RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 01/03/2016. 1 James Venturini Influência da condição de hipoinsulinemia-hiperglicemia na candidíase experimental sistêmica: avaliação da atividade macrofágica e da distribuição das subpopulações de monócitos sanguíneos Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu, da UNESP, para obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais. Orientador: Prof. Titular Rinaldo Poncio Mendes Co-orientadora: Prof. Dra. Maria Sueli Parreira de Arruda Botucatu-SP 2013 2 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP Venturini, James. Influência da condição de hipoinsulinemia-hiperglicemia na candidíase experimental sistêmica: avaliação da atividade macrofágica e da distribuição das subpopulações de monócitos sanguíneos/ James Venturini. – Botucatu : [s.n.], 2013. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu, Botucatu, 2013. Orientador: Rinaldo Poncio Mendes Co-orientadora: Maria Sueli Parreira de Arruda Assunto CAPES: 40101096 1. Candidiase CDD 616.998 Palavras-chave: Diabetes mellitus; candidíase experimetnal sistêmica; C. albicans; macrofagos; monócitos; aloxana, imunopatologia 3 James Venturini Influência da condição de hipoinsulinemia-hiperglicemia na candidíase experimental sistêmica: avaliação da atividade macrofágica e da distribuição das subpopulações de monócitos sanguíneos Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu, da UNESP, para obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais. Professor Titular Rinaldo Poncio Mendes Faculdade de Medicina de Botucatu / UNESP Professora Titular Vera Lúcia Garcia Calich Instituto de Ciências Biomédicas / USP Professora Ajunta Vanessa Soares Lara Faculdade de Odontologia de Bauru / USP Professora Doutora Vânia Nieto Brito de Souza Instituto Lauro de Souza Lima Professora Dra. Angela Satie Nishikaku Escola Paulista de Medicina / UNIFESP Local e data de aprovação: Botucatu, 22 de fevereiro de 2013. 4 “Saber é compreender como é que a mais insignificante das coisas está ligada ao todo; nada existe por si só.” Émile-Auguste Chartier 5 A Deus Por me fortalecer em toda minha trajetória Pela sustentação nos momentos de dúvidas Pela lucidez ao perceber as minhas falhas Pelos pequenos milagres de cada dia. 6 À minha família, em especial a Meu pai Antonio, minha mãe Valentina Minhas irmãs Giselle, Graziela e Isabela Minha sobrinha Hellen Venturini Cascadan Pelo exemplo de alegria fortaleza nas adversidades da vida, Pelo apoio incondicional nas decisões mais difíceis, Pelo amor, carinho e confiança sempre recebidos. 7 Ao Professor Titular Rinaldo “Tietê” Poncio Mendes, Pela orientação segura, pelo exemplo de dedicação à docência e ensinamentos recebidos e pelas inúmeras oportunidades concedidas. A Professora Doutora Maria Sueli Parreira de Arruda, Por me estimular incansavelmente para a Ciência e por me conceder diariamente o privilégio de compartilhar suas experiências e sonhos. 8 Aos meus Verdadeiros Amigos por tudo o que são E por tudo o que aprendo com vocês. Valeu cultivar suas amizades, pois os frutos, além de fartos, são preciosos! 9 À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão de bolsa de estudo 10 Aos colaboradores deste estudo: Dra. Márjorie de Assis Golim, Dra. Maria Renata Sales Nogueira da Costa, Thais Fraga da Silva, Camila Marchetti, Luiza Mimura, Angela Finato, Amanda dos Santos, Débora Almeida Obrigado pela contribuição e pela amizade conquistada. Ao Professor Dr. Frank Tacke e toda equipe de seu laboratório, que me receberam como verdadeiros amigos, particularmente a Felix Haymman e Viktor Fech Ao Prof. Dr. Olavo Speranza de Arruda, pela amizade e confiança depositada. Ao Dr. Hélio Rubens de Carvalho Nunes, Grupo de Apoio à Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu, pelo auxílio nas análises estatísticas. Aos colegas do Laboratório de Imunopatologia Experimental ( Unesp-Bauru), e do Laboratório de Micologia do Departamento de Doenças Tropicais (Unesp- Botucatu) por tudo o que vocês têm realizado e me ensinado a cada dia. Aos pesquisadores e funcionários do Instituto Lauro de Souza Lima pela amizade, ensinamentos, alegrias e desafios compartilhados no dia-a-dia. 11 Aos Coordenadores do Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais, Dr. Paulo Câmara Marques Pereira e, em especial, a Dra. Jussara Marcondes Machado pelo carinho recebido e pela formação acadêmica Aos docentes do Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais pelos ensinamentos, em especial aos Professores Doutores: Alexandrina Sartori, Lenice do Rosário de Souza e Maria Terezinha Serrão Peraçoli Aos colegas de Pós-Graduação pela amizade e ensinamentos compartilhados, em especial a: Daniela. Moris de Souza, Ricardo de Souza Cavalcante, Priscila Zacarrias, Vanessa Martinez Manfio, Eliana Peresi (Pananã), Talisia M. Colachite, Larissa Ragozzo, Mariana Gatto, Thatiane Sylvestre, Adriele Levorato, Marcela Rodrigues de Camargo e Bruno Jose Conti. Aos docentes e funcionários do Departamento de Ciências Biológicas e demais servidores da Faculdade de Ciências, Unesp/Bauru pelo convívio diário em 13 anos de minha vida unespiana. 5 1. INTRODUÇÃO Candida albicans é um fungo dimórfico que vive como comensal do trato gastrintestinal e urinário de muitas espécies de mamíferos. Em indivíduos sadios, raramente causa infecção persistente, mas sob certas circunstâncias, esse fungo tem sido isolado como patógeno, com envolvimento freqüente de órgãos vitais como o cérebro, fígado e rins.(1) De modo geral, a candidíase sistêmica é observada em pacientes hospitalizados por longos períodos e, ou, expostos a antibióticos, terapias imunodepressivas e procedimentos invasivos múltiplos. No Brasil, a incidência de candidemia é considerada elevada – 2,49 casos por 1000 admissões.(2) O diabetes mellitus (DM) corresponde a 13% - 17% das doenças de base em pacientes com candidemia(2-5). Embora possam apresentar diferentes tipos de comprometimento imunológico(revisão em Geerlings e Hoepelman(6)), a resposta imune desses pacientes frente à Candida não é clara. Para alguns autores, pacientes diabéticos respondem como a população em geral quando provocados com antígenos de Candida em ensaios de linfoproliferação(7); outros, contudo, descreveram que enquanto 88% dos indivíduos considerados sadios são candidina reatores, somente 44% dos pacientes diabéticos o são.(8) Do mesmo modo, enquanto alguns pesquisadores observam diminuição da atividade fagocítica de monócitos e neutrófilos nesses pacientes(9-11), outros não encontraram diferenças entre estes e grupos controle.(12,13) Dadas as dificuldades em conduzir estudos em humanos, modelos experimentais de candidíase sistêmica no cenário de hipoinsulinemia e hiperglicemia (HH) têm sido propostos(14,15). Mesmo assim, são poucos os estudos avaliando o comprometimento da resposta imune sob esta condição. Em modelo de candidíase disseminada, Mencacci et al.(15) observaram o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th2, ou seja, ausência de positividade à reação intradérmica específica, elevados níveis de IL-4, IL-6 e IL-10 e baixos níveis de IFN-γ e IL-2. Por outro lado, Peterson et al.(16) não encontram alterações na atividade fagocítica de macrófagos peritoneais frente a Candida em camundongos tornados diabéticos. Do mesmo modo, 6 trabalhando com ratos obesos da linhagem Zucker, que mimetizam o DM tipo II, Plotkin et al(17), também observaram que macrófagos peritoniais exibiam fagocitose preservada; contudo, a capacidade fungicida estava comprometida. Apesar destas controvérsias, é certo que os fagócitos desempenham papel fundamental no controle e/ou erradicação dos fungos(18-20). Os neutrófilos desempenham papel central na defesa frente a Candida. Embora deficiências funcionais tenham sido observadas em neutrófilos de pacientes diabéticos, ainda há muitas lacunas envolvendo o real papel destas células na persistência das infeccções em pacientes diabéticos(21,22). Os macrófagos, por sua vez, são células que exibem heterogeneidade fenotípica e funcional devida, pelo menos em parte, à sua capacidade de se adaptar às mudanças do meio ambiente tecidual. Esta plasticidade funcional é importante para que possa atuar no clearance de tecidos lesados e de microrganismos invasores, no recrutamento de células do sistema imune adaptativo e, ainda, na resolução de lesões. De modo geral, estudos investigando a população macrofágica tanto em pacientes como em animais diabéticos têm apresentado resultados divergentes, ora sugerido que esta condição afetaria negativamente(23,24), ora positivamente a atividade dos macrófagos (25-27). Dada a complexidade dos eventos envolvidos nesse processo, é evidente que alterações na orquestração das múltiplas atividades dos macrófagos prejudicariam a eficácia da resposta do organismo a infecções e outros processos lesivos. Entre as questões que se apresentam, chamou-nos a atenção a possível participação dos monócitos neste cenário. De modo geral, os monócitos sanguíneos constituem uma fonte móvel de células funcionalmente competentes que, através da corrente sanguínea, entram constitutivamente em todos os compartimentos do corpo. Nos diferentes órgãos, estas células se adaptam ao microambiente local, resultando em subpopulações macrofágicas com características morfofuncionais distintas, importantes para a flexibilidade e eficácia da resposta imune(28). 7 Assim, além de suprir os tecidos periféricos, os monócitos também contribuem diretamente para a resposta imune frente a patógenos, no local da infecção. Estudos recentes indicam a existência de dois grandes subtipos de monócitos: os denominados “clássicos”, que são seletivamente recrutados para o tecido inflamado e os ditos “não-clássicos”, assim denominados por serem encontrados tanto no tecido livre de inflamação como no tecido inflamado, durante e após a cura do processo.(29-33) Os monócitos “inflamatórios” (Gr1+) expressam grandes quantidades de CD115 (receptor de M-CSF), Ly6C, receptor CCR2 e da molécula de adesão L-selectina (CD62L)(34). Landsman et. al.(35) observaram que esses monócitos ficam transitando entre o sangue e a medula óssea e extravasam quando são recrutados para um local de inflamação. Os monócitos „não-clássicos‟ ou “residentes” (GR1-) expressam em comum com os “inflamatórios” o receptor CD115, mas diferem destes por não expressarem os receptores Ly6C e CD62L e por expressarem CX3CR1(33,34). Essas células parecem estar envolvidas nos mecanismos de homeostase dos vasos sanguíneos. Assim, na ausência de processo inflamatório estes monócitos permaneceriam dentro dos vasos, mas em resposta a dano tecidual, extravasariam rapidamente e invadiriam o tecido lesado(36). Alterações na distribuição das subpopulações de monócitos têm sido associadas em diversas patologias como obesidade(37), doenças cardiovasculares(38), fibrose hepática(39) e diabetes tipo I(40), mas não é do nosso conhecimento que este parâmetro, associando a condição HH e candidíase sistêmica, tenha sido avaliado. Assim, a determinação das subpopulações de monócitos bem como o perfil de citocinas inflamatórias durante a evolução da candidíase sistêmica sob a condição HH, certamente auxiliarão na melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nestes processos e, como conseqüência, em novas abordagens imunoterapêuticas. De modo especial, as informações referentes ao perfil destas células no sangue circulante, na ausência e na presença de infecção, poderão fornecer dados que permitam uma abordagem 8 terapêutica mais precoce, minimizando os transtornos decorrentes das dificuldades em controlar esta infecção em pacientes diabéticos. 65 CONCLUSÕES O estudo de camundongos outbred submetidos à condição de hipoinsulinemia- hiperglicemia (HH), infectados por via intravenosa com Candida albicans, permitiu concluir o que se segue. Objetivo 1. Avaliar a influência da condição HH sobre o curso da candidiase sistêmica por meio das análises microbiológica, histopatológica e de sobrevida 1.1. A recuperação de fungos de rins, cérebro, baço e medula óssea não depende não depende da condição HH. A recuperação de fungos é maior na condição HH aos 7 dias. As hemoculturas são sempre negativas. 1.2. No início da infecção, a carga fúngica é intensa nos rins, porém com discreto infiltrado inflamatório. A seguir, observa-se destruição de fungos e intenso infiltrado inflamatório 1.3. Nos demais órgãos, a carga fúngica é sempre muito discreta. 1.4. A condição HH induz maior taxa de mortalidade em camundongos infectados; Objetivo 2. Determinar a influência da condição HH sobre a concentração plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p70, INF-y e CCL2 em camundongos com candidiase sistêmica. 2.1. A infecção de animais livres da condição HH leva ao aumento precoce dos níveis plasmáticos de TNF-α, IL-6 e CCL2; 66 2.2. A condição HH determina aumento ainda maior dos níveis plasmáticos de IL-6 e TNF-α após infecção. Objetivo 3. Em camundongos com a condição HH, determinar a influência da infecção fúngica sobre a atividade funcional de fagócitos peritoneais, avaliada por meio da produção de peróxido do hidrogênio, óxido nítrico, TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p70, INF-y e CCL2. 3.1. Camundongos HH-induzidos apresentam maior produção espontânea de TNF-α e peróxido do hidrogênio (H2O2), que se torna ainda maior quando estimulados com fungos mortos pelo calor. 3.2. A infecção fúngica exacerba a produção de TNF-α. Objetivo 4. Determinar a influência da condição HH e da infecção fúngica na distribuição de granulócitos e das subpopulações de monócitos no sangue periférico. 4.1. A infecção fúngica induz aumento de granulócitos e de monócitos totais e inflamatórios, independentemente da condição HH. 4.2. O aumento da porcentagem de granulócitos permanece estável, enquanto o de monócitos retorna a níveis basais em sete dias. 67 RESUMO Diabetes mellitus (DM) é um importante fator de predisposição para o desenvolvimento de infecções, incluindo a candidíase. Embora a incidência e a gravidade das doenças infecciosas em pacientes diabéticos estejam com frequência relacionadas a disfunções da resposta imune, seus mecanismos ainda não foram bem esclarecidos. No presente estudo avaliou-se a influência da condição de hipoinsulinemia-hiperglicemia (HH) na evolução da candidíase experimental sistêmica. Parâmetros histológicos, microbiológicos e imunológicos envolvendo medula óssea, cérebro, baço e fígado, níveis plasmáticos de quimiocina e de citocinas, atividade macrofágica e distribuição de granulócitos e subpopulações de monócitos do sangue periférico foram avaliados. Para tanto, camundongos suiços, HH-induzidos ou não pela aloxana, foram inoculados com Candida albicans pela veia da cauda e avaliados 12, 24 e 96 horas e 7 dias após infecção. A presença de fungos foi avaliada em: sangue, medula óssea, rins, fígado, cérebro e baço. A atividade macrofágica foi estudada pela resposta de fagócitos peritoneais cultivados ou não com C. albicans mortas pelo calor, avaliando-se a produção de peróxido de hidrogénio e de óxido nítrico e os níveis de TNF-α, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-12p70 e CCL2 em sobrenadande de cultura. Os níveis plasmáticos destas citocinas também foram determinados. A distribuição de granulócitos e das subpopulações de monócitos circulantes foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados mostraram aumento da mortalidade em camundongos HH; apesar da ausência de diferenças de resposta tecidual entre os grupos infectados; notamos diferenças importantes na carga fúngica presente nos diversos tecidos examinados (especificar). Estes animais também exibiam elevados níveis plasmáticos de IL-6 e TNF-α, e uma produção exacerbada de TNF-α pelos macrófagos. Após infecção observou-se aumento na da porcentagem de granulócitos e monócitos inflamatórios em animais HH e infectados, que foi superior ao observado em animais infectados e livres da condição HH. Esses resultados, analisados em seu 68 conjunto, demonstram que a inoculação intravenosa de C. albicans provoca um aumento dos níveis plasmáticos de IL-6, TNF-α e CCL2 e da atividade macrofágica por fagócitos peritoneais, além de alterações na distribuição de granulócitos e monócitos do sangue periférico. Por fim, demonstram que sob a condição HH os animais exibem uma hiper-resposta à infecção com C. albicans que, por sua vez, pode estar envolvida na elevada mortalidade observada nestes animais. 69 ABSTRACT Diabetis mellitus (DM) is an important predisposing factor for the development of infections, including candidiasis. Although the incidence and severity of infectious diseases in diabetic patients are related to dysfunction in the immune function, the mechanisms involved in the high susceptibility to this fungal infection are not clear. In the present study, we evaluated the influence of hypoinsulinemia-hyperglycemia (HH) on plasma levels of chemokine/cytokines, macrophage activity and distribution of peripheral blood granulocytes and monocytes subsets in a murine model of systemic candidiasis. C. albicans was intravenously inoculated in alloxan-induced HH mice, which were evaluated 12, 24 and 96 hours, and 7 days after infection. Colony-forming unit analysis and/or histopathological examination were performed on blood, bone-marrow, kidney, brain, liver and spleen. Peritoneal phagocytes were cultured with or without heat-killed C. albicans, and the production of hydrogen peroxide and nitric oxide were determined. The levels of TNF-α, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-12p70 and CCL2 were measured in the culture supernatants and also in the plasma of the mice. The distribution of peripheral blood granulocytes and monocytes subsets were performed by flow cytometry. Our findings showed an increased mortality in the infected HH mice, but they showed no significant differences in fungal recovery. Upon histopathological examination, no differences were observed between both infected groups, but strong discrepancies in fungal load were found among the tissues examined. High plasma levels of IL-6 and TNF-α as well as an excessive TNF-α-mediated macrophage response were also observed in the infected HH-induced mice. Soon after the fungal challenge, increased percentage of granulocytes and inflammatory monocytes was observed. C.albicans-infected HH mice presented a higher percentage of granulocytes than the non-HH infected mice. 70 Taken together, our results showed that the intravenous inoculation of C. albicans triggers an increase in the plasma levels IL-6, TNF-α and CCL2, a proinflammatory profile in the peritoneal phagocytes, and alterations on the distribution of peripheral blood granulocytes and monocytes. Our findings also showed that the HH condition results in hyperresponsivity to C. albicans infection and, as consequence, could be involved in the high mortality observed in these animals.