UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU RESÍDUOS DA INDÚSTRIA PESQUEIRA NA INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli E Ralstonia solanacearum E DE BIOFERTILIZANTES NO CONTROLE DE OÍDIOS ALEXANDRE VISCONTI Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU-SP Junho - 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU RESÍDUOS DA INDÚSTRIA PESQUEIRA NA INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli E Ralstonia solanacearum E DE BIOFERTILIZANTES NO CONTROLE DE OÍDIOS ALEXANDRE VISCONTI Orientador: Prof. Dr. Wagner Bettiol Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas). BOTUCATU-SP Junho - 2011 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Visconti, Alexandre, 1967- V824r Resíduos da indústria pesqueira na indução de supressividade a Cylindrocladium spathiphylli e Ralstonia solanacearum e de biofertilizantes no controle de oídios. – Botucatu : [s.n.], 2011 ix, 127 f. : tabs., gráfs., fots. color. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2011 Orientador: Wagner Bettiol Inclui bibliografia 1. Biofertilizantes. 2. Cylindrocladium spathiphylli. 3. Controle biológico. 4. Oídios. 5. Ralstonia solanacearum. 6. Resíduos industriais. I. Bettiol, Wagner. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”(Campus de Botucatu. Faculdade de Ciências Agronômicas. III. Título. III DEDICO Às pessoas especiais que acreditaram em mim e no sucesso de meu Doutorado: Minha esposa Giseli; Aos nossos filhos Gustavo e Murilo; Aos meus pais Joaquim e Carmen Rosélis; Aos meus irmãos Luis Antonio e Daniel Felipe; Aos meus sogros Alceu (in memoriam) e Idiani; e À tia Vera. IV AGRADECIMENTOS A Deus por esta graça alcançada. À Epagri, em especial aos anos de 2007 e 2008, aos Presidentes Athos de Almeida Lopes e Murilo Xavier Flores e aos Diretores Ditmar Afonso Zimath, Edson Silva, Renato Broetto e Elisabete Silva de Oliveira, por permititem a continuidade de minha pós- graduação para a obtenção do Doutorado. Ao meu grande AMIGO, IRMÃO e CONSELHEIRO Juarez José Vanni Müller, pessoa de meu profundo respeito e admiração, grande exemplo humano e profissional, incentivador de minha pós-graduação. Ao Prof. Dr. Wagner Bettiol, por seu aceite em continuar me orientando no doutorado, pelo seu conhecimento, sua paciência, nossas “poucas” discussões e, principalmente, sua amizade. Poucas foram as decisões corretas em minha vida e sua escolha como orientador se inclui. Aos colegas da Estação Experimental de Itajaí, Gilmar Roberto Zaffari, Eliséo Soprano, Terezinha Catarina Heck, Inácio Hugo Rockenbach (inclusive aos que já se aposentaram), Maurício César Silva, Irceu Agostini, Fernando Adami Tcacenco, Euclides Barni, Antônio Amaury Silva Júnior, Airton Rodrigues Salerno, Henri Stuker, Jorge Luiz Malburg, Pedro Nicolau Serpa, Neri Dalenogare, pelo incentivo. Aos docentes do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Proteção de Plantas) da UNESP-FCA/Botucatu, Antonio Carlos Maringoni, Edson Luis Furtado, Silvia Renata Siciliano Wilcken, Renate Krause Sakate, Marcelo Agenor Pavan, Carlos Frederico Wilcken, Raquel Ghini e Wagner Bettiol, pelos ensinamentos transmitidos. Aos professores da ESALQ/USP, Ivan Paulo Bedendo e Sônia Maria de Stefano Piedade, professores das disciplinas de Bactérias Fitopatogênicas e de Estatística, respectivamente, que cursei nesta universidade durante meu doutorado. Aos amigos Evandro Pereira Prado (Biludo), Daniel Pivotto (Fânero) e Gregório Lima, da república em Botucatu, e ao Andrelino Kempe, da república de Jaguariúna, pelas boas lembranças. V À turma que convivi, Lívia Mendes, Tatiana Mituti, Haroldo Elias Tavares, Demétrius Araújo, Marcus Vinícius Masson, Alexandre Cândido, Élida Barbosa Corrêa, Marina Meloni Gória, Luciana Reyers, Marcela Galo Teodoro, Sarah Pigato Canova, João Tozzi, Eduardo Gottardo, Maria Augusta de Camargo Ferraz (Guta), Mariana Castro Lotto, Fábio Luiz Soares Júnior (Dig), Leonardo José da Silva, Flávia Mandolesi de Mello, Natália Carvalhaes de Oliveira, Fernando Dini Andreote, Carla Almeida, Osvaldo Luis Ferreira Júnior, Ângela Valente, Elinalva Maciel Paulo (com o Ferreirinha junto), Liliana Patrícia Vital de Mattos, Rodrigo e Natália Taketani, Gabriela Grangueli Gonçalves, Joice Leite, Carla Aragão Almeida, Jaime Pieroni Júnior e Ângela Maria Maciel Montes Peralva Valente, carinho e saudades. À turma que convivo e que não vou esquecer: Zayame Vegette Pinto, Michelli de Souza Santos, Fernanda Ribeiro de Andrade Oliveira, Cassiano Forner, Regiane Iost (Figura), Juliano César Silva, Regiane Médici, Vanessa Nessner Kavamura (o Tomio também), Luciana Ávila, Luana Piermann, José Abrahão Haddad Galvão, Lúcio Bertoldo Costa, Rachel Temperani Amaral Machado, Andiale Pinto dos Santos, Rodrigo Estevam de Oliveira Mac Leod, César Júnior Bueno, Carlos Eduardo Oliveira da Silva, Elen Ribeiro dos Santos, Luiz Alexandre Sereda, Wallace Rafael de Souza, Suikinai Nobre Santos, Mírian Lobo Sáber, Juliana Ferrari de Almeida Nogueira. Estes ainda vão deixar muitas saudades. À Embrapa Meio Ambiente, pela oportunidade da realização deste trabalho. Aos pesquisadores da Embrapa Meio Ambiente: Raquel Ghini, Marcelo Augusto Boechat Morandi, Célia Maria Manganhoto de Souza Silva, Itamar Soares de Melo, Lilia Aparecida Salgado de Morais, Bernardo de Almeida Halfeld Vieira, Kátia de Lima Nechet, Adriana Marlene Moreno Pires, Marcos Antônio Vieira Ligo, Rosa Toyoko Shiraishi Frighetto, Marcos Eliseu Losekann e Júlio Ferraz de Queiroz. Aos colaboradores do Laboratório de Microbiologia Ambiental, João Luiz da Silva, Rosely dos Santos Nascimento, Márcia Maria Parma, Elke Dias Simone Vilela, Anamaria Ferreira Mayer Dentzien e Tatiana Alves Rigamonte Fernandes, obrigado pela atenção. VI Aos laboratoristas Orlando Batista dos Santos, Viviane Cristina Bettanin Maximiliano, Cindi Cristina Ferreira de Camargo e Lidiane Cristina Ferreira da Silva, do Laboratório de Química de Solo e Água; à Meire Correia da Silva Ferrari do Laboratório de Qualidade do Solo; e ao Rodrigo Fernandes Castanha do Laboratório de Produtos Naturais, minhas lembranças. Ao Eraldo de C. Conceição Telles, Claudemir Aparecido Donetti, Antônio Benedito Cavalaro, Antônio Ribeiro, Eliseu Palma, José Renato Barbosa, Mauri Valdivino Pereira, da manutenção e infraestrutura, pela pronta ajuda. Ao Victor Paulo Marques Simão, Maria Amélia de Toledo Leme, Maria de Cléofas Faggion Alencar e José de Arimatéia de Araújo Sousa, da biblioteca da Embrapa Meio Ambiente, pelo pronto atendimento de minhas solicitações. Aos motoristas Antônio dos Santos, Carlos Alberto Faria de Oliveira, Roberto Catarino dos Santos, Sérgio Luiz Sereda e Walter Claudionir Chiquitto, por tantas idas e vindas. Ao Waldemore Moriconi, Henrique Barros Vieira, Antônio Alves de Souza, Brasilino Mendes Soares Filho, Célia Batista da Silva de Lima, Hiram Campos de Carvalho, Júlio Cesar de Oliveira, Laércio Carmo da Silva, Luis Carlos Moreira, Roberto Carlos Rossali Passolongo, Valdecir Cândido de Oliveira e Vicente Gabriel Neto, dos Campos Experimentais da Embrapa Meio Ambiente, pelo apoio na condução dos experimentos. Ao produtor Ronaldo Aluísio Kievitsbosch, especial agradecimento por sua disposição no fornecimento de mudas e insumos para condução de meus experimentos. Também aos produtores Johannes Petrus Wulfram De Wit e Adrianus Lambertus Pennings, pelo fornecimento de materiais para o desenvolvimento dos trabalhos. Aos colegas da Universidade Federal de Lavras – UFLA, Flávio Henrique Vasconcelos de Medeiros, Henrique Monteiro Ferro e Roberto Lanna. À Irene Maria Gatti de Almeida, do Instituto Biológico, de Campinas, pelo fornecimento do isolado de Ralstonia solanacearum. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pela concessão da bolsa de doutorado. Aos meus amigos de Brusque e de Lages. VII À seção de Pós-Graduação do Câmpus da FCA, Jaqueline de Moura Gonçalves, Marlene Rezende de Freitas, Katia Otomo Duarte, Taynan Ribeiro Moraes da Silva e Marilena do Carmo Santos, pela presteza quando solicitada. Aos colaboradores da Biblioteca “Prof. Paulo de Carvalho Mattos”, Airton Fioravante, Ana Lúcia de Grava Kempinas, Célia Regina Inoue, Denise Melo Nogueira de Assis, Ermete Nibi Neto, Janaina Celoto Guerrero, Joel Di Creddo, Luiz Carlos Rodrigues da Paz, Maria Inês Andrade e Cruz, Maria Lúcia Martins Frederico, Nilson de Camargo, Solange Aparecida Paulossi Spadim; e, Ao Conselho do Curso de Pós-Graduação em Agronomia, Área de Concentração em Proteção de Plantas da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP- FCA, pela oportunidade de realização dos trabalhos. AGRADEÇO VIII SUMÁRIO Página RESÍDUOS DA INDÚSTRIA PESQUEIRA NA INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli E Ralstonia solanacearum E DE BIOFERTILIZANTES NO CONTROLE DE OÍDIOS ................................................................................................................. 1 1. RESUMO........................................................................ ............................ 1 2. SUMMARY.................................................................... ............................ 3 3. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................... 5 4. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................. 8 4.1. Supressividade a fitopatógenos.................................................................. 8 4.2. Supressividade com resíduos marinhos..................................................... 10 4.2.1. Farelo, hidrolisado e emulsão de peixe...................................................... 10 4.2.2. Cascas de crustáceos (camarão, caranguejo e siri)................................... 18 4.2.3. Resíduos de algas marinhas....................................................................... 22 4.2.4. Concha de moluscos................................................................................... 24 4.3. Biofertilizantes no controle de doenças de plantas.................................... 26 4.4. Segurança alimentar de produtos orgânicos............................................. 28 CAPITULO I – INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli EM PLANTAS DE ESPATIFILO COM RESÍDUOS MARINHOS............................................................................................................. 30 RESUMO........................................................................ ............................ 31 ABSTRACT.............................................................. .................................. 32 INTRODUÇÃO.............................................................. ............................ 33 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 34 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ .... 37 AGRADECIMENTOS............................................................................... 41 REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS......................................................... 41 CAPÍTULO II – EFEITO DE RESÍDUOS MARINHOS NA INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Ralstonia solanacearum EM TOMATE................................................................................................................. 55 IX RESUMO.................................................................................................... 56 ABSTRACT................................................................... ............................. 57 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 58 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 60 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 63 AGRADECIMENTOS............................................................................... 66 REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS......................................................... 66 CAPÍTULO III – POTENCIAL DE BIOFERTILIZANTES AERÓBICOS NO CONTROLE DE Podosphaera fuliginea EM PEPINO E Oidium neolycopersici EM TOMATE.......................................................................................................... 82 RESUMO....................................................................... ............................. 83 ABSTRACT.................................................................. .............................. 84 INTRODUÇÃO............................................................. ............................. 85 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................... 86 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 90 AGRADECIMENTOS............................................................................... 92 REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS......................................................... 92 5. CONCLUSÃO............................................................... ............................. 103 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 104 7. APÊNDICE................................................................................................. 123 1 RESÍDUOS DA INDÚSTRIA PESQUEIRA NA INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli E Ralstonia solanacearum E DE BIOFERTILIZANTES NO CONTROLE DE OÍDIOS. Botucatu, 2011. 127f. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Autor: ALEXANDRE VISCONTI Orientador: Prof. Dr. WAGNER BETTIOL 1. RESUMO O trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de hidrolisado de peixe (HP), emulsão de peixe (EP), casca de camarão (CC), pó da alga marinha Sargassum sp. (AG) e pó de concha de marisco (CM) no controle de Cylindrocladium spathiphylli em espatifilo e Ralstonia solanacearum em tomate; e avaliar o efeito de dois biofertilizantes no controle de Oidium neolycopersici em tomate e Podosphaera fuliginea em pepino. Ao substrato padrão de cultivo de espatifilo, coletado de sistemas de produção naturalmente infestado com o patógeno, foram incorporados HP e EP nas concentrações de 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (v/v) do volume necessário para atingir a capacidade de retenção de água e CC, AG e CM nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% (v/v). As misturas foram incubadas por 10 dias à temperatura ambiente e, posteriormente, transferidas para vasos plásticos de 300 mL, seguido do plantio de uma muda de espatifilo da variedade Opal. No plantio, aos 90 e aos 180 dias de cultivo foi determinada a respiração microbiana, o carbono da biomassa microbiana e atividade de hidrólise do diacetato de fluoresceína. Macro e micronutrientes dos substratos foram determinados no plantio e ao final do experimento. A incidência da doença foi avaliada aos 180 dias de cultivo e a severidade 2 semanalmente até os 180 dias após o plantio. Para confirmação da presença do patógeno, fragmentos de raízes foram transferidos para placas de Petri contendo BDA + estreptomicina. A EP a 20% (v/v) induziu a supressividade a C. spathiphylli. No controle de R. solanacearum o substrato de cultivo (80% latossolo + 20% substrato comercial à base de casca de pinus + 5g de 10-10-10 L-1 de substrato) foi infestado com 250 mL da suspensão do patógeno na concentração de 107 UFC mL-1/litro de substrato. Após sete dias de incubação incorporou-se os resíduos nas concentrações de 0; 1,5; 3 e 6% (v/v) para CC, AG e CM e 0; 7,5; 15; 22,5 e 30% (v/v) de EP do volume de água necessário para atingir a capacidade de campo. As misturas foram distribuídas em vasos de 2,8 L e mantidas em casa de vegetação por 10 dias seguido do plantio de quatro mudas de tomate ‘Santa Clara VF 5600’ com 25 dias de idade/vaso. As varíaveis analisadas foram: atividade enzimática de urease, respiração e macro e micronutrientes dos substratos, a incidência aos 115 dias e a severidade da doença a cada três dias. Os resíduos marinhos não controlaram R. solanacearum em plantas de tomate. O efeito dos biofertilizantes no controle de O. neolycopersici em tomate e P. fuliginea em pepino foi avaliado com aplicação preventiva e curativa. Duas mudas de pepino e tomate com 15 e 50 dias de idade, respectivamente, foram cultivadas em vasos de 2,8 L contendo o substrato descrito anteriormente. Nos tratamentos curativos, as folhas de pepino e tomate foram inoculadas com suspensão de 105 esporos mL-1 do patógeno e, após três dias pulverizados os biofertilizantes nas faces adaxial e abaxial das folhas até o ponto de escorrimento. Nos tratamentos preventivos, plantas previamente pulverizadas com os biofertilizantes foram mantidas em casa de vegetação contendo inóculo natural do patógeno. As pulverizações dos biofertilizantes foram repetidas semanalmente e a severidade avaliada a cada sete dias. O biofertilizante 2, pulverizado preventivamente, reduziu a severidade de P. fuliginea em pepino no primeiro cultivo. ____________________________________________________________________________ Palavras chave: supressividade, resíduos marinhos, hidrolisado de peixe, emulsão de peixe, casca de camarão, alga marinha, Sargassum sp., concha de marisco, Oidium neolycopersici, Podosphaera fuliginea. 3 FISHERIES WASTES IN THE INDUCTION OF SUPPRESSIVENESS ON Cylindrocladium spathiphylli AND Ralstonia solanacearum AND BIOFERTILIZERS ON THE CONTROL OF POWDERY MILDEWS. Botucatu, 2011. 127f. Thesis (Doctor in Agronomy/Plant Protection) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Author: ALEXANDRE VISCONTI Adviser: Prof. Dr. WAGNER BETTIOL 2. SUMMARY This study aimed to evaluate the potential of fish hydrolyzed (HP), fish emulsion (EP), shrimp peel (CC), Sargassum seaweed powder (AG) and mussel shell powder (CM) for the control of Cylindrocladium spathiphylli in Spathiphyllum and Ralstonia solanacearum in tomato; and evaluate the effect of two biofertilizers in the control of Oidium neolycopersici in tomato and Podosphaera fuliginea in cucumber. In the container media, naturally infested, collected from production systems, was incorporated with HP and EP at concentrations of 0, 5, 10, 15, 20 and 25% (v/v) of the volume of water required to reach the water retention capacity of the container media and CC, AG and CM at concentrations of 0, 1, 2, 3, 4 and 5% (v/v). The mixtures were incubated for 10 days at room temperature. After this, the mixtures were transferred to plastic pots of 300 mL, followed by the planting of one plug Spathiphyllum ‘Opal’ per pot. In planting, at 90 and 180 days of cultivation were determined microbial respiration, carbon biomass and activity by the hydrolysis of diacetate fluorescein. Macro and micronutrient of container media were determined at planting and at the end of the experiment. The incidence was evaluated after 180 days of cultivation and disease severity was assessed 4 weekly until 180 days of planting. To confirm the causal agent of disease in plants, root fragments were placed in Petri dishes containing PDA medium + streptomycin, kept in a growth chamber. We concluded that EP at 20% (v/v) induced suppressiveness to C. spathiphylli. In the control of Ralstonia solanacearum were evaluated EP, CC, CM and AG. The container media (80% latosol + 20% commercial pine bark container media + 5g NPK 10- 10-10 L-1 container media) was infested with 250 mL of a suspension with 107 CFU mL-1 of the pathogen by liter of container media. After seven days of incubation the residues were incorporated at concentrations of 0; 1,5; 3 and 6% (v/v) for CC, CM and AG; and concentrations of 0; 7,5; 15; 22,5 and 30% (v/v) of EP of the volume of water required to reach field capacity. The mixtures were distributed in 2,8 L plastic pots and kept in a greenhouse for 10 days followed by planting of four tomato seedlings ‘Santa Clara VF 5600’ with 25 days of age/pot. The incidence at 120 days and severity of the disease every three days until 120 days after planting were analyzed. The marine residues incorporated into the container media did not control R. solanacearum in tomato plants. The effect of biofertilizers in the control of O. neolycopersici in tomato ‘Santa Clara VF 5600’ and P. fuliginea in cucumber ‘Safira’ were evaluated in a greenhouse under preventive and curative applications. Two cucumber and tomato seedlings/pot, with 15 and 50 days old, respectively, were grown in plastic pots containing 2,8 L of container media (similar previously presented). In curative treatments, the leaves of cucumber and tomato plants were inoculated with a suspension of 105 spores mL-1 of the pathogen, and three days after inoculation the biofertilizers were sprayed in the surfaces adaxial and abaxial leaf to the point of run-off. For preventive treatments, plants previously sprayed with biofertilizers were kept in a greenhouse containing natural inoculum. The spraying of biofertilizers was repeated weekly. The severity was assessed every seven days. The biofertilizer 2 sprayed preventively reduce the severity of P. fuliginea in thr first cucumber cultivation. ____________________________________________________________________________ Keywords: suppressiveness, marine residues, fish hydrolysed, fish emulsion, shrimp peel, seaweed, Sargassum sp., mussel shell, Oidium neolycopersici, Podosphaera fuliginea. 5 3. INTRODUÇÃO GERAL A aplicação de fungicidas como única prática no controle de doenças de plantas é uma estratégia indesejável havendo, por parte da cadeia agrícola produtiva, crescente interesse na utilização de práticas de manejo integradas e ambientalmente adequadas para o controle de doenças, tais como o controle biológico e os produtos biocompatíveis. A supressividade, fenômeno de alguns solos prevenirem naturalmente o estabelecimento de patógenos ou inibirem as suas atividades patogênicas tem despertado crescente interesse e, em muitos casos, têm-se tornado alternativa importante, principalmente, no controle de patógenos de solo em sistemas intensivos de produção. No Brasil, os resíduos da agroindústria, os urbanos industriais e os marinhos são descartados, em sua maioria, como lixo, desprezando seu potencial como fornecedor de nutrientes, condicionante de solo e inibidor de patógenos de plantas. Os resíduos marinhos seguem a mesma tendência, com destino para lixões ou despejados no mar. O seu uso no controle de fitopatógenos ainda é escasso, principalmente, em regiões tropicais. O farelo, o hidrolisado e a emulsão de peixe, as cascas de crustáceos e as algas marinhas tem sido eficazes 6 no controle de fitopatógenos, porém com resultados variáveis, dependente das características do solo/substrato, do patossistema estudado, do tipo de resíduo, concentração aplicada, forma de aplicação e o grau de maturação do resíduo. Estes resíduos marinhos atuam de forma distinta, diretamente correlacionado ao pH, agindo por mecanismos bióticos e abióticos na redução das doenças como, o estímulo de microrganismos residentes com atividade de biocontrole; a indução de resistência sistêmica nas plantas; a produção de compostos químicos tóxicos aos fitopatógenos, e a presença de substâncias tóxicas como os ácidos graxos voláteis (AGVs). Os biofertilizantes são obtidos de fermentações aeróbicas ou anaeróbicas de resíduos orgânicos e que contêm nutrientes, estimulantes e microrganismos capazes de promover o desenvolvimento das plantas e auxiliar na sua proteção a fitopatógenos. Os mecanismos de controle estão diretamente ligados à produção de metabólitos produzidos pelos microrganismos presentes no biofertilizante ou pela ação direta dos microrganismos sobre o patógeno ou sobre o hospedeiro (indução de resistência). O seu uso pelo produtor está diretamente relacionado à disponibilidade de insumos na propriedade e ao baixo custo. No entanto, a diversidade dos resíduos utilizados requer a necessidade de conhecimento quanto ao modo de preparo, forma de aplicação, ação sobre o fitopatógenos e, não menos importante, a manutenção da qualidade sanitária do alimento para o consumidor. A preocupação da população com o seu bem-estar e com o ambiente tem promovido a busca por alimentos de melhor qualidade e mais seguros. Na escolha entre os alimentos cultivados em sistemas tradicionais ou oriundos de sistemas orgânicos, o consumidor tem levado em conta, o custo energético da produção, a contaminação da cadeia alimentar e da água, o conteúdo nutricional dos alimentos, os riscos microbiológicos e o uso de ferramentas biotecnológicas, como a transgenia. Os alimentos devem ser produzidos seguindo práticas que resultem em produtos seguros para serem consumidos. A contaminação microbiológica de alimentos, produzidos em sistemas orgânicos ou convencionais, depende, principalmente, das práticas de produção adotadas na propriedade e do manuseio correto das fontes de insumos utilizadas. Além disso, um alimento para ser comercializado como orgânico passa frequentemente por uma série de procedimentos exigidos pelas certificadoras, a qual não permite que o esterco animal seja utilizado antes de seu correto processamento, inativando os 7 microrganismos patogênicos presentes. Não há ainda informações indicando que os alimentos orgânicos podem ser contaminados de forma diferente dos convencionais. Este trabalho teve por objetivo testar o uso de cinco resíduos marinhos para o controle de Cylindrocladium spathiphylli em espatifilo e Ralstonia solanacearum em tomateiro; e avaliar o efeito de dois biofertilizantes no controle de Oidium neolycopersici em tomateiro e Podosphaera fuliginea em pepino. 8 4. REVISÃO DE LITERATURA 4.1. Supressividade a fitopatógenos O controle de doenças de plantas com fungicidas é uma prática comum a todos os sistemas agrícolas convencionais de produção. O seu amplo uso é justificado por possuir características desejáveis ao produtor como a simplicidade de uso, a previsibilidade dos resultados e a necessidade de pouco entendimento dos processos básicos do agroecossistema para a sua aplicação (MORANDI & BETTIOL, 2009). Segundo Garcia Garcia et al. (2005), a rigidez e a evolução da legislação e do sistema de registro de agrotóxicos no Brasil deveriam garantir que os produtos colocados à disposição do usuário sejam seguros quando utilizados de forma correta contudo, o uso inadequado e/ou intensivo tem demonstrado alto potencial de impacto negativo nos agroecossistemas, provocando desequilíbrios biológicos que eliminam os inimigos naturais de pragas de doenças, favorecendo a reincidência de altas populações das pragas e patógenos (ressurgência), a redução da biodiversidade dos escossistemas, a alteração da fisiologia das plantas, a interferência na relação simbiótica entre plantas e microrganismos (TOKESHI, 2000; 9 CAMPANHOLA & BETTIOL, 2003) e os danos à saúde humana com a persistência das moléculas sobre os alimentos, inclusive nos processados (JARDIM et al., 2009). A aplicação de fungicidas como única prática no controle é vista, atualmente, perante a sociedade, como uma estratégia indesejável. Assim, cresce o interesse na utilização de práticas de manejo integradas e ambientalmente adequadas para o controle de pragas e doenças, como o controle biológico, produtos biocompatíveis e compostos orgânicos (LABRIE et al., 2001; TEMORSHUIZEN et al., 2006; MORANDI & BETTIOL, 2009). A supressividade, ferramenta de controle biológico, é o fenômeno de alguns solos de prevenirem naturalmente o estabelecimento de patógenos ou inibirem as suas atividades patogênicas. Solos com essas características são denominados solos supressivos, opostos de solos conducentes. Ela pode ocorrer pela capacidade do solo em suprimir o patógeno reduzindo a densidade do inóculo ou pela supressão da doença, onde o patógeno está presente, mas a severidade é reduzida (BETTIOL et al., 2009). A supressividade em solos pode ser uma característica natural ou não, induzida por fatores bióticos e abióticos (COOK & BAKER, 1983). Dentre os fatores bióticos, são destacados a promoção da microbiota antagônica presente no solo e a introdução de antagonistas e, entre as características abióticas de um solo ou substrato são manejados principalmente, o pH, concentrações de macro e micronutrientes, a condutividade elétrica, alterações nas condições de aeração, estrutura e textura dos solos e a introdução e/ou manejo de resíduos orgânicos (PAPAVIZAS, 1985; MAZZOLA, 2002; de JENSEN et al., 2002; WELLER et al., 2002; MORANDI et al., 2003; CAVAGLIERI et al., 2005; CHUNG & KIM, 2005; SZCZECH & SHODA, 2006; GHINI & MORANDI, 2006; ALVARADO et al., 2007; BAUTISTA-CALLES et al., 2008; SHARMA & SHARMA, 2008; YANG et al., 2009; LIU et al., 2009; BARDAS et al., 2009; RAMESH et al., 2009; TARIQ et al., 2010; LOPEZ- MONDEJAR et al., 2010; CHATTERTON & PUNJA, 2010; DUKARE et al., 201; HORNBY, 1983; CHASE & POOLE, 1987; GORODECKI & HADAR, 1990; BETTIOL & GHINI, 2001; BAILEY & LAZAROVITS, 2003; TEMORSHUIZEN et al., 2006; GHINI et al.; 2007; ZMORA-NAHUM et al., 2008). A supressividade tem despertado crescente interesse e, em muitos casos, têm-se tornado alternativa única, principalmente no controle de patógenos habitantes do 10 solo em sistemas intensivos onde a inexistência de produtos registrados e/ou a inviabilidade na aplicação dos agrotóxicos motivam o uso deste método alternativo (RODRIGUES et al., 1998; DE WITT et al., 2010). Uma das linhas de produtos que podem ser utilizados/testados em supressividade são os resíduos marinhos, geralmente descartados como lixo. 4.2. Supressividade induzida por resíduos marinhos Os resíduos gerados na agropecuária são reciclados naturalmente, com ação na melhoria das características físico-químicas de solos, porém parte significativa é descartada como lixo, poluindo os ecossistemas, desprezando seu potencial como inibidor de patógenos de plantas (BAILEY & LAZAROVITS, 2003). Informações sobre o uso de resíduos no controle de fitopatógenos ainda são escassos, principalmente, em regiões tropicais. Os resíduos marinhos seguem eventualmente a mesma tendência de descarte, com destino para lixões ou despejados no mar sem tratamento (PESSSATI, 2001; ASSIS et al., 2008). Esses resíduos são constituídos de frações significativas de carbono, proteínas, cálcio, vitaminas, macro e micronutrientes, mas possuem também em sua composição elevado teor de água e gorduras insaturadas facilmente oxidadas, constituindo-se de material altamente perecível (STEVANATO, 2006), capazes de gerar grande impacto poluidor se inadequadamente descartados no ambiente (VINATEA & VIEIRA; 2005), porém, com evidente utilidade na agricultura, quando convertidos em fertilizantes orgânicos (ABBASI et al., 2004; ABBASI et al.; 2006). No controle de fitopatógenos, os resíduos de origem marinha apresentam-se promissores e eficientes (ALI et al., 2002; ABBASI et al., 2004; ABBASI et al.; 2006, BENCHIMOL et al., 2006; VISCONTI et al., 2010; ESCUADRA & AMEMIYA, 2008) atuando, como os demais resíduos, por meio dos diversos mecanismos de controle, bióticos e abióticos (BETTIOL & GHINI, 2001; BETTIOL et al.; 2009), porém, com resultados variáveis, dependente das características do solo, do patossistema estudado, tipo de resíduo e concentração, forma de aplicação e grau de maturação (BONANOMI et al., 2010). 4.2.1. Farelo, hidrolisado e emulsão de peixe 11 Compõem-se de resíduos processados da indústria pesqueira aplicados ao solo/substratos ou aspergidos via foliar como fonte de nitrogênio. Estes resíduos, apesar da origem singular, diferenciam-se por sua forma de obtenção, constituição e consistência. O farelo de peixe constitui-se basicamente de proteína desidratada, obtida no processamento de resíduos de pescado. O hidrolisado de peixe é obtido por fermentação aquosa do resíduo seguido de tratamento térmico, obtendo-se duas fases, a hidrolítica (líquida) e a húmica (sólida) e, a emulsão de peixe, diferencia-se dos hidrolisados em sua constituição, com concentração de sólidos entre 55-74% (PRAÇA & RUSIG, 1993). Blatt & McRae (1998), Gagnon & Berrouard (1994) e Abbasi et al. (2004; 2006) comprovaram o efeito fertilizante do farelo e da emulsão de peixe incorporados a substratos e solos, respectivamente. O hidrolisado de peixe e a emulsão de peixe são registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA como fertilizante orgânico. No controle de fitopatógenos, Sheikh et al. (2006) testaram a aplicação individual e conjunta de Bacillus thuringiensis com cinco fertilizantes comerciais recomendados para viveiros de mudas e farelo de peixe, sobre o desenvolvimento de mudas de quiabo (Abelmoschus esculentus L.) e feijão mungo (Vigna radiata L.) em solos infestados com Rhizoctonia solani, Fusarium solani e Macrophomina phaseolina. Os autores observaram que os tratamentos contendo farelo de peixe + B. thuringiensis reduziram significativamente a infecção provocada por R. solani e F. solani e inibiram completamente a infecção de M. phaseolina. As mesmas combinações promoveram a germinação de sementes de ambas espécies e, as duas formas de dispensa das suspensões foram efetivas. Porém, com resultados mais expressivos com a aplicação no solo. Emulsões e hidrolisados, além de excelentes fontes nitrogenadas solúveis às plantas, também são promissores no controle de fitopatógenos pois liberam quantidades consideráveis de ácidos graxos voláteis (AGVs). Análises de emulsionados comerciais canadenses indicaram a presença de concentrações (mmol L-1) dos ácidos glicólico (200,0), fórmico (30,0), acético (110,0), propiônico (25,0), isobutírico (1,0), n-butírico (1,0) e n-valérico (2,0) com ação fitopatogênica a Verticillium dahliae e Streptomyces scabies (LAZAROVITS et al., 2009). 12 Abbasi et al. (2003) avaliaram, sob condições controladas e a campo, durante dois anos, o controle de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria em plantas de tomate e pimentão, com pulverização semanal sobre as folhas de emulsão de peixe, óleo de nim e acibenzolar-S-methyl (ASM). Em condições controladas, a emulsão de peixe reduziu a severidade da doença em ambas às culturas, em relação ao controle, porém, não foi o tratamento mais efetivo. O óleo de nim e o ASM provocaram fitotoxidez nas plantas. A campo, os resultados foram variáveis. A severidade e o número de lesões por fruto foram reduzidos significativamente somente no segundo ano de plantio para todos os tratamentos. Abbasi et al. (2004) testaram emulsão de peixe (EP) incorporada a solos areno-argiloso e orgânico, e em substrato à base de turfa, no controle de Rhizoctonia solani e Pythium aphanidermatum em mudas de rabanete e pepino. A concentração de 4% de EP aos 28 dias de incubação reduziu a severidade das doenças sobre as culturas avaliadas. No experimento em solo areno-argiloso com EP a sanidade das mudas manteve-se superior a 95% em relação à testemunha. No solo orgânico, naturalmente infestado com os patógenos, a EP manteve as mudas 100% sadias entre os tratamentos. Abbasi et al. (2006) avaliaram a supressividade de emulsão de peixe a V. dahliae e S. scabies em berinjela e batata, respectivamente, incorporando-a a solos arenosos com diferentes pHs, coletados de regiões produtoras de batata com histórico de Verticillium spp. Uma única aplicação de 1% (p/p) de emulsão de peixe ao solo reduziu a incidência e a severidade da murcha causada por V. dahliae em plantas de berinjela, de 75% para 8% e de 3,4 para 1,2 respectivamente, em relação à testemunha. A aplicação de emulsão de peixe para o controle da sarna da batata, causada por S. scabies, foi avaliada pelo período de três anos, com efeito variável a cada ano. Abbasi et al. (2009) avaliaram o efeito de diferentes concentrações de EP em solos naturalmente infestados com Pythium ultimum e artificialmente com V. dahliae. Solução padrão contendo concentrações equivalentes aos AGVs da EP também foi testada. As soluções de ácidos orgânicos da EP e de AGVs, em pH 4, inibiram a germinação dos microescleródios de V. dahliae, diretamente proporcional à concentração aplicada. O crescimento micelial de P. ultimum foi completamente inibido em todas as concentrações de 13 ambas as soluções, diferentemente da testemunha que, após dois dias de incubação ocorreu crescimento micelial. Mattos (2007), Mattos & Bettiol (2008) e Bettiol et al. (2009) estudaram o potencial do hidrolisado de peixe (HP), sobre três isolados de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raça 3 em tomateiro. Os autores concluíram que todas as concentrações de HP testadas foram efetivas na redução da severidade da doença, tanto para as misturas esterilizadas quanto às não esterilizadas. Os autores discutem que a efetividade dos tratamentos está correlacionada com mais de um mecanismo de ação, mas, principalmente a ação dos AGVs. Visconti et al. (2010) avaliaram o efeito in vitro de cinco resíduos marinhos, incluindo o hidrolisado de peixe (HP), sobre o crescimento micelial de Cylindrocladium spathiphylli e somente o HP no controle do patógeno em substratos infestados cultivados com mudas de espatifilo. Na concentração de HP a 25% (v/v) do volume necessário para atingir a capacidade de retenção do substrato, não autoclavado houve o maior efeito inibitório do crescimento micelial para os extratos aquosos de matéria orgânica-EAMOs (81,5%), para as misturas de substrato e resíduo (100%) e sobre o efeito dos metabólitos voláteis (100%), em relação à testemunha. Nos tratamentos autoclavados o HP foi o único resíduo que inibiu o patógeno. Em mudas de espatifilo cultivadas em substrato infestado com o patógeno, a aplicação de 20% de HP foi suficiente para dobrar o tempo de início do aparecimento dos sintomas da doença e a severidade foi significativamente inferior, em relação à testemunha. Os autores atribuem a efetividade do HP também aos AGV, pois o pH médio de 6,3 dos tratamentos não permitiu a formação de amônia (NH3) e ácido nitroso (HNO2). Pinto et al. (2010) avaliaram de efeito do hidrolisado de peixe (HP) incorporado ao substrato à base de casca de Pinus no controle de Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi em crisântemos do tipo bola-belga. O HP não induziu supressividade à doença, sendo que a severidade aumentou proporcionalmente à sua concentração no substrato. Os resultados de Mattos (2007) e Pinto et al. (2010) demonstram que a efetividade dos resíduos nitrogenados, como nos demais resíduos orgânicos, na supressividade aos fitopatógenos, deve ser analisada para cada patossistema. Patógenos de mesmo gênero e 14 espécie, porém, de gama de hospedeiros diferentes, com comportamentos distintos em relação ao mesmo resíduo. Segundo Tenuta & Lazarovits (2002), Lazarovits et al. (2005) e Lazarovits et al. (2009), os resíduos nitrogenados, sólidos e líquidos, adicionados ao solo atuam de forma distinta, diretamente correlacionados ao pH do solo/substrato, agindo por diversos mecanismos de redução de doenças como o estímulo de microrganismos residentes com atividade de biocontrole; a indução de resistência sistêmica nas plantas; a produção de compostos químicos tóxicos aos fitopatógenos, como a amônia (NH3), o ácido nitroso (HNO2), o cianeto de hidrogênio, o formaldeído, o etileno e a acetona, dentre outros e a presença de substâncias tóxicas como os ácidos graxos voláteis (AGVs). Esses autores descrevem que, provavelmente, na redução da doença por resíduos nitrogenados, como os resíduos marinhos, ocorra a atuação de mais de um mecanismo de ação, mas que, provavelmente, um deles desempenha papel predominante sobre a redução à doença, dependendo do tipo de solo e/ou substrato específico, da dose aplicada e do patossistema. A amônia é um composto químico de comprovada ação tóxica sobre microrganismos de solo. Tsao & Oster (1981) comprovaram o efeito tóxico deste composto na inibição de esporângios de Phytophthora cinnamomi e Phytophthora parasitica. Após a aplicação de 0,1% (p/p) de uréia e 2% (v/v) de cama de aves a solo areno-argiloso (pH 6,7) e incubados por 7 dias, os autores concluíram que a liberação de 4 e 6 ppm de amônia (NH3) foram suficientes para reduzir a germinação de esporângios de P. cinnamomi e P. parasitica, respectivamente, a níveis inferiores a 1% em relação à testemunha. A concentração de 17 ppm de NH3 reduziu a germinação de clamidósporos de P. parasitica a níveis inferiores a 10%. Tenuta & Lazarovits (2002) confirmaram o efeito tóxico da NH3 liberado de farelo de osso, farelo de carne e da uréia sobre microescleródios de V. dahliae e que sua efetividade foi diretamente ligada ao pH do solo e à concentração utilizada. Testes in vitro demonstraram efetividade da amônia sobre a morte de microescleródios em pH superior a 8,5 e na concentração de 200 mM de NH3. Em experimentos de microcosmo, com solos areno- argilosos de diferentes pH (5,35 e 8,05), a incorporação de 4% (v/v) dos farelos de osso e de carne, e 1.600 mg Kg-1 solo de uréia resultaram na produção de concentrações superiores 35 15 mM de NH3 somente no solo com pH alcalino. A morte dos microescleródios em solo com pH 5,35 foi devido à ação do ácido nitroso liberado sob a condição de acidez. Segundo Lazarovits et al. (2005), Lazarovits et al. (2009) e Abbasi et al. (2009), os resíduos nitrogenados, como os farelos de carne, de sangue, de peixe, a cama de aves e o esterco suíno, quando incorporados ao solo, em grandes quantidades (2 a 10% em peso), são decompostos pelos microrganismos, liberando grandes quantidades de compostos nitrogenados inorgânicos que, sob condições de pH neutro são convertidos em amônio (NH4 +), forma atóxica, porém, em condições de pH≥8,0 o amônio converte-se em amônia (NH3), este sim, composto nitrogenado letal aos fitopatógenos. O ácido nitroso (HNO2) é um composto nitrogenado derivado do amônio (NH4 +) que se converte em nitrito (NO2 -) que, sob condições de acidez associa-se a prótons formando HNO2 (LAZAROVITS et al., 2005). A letalidade do HNO2 foi demonstrada por Tsao & Oster (1981) que comprovaram o efeito tóxico da amônia e do ácido nitroso a P. cinnamomi e P. parasitica, com a aplicação de 0,1% (p/p) de uréia e 2% (v/v) de cama de aves adicionados a um solo areno-argiloso com dois pHs (6 e 8), incubados por sete dias. A inibição da germinação de esporângios, para ambos os patógenos, a níveis inferiores a 1% em relação à testemunha, ocorreu sob concentrações de 0,3 e 0,5 ppm de HNO2 e pH 6. Sob pH 8 não foi observado efeito inibitório. Loffler et al. (1986) observaram redução da população e a inibição da germinação de clamidósporos de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi em solo com pH 5,7 incorporando-se 1g de uréia e NH4Cl por quilograma de solo seco. Esse efeito não foi observado no solo com pH 7,3. Os resultados demonstraram que, no solo supressivo, a incorporação de 0,1% de uréia acumulou 100 vezes mais nitrito, após 14 dias de incorporação em relação ao solo conducente. Michel & Mew (1998) investigaram sobrevivência de Ralstonia solanacearum em quatro solos artificialmente infestados, com a incorporação simultânea de uréia (200 Kg N ha-1) e CaO (5.000 Kg ha-1), por 21 dias. Os solos arenosos foram supressivos ao patógeno, por até 14 dias, coincidindo com as maiores concentrações de nitrito. Aos 21 dias, a populações de R. solanacearum eram as mesmas para todos os solos e as concentrações de NO2 equivalentes à testemunha. 16 Tenuta & Lazarovits (2002; 2003) avaliaram o efeito da amônia (NH3) e do ácido nitroso (HNO2) em 12 solos incorporados com diferentes concentrações de farelo de carne e ossos, sobre a germinação de microescleródios de V. dahliae. A morte dos microescleródios foi observada somente em solos arenosos e as maiores concentrações de NH3 e HNO2 foram observadas nos solos com pH natural superior a 8,0 e inferior a 5, respectivamente. O efeito tóxico de AGVs liberados de chorume de suíno, sobre a morte de microescleródios de V. dahliae foi observado por Tenuta et al. (2002). Dentre os AGVs identificados, com ação sobre o patógeno, estavam os ácidos (mM): acético (270,0), propiônico (59,0), isobutírico (38,0), n-butírico (16,3), n-valérico (17,6), isovalérico (3,6) e n- capróico (9,0). O ácido fórmico não foi identificado. O pH foi determinante na efetividade do chorume nas concentrações de 10 e 15% (v/v) de chorume suíno e de misturas de AGVs equivalentes, em pH 4,5, inibiram completamente a germinação dos microescleródios, comprovando-se que as formas não ionizadas dos AGVs são tóxicas ao fitopatógeno. Os tratamentos com pH > 5,5 reduziram drasticamente a efetividade do chorume suíno e da mistura de AGVs, na inibição da germinação dos microescleródios. Segundo Lazarovits et al. (2009), em pH ≥ 5,7 os AGVs combinam-se ao solo na forma de sais, tornando-se atóxicas aos fitopatógenos (ex: ácido acético, forma tóxica, converte-se em acetato de sódio). Conn et al. (2005) observaram o efeito do pH na liberação de NH3, HNO2 e AGVs, incorporando em seis solos com características físico-químicas particulares, 30% (p/p de solo) de chorume suíno originário de 19 locais, sobre a germinação de microescleródios de V. dahliae. As misturas contendo concentrações superiores a 3 mM de AGVs inibiram a germinação dos microescleródios do patógeno. Os chorumes suíno continham concentrações variáveis de AGVs, inversamente proporcionais ao pH das misturas e que a efetividade, está associada também, ao tempo de exposição e a origem dos resíduos. O chorume suíno oriundo de sistemas de terminação de animais tem concentrações de AGVs quatro a seis vezes superiores em relação a sistemas iniciais de engorda. Atribui-se este fato ao provável aumento da densidade populacional e produção de esterco nos sistemas de terminação (CONN et al., 2007). 17 Morales et al. (2007) observaram a diminuição no tombamento de plântulas de feijoeiro causadas por Sclerotium rolfsii foi proporcional a concentração de chorume suíno incorporado ao solo contendo o patógeno. Os autores descrevem a influência direta do zinco como variável integrante do conjunto que atuou na supressividade ao patógeno. Análises dos HPs fabricados no Brasil mostram as seguintes concentrações de AGVs (mM): formato (20,4), acetato (197,9), propionato (45,0), n-butirato (46,4), iso-butirato (9,0), iso-valerato (4,6) e glicolato (768,1) (BETTIOL et al., 2009); este último não é classificado como ácido orgânico volátil mas como agente promotor de crescimento de plantas (Abbasi et al.; 2009). Segundo Weller et al. (2010), um dos principais benefícios da incorporação de resíduos é a geração de supressividade natural nos solos, por meio da promoção do crescimento da microbiota nativa, com efetiva ação antagonista sobre os fitopatógenos. Emulsões e hidrolisados de peixe estimulam a atividade microbiana em solos e em substratos (BAILEY & LAZAROVITS, 2003; ABBASI et al., 2004; VISCONTI et al., 2010) mais especificamente aqueles em que Trichoderma spp. encontra-se associado à supressividade (LAZAROVITS et al., 2009). El-Tarabily et al. (2003) avaliaram o efeito da emulsão de peixe como promotor de crescimento de isolados de bactérias e actinobactérias no desenvolvimento de mudas de rabanete em solo arenoso. A combinação de solo + emulsão de peixe autoclavada + mistura de microrganismos não alterou os níveis de nutrientes, mas elevou significativamente as concentrações de seis hormônios, na parte aérea e no sistema radicular, em relação aos tratamentos controle, solo + fertilizantes inorgânicos e solo + emulsão de peixe autoclavado. Abbasi et al. (2004) comprovaram que, parte da supressividade da emulsão de peixe (EP) é de natureza biológica em solos com e sem a adição de EP, pasteurizados e infestados com R. Solani, incubados por 1, 7, 14 e 28 dias. Em todos os períodos de incubação, a severidade nos tratamentos pasteurizados foi significativamente superior em comparação aos não pasteurizados e a adição de EP aumentou a população de fungos totais e multiplicou a população total de bactérias em nove vezes nos tratamentos não pasteurizados e, em três vezes, nos pasteurizados, após 28 dias. 18 Visconti et al. (2010) observaram efeito semelhante com hidrolisado de peixe (HP) onde parte do efeito supressivo no controle a C. spathiphylli está associada à microbiota presente no substrato. O extrato aquoso de HP a 20% adicionado ao meio BDA, resultou em índices de inibição do crescimento micelial (IICM) de 81,5% no tratamento não autoclavado e 17,2% no tratamento autoclavado. Os autores concluíram que a redução do efeito inibitório está associada à perda da microbiota presente no resíduo pela autoclavagem. Junto com o farelo, hidrolisado e emulsão de peixe as cascas de crustáceos também possuem potencial para atuarem na supressividade a patógenos de plantas. 4.2.2. Cascas de crustáceos (camarão, caranguejo e siri) Camarão, caranguejo e siri são invertebrados marinhos estruturalmente formados por um exoesqueleto de quitina (ROBERTS, 2002; RINAUDO, 2006; AL SAGHEER et al., 2009), com composição variável entre 5 a 7% de quitina no camarão (MATHUR & NARANG, 1990), e de 15 a 20% em caranguejos e siris (NACZK et al., 2004). A quitina também ocorre na natureza como componente estrutural no exoesqueleto de outros artrópodos e da parede celular de fungos (RINAUDO, 2006). Segundo Griffin (1993), a quitina é o principal componente estrutural da parede celular da maioria dos fungos, compondo 39% da parede celular do gênero Fusarium. A quitina é um polissacarídeo constituído por um polímero de cadeia longa, a β-(1-4)-N-acetil-D-glucosamina. É o segundo composto químico de maior abundância encontrado na natureza, abaixo apenas de celulose (ROBERTS, 2002; AL SAGHEER et al., 2009). Esse biopolímero, devido à sua versatilidade, é utilizado como agente floculante no tratamento de efluentes, como adsorvente na clarificação de óleos, e principalmente, na produção de quitosana (MOURA et al., 2006). A quitosana, polissacarídeo obtido a partir da desacetilação da quitina (ROBERTS, 2002; RINAUDO, 2006; ASSIS et al., 2008; AL SAGHEER et al., 2009), foi estudada com sucesso em uma grande variedade de aplicações de uso humano, por ser biocompatível, biodegradável, possuir propriedades antimicrobianas, ser emulsificante, utilizada no tratamento de efluentes, ser formadora de gel e como envoltório protetor de alimentos, e de uso agrícola, como fornecedora de nutrientes e promotora de crescimento de plantas e no 19 controle de patógenos de plantas como os nematóides (ADACHI et al., 1987; EHTESHAMUL-HAQUE et al., 1997) e fungos (KIMURA et al., 1999; KUMAR, 2000; ROBERTS, 2002; ASSIS & LEONI, 2003; BERGER et al., 2004; TANADA-PALMU et al., 2005; BENCHIMOL et al., 2006). O principal mecanismo de ação das cascas de crustáceos no controle de patógenos habitantes do solo, reside no estímulo à microbiota biodegradadora de quitina (PINTO et al., 2010), como actinobactérias, bactérias do gênero Pseudomonas e fungos de gênero Trichoderma (ROSE et al., 2003), produtores da enzima quitinase (BOLLER, 1986; KNEZEVIC-JUGOVIC et al., 2011), agindo sobre as estruturas dos fitopatógenos, como a parede celular dos fungos e de ovos de nematóides (GODOY et al., 1983); e na indução de resistência sistêmica (IRS) nas plantas (PUNJA & ZHANG, 1993; BENHAMOU et al., 1994; DI PIERO & GARDA, 2008). Ehteshamul-Haque et al. (1997) avaliaram o efeito de quitina e do pó- de-caranguejo e pó-de-camarão incorporados ao solo cultivado com grão de bico, infestado com Meloidogyne javanica. A incorporação de 0,1% (m/m) de quitina, derivada de caranguejo e de camarão, e de pó-de-caranguejo a 0,5 g 100 g-1 solo, foi suficiente para reduzir a severidade das nematoses. O pó-de-camarão incorporado a 1% foi fitotóxico. Hallmann et al. (1999), em casa de vegetação, testaram o efeito da incorporação de 1% (p/p) de quitina em solos areno-argiloso, cultivado com algodão, artificialmente infestado com nematóides Meloidogyne incognita, Hoplolaimus spp. e Paratrichodorus spp., durante dois anos. A adição da quitina eliminou todos os nematóides fitoparasitas no primeiro ano de cultivo e reduziu significativamente a infestação de M. incognita em relação à testemunha, no segundo ano de cultivo. Os tratamentos contendo quitina elevaram a população de fungos e de bactérias com atividade quitinolítica. Também Godoy et al. (1983) avaliaram o efeito de concentrações de quitina incorporadas em solo arenoso, naturalmente infestado com Meloidogyne arenaria, sobre a população do patógeno e na microbiota do solo. As concentrações a partir de 0,4% (m/m) de quitina reduziram o índice de galhas de M. arenaria, porém, as concentrações superiores a 0,8% foram fitotóxicas à planta. As concentrações de quitina a partir de 1%, elevaram a pH do solo, a condutividade elétrica, os níveis de nitrogênio amoniacal e nitrato e a 20 atividade de quitinase. Ocorreu o aumento das populações de bactérias, fungos filamentosos e actinobactérias na concentração de 1% de quitina. Dos 17 gêneros de fungos identificados, 14 tinham atividade quitinolítica sobre o patógeno. Labrie et al. (2001) testaram o efeito da quitina adicionada ao processo de compostagem no controle de Phytophthora fragariae var. rubi e Pythium ultimum. Os autores descreveram que a geração de composto bi-fásico, obtido pela incorporação de nova quantidade de resíduos de camarão a pilha de composto, modificou a comunidade microbiana, principalmente a de bactérias Gram-positivas, responsáveis pelo antagonismo aos fitopatógenos. Benchimol et al. (2006) estudaram a potencialidade da casca-de- caranguejo (CG) na redução da incidência de Fusarium solani f. sp. piperis e na promoção do crescimento de mudas de pimenteira-do-reino (Piper nigrum). A adição da casca-de-caranguejo a 1,0%, pré-incubada por 15 dias em solo de mata não autoclavado, e por 30 dias em solo de mata autoclavado, reduziu a mortalidade das mudas de pimenteira-do-reino por F. solani f. sp. piperis em 20% em relação ao solo sem o resíduo. O carbono da biomassa microbiana foi significativamente superior, nos tratamentos adicionados de 1% (v/v) de solo e incubados por 15 e 30 dias. As concentrações de 0,5% de CG promoveram o aumento dos teores de matéria seca em relação ao controle, sugerindo que a concentração de 1% foi fitotóxica. Escuadra & Amemiya (2008) compararam o efeito de misturas de solo com farelo de trigo, serragem de pinus, borra de café e esterco de aves, com e sem a adição de casca-de-caranguejo, a Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae, em espinafre. Os resíduos reduziram a incidência da doença somente a partir do segundo cultivo, em relação à testemunha. A severidade foi significativamente reduzida entre os tratamentos, com o menor índice de descoloração dos tecidos na mistura de resíduos com casca-de-caranguejo e cama de frango, em três cultivos sucessivos. Pinto et al.(2010), avaliaram o efeito da casca de camarão (CC) moída e quitosana sobre a murcha do crisântemo, causada por Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi, em sistemas de produção de crisântemo tipo Bola-belga. A CC suprimiu a doença na concentração de 4% (v/v) de substrato, além de promover o crescimento da planta, porém, na concentração de 5% (v/v) houve morte das plantas por fitotoxidez. O diâmetro das 21 plantas foi diretamente proporcional à concentração da CC e em todas as concentrações a altura das plantas foi superior à testemunha. A CC reduziu o pH, de 6,1 para 5,5, aumentou a condutividade elétrica e elevou os níveis de nitrato, magnésio, cálcio, sódio, cloreto e fósforo. A quitosana não permitiu o estabelecimento de uma resposta padrão sobre a doença, devido ao comportamento variável dos resultados. Visconti et al. (2010) testaram, in vitro o efeito de concentrações de casca-de-camarão (CC) adicionadas ao meio BDA, sobre o crescimento micelial de C. spathiphylli. A CC a 20 e 25% (v/v) de meio, sem autoclavagem, suprimiram o crescimento micelial do fungo. As misturas autoclavadas e os compostos voláteis não inibiram o crescimento micelial do patógeno. Liu et al. (2007) testaram o efeito da quitosana sobre a germinação de esporos e crescimento micelial de Botrytis cinerea e Penicillium expansum e verificaram inibição completa da germinação dos esporos de P. expansum a 0,5% e de B. cinerea a 1% de quitosana. A elongação do tubo germinativo, para ambos patógenos foi inibida nas concentrações superiores a 0,01%. Sobre frutos de tomateiro os autores verificaram que as concentrações de quitosana proveram efetivo controle a ambos patógenos em duas temperaturas (2 e 25 ºC). Resultados de análise da atividade de polifenoloxidade, peroxidade e de compostos fenólicos com a aplicação da solução a 1% de quitosana para ambas temperarturas sugerem a ação de indução de resistência aos patógenos. Muñoz et al. (2008) avaliaram in vitro e sobre frutos de tomate e uva, o efeito de concentrações de quitosana no controle de Colletotrichum sp. In vitro a inibição do crescimento micelial do Colletotrichum sp. foi diretamente proporcional à concentração da solução de quitosana Nos frutos, as menores lesões ocorreram na concentração de 2,5% de solução de quitosana e armazenados a 24 °C, por sete dias, com diâmetro significativamente inferior ao tratamento controle. Benhamou et al. (1994) comprovaram a ação da quitosana na indução de resistência sistêmica (IRS) em plantas de tomate sobre Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici. A aplicação de 1 mg de quitosana em 1 mL de substrato inerte autoclavado, 6 horas antes do plantio das mudas de tomate, promoveu alterações nas estruturas das células da 22 planta dificultando a penetração do patógeno e aumentou as concentrações de compostos fenólicos na planta. Di Piero & Garda (2008) avaliaram o controle da antracnose em feijoeiro-comum pela aplicação de quitosana e concluíram que, em plantas previamente tratadas com quitosana e, posterior, inoculação do fitopatógeno, a severidade no trifólio tratado foi reduzida em relação ao trifólio protegido. Concentrações de 9 mg por planta, quatro dias antes da inoculação, reduziram a severidade da doença em torno de 70%,. Houve alteração no metabolismo da planta e o aumento na atividade de beta-1,3-glucanase, nas folhas previamente tratadas com qutiosana. A inibição do patógeno foi diretamente proporcional às concentrações de quitosana no meio de cultura. Os autores concluíram que a quitosana tem propriedades antifúngicas contra Colletotrichum lindemuthianum, bem como a capacidade para induzir resistência ao fitopatógeno em feijoeiro. Além da quitina e da quitosana as algas marinhas também tem potencial para atuarem na supressão em solos agrícolas. 4.2.3. Resíduos de algas marinhas Algas são organismos marinhos autótrofos, fotossintetizantes e distribuídos, atualmente, em três reinos (VIDOTTI & ROLLEMBERG, 2004) com cerca de 127.000 espécies descritas (GUIRY & GUIRY, 2011). Sua utilidade é diversa, sendo empregada na indústria alimentícia, in natura e na extração de espessantes, na indústria de cosméticos, farmacêutica, química, em estações de tratamento de água e rações animais (McHUGH, 2003). As plantas e algas marinhas são importantes fontes de substâncias biologicamente ativas, ou seja, substâncias com alguma atividade sobre um organismo vivo, diverso daquele no qual foi produzido. São provenientes do metabolismo secundário, como os fenóis, os terpenos e os polipeptídeos, com ação antimicrobiana, inibindo o crescimento micelial de fungos, a germinação de esporos ou a multiplicação de bactérias e induzem resistência, pois contêm moléculas bioativas capazes de ativar os mecanismos de defesa das plantas, podendo atuar como bioestimulantes, promovendo o desenvolvimento da planta (TALAMINI & STADNIK, 2004). 23 Paracer et al. (1987) testaram o efeito das algas marinhas Laurencia poitei, Paenicillus capitatus, Bryothamnion triquestrum, Gracilaria mammillaris, Anadyomene stellata, Dictyota dichotoma, Caulerpa prolifera, Botryocladia occidentalis, Sargassum cymosum e Spatoglossum schroederi sobre a severidade causada por Meloidogyne incognita, Meloidogyne arenaria e Meloidogyne javanica em plantas de tomate. As plantas de tomate cultivadas com 1% (p/p) de C. prolifera, B. occidentalis e S. schroederi incorporadas ao solo de cultivo exibiram os menores índices de severidade (2,31; 2,51 e 2,57, respectivamente), em comparação a testemunha (4,21). Ara et al. (1997) avaliaram o efeito do pó das algas Sargassum tenerrimum, Sargassum swartzii e Sargassum wightii sobre a severidade de M. javanica em quiabeiro. Foi observada menor severidade da doença com a utilização de S. tenerrimum seguido de S. swartzii e S. wightii. Sultana et al. (2005) compararam o efeito de duas algas marrons (Stokeyia indica, Padina pavonia), uma alga verde (Codium iyengarii) e uma vermelha (Solieria robusta), associadas ou não com Pseudomonas aeruginosa, no controle de Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Fusarium solani em quiabo e, Sultana et al. (2008) em pimenta, em solo areno argiloso (pH 8,0) naturalmente infestado com os patógenos. Para o quiabo, as algas P. pavonia, S. robusta a 1% e C. iyengarii a 0,5%, combinadas ou não com P. aeruginosa, reduziram significativamente a infecção e M. phaseolina. A infecção de R. solani foi completamente inibida por S. robusta em ambas as concentrações. Para a pimenta, as algas S. indica e S. robusta incorporadas a 1% e P. aeruginosa inibiram significativamente a severidade de M. phaseolina. Para R. solani somente a incorporação de S. robusta a 1% no solo foi efetiva. Todas as concentrações das algas reduziram significativamente a infecção provocada por F. solani e a alga C. iyengarii a 1% foi fitotóxica ao quiabo e a pimenta. Ben Jenana et al. (2009) testaram o efeito de misturas de Posidonia oceanica (Po), esterco de aves (Ea) e resíduos industriais da extração de óleo de oliva (Ro) no controle de P. aphanidermatum em tomate. Os resultados in vitro demonstraram significativa inibição do crescimento micelial nas misturas contendo concentrações a partir de 35% de P. oceanica. Nos testes in vivo, as três misturas incorporadas aos substratos inoculados proporcionaram severidade significativamente inferior, 20, 45 e 45% em relação à testemunha 24 (90%), para as misturas contendo 20, 35 e 50% de P. oceanica, respectivamente, contudo, a maior promoção de crescimento foi obtida com a maior concentração de alga. Sultana et al. (2011) compararam o efeito da alga vermelha Solieria robusta à aplicação de fertilizantes químicos e de fungicida, na promoção de crescimento e no controle de M. phaseolina, R. solani, F. solani e a M. javanica. Nesse estudo, os autores observaram que a aplicação individual de S. robusta, potássio, uréia e Topsin-M reduziram significativamente a incidência de M. phaseolina. Para R. solani todos os tratamentos reduziram a incidência e para F. Solani, somente S. robusta foi eficiente. O efeito de tratamento contendo somente S. robusta foi aos tratamentos químicos com redução do número de galhas no sistema radicular. Dentro dos produtos de origem marinha a concha de moluscos também é um potencial resíduo para atuar na supressividade aos fitopatógenos. 4.2.4. Concha de moluscos Conchas de molucos compõem-se de 95% de carbonato de cálcio (CaCO3) (SILVA, 2007) e concentrações (mg Kg-1) de magnésio (435,35 a 1080,63), estrôncio (1.120,96 a 1.426,99), ferro (478,09 a 683,5), sódio (55,89 a 63,93), manganês (23,28 a 35,87), cromo (71,07 a 80,23), zinco (3,34 a 11,32) e, em menor concentração, o potássio (1,24 a 1,53), o níquel (1,63 a 6,16), o cobre (1,66 a 3,23), o chumbo (0,43 a 1,46) e o cádmio (0,03) (SILVA et al., 2010). As conchas de moluscos possuem também, em sua composição 6,1% de quitina (CAMPANA-FILHO et al., 2007). Devido a alta concentração de CaCO3, o principal uso agrícola de conchas de moluscos é como corretivo agrícola do solo, em substituição ao calcários de rocha. Ilkiu-Vidal et al. (2010) testaram o efeito de concentrações de CaCO3, na produção de matéria seca (MS) de sálvia (Salvia officinalis) sob diferentes pHs. A elevação do pH do solo para 5, com carbonato de cálcio, foi suficiente para elevar os teor de MS da planta em 52%. Benedetti et al. (2009) avaliaram o efeito da presença e da ausência de calagem com carbonato de cálcio sobre a adubação mineral e orgânica realizada em espinheira- santa (Maitenus ilicifolia) cultivada em latossolo vermelho distrófico. A correção do solo ocorreu 48 dias antes do plantio. Ao comparar os tratamentos sem adubação, ou autores 25 observaram aumento da área foliar e do diâmetro do caule da planta. A adubação mineral foi benéfica a planta somente nos tratamentos com calagem, com teores de matéria seca do caule e da parte aérea e a altura das plantas superiores à adubação orgânica. Brasil & Nascimento (2010) avaliaram o feito da adubação fosfatada e da correção do solo com carbonato de cálcio sobre o desenvolvimento de cultivares de maracujá. A incorporação do carbonato de cálcio, 50 dias antes do plantio das mudas de maracujá, elevou o pH do solo, a saturação de bases e a concentração de cálcio no solo, com resposta linear, diretamente proporcional a altura das plantas e a massa seca da parte aérea. A eficiência do CaCO3 como corretivo foi comprovada por Ernani et al. (2001), onde para cada dose de CaCO3 incorporada aos solos Cambissolo Húmico e Latossolo Bruno, elevou quadraticamente o pH do solo. Além de excelente fonte de cálcio e corretivo de solo, os macro e micronutrientes, presentes em conchas de marisco, podem favorecer a supressividade ao patógeno, atuando de forma indireta, por meio do favorecimento da atividade microbiana ou diretamente, interferindo no ciclo de vida do patógeno. Esses compostos químicos podem induzir a resistência do hospedeiro ou controlar diretamente o patógeno (BETTIOL et al., 2009). Os macros e os micronutrientes exercem importantes funções no metabolismo das plantas, estando envolvidos em quase todos os mecanismos de defesa como componentes integrais e ativadores, inibidores e reguladores do metabolismo. A nutrição mineral das plantas determinará, em grande parte, a conformação de suas estruturas histológicas e morfológicas, a intensidade de muitas atividades fisiológicas e, consequentemente, a resistência ou suscetibilidade às doenças, expressadas na capacidade de reduzir/impedir a atividade patogênica e na habilidade de permitir a sobrevivência de patógenos (VIDA et al, 2004). Apesar das características químicas, o uso agrícola da concha de moluscos restringe-se atualmente a correção do solo. Seu potencial como indutor de supressividade a fitopatógenos ainda é desconhecido. Além do potencial dos produtos de origem marinha na supressividade, os biofertilizantes também são importantes insumos agrícolas efetivos no controle de doenças de plantas. 26 4.3. Biofertilizantes no controle de doenças de plantas Biofertilizantes são fermentações, oriundas de digestão aeróbica ou anaeróbica de materiais orgânicos de origem animal ou vegetal em meio líquido, contendo nutrientes, estimulantes e microrganismos capazes de promover o desenvolvimento das plantas e auxiliar na sua proteção a fitopatógenos (BETTIOL, 2003). A composição química do biofertilizante varia conforme o método de preparo e o material utilizado. O controle de doenças pode ser por meio dos metabólitos produzidos pelos microrganismos presentes no biofertilizante ou pela ação direta destes microrganismos sobre o patógeno ou sobre o hospedeiro (BETTIOL & GHINI, 2004). Trach & Bettiol (1994) avaliaram o efeito de biofertilizantes anaeróbios sobre o crescimento micelial de Pythium aphanidermatum, Alternaria solani, Stemphylium solani, Septoria licopersici, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli e sobre a germinação de conídios de B. cinerea, A. solani, Hemileia vastatrix e Coleosporium plumierae. Os autores observaram inibição completa do crescimento micelial com concentrações a partir de 10% ocorreu completa inibição do crescimento desses fungos. Os biofertilizantes inibiram totalmente a germinação de B. cinerea, A. solani, C. plumierae e H. vastatrix, porém com concentrações variáveis para cada patógeno. Também Deleito et al. (2005) avaliaram o efeito in vitro do biofertilizante Agrobio® sobre a bactéria Xanthomonas euvesicatoria. O biofertilizante apresentou ação bacteriostática a X. euvesicatoria, que indicou a presença de antibióticos no processo de fermentação. Kupper et al. (2006) avaliaram o efeito de dois biofertilizantes produzidos em sistema anaeróbico e aeróbico, aplicados em diferentes concentrações, respectivamente, in vitro sobre o crescimento micelial de Phyllosticta citricarpa e em pomares de citros, visando ao controle de seu teleomorfo Guignardia citricarpa nos frutos. Pulverizações dos biofertilizantes foram efetuadas no período de 180 dias em intervalos de 28 dias. In vitro somente o biofertilizante produzido anaerobicamente, nas concentrações superiores a 10%, inibiu o crescimento micelial de P. citricarpa. No experimento a campo, o biofertilizante produzido anaerobicamente reduziu a severidade de G. citricarpa 27 proporcionalmente à concentração aplicada. As combinações dos biofertilizantes com isolados de B. subtilis e Trichoderma spp. não foram efetivas (KUPPER et al., 2009). Bernardo & Bettiol (2010) compararam o efeito de Bacillus subtilis, Trichoderma harzianum, leite e o biofertilizante Microbiol® no controle da pinta preta em laranja `Pêra´ orgânica. Os índices de doença dos tratamentos observados pelo período de três anos, apenas o biofertilizante reduziu a severidade da doença somente em períodos com baixa pressão de inóculo do patógeno. Segarra et al. (2009) avaliaram o efeito de extrato aquoso aerado, oriundo de resíduos compostados sobre Erysiphe polygoni ocorrendo em plantas de tomate sob cultivo protegido. A aplicação do composto reduziu a severidade em 19%. Nos tratamentos pulverizados com o extrato não houve a formação de micélio cotonoso, apenas manchas amareladas. As plantas pulverizadas com extrato mostraram coloração mais esverdeada em relação as não tratadas. A contagem de bactérias e fungos totais presentes no filoplano que recebeu os extratos foi superior à testemunha. Não foi observado atividade de indução de resistência entre os tratamentos. Al-Dahmani et al. (2003) avaliaram o efeito de extratos aquosos aeróbicos e anaeróbicos, em três diferentes concentrações, obtidos de oito tipos de compostos orgânicos, em tomateiros cultivados em estufa naturalmente inoculados com Xanthomonas versicatoria. O efeito dos extratos foi variável nos três anos de cultivo, semelhante ao fungicida somente sob baixa pressão de inóculo, no primeiro ano de cultivo. Koné et al. (2009) observaram o efeito preventivo e curativo de extratos aquosos anaeróbicos de estercos ovino, bovino e de aves, casca de camarão e alga marinha, em plantas de tomate artificialmente infestados com Oidium neolycopersici e Botrytis cinerea. Os autores descrevem que pulverizações preventivas do extrato de esterco de ovino reduziram a severidade de B. cinerea, efeito não observado a O. neolycopersici. Resultados in vitro sobre o crescimento micelial de B. cinerea sugerem que a presença de microrganismos no extrato foi um fator de indução de supressividade. Práticas alternativas como a utilização de resíduos marinhos na supressividade e o uso de biofertilizantes no controle de doenças de plantas têm que considerar a possibilidade de contaminação dos produtos agrícolas comestíveis in natura. 28 4.4. Segurança alimentar de produtos orgânicos A preocupação da população com o seu bem-estar e com o meio ambiente tem promovido a busca por alimentos melhor qualidade e mais seguros. Para a escolha entre os alimentos cultivados em sistemas tradicionais ou oriundos de sistemas orgânicos o consumidor tem levado em conta, principalmente, o alto consumo energético de produção, a contaminação da cadeia alimentar e da água por resíduos de pesticidas e nitratos, o baixo conteúdo nutricional dos alimentos, os riscos microbiológicos e o uso da biotecnologia (LAIRON, 2009). Para Arbos et al. (2010) todos os alimentos devem ser produzidos seguindo práticas que resultem em produtos seguros para serem consumidos. Essa premissa é verdadeira tanto para o sistema orgânico de cultivo, como para o convencional. No entanto, questões têm sido levantadas a respeito da possibilidade de um maior risco de contaminação microbiológica e parasitária nos alimentos produzidos no sistema orgânico, em virtude principalmente do uso de estercos animais como adubo e a proibição da aplicação de agrotóxicos que podem aumentar o risco de uma contaminação e, desse modo, tornar o alimento não adequado ao consumo. Vários são os microrganismos de origem fecal que provocam doenças, entre eles destacam-se a Salmonella, Shigella, Listeria monocytogenes e os coliformes fecais (STRAUCH, 1991; Van RENTERGHEM et al., 1991; WARNICK et al., 2001), oriundos de lodo de esgoto, de esterco de animais ou água de irrigação contaminada contendo material fecal (LAIRON, 2009; ARBOS et al., 2010). A Salmonella é um dos microrganismos mais envolvidos em surtos de doenças de origem alimentar em diversos países, inclusive o Brasil. Dentro do grupo de coliformes estão as cepas de Escherichia coli, as quais são membros da microbiota intestinal normal, as mais comuns e clinicamente importantes, além de serem causadoras de diarréia (MOGHARBEL & MASSON, 2005). Para Gaspar et al. (1999), o significado da presença de E.coli em um alimento deve ser avaliado sob dois aspectos, um deles é que este possui uma enterobactéria, e uma vez detectada no alimento, indica que este possui uma contaminação microbiana de origem fecal e, portanto, está em condições higiênicas inadequadas, e o outro, é que cepas de E. coli são comprovadamente patogênicas para o homem. 29 Siqueira (1997) observou em Belo Horizonte que 44,0% das saladas cruas de restaurantes com condições higiênicas e sanitárias insatisfatórias devido à presença de coliformes fecais sendo que, 15% ofereciam produtos potencialmente capazes de causar toxinfecção alimentar. Arbos et al. (2010) identificaram a presença de coliformes totais e fecais em 100% das amostras de alface, tomate e cenoura coletadas em produtores orgânicos da região metropolitana de Curitiba-PR. Em uma amostra de alface e uma de cenoura foi identificada a presença de Salmonella. Segundo os autores a contaminação está associada à água contaminada utilizada na irrigação e na lavação das hortaliças. A contaminação microbiológica de alimentos produzidos em sistemas orgânicos ou convencionais depende principalmente das práticas de produção adotadas na propriedade e do manuseio correto das fontes de insumos utilizadas. Além disso, um alimento para ser comercializado como orgânico passa frequentemente por uma série de procedimentos exigidos pela certificadora, a qual não permite que o esterco animal não seja utilizado antes da sua correta compostagem (SMITH, 1993). O uso do lodo de esgoto em sistemas de agricultura orgânica é proibido e a ocorrência de uma fase termófila (>70°C), em processos de compostagem aeróbia, reduz significativamente ou eliminam totalmente os microrganismos patogênicos presentes, tais como Salmonella enteritidis ou E. coli (LUNG et al., 2001; DROFFNER & BRINTON, 1995; VUORINEN & SAHARINEN, 1997; TIQUIA et al., 1998) porém, com menor eficácia para eliminação de Clostridium botulinum (BOHNEL & LUBE, 2000). A procura por alimentos orgânicos é expressiva em todo o mundo devido à conscientização da população sobre os riscos para a saúde decorrentes da presença de resíduos químicos nos alimentos. Contudo, os alimentos orgânicos requerem a adoção de práticas de manuseio que permitam o uso seguro de seus insumos. No entanto, não há informações convincentes indicando que os alimentos orgânicos podem ser contaminados de forma diferente dos alimentos convencionais (LAIRON, 2009). 30 CAPÍTULO I INDUÇÃO DE SUPRESSIVIDADE A Cylindrocladium spathiphylli EM PLANTAS DE ESPATIFILO COM RESÍDUOS MARINHOS 31 Indução de supressividade a Cylindrocladium spathiphylli em 1 plantas de espatifilo com resíduos marinhos 2 Alexandre Visconti1*, Cassiano Forner3, Elke S. D. Vilela2, Henri Stuker1 & Wagner 3 Bettiol2*. 4 1Estação Experimental de Itajaí, Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa 5 Catarina – EPAGRI, CP 277, 88301-970, Itajaí, SC, Brasil; 2Laboratório de Microbiologia 6 Ambiental, Embrapa Meio Ambiente, CP 69, 13820-000, Jaguariúna, SP, Brasil; 7 3Departamento de Produção Vegetal – Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências 8 Agronômicas, UNESP – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 18610-307, 9 Botucatu, SP, Brasil. *Bolsistas do CNPq. 10 Artigo escrito segundo as normas da Tropical Plant Pathology 11 12 Autor para correspondência: Alexandre Visconti, e-mail: visconti@epagri.sc.gov.br 13 14 RESUMO 15 O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de concentrações de hidrolisado de peixe (HP), 16 emulsão de peixe (EP), casca de camarão (CC), alga marinha (Sargassum sp.) (AG) e concha 17 de marisco (CM) na indução de supressividade a Cylindrocladium spathiphylli em plantas de 18 espatifilo. Ao substrato, naturalmente infestado com o patógeno, incorporou-se HP e EP nas 19 concentrações de 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (v/v) do volume necessário para atingir a capacidade 20 de retenção do substrato, e a CC, AG e CM nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% (v/v). 21 Após incubação por 10 dias efetuou-se o plantio de uma muda de espatifilo da cultivar Opal. 22 32 HP, a EP e a CC reduziram a incidência e a severidade da doença com efeito quadrático à 23 concentração. O pH e os teores de potássio, cálcio e magnésio do HP; a condutividade elétrica 24 e os teores de potássio e magnésio da EP; e o pH, e os teores de nitrogênio, potássio e cálcio 25 da CC resultaram em forte correlação negativa com a incidência e a severidade. As curvas de 26 regressão da hidrólise do diacetado de fluoresceína (FDA), respiração do substrato e carbono 27 da biomassa microbiana (CBM) exibiram efeito quadrático às concentrações de HP, EP e CC, 28 com ponto de inflexão a 25, 20 e 3%, respectivamente. A EP a 20% resultou nos maiores 29 teores de matéria seca e a menor reincidência do patógeno aos 180 dias. A EP a 20% induziu 30 supressividade a Cylindrocladium spathiphylli. 31 Palavras-chave: Controle biológico, emulsão de peixe, hidrolisado de peixe, casca de 32 camarão, concha de marisco, Sargassum. 33 34 ABSTRACT 35 Induction of suppressiveness against Cylindrocladium spathiphylli in Spathiphyllum with 36 marine residues. 37 The aim of this work was to investigate the effect of fish hydrolyzed (HP), fish emulsion 38 (EP), shrimp peel (CC), seaweed (Sargassum sp.) (AG) and mussel shell (CM) on induce 39 suppressiveness against Cylindrocladium spathiphylli on Spathiphyllum plants. On the 40 container media, naturally infested with the pathogen, were added HP and EP at 41 concentrations of 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (v/v) of the volume of water required to reach the 42 water retention capacity of the container media, and CC, AG and CM at concentrations of 0, 1, 43 2, 3, 4 and 5% (v/v). After incubation for 10 days were planting one plug of Spathiphyllum 44 33 ‘Opal’ per pot. HP, EP and CC reduced the incidence and the area under curve of progress 45 disease (AUCPD) with quadratic effect at each concentration. The pH and the potassium, 46 calcium and magnesium levels from HP, the electrical conductivity and potassium and 47 magnesium levels from the EP, and the pH and nitrogen, potassium and calcium levels from CC 48 showed strong negative correlation with the incidence and AUCPD. Hydrolysis of diacetate 49 fluorescein (FDA), respiration of container media and carbon of microbial biomass (CBM) 50 showed quadratic effect at concentrations of HP, EP and CC, with the inflection point at 25, 20 51 and 3%, respectively. EP at 20% showed the highest dry matter and the lower recurrence of the 52 pathogen in 180 days. EP at 20% induced suppressiveness to Cylindrocladium spathiphylli. 53 Key words: Biological control, fish emulsion, fish hydrolyzed, shrimp peel, mussel shell, 54 Sargassum. 55 56 INTRODUÇÃO 57 Em plantas de espatifilo (Spathiphyllum wallisi), o fungo Cylindrocladium spathiphylli, 58 agente causal da podridão do colo e da raiz (Reis et al., 2004) é o principal patógeno, 59 responsável por perdas significativas dessa florífera (Chase & Poole, 1987; Temorshuizen et al., 60 2006). Para essa doença não há controle curativo e a constatação de plantas com os sintomas, 61 acarreta na sua erradicação. A inexistência de produtos registrados e eficazes para o controle 62 da doença e a exigência da sociedade por produtos de alta qualidade (Morandi & Bettiol, 63 2009), requerem a busca de alternativas de controle. A incorporação de resíduos orgânicos 64 para a conversão de substratos conducentes em supressivos ao patógeno surge como 65 alternativa ao problema (Bettiol & Ghini, 2005). 66 34 Os resíduos marinhos atuam como indutores de supressividade aos patógenos de solo 67 (Bailey & Lazarovits, 2003). Farelo de peixe a 0,1% (p/p), associado à Bacillus thuringiensis, 68 reduziu significativamente a severidade provocada por Rhizoctonia solani e Fusarium spp., e 69 inibiram completamente a infecção de Macrophomina phaseolina em quiabeiro (Sheikh et al, 70 2006). Abbasi et al. (2004) observaram redução na severidade causada por Rhizoctonia solani 71 e Pythium aphanidermatum em mudas de rabanete e pepino, incorporando 4% (m/m) de 72 emulsão de peixe em solos infestados com os patógenos e incubados por 28 dias. A 73 supressividade a Verticillium dahliae e Streptomyces scabies em berinjela e batata foi induzida 74 com sucesso com uma única aplicação de 1% (m/m) de emulsão de peixe, em solos arenosos 75 com histórico das doenças (Abbasi et al., 2006). 76 A indução de supressividade com hidrolisado de peixe foi observada em Fusarium 77 oxysporum f. sp. lycopersici raça 3 em tomate (Bettiol et al., 2009); com casca de crustáceos 78 em Fusarium solani f. sp. piperis em mudas de Piper nigrum (Benchimol et al., 2006) e em 79 Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi em crisântemo (Pinto et al., 2010). Labrie et al. 80 (2001) obtiveram eficácia com o uso de quitina no controle de Phytophthora fragariae var. 81 rubi e Pythium ultimum em pepino; e Muñoz et al. (2008) verificaram a eficácia da quitosana 82 no controle de Colletotrichum sp. em uva e tomate. 83 O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade de hidrolisado de peixe, 84 emulsão de peixe, casca de camarão moída, pó-de-alga marinha e pó-de-concha de marisco em 85 induzir supressividade a C. spathiphylli em plantas de espatifilo. 86 87 MATERIAL E MÉTODOS 88 35 Resíduos da indústria pesqueira. Dos resíduos utilizados, o hidrolisado de peixe (HP) e 89 a emulsão de peixe (EP) são produtos comerciais de nome FishFértil Active® (Fish Fertilizantes 90 Ltda., Estiva Gerbi-SP) e Fertilizante Orgânico Composto Classe A - JK® (JK Fertilizantes – 91 Paulínia-SP), respectivamente. A casca de camarão (CC), a concha de marisco (CM) e a alga 92 marinha Sargassum sp. (AG) foram coletados em colônias de pescadores dos municípios de 93 Balneário Camboriú e Penha, SC, secos em estufa de ar forçado a 40 °C para perda da umidade 94 até o ponto de moagem, seguido de trituração, moagem e separação em peneira de 60 Mesh 95 (0,25 mm). A composição de cada resíduo encontra-se na Tabela 1. 96 Efeito dos resíduos marinhos adicionados ao substrato de cultivo, naturalmente 97 infestado, no controle de C. spathiphylli. O substrato de cultivo Multiplant® (Terra do 98 Paraíso, Holambra-SP) (60% de composto de casca de pinus, 15% de vermiculita e 25% de 99 húmus e terra vegetal, pH 5,5, CE 0,6 μS cm-1) naturalmente infestado com o patógeno, 100 coletados de vasos contendo plantas com sintomas da doença, foi reunido em um único 101 volume, seguido de revolvimento para uniformização do inóculo. Após, foram incorporados os 102 resíduos de CC, AG e CM nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% (v/v) e o HP e a EP nas 103 concentrações de 0, 5, 10, 15, 20 e 25% (v/v) do volume necessário para atingir a capacidade 104 de retenção de água do substrato. As misturas foram incubadas por 10 dias em sacos plásticos 105 negros mantidos a temperatura ambiente, seguido de transferência para vasos plásticos de 300 106 mL, e o plantio de uma muda de espatifilo da cultivar Opal em cada vaso. Os vasos foram 107 mantidos sob ambiente protegido, coberto com filme de polietileno branco fosco e a irrigação 108 foi feita por aspersão. A partir de 30 dias do plantio, as plantas foram adubadas semanalmente 109 com 4 e 6 g vaso-1 de N (uréia) e K (KNO3), respectivamente. No plantio, aos 90 e aos 180 110 36 dias de cultivo, foram coletadas amostras para a determinação da respiração microbiana (Grisi, 111 1978), carbono da biomassa microbiana (CBM) (Vance et al., 1987) e atividade microbiana do 112 substrato por meio da hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA) (Schnürer & Rosswall, 113 1982). Macro e micronutrientes dos substratos foram determinados no plantio e ao final do 114 experimento. A incidência foi avaliada aos 180 dias de cultivo e a severidade da doença foi 115 avaliada semanalmente até os 180 dias após o plantio. Para a severidade foi utilizada a escala de 116 notas: 1- planta sadia, 2 - planta murcha, 3 - planta morta. Com os resultados foram calculadas 117 as áreas abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), as curvas de regressão linear e a 118 incidência da doença (ID) em relação à testemunha. Ao final do experimento determinou-se a 119 matéria seca total das plantas remanescentes. Os resíduos foram analisados em dois 120 delineamentos experimentais inteiramente casualizados em arranjo fatorial (3 X 6) para a casca 121 de camarão, pó-de-alga e pó-de-concha-de-marisco, e em arranjo fatorial (2 X 6) para o 122 hidrolisado e a emulsão de peixe, com 30 repetições (1 repetição = 1 vaso com uma planta). 123 Re-isolamento de C. spathiphylli de fragmentos radiculares. Para confirmação do 124 agente causal da doença nas plantas, foram coletados cinco fragmentos de raízes com 5 mm de 125 comprimento, lavados em água corrente e desinfestados em álcool 70%, por 1 minuto, e 126 hipoclorito de sódio 2,0%, por 30 segundos, seguido de duas lavagens em água destilada e 127 secas em papel de filtro esterilizado. Em ambiente asséptico, os fragmentos foram transferidos 128 para placas de Petri contendo meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) + estreptomicina (1 g L-1 de 129 meio). As placas foram mantidas em câmara de crescimento a 24 °C ± 2 por 72 h para 130 observação dos sinais do patógeno, expresso em 1 = presença ou 0 = ausência do patógeno. Os 131 resultados foram transformados em arcoseno de √x/100. 132 37 Análise estatística - Os resultados dos experimentos foram submetidos à análise de 133 variância e a separação de médias realizada pelo teste de Tukey a 5% utilizando o software 134 SISVAR 5.0 e as regressões no Sigma Plot 11.0. 135 136 RESULTADOS E DISCUSSÃO 137 A análise de variância dos resíduos líquidos (CV= 17,8%) e dos resíduos sólidos (CV= 138 12,9%) não teve significância entre os resíduos, mas foi significativo (p<0,05) para 139 concentração e a interação resíduo X concentração. Nos experimentos, o desdobramento de 140 resíduo e concentração foi estudado através de análise de regressão (Figuras 1 e 2). 141 O hidrolisado de peixe (HP), a emulsão de peixe (EP) e a casca de camarão (CC) 142 reduziram a incidência da doença, aos 180 dias de cultivo, com efeito quadrático proporcional 143 às concentrações aplicadas (Figuras 1A e 2A). As maiores concentrações de CC e HP 144 proporcionaram incidências inferiores a 15% (R2 = 0,59) e 22% (R2 = 0,46) em relação à 145 testemunha (0%) com 100% de incidência, respectivamente. No tratamento contendo EP a 146 25% não foram observados sintomas do patógeno nas plantas de espatifilo (Figura 1). 147 O comportamento para a severidade, com redução da AACPD no período de 180 dias, 148 proporcionalmente à concentração aplicada (Figuras 1B e 2B) foi semelhante nestes resíduos. 149 A redução da incidência e da severidade de doenças causados por fitopatógenos de solo, com a 150 adição de concentrações de resíduos ao solo ou em substrato foram obtidos por Abbasi et al. 151 (2004, 2006) com emulsão de peixe, e por Lazarovits et al. (2009), Bettiol et al. (2009) e 152 Visconti et al. (2010) com hidrolisado de peixe. 153 38 Pinto et al. (2010) controlaram F. oxysporum f. sp. crisanthemi em crisântemo 154 incorporando 4% (v/v) do pó de casca de camarão ao substrato de cultivo, porém, a 155 concentração de 5% do resíduo foi fitotóxica às plantas, efeito não observado para o espatifilo. 156 As análises de correlação negativa da AACPD e da incidência da doença (Tabela 3) com 157 os atributos químicos dos substratos aos 180 dias evidenciam forte correlação das variáveis 158 abióticas dos resíduos na supressividade ao patógeno. A elevação das concentrações dos 159 resíduos incorporados ao substrato reduziram a incidência e a severidade da doença. No 160 hidrolisado de peixe, o pH e os teores de potássio, cálcio e magnésio; na emulsão de peixe, a 161 condutividade elétrica e os teores de potássio e magnésio; e na casca de camarão, o pH, e os 162 teores de nitrogênio, potássio e cálcio destacaram-se como variáveis supressoras de C. 163 spathiphylli. 164 A redução da severidade de C. spathiphylli em plantas de espatifilo com o aumento do 165 pH foi observado por Chase e Poole (1987) e Temorshuizen et al. (2006). Heyman et al. (2007) 166 obtiveram forte correlação negativa na supressividade a Aphanomyces euteiches em ervilha 167 com doses crescentes de cálcio incorporadas ao solo. Segundo Höper e Alabouvette (1996), a 168 elevação do pH favorece a absorção de cálcio (Ca) e magnésio (Mg) pelas raízes, reponsáveis 169 pelo espessamento da parede celular inibindo a atividade de poligalacturonase produzida por 170 diversos fungos. 171 A correlação entre os teores de nitrogênio presente na casca de camarão e a incidência e 172 severidade do patógeno foi negativa (Tabela 3). O efeito do pH na formação de compostos 173 nitrogenados tóxicos como a amônia (N-NH3) e o ácido nitroso (HNO2) ou na liberação de 174 ácidos graxos voláteis (AGVs), com ação de inibição de fitopatógenos é discutido por Abbasi 175 39 et al. (2004, 2006), Lazarovits et al. (2005, 2009) e Abbasi et al. (2009). A redução do pH ao 176 longo do cultivo de espatifilo e a presença de concentrações de nitrogênio nos substratos 177 (Tabela 2), mesmo que por curto período, devido a lixiviação dos nutrientes do substrato pela 178 irrigação, pode ao longo do ciclo de cultivo ter favorecido a formação de HNO2 e/ou liberação 179 de AGVs inibindo a ação de C. spathiphylli. 180 A hidrólise do diacetado de fluoresceína (FDA), respiração do substrato e carbono da 181 biomassa microbiana (CBM) indicam, para os resíduos líquidos, comportamento quadrático da 182 atividade microbiana nos substratos, com ponto de inflexão na concentração de 25% para o 183 hidrolisado de peixe (Figuras 3A, C e E) e de 20% para a emulsão de peixe (Figuras 3B, D e 184 F). Nos resíduos sólidos, comportamento semelhante ocorreu somente nas concentrações de 185 casca de camarão com ponto de inflexão a 3% (v/v) do resíduo incorporado (Figuras 4A, D e 186 G). Nestes resíduos a maior atividade de FDA, respiração e CBM foram observadas na fase de 187 plantio. Efeito inverso foi observado nos resíduos de alga marinha (AG) e concha de marisco 188 (CM), com elevação das concentrações de CBM e FDA aos 90 e 180 dias (Figura 4B, C, E, F, 189 H e I). 190 A atividade microbiana foi identificada como variável integrante do conjunto que atuam 191 na supressividade ao patógeno por Bailey & Lazarovits (2003), Abbasi et al. (2004, 2009), 192 Bettiol & Ghini (2005), Bettiol et al. (2009), Bonanomi et al. (2010) e Visconti et al. (2010). 193 Segundo Lazarovits et al. (2009) emulsões e hidrolisados de peixe estimulam a atividade 194 microbiana em solos com aumento das populações de Trichoderma spp. sendo esses 195 organismos associados à supressividade. El-Tarabily et al. (2003) comprovaram o efeito da 196 40 emulsão de peixe no estímulo do crescimento de bactérias e actinobactérias e desses no 197 desenvolvimento de mudas de rabanete em solo arenoso. 198 Os resíduos de AG e CM adicionados ao substrato de cultivo não induziram 199 supressividade a C. spathiphylli. Diferentemente dos resíduos de HP, EP e CC, as alterações 200 microbianas ocorreram mais lentamente, permitindo o estabelecimento do patógeno no 201 substrato. Apesar da ineficácia dos tratamentos contendo AG e CM, há necessidade de se 202 conhecer o comportamento desses resíduos em outros patossistemas. 203 A EP a 20% promoveu os maiores teores de matéria seca da raiz e da parte aérea, 1,46 e 204 0,79 g, em relação à testemunha com 0,96 e 0,47 g, respectivamente. O peso da matéria seca 205 total do tratamento foi 21,3% superior ao segundo tratamento de maior concentração de 206 matéria seca, semelhante ao efeito obtido por Abbasi et al. (2004) com emulsão de peixe em 207 mudas de rabanete, pepino e fumo. 208 Análises de correlação de Pearson (P < 0,05) entre a presença do patógeno na planta, 209 através do reisolamento do patógeno em Placas de Petri e os teores de matéria seca tiveram 210 forte correlação negativa para a concentração de EP a 20%, com valores para a parte aérea de r 211 = -0,86 e para as raízes de r = -0,88 (Tabela 4), confirmando o efeito do resíduo sobre o 212 patógeno e como promotor de crescimento de planta (Figura 5). A morte de microescleródios 213 de V. dahliae com emulsionado de peixe foi observada por Abbasi et al. (2006). 214 Com os resultados de incidência, severidade, carbono da biomassa microbiana, hidrólise 215 de diacetato de fluoresceína e as correlações entre o re-isolamento do patógeno em meio BDA 216 e os teores de matéria seca, conclui-se que, nas condições experimentais, a emulsão de peixe a 217 41 20% (v/v) do volume necessário para atingir a capacidade de retenção de água do substrato, 218 induziu supressividade a Cylindrocladium spathiphylli. 219 220 AGRADECIMENTOS 221 Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 222 Tecnológico – CNPq pelo provimento das bolsas de doutorado e produtividade em pesquisa 223 aos dois primeiros autores, respectivamente, e ao produtor Ronaldo Aluísio Kievitsbosch de 224 Holambra-SP, pelo fornecimento dos insumos para realização da pesquisa. 225 226 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS 227 Abbasi PA, Conn KL, Lazarovits G (2004) Suppression of Rhizoctonia and Pythium damping-228 off of radish and cucumber seedlings by addition of fish emulsion to peat mix or soil. 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