UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ATUALIZAÇÕES SOBRE BIOLOGIA E MANEJO CONSERVACIONISTA EM PRIMATAS ATELÍDEOS DA ESPÉCIE Lagothrix cana MARCELO ROCHA CARNEIRO Botucatu – SP 2018 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA ATUALIZAÇÕES SOBRE BIOLOGIA E MANEJO CONSERVACIONISTA EM PRIMATAS ATELÍDEOS DA ESPÉCIE Lagothrix cana MARCELO ROCHA CARNEIRO Tese apresentada à Banca de Defesa do Programa de Pós-Graduação em Animais Selvagens, como exigência parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientadora: Profª Drª Lígia Souza Lima Silveira da Mota Botucatu – SP 2018 MARCELO ROCHA CARNEIRO ATUALIZAÇÕES SOBRE BIOLOGIA E MANEJO CONSERVACIONISTA EM PRIMATAS ATELÍDEOS DA ESPÉCIE Lagothrix cana COMISSÃO EXAMINADORA Membros Titulares: Profª Drª Lígia Souza Lima Silveira da Mota – Orientadora Prof. Dr. Carlos Roberto Teixeira Prof. Dr. Vidal Haddad Júnior Profª Drª Lisiane de Almeida Martins Dr. Caio Henrique Paganini Burini Membros Suplentes: Profª Drª Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt Prof. Dr. Paulo Rogério Mangini Dr. Augusto Kluczkovski Junior Data da Defesa: 10 de Dezembro de 2018. Às minhas filhas... AGRADECIMENTOS Aos meus avós, Profs. José Candido Rocha (in memorian) e Levy Miró Carneiro (in memorian), eternos exemplos nas áreas de pesquisa e docência em ciências da saúde, sempre pautando as ações na ética e na humildade. À minha esposa, minhas filhas, meus pais e minhas irmãs, pela confiança e pela compreensão em meus períodos de ausência. Aos Professores que me inspiraram, excepcionalmente à minha orientadora, Profª Drª Lígia Silveira da Mota, pela paciência, pela compreensão e pelo exemplo de esforço e resiliência. Aos Professores Carlos Roberto Teixeira e Sheila Canavese Rahal, por me acolherem, quando eu passava por um momento extremamente delicado. A meu eterno conselheiro, Prof. Pós-Dr. José Ricardo Pachaly, pela paciência e presteza com que sempre se dispôs a me atender, pelos sapientíssimos conselhos, pela franqueza, às vezes áspera e pela competência, que sempre marcaram todos os seus trabalhos; e, acima de tudo, pela amizade. Ao Prof. Dr. Fabiano Montiani-Ferreira, pela providencial ajuda com as análises estatísticas. Aos colegas de Manaus, Augusto e Laerzio e às equipes de apoio do CETAS Sauim Castanheiras e Fundação Floresta Viva, pela oportunidade de estar tão próximo a essa emblemática espécie. À toda equipe do Laboratório de Genética Animal, do Instituto de Biociências – UNESP, principalmente à M.Sc. Talita Roberto Aleixo de Almeida, pelo apoio e pela atenção. Ao amigo e colega, Dr. Newton Lucchiari e à sua doce família, pela acolhida e pelo carinho de sempre. Aos meus colegas de graduação, Lucacin, Bagé, Vila, Rui, Pé-de-Boi, Tim, Ênio, Aluizio, Juliano, Deusnildo, Bugrão, Cabelo, Tigela, Jeca, Grego, Pirajú, Chico, Beto, Arturo, Milão, Tomitam, Abdala, Bob, e, em especial, a meu amigo Peão, pelo apoio incondicional. A meus amigos de infância, principalmente, àqueles que já nos deixaram. A todos os parceiros de trabalho, com quem convivi, nessas duas décadas de vida profissional. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de estudos. "O saber, a gente aprende com os mestres e com os livros; A sabedoria, se aprende é com a vida e com os humildes..." (Cora Coralina) viii SUMÁRIO Página LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................ x. LISTA DE QUADROS E TABELAS .......................................................... xi. LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................... xii. RESUMO .................................................................................................. xiv. ABSTRACT .............................................................................................. xv. 1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 1. 2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 5. 2.1 Medicina da Conservação ................................................................ 5. 2.2 Classificação Taxonômica dos Primatas Platirrinos ............................ 6. 2.3. Família Atelidae (Gray, 1825) ............................................................. 7. 2.4. Gênero Lagothrix ................................................................................ 8. 2.5. Lagothrix cana (Geoffroy, 1812) .......................................................... 12. 2.6. Contenção Farmacológica .................................................................. 13. 3 OBJETIVOS ......................................................................................... 16. 3.1 Gerais ..................................................................................................... 16. 3.2 Específicos .............................................................................................. 16. 3.3 Autorizações ........................................................................................... 17. 4 MATERIAIS E MÉTODO ...................................................................... 17. 4.1 Local ....................................................................................................... 17. 4.2 Animais ............................................................................................... 17. ix 4.3 Extração de DNA e avaliação da qualidade do material obtido .......... 21. 4.4 Reação de amplificação (PCR) e purificação do produto.................... 22. 4.5 Sequenciamento Nucleotídico ............................................................ 23. 4.6 Análise dos dados / Edição e Alinhamento das Sequências................ 24. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 24. 5.1 Quanto à contenção farmacológica ..................................................... 24. 5.2 Quanto à obtenção do material biológico ............................................ 26. 6 CONCLUSÕES .................................................................................... 32. 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 33. 8 ANEXOS ................................................................................................ 42. 8.1 Cópia de artigo publicado durante o período do Doutorado ................. 42. 8.2 Cópia de artigo aceito para publicação produzido durante o período do Doutorado ...................................................................................... 51. 8.3 Cópia da carta de aceite de publicação de artigo produzido durante o período do Doutorado ...................................................................... 68. 8.4 Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Biociências – Brazilian Journal of Biosciences ........................................................................ 69. x LISTA DE ILUSTRAÇÕES Página FIGURA 1 - Imagem de um macaco barrigudo (Lagothrix cana) infante, utilizando a cauda prênsil como apoio ......................................... 7. FIGURA 2 - Distribuição geográfica dos cinco morfotipos reconhecidos atualmente de macacos- barrigudos ........................................... 8. FIGURA 3 - Imagem de uma fêmea lactente de macaco- barrigudo (Lagothrix cana), com filhote às costas ......................................................... 9. FIGURA 4 - Imagem de uma fêmea lactente de macaco- barrigudo (Lagothrix cana), com filhote às costas ......................................................... 9. FIGURA 5 - Imagem de um exemplar adulto de macaco- barrigudo (Lagothrix cana) evidenciando a coloração da pelagem dos membros ......... 12. FIGURA 6 - Imagem do procedimento prévio à contenção de um macaco- barrigudo (Lagothrix cana) adulto, por meio da utilização de zarabatana para propulsão de dardo artesanal pressurizado contendo a solução ZAD-50 ........................................................ 18. FIGURA 7 - Imagem de dardo confeccionado artesanalmente para execução de captura de macacos-barrigudos (Lagothrix cana) ................... 18. FIGURA 8 - Venopunção da veia braquial para colheita de sangue em macaco-barrigudo (Lagothrix cana) ............................................. 19. FIGURA 9 - Tubo de ensaio contendo anticoagulante (EDTA), após colheita de amostra de sangue de exemplar de macaco-barrigudo (Lagothrix cana) ........................................................................... 19. FIGURA 10 - Exemplar adulto de macaco-barrigudo (Lagothrix cana) sendo monitorado quanto à temperatura corporal e oximetria de pulso.............................................................................................. 20. FIGURA 11 - Exemplo de ficha anestésica utilizada na monitorização de macacos-barrigudos (Lagothrix cana), durante o trabalho de pesquisa....................................................................................... 21. xi . LISTA DE QUADROS E TABELAS Página QUADRO 1 - Frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e saturação parcial de oxigênio (SpO2) de 21 primatas adultos da espécie Lagothrix cana, submetidos a contenção farmacológica e anestesia dissociativa de campo pela associação de Zoletil®, Atropina e Detomidina (“ZAD-50”), em doses calculadas por meio de extrapolação alométrica interespecífica (média ± desvio padrão) .............................................................................................................. 25. QUADRO 2 - Relação de amostras obtidas de macacos-barrigudos (Lagothrix cana) submetidas à avaliação de integridade das amostras e quantificação de DNA ......................................................................... 27. TABELA 1 - Sítios variáveis em 567 pares de bases do gene COII do DNA mitocondrial em Lagothrix. cana, L. lagothricha e L. poeppigii .......... 28. TABELA 2 - Sítios variáveis em 567 pares de bases do gene COII do DNA mitocondrial em Lagothrix. cana e Ateles fusciceps .......................... 29. TABELA 3 - Sítios variáveis em 429 pares de bases da região controle do DNA mitocondrial (D-Loop) em 09 indivíduos da espécie Lagothrix cana ............................................................................................................. 30. xii .LISTA DE ABREVIATURAS “ZAD-50” – Solução anestésica contendo Zoletil® + Cloridrato de Detomidina + Sulfato de Atropina °C – Graus Celsius µl - Microlitro µM – Micromolar ATP - Trifosfato de adenosina Bpm – Batimentos por Minuto CETAS - Centro de Triagem de Animais Silvestres COI – Citocromo C Oxidase I COII - Citocromo C Oxidase II COIII - Citocromo C Oxidase III CytB - Citocromo B DNA – Ácido Desoxirribonucleico EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético ICMBio - Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) IUCN - União Internacional para a Conservação da Natureza Kb - kilo (quilo) pares de bases = 1.000 pb mg/kg – miligramas por kilograma MgCl2 – Cloreto de Magnésio MPI – Minutos Pós Injeção Mpm – Movimentos por Minuto mtdna - DNA mitocondrial NADH - “Dinucleotideo de nicotinamida e adenina hidrogenado NCBI - National Center for Biotechnology Information ng/µL – Nanogramas por Microlitro nm - Nanômetro pb - Pares de Bases pb – Pares de Bases PCR - Reação em Cadeia da Polimerase RNA – Ácido Ribonucleico RPE - Reação Postural de Endireitamento Rpm – Rotações por Minuto rs Coeficiente de Correlação de Postos de Spearman SISBio - Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade xiii SISGen - Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado SpO2 - Saturação Parcial de Oxigênio TAE - Tris-Ácido acético-EDTA TM - Marca Registrada U/mL– Unidades por Microlitro ρ - coeficiente de variação xiv RESUMO Este trabalho relata preliminarmente, a caracterização genética de primatas da espécie Lagothrix cana (macacos-barrigudos cinza), por meio de sequenciamento genético e análise de DNA mitocondrial do segmento D-Loop, após extração do DNA com a utilização da técnica do fenol/clorofórmio. Aliado a isso, é reportada uma revisão bibliográfica acerca dos dados anatômicos, fisiológicos, clínicos, reprodutivos e comportamentais, já disponíveis em literatura especializada sobre a espécie. Também, é validado um protocolo de contenção farmacológica executável e eficiente para procedimentos da rotina dos profissionais que desenvolvem ações, na área de medicina da conservação e atuam com primatas cativos deste gênero. Foram utilizados 21 primatas adultos da espécie Lagothrix cana (macaco-barrigudo), pesando 5,24 ± 1,66 kg, sendo 14 fêmeas e sete machos, para a validação deste protocolo. Os fármacos utilizados foram a tiletamina, o zolazepam, a atropina e a detomidina, em associação, com suas doses calculadas por meio de extrapolação alométrica interespecífica. Os fármacos foram combinados numa preparação concentrada que foi denominada “ZAD-50” (Zoletil/50® + Atropina + Detomidina), obtendo-se volume final exato de 3,0 ml de ZAD-50, com a associação de fármacos numa concentração que permite a contenção farmacológica de um mamífero placentário que pese 10,0 Kg com um volume de 0,6 ml, por exemplo. 567 pares de bases de DNA mitocondrial foram utilizadas, e conseguiu-se caracterizar os indivíduos como pertencentes à espécie Lagothrix cana, além de realizar o sequenciamento do segmento “D-Loop” do DNA mitocondrial, para esta espécie. Palavras Chave: DNA, Lagothrix, extrapolação alométrica, animais selvagens, “D-Loop”, Atelídeos xv ABSTRACT This manuscript reports, at first, the genetic characterization of primates Lagothrix cana (“gray wooly-monkeys”), by means of DNA sequencing and mitochondrial DNA analysis of the D-Loop section, after the extraction with the phenol/chloroform method, described by Sambrook e Russel (2001). In addition, is related a wide vision of the scientific data available bibliographic about the anatomical, physiological, medical, reproductive and behavioural existing data, about the specie. Also is related a performable and efficient chemical restraint protocol to permit usual procedures for professionals of conservation medicine, who works with captive primates of Lagothrix sp. genus. The study evaluate the chemical restraint and field anesthesia of 21 wooly-monkeys (Lagothrix cana: Atelidae) weighing 5,24 ± 1,66 kg, being fourteen female and seven male. There was employed the combination of tiletamine, zolazepam, atropine, and detomidine, in allometrically scaled dosages. The drugs were combined in a concentrate preparation called “ZAD-50” (Zoletil/50® + Atropine + Dormiun-V®). and give an accurate final volume of 3.0 mL of ZAD-50, with the combination of drugs at a concentration that allows the pharmacological restraint of a placental mammal weighing 10.0 kg with a volume of 0.6 ml, for example. 567 base pairs of mitochondrial DNA samples was utilized and was realized the classification of the specimens as Lagothrix cana, after the comparison with L. poepigii and L. lagothricha data. Besides that, the characterization of the D-Loop segment of mitochondrial DNA for this species was described. Key Words: DNA, Lagothrix, allometric scaling, wild animals, D-Loop, Atelids 1 1 INTRODUÇÃO O número total de espécies conhecidas no Brasil oscila entre 170 e 210 mil, sendo que 103 a 134 mil, se referem a espécies do reino Animal e, cerca de 43 a 49 mil, correspondem ao Reino Vegetal. Dentre as espécies de animais, 7 mil correspondem a vertebrados, com estimativa de 3.420 espécies de peixes, 1.696 de aves, 687 de anfíbios, 633 de répteis, e 541 de mamíferos, porém, acredita-se que este número possa ser bem maior (LEWINSOHN e PRADO, 2005). Dados de 2011, dos Centros Nacionais de Pesquisa e Conservação do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) alteraram estes números para 8.200 espécies de vertebrados descritas, sendo 4.100 peixes, 1.826 aves, 875 anfíbios, 721 répteis e 713 mamíferos, distribuídos em cinco biomas distintos (PERES et al., 2011). O principal desafio na rotina dos profissionais envolvidos em ações conservacionistas é a escassez de dados científicos confiáveis ou, na maioria dos casos, da ausência destes dados, para balizar o planejamento e desenvolvimento destas ações. Estes profissionais, muitas das vezes, acabam optando por lançar mão dos dados disponíveis para espécies que se encontrem o mais próximo possível, na escala taxonômica, da espécie em questão, e termina por adaptar estes dados, pela ausência de parâmetros específicos para a espécie, com a qual está trabalhando. Muitas das vezes, nem isso é possível. Este panorama não é diferente para a espécie objeto deste estudo, o macaco- barrigudo da espécie Lagothrix cana. Os dados específicos existentes na literatura especializada são raros, e sob o ponto de vista da caraterização genotípica de seus indivíduos, não constam registros com esta descrição, até a atualidade. Da mesma forma, não se encontram registros específicos, referentes às características de anatomia e fisiologia reprodutivas, apenas de outras espécies do gênero Lagothrix, como, por exemplo, Lagothrix poeppigii (MAYOR et al., 2012a; MAYOR et al., 2012b; ANDRADE et al., 2018). Também não há registro de planejamento ou execução de um plano de manejo reprodutivo específico para Lagothrix cana. O que existe são tentativas empíricas de cruzamento entre indivíduos cativos, sem nenhum critério de distinção genética. Na maioria das vezes, estes trabalhos são apenas pautados, na origem geográfica de indivíduos provenientes de ação de fiscalização do tráfico ilegal, 2 sem nenhum planejamento que previna o aumento da prevalência da consanguinidade dentre os plantéis. É sabido, também, que animais desta espécie, nascidos em cativeiro, dificilmente chegam à idade reprodutiva, pois, as fêmeas cativas não desenvolvem comportamentos condizentes com uma habilidade materna proficiente. Acredita-se que tal fato se deva ao fato de que estas fêmeas não observam este comportamento nas outras fêmeas do plantel, para repeti-lo. Apesar do cativeiro ser, atualmente, um recurso cada vez mais necessário para a conservação de espécies ameaçadas, seja pela manutenção do banco genético, seja na educação ambiental, é sabido que o efeito estressante do cativeiro e a capacidade de adaptação da espécie neste ambiente, ocasiona reações de ordens somática, endocrinológica e comportamental, entre outras. que afetam a higidez dos indivíduos cativos (ORSINI e BORDAN, 2014). Com o advento das técnicas de biologia molecular, a partir da década de 80, tornou-se possível a manipulação de ácidos nucleicos, o que levou à análise de diferentes tipos de marcadores moleculares. Tais marcadores moleculares podem corresponder a qualquer loco gênico, ou seu próprio produto, que apresente polimorfismos inerentes e que possam ser aplicados em estudos que buscam compreender um questionamento biológico. De maneira mais ampla, marcadores moleculares podem ser definidos como todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de qualquer outro segmento específico de DNA (AVISE, 2004). Com o desenvolvimento da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) pelo bioquímico Kary Mullis, em 1985, elevou- se, e muito, a eficiência na detecção de tais polimorfismos. Este progresso se deve a redução do tempo de execução dos experimentos, de custo e de sua complexidade (CURI et al., 2002). A técnica de PCR se baseia na síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA, por meio da amplificação em ciclos e na presença da enzima DNA polimerase. Para a seleção do segmento específico de DNA a ser amplificado é necessário o emprego de sequências de oligonucleotídeos iniciadores chamado de primers, delimitando assim a sequência-alvo. Os primers são sintetizados artificialmente sendo, suas sequências de nucleotídeos, complementares às sequências específicas que flanqueiam a região alvo no DNA (MATIOLI & PASSOS-BUENO, 2001). Um ciclo da reação envolve a desnaturação da dupla fita do DNA alvo por meio da elevação da temperatura, seguida do anelamento 3 dos primers por meio da diminuição da temperatura e de sua extensão pela ação da DNA polimerase. Este ciclo é repetido por cerca de 30 a 40 vezes, sendo que a quantidade de DNA alvo dobra seguindo uma progressão geométrica (BROWN, 2003). Os dados resultantes de análises genéticas embasadas em diferentes tipos de marcadores moleculares, sejam estes nucleares ou mitocondriais, podem fornecer informações sobre a estrutura genética populacional, níveis de fluxo gênico, relações filogenéticas, biogeografia de grupos definidos e análise de parentesco (AVISE, 1994). Dessa forma, os marcadores genéticos representam ferramentas poderosas e informativas para ecólogos e geneticistas da conservação definirem, por exemplo, a escala geográfica e a área adequada para realização de monitoramento e manejo das populações. Dentre os marcadores mais utilizados em análises genéticas populacionais, destacam-se a região controle do DNA mitocondrial (mtDNA) e os microssatélites, por serem altamente polimórficos e possuírem altas taxas de mutação (SCHLÖTTERER, 2004). O genoma mitocondrial em animais é constituído de uma molécula fita dupla de DNA circular, de pequeno tamanho e que codifica aproximadamente 5% de toda a maquinaria necessária para o funcionamento da mitocôndria (NAHUM, 2001). Dependendo do tipo da célula, podem ser encontrados mais de mil genomas mitocondriais (mtDNA). Nos animais, este possui em média 18 kilo pares de bases (Kb) de comprimento, sendo herdado maternalmente e geralmente não apresentando recombinação gênica (AVISE, 1994). O mtDNA está organizado em 37 genes codificantes, dos quais 22 resultam em RNAs transportadores, 2 são para RNAs ribossomais e 13 são transcritos em RNAs mensageiros e traduzidos, principalmente, nos complexos proteicos responsáveis pela dinâmica da cadeia transportadora de elétrons e fosforilação oxidativa (AVISE, 2000). Dentre os 13 genes, sete codificam subunidades da enzima NADH desidrogenase (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5 e 6), três codificam subunidades da enzima citocromo C oxidase (COI, II e III), dois codificam subunidades da ATP sintetase (ATP 6 e 8) e, em uma única sequência, o gene que codifica o citocromo B (NAGATA et al., 2005). Nos vertebrados existe uma região não codificadora conhecida como “alça D” (D-loop) que contém o controle da replicação e transcrição desse genoma (BOORE, 1999). 4 Os marcadores moleculares baseados em DNA mitocondrial (mtDNA) possuem apenas herança materna, ao contrário dos nucleares que possuem herança biparental. De acordo com Olson et al. (2009), pelo fato da herança materna estar altamente conservada, em muitos dos genes localizados no genoma mitocondrial, estes marcadores, muitas vezes, podem ser usados para resolver as relações que medem períodos de tempo muito longos e são relevantes quando se considera questões de filogenia e importância taxonômica. Assim, uma característica importante do mtDNA é a sua alta taxa de evolução, a qual acredita-se ser 10 vezes superior à de um gene nuclear de cópia única. A explicação para este fenômeno se encontra no fato da baixa capacidade de reparo da enzima DNA polimerase e a alta exposição desta molécula aos agentes oxidativos gerados durante o processo de respiração celular (MEYER, 1993). A taxa de evolução do mtDNA não é homogênea entre os seus diferentes genes. Alguns genes acumulam mais rapidamente essas substituições de bases, dentre os quais encontramos os genes codificadores das subunidades da NADH desidrogenase, citocromo C oxidase e dos RNAs transportadores. Os genes codificadores para as subunidades ribossômicas e para o citocromo B estão entre os mais conservados entre os organismos (SACCONE, 1994). A região controle D-loop é a que mais acumula mutações podendo elevar sua taxa de evolução de duas a cinco vezes em relação a dos genes que codificam proteínas (MEYER, 1993). Esta mesma taxa é um dado importante na escolha do(s) gene(s)-chave(s) para resolver questões filogenéticas, taxonômicas e de genética de populações, no entanto, em pesquisas de eventos mais antigos, como a formação de espécies, gêneros e famílias, os genes mais conservados podem ser bons indicadores. A ausência de recombinação e a herança materna aliados à sua alta taxa de evolução, heterogênea entre seus genes, fazem com que o mtDNA seja um excelente marcador para estudos filogenéticos e de taxonomia molecular, sendo empregado largamente para estudos de populações e em relações inter e intra-espécies. Frente a uma grande variedade de regiões gênicas e não gênicas do mtDNA, o desenvolvimento acelerado das técnicas de sequenciamento de nucleotídeos, nos últimos anos, permitiu uma grande revolução no uso de ferramentas moleculares. Atualmente, no campo da genômica, diversos genes e genomas 5 mitocondriais completos de uma grande variedade de organismos já têm suas sequências depositadas em bancos públicos de dados. Toda essa informação disponibilizada pela ciência genômica só é possível de ser organizada, analisada e interpretada com o apoio da informática, o que constitui uma nova ciência, a bioinformática. Atualmente a bioinformática é imprescindível para a manipulação dos dados biológicos e sua associação às ferramentas de biologia molecular favorece o desenvolvimento de marcadores genéticos nas mais diferentes áreas. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Medicina da Conservação A Medicina da Conservação constitui uma nova ciência, voltada para enfrentar a ameaça crescente que agentes etiológicos, dos mais diversos tipos, afligem sobre a riqueza biológica do planeta. Possui como pilares básicos, pesquisa e ação e se pauta no conceito da transdisciplinaridade dos profissionais envolvidos nesses dois quesitos. Atuar em medicina da conservação é trabalhar para manter a diversidade biológica e, consequentemente, a qualidade de vida para pessoas, espécies domésticas e selvagens, sobretudo com intenção de manter em um ambiente favorável à plena saúde ecológica (MANGINI & SILVA, 2006). Esta manutenção da diversidade biológica depende intimamente da qualidade dos estudos realizados para a produção de dados e subsequente planejamento e execução dessas ações. A premente necessidade de um banco genético confiável, proveniente de animais puros (não hibridizados), em nível de gênero, espécie ou subespécie é o mais desejável, pois, do contrário, perpetuar- se-á a heterogeneicidade gênica, fugindo ao princípio conservacionista, ou melhor, retroagindo no sentido do objetivo conservacionista. Somente desta forma se conseguirá atingir os objetivos propostos pelo conceito da Medicina da Conservação: Saúde Ambiental (conjunção entre Saúde Humana, Saúde Vegetal e Saúde Animal) e Saúde do Ecossistema (TABOR, 2002). 2.2 Classificação Taxonômica dos primatas Platirrinos 6 A classificação taxonômica dos chamados primatas “do novo mundo” (Platyrrhini)1 é bastante controversa e ainda gera muita discussão a seu respeito, mesmo com a adoção do conceito de espécie filogenética, e com os estudos citogenéticos e moleculares (RYLANDS, MITTERMEIER & SILVA JR., 2011). Historicamente, dividia estes primatas eram divididos em duas grandes famílias: Callitrichidae e Cebidae. Anos se passaram, e Hershkowitz (1977) incluiu nessa classificação, uma terceira família (Callimiconidae) e Groves (2005) alterou significativamente essa divisão, ao sugerir a famílias para os platirrinos: Aotidae, Atelidae, Cebidae e Pitheciidae. Nenhum desses sistemas é considerado sob o ponto de vista filogenético, pois contêm um ou mais grupos não-monofiléticos. Rylands et al. (2000, 2006, 2009), Groves (2001a, 2005), Rylands & Mittermeier (2008), e Cortés-Ortiz (2009) apresentaram revisões na taxonomia dos primatas platirrinos. Após o advento da análise e sequenciamento do DNA, e havendo maior suporte para recompilação dos dados, concluiu-se que, atualmente, existem descritas 152 espécies, e 204 espécies e subespécies de Platirrinos. A utilização do conceito de espécie filogenética, considerado mais prático e objetivo que o conceito de espécie biológica (GROVES, 2001a, 2004) tem sido responsável por muito do acréscimo do número de espécies, aliado a outras características, como comportamento, vocalização, etc., não mais limitando a pesquisa a quesitos fenotípicos (morfométricos, por exemplo). O uso da genética molecular estabelece estas diferenças filogenéticas às espécies, solucionando dúvidas, demonstrando a validade de diferenças entre espécies distintas, anteriormente classificadas como uma só espécie, e trazendo à tona “espécies críticas”. Utilizando-se o conceito de espécie filogenética e compilando dados moleculares e de citogenética, os platirrinos foram subdivididos, mais recentemente, em 3 clados: (a) Atelidae, (b) Pitheciidae e (c) Cebidae (absorvendo os Callimicos, Callitriquídeos e Aotus spp.). Na atualidade, a lista da International Union for Conservation of Nature/Species Survival Commission (IUCN/SSC - Primate Specialist Group) totaliza 464 espécies e 676 espécies e subespécies de Primatas. 1 Alguns pesquisadores consideram equivocada esta nomenclatura, porém, devido à ocorrência da mesma em muitas referências bibliográficas, foi mantida entre parênteses (Nota do Autor). 7 2.3 Família Atelidae (Gray, 1825) Atelídeos correspondem às espécies que atingem as maiores massas corporais, dentre os Platirrinos. Possuem uma cauda prênsil (Figura 1), que funciona como um quinto membro, auxiliando no equilíbrio durante sua movimentação. A fórmula dentária dos adultos é representada por 2 X I 2/2; C1/1; P 3/3; M 3/3. A família Atelidae é composta por 4 gêneros: Alouatta (bugios) compreendendo 10 espécies; Ateles (macacos-aranha) compreendendo 7 espécies; Lagothrix (macacos-barrigudos) representado por 4 espécies; e Brachyteles (muriquis), representado por 2 espécies (SCHNEIDER, 2000; OPAZO et al., 2006; WILDMAN et al., 2009). FIGURA 1. Imagem de um macaco-barrigudo (Lagothrix cana) infante, utilizando a cauda prênsil como apoio. 2.4 Gênero Lagothrix Os macacos-barrigudos (Lagothrix spp.) são primatas da família Atelidae, que ocupam alguns segmentos do território amazônico (Figura 2), abrangendo áreas nos seguintes países: Peru, Colômbia, Venezuela, Equador, Bolívia e Brasil (FOODEN, 1963). 8 FIGURA 2. Distribuição geográfica dos cinco morfotipos reconhecidos atualmente de macacos- barrigudos. (Adaptado de A. Di Fiore et al. /Molecular Phylogenetics and Evolution) O gênero contém espécies classificadas, segunda a União Internacional para a Conservação da Natureza (IUCN), em “Vulneráveis” (L. lagotricha e L. poeppigii), “Em Perigo” (L. cana) e “Em Perigo Extremo” (L. lugens), e como suas populações continuam decaindo, programas de manejo reprodutivo em indivíduos cativos são fundamentais como ferramenta para elaboração e execução de ações de conservação para estes gêneros. Apesar disso, a manutenção e a reprodução em animais cativos destas espécies têm se demonstrado muito difícil (ANGE-VAN HEUGTEN et al., 2008; MOONEY & LEE, 1999), e sua biologia reprodutiva e parâmetros históricos são pouco conhecidos (DI FIORE et al., 2010; MOONEY & LEE, 1999). Na realidade, os registros clássicos sobre dados morfológicos remontam ao período entre 1930 e 1950 e, ainda assim, permanecem como fonte principal de citações em produções científicas, mesmo sabendo-se que a maioria está relacionado a Primatas do Velho Mundo, e em condições de cativeiro. Macacos-barrigudos possuem hábitos diurnos (PERES, 1994). Ocupam principalmente áreas de floresta primária, circulando entre todos os níveis e dificilmente descem ao solo, pois bebem a água acumulada em folhas, bromeliáceas e outras estruturas vegetais. Formam grupos de até 40 indivíduos, mas existem relatos ocasionais de indivíduos solitários. Dormem nas copas das 9 árvores, em cima de galhos, mas não necessariamente em um mesmo local, quase sempre próximos às fontes de alimento. Geralmente, enquanto a maioria do grupo se alimenta, alguns indivíduos atuam como sentinelas contra eventuais predadores (ANDRADE et al., 2017). São primariamente frugívoros, e, portanto excelentes dispersores de sementes. O comportamento alimentar de aproximadamente 40 indivíduos, foi estudado durante 11 meses, na região de Tefé (Amazonas, Brasil), em 3298 registros de alimentação, constatando-se que a dieta se compõe principalmente por frutos maduros (83%) e sementes (7%). Pode ocorrer variação estacional, e em períodos em que há escassez de frutos a composição da dieta pode variar, incluindo folhas verdes, seiva e flores, sendo que alimentos de origem animal (artrópodes e outras presas) não constituem mais que 0,1% da ingesta (PERES, 1994). Bodmer e Robinson (2004), após estudar durante quatro meses o comportamento de 18 indivíduos semicativos, observaram que o descanso consome 45% do tempo, sendo forrageamento a atividade mais frequente (29%), seguido por deslocamento (23%), interações sociais (3%) e grooming (1%). A maturidade sexual ocorre entre cinco e oito anos, a gestação dura aproximadamente 225 dias, e o período de lactação varia entre nove meses e um ano, sendo que a expectativa de vida em cativeiro é de aproximadamente 25 anos (MAYOR et al., 2017). Somente as fêmeas carregam os filhotes (Figuras 3 e 4), primeiramente agarrados ao ventre e, após algum tempo de desenvolvimento, em suas costas (VOSS e FLECK, 2011). FIGURAS 3 e 4. Imagens de uma fêmea lactente de macaco-barrigudo (Lagothrix cana), com filhote às costas. Seus principais predadores são os grandes rapinantes, os grandes felídeos e os humanos, por serem muito apreciados como alimento por algumas 10 comunidades indígenas. Na região amazônica, a caça de animais selvagens é uma atividade tradicional, que visa prover as necessidades das populações locais em termos de alimentação de subsistência e outros itens (FITZ GIBBON, 1998), e os Lagothrix são os primatas mais frequentemente caçados na região Amazônica (PUERTAS e BODMER, 2004). Além da caça predatória, a destruição do habitat natural e o tráfico de exemplares para serem utilizados como pets contribuem para a diminuição substancial das populações em vida livre. A pressão antrópica é tão devastadora que já existem relatos de indivíduos transpondo os limites de sua distribuição geográfica original, numa tentativa de busca de um ambiente favorável para sua manutenção (NUNES e ORSINI, 2016). A escassez de maiores informações a respeito das características reprodutivas da espécie também constitui um fator limitante à execução de atividades de manejo com vistas ao repovoamento das áreas que ainda não foram degradadas (BODMER e ROBINSON, 2004). A classificação taxonômica dos macacos-barrigudos, como a dos outros atelídeos, também é bastante controversa. Fooden (1963) propôs a existência de 2 espécies: L. flavicauda, para o macaco-barrigudo da cauda amarela (“yellow tailed wooly monkey”) e L. lagotricha para todas as demais, baseando-se em características como coloração, morfometria, e diferenças osteológicas que considerou qualitativas. Até hoje, ainda não se tem evidência adicional que prove a existência de 3 espécies como proposto primariamente por Groves (2001, 2005). No mesmo trabalho, Fooden (1963) agregou L. flavicauda à família Atelidae, porém, em gênero distinto de Lagothrix, como um gênero distinto. Essas variações taxonômicas dificultam a determinação da relação de L. flavicauda com outras espécies de Lagothrix e de outros Atelídeos. Posteriormente, estudos realizados por meio da análise do sequenciamento de genes mitocondriais (mtCOI e mtCOII) de 141 indivíduos de variadas espécies de Lagothrix (RUIZ-GARCÍA, PINEDO-CASTRO & SHOSTELL, 2014), obtiveram várias conclusões: (a) L. flavicauda apresentou diversidade genética igual a zero, enquanto que L. poeppigii e L. lugens apresentaram a maior diversidade genética, quando comparados entre si, e L. lagotricha e L. cana apresentaram um grau mais modesto de diversidade, quando comparadas as suas amostras; (b) A hipótese da ocorrência de duas espécies (L. lagotricha e L. flavicauda) se comprova a nível molecular, avaliando-se a introgressão genética 11 e a hibridização recente. Neste caso, L. lagotricha apresentaria 4 subespécies. Esta conclusão contraria a hipótese de Groves (2001) e corrobora a proposta de Fooden (1963); (c) L. poeppigii foi a primeira espécie dentre os indivíduos da espécie do táxon L. lagotricha que experimenta diversificação mitocondrial haplótipa, enquanto que L. cana e L. lagotricha apresentam essa diversificação, mais recentemente; (d) L. poeppigii e L. lagotricha foram os taxa que apresentaram a maior evidência de expansão populacional em diferentes períodos do Pleistoceno, enquanto L. lugens apresentou um declínio populacional nos últimos 25.000 anos. Isto demonstra a necessidade premente da realização de ensaios laboratoriais abrangendo o uso da genética molecular com finalidade de obter uma classificação taxonômica mais objetiva e precisa para as espécies em questão, e amplia significativamente os horizontes da pesquisa científica, na atualidade. 2.5 Lagothrix cana (Geoffroy, 1812) A classificação taxonômica atual de Lagothrix cana é classificado atualmente como pertencente ao Reino Animalia, Filo Chordata, Classe Mammalia, Ordem Primates, Subordem Haplorrhini, Infraordem Simiiformes, Parvordem Platyrrhini, Família Atelidae, Subfamília Atelinae, Gênero Lagothrix, Espécie Lagothrix cana e possui vários nomes populares, entre eles: “macaco- barrigudo”, “macaco-barrigudo cinza”, e em alguns casos, é citado como “Geoffroy’s woolly monkey”. O macaco-barrigudo dessa espécie possui uma pele grossa e densa, com coloração acinzentada e preta (Figura 5), em seus membros (ROWE, 1996). Apesar de seu grande tamanho e conformação robusta, os macacos-barrigudos são capazes de locomover-se habilmente sobre as árvores, com a ajuda de sua longa cauda prênsil. 12 FIGURA 5. Imagem de um exemplar adulto de macaco-barrigudo (Lagothrix cana) evidenciando a coloração da pelagem dos membros. A espécie está classificada como “Em perigo (EN)” na lista vermelha da IUCN, e, em geral, os machos são maiores que as fêmeas, podendo alcanças 65 cm, da cabeça à base da cauda e massa corporal de aproximadamente 9,5 Kg, enquanto que as fêmeas não ultrapassam 58 cm e 7,7 Kg. Atualmente existem 18 áreas de proteção que abrangem a espécie no Brasil, mas nenhuma ação de preservação contempla a utilização dos animais cativos em plantéis de Zoológicos e criadouros, com reintrodução de espécimes na natureza. 2.6 Contenção Farmacológica A associação de anestésicos dissociativos a agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 é utilizada em medicina veterinária desde a década de 1960, e continua a ser o protocolo geral mais empregado na contenção farmacológica e anestesia injetável de animais selvagens (PACHALY & VOLTARELLI-PACHALY, 2011). Dos anestésicos dissociativos, os mais comuns são a cetamina e a 13 tiletamina, fármacos que promovem sedação e analgesia por interromper a transmissão ascendente das porções cerebrais inconscientes para as conscientes, ao mesmo tempo em que produzem um estado cataléptico (PACHALY, 2000). O início da ação é rápido, e quando usados em conjunto com agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2, a indução geralmente é tranquila, sendo que os efeitos cardiovasculares dos agonistas são em parte compensados pelo agente dissociativo (MUIR, SKARDA & MILNE, 1977; MATTHEWS et al., 1993; PACHALY, 1994). É comum se observar um padrão respiratório apnêustico, caracterizado por uma pausa após a inspiração, podendo também ocorrer hipertonia muscular (LIN, 1996; LIN et al., 1992). O cloridrato de tiletamina é um anestésico dissociativo mais potente que o cloridrato de cetamina, porém apresenta maior capacidade de causar convulsões (DINIZ, 1999). Por isso, é produzido sempre em associação a um potente benzodiazepínico, o zolazepam, que possui ação anticonvulsivante e miorrelaxante, minimizando as ações cataleptóides da tiletamina (DINIZ, 1999). A duração de ação da tiletamina é três vezes mais longa que a da cetamina, sendo mais eficaz na indução da anestesia em primatas e gatos que em outras espécies (BRANSON, 2003). A utilização de agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 potencializa os efeitos da associação tiletamina-zolazepam, resultando em aumento do plano anestésico (SELMI et al., 2003). Tais fármacos são sedativos e causam depressão dose-dependente pela estimulação de receptores adrenérgicos alfa- 2 no sistema nervoso, tanto central quanto periférico (CORTOPASSI, 2004). Os agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 atuam impedindo a liberação da noradrenalina, e não existindo quantidade suficiente de noradrenalina na fenda sináptica, a transmissão do impulso nervoso fica inibida (PACHALY, 2000). É importante frisar que se o paciente estiver previamente excitado ou sob situação de alto índice de estresse, o efeito farmacológico dos agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 fica diminuído, tanto isoladamente quanto em combinação com anestésicos (PACHALY, 2000). A detomidina é um dos agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 atualmente mais utilizados na sedação e medicação pré-anestésica em equinos (CHAMBERS et al., 1993), outros autores, indicam-na para intervenções cirúrgicas na posição quadrupedal (FEITOSA et al., 1990). Também tem sido 14 usada em associação a diversos outros fármacos, aparentemente com pequenas diferenças em relação à xilazina, para sedação pré-anestésica (CLARKE &, TAYLOR, 1986, MATTHEWS et al., 1991. MATTHEWS et al., 1993; FANTONI et al., 1999; PACHALY et al., 2011a). Existe aparentemente um “efeito platô” na sedação, sendo que um aumento da dose de detomidina pode melhorar a analgesia e aumentar a duração de seu efeito, mas não leva a um aumento concomitante na intensidade da sedação (JÖCHLE, 1989; PACHALY et al., 2011b). Em função do relativo aumento da potência e efeito prolongado de sua ação, pode ocorrer sedação residual (MATTHEWS et al., 1991; MATTHEWS et al., 1993; PACHALY et al., 2011a). Sua utilização, isoladamente ou em associação a outros fármacos sedativos e anestésicos, para contenção farmacológica de diversas espécies de mamíferos selvagens placentários não xenartros (PACHALY et al., 2011a). A associação denominada “ZAD” já foi utilizada para contenção farmacológica de leões (PACHALY & VOLTARELLI- PACHALY, 2011), quatis (PACHALY et al., 2013) e onças (OSILHEIRE et al., 2012), bem como em cães (CIANCA et al., 2014) e gatos domésticos (ANDO et al., 2015), além de pequenos roedores, como o hamster-sírio (PACHALY et al., 2014a). Em anestesiologia, o sulfato de atropina é empregado para reduzir secreções do trato respiratório e das glândulas salivares, e para inibir os efeitos da estimulação vagal sobre os sistemas respiratório e cardiovascular (SOMA, 1971; SOMA & PENNEY, 1975). Age bloqueando o estímulo vagal induzido por respostas reflexas à tração de vísceras, à estimulação laríngea direta e o induzido por diversos agentes anestésicos e pré-anestésicos (SOMA & PENNEY, 1975; HOLZ, HOLZ & BARNETT, 1994). Tem também ação broncodilatadora, relaxando a musculatura lisa bronquial e traqueal, mas não produz alterações importantes na pressão sanguínea (SOMA & PENNEY, 1975). Diminui o peristaltismo e reduz a atividade secretora do trato digestório (MASSONE, 1988), e em muitas espécies produz midríase (SOMA & PENNEY, 1975). Sua utilização evita efeitos adversos dos agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2, como bradicardia, hipotensão e bloqueio atrioventricular (PACHALY, 1995). Estando os animais submetidos à anestesia de campo, é fundamental a monitorização dos parâmetros vitais como frequência cardíaca e respiratória, e embora a frequência cardíaca diminua após a administração de agonistas de 15 receptores adrenérgicos alfa-2, geralmente retorna ao normal após a administração do anestésico dissociativo (LIN, 1992; PACHALY & VOLTARELLI- PACHALY, 2011; OSILHEIRE et al., 2012; PACHALY et al., 2013). Empregando a combinação de anestésicos dissociativos a agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2, também não é incomum, se observar padrão respiratório apnêustico, caracterizado por uma pausa após a inspiração (AUBIN & MAMA, 2002; LIN, 1996). Entretanto, à medida que a profundidade anestésica se torna menos intensa, a respiração se torna mais regular e laboriosa. Na avaliação da profundidade anestésica, essa mudança no padrão respiratório pode ser bastante útil, sendo que é pouco comum a necessidade de ventilação assistida quando são usadas as combinações de anestésicos dissociativos a agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 (AUBIN & MAMA, 2002). Também pode ocorrer hipertonia muscular (LIN, 1992). Tradicionalmente, doses de fármacos são calculadas e expressas em quantidade por unidade de massa corporal (mg/kg). O emprego desse padrão metodológico, que usa proporcionalidade direta, pode levar a problemas graves relacionados com subdosagens ou dosagens excessivas, devido à grande disparidade de tamanhos e padrões fisiológicos encontrados em algumas espécies (PACHALY, 2006; PACHALY, 2009). O método de extrapolação alométrica, entretanto, calcula e expressa doses como quantidade por unidade de energia consumida por um determinado animal em situação de metabolismo basal (mg/kcal). Uma vez que absorção, distribuição e eliminação de todas as drogas ocorrem em função da taxa metabólica basal, o método alométrico permite, pelo conhecimento das taxas metabólicas basais de dois diferentes vertebrados, extrapolar matematicamente para um deles doses de medicamentos indicadas para outro, para o qual já tenham sido realizados estudos laboratoriais de experimentação farmacocinética e farmacodinâmica (PACHALY, 2006; PACHALY, 2009). O objetivo prático mais evidente, em medicina veterinária, é a extrapolação das doses de drogas entre animais de formas, tamanhos e massas diferentes, possibilitando o uso de dados farmacológicos obtidos em um animal-modelo, para o qual o fármaco foi desenvolvido e estudado, para a farmacoterapia em um animal-alvo, que pode ser qualquer paciente doméstico ou selvagem (PACHALY, 2006; PACHALY, 2009; SEDGWICK & POKRAS, 1988). 16 No que tange, especificamente à contenção farmacológica de primatas não-humanos, a associação de anestésico dissociativo, benzodiazepínico, atropina e agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 já havia se mostrado efetivamente segura para procedimentos semelhantes aos que foram objeto deste estudo, quando na ocasião, a xilazina, foi a droga utilizada como representante da classe dos agonistas de receptores adrenérgicos alfa-2 (CARNEIRO, 2011; PACHALY et al., 2011b). 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivos Gerais Este trabalho tem como objetivo capturar indivíduos cativos da espécie Lagothrix cana para validação de um protocolo anestésico factível para o manejo e manipulação dos mesmos, colher e armazenar amostras biológicas e realização de pequenos ´procedimentos. 3.2 Objetivos Específicos Padronizar um método confiável de extração de DNA, para as amostras colhidas, para posterior análise e sequenciamento genético, abordando: a caracterização gênica, análises gênicas para características taxonômicas parentais, bem como confrontar os resultados com os dados referentes à espécie, que constam na literatura especializada. Isto irá fomentar a retroalimentação científica e servir de referência para futuras ações, no âmbito da reprodução e conservação da mesma. Comparar os resultados com outros dados referentes a outras espécies de Primatas Atelídeos, dentro e fora do Gênero Lagothrix, com vistas a avaliar a distância filogenética, entre as mesmas. 3.3 Autorizações Este projeto se encontra registrado no Instituto de Pesquisa, Estudos e 17 Ambiência Científica da Universidade Paranaense (IPEAC/UNIPAR), sob nº 20.047/2011, e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Experimentação Animal da Universidade Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (CEUA/FMVZ – UNESP), sob número de registro geral 174/2015. Seu número de Registro, junto ao Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBio), é o nº 52027, e seu cadastro, junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGen), é o A98EF86, na categoria Acesso ao Patrimônio Genético. 4. MATERIAIS E MÉTODO 4.1 Local Os animais foram submetidos aos procedimentos no Centro de Triagem de Animais Selvagens (CETAS) Sauim Castanheiras e nas instalações da Fundação Floresta Viva, no município de Manaus (AM). As amostras foram trazidas ao Departamento de Genética do Instituto de Biociências da UNESP, campus Botucatu – Laboratório de Genética Animal para a realização das análises genéticas. 4.2 Animais Para este estudo, preliminarmente, foram capturados, aproximadamente 21 indivíduos, supostamente pertencentes à espécie Lagothrix cana, provenientes dos plantéis do CETAS Sauim Castanheiras (Prefeitura Municipal de Manaus – AM e da Fundação Floresta Viva (Manaus – AM), para realização de procedimentos de rotina O protocolo para esta contenção utilizado foi a base de solução de sulfato de atropina + cloridrato de detomidina + cloridrato de tiletamina + cloridrato de zolazepam (“ZAD-50”). Os animais foram contidos por injeção intramuscular profunda, após contenção física em puçá/rede ou por dardos pressurizados propelidos por zarabatana (Figuras 6 e 7), conforme PACHALY et al. (2011). O método de planejamento terapêutico de doses de fármacos utilizado foi o da 18 extrapolação alométrica interespecífica (PACHALY, 2009). FIGURA 6. Imagem do procedimento prévio à contenção de um macaco-barrigudo (Lagothrix cana) adulto, por meio da utilização de zarabatana para propulsão de dardo artesanal pressurizado contendo a solução ZAD-50. FIGURA 7. Imagem de dardo confeccionado artesanalmente para execução de captura de macacos-barrigudos (Lagothrix cana). Fonte: Prof. Luiz Paulo Cobra Monteiro Filho. Foram realizados os procedimentos de captura, transporte, exame físico, marcação por microchip, colheita de amostras de sangue, tratamento de feridas contaminadas e suturas cutâneas, procedimentos odontológicos (periodontia, exodontia, endodontia e dentística restauradora). Os machos foram submetidos a deferentectomia, com o protocolo associado a anestesia local. Após a punção 19 da veia braquial (Figura 8), as amostras de sangue foram acondicionadas em tubos de ensaio contendo anticoagulante (EDTA) (Figura 9) e acondicionadas em caixa térmica contendo gelo reciclável, e posteriormente congeladas e mantidas a uma temperatura média de -25°C. FIGURA 8. Venopunção da veia braquial para colheita de sangue em macaco-barrigudo (Lagothrix cana). FIGURA 9. Tubo de ensaio contendo anticoagulante (EDTA), após colheita de amostra de sangue de exemplar de macaco-barrigudo (Lagothrix cana). 20 Os animais foram monitorizados durante todo o período anestésico (figura 10), com atenção especial ao retorno de reações conscientes, retorno da reação postural de endireitamento (RPE), e o retorno à ambulação normal, para serem liberados aos recontos. Os dados eram todos anotados em fichas anestésicas individuais (Figura 11). FIGURA 10. Exemplar adulto de macaco-barrigudo (Lagothrix cana) sendo monitorado quanto à temperatura corporal e oximetria de pulso. 21 FIGURA 11. Exemplo de ficha anestésica utilizada na monitorização de macacos-barrigudos (Lagothrix cana), durante o trabalho de pesquisa. 4.3 Extração de DNA e avaliação da qualidade do material obtido No laboratório, as amostras foram descongeladas e a extração de DNA total foi realizada por meio da técnica empregando fenol/clorofórmio, segundo 22 protocolo descrito em Sambrook e Russel (2001). A quantidade e a qualidade do DNA foram avaliadas em espectrofotômetro (Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer - Thermo Fisher Scientific), por meio de absorbância a 260-280 nm e, em gel de agarose a 1,0%, corado com Gel Red (Uniscience) (0,1μL/10mL) imerso em tampão TAE 1X (Tris-Ácido acético-EDTA) e visualizados em digitalizador de imagens, sob luz ultravioleta. 4.4 Reação de amplificação (PCR) e purificação do produto Para a determinação da(s) espécie(s) referente às amostras colhidas, empregou-se segmentos da região controladora do DNA mitocondrial (D-Loop) e do COII, obtidos utilizando os primers L15400 (5’- TCCACCATTAGCACCCAAAG-3’) e H15940 (5’- CCTGAAGTCGGAACCAGATG-3’) (KOCHER et al., 1989), L6955 (5- AACCATTTCATAACTTTGTCAA-3) e H7766 (5 -CTCTTAATCTTTAACTT AAAAG-3) (ASHLEY e VAUGHN, 1995; COLLINS e DUBACH, 2000), respectivamente. As reações de amplificação (PCR - Polymerase Chain Reaction) foram feitas em um volume final de 11 µl, contendo: 5 µl de água milliQ autoclavada; 4 µl de GoTaq (Promega) (mix pronto 1x contendo 0,20 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1 U de Taq DNA Polimerase); 0,5 µl de cada primer (10 µM); 1 µl de DNA (20-50 ng/µL) As condições de amplificação para o mtCOII foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C, por 5 minutos, seguida de 35 ciclos a 95°C, por 30 segundos; 50ºC por 30 segundos e 72°C, por 30 segundos, com um passo final de extensão a 72°C, por 5 minutos. As condições de amplificação, para a região controle, foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C, por 10 minutos, seguida de 35 ciclos a 94°C, por 23 35 segundos; 55ºC, por 35 segundos e 70°C, por 30 segundos, com um passo final de extensão a 72°C, por 10 minutos. O rendimento do produto da amplificação foi avaliado em eletroforese em gel de agarose 1,5% imerso em tampão TAE 1x (Tris-Ácido acético-EDTA), corado com Gel RedTM e visualizado em transluminador, sob luz ultravioleta. Posteriormente, cerca de 5 µl de cada produto de amplificação foi purificado com a adição de 0,5 µl de fosfatase alcalina de camarão (1 U/µl) (Affymetrix, Inc.) e 0,4 µl de exonuclease I (10 U/ µl) (Affymetrix, Inc.) e incubado por 45 minutos a 37ºC. Feito isto, este foi incubado a 80°C, por 15 minutos. 4.5 Sequenciamento Nucleotídico As reações de sequenciamento do produto de PCR foram realizadas pelo sequenciador Applied Biosystems 3500 no Laboratório de Diagnóstico Molecular do Instituto de Biociências da UNESP/Botucatu. Os produtos de amplificação foram sequenciados nos sentidos direto e reverso para garantir uma maior confiabilidade dos resultados. Para a reação de sequenciamento, foi utilizado o kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Para cada reação, foram utilizados 1,2 µl de solução Big Dye, 1 µl de primer (10 µM) e 5 µl do produto mitocondrial. As reações foram colocadas em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 96ºC, por 1 minuto; seguida de 25 ciclos a 96ºC, por 10 segundos; 50ºC, por 30 segundos e 60ºC, por 4 minutos; com um passo final de extensão a 72º C, por 10 minutos. Posteriormente, foram adicionados 4 µl de água MilliQ autoclavada e 16 µl de etanol 95%. A solução foi misturada em agitador de tubos e mantida por 15 minutos à temperatura ambiente (~25ºC). A amostra foi centrifugada por 30 minutos, a 12000 rpm e o sobrenadante retirado. O precipitado foi lavado com cerca de 200 µl de etanol 70%, e a solução foi misturada em um agitador de tubos e novamente centrifugada por 7 minutos, a 12000 rpm. A amostra foi seca a 90ºC, durante 2 minutos e mantida a -20ºC. O produto do sequenciamento foi dissolvido em 1,6 µl de formamida:dextran azul 25 mM EDTA (5:1), ressuspenso e desnaturado por 2 minutos a 90ºC, em banho seco. As sequências das duas fitas de DNA de cada 24 amostra foram editadas e alinhadas no programa Sequence Navigator (Applied Biosystems). 4.6 Análise dos dados / Edição e Alinhamento das Sequências A visualização dos eletroferogramas da sequência nucleotídica dos fragmentos de DNA mitocondrial foi realizada por meio do programa computacional Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd, 2007), o qual permite a leitura de diversas extensões do sequenciamento. A amplitude e os espaçamentos dos picos foram devidamente observados para atestar a qualidade das sequências e verificar se as mutações eram reais ou se poderiam ser artefatos da técnica do sequenciamento. Utilizando o programa computacional Geneious 4.8.5 (DRUMMOND et al., 2009), as sequências obtidas no Chromas Lite 2.01 foram editadas e alinhadas e os respectivos eletroferogramas verificados. Cada resultado foi analisado individualmente e comparado ao seu respectivo eletroferograma pelo menos duas vezes. Os alinhamentos foram realizados utilizando a ferramenta (algoritmo) MUSCLE do programa Geneious 4.8.5 (EDGARD, 2004). Os alinhamentos foram também verificados manualmente, pelo menos duas vezes, e comparados aos seus eletroferogramas para a certificação da posição de bases nitrogenadas nas sequências obtidas. Para confirmar a identidade das sequências foi utilizado o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al. 1990), através do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), o qual relaciona sequências por meio de similaridade entre bases nitrogenadas. Todas as amostras foram alinhadas entre si gerando um arquivo que foi utilizado na realização de testes estatísticos posteriores. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Quanto ao protocolo de contenção farmacológica Os animais perderam expressivamente a RPE em 2,52 ± 0,74 MPI, e 25 apresentaram início da anestesia aos 3,57 ± 0,74 MPI. O retorno de reações conscientes foi observado em 102,0 ± 66,72 MPI, com recuperação da RPE, aos 118,0 ± 62,46 MPI, e retorno à ambulação normal aos 237,5 ± 3,53 MPI. Os dados referentes aos parâmetros fisiológicos frequência cardíaca, frequência respiratória, saturação parcial de oxigênio (SpO2) e temperatura retal aos 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos do período anestésico são apresentados na Tabela 1. A análise global da frequência cardíaca mostrou redução significativa (p<0.05) com relação ao passar do tempo e ponto de redução pontual mais crítica entre 10 e 60 MPI (p=0,0248). A frequência respiratória não mostrou diferença significativa em nenhum dos momentos da anestesia. Já no que se diz respeito à temperatura retal, observou-se queda global significativa (p<0.05) a partir de 10 MPI, com a redução pontual mais crítica entre 40 e 50 MPI (p<0,05). Finalmente, a saturação parcial de oxigênio não apresentou diferenças globais significativas durante todo o período anestésico. Houve, no entanto, diferença significativa pontual dos valores obtidos entre 30 e 60 MPI (p=0,0334). QUADRO 1. Frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e saturação parcial de oxigênio (SpO2) de 21 primatas adultos da espécie Lagothrix cana, submetidos a contenção farmacológica e anestesia dissociativa de campo pela associação de Zoletil®, Atropina e Detomidina (“ZAD-50”), em doses calculadas por meio de extrapolação alométrica interespecífica (média ± desvio padrão). Minutos pós- injeção Frequência Cardíaca (bpm) Frequência Respiratória (mpm) Temperatura retal (oC) SpO2 (%) 10 147 ± 29 51 ± 14 39,0 ± 0,7 89 ± 4 20 143 ± 14 50 ± 10 38,9 ± 0,8 88 ± 4 30 141 ± 13 48 ± 10 38,7 ± 0,8 87 ± 4 40 139 ± 15 48 ± 11 38,3 ± 1,0 84 ± 8 50 141 ± 25 51 ± 15 38,0 ± 1,0 84 ± 11 60 131 ± 14 47 ± 12 37,8 ± 1,2 87 ± 10 (mpm = movimentos por minuto; bpm = batimentos por minuto) A frequência cardíaca, na avaliação estatística pelo teste de Spearman, mostrou moderada correlação negativa significativa com o tempo (rs = -0,6; p= 0,0003), ou seja, diminuindo conforme passava o tempo. Quanto à frequência respiratória, a análise dos dados pelo teste de Spearman mostrou fraca 26 correlação negativa significativa entre o tempo e a frequência respiratória (rs = - 0,3, p = 0,02). No que diz respeito à temperatura retal, houve forte correlação negativa com o tempo (rs = -0,9, p= 0,0001), diminuindo intensamente conforme passava o tempo. No que tange à saturação parcial de oxigênio, não houve correlação pelo teste de Spearman (p= 0,38). A qualidade da contenção farmacológica, da analgesia e do miorrelaxamento foi considerada excelente, e durante anestesia, os parâmetros fisiológicos apresentaram características compatíveis com o esperado. Não houve variação na frequência respiratória, enquanto a frequência cardíaca se manteve estável na maior parte do tempo anestésico, apresentando uma diminuição dos batimentos entre 10 MPI e 60 MPI, podendo estar relacionada com o estresse prévio à contenção, que favorece o aumento da frequência cardíaca. A temperatura retal caiu progressivamente a partir de 10 MPI e a saturação parcial de oxigênio não apresentou diferenças significativas durante a anestesia. A qualidade da recuperação foi considerada excelente em todos os casos. 5.2 Quanto à obtenção do material biológico Quanto à extração do DNA, foram colhidas um total de 21 amostras biológicas provenientes do CETAS Sauim Castanheiras e da Fundação Floresta Viva, durante o todo o período. A quantificação e a verificação da integridade das amostras de DNA foram feitas em espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer – Thermo Fisher Scientific. Esse equipamento quantifica o DNA total contido em cada amostra individual, além de verificar se há contaminação por proteína por meio da razão de absorbância da luz na faixa de 260/280 nm (Quadro 2). 27 QUADRO 2. Relação de amostras obtidas de macacos-barrigudos (Lagothrix cana) submetidas à avaliação de integridade das amostras e quantificação de DNA. AMOSTRAS CONCENTRAÇÃO DE DNA (ng/µL) ABSORBÂNCIA 260/280 3 22,0 1,25 6 20,0 1,40 35 28,4 1,53 83 30,9 1,88 89 18,0 1,32 110 43,9 1,87 111 12,9 1,50 138 10,8 1,41 164 5,8 1,39 216 21,9 1,65 291 25,8 1,83 341 16,2 1,30 371 30,9 1,48 484 48,9 1,88 623 16,7 1,53 629 39,1 1,94 676 23,4 1,80 699 8,6 1,24 798 35,3 2,00 841 5,3 1,33 850 38,6 1,35 860 27,7 1,19 873 6,9 1,63 891 28,1 1,96 992 19,0 1,31 Os genes mitocondriais COII e D-Loop foram amplificados por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) empregando amostras de DNA obtidas a partir de 19 indivíduos. Na amplificação do gene COII utilizando os primers L6955 e H7766 (COLLINS e DUBACH, 2000) a reação foi positiva para 10 indivíduos (003, 006, 089, 098, 110, 629, 699, 873, 922, 992), gerando fragmentos de aproximadamente 700pb (pares de bases). Na amplificação do gene D-Loop empregando os primers L15400 e H15940 (ASHLEY e VAUGHN, 1995) a reação foi positiva para 09 indivíduos sendo os mesmos elencados para o marcador mitocondrial COII com exceção do indivíduo 922, gerando fragmentos de aproximadamente 500pb. Os resultados do sequenciamento foram analisados no programa computacional Chromas Lite 2.01 (Technelysium Pty Ltd, 2007) a fim de verificar 28 a qualidade das leituras das sequências de DNA obtidas. A amplitude e os espaçamentos dos picos foram devidamente observados verificando se as mutações eram reais ou se poderiam ser artefatos da técnica do sequenciamento. Subsequente a essa análise, as sequências obtidas para os genes COII e D-Loop foram alinhadas e as sequências consensos de 567pb e de 429pb respectivamente, foram submetidas a comparações com demais sequências de DNA mitocondriais depositadas no GenBank por meio do método de algoritmo de BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990). Na comparação do alinhamento das sequências obtidas para o fragmento do gene mitocondrial COII entre os 10 animais analisados com as sequências depositadas no GenBank para as espécies Lagothrix cana, L. lagothricha e L.poeppigii observou-se 100% de similaridade com Lagothrix cana confirmando assim que esses animais são comprovadamente pertencentes a esta espécie. A comparação dessas sequências nucleotídicas permitiu determinar 8 sítios variáveis entre as espécies L. cana e L. lagothricha e de 9 sítios variáveis entre L. cana e L. poeppigii (Tabela 1). TABELA 1. Sítios variáveis em 567 pares de bases do gene COII do DNA mitocondrial em Lagothrix. cana, L. lagothricha e L. poeppigii Sequências 3 3 6 3 3 4 4 4 4 5 5 0 9 9 2 9 1 3 7 7 1 3 Indivíduos 1 9 5 2 1 7 9 4 L. cana T T A T T T T C C A C 003 . . . . . . . . . . . 699 . . . . . . . . . . . 873 . . . . . . . . . . . 922 . . . . . . . . . . . 629 . . . . . . . . . . . 110 . . . . . . . . . . . 006 . . . . . . . . . . . 089 . . . . . . . . . . . 098 . . . . . . . . . . . 992 . . . . . . . . . . . L. lagothricha C . G C C C C . T . T L. poeppigii . C G C C C C T T G . 29 Apresenta-se na tabela 2 a comparação das sequências nucleotídicas já descritas no quadro 1, porém incluindo a espécie Ateles fusciceps, (macaco- aranha). Esta comparação teve, por intuito, mostrar o maior número de polimorfismos (58) quando alinhamos sequências oriundas entre 2 gêneros distintos que, neste caso são Lagothrix e Ateles. TABELA 2. Sítios variáveis em 567 pares de bases do gene COII do DNA mitocondrial em Lagothrix. Cana e Ateles fusciceps Sequências 3 1 3 3 6 6 7 8 9 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 0 9 2 9 5 5 3 9 1 2 2 3 3 5 5 6 6 1 0 7 5 8 6 9 2 5 Indivíduos L. cana T C T T C A A T C T T T G C C A T G T A. fusciceps C T . . A . T C T C C C A T T T C A C Sequências 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 7 8 8 8 8 9 9 1 1 2 2 2 3 6 7 8 9 9 0 8 0 6 7 9 2 5 3 6 0 5 8 7 7 9 2 1 7 5 Indivíduos L. cana T G C C G C G A C T A T T T A C C C C A. fusciceps C A T T A T A G T C C C C C G T T T T Sequências 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 2 3 5 5 6 6 9 9 9 0 1 1 3 4 5 5 6 7 1 7 6 4 7 6 9 0 3 9 5 1 5 2 7 1 2 5 1 Indivíduos L. cana T A T C T T T T G T C T T T C A C C C A. fusciceps . T C T C C A C A C A C . . T G T A . 30 Sequências 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 7 8 8 9 0 1 1 3 4 6 7 3 7 8 4 6 9 4 6 1 Indivíduos L. cana C C T A T T A C C C A. fusciceps . T C G A C . T T T Para o gene mitocondrial D-Loop não foi encontrada sequência depositada no GenBank para o Lagothrix cana. Na comparação do alinhamento das sequências obtidas para este fragmento entre os 09 animais analisados observou-se um total de 05 polimorfismos distribuídos em 04 haplótipos (Tabela 3). Estes resultados serão submetidos ao banco de dados GenBank de forma a disponibilizá-los publicamente para pesquisas futuras. Observa-se que o haplótipo 2 formado pelos animais 089, 6873, 110, 699, 992 foi o mais frequente representando cerca de 55,6% das amostras analisadas. TABELA 3. Sítios variáveis em 429 pares de bases da região controle do DNA mitocondrial (D- Loop) em 09 indivíduos da espécie Lagothrix cana 8 1 1 2 3 2 1 1 5 0 4 5 6 0 Indivíduos 003 C G G C A 098 . . . . . 089 T A . T G 873 T A . T G 110 T A . T G 699 T A . T G 992 T A . T G 006 . A A T G 629 T A A . . 31 A região controle do DNA mitocondrial, que inclui o gene D-Loop bem como os genes citocromo B (CytB) e citocromo C oxidase (COI, II e III) têm sido as sequências mais utilizadas para identificar e catalogar espécies, discriminar subespécies, estudar evolução em espécies domésticas, silvestres e selvagens. O projeto internacional conhecido como DNA Barconding of Live lançado no ano de 2005 objetivou inicialmente, gerar sequências de aproximadamente 648 pb do gene mitocondrial COI como ferramenta de auxílio em filogenética e catalogação da biodiversidade. Contudo, a melhoria tecnológica proporcionou um aumento de escala nos estudos mitocondriais proporcionando um avanço considerável. Um dos primeiros trabalhos em primatas empregando os marcadores mitocondriais COII é o de Ashley & Vaughn (1995). Com a finalidade de esclarecer aspectos da história evolutiva no gênero Aotus foram obtidas amostras de DNA de 03 possíveis espécies – A. lemurinus, A. nancymae e A. azarae. Após a comparação das sequências obtidas para este gene, os resultados indicaram níveis altos de divergência nesta sequência nucleotídica para as 3 espécies sugerindo assim que os táxons são geneticamente bem distintos e que provavelmente passaram por longos períodos de evolução isolada. Ruiz-Garcia & Pinedo (2010), propuseram a primeira hipótese de sistemática molecular sobre a origem e evolução do táxon Lagothrix com base na análise dos 720pb do gene mitocondrial COII obtidas a partir de amostras de 97 indivíduos. Os autores concluíram que todas as formas atuais de Lagothrix sp,, provavelmente descenderam do ancestral L. poeppigii ou talvez, de forma menos provável, de L. lugens. Ruiz-Garcia et al. (2014) sequenciaram os genes COI e COII de 141 espécimes de Lagothrix sp. neotropicais e propuseram, a partir dos dados moleculares, uma nova proposta de classificação desse gênero. O emprego do marcador molecular COII nesta pesquisa visou, principalmente, a confirmação de qual ou quais espécies pertenciam cada um dos indivíduos analisados considerando o gênero Lagothrix. Ou seja, a caracterização gênica individual para este gene é uma importante etapa na elaboração de um plano de reintrodução de indivíduos ou de reprodução, evitando principalmente a formação de híbridos. Conforme apresentado no quadro 1, todos os 10 indivíduos analisados pertenciam à espécie Lagothrix cana. 32 Averiguando os resultados descritos nas tabelas 1 e 2, destaca-se a eficácia deste marcador para a identificação de espécies. 6 CONCLUSÕES Quanto à contenção farmacológica, em todos os animais foi plenamente satisfatória. Não foram observadas reações adversas e os parâmetros vitais avaliados mantiveram-se dentro de padrões compatíveis com o estado de contenção farmacológica e com o retorno à vida normal. A combinação “ZAD-50” tem volume final de 3,0 ml após o preparo, estando os fármacos tiletamina, zolazepam, atropina e detomidina associados em alta concentração. Esse método simplifica enormemente o trabalho veterinário com mamíferos selvagens, como os primatas do porte da espécie Lagothrix cana, possibilitando a captura de cada animal empregando-se um único dardo de pequeno volume. Como exemplo, a contenção farmacológica de um macho adulto pesando 8,8 kg se faz com um volume de 0,54 ml de ZAD-50. O método de contenção farmacológica mostrou-se seguro e eficiente para procedimentos de captura, transporte, exame físico, marcação por microchip, colheita de amostras de sangue e urina, curativos, tratamento de feridas contaminadas e suturas cutâneas, procedimentos cirúrgicos e odontológicos, incluindo periodontia, exodontia, endodontia e dentística restauradora. Quanto à análise genética, este trabalho conseguiu padronizar uma sequência de genes no segmento D-Loop, que caracteriza a espécie Lagothrix cana, e que deve ser adicionada ao Gen Bank, para fornecer subsídios em eventuais pesquisas subsequentes, relacionadas a assuntos tais quais filogenia, evolução, biodiversidade, reprodução em cativeiro, entre outros. 33 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALTSCHUL, S.F., GISH, W., MILER, W., MEYERS, E.W., LIPMAN, D.J. 1990. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 403-410 (http//www.ncbi.nlm.nih.gov.blast). 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Marcelo Rocha Carneiro Médico Veterinário, Mestre em Ciência Animal. Aluno do Programa de Pós- graduação em Animais Selvagens da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Botucatu, SP. E-Mail: mrcarneiro71@gmail.com Laerzio Chiesorin Neto Médico Veterinário, Especialista. Professor da Universidade Nilton Lins, Manaus, AM. E-Mail: laerziovet@ibest.com.br Augusto Kluczkovski Júnior Médico Veterinário, Mestre, Doutor – Fundação de Vigilância em Saúde – FVS – Manaus, AM. E-mail: augustokjr@hotmail.com Fabiano Montiani-Ferreira Médico Veterinário, Mestre, Doutor. Professor Adjunto - Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Paraná – UFPR, Curitiba, PR. E-mail: montiani@ufpr.br Lígia Souza Lima Silveira da Mota Zootecnista, Mestre, Doutora. Professora Adjunta no Departamento de Genética do Instituto de Biociências e docente do Programa de Pós-Graduação em Animais Selvagens da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da http://medvep.com.br/normas-para-publicacao/ mailto:mrcarneiro71@gmail.com mailto:laerziovet@ibest.com.br mailto:augustokjr@hotmail.com mailto:montiani@ufpr.br 52 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Botucatu, SP. E-mail: ligia.mota@unesp.br José Ricardo Pachaly Autor para correspondência. Médico Veterinário, Mestre, Doutor, Pós-Doutor. Professor Titular do Programa de Mestrado em Ciência Animal da Universidade Paranaense – UNIPAR. Diretor Científico do Instituto Brasileiro de Especialidades em Medicina Veterinária – ESPECIALVET. Rua Lopes Trovão, 250, Zona 4, CEP 87014-080, Maringá, PR, Brasil. E-mail: pachaly@uol.com.br Carneiro M.R., Chiesorin Neto, L.; Kluczkovski Jr. A.; Montiani-Ferreira, F.; Mota, L.S.L.S., Pachaly J.R.. Contenção farmacológica e anestesia de campo em macacos-barrigudos (Lagothrix cana, Atelidae) empregando a fórmula “ZAD-50” (Zoletil/50® + Atropina + Dormiun-V®) e o método de extrapolação alométrica para cálculo de doses. MEDVEP – Rev Cientif Vet Pequenos Anim Esti 2018: X(XX):XXX-XXX. RESUMO Relata-se a contenção farmacológica e anestesia dissociativa de campo de 21 primatas adultos da espécie Lagothrix cana (macaco-barrigudo), pesando 5,24 ± 1,66 kg, sendo 14 fêmeas e sete machos. Foi usada a associação de tiletamina, zolazepam, atropina e detomidina, em doses calculadas por meio de extrapolação alométrica interespecífica. Os fármacos foram combinados numa preparação concentrada que foi denominada “ZAD-50” (Zoletil/50® + Atropina + Dormiun-V®), para a qual se adicionam ao conteúdo de tiletamina e zolazepam desidratados de um frasco do