas (P > 0,05), pode-se observar que P. brasiliensis apresentou maior atividade antioxidante contra radicais DPPH, seguido de M. furnieri, H. pudibundus apresentou menor atividade antioxidante. Já nas amostras hidrolisadas com a enzima Alcalase (Figura 3), H. pudibundus apresentou maior atividade antioxidante. Figuras 2 e 3: Capacidade dos hidrolisados em sequestrar o radical livre DPPH. Dados expressos como média (n=6). Letras idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas (P > 0.05). CO= Callinectes ornatus; HP= Hepatus pudibundus; MF= Micropogonias furnieri; PB= Paralonchurus brasiliensis. 34 | P á g i n a Com os resultados da dosagem dos grupos sulfidrilas é possível observar que as amostras de P. brasiliensis e M. furnieri hidrolisadas com Protamex (Figura 4) apresentaram as maiores concentrações de grupos sulfidrilas, seguidas dos crustáceos H. pudibundus e C. ornatus com as menores concentrações. Os hidrolisados com a enzima Alcalase (Figura 5) não apresentaram diferenças estatísticas, porém os hidrolisados de P. brasiliensis exibiram a maior concentração de -SH, o que também se observa quando comparado com os resultados de M. furnieri. Figuras 4 e 5: Concentração de grupos sulfidrilas das diferentes amostras obtidas pelo processo de hidrolise enzimática com as enzimas Protamex e Alcalase. Dados expressos como média (n=6). Letras idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas (P > 0.05). CO= Callinectes ornatus; HP= Hepatus pudibundus; MF= Micropogonias furnieri; PB= Paralonchurus brasiliensis. Com relação aos resultados obtidos da capacidade dos hidrolisados proteicos das quatro espécies estudadas para redução de radicais peroxil, a amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com a enzima Protamex (Figura 6) apresentou a menor capacidade antioxidante em comparação com C. ornatus, H. pudibundus e P. brasiliensis quando hidrolisados com a mesma enzima. Nas amostras hidrolisadas com a enzima Alcalase (Figura 7), H. pudibundus apresentou a maior capacidade antioxidante. De uma maneira geral, pode-se observar que os resultados com a enzima Protamex foram melhores do que com a enzima Alcalase. 35 | P á g i n a Figuras 6 e 7: Capacidade antioxidante total contra radicais peroxil dos hidrolisados proteicos hidrolisados obtidos com as enzimas Alcalase e Protamex. Dados expressos como média (n=6). Letras idênticas indicam ausência de diferenças estatísticas (P > 0.05). CO= Callinectes ornatus; HP= Hepatus pudibundus; MF= Micropogonias furnieri; PB= Paralonchurus brasiliensis. Os resultados das análises de antioxidantes descritos acima por Camargo et al.70–72, indicam que os hidrolisados proteicos dos músculos das quatro espécies do bycatch estudadas possuem propriedade antioxidante. Entretanto, os hidrolisados proteicos de P. brasiliensis apresentaram maior capacidade antioxidante in vitro, evidenciado pela sua grande concentração de grupos sulfidrilas e pela eliminação de radicais DPPH. De uma maneira geral, houve poucas diferenças entre os músculos hidrolisados com a enzima Alcalase e Protamex, porém Paralonchurus brasiliensis apresentou a maior concentração de grupos sulfidrilas quando hidrolisado com a enzima Alcalase70–72. 3.1.3. ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS As amostras utilizadas pela doutora Tavani Rocha Camargo foram enviadas para o Departamento de Química e Bioquímica no Campus da Unesp em Botucatu, onde alunos do professor Willian Fernando Zambuzzi realizaram análises para avaliar se os hidrolisados eram citotóxicos para as células ou se interferiam no processo de adesão. Logo após, foram recolhidas e encaminhadas ao Centro de Estudo de 36 | P á g i n a Animais Peçonhentos – CEVAP/UNESP onde foram conservadas em geladeira a 4ºC de acordo com as recomendações. 3.2. ELETROFORESE EM SDS-PAGE As amostras foram separadas, pesadas (100μL), diluídas em tampão de amostra (0,06M Tris; 2% SDS; 10% Glicerol; 0,025% Azul de Bromofenol; pH 6,8) e aquecidas durante 5 minutos à 70ºC em banho-maria. O gel, devidamente polimerizado, foi montado em cuba de eletroforese vertical Mini Protean II (Bio-Rad Laboratories), contendo tampão Tris Glicina-SDS, com pH 8,3. 50μg da amostra diluído em tampão de amostra (0,06 M Tris; 2%SDS; 10% Glicerol; 0,025% Azul de Bromofenol; pH 6,8) foram aplicados, em cada poço do gel. Para a separação das proteínas, a eletroforese foi efetuada com voltagem contínua de 150V por 12 minutos, para alinhar as proteínas, em seguida efetuamos um aumento na voltagem para 200 V por 40 minutos. Quando o indicador azul de bromofenol atingiu a porção inferior do gel, a fonte foi desligada e o gel transferido à um recipiente com solução corante Coomassie Briliant Blue R250 0,025% (Sigma Chem. Co). O gel foi corado por 40 minutos e descorado em solução Destain (etanol 30% [v/v] e ácido acético 10%[v/v]) até o background do gel (plano de fundo das proteínas) alcançar a transparência. Para separação de moléculas com tamanhos e cargas diferentes foram realizados quatro géis de poliacrilamida, dois a 12% e dois a 20% preparados com tampão Tris-HCl pH 8,8; SDS (Dodecil sulfato de sódio) (Sigma Chem. Co) à 10% (m/v); Acrilamida: Bis 30, 0:0,8 (Sigma Chem. Co); persulfato de amônio (Sigma Chem. Co) 10% (v/v) e Temed (N ́, N ́, N ́, N ́- tetrametilenodiamino) (Sigma Chem. Co), podendo assim separar as amostras de Alcalase e Protamex. Após a corrida eletroforética, corado em Solução de Comassie Blue R-250, durante 30 minutos. A descoloração do gel foi efetuada em banhos sucessivos com solução de ácido acético-etanol-água (10:30:60). Após a descoloração, foi feira a captura de imagem do gel. 37 | P á g i n a 3.3. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA / FASE REVERSA (CLAE/FR) Para o conhecimento do perfil cromatográfico das amostras de Paralonchurus brasiliensis, Micropogonias furnieri e Hepatus pudibundus hidrolisados tanto com Alcalase quanto com Protamex, foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu® modelo LC-20AT, equipado com detector de luz ultravioleta do tipo arranjo de diodos modelo SPD-M20A, constituído por duas bombas LC-20AT (bombas A e B), injetor automático modelo SIL-20AC HT, com um coletor automático modelo FRC-10A e um sistema controlador modelo CBM-20AT. O controle de aquisição de dados foi feito através do software LC Solution. Todos os solventes orgânicos utilizados foram de grau HPLC e a água Milli-Q obtida em ultrapurificador de água Milipore®. O cromatograma foi obtido sob fase reversa, utilizando uma coluna analítica C- 18 (4,6 X 250 mm) (Wakopak®). As amostras liofilizadas, na concentração de 0,5 mg / 0,5 mL de Ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% (v/v) foram injetadas manualmente no sistema. A eluição das amostras foi feita através de dois solventes: (A) TFA 0,1% (v/v) e (B) TFA 0,1% (v/v) e Acetonitrila 90% (v/v), através de um gradiente de 0 a 100% do solvente B por 20 minutos. O fluxo utilizado foi de 1 mL/min e a eluição foi monitorada na absorbância de 214nm. Este procedimento foi realizado para todas as amostras. Esta metodologia foi desenvolvida pela área laboratorial do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) – UNESP. 3.4. Espectrometria de Massas (MALDI-TOF) A espectrometria de massa tipo MALDI-TOF, foi realizada no Departamento de Bioquímica do Instituto Butantan. 38 | P á g i n a As análises foram realizadas em um instrumento Axima Performance MS/MS (Shimadzu). As amostras, em solução, foram misturadas na proporção 1:1 (v:v) com uma solução supersaturada de matriz recomendada para a análise de peptídeos (ácido cinâmico), proteínas (ácido sinápico) ou para baixa massa molecular (DHB), conforme o caso e a mistura foi depositada sobre a placa de amostragem (0,4-0,8 µL) para evaporação dos solventes. Foi utilizado o modo automático de controle do equipamento e aquisição de dados via software de controle do equipamento (Launchpad, Shimadzu Biotech). 3.5. Espectrometria de Massas (LC/MS) A espectrometria de massas LC/MS foi realizada no Departamento de Bioquímica do Instituto Butantan. As amostras previamente secas foram dissolvidas em 0,1% ácido fórmico e depositadas no amostrador do auto injetor. 20 µL de amostra foram injetadas em um sistema de HPLC/Espectrometria de Massas (LC/MS) tipo IT-TOF (Shimadzu) sob fluxo constante de 0.2mL/min, e submetida a uma separação cromatográfica por fase reversa em coluna Kinetex C18 (2.1 x 50 mm), utilizando como solventes A: ácido fórmico 0,1% e solvente B: ACN: H2O:ácido fórmico/900:100:0,1 e um programas de gradiente linear de 0 a 100% de B em 30 minutos. O controle do instrumento, a aquisição e o processamento de dados foram realizados pelo pacote de programas LCMSolution (Shimadzu). 39 | P á g i n a 3.6. Espectrometria de Massas (LC-MSMS) A análise proteômica LC-MSMS também foi realizada no Departamento de Bioquímica do Instituto Butantan. As amostras foram então analisadas em sistema de cromatografia líquida- espectrometria de massas em equipamento ESI-IT-TOF acoplado a UFLC (20A Prominence, Shimadzu). Cada amostra foi injetada em uma coluna C18 (Kinetex C18, 5 μm; 50 × 2,1 mm) em um sistema de solvente binário: (A) água : ácido (999 : 1) e (B) ACN : água : ácido (900 : 99: 1). Um gradiente de eluição de 0-100% de solvente B foi utilizado por 35 minutos a um fluxo constante de 0,2 mL.min-1. As amostras foram monitoradas por um detector Shimadzu SPD-M20A PDA antes de serem injetadas no espectrômetro de massa. A tensão da interface foi de 4,5 kV; a tensão capilar de 1,95 kV, a 200ºC; e a fragmentação induzida por uma colisão de argônio, com 55% de "energia". Os espectros de MS foram adquiridos no modo positivo, na faixa de m / z de 350-1400 e os espectros de MS / MS foram coletados na faixa de 50 a 1950 m / z. Os arquivos LCD foram convertidos em arquivos MGF pela ferramenta Shimadzu LCMSolution e carregados no Peaks Studio V7.0 (BSI, Canadá). Os dados foram processados de acordo com os seguintes parâmetros: MS e massa de erro MS / MS foram 0,1 Da; oxidação de metionina e carbamidometilação como modificação variável e fixa, respectivamente; tripsina como enzima de clivagem; clivagens perdidas máximas (3), PTMs variáveis máximas por peptídeos (3) e clivagem não específica (ambas); a taxa de descoberta falsa foi ajustada para ≤0,5%; apenas proteínas com pontuação 20 e contendo pelo menos 1 peptídeo único foram consideradas neste estudo. 40 | P á g i n a 4. RESULTADOS 4.1 ELETROFORESE SDS-PAGE Os resultados obtidos pela eletroforese SDS-PAGE revelaram que as hidrólises foram concluídas com êxito, podendo ser observados nas Figuras 8 a 11. A ausência de bandas proteicas nos géis de malha 12% e 20% representam a efetividade das hidrólises, representando amostras sem proteínas intactas, apenas com peptídeos. Figuras 8 e 9: Eletroforese SDS-PAGE realizada com géis de malha 12% (A) e 20% (B), respectivamente, das amostras de Paralonchurus brasiliensis (1), Micropogonias furnieri (2) e Hepatus pudibundus (3) hidrolisadas com Alcalase. As bandas marcadas à esquerda dos géis representam o padrão de massa molecular. Figuras 10 e 11: resultado da eletroforese SDS-PAGE realizada com géis de malha 12% (A) e 20% (B), respectivamente, das amostras de Paralonchurus brasiliensis (1), Micropogonias furnieri (2) e Hepatus pudibundus (3) hidrolisadas com Protamex. As bandas marcadas à esquerda dos géis representam o padrão de massa molecular. 250 150 100 75 50 37 25 20 250 150 100 75 50 37 25 20 KDa 1 2 3 A KDa 1 2 3 B 41 | P á g i n a 4.2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECTOR UV (CLAE) A cromatografia foi utilizada para se obter uma caracterização geral das amostras e visualizar qual seria o perfil dos compostos existentes, relacionando a complexidade e a polaridade. Quanto mais próximo do início da corrida, significa que os compostos encontrados são mais hidrofílicos, ou seja, possuem maior interação com a água. Os compostos que surgem em picos mais próximos ao final da corrida, são os mais hidrofóbicos, ou seja, possuem maior interação com o composto orgânico (acetonitrila), portanto, são apolares. As amostras de Paralonchurus brasiliensis indicaram poucas diferenças de picos ao comparar a amostra hidrolisada com Alcalase (Figura 12) com a hidrolisada Protamex (Figura 13), sendo possível notar a semelhança dos perfis na Figura 14. Em ambos os perfis cromatográficos de Paralonchurus brasiliensis os picos começaram a surgir em aproximadamente 9,2 minutos de corrida e eluiram a 45% de acetonitrila, portanto, é uma amostra com picos intermediários a apolares. É possível observar que a amostra hidrolisada com Alcalase obteve quatro picos majoritários, sendo três com polaridade intermediária e um apolar, enquanto a amostra hidrolisada com Protamex apresentou apenas três picos majoritários com polaridade intermediária. Figura 12: Perfil cromatográfico da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Alcalase. 42 | P á g i n a Figura 13: Perfil cromatográfico da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Protamex. Figura 14: Perfil cromatográfico da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Alcalase (cor preta) e Protamex (cor rosa). As amostras de Micropogonias furnieri apresentaram perfis peptídicos mais similares, onde os picos estão regulares em relação a amplitude e espaçamento, tendo como diferencial apenas o tempo de início dos picos, sendo 9,2 minutos na amostra hidrolisada com Alcalase (Figura 15) e 9,6 minutos na amostra hidrolisada com Protamex (Figura 16), porém ambos são classificados como polaridade intermediária a apolar devido a porcentagem de eluição começar em 45 a 50%. 43 | P á g i n a Figura 15: Perfil cromatográfico da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com Alcalase. Figura 16: Perfil cromatográfico da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com Protamex. 44 | P á g i n a Na figura 17 é possível observar a semelhança do perfil peptídico de ambas as amostras e a diferença de amplitude do primeiro pico. Na amostra hidrolisada com Alcalase foram encontrados seis picos majoritários, portanto seis produtos principais da digestão, e quatro picos majoritários da amostra hidrolisada com Protamex. Figura 17: Perfil cromatográfico da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com Alcalase (cor preta) e Protamex (cor rosa). A maioria dos picos majoritários encontrados possuem polaridade intermediária contendo apenas um pico majoritário polar na amostra com Protamex. E ambas as amostras possuem pequenos picos apolares. As amostras de Micropogonias furnieri apresentam polaridades similares se comparadas com as amostras de Paralonchurus brasiliensis. As amostras de Hepatus pudibundus (crustáceo) se mostraram mais peculiares do que as de Paralonchurus brasiliensis e Micropogonias furnieri (peixes) tendo grande diferença entre os perfis. É possível observar que na amostra hidrolisada com Alcalase (Figura 18) foram obtidos sete picos majoritários, onde quatro possuem polaridade intermediária e três são apolares, em contrapartida, na amostra com Protamex (Figura 19), foram obtidos apenas três picos majoritários, sendo dois polares e um apolar. Na Figura 20 fica nítida a diferença dos perfis peptídicos das amostras hidrolisadas com diferentes enzimas. Valendo ressaltar que a amostra hidrolisada com Alcalase mostrou mais resultado relacionado com a polaridade dos compostos. 45 | P á g i n a Figura 18: Perfil cromatográfico da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com Alcalase. Figura 19: Perfil cromatográfico da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com Protamex. Figura 20: Perfil cromatográfico da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com Alcalase (cor preta) e Protamex (cor rosa). 46 | P á g i n a 4.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS TIPO MALDI-TOF A espectrometria de massas tipo MALDI-TOF forma espectros de massa de acordo com sua razão massa/carga (m/z), os picos correspondem a massa molecular e indicam a quantidades de variáveis de cada substância analisada. Esse tipo de espectrometria é muito utilizado em análises de misturas e, portanto, foi um dos métodos escolhidos na realização do presente estudo. A Figura 21 mostra o perfil da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Alcalase, é possível observar um pico principal com uma massa de 1181,40 Da, sendo este constituído por 11 aminoácidos. Foram encontrados seis picos com 15 a 27 aminoácidos, com massas entre 1554,4 Da a 2774,5 Da. Figura 21: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Alcalase. 47 | P á g i n a Enquanto na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Protamex os resultados foram mais promissores, tendo em vista que houve dezesseis picos de peptídeos com potencial atividade biotecnológica contendo entre 11 a 20 aminoácidos, sendo o de maior massa 1977,5 Da, contendo de 19 a 20 aminoácidos em sua cadeia (Figura 22). Figura 22: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Protamex. Na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Alcalase, o pico com maior intensidade possui massa de 1102,98 Da, ao total foram dezoito picos de interesse, onde nove possuem cadeias com 15 a 25 aminoácidos (Figura 23). Por outro lado, a amostra hidrolisada com Protamex apresentou o maior pico com massa equivalente a 1181,60 Da, um total de vinte e dois picos, sendo treze com cadeias de 15 a 26 aminoácidos (Figura 24). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Int. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z 1[c].F8 3.6 mV[sum= 3604 mV] Profiles 1-1000 Smooth Gauss 50 -Baseline 150 Data: PA-R0001.F8[c] 15 Feb 2022 16:18 Cal: tof 15 May 2015 13:56 Shimadzu Biotech Axima Performance 2.9.3.20110624: Mode Reflectron, Power: 130, P.Ext. @ 5000 (bin 160) 1181.40 1115.42 1115.42 1142.38 1147.77 1147.78 1575.24 1575.25 1233.69 1424.93 1233.67 1668.48 1959.611476.14 1668.48 1977.59 48 | P á g i n a Figura 23: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Alcalase. Figura 24: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Protamex. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Int. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z 2[c].F6 1.9 mV[sum= 1643 mV] Profiles 143-1000 Smooth Gauss 50 -Baseline 150 Data: MA-R0001.F6[c] 15 Feb 2022 16:04 Cal: tof 15 May 2015 13:56 Shimadzu Biotech Axima Performance 2.9.3.20110624: Mode Reflectron, Power: 130, P.Ext. @ 5000 (bin 160) 1102.98 1181.27 1061.89 1575.10 1568.48 1345.38 1014.94 1190.45 1439.27 1214.46 1959.13 1430.38 1602.22 1794.99 2525.601984.76 2152.75 2341.62 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Int. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z 1[c].F9 4.0 mV[sum= 3976 mV] Profiles 1-1000 Smooth Gauss 50 -Baseline 150 Data: MP-R0001.F9[c] 15 Feb 2022 16:21 Cal: tof 15 May 2015 13:56 Shimadzu Biotech Axima Performance 2.9.3.20110624: Mode Reflectron, Power: 130, P.Ext. @ 5000 (bin 160) 1181.60 1207.46 1033.07 1068.75 1351.88 1739.921022.96 1235.67 1531.09 2134.211082.52 2342.401367.31 1780.18 1539.71 1959.61 2145.93 1749.41 2331.08 1945.47 2153.56 2604.87 49 | P á g i n a A análise das amostras de Hepatus pudibundus se mostraram mais peculiares e com grande potencial. Na amostra hidrolisada com Alcalase (Figura 25), foram reconhecidos vinte e três picos, onde treze estão no parâmetro de cadeias com 16 a 29 aminoácidos, a maior massa molecular encontrada foi de 2939,54 Da e o pico com maior interação possui 1686 Da. Na amostra hidrolisada com Protamex (Figura 26) foram constatados treze picos de peptídeos com 16 a 27 aminoácidos e um total de vinte e um picos. O pico com maior interação possui massa molecular de 1685,97 Da. Figura 25: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Alcalase. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Int. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z 1[c].F10 1.5 mV[sum= 1488 mV] Profiles 1-1000 Smooth Gauss 50 -Baseline 150 Data: HP-R0001.F10[c] 15 Feb 2022 16:24 Cal: tof 15 May 2015 13:56 Shimadzu Biotech Axima Performance 2.9.3.20110624: Mode Reflectron, Power: 130, P.Ext. @ 5000 (bin 160) 1685.97 1420.60 1101.81 1630.10 1425.48 1169.95 1868.64 1396.541062.72 1711.01 1086.08 1317.76 1704.56 1884.14 1616.76 1803.96 1985.98 2574.092182.31 2351.00 2743.55 50 | P á g i n a Figura 26: Resultado da análise de espectrometria de massas tipo MALDI-TOF gerado a partir da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Protamex. 4.4 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS – LC/MS A análise de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC/MS) foi realizada a fim de tentar entender a aparente divergência entre a riqueza de moléculas obtidas nas análises de espectrometria de massas MALDI-TOF e na quantidade de picos obtidos pela cromatografia líquida com detecção UV (CLEA). Na figura 27 consta o perfil encontrado na análise LC/MS realizada no peixe Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com Alcalase. Nesse perfil é possível notar que o pico majoritário se encontra em 9,35 minutos de corrida e os outros dois picos majoritários foram obtidos em 7,14 minutos e 8,17 minutos. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Int. 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z 1[c].F7 0.4 mV[sum= 439 mV] Profiles 1-1000 Smooth Gauss 50 -Baseline 150 Data: HA-R0001.F7[c] 15 Feb 2022 16:13 Cal: tof 15 May 2015 13:56 Shimadzu Biotech Axima Performance 2.9.3.20110624: Mode Reflectron, Power: 130, P.Ext. @ 5000 (bin 160) 1686.001169.111001.12 1486.58 1101.90 1005.51 1025.92 1290.99 1641.59 1223.99 1420.65 1711.34 1234.27 1462.52 1631.40 1425.63 1868.77 1618.29 1884.78 1861.39 2032.75 2219.15 2567.69 2735.34 2939.54 51 | P á g i n a Figura 27: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Alcalase obtido pela análise LC/MS, sendo uma amostra polar. É possível notar os picos majoritários presentes nos tempos de retenção de 7,14 minutos, 8,17 minutos e 9,35 minutos os quais foram ampliados e os resultados estão apresentados nas Figuras 28, 29 e 30, respectivamente. O pico com maior interação no tempo de retenção de 7,14 minutos, possui massa molecular de 401,23 Da – não visto no MALDI-TOF devido a sua baixa massa – e picos medianos com massas entre 263 Da a 554,3 Da. Nesse tempo de corrida a amostra também apresenta pequenos picos com massas que variam de 657,3 Da a 332,4 Da. No tempo de 8,17 minutos (Figura 29), o pico de maior interação tem massa molecular de 401,27 Da, sendo semelhante ao tempo de 7,14 minutos. O número de aminoácidos presentes nos peptídeos também é parecido, de 3 a 7 aminoácidos, com pequenos picos com maior massa molecular. 52 | P á g i n a Figura 28: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 7,14 minutos. Figura 29: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 8,17 minutos. Já no tempo de 9,35 minutos (Figura 30), o pico com maior interação possui 554,3 Da de massa molecular, já os outros picos são poucos e bem menores, contendo de 2 a 6 aminoácidos. Portanto, pode-se concluir que nos picos de 7,14 minutos, 8,17 minutos e 9,35 minutos predominam os peptídeos com 3 a 6 aminoácidos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Inten.(x1,000,000) 401.2723 263.1358 554.3064295.1572 451.2459 657.3361 710.3403 1332.4139822.5007 1122.74171013.1697 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Inten.(x1,000,000) 401.2735 538.2622 478.2131 265.1416 683.3547 742.3511 985.0338 1380.4107 53 | P á g i n a Figura 30: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 9,35 minutos. A amostra de Paralonchurus brasilensis hidrolisada com Protamex mostrou um perfil mais diverso (Figura 31) com picos significantes nos tempos de retenção de 8,94 minutos, 9,54 minutos, 11,35 minutos e 15,41 minutos. Além disso, a amostra se mostrou mais polar, tendo em vista que os picos foram surgindo no começo da corrida. Figura 31: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Protamex obtido pela análise LC/MS, sendo uma amostra polar. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 Inten.(x10,000,000) 554.3122 458.2978 416.2209 245.1644 648.2582 904.0299 54 | P á g i n a Ao ampliar o pico de 8,94 minutos (Figura 32), é possível observar que o pico com maior interação obteve 508,27 Da, possuindo 5 aminoácidos e não identificado por MALDI-TOF, e o pico de maior massa é de 1016,37 Da, contendo 10 aminoácidos. Figura 32: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 8,94 minutos. No tempo de 11,35 minutos (Figura 33), o maior pico encontrado possui massa de 585,3 Da, contendo 5 ou 6 aminoácidos e o de maior massa é de 1118,4 Da, possuindo 11 aminoácidos e já observado em MALDI-TOF. Em 15,41 minutos (Figura 34) foi encontrado um pico com 776,3 Da, sendo este o de maior interação e um pico de 1317,6 Da, possuindo a maior massa encontrada nesse tempo de retenção. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 Inten.(x10,000,000) 508.2718 245.1794 303.1502 605.2810 718.3265619.2793 809.3648 1016.3717 55 | P á g i n a Figura 33: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 11,35 minutos. Figura 34: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 15,41 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Inten.(x1,000,000) 776.3297 651.9532 589.2692 977.8357 515.2070401.2338 1163.7002782.3070279.1490 905.3192 1059.3079 1317.6170 56 | P á g i n a As amostras de Micropogonias furnieri mostraram perfis parecidos com os de Paralonchurus brasiliensis, o gráfico correspondente ao perfil da amostra hidrolisada com Alcalase é mostrada na Figura 35. Figura 35: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Alcalase obtido pela análise LC/MS, onde é possível notar a polaridade da amostra. A amostra é predominantemente polar, possuindo alguns compostos intermediários e poucos apolares, nos picos principais foram encontrados compostos de baixa massa molecular. No tempo de retenção de 7,15 minutos (Figura 36) está o pico de maior retenção, onde o íon principal foi de 401 Da – também não identificado pelo MALDI-TOF. A maioria possui massa molecular entre 263 Da a 700 Da, o composto de maior massa corresponde a 1402 Da, possuindo 14 aminoácidos em sua cadeia. No total foram registrados onze picos. 57 | P á g i n a Figura 36: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 7,15 minutos. No tempo de 9,35 minutos (Figura 37), os picos de principais possuem massa de 554 Da, 5 aminoácidos e 456 Da, 4 aminoácidos, em um total de sete picos, os compostos se concentram em massas entre 245,1 Da e 648,2 Da. O pico com maior massa molecular registrado foi de 1028,55 Da, possuindo 10 aminoácidos em sua cadeia. Figura 37: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 9,35 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Inten.(x1,000,000) 401.2730 451.2453 263.1391 295.1392 554.3060 657.3340 733.3091 869.3526 1401.97981065.8901 1198.0081 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Inten.(x10,000,000) 554.3125 458.2987 416.2224 245.1778 648.2483 923.4867 1028.5565 58 | P á g i n a Os peptídeos encontrados no tempo de retenção de 12,67 minutos (Figura 38) se mostraram com picos menores, possuindo o pico de maior interação com 467 Da, e o pico de maior massa molecular com 1278 Da, ou seja, 12 ou 13 aminoácidos em cadeia. Lembrando que um pico não necessariamente indica apenas uma molécula. Figura 38: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 12,67 minutos. A amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com a enzima Protamex (Figura 39) possui um perfil cromatográfico polar, com três picos principais, no tempo de retenção de 7,5 minutos, 8,9 minutos e 9,65 minutos. Nos três tempos é possível observar que há apenas um pico com grande interação, sendo os outros significativamente menores. No tempo de 7,5 minutos (Figura 40) o maior pico possui massa de 444,27 Da, ou seja, 4 aminoácidos na cadeia, já a maior massa registrada nesse tempo de retenção é de 1487,8 Da, 14 ou 15 aminoácidos, de um total de doze picos. Em 8,9 minutos (Figura 41), foram registrados apenas seis picos, sendo o de maior interação com massa 508,27 Da e o de maior massa 635,28 Da, contendo 5 e 6 aminoácidos respectivamente, portanto nesse tempo de retenção foram obtidos apenas peptídeos com baixa massa molecular. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Inten.(x1,000,000) 467.2209 547.2666634.2906392.2257 261.1527 358.2495 895.3504 716.3316 1278.0200994.6816 1119.6626 59 | P á g i n a Figura 39: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Protamex obtido pela análise LC/MS. Figura 40: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 7,5 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Inten.(x1,000,000) 444.2762 508.2618 350.1568 558.2670 279.1292 683.3477 699.3089 1127.6071873.4532 1487.80671233.1094 60 | P á g i n a Figura 41: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 8,9 minutos. O tempo de retenção de 9,65 minutos (Figura 42) também não registrou muitos peptídeos, sendo sete picos no total, onde o de maior interação possui massa de 245.17 Da, 2 aminoácidos na cadeia e o de maior massa 976,63 Da, contendo 9 ou 10 aminoácidos. Figura 42: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 9,65 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Inten.(x10,000,000) 245.1663 328.2063 488.2488 429.2221 568.2880 807.3438 976.6318 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 Inten.(x10,000,000) 508.2703 346.2252 245.1671 373.2459 605.2841 635.2892 61 | P á g i n a Com essas informações podemos dizer que a amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Protamex obteve peptídeos com menores massas moleculares, já que a média de aminoácidos em cadeia foi de 4 a 9. A amostra do crustáceo Hepatus pudibundus hidrolisada com Alcalase (Figura 43) é considerada polar, com apenas dois pequenos picos com apolares. Seus três picos principais estão no tempo de retenção de 10,34 minutos, 11,73 minutos e 12,3 minutos. No tempo de retenção de 10,34 minutos (Figura 44), no geral, foram obtidos pequenos picos, onde o de maior interação possui massa molecular de 391,88 Da, ou seja, 3 ou 4 aminoácidos na cadeia e o de maior massa foi de 1362,33 Da, portanto, 13 aminoácidos, que já havia sido registrado com o MALDI-TOF. Os picos menores variam de 2 a 8 aminoácidos na cadeia, tanto esses, quanto o de maior interação não foram registrados no MALDI-TOF. Figura 43: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Alcalase obtido pela análise LC/MS, onde é possível notar que se trata de uma amostra polar. 62 | P á g i n a Figura 44: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 10,34 minutos. Observando o gráfico do tempo de retenção de 11,73 (Figura 45) foram obtidos apenas cinco picos existentes, sendo o de maior intensidade o pico de massa 620,3 Da, contendo 6 aminoácidos na cadeia e o de maior massa 719,3 Da, portanto, 7 aminoácidos. Figura 45: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 11,73 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Inten.(x1,000,000) 391.8800 587.3128 474.2404362.8651 795.3889 658.2823 227.1710 707.3320 870.3742 1362.33091173.0700 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Inten.(x1,000,000) 620.3025 520.2599 542.2462 403.2035 719.3012 63 | P á g i n a Dos outros três picos encontrados dois possuem 5 aminoácidos na cadeia e um possui 4 aminoácidos. Dessa maneira, o gráfico do tempo de retenção citado revela um pequeno arranjo de peptídeos com baixa massa molecular que não foram detectados pelo MALDI-TOF. No tempo de retenção de 12,30 (Figura 46) minutos nota-se poucos picos com vários peptídeos de baixa massa, sendo nove picos variando de 270,1 Da a 908,3 Da, onde o de maior interação com 401,2 Da, além de um pequeno pico maior de 1230,7 Da, sendo este com 12 aminoácidos. No geral, este tempo de retenção revelou picos com uma variação de 3 a 9 aminoácidos em cadeia, considerados peptídeos de baixa massa molecular. Figura 46: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Alcalase no tempo de 12,3 minutos. A amostra do crustáceo Hepatus pudibundus hidrolisada com Protamex (Figura 47) é considerada polar a intermediária, os picos considerados principais foram encontrados nos tempos de retenção de 6,63 minutos, 10,44 minutos e 11,79 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Inten.(x1,000,000) 401.2652 270.1792 586.2850 801.5058 360.1955 514.2333 721.3366618.2988 908.3541 1230.7136 64 | P á g i n a Figura 47: Resultado do perfil peptídico total da amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Protamex obtido pela análise LC/MS, onde é possível notar que se trata de uma amostra polar a intermediária. O perfil relacionado ao tempo de retenção de 6,63 (Figura 48) minutos apresentou treze picos, dos quais o de maior intensidade possui 437,23 Da, ou seja, 4 aminoácidos e o de maior massa molecular aproximadamente 1500 Da, 15 aminoácidos. A maior parte dos peptídeos estão entre 279,14 Da e 626,36 Da. Figura 48: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 6,63 minutos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Inten.(x1,000,000) 437.2359 316.1767 279.1434 562.2746470.3145 626.3628 1368.77681264.6008 1490.8602833.1379 987.1771 1106.6630 65 | P á g i n a Foram registrados dez picos no tempo de retenção de 10,44 minutos (Figura 49), onde a maioria se encontra entre 227,14 Da e 867,35 Da, portanto, possuem de 2 a 8 aminoácidos, compondo peptídeos de baixa massa molecular que não foram registrados por MALDI-TOF. O peptídeo de maior massa molecular possui 1074,72 Da, com 10 aminoácidos em sua cadeia. No tempo de retenção de 11,79 minutos (Figura 50) também constatou peptídeos de baixa massa molecular, em um total de sete picos, os peptídeos são de 229,15 Da a 848,44 Da, portanto de 2 a 8 aminoácidos. A maior interação está no pico com 620,3 Da, contendo 6 aminoácidos em sua cadeia. Figura 49: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 10,44 minutos 66 | P á g i n a Figura 50: Massas moleculares obtidas por LC/MS realizado na amostra de Hepatus pudibundus hidrolisado com a enzima Protamex no tempo de 11,79 minutos 4.5 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS SEQUENCIAL – LS/MSMS A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial ou LS/MSMS realiza as estatísticas da análise, onde os padrões de peptídeos são colocados para saber quais proteínas originaram os peptídeos existentes nas amostras e qual foi a relevância da clivagem realizada. Foram várias proteínas descritas nas listas, porém foi necessária a utilização do banco de dados de Teleostei para os peixes e Arthropoda para o crustáceo. Os resultados obtidos pelas análises proteômicas estão disponíveis em Anexo. Essa análise foi imprescindível para o controle de qualidade da amostra, comprovando que o preparo da amostra foi eficiente, tendo em vista que as proteínas que originaram os peptídeos encontrados são todas de origem muscular, como actina, miosina e beta-actina. Dessa maneira, o controle de qualidade foi positivo comprovando que não houve contaminação de outros tecidos e órgãos. 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 m/z 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Inten.(x10,000,000) 620.3069 520.2625 569.2666403.1983 229.1547 718.2544 838.4409 67 | P á g i n a 4.6 SEQUENCIAMENTO DE NOVO No caso de organismos que não tenham o genoma sequenciado e, portanto, possuem poucas proteínas que constam nos bancos de dados, a abordagem de sequenciamento de novo é essencial. Nele os peptídeos são sequenciados por massa independente de banco de dados ou análises proteômicas. Dessa maneira, esse sequenciamento foi realizado no parâmetro de até 85% de confiança para o score de novo, os resultados completos estão em anexo. Nas Tabelas 4 e 5 estão descritos os peptídeos com confiança média até 90% encontrados nas amostras de Paralonchurus brasiliensis hidrolisadas com Alcalase e com Protamex, respectivamente. O programa de alinhamento BLAST77 foi utilizado na busca em bancos de dados de ácidos nucléicos e proteínas por sequências homólogas e para a realização do alinhamento local por pares de sequências. Dessa maneira, essa ferramenta permitiu uma análise individual das sequências peptídicas com confiança média geral (ALC) até 90%. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 6 e 7, sendo amostras hidrolisadas com Alcalase e Protamex, respectivamente. Já as Tabelas 8 e 9 representam as bioatividades já encontradas presente nos peptídeos registrados no banco de dados BioPep78, sendo a Tabela 8 as amostras hidrolisadas com Alcalase e Tabela 9 as amostras hidrolisadas com Protamex, permitindo assim, uma comparação dos peptídeos gerados pelas duas hidrólises. Tabela 4: Peptídeos encontrados na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Alcalase pelo sequenciamento de novo, com confiança média geral até 90%. Onde, ALC = confiança média geral, RT = tempo de retenção, ppm = chance de erro na identificação da sequência peptídica. Peptídeo ALC (%) Massa RT ppm LLAPPE 97 638.36 11.09 -0.8 YEKK 96 566.30 0.69 0.1 LVYPSV 94 676.37 13.97 -31.2 VKLPKL 94 696.48 11.25 -0.6 LKYPLE 94 761.43 11.22 -0.8 LDFDEFLMK 94 1156.54 14.85 0.7 LLDQDKSGFLE 93 1263.63 11.60 5.2 SERRLL 93 772.45 11.54 -15.0 EYKK 92 566.30 7.02 0.0 LLVYPW 91 789.44 14.90 -0.4 TGPLKF 91 661.37 11.39 -0.8 VDLVSFK 91 806.45 13.15 -26.9 QDDKLKDK 91 988.51 8.10 -0.5 VGADKK 90 616.35 2.03 -1.3 VVDRLK 90 728.45 11.18 -16.1 68 | P á g i n a Tabela 5: Peptídeos encontrados na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Protamex pelo sequenciamento de novo, com confiança média geral até 90%. Onde, ALC = confiança média geral, RT = tempo de retenção, ppm = chance de erro na identificação da sequência peptídica. Tabela 6: Análise individual das sequências peptídicas encontradas na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Alcalase, visando alinhamento e consequência pelo banco de dados BLAST77, descrição das dez primeira sequencias peptídicas. Sendo Query cover = porcentagem da sequência enviada conseguiu realizar um alinhamento, E value = possibilidade de o alinhamento ter sido realizado ao acaso (quanto mais perto do valor 0, maior é a confiabilidade) e Seq ID = identificação da sequência peptídica. Peptídeo ALC (%) Massa RT ppm LEEEELKLF 97 1148.59 13.44 -0.4 EYKK 95 566.30 2.46 -0.3 VDLWFK 95 806.43 13.17 -0.9 LKLFL 94 632.42 13.64 -0.4 LEDDLVALK 92 1014.55 12.13 5.3 VGDEAKSQ 91 832.39 8.15 0.1 VDLWFKA 90 877.46 13.37 -1.1 TVDDKVELE 90 1046.51 11.30 -0.4 LVVDRKL 90 841.53 12.90 -14.4 LLDKNRDGLLSQ 90 1370.75 10.32 4.4 EARE 90 503.23 4.23 -0.1 QGREK 90 616.32 4.94 0.1 Peptídeo Massa Query cover E value Seq. ID Descrição Espécie LLAPPE 638.36 100% 520 TSK3760.1 Roquin-1 Hemibagrus wyckioides YEKK 566.30 100% 19223 TSR51413.1 Titina Bagarius yarrelli LVYPSV 676.37 100% 367 XP_043868191.1 Proteína dedo de zinco Solea senegalensis VKLPKL 696.48 100% 738 XP_035982871.1 Isoforma de proteína ANHAK associada à diferenciação de neuroblastos Fundulus heteroclitus LKYPLE 761.43 100% 182 RXN10808.1 Miosina Labeo rohita LDFDEFLMK 1156.54 100% 1.9 XP_042563305.1 Proteína de ligação ao cálcio Clupea harengus LLDQDKSGFLE 1263.63 100% 0.52 TSK14644.1 Parvalbumina Bagarius yarrelli SERRLL 772.45 100% 520 XP_024127336.1 Ubiquitina-ligase Oryzias melastigma EYKK 566.30 100% 19233 TSR51413.1 Titina Bagarius yarrelli LLVYPW 789.44 100% 33 XP_028311025.1 Hemoglobina beta- A-like Gouania willdenowi 69 | P á g i n a Tabela 7: Análise individual das sequências peptídicas encontradas na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Protamex, visando alinhamento e consequência pelo banco de dados BLAST77, descrição das dez primeira sequencias peptídicas. Tabela 8: Bioatividades encontradas nos peptídeos presentes na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Alcalase através da utilização do banco de dados BioPep78, apenas as sequencias com confiança média geral (ALC) até 90% foram descritas. Peptídeo Massa Sequência Bioatividades LLAPPE 638,36 LAP, AP, LA, PP Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina PP, LA, AP, LL, LLAP Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV PP, PE Inibidor de alfa-glicosidase LA, PE Inibidor da Dipeptidil Peptidase III YEKK 566,3 EK, YE Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina KK Ligante de permease bacteriana EK, KK, YE Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LVYPSV 676,37 LVYP, VY, VYP, YP, LVY Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina VY Antioxidante YP, LV, OS, SV, VY Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV YP Inibidor de alfa-glicosidase VY Inibidor da Dipeptidil Peptidase III Peptídeo Massa Query cover E value Seq. ID Descrição Espécie LEEEELKLF 1148.59 100% 1.4 P86432.1 Parvalbumina Oncorhynchus mykiss EYKK 566.30 100% 19223 TSR51413.1 Titina Bagarius yarrelli VDLWFK 806.43 100% 46 XP_021169181.2 Nucleosídeo difosfato quinase B Fundulus heteroclitus LKLFL 632.42 100% 4595 XP_023808923.1 Nesprina-1 Oryzias latipes LEDDLVALK 1014.55 100% 5.6 KAF6714773.1 Serina beta- lactamase- like LACTB. mitocondrial Oryzias melastigma VGDEAKSQ 832.39 100% 855 XP_020777739.1 Serotransferrina-like Boleophthalmus pectinirostris VDLWFKA 877.46 100% 7.3 XP_021169181.2 Nucleosídeo difosfato quinase B Fundulus heteroclitus TVDDKVELE 1046.51 88% 22 XP_040927192.1 Cadeia pesada de miosina Betta splendens LVVDRKL 841.53 100% 473 XP_016302193.1 WD repeat- containing protein 3- like Sinocyclocheilus anshuiensis LLDKNRDGLLSQ 1370.75 100% 0.89 XP_022539758.1 Proteína de ligação ao cálcio Astyanax mexicanus 70 | P á g i n a VKLPKL 696,48 VK, KL, KLP, LP Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina VKL Antioxidante LP, PK, VK Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LKYPLE 761,43 YP, PL, KY Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LK Antioxidante YP, PL, KY Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV YPL, YP Inibidor de alfa-glicosidase LDFDEFLMK 1156,54 DF, EF Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina FL, LM, MK Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV FL Inibidor da Dipeptidil Peptidase III EF Inibidor de renina LLDQDKSGFLE 1263,6 GF, SG Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina GFL Imunoestimulante LL, FL, DQ, GF, KS, QD Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV FL, GFL Inibidor da Dipeptidil Peptidase III SERRLL 772,45 RL, RR, ER Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LL, RL, RR Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV RR Inibidor da Dipeptidil Peptidase III EYKK 566,3 YK, EY Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina KK Ligante de permease bacteriana EY, KK, YK Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV YK Inibidor da Dipeptidil Peptidase III LLVYPW 789,44 LVYP, VY, VYP, YP, LVY Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina PW, VY, YPW Antioxidante LL, YP, LV, PW, VY Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV YP Inibidor de alfa-glicosidase VY, LVYPW Inibidor da Dipeptidil Peptidase III TGPLKF 661,37 GP Atividade anti-amnésica GPL, GP, PL, TG, KF, TGP Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina GP Antitrombótica LK Antioxidante GP, PL, KF, TG Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV KF Inibidor de renina VDLVSFK 806,45 SF Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LV, SF, VD, VS Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV SF Inibidor de renina QDDKLKDK 988,51 KL Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina KD, LK Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV QD Antioxidante VGADKK 616,35 VG, GA Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina KK Ligante de permease bacteriana GA, AD, KK, VG Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV AD Inibidor de alfa-glicosidase 71 | P á g i n a Tabela 9: Bioatividades encontradas nos peptídeos presentes na amostra de Paralonchurus brasiliensis hidrolisada com Protamex através da utilização do banco de dados BioPep78, apenas as sequencias com confiança média geral (ALC) até 90% foram descritas. Peptídeo Massa Sequência Bioatividades LEEEELKLF 1148.59 LKL, LF, KL, LEE Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina EL, LK Antioxidante EYKK 566.30 YK, EY Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina KK Ligante de permease bacteriana EY, KK, YK Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV YK Inibidor da Dipeptidil Peptidase III VDLWFK 806.43 LW Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LWF, LW Antioxidante LW, WF, VD Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LW Inibidor da Dipeptidil Peptidase III LW Inibidor de renina LKLFL 632.42 LKL, LF, KL Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LK Antioxidante FL Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV FL Inibidor da Dipeptidil Peptidase III LEDDLVALK 1014.55 LK Antioxidante VA, AL, LV Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV VGDEAKSQ 832.39 VG, GD, EA Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina EAK Antioxidante KS, VG Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV EA Inibidor de alfa-glicosidase VDLWFKA 877.46 LW, KA Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LWF, LW Antioxidante KA, LW, WF, VD Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LW, KA Inibidor da Dipeptidil Peptidase III LW Inibidor de renina TVDDKVELE 1046.51 VE Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina EL Antioxidante KV, TV, VD, VR Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV VE Inibidor de alfa-glicosidase LVVDRKL 841.53 KL, DR Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina VV, DR, LV, RK, VD Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LLDKNRDGLLSQ 1370.75 GL, DG, DGL Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LL, GL, NR Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV NR Inibidor de renina EARE 503.23 EA, AR Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina EA Inibidor de alfa-glicosidase QGREK 616.32 GR, QG, EK Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina EK, QG Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV 72 | P á g i n a Nas Tabelas 10 e 11 estão descritas as amostras de Micropogonias furnieri hidrolisadas com Alcalase e com Protamex, respectivamente, de acordo com os dados que foram obtidos a partir do no sequenciamento de novo. Os resultados obtidos pelo programa de alinhamento BLAST77 realizado nas sequencias peptídicas com confiança média geral (ALC) até 90%, estão representados nas Tabelas 12 e 13, sendo amostras hidrolisadas com Alcalase e Protamex, respectivamente. Já nas Tabelas 14 e 15 estão descritas as bioatividades presentes nos peptídeos registrados pelo banco de dados BioPep78, sendo a Tabela 14 as amostras hidrolisadas com Alcalase e Tabela 15 as amostras hidrolisadas com Protamex, permitindo assim, uma comparação dos peptídeos gerados pelas duas hidrólises. Tabela 10: Peptídeos encontrados na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Alcalase pelo sequenciamento de novo, com confiança média geral até 90%. Onde, ALC = confiança média geral, RT = tempo de retenção, ppm = chance de erro na identificação da sequência peptídica. Peptídeo ALC (%) Massa RT ppm LDEVLKFF 95 1009.54 14.37 -0.4 LEHEE 95 655.28 8.51 3.2 LNNLL 93 585.34 11.73 -37.8 TKTPGLME 93 875.44 10.50 -1.2 KLKKK 93 643.47 0.94 0.5 MKFLW 92 723.37 13.84 -1.8 LKYPLE 92 761.43 11.25 -1.5 APPHLF 91 680.36 11.68 -1.5 LLAPPEVGKY 91 1085.61 10.01 8.3 VVDGVKL 91 728.44 11.24 -1.5 WLDPDDFPLLLFS 91 1576.78 15.34 5.8 FLFGSKDKDPP 90 1249.63 11.36 -14.3 AGDDAPVK 90 771.37 8.96 -33.0 LLVYPW 90 789.44 14.89 0.0 KKTSPAE 90 759.41 1.29 14.0 FDDLQVR 90 891.44 11.05 -1.5 KDLLMVLTHSK 90 1283.72 12.36 -15.7 KFLVLADLW 90 1103.63 13.30 2.2 73 | P á g i n a Tabela 11: Peptídeos encontrados na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Protamex pelo sequenciamento de novo, com confiança média geral até 90%. Onde, ALC = confiança média geral, RT = tempo de retenção, ppm = chance de erro na identificação da sequência peptídica. Tabela 12: Análise individual das sequências peptídicas encontradas na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Alcalase, visando alinhamento e consequência pelo banco de dados BLAST77, descrição das dez primeiras sequências peptídicas. Peptídeo Massa Query cover E value Seq. ID Descrição Espécie LDEVLKFF 1009.54 100% 1.6 XP_034043238.1 ATPase 2-like Thalassophryne amazonica LEHEE 655.28 100% 1610 XP_036065667.1 Titina Oryzias melastigma LNNLL 585.34 100% 4594 XP_029692942.1 Titina-like Takifugu rubripes TKTPGLME 875.44 100% 2.2 TWW70116.1 Cadeia pesada de miosina Takifugu rubripes KLKKK 643.47 100% 9253 XP_046728865.1 Nesprina-2 Silurus meridionalis MKFLW 723.37 100% 141 KAA0719128.1 Proteína dedo de zinco Sinocyclocheilus rhinocerous LKYPLE 761.43 100% 182 RXN10808.1 Miosina-Vc não convencional Labeo rohita APPHLF 680.36 100% 182 XP_029608157.1 Metilcitosina dioxigenase Salmo trutta LLAPPEVGKY 1085.61 100% 56 XP_013882412.1 Tomoregulina-1 Austrofundulus limnaeus VVDGVKL 728.44 100% 116 TSK22821.1 Creatina kinase Bagarius yarrelli Peptídeo ALC (%) Massa RT ppm LEEEELKLF 97 1148.59 13.44 -0.3 FLDLDQDKKFEE 94 1525.73 12.66 -0.7 LVLHL 93 593.39 12.64 -1.2 VLDQDKSGFLE 93 1249.61 11.38 -0.4 LEKERL 93 786.45 11.42 -37.0 LVLDAGDRTH 92 1095.56 11.28 -10.2 LVEELPARW 92 1111.60 13.24 22.3 LHDQH 92 648.29 3.70 0.3 VGDEAQSK 92 832.39 8.09 0.0 VMLKQ 91 617.35 5.47 -31.3 FSVDEEFPDLSQH 91 1548.67 13.11 1.0 LEDQYSELK 91 1123.53 10.84 -0.3 DVEEFPDLSHQ 90 1314.57 12.03 -0.7 FAGDDAPRAL 90 1031.50 11.22 -0.9 LKEAETR 90 845.46 8.38 0.1 74 | P á g i n a Tabela 13: Análise individual das sequências peptídicas encontradas na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Protamex, visando alinhamento e consequência pelo banco de dados BLAST77, descrição das dez primeiras sequências peptídicas. Tabela 14: Bioatividades encontradas nos peptídeos presentes na amostra de Micropogonias furnieri hidrolisada com Alcalase através da utilização do banco de dados BioPep78, apenas as sequencias com confiança média geral (ALC) até 90% foram descritas. Peptídeo Massa Sequência Bioatividades LDEVLKFF 1009.54 KF, EV, FF Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LK Antioxidante EV, KF, VL, FF Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV KF Inibidor de renina LEHEE 655.28 EH, HE Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV LNNLL 585.34 LN Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina LL, LN, NL, NN Inibidor da Dipeptidil Peptidase IV TKTPGLME 875.44 PGL, GL, PG, ME, TP Inibidor da Enzima Conversora da Angiotensina PG Atividade anti-amnésica PG Antitrombótica Peptídeo Massa Query cover E value Seq. ID Descrição Espécie LEEEELKLF 1148.59 100% 2.0 TWW69872.1 Parvalbumina Beta 2 Takifugu flavidus FLDLDQDKKFEE 1525.73 100% 7.2 XP_016411869.1 Ubiquitina carboxil- hidrolase Sinocyclocheilus rhinocerous LVLHL 593.39 100% 4595 XP_023807343.1 Nesprina-1 Oryzias latipes VLDQDKSGFLE 1249.61 100% 0.066 TSK77154.1 Parvalbumina Beta Bagarius yarrelli LEKERL 786.45 100% 366 XP_041932362.1 Nesprina-1 Alosa sapidissima LVLDAGDRTH 1095.56 100% 28 XP_028972366.2 Glicogenina-2 Esox lucius LVEELPARW 1111.60 100% 16 XP_