405Bacillus thuringiensis: diversidade gênica em isolados lepidoptera-específicos. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414, out./dez., 2008 BACILLUS THURINGIENSIS: DIVERSIDADE GÊNICA EM ISOLADOS LEPIDOPTERA-ESPECÍFICOS A.M. Guidelli-Thuler1, J.A.D. Sena1, I.L. Abreu1, C.C. Davolos1, S.B. Alves2, R.A. Polanczyk3, F.H. Valicente4, M.V.F. Lemos1 1Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinarias, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, CEP 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: guidelli@fcav.unesp.br RESUMO O presente trabalho teve como objetivo caracterizar geneticamente 1.073 isolados de Bacillus thuringiensis , de três coleções brasileiras, provenientes da UNESP, Jaboticabal, da ESALQ/ Piracicaba e da EMBRAPA. Sete Lagoas, analisando os tipos de genes cry1 apresentados pelos isolados. Para isso, foram elaborados oligonucleotídeos iniciadores a partir de 16 regiões conservadas e 4 regiões não conservadas das seqüências de cada uma das 16 subclasses do gene cry1. Essas seqüências foram amplificadas por PCR e a presença de amplicons para cada subclasse foi calculada em porcentagem por gene e por coleção. Nessa análise, 55,7% dos isolados apresentaram amplificação para o gene cry1, e as subclasses cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1Ae, cry1Af, cry1Ag, e cry1Bf, cry1Ca e cry1Fa estão presentes em alta proporção de isolados, variando de 43,4% a 54,9%. Verificou-se que existe uma distribuição das subclasses dentro do banco de isolados de B. thuringiensis em estudo, com maior porcentagem de isolados portadores dos genes cry1Ab (42,12%) e com menor porcentagem de representantes da subclasse cry1Db (0,6%). A variabilidade gênica, nas coleções analisadas, destaca as coleções de Jaboticabal e Piracicaba como fontes de isolados promissores para uso em programas de Controle Biológico de pragas da ordem Lepidoptera. A coleção de Sete Lagoas, na qual as freqüências das subclasses estudadas foram relativamente baixas (abaixo de 20%), destaca somente o gene cry1Ab, presente em 38,5% dos isolados desta coleção. PALAVRAS-CHAVE: Variabilidade genética, gene cry, Bacillus thuringiensis . ABSTRACT BACILLUS THURINGIENSIS: GENETIC DIVERSITY OF LEPIDOPTERA-SPECIFIC ISOLATES. The aim of this work was to genetically characterize 1,073 isolates of B. thuringiensis , from three Brazilian collections – UNESP/Jaboticabal, ESALQ/Piracicaba and EMBRAPA/Sete Lagoas – with the main emphasis on the analysis of the cry1 gene types presented by these isolates. To achieve this purpose, oligonucleotide primers were designed based on 16 conserved and 4 unconserved regions of the corresponding sequences from each one of the 16 subclasses of the cry1 set of genes and used in PCR amplification assays. These sequences were amplified and the presence of amplicons for each subclass was evaluated in terms of percentage of gene type per bacterial collection. As a result, 55.7% of the isolates reacted to the primer Gral cry1, and the subclasses cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1Ae, cry1Af, cry1Ag, cry1Bf, cry1Ca and cry1Fa were detected in high percentages among the isolates ranging from 43.4 to 54.9%. A subclass distribution was observed among the set of isolates from these collections, with the greater percentage of isolates harboring the cry1Ab (42.12%) and the lowest percentage for the cry1Db subclass (0.6%). The genetic variability of the analyzed bacterial collections seems to indicate the ESALQ/Piracicaba and the UNESP/Jaboticabal subsets as sources of promising isolates for the control of Lepidoptera pest insects. For the EMBRAPA/Sete Lagoas subset of isolates, in which the evaluated subclasses 2Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, Piracicaba, SP, Brasil. 3Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Produção Vegetal, Alegre, ES, Brasil. 4EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, Brasil. 406 A.M. Guidelli-Thuler et al. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414 out./dez., 2008 frequencies were considered low (below 20%), the cry1B was the most frequently observed gene type present in 38.5% of the isolates. KEY WORDS: Genetic variability, cry gene, Bacillus thuringiensis . INTRODUÇÃO O controle de insetos-praga é um aspecto funda- mental na produção agrícola, tanto para grandes como para pequenos produtores (MONNERAT; BRAVO, 1999). Nos últimos anos, tem sido alto o investimento na otimização de agentes de controle biológico mas, apesar disso, somente alguns bioinseticidas têm sido empregados. Estatísticas mostram que apenas 1% das pragas agrícolas e vetores de doenças é controla- do por compostos originários de organismos vivos. Entretanto, a bactéria Bacillus thuringiensis é respon- sável por 90-95% desse mercado (VALADARES-INGLIS et al., 1998) e, em 1990, cobria uma área de 150.000 ha no Brasil (ALVES, 1990). Devido à sua grande importância ecológica, B. thuringiensis tem sido amplamente estudado, isolado de todos os ambientes onde foi procurado, apresen- tando grande variabilidade genética e uma ampla gama de sorotipos diferentes (VILAS-BÔAS, 2002). VILAS-BÔAS; LEMOS (2004) apresentaram a caracte- rização do conteúdo de genes cry como a principal motivação para a realização de amplos programas de busca de novas linhagens. A patogenicidade e a especificidade de uma linhagem são determinadas pelos tipos de genes cry funcionais que o B. thuringiensis possui. Estes genes codificam para as proteínas Cry, que são sintetizadas na forma de protoxinas. Ao serem ingeridas por um inseto suscetível, as protoxinas são solubilizadas no ambiente alcalino do intestino do inseto, e convertidas em δ-endotoxinas. As toxinas hidrolisadas cruzam a membrana peritrófica, ligam- se a receptores específicos nas células colunares do intestino médio, formando poros que aumentam a permeabilidade da membrana, interferindo no gradi- ente iônico e balanço osmótico da membrana apical. O aumento na absorção de água causa lise celular e eventual ruptura e desintegração das células do intes- tino médio. O inseto também pode morrer por inani- ção, uma vez que, pouco tempo após a infecção, ele para de se alimentar (HOFTE; WHITELEY, 1989; K NOWLES, 1994; COPPING; MENN, 2000). Até hoje, cerca de 300 genes cry foram seqüenciados e classificados em 50 grupos e diferentes subgrupos dependendo da similaridade de seus aminoácidos. Mesmo considerando-se a variabilidade das proteí- nas Cry até agora descritas, é ainda extremamente necessária a busca por novas toxinas, visando o controle de um número maior de insetos. É também importante encontrar alternativas para o controle da resistência de insetos às toxinas Cry, especialmente com o advento das plantas transgênicas (VILAS-BÔAS; LEMOS, 2004). A busca e a caracterização de novos genes cry podem resultar em novas alternativas para o controle de espécies de insetos com nenhuma ou pouca sus- ceptibilidade às proteínas Cry atualmente conheci- das, além de poder auxiliar no desenvolvimento de sistemas de manejo que evitem ou minimizem o apa- recimento de resistência a B. thuringiensis em popula- ções de insetos alvo em campo (VILAS-BÔAS, 2002). Atualmente, os casos mais graves de resistência ocor- reram com a lagarta Plutella xylostella (TABASHINIK et al., 1990; FERRÉ et al., 1991; TABASHINIK, 1994). A caracterização de coleções de linhagens pode também auxiliar no entendimento do papel de B. thuringiensis no ambiente e da distribuição de genes cry. Assim, o trabalho de FEITELSON et al. (1992) propôs que espécies de insetos e linhagens de B. thuringiensis vêm coevoluindo. Seguindo a mesma corrente de pensamento, BRAVO et al. (1998) demons- traram que alguns genes cry foram distribuídos diferentemente em algumas regiões geográficas analisadas. A variabilidade genética entre diferentes isola- dos de B. thuringiensis foi estudada principalmente através da utilização de técnicas que tem como base a PCR. Estas técnicas apresentam aplicações tais como a determinação da persistência da bactéria no ambiente (BOURQUE et al., 1993) e a predição da ativi- dade tóxica de uma linhagem através da determina- ção do conteúdo de genes cry, muitas vezes eviden- ciando a presença de genes desconhecidos e, direcionando os trabalhos de bioensaio (SAUKA et al., 2006; IBARRA et al., 2003; BRAVO et al., 1998; CERÓN et al., 1994; 1995; CHAK et al., 1994; KALMAN et al., 1993; CAROZZI et al., 1991). Na busca por novos genes cry, várias coleções de linhagens de B. thuringiensis foram avaliadas (BERÓN; SALERMO, 2006; JARA et al., 2006; KIM, 2000; ZHANG et al., 2000; BRAVO et al., 1998; BEN-DOV et al., 1997), mas poucas contemplaram amostras brasileiras (VILAS- BÔAS; LEMOS, 2004; IBARRA et al., 2003). Levando-se em consideração o fato de que o Brasil é um país que apresenta regiões com clima tropical e subtropical, contendo uma rica diversidade biológica, espera-se encontrar uma alta diversidade de isolados em solos brasileiros. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar geneticamente 1.073 isolados de B. thuringiensis, com ênfase principal na análise dos tipos de genes cry1 apresentados pelos isolados. 407Bacillus thuringiensis: diversidade gênica em isolados lepidoptera-específicos. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414, out./dez., 2008 MATERIAL E MÉTODOS Linhagens bacterianas Foram analisados 1.073 isolados de B. thuringiensis obtidos de vários pontos do território brasileiro, cedi- dos pelo Prof. Dr. Sérgio Batista Alves, do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos (Depto. de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP), Piracicaba, SP, pelo Dr. Edílson Paiva (Núcleo de Biologia Aplicada da EMBRAPA Milho e Sorgo) Sete Lagoas, MG, e pelo Prof. Dr. Manoel Victor Franco Lemos (Depto. de Biologia Aplicada a Agropecuária), FCAV/UNESP, Jaboticabal. Todos os isolados encontram-se em estoques no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada na FCAV/UNESP - Jaboticabal. Extração de DNA Os isolados de B. thuringiensis foram previamente cultivados em placas contendo meio NA sólido, por 12h a 30° C. Para cada isolado uma colônia foi ressuspendida em 1mL de água estéril em tubos de microcentrífuga e o material genético foi extraído utilizando-se o Kit InstaGene Matrix (Bio-Rad), con- forme instruções do fabricante. As amostras de DNA obtidas foram estocadas em freezer -20° C e mantidas até a utilização. Construção dos oligonucleotídeos iniciadores Os oligonucleotídeos iniciadores foram elabora- dos a partir das regiões conservadas das seqüências correspondentes à cada uma das 16 subclasses do gene cry1 para a ordem Lepidoptera, obedecendo à lista de nomenclaturas das delta-endotoxinas de B. thuringiensis que são atualizadas constantemente e publicadas no site http://www.lifesci.sussex.ac.uk/ home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html. Para o ali- nhamento de todas as seqüências de cada subclasse utilizou-se o programa Clustal W (THOMPSON et al., 1994) e o programa Gene Runner 3.0 (Hastings Software, Inc.) para a elaboração dos iniciadores. Para algumas das subclasses cry1 foram elaborados iniciadores também a partir de regiões não conserva- das pela MWG (Ebersberg, Alemanha) e pela Bio Synthesis (Lewisville, EUA). Comprovação da presença de gene cry1 nos iso- lados Para a confirmação da presença de genes cry1 nos isolados utilizou-se o par de iniciadores gerais, deno- minado Gral-cry1, segundo BRAVO et al. (1998). Após as amplificações, as eletroforeses foram rea- lizadas segundo SAMBROOK ; RUSSEL (2001). Identificação de subclasses do gene cry1 A identificação das subclasses do gene cry1, nos isolados de B. thuringiensis estudados, foi realizada para 16 subclasses (Tabela 1). Para tanto, as reações de amplificação foram conduzidas, basicamente, nas mesmas condições realizadas para a verificação do gene cry1, anteriormente mencionado. Modificações ocorreram na temperatura de pareamento, para alguns iniciadores, conforme apresentados na Tabela 1. Tabela 1 - Seqüências dos iniciadores para o gene cry1 e suas subclasses analisadas. Iniciador Seqüências(5´-3´) Produto Temperatura Amplificado (pb) Pareamento (°C) cry1Aa conservada ATTTCCTTGTCGCTAACGC´ 426 50 CCAAACACTGAAACATCTCTC´ cry1Aa não conservada TTCGCATCATTTCTCCTTAG 1035 50 CTGTCCACGATAAATGTTCC´ cry1Ab conservada GAGATGTTTCAGTGTTTGGAC 799 50 GTCCCGTCAAGAACAGATAG cry1Ab não conservada CGGGTAATCGCTCGTCTATC 640 50 CTTACTTCTCGCCCATTATCC cry1Ac conservada GGTGCTGGATTTGTGTTAGG 712 50 TTCTTTCTATGCCCTGAGCC cry1Ad conservada GAGATGTTTCAGTGTTTGGAC 750 50 GCTGGCACACTATTATCCTG Continua... 408 A.M. Guidelli-Thuler et al. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414 out./dez., 2008 RESULTADOS Dos 1.073 isolados de B. thuringiensis submetidos à análise, 11,4% eram da coleção da UNESP- Jaboticabal, 28,9% da ESALQ-Piracicaba e 59,7 % da EMBRAPA-Sete Lagoas, sendo as amostras coletadas de solo urbano, solos não cultivados e cultivados com cereais, hortícolas e frutíferas, silagem, insetos mor- tos, poeira acumulada em produtos estocados (cere- ais como milho, sorgo etc.), entre outros em diferentes estados do Brasil. Os isolados das coleções foram previamente ca- racterizados em seus locais de origem como sendo B. thuringiensis, após minuciosa observação microscó- pica para a constatação da presença de inclusões cristalinas. Mesmo assim, uma amostragem realiza- da nas coleções da ESALQ - Piracicaba e EMBRAPA - Sete Lagoas foi submetida novamente à análise microscópica antes que elas integrassem o novo banco. Na nova análise foi confirmada a presença de cristais protéicos, portanto, todas as 1.073 amostras foram devidamente etiquetadas e estocadas no LGBBA (UNESP-Jaboticabal). Com a confirmação específica dos isolados de B. thuringiensis procedeu-se à extração de DNA total em quantidade e qualidade adequadas para as reações de amplificação. Essas amplificações para regiões de cada subclasse do gene cry1 para alguns dos isolados da coleção podem ser observadas na Figura 1. Na Figura 2 observa-se a distribuição das 16 subclasses do gene cry1, mais a família de genes cry1, na coleção de isolados da UNESP - Jaboticabal. Nota- se que as porcentagens de isolados de B. thuringiensis para cada subclasse foi relativamente alta em sua maioria, nesta coleção. Assim, 55,7% dos isolados Tabela 1 - Continuação Iniciador Seqüências(5´-3´) Produto Temperatura Amplificado (pb) Pareamento (°C) cry1Ae conservada GCTCTTACAACCGCTATTCC 838 50 TATTATCCTGTGGTGGTATTTC cry1Af conservada CCTTACAACCGCTATTCCTC 729 50 GTCCCGTCAAGAACAGATAG cry1Ag conservada GAACAGTGCCCTTACAACCG 558 50 GTGGTTATTTGATGCCCTGAC cry1Bb conservada CTTGTGTGTAGCCGAGGTG 484 50 TGCGTCTCTCAATAATAATAGG cry1Bc conservada TATTGGGCGTATTAGGTGTG 401 52 TGCGTCTCTCAATAATAATAGG cry1Be conservada TAGGGATACGGCTCTTGCTC 742 54 CGATTCAAGTCTATGTCCCAC cry1Bf conservada AACAAACGAGAGATTATTCCG 715 50 CGTTCTGTTGTTTCTGGTGG cry1Ca conservada TGGTCAACTAACAAGGGAAG 393 50 TCTACTCCTTCAACACCACG cry1Ca não conservada AGAGCGGAGAAGAAGTGGAG 559 50 CTTCCTCTTCTACACAGTTGC cry1Da conservada GAAGGGAAGGAAATACAGAGC 670 50 GTTATTGGAGTGAAGAGTGTTG cry1Db conservada TTTATCCGTTTATGTTCAGGC 600 50 GATGCGGAAATAGTTACGGG cry1Ea conservada GAACTCAGCCATTAGAAGCC 609 48 CCTCCTGTAAATCCTGGTCC cry1Fa não conservada AATGTAGAGCCGTTTGTTAGTG 595 50 CCCTCAAGTTATTTAGACCTG 409Bacillus thuringiensis: diversidade gênica em isolados lepidoptera-específicos. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414, out./dez., 2008 reagiram com o par de iniciadores gerais Gral cry1, e as subclasses cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad, cry1Ae, cry1Af, cry1Ag, e cry1Bf, cry1Ca e cry1Fa estão presen- tes em alta proporção de isolados, variando de 43,4% a 54,9%. Para as subclasses cry1Aa, cry1Ab, cry1Ca e cry1Fa, foram observados os maiores números de isolados, quando utilizados os iniciadores provenientes de regiões não conservadas. Para as subclasses cry1Ca verificou-se diferença marcante quando utilizados iniciadores de regiões conservadas (8,2% dos isola- dos) em relação aos iniciadores para regiões não conservadas (54,1% dos isolados) (Fig. 2). Provavelmente, os iniciadores elaborados a partir de regiões não conservadas poderiam amplificar maior número de diferentes genes desta subclasse, visto que, para a subclasse cry1Aa, por exemplo, há várias sub- divisões: cry1Aa1, cry1Aa2, cry1Aa3 etc. Menores por- centagens foram obtidas para as subclasses cry1Bb, cry1Bc, cry1Be, cry1Da, cry1Db e cry1Ea. Verificou-se que a coleção da UNESP - Jaboticabal é muito rica em isolados portadores de genes para a subclasse cry1A, sugerindo uma tendência de manu- tenção dessa proporção de isolados nas análises futuras com os demais genes desta subclasse. O fato de 55,7% dos isolados, na coleção, serem portadores do gene cry1 indica sua aplicabilidade em programas de controle de pragas da ordem Lepidoptera. Deve-se ressaltar que alguns isolados não apre- sentaram amplificação para a família cry1, com o par de iniciadores gerais Gral cry1, mas apresentaram para uma ou outra subclasse. Sugere-se, então, que estes iniciadores não são tão gerais e que nem todas as subclasses do gene cry1 foram contempladas e alinhadas por BRAVO et al. (1998), quando da elabora- ção desse par de iniciadores. O que se confirma pela crescente descoberta de novos genes cry1, agregados constantemente aos bancos de dados de seqüências. Na coleção da ESALQ - Piracicaba (Fig. 3) nota-se que a distribuição das subclasses seguiu um perfil muito próximo ao da coleção de Jaboticabal, porém, com porcentagens menores de isolados dentro de cada subclasse. Observou-se, nesta coleção, amplificação em 42,6% dos isolados com os iniciadores gerais Gral cry1, mas dentre estes, 4,5; 4,2 e 3,2% dos isolados não apresen- taram amplificação para as subclasses cry1Ab, cry1Ae e cry1Ag, respectivamente (Fig. 3). Houve baixa porcentagem de isolados (14,5%) portadores da subclasse cry1Ad, quando comparada à coleção de Jaboticabal (43,4%). No entanto, a subclasse cry1B, continuou sendo a menos abundan- te seguida da subclasse cry1D. Para a subclasse cry1Ca, o par de iniciadores para a região não conservada apresentou maior porcenta- gem de isolados (41,9%), como na coleção da UNESP - Jaboticabal (Fig. 2), contra 0,3% para os iniciadores da região conservada. Comparando-se a coleção da ESALQ - Piracicaba (Fig. 3) à coleção da UNESP - Jaboticabal (Fig. 2), maior porcentagem (36,1%) de isolados apresentou a subclasse cry1Ea, enquanto a proporção de isolados contendo cry1Fa foi menor (33,9%). A coleção da ESALQ - Piracicaba constitui-se tam- bém em excelente fonte de isolados efetivos no contro- le biológico de insetos da ordem Lepidoptera. No entanto, não se descarta a possibilidade de que os isolados das coleções referidas apresentem amplifi- cação para as outras subclasses do gene cry1, ou para outras famílias específicas para outras ordens de insetos. A coleção da EMBRAPA - Sete Lagoas apresentou um perfil de distribuição das subclasses estudadas totalmente diferente das outras duas coleções (Fig. 4). Apesar de ser a coleção com maior número de isolados (641), foi a que apresentou a menor porcentagem de isolados portadores da subfamília cry1A, considera- da a mais comum entre os isolados de B. thuringiensis. Apenas 18,6% dos isolados desta coleção apresenta- ram amplificação para o gene cry1 com os iniciadores gerais, e somente para a subclasse cry1Ab, com inici- adores para região conservada, é que houve maior porcentagem de isolados (38,5%). A distribuição de isolados portadores da subclasse cry1B, no entanto, apresentou-se mais evidente que nas outras coleções (17 a 19% dos isolados) (Fig. 4). Esta coleção apresenta um conjunto peculiar de iso- lados caracterizando um banco que deve ser intensa- mente explorado, visto que estes isolados de B. thuringiensis podem ser portadores de outras famílias de genes cry, bem como de outras subclasses com diferentes espectros de atuação contra insetos pragas, ou mesmo vetores de doenças. Na Figura 5 pode ser observada a distribuição das 16 subclasses estudadas e da família cry1, conside- rando as três coleções conjuntamente, ou seja, a dis- tribuição dentro dos 1073 isolados de B. thuringiensis. Essa distribuição foi mais homogênea entre as subclasses, com maior porcentagem de isolados por- tadores dos genes cry1Ab (42,12%) e menor porcenta- gem de isolados que contém cry1Db (0,6%), verifican- do-se ainda que o banco de isolados de B. thuringiensis em estudo contempla todas as subclasses do gene cry1. A caracterização específica destes isolados, por PCR, produziu diferentes perfis (combinações) de genes cry1. Devido ao tamanho da coleção, os isola- dos foram agrupados de acordo com o número de subclasses cry1 exibido por cada um, conforme se observa na Figura 6, e pelas combinações mais fre- qüentes de genes cry1 encontradas nos isolados (Ta- bela 2). 410 A.M. Guidelli-Thuler et al. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414 out./dez., 2008 G FED CBA H I K LJ M N O P Q R P Fig. 1 - Eletroforeses evidenciando a amplificação para regiões de cada subclasse do gene cry1 para alguns dos isolados da coleção. A) cry1Aa conservada; B) cry1Aa não-conservada; C) cry1Ab conservada; D) cry1Ab não-conservada; E) cry1Ac conservada; F) cry1Ad conservada; G) cry1Ae conservada; H) cry1Af conservada; I) cry1Ag conservada; J) cry1Bb conservada; K) cry1Bc conservada; L) cry1Be conservada; M) cry1Bf conservada; N) cry1Ca conservada; O) cry1Ca não- conservada; P) cry1Db conservada; Q) cry1Ea conservada; R) cry1Fa conservada; S) cry1Da conservada. Apesar da maioria dos isolados ter apresentado uma ou mais subclasses do gene cry1, 42,2% deles (453 isolados) não apresentaram amplificação para nenhuma delas. Cerca de 20% apresentaram uma das 16 subclasses analisadas, sendo a cry1Ab a mais predominante. Isolados que amplificaram de 9 a 13 genes consti- tuem 22,2% dos isolados, sendo que a maioria apre- senta os perfis de combinação de 10 e 11 subclasses. Ressalta-se aqui a presença de um isolado que apre- sentou amplificação para 14 subclasses, não amplifi- cando apenas para os genes cry1Ae, cry1Be e cry1E. Um número mais reduzido (10%) apresentou perfis contendo de três a oito subclasses. DISCUSSÃO Poucos estudos têm relatado uma caracterização de- talhada de coleções de B. thuringiensis em termos de conteúdo de gene cry (BEN-DOV et al., 1996; BRAVO et al., 1998; CHAK et al., 1994; FERRANDIS et al., 1999; URIBE et al., 2003). Simone Retângulo Simone Texto digitado Simone Texto digitado Simone Texto digitado Simone Texto digitado s 411Bacillus thuringiensis: diversidade gênica em isolados lepidoptera-específicos. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414, out./dez., 2008 Tabela 2 - Combinações (perfis) mais freqüentes de genes cry1, e seus respectivos isolados, encontradas nesse estudo. Combinação de genes cry1* Isolados nº de isolados 1,2,3,4,5,6,7,8,9,12,13,17 Br69, Br78, Br82, Br83, Br87, Br91 6 1,2,3,4,5,6,7,8,12,13,16,17 Br45, Br61, Br64, Br72, Br86, Br90, R203, R205, R206, R219, R220, R221, 14 R227, R230 1,2,3,4,5,6,7,8,12,13,17 Br8, Br9, Br10, Br11, Br12, Br16, Br17, Br58, Br70, Br71, Br84, Br93, 21.5A, 18 SP1, SP8, SP14, MT4, AM2 1,2,3,4,5,6,7,8,12,17 MS9, MS10, PR5, PR6, PR11, MT1, MT3, RS1 8 1,2,3,4,6,7,8,12,13,16,17 Br46, Br48, Br60, Br74, R120, R122, R140, R146, R149, R157, R158, R161, R162, R165, R166, R168, R177 R180, R181, R182, R184, R193, R199, R223, 26 R224, R228 1,2,3,4,6,7,8,12,13,16 R25, R26, R27, R33, R54, R70, R73, R75, R77, R81, R83, R84, R144 13 1,2,3,4,6,7,8,13,16,17 R232, R233, R235, R240, R248, R249, R254, R258, R259 9 1,2,3,4,6,8,12,13,16,17 R144, R148, R155, R156, MS4 5 1,2,3,6,7,8,12,13,16,17 R121, R123, R125, R139, R164, R169 6 1139 H, 1140B, 1140C, 1150C, 939FB, 939FC, 1119A, 1119C, 1134B, 1134C, 1,2,3,9,10,11,12,13,14,16,17 1136C, 1136B, 1136B, 1138A 1119C, 1139D, 1036C, 1124E, 1128, 1129A, 23 1130D, 1132A, 1130C 1,2,9,10,11,12,13,14 E28, E39, 41.7L, 42.7L, 43.7L, 44.7L, 45.7L, 47.7L 8 1,3 858B2, 933D3, 939E, 939G, 939N, 939S, 940B, 940I, 961B, 965A, 972A, 13 1010D, 1043N-N 1,9,10,11,12,13,14,15 E42, E43, E44, E45, E46, E47, E48, E49, E50 9 1 937BF, 944B, 1008B, 1009A, 1043I 5 3,16 R208, R209, R210, R213, R215, 842C, 862CF1, 889GG, 890BA, 890BB, 941L, 22 946H, 946JR, 946L, 957A, 964A, 964C, 965C, 969B, 977F, 999, CST23 884A3B, 1120D, R170, R265, 702, 846J, 851C, 857 AC2, 857B, 858AB4, 858AB5, 858B1, 868C1, 868C2, 868C3, 868C5,868C8, 884A1.C, 884A3.D, 884A3.E, 884A3.G, 887AA, 927A2, 927A3, 927A4, 927A6, 927A7, 927A7.10, 927A9, 927A9.1, 927A9.5, 927A9.7, 927A9.8, 927A9.12, 927A9.13, 927A9.17, 927A9.19, 927C, 927F, 927G, 927N, 927K, 933A, 933D2, 933D2A, 933D2B, 933D2D, 933D2E, 933D2F, 933D2G, 933D2H, 933F, 933L, 937C, 937K, 938A, 938E, 939, 3 939A, 939B, 939C, 939D, 939D3, 940C, 940CI, 940H, 940J, 941CC, 941CD, 128 941CG, 941CO, 941CF, 941I, 941K, 941M, 943B, 945D, 945E, 946B, 946F, 946JO, 947A, 948, 948F, 951AG, 951B, 952B, 952C, 955A, 957BB, 957BJ, 957BB, 957BJ, 957BK, 963, 964B, 964D, 965, 965E, 972C, 972CA, 974C, 976B, 976C, 977D, 981, 986H, 986L, 986N, 987B, 993, 1001A, 1007, 1059A, 1060C, 1060D, 1061C, 1063D, 1066B, 1067B, 1067D, 1067I, 1068E, 1068F, 1071, 1072, 1123D, 1148D 6 E27, S497, R49, R98, R113, R114, R116, 118, R126, R128, R129, MBT 12 9 S251, S284, S350, S1349, R2, R35, R52, 69.24A, S385, 854, 1133A 11 10 S98, R12, R62, R64, R66, R71, R72, R90, 1033I, 1034D, 970F, 977B 12 12 970, S75, 815C, 816, 856A, 868A, 878A, 1062C 8 16 R160, R171, R196, R197, R198, R201, R225, R274, 933C, 933K, 937F, 937I, 23 948C, 960, 965M, 971H, 978ª 1073B, CST Seiva, Seiva, 106.12A, E13, 6.7L *1: gral cry1; 2: cry1Aa: 3: cry1Ab; 4: cry1Ac; 5: cry1Ad; 6: cry1Ae; 7: cry1Af; 8: cry1Ag; 9: cry1Bb ; 10: cry1Bc; 11: cry1Be ; 12: cry1Bf; 13: cry1Ca; 14: cry1Da; 15: cry1Db ; 16: cry1Ea; 17: cry1Fa; 18: cry1Fb. 412 A.M. Guidelli-Thuler et al. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414 out./dez., 2008 CHAK et al. (1994), trabalhando com amostras de solos provenientes de Taiwan, obtiveram 225 isola- dos dos quais 221 (98,2%) continham genes cry1. Destes, somente cinco diferentes perfis de genes cry foram encontrados usando iniciadores específicos para cry1, cry3, e cry4. Nenhum dos isolados apresen- tou genes cry3. BEN-DOV et al. (1996), quando analisa- ram 215 isolados obtidos de amostras de Israel, pelo uso de iniciadores gerais e específicos para genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry7, e cry8, encontraram genes cry1 representados por 16 diferentes perfis. BRAVO et al. (1998) relataram que, de um total de 496 isolados obtidos de diferentes ecossistemas no México, 246 isolados (49,6%) continham genes cry1 apresentando 35 diferentes perfis usando iniciadores específicos para genes cry1, cry3, e cry7. Também FERRANDIS et al. (1999), na Espanha, verificaram que, de 223 isolados de B. thuringiensis, 121 (54,3%) continham gene cry1, e encontraram ainda 16 diferentes perfis nesses isola- dos após terem realizado análises com os iniciadores para os genes cry1, cry2 e cry4. O presente estudo relata 16 diferentes subclasses do gene cry1 em 621 dos 1.073 isolados em estudo, provenientes de diferentes ecossistemas no Brasil, usando iniciadores específicos para os genes cry1. A grande variabilidade e distribuição de B. thuringiensis nos estudos em diversos países sugerem que as dife- renças ecológicas do local de origem e/ou as relações de co-evolução tenham favorecido a expressão de diferentes padrões de genes cry1. CHAK et al. (1994) e BRAVO et al. (1998) encontraram padrão similar e, em ambos os trabalhos, o perfil mais comum de gene cry1 correspondeu aos genes cry1Aa, cry1Ab e cry1Ac, o que pôde ser observado, também no presente estudo, nas coleções de Jaboticabal e Piracicaba, que apresentaram compor- tamento semelhante quanto à distribuição dos perfis de genes cry1. Ainda, CHAK et al. (1994) encontraram importante freqüência entre os perfis cry1Aa/cry1Ac e cry1C/cry1D em 21,3 e 17,7% dos isolados, respec- tivamente. No mesmo contexto, FERRANDIS et al. (1999) mostraram que 93% dos isolados com presença do gene cry1C continham o gene cry1D no seu genoma, sugerindo então, alta ligação genética entre esses dois genes. Segundo SANCHIS et al. (1988), a linhagem padrão de B. thuringiensis subsp. Aizawai 7.29 contém genes cry1C e cry1D no mesmo replicon. As análises aqui apresentadas corroboram com esses autores, visto que nas três coleções, muitos isolados que apresenta- ram o gene cry1C também continham o gene cry1D (Tabela 2). Todos esses resultados indicam que os pares de genes mencionados encontram-se juntos na natureza, provavelmente fazendo parte do mesmo replicon, localizados em um megaplasmídeo (GONZÁLES et al., 1982; SANCHIS et al., 1988). A ocorrência conjunta de alguns desses cry pode minimizar problemas relacionados a inseticidas base- ados em B. thuringiensis, devido ao seu espectro de ação limitado quando comparado aos inseticidas químicos. Este é um fator limitante já que as culturas agrícolas são atacadas simultaneamente por diferentes pragas e, às vezes, por insetos de diferentes ordens. Portanto, uma importante característica encontrada neste estudo é a presença de mais que um gene cry1 na maioria dos isolados (Fig. 6). De 621 isolados, 399 apresentaram duas ou mais subclasses do gene cry1. No entanto, deve-se ressaltar que, para alguns genes cry1, os inici- adores elaborados podem ter amplificado mais de uma subclasse, por estarem em uma região de homologia entre elas, levando a um número superestimado de genes em alguns isolados; como exemplo, o isolado que apresentou 14 subclasses (Fig. 6). Isso só poderia ser verificado através do seqüenciamento dos produtos amplificados e comparação com as seqüências deposi- tadas no banco de dados. Há alguns genes cry que são comumente identifi- cados em todas as coleções do mundo, tais como os genes cry1; e outros são mais freqüentes em uma região que em outra. Por exemplo, os genes cry1A, cry1C, cry1D e genes cry2 foram mais comumente encontrados em isolados da Ásia (BEN-DOV et al., 1997; KIM, 2000; ZHANG et al., 2000) que naqueles da América Latina (BRAVO et al., 1998). O mesmo não ocorreu neste trabalho, onde cry1A e cry1C apresentaram alta fre- qüência. A variabilidade gênica nas coleções analisadas destaca as coleções de Jaboticabal e Piracicaba, como fonte de isolados promissores para uso em programas de Controle Biológico de pragas da ordem Lepidoptera, diferentemente do observado para a coleção da EMBRAPA - Sete Lagoas, na qual as freqüências das subclasses estudadas foram relativamente baixas (abaixo de 20%), com destaque somente para o gene cry1Ab, presente em 38,5% dos isolados desta coleção. Desde que a resistência a B. thuringiensis em popula- ções de insetos da ordem Lepidoptera tem sido relatada (FERRÉ et al., 1991; TABASHNIK, 1994), há um grande inte- resse no isolamento de novas linhagens de B. thuringiensis cujas propriedades tóxicas diferem daquelas já usadas como bioinseticidas. Os resultados obtidos aqui mos- tram que o Brasil apresenta-se como uma fonte potenci- almente rica em isolados de B. thuringiensis, mas a possibilidade em usar essas toxinas a partir de novos isolados requer ainda estudos mais detalhados. AGRADECIMENTOS À FAPESP pelo apoio financeiro. Ao Dr. Edílson Paiva (CNPMS/EMBRAPA) pelo envio dos isolados da coleção de Sete Lagoas. Bacillus thuringiensis: diversidade gênica em isolados lepidoptera-específicos Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.75, n.4, p.405-414, out./dez., 2008 Fig. 2 - Distribuição das subclasses do gene cry1 nos isolados da Coleção da UNESP - Jaboticabal. Fig. 3 - Distribuição das subclasses do gene cry1 nos isolados da Coleção da ESALQ - Piracicaba. Fig. 4 - Distribuição das subclasses do gene cry1 nos isolados da EMBRAPA - Coleção de Sete Lagoas. Fig. 5 - Distribuição das 16 subclasses do gene cry1 (iniciadores específicos) e cry1 (iniciadores gerais) presentes na coleção de isolados de B. thuringiensis em estudo. Fig. 6 - Número de subclasses do gene cry1 presentes nos isolados da coleção em estudo. REFERÊNCIAS ALVES, S.B. Controle Microbiano de Insetos. In: Crocomo, W.B. Manejo integrado de pragas, São Paulo, Editora Unesp, 1990, p.147-176. 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