Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química de Araraquara Estudo químico e biológico de plantas da família Eriocaulaceae Marcelo Aparecido da Silva Araraquara 2008 MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 2 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química de Araraquara Estudo químico e biológico de plantas da família Eriocaulaceae Aluno: Marcelo Aparecido da Silva Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Araraquara 2008 Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como requisito para obtenção do título de Doutor em Química. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 3 FICHA CATALOGRÁFICA Silva, Marcelo Aparecido da S586e Estudo químico e biológico de plantas da família Eriocaulaceae / Marcelo Aparecido da Silva. – Araraquara : [s.n], 2008 157 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Wagner Vilegas 1. Produtos naturais. 2. Cromatografia contracorrente. 3. Sempre vivas - Eriocaulaceae. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 4 MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 5 Súmula curricular 1. Dados pessoais Nome: Marcelo Ap. da Silva Filiação: Paulo Roberto da Silva e Cinira Ap. Camolezi da Silva Naturalidade: Pitangueiras SP E-mail: marcamosilva@yahoo.com.br 2. Formação acadêmica Graduação Instituição: Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas. Local: Alfenas MG. Curso: Farmácia – Modalidade Fármacos e Medicamentos. Período: 1997 – 2001. Pós-graduação: Mestrado Instituição: Universidade Paulista “Julio de Mesquita Filho”, UNESP, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Mestre em Ciências Farmacêuticas – Área de concentração: Fármacos e Medicamentos. Titulo da dissertação: Estudo químico e biológico de Strychnos pseudoquina (Loganiaceae). Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Bolsista: CAPES (período 07/2002 – 11/2003) Local: Araraquara SP Periodo: 03/2002 – 11/2003 Doutorado Instituição: Universidade Paulista “Julio de Mesquita Filho”, UNESP, Instituto de Química. Titulo da tese: Estudo químico e biológico de plantas da família Eriocaulaceae. Orientador: Prof. Dr. Wagner Vilegas Bolsista: CAPES (período 01/2006 – 07/2008) Local: Araraquara SP Período: 08/2004 – 07/2008 3. Atuação profissional -) Bolsista didático da disciplina de Botânica, curso de farmácia-bioquímica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, Araraquara SP, 06/2005 – 12/2005. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 6 -) Responsável pela disciplina de Bioativos de origem vegetal, curso de farmácia, Faculdade Santa Giulia, Taquaritinga SP, 01/2005 – 07/2006. -) Responsável pela disciplina de Farmacobotânica, curso de farmácia, Faculdade Santa Giulia, Taquaritinga SP, 01/2005 – 07/2006. -) Responsável pela disciplina de Farmacognosia II, curso de farmácia, Faculdade Santa Giulia, Taquaritinga SP, 01/2005 – 07/2006. -) Responsável pela disciplina de Farmacognosia I, curso de farmácia, Faculdade Santa Giulia, Taquaritinga SP, 01/2005 – 07/2006. -) Responsável pela disciplina de Botânica I, curso de ciências biológicas, Faculdade Santa Giulia, Taquaritinga SP, 07/2004 – 12/2004. 4. Publicações 1) Silva, M.A.; Sumitami, L. S. A.; Vilegas, W.; Santos, L. C. Compostos fenólicos e atividade antioxidante de Leiothrix flavescens (Bong) Ruhland (Eriocaulaceae). Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. 28 (3): 319-324, 2008. 2) Silva, M.A.; Oliveira, A.P.S.; Sannomiya, M.; Sano, P.; Varanda, E.A.; Vilegas, W.; Santos, L.C. Flavonoids and a naphthopyranone from Eriocaulon ligulatum and their mutagenic activity. Chemical Pharmaceutical Bulletin. v. 55, n. 11, p. 1635-1639, 2007. 3) Sannomiya, M.; Figueiredo, M.E.; Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Santos, L.C.; Souza-Brito, A.R.M.; Vilegas, W. Preparative isolation of a nove flavonoids from na infusion of Byrsonima basiloba leaves by high-speed-counter-current chromatography. Natural Product Communications. v. 2, n. 8, p. 829-834, 2007. 4) Santos, F.V.; Colus, I.M.S.; Silva, M.A.; Vilegas, W.; Varanda, E.A. Assessment of DNA damage by extracts and fractions of Strychnos pseudoquina, a Brazilian medicinal plant with antiucerogenic activity. Food and Chemical Toxicology. v. 44, p. 1585-1589, 2006. 5) Rinaldo, D.; Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Calvo, T.R.; Sannomiya, M.; Santos, L.C.; Vilegas, V. Fast Preparative separation of flavonoids from the aerial parts of Davilla elliptica by high-speed counter-corrent chomatography. Química Nova. v. 29, n. 5, p. 947-949, 2006. 6) Figueiredo, M.E.; Michelin, D.C.; Sannomiya, M.; Silva, M.A.; Santos, L.C.; Almeida, L.F.R.; Souza-Brito, A.R.M.; Salgado, H.N.; Vilegas, W. Avaliação química e da atividade anti-diarréica MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 7 das folhas de Byrsonima cinera DC. (Malpighiaceae). Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 41, n. 1, p. 79-83, 2005. 7) Santos, L.C.; Silva, M.A.; Rodrigues, C.M.; Rodrigues, J.; Rinaldo, D.; Sannomiya, M.; Vilegas, W. Fast preparative separation of flavones from capitula of Eriocaulon ligulatum (Vell.) L.B.Smith (Eriocaulaceae) by high-speed countercurrent chromatography (HSCCC). Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v. 26, n 2, p. 101-103, 2005. 8) Santos, L.C.; Rodrigues, C.M.; Silva, M.A.; Coelho, R.G.; Sannomiya, M.; Vilegas, W. Chemical profile of Eriocaulon ligulatum (Eriocaulaceae). Biochemical Systematic and Ecology. v. 33, p. 1159-1166, 2005. 9) Silva, M.A.; Rafacho, B.P.M.; Hiruma-Lima, C.A.; Rocha, L.R.M.; Santos, L.C.; Sannomiya, M.; Souza-Brito, A.R.M.; Vilegas, W. Evaluation of Strychnos pseudoquina ST. Hil. leaves extract on gastrointestinal acitivity. Chemical Pharmaceutical Bullettin. v. 53, n. 8, p. 881-885, 2005. 10) Silva, M.A.; Hiruma-Lima, C.A.; Sannomiya, M.; Souza-Brito, A.R.M.; Santos, L.C.; Vilegas, W. Strychnos L. da América do Sul e Central. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 15, n. 3, p. 256-267, 2005. 11) Sannomiya, M.; Fonseca, V.B.; Silva, M.A.; Rocha, L.R.M.; Santos, L.C.; Hiruma-Lima, C.A.; Souza-Brito, A.R.M.; Vilegas, W. Flavonoids and antiulcerogenic activity from Byrsonima crassa leaves extracts. Journal of Ethnopharmacology. v. 97, p. 01-06, 2005. 5. Publicação didática -) Publicação do livro “Cromatografia em Contracorrente”. Autores: Marcelo Ap. da Silva; Wagner Vilegas e Lourdes Campaner dos Santos. Publicado pela Editora do Instituto de Química de Araraquara em 2008 (1º Edição). ISBN 978-85-60322-03-9. 6. Trabalhos submetidos à publicação 1) High-Performance Liquid Chromatography Quantification of Flavonoids in the Eriocaulaceae Genus and the Antimicrobial Activity. Autores: Marcelo Ap. da Silva; Claudia A. Lima Cardoso; Lourdes C. dos Santos e Wagner Vilegas. Phytochemical Analysis, 2008, submetido. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 8 2) Effect of methanolic extract of leiothrix flavescens on rodent gastrointestinal tract. Autores: Thiago M. Moraes; Marcelo Ap. da Silva; Clenilsom M. Rodrigues; Lourdes C. dos Santos; Miriam Sannomiya; Lucia R. M. Rocha; Alba R. M. S. Brito; Wagner Vilegas, Clélia A. Hiruma-Lima. Phytoterapia Research, 2008, submetido. 3) Liquid chromatographic/electrospray ionization tandem mass spectrometric study of the chemical composition of Eriocaulon ligulatum (Vell.) L.B.Smith (Eriocaulaceae) Autores: Marcelo Ap. da Silva, Lourdes C. dos Santos, Clenilson M. Rodrigues, Virginia Carbone, Angela Mari, Susel Anapoli, Sonia Piacente, Cosimo Pizza e Wagner Vilegas. Artigo em fase de reestruturação. 7. Participação em eventos científicos Participamos de 12 eventos internacionais e 24 eventos nacionais, com a apresentação de 36 resumos, todos em forma de pôsteres. 8. Orientações 1) Orientação da bolsista técnica Danielle Cristina Baldo, estudante do curso de Farmácia- Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas-UNESP, no período de Janeiro de 2006 a Junho de 2007, onde desenvolveu o projeto intitulado “Uso sustentável da biodiversidade brasileira avaliação químico-farmacológica de plantas superiores”. A aluna foi bolsista FAPES durante a realização do treinamento (processo: 06/51043-8). 2) Colaborou na orientação no desenvolvimento da monografia da aluna Juliana Sayuri de Araújo Sumitani, estudante do curso de Bacharelado em Química do Instituto de Química de Araraquara, no período de Dezembro de 2006 a Dezembro de 2007, onde desenvolveu o projeto intitulado “Estudo química de eriocaulaceae - capítulos de Leiothrix spiralis e Leiothrix flavescens”. A aluna foi bolsista CNPq durante a realização da monografia. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 9 Quero falar de uma coisa Adivinha onde ela anda Deve estar dentro do peito Ou caminha pelo ar Pode estar aqui do lado Bem mais perto que pensamos A folha da juventude É o nome certo desse amor Já podaram seus momentos Desviaram seu destino Seu sorriso de menino Quantas vezes se esconderam Mas renova-se a esperança Nova aurora a cada dia E há que se cuidar do broto Pra que a vida nos dê flor e fruto Coração de estudante Há que se cuidar da vida Há que se cuidar do mundo Tomar conta da amizade Alegria e muito sonho Espalhados no caminho Verdes, plantas e sentimento Folhas, coração, juventude e fé. Milton Nascimento MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 10 Aos meus pais, Paulo e Cinira, Que sempre me apoiaram nas horas incertas com paciência e muita sabedoria, me mostraram as lições que não se aprendem na escola. Muito obrigado, Pai e Mãe, pelo amor e confiança que sempre depositaram em mim. As minhas irmãs, Margareth e Maria Amália , Pelo carinho, amizade, compreensão, amor e apoio. Obrigado. Ao meu tio João, Pelas muitas palavras sábias proferidas. Pelos exemplos de luta e perseverança naquilo que acreditamos. Muito obrigado Tio. Às minhas Avós e aos meus Avôs, Não vou fingir que parou de doer, mas um dia isto vai passar. Eu não consigo me convencer, que essa vida não foi injusta. Tanta falta me faz vocês... Queria ver vocês lá em casa... Dedico esse trabalho com muito carinho MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 11 Agradecimentos Em especial ao meu orientador e amigo Wagner Vilegas pela oportunidade oferecida desde o início, ensinando-me os primeiros passos na química de produtos naturais. Lembra Wagner, quando você me ensinou como montar a minha primeira coluna cromatográfica durante o mestrado... Depois, me ofereceu a oportunidade de realizar o doutorado. Obrigado pela confiança depositada durante todos esses anos de trabalho que estivemos juntos. Além de orientador você foi é será, sempre um grande amigo. À professora Lourdes, a grande amiga Lourdes, percebo que neste momento me faltam palavras para expressar tamanha gratidão por você Lourdes... Quero te dizer que “ Amigo é coisa pra se guarda debaixo de sete chaves, dentro do coração, assim falava a canção.....Amigo é coisa pra se guarda no lado esquerdo do peito, mesmo que o tempo e a distância digam não.....” Lourdes, obrigado pelo apoio, dedicação, paciência, pelos ensinamentos e por tantas outras coisas que você me proporcionou durante os anos de convivência. Muito Obrigado. Aos amigos e amigas de laboratório, Angélica (FCF-Botânica), Ana Carolina Benfatti, Ana Lucia, Adriana Moura, Carolina Gomes, Clenilson Rodrigues, Daniel Rinaldo, Danielle Baldo, Danielly, Fabio Andrade, Flávia, Felipe, Juliana Rodrigues, Juliana Severi, Juliana Sayuri, Miriam Sanommya, Micheli, Márcio Andreo, Roberta Coellho Tamara Calvo, Tiago Nakamura, Viviane Cândida, agradeço pela convivência. Obrigado a todos. Ao Professor e amigo Luis Vitor, da FCF-Unesp, pelas longas conversas enriquecedoras durante estes anos e também pela grande oportunidade de ministrar aulas de Botânica para o curso de Farmácia. Muito Obrigado. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 12 À Prof. Drª. Clélia A. Hiruma Lima e sua orientada Catharine Ferrazoli, do IB- Botucatu, Unesp, pelos ensaios de motilidade intestina, atividade gastoprotetoras e de toxicidade aguda realizados com as espécies. Obrigado, Clélia pela grande ajuda e amizade durante esses anos de trabalho. À Prof. Drª. Eliana Ap. Varanda e à Ana Paula de Oliveira, da FCF-Unesp, pela realização dos ensaios de mutagenicidade e pelas enriquecedoras discussões. Ao Prof. Dr. Paulo Sano, do IB-USP, pelas coletas e identificações das espécies de Eriocaulaceae. Obrigado, também, por me a apresentar à belíssima e cativante Serra do Cipó. À Drª. Virginia Carbone, do Centro de Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolare, Istituto di Scienze dell‛ Alimentazione, Avellino. Ao Prof Cosimo Pizza e à Profª. Sonia Piacente, da Universitá degli Studi di Salerno, pela realização dos experimentos de HPLC-MS. Ao Dr. Nivaldo Boralle, pelas realizações dos espectros de RMN e por seus valiosos ensinamentos. Aos demais professores do departamento de Química Orgânica do Instituto de Química de Araraquara, por todo o conhecimento transmitido durante suas aulas. À Profª. Drª. Claudia A. l. Cardoso, da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, pela colaboração no estudo dos extratos das espécies de Eriocaulaceae. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 13 À Profª. Drª. Alba R. M. Souza Brito, do departamento de Fisiologia e Bioquímica, Instituto de Biociências da Unicamp, pela amizade e ensinamentos durantes esses anos de convivência. A todos da biblioteca do IQ, pela ajuda e orientação durante a minha pós- graduação. A todos da seção de pós-graduação, pela ajuda e orientações prestadas. A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a conclusão deste trabalho. À Capes, Fapesp-Biota e CNPq pela ajuda financeira. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 14 Lista de abreviaturas n-BuOH n-Butanol n-PrOH n-Propanol CC Cromatografia em coluna CCC Cromatografia em contracorrente CCD Cromatografia em camada delgada comparativa CFCR Coleção da flora de campos rupestres d Dubleto dd Duplo dubleto DAINEs Droga antiinflamatória não esteroidal DCM Diclorometano d.i. Diâmetro interno DMSO d6 Dimetilsulfóxido deuterado DPPH 1,1-difenil-1-picril-hidrazila EtOAc Acetato de etila Ex - MeOH Extrato metanólico Ex - DCM Extrato diclorometânico Fr-BuOH Fração butanólica Fr-EtOAc Fração acetato de etila gCOSY Gradient correlate spectroscopy gHMBC Gradient heteronuclear multiple bond correlations gHMQC Gradient heteronuclear through multiple quantun coherence HPLC-UV-PDA High performance liquid chromatography-Ultraviolet visible-Photodiode array HPLC/MS High performance liquid chromatography-Mass spectrometry HPLC/ESI-IT-MS High performance liquid chromatography-Electrospray-Ion Trap-Mass spectrometry HSCCC High Speed Countercurrent Chomatography (cromatografia em contracorrente de alta velocidade) J Constante de acoplamento m Multipleto m/z Relação massa/carga MeOH Metanol NO Óxido nítrico NP/PEG Natural product/Polyethylenoglicol reagent Rf Fator de retenção RMN de 13C Ressonância magnética nuclear de carbono treze RMN de 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio Ss 1 Solvente CHCl3:MeOH:n-propanol:H2O (5:6:1:4), fase inferior Ss 2 Solvente CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20), fase inferior Ss 3 Solventes Hex:EtOAc (95:05) Ss 4 Solventes Hex:EtOAc (80:20) s Singleto T Tesla TFA Ácido trifluoracético TMS Tetrametilsilano TOCSY-1D Total correlation spectroscopy UV Ultravioleta Deslocamento químico v.o. Via oral MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 15 Sumário Resumo........................................................................................................................................................ 17 Abstract........................................................................................................................................................ 18 1. Eriocaulaceae.................................................................................................................................... 19 A família Eriocaulaceae.............................................................................................................................. 20 A química da família Eriocaulaceae............................................................................................................ 25 O gênero Eriocaulon................................................................................................................................... 27 O gênero Syngonanthus............................................................................................................................... 28 Foto das espécies de Eriocaulaceae estudadas nesse trabalho..................................................................... 30 Panorama químico das espécies pertencentes à família Eriocaulaceae....................................................... 31 2. Objetivos............................................................................................................................................. 36 3. Estudo químico................................................................................................................................. 38 Cromatografia em contracorrente de alta velocidade – HSCCC................................................................. 39 Escolha do sistema de solvente................................................................................................................... 42 Coleta do material vegetal e preparo dos extratos....................................................................................... 45 Estudo químico dos capítulos das espécies................................................................................................. 46 Estudo químico das frações obtidas de E. ligulatum................................................................................... 47 Purificação da fração acetato de etila (Fr-EtOAc) por HSCCC.................................................................. 47 Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) por HSCCC.......................................................................... 48 Fracionamento do Ex-MeOH usando cromatografia de permeação em gel................................................ 50 Análise do extrato diclorometânico (Ex-DCM).......................................................................................... 51 Estudo químico das frações obtidas de S. suberosus.................................................................................. 52 Purificação da fração acetato de etila (Fr-EtOAc) por HSCCC.................................................................. 52 Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) por HSCCC.......................................................................... 53 Perfil do extrato metanólico dos capítulos de Syngonathus spp.................................................................. 55 Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) por HSCCC.......................................................................... 57 4. Elucidação estrutural e identificação...................................................................................... 60 Identificação das substâncias isoladas das espécies de Eriocaulaceae........................................................ 62 Determinação estrutural de substâncias isoladas das espécies de Eriocaulaceae........................................ 65 Elucidação estrutural de El 3....................................................................................................................... 65 Elucidação estrutural de El 5....................................................................................................................... 79 5. HPLC-MS e FIA-EIS-IT-MS dos extratos das espécies de Erioculaceae.................. 90 Estudo do Ex-MeOH dos capítulos de E. ligulatum utilizando HPLC/MS................................................ 91 Análises por FIA-ESI-IT-MS dos extratos metanólicos de Syngonathus sp............................................... 103 6. Ensaios químicos e biológicos..................................................................................................... 110 Ensaios biológicos....................................................................................................................................... 111 Teste da toxicidade aguda e “screening” hipocrático.................................................................................. 111 MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 16 Motilidade intestinal.................................................................................................................................... 114 Avaliação da atividade gastroprotetora....................................................................................................... 115 Ensaio antioxidante com DPPH.................................................................................................................. 125 Quantificação de fenóis totais..................................................................................................................... 127 Avaliação da mutagenicidade...................................................................................................................... 130 7. Considerações finais....................................................................................................................... 140 8. Materiais e métodos........................................................................................................................ 144 9. Referências bibliográficas............................................................................................................ 149 MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 17 Resumo As Eriocaulaceae constituem uma família característica de monocotiledôneas pantropicais. Apesar de a maioria das espécies serem encontradas na América do Sul, principalmente nos “Campos Rupestres” brasileiros, ainda são poucos os estudos químicos e biológicos sobre essas plantas. Por isso, neste trabalho nós contribuímos para aprofundar o conhecimento a respeito dessa família, investigando plantas dos gêneros Eriocaulon (E. ligulatum) e Syngonanthus (S. suberosus e S. dealbatus). Os extratos foram preparados por maceração e/ou percolação com solventes orgânicos (hexano, diclorometânico e metanol). Em seguida, foram fracionados usando técnicas cromatográficas convencionais (colunas de sílica gel ou permeação em gel) ou cromatografia em contracorrente. As estruturas foram determinadas usando infravermelho, ultravioleta, técnicas mono- e bidimensionais de RMN, além de espectrometria de massas com fonte electrospray e analisador íon trap. A investigação química de E. ligulatum levou à identificação e elucidação de um novo flavonóide acilado (6,4’-dimetoxiquercetina-3-O-�-D-6’’[(E)-3,4,5-triidroxicinamato]glicopirano_ sídeo), uma nova naftopiranona dimérica (Eriocaulina), e de três flavonas (6-metoxiapigenina-7-O- �-D-glicopiranosídeo, 6-metoxiapigenina-7-O-�-D-alopiranosídeo e 6-metoxiapigenina). No estudo químico das espécies de Syngonanthus identificou-se flavonóides O- e C-glicosilados. O extrato metanólico bruto de E. ligulatum não demonstrou atividade tóxica em camundongos e exibiu promissor efeito gastroprotetor. O extrato bruto não foi mutagênico no teste de Ames, mas frações contendo apenas agliconas de flavonóides e/ou naftopiranonas foram mutagênicas para algumas cepas de Salmonella typhimurium. Este estudo químico também adiciona novos dados úteis para a discussão da complexa taxonomia de Eriocaulaceae. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 18 Abstract The Eriocaulaceae comprises a characteristic family of pantropical monocotyledons. Inspite most of the species are found in South America, mainly at the Brazilian “Campos Rupestres”, chemical and biological knowledge of these plants are still scarce. Thus, in this work we contributed to improve the knowledge about this family, investigating plants from the genera Eriocaulon (E. ligulatum) and Syngonanthus (S. suberosus and S. dealbatus). Extracts were prepared with organic solvents (hexane, dichloromethane and methanol). The methanol and dichloromethane extracts were fractionated and the isolated compounds were purified by several chromatographic techniques, including high speed countercurrent chromatography (HSCCC), silica gel column chromatography and gel permeation chromatography. Structures were determined by infrared and ultraviolet spectroscopy, as well as mono- and bidimensional NMR techniques, besides electrospray – ion trap – mass spectrometry. The chemical investigation of E.ligulatum led to the identification of the new acylated flavonoid 6,4’-dimethoxyquercetin-3-O-�-D-6’’[(E)-3,4,5-trihydroxy-cinnamate]glucopyranoside and a naphthopyranone dimer, named eriocauline, together with other known flavonoids, 6- methoxyapigenin-7-O-�-D-glucopyranoside, 6-methoxyapigenin-7-O-�-D-allopyranoside and 6- methoxyapigenin, while Syngonanthus species afforded mainly flavonoids O- and C-glicosides. Pharmacological assays demonstrated that the crude methanol extract of E. ligulatum did not present acute toxic effect in mice and that it displayed promising gastroprotective activity. The crude extract was not mutagenic in the Ames assay, but fractions containing only flavonoid aglycones and/or naphtopyranones were mutagenic to some Salmonella/microsome strains. The chemical data obtained in this work also added more data to the discussion of the complex taxonomy of Eriocaulaceae. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 19 1.Eriocaulaceae MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 20 Eriocaulaceae As plantas pertencentes à Eriocaulaceae são perenes e possuem tamanhos que variam de poucos centímetros a metros de altura. A família pertence à classe das monocotiledôneas. As monocotiledôneas são bem distintas, incluindo plantas como as gramíneas, orquídeas e as palmeiras (Raven et al, 2001). As Eriocaulaceae possuem distribuição pantropical, com cerca de 1200 espécies reunidas em onze gêneros (Tab. 1.1), segundo a proposta de Ruhland (1903), que é o mais consistente e ainda se encontra em vigor nos dias atuais. Cabe destacar que Ruhland fez a ultima grande revisão mundial da família, estabelecendo assim a base da sistemática das Eriocaulaceae utilizada até o presente (Sano, 1999). Tabela 1.1. Gêneros pertencentes à família Eriocaulaceae segundo a proposta de Ruhland (1903). (número aproximado de espécies de cada gênero, Giulietti, 1997 e Sano, 1999). Eriocaulon (450) Paepalanthus (450) Leiothrix (30) Rondonanthus (6) Tonina (10) Mesanthemum+ (10) Blastocaulon (10) Actinocephalus (29) Philodice (10) Lachnocaulon++ (10) Syngonanthus (200) + Gênero restrito a África. ++ Gênero restrito a América do Norte. Eriocaulaceae possui uma complexa divisão que envolve gêneros, subgêneros, seções e subseções. Estas subdivisões ocasionam certa dificuldade na classificação taxonômica das espécies. A figura 1.1 apresenta a classificação dos taxa proposta para Eriocaulaceae, segundo Giulietti et al (2000). Subfamílias Gêneros Subgêneros Seções Subseções Eriocauloideae Eriocaulon Masanthemun Paepalanthoideae Tonina Blastocaulon Eulepsis Lachnocaulon Leiothrix Leiotrhix Rheocaulon Eleutherandra Stephanophyllum Paepalanthus Platycaulon Thelxinoe Xeractis Xeractis Crysostegis Gymnostegis Pleutophyllon Paepalocephalus Actinocephalus Diphymene Eriocaulopsis Philodice Rondononthus Syngonanthus Syngonanthus Carpocephalus Trysanocephalu Eulepis Figura 1.1. Classificação dos taxa de Eriocaulaceae (Giulietti et al, 2000). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 21 Os espécimens de Eriocaulaceae são distribuídos no mundo (Fig. 1.2) e no Brasil (Fig. 1.3), (Giulietti, 1978a). Crescem principalmente em solos arenosos, juntamente com espécimens das famílias Poaceae, Cyperaceae e Xyridaceae, constituindo com isso a comunidade herbácea dominante (Scatena & Menezes, 1996). A família é caracterizada morfologicamente pelas folhas em forma de roseta, de onde partem os escapos e destes escapos surgem às inflorescências do tipo capítulos envolvidos por brácteas (Fig. 1.4) (Monteiro et al, 1976). Os capítulos e escapos permanecem com aparência de vivos durante muitos anos, mesmo depois de retirados do solo. Por esta razão, muitas espécies desta família são conhecidas popularmente como “sempre-vivas”. Figura 1.2. Distribuição geográfica da família Eriocaulaceae (baseado em Giulietti, 1978a). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 22 Figura 1.3. Distribuição geográfica da família Eriocaulaceae no Brasil (baseado em Giulietti, 1978a). Figura 1.4. (A) Esquema dos capítulos, escapos e folhas em Eriocaulaceae. (B) Detalhe do capítulo envolto por brácteas de Syngonanthus fuscescens Ruhland (Parra, 1998). A comercialização de “sempre-vivas” pela população que vive na Cadeia do Espinhaço (Fig. 1.5) (Minas Gerais, Goiás e Bahia) desenvolveu-se principalmente nas últimas décadas e certamente é decorrente do declínio da atividade mineradora nestas áreas, que conheceram grandes riquezas durante os ciclos do ouro e do diamante (Menezes & Giulietti, 1986). BA MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 23 Figura 1.5. Mapa do Estado de Minas Gerais em que se destaca a porção da Cadeia do espinhaço compreendida entre Belo Horizonte e o Estado da Bahia (Menezes & Giulietti, 1986). Nas últimas décadas, devido à escassez do ouro e do diamante, a população existente nestas regiões viu-se obrigada a procurar novas fontes de sobrevivência. Com isso, o enorme volume de exportações dessas plantas para países da América do Norte e Europa têm tornado estas espécies uma fonte de recurso financeiro. A coleta das “sempre-vivas” é inteiramente baseada em extrativismo a partir das populações naturais, feitas por pessoas da própria região (Fig. 1.6), (Schmidt, 2005). No entanto, a exportação das “sempre-vivas” conduz a uma situação altamente predatória, pois as coletas podem acarretar numa diminuição das populações das espécies, especialmente porque as flores são retiradas antes da formação das sementes (Giulietti, 1978a). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 24 Figura 1.6. Obtenção de matéria-prima e confecção artesanal das “capim-dourado” (Schmidt, 2005). Este grande volume de exportação também despertou a curiosidade de pesquisadores brasileiros, levando a especulações sobre as possíveis utilizações para outros fins, além da decoração. Entre os usos populares das espécies de Eriocaulaceae, está a de repelir insetos. Esta característica faz com que sejam colocadas em armários e gavetas para afugentar baratas e traças (Menezes & Giulietti, 1986). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 25 A química de Eriocaulaceae Os estudos químicos com Eriocaulaceae iniciaram-se com Bate Smith & Harborne (1969), que relataram a presença da quercetagetina em Eriocaulon nilagirense Steud. e E. septangulare. Os mesmos autores detectaram a presença do mesmo flavonol 6-oxigenado nas folhas de E. decangulare L., E. brownianum Mart., E. sexangulare L. e E. wightianum Mart. e sua ausência em E. truncatum Ham. Gibbs (1974) relata a presença dos flavonóides quercetagetina, kaempferol, 6- hidroxiflavonol, patuletina e derivados de ácidos cinâmicos (ác. cafeico, ác. ferúlico, ác. sinápico, ác. p-cumárico) em espécies do gênero Eriocaulon. Salatino et al (1990) realizaram o estudo do teor de fenóis dos capítulos de 86 espécimens de 8 gêneros de Eriocaulaceae. Nesse estudo, os autores verificaram que, dentre os gêneros estudados, os que apresentaram teores mais baixos e menor variabilidade foram Leiothrix (0,2-1,4 %), seguido por Syngonanthus (0,3-1,7 %) e Eriocaulon (1,3-1,8 %). Os maiores teores e a maior variabilidade foram obtidos com Paepalanthus, com valores entre 0,7-8,9 %. Em Paepalanthus, as espécies pertencentes a Paepalanthus subg. Platycaulon foram as que apresentaram os maiores teores (3,6-8,4 %), enquanto que as de Paepalanthus subg. Xeractis apresentaram os menores teores (0,7-3,6 %). Do ponto de vista evolutivo, segundo os autores, esses resultados apontam para uma posição basal de Paepalanthus, devido aos maiores teores de fenóis, e uma posição mais avançada de Leiothrix. Provost et al (1990) isolaram a naftopiranona vioxantina em extratos acetônicos de Paepalanthus falcifolius, P. albovaginatus, P. argentus, P. ramosus e P. cuspidatus. Dokkedal et al (1992) investigaram a presença de flavonas O– e C–glicosiladas em 6 espécies do gênero Leiothrix. Os autores concluíram que o gênero Leiothrix pode ser distinguido de outros gêneros, como Eriocaulon, devido à presença dessas flavonas em espécies de Leiothrix. Mayworm et al (1993) encontraram a quercetagetina, quercetina-3-metiléter, a patuletina-3- O-glicosídeo e a apigenina 4’-O-glicosídeo em 4 espéces de Paepalanthus (P. hilairei, P. robustus, P. planifolius e P. bifrons). Esta informação aproximou taxonomicamente os gêneros Paepalanthus e Eriocaulon. Ricci et al (1996) realizaram o estudo taxonômico de 13 espécies de Syngonanthus, comprovando a presença de 24 flavonas, sobretudo derivados 7-O-glicosilados da luteolina e 6- hidroxiluteolina, além de O-glicosídeos da apigenina. Nos últimos anos, a maioria dos trabalhos referentes a estudos químicos de plantas da família Eriocaulaceae foi realizada pelo grupo de estudo de química orgânica de produtos naturais coordenado pelo Prof. Dr. Wagner Vilegas. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 26 Os trabalhos tiveram início com a investigação dos capítulos de espécies de Paepalanthus. O estudo de P. bromelioides resultou no isolamento de uma naftopiranona, a paepalantina (nafto[2,3- C]pirano-1-ona) (Vilegas et al, 1990), e prosseguiu com a obtenção da paepalantina-9-O-�-D- glucopiranosídeo e da paepalantina-9-O-�-D-alopiranosil-(1’’�6’)-�-D-glicopiranosídeo (Vilegas et al, 1998), além de outra naftopiranona, a vioxantina, e um dímero da paepalantina, ligado pelas posições 8-8’ (Coelho et al, 2000). Outro dímero, constituído por uma unidade de paepalantina e outra de semi-vioxantina, foi isolado de P. planifolius (Santos et al, 2001b). Derivados glicosilados da semi-vioxantina (3,4-diidro-10-hidroxi-7-metoxi-3-(R)-metil-1H-3,4-diidronafto-[2,3c]-piran-1- ona-9-O- -D-glicopiranosídeo, 3,4-diidro-10-hidroxi-7-metoxi-3-(R)-metil-1H-3,4-diidronafto [2,3c ]-piran-1-ona-9-O- -D-glicopiranosil(1’�6’’)glicopiranosídeo e 3,4-diidro-10-hidroxi-7-metoxi-3- (R)-metil-1H-3,4-diidronafto-[2,3c]-piran-1-ona-9-O- -D-alopiranosil(1’’�6’)glicopiranosídeo) foram encontrados também em P. vellozioides e P. latipes (Vilegas et al, 1999a). A 5- desmetoxipaepalantina e seus derivados glicosilados foram encontrados em P. macrocephalus (Bong.) Koernicke (P. sect. Eriocaulopsis subs. Aphorocaulon), em conjunto com derivados 6- metoxilados da quercetina e seus glicosídeos (Dokkedal, 2000). Flavonóis acilados e glicosilados derivados da quercetina foram encontrados em Paepalanthus hilairei, P. robustus, P. denudatus, P. ramosus, P. polyanthus (Andrade et al, 1999). Tendo em vista que em muitas espécies o escapo é uma parte abundante e bastante utilizada na confecção de peças artesanais, foi iniciada a investigação dos escapos de P. bromelioides e P. latipes. Deles, Nehme (1997) obteve derivados 7-metoxilados da quercetina, enquanto que Santos (1997) encontrou naftopiranonas nos capítulos e flavonóis 6-metoxilados derivados do kaempferol e da quercetina nos escapos de P. hilairei. Iniciando o estudo de folhas, foram isoladas diidronaftopiranonas glicosiladas de P. vellozioides e P. latipes, acompanhadas de flavonóides 7-metoxilados e seus glicosídeos (Vilegas et al, 1999a e 1999b). Com relação à composição química apolar, Garcia (1997) avaliou o perfil químico de extratos hexânicos de várias espécies da família Eriocaulaceae, encontrando hidrocarbonetos alifáticos lineares com cadeias que variam entre C25 e C31. A presença desses hidrocarbonetos provavelmente contribui para diminuir a perda de água pelas plantas (Raven et al, 2001). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 27 O gênero Eriocaulon Segundo Bongard (1831), Eriocaulon é um nome de origem grega que significa caule lanoso. Como nome genérico, foi usado pela primeira vez por Plukenet em 1696, para designar Eriocaulon noveboracense Plunk. O gênero Eriocaulon apresenta aproximadamente 450 espécies distribuídas pela América, África, Ásia e Europa (Moldenke, 1971). Eriocaulon é o único gênero da família de ocorrência no continente Asiático, com poucas espécies na Ex-União Soviética e Mongólia, e com maior número no Sul e Sudeste, especialmente Índia, onde ocorrem 66 espécies (Moldenke, 1971). As plantas nessa região ocorrem geralmente em locais montanhosos, com altitudes em torno de 1.000 m. Algumas espécies, como E. pumilio Hook. F., ocorrem no Himalaia, em até 3.000 m de altitude. As espécies habitam, em geral, locais muito úmidos ou são plantas aquáticas. A primeira monografia sobre as espécies brasileiras de Eriocaulon foi elaborada por Bongard (1831), que descreveu sucintamente 80 espécies do gênero. Dessas, apenas E. crassiscapum Bong., E. pubigerum Bong., E. elichrysoides Bong. e E. sparganioides Bong. ainda permanecem entre os Eriocaulon de acordo com o conceito atual de classificação taxonômica deste gênero. As 76 restantes são consideradas hoje representantes de outros gêneros. No Brasil são conhecidas 59 espécies, distribuídas desde o Amazonas até o sul do Paraná. No entanto, a maior concentração está nos Estados de São Paulo, Goiás, e principalmente em Minas Gerais, onde 31 espécies foram encontradas (Giulietti, 1978a). No Brasil ocorrem dois grupos de espécies bem distintas: aquelas cujas rosetas medem entre 5-15 cm de diâmetro, com os capítulos pequenos e escuros, como E. modestum Kunth. e E. crassicapum Bong., e as espécies com rosetas desenvolvidas, com 20-60 cm de diâmetro, e capítulos claros e com diâmetros maiores que 1 cm, como E. elichrysoides Bong. E. ligulatum Vell. (Giulietti, 1997). Do ponto de vista químico, Bate Smith et al (1969) analisaram extratos de folhas frescas de algumas espécies de Eriocaulon, e detectaram a presença do flavonóide quercetagetina em E. septangulare With., E. brownianum Mart., E. nilagirense Steud., E. decangulare L., E. sexangulare L., e E. wrightianum Mart. Nesse mesmo trabalho, o erioflavonol foi isolado dos capítulos de E. brownianum Mart. Ho et al (2002) identificaram 4 flavonóides dos capítulos de E. buergerianum Koern., dentre eles a (2S)-3’,4’-metilenodioxi-5,7-dimetoxiflavona e a hispidulina-7-(6-E-p-coumaroil-�-D- glucopiranosídeo), e o tocoferol. Santos et al (2005) isolaram 10 flavonas 6-metoxiladas e 2 naftopiranonas glicosiladas do extrato metanólico dos capítulos e escapos de E. ligulatum. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 28 Fang et al (2008) isolaram uma xantona, uma isoflavona, um flavonóide acilado derivado da 6-metoxiquercetina e 19 derivados fenólicos e flavonoídicos do extrato matanólico dos capítulos de E. buergerianum, usada na medicina tradicional Chinesa para combater inflamações oftálmicas e bacterianas. O gênero Syngonanthus O gênero Syngonanthus inclui aproximadamente 200 espécies, distribuídas nas Américas e África. Dessas, somente sete ocorrem na África, duas ocorrem na América do Norte e doze na América Central. O maior número encontra-se na América do Sul, principalmente no Brasil, nos Estados de Minas Gerais e Bahia, com aproximadamente 180 espécies (Giulietti, 1997). Quanto à química do gênero, 25 espécies representativas dos quatros subgêneros que ocorrem no Brasil (Carpocephalus, Dimorphocaulon [=Syngonanthus], Eulepis e Thysanocephalus) foram estudadas (Ricci, 1993; Ricci et al, 1996; Bonfim, 1993). Nelas foram identificadas grande quantidade de flavonas, com predominância de O–glicosídeos e C–glicosídeos derivados da luteolina, e com menor freqüência O–glicosídeos derivados da apigenina. Os derivados da 6- hidroxiluteolina ocorrem predominantemente em espécies de Syngonanthus sect. Carpocephalus e sect. Dimorphocaulon, enquanto que nas espécies de Syngonanthus sect. Eulepis e sect. Thysanocephalus predominam os C–glicosídeos, mais freqüentemente como derivados de luteolina (Fig. 1.7). Como resultado, os autores concluíram que existe semelhança química entre Syngonanthus sect. Carpocephalus e sect. Dimorphocaulon de um lado, e Syngonanthus sect. Eulepis e sect. Thysanocephalus do outro lado (Fig. 1.7). Tal similaridade química concorda com os padrões morfológicos e anatômicos da flor, auxiliando a caracterizar os dois agrupamentos formados pelas seções de Syngonanthus. Esses estudos, em conjunto com a análise do teor dos compostos fenólicos mencionados anteriormente (Salatino et al, 1990), sugeriram a evolução a partir de um ancestral comum (Fig. 1.8). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 29 Flavonas Flavonol 6-oxigenados Paepalanthus Flavonol 6-oxigenados Eriocaulon Seção Eulepis e Thysanocephalus C-glicoflavonas e O-glicoflavonas O-glicoflavonas e 6-OH-O- glicoflavonas Seção Carpocephalus e Dimorphocaulon Syngonanthus Leiothrix C-glicoflavonas e O-glicoflavonas e 6-metóxi-O- glicoflavonas Figura 1.7. Relação de afinidade entre os gêneros pertencentes à família Eriocaulaceae baseado na presença de flavonóides (Ricci et al, 1996). Figura 1.8. Cladograma geral da evolução das espécies da família Eriocaulaceae (Giulietti et al, 2000). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 30 Figura 1.9. Fotos das espécies estudadas neste trabalho. (A) Detalhe dos capítulos e escapos de E. ligulatum Sano nº 2978 (CFCR 7996). (B) Foto da exsicata de S. suberosus CFCR 4463 (Sano nº 2976). (C) Foto da exsicata de S. dealbatus CFCR 8161 (Sano nº 2975). AA BB CC MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 31 Panorama químico das espécies pertencentes à família Eriocaulaceae Várias espécies pertencentes à família Eriocaulaceae foram investigadas, tendo-se isolado majoritariamente flavonóides, naftopiranonas e xantonas (tabelas 1.2 e 1.3.). Tabela 1.2. Panorama químico das espécies pertencentes à família Eriocaulaceae. Espécies Substâncias Referências Paepalanthus P. subg. Xeractis P. chlorocephalus 01, 10, 14, 30, 39, 44, 46 Dokkedal, 2000. P. argenteus var. argenteus 02, 08, 17, 27 Dokkedal, 2000. P. sect. actinocephalus P. polyanthus 14, 15, 17, 20, 21, 22, 31, 33 Andrade et al, 1999; Santos et al, 2002. P. hilairei 14, 19, 20, 21, 22, 30, 36, 37 Santos, 1997 e 2001; Andrade et al, 1999. P. robustus 04, 15, 19, 21, 30, 31, 36, 37 Andrade et al, 1999. P. ramosus 14, 15, 19, 20, 30, 34, 36, 37 Andrade et al, 1999; Santos, 2001. P. denudatus 14, 15, 19, 30, 31, 36, 37 Andrade et al, 1999; Dokkedal, 2000. P. microphyllus 35, 36, 37, 41, 42, 43 Santos, 2001. P. brachypus 14, 21 Santos, 2001. P. subsect. aphorocaulon P. macrocephalus 14, 17, 28, 30, 36, 39, 40, 44, 45 Dokkedal, 2000. P. sect. diphyomene P. speciosus 35, 36, 38, 44 Garcia, 1997. P. subg. Platycaulon P. vellozioides 18, 24, 25, 26, 27, 32, 35, 37, 44, 45, 46 Vilegas et al, 1999a e 1999b. P. latipes 18, 24, 25, 26, 27, 32, 35, 37, 44, 45 Dokkedal, 2000; Vilegas et al, 1999a e 1999b; Nehme, 1997. P. bromelioides 02, 17, 18, 25, 28, 35, 36, 37, 47 Vilegas et al, 1990 e 1998; Coelho et al, 2000. P. macropodus 14, 16, 17, 23, 37 Andrade et al, 2002. P. planifolius 04, 06, 09, 12, 19, 24, 33, 35, 36, 37, 46, 47, 48 Santos et al, 2001b. Leiothrix L. curvifolia 02, 03, 05, 29, 50, 51 Santos et al, 2001a. L. flavescens 05, 07, 09, 10, 13, 28, 49 Santos et al, 2001a. Syngonanthus S. bisulcatus 03, 05, 09, 10, 11, 13 Coelho, 2000. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 32 Tabela 1.3. Substâncias isoladas das espécies pertencentes à família Eriocaulaceae. O O R4 R2 OH R1 R3 OH 1 3 45 6 8 9 10 27 1' 2' 3' 4' 5' 6' A C B Agliconas de flavonas Substância R1 R2 R3 R4 01 OCH3 OH H OH 02 OCH3 OH H OCH3 03 H OH H OH 04 OH OH H OH 05 H OH H H 06 OH OCH3 H H 07 H OH OH OH Glicosídeos de flavonas Substância R1 R2 R3 R4 08 OCH3 O–glic H OCH3 09 H O–glic H OH 10 C–glic OH H OH 11 C–glic O–glic H OH 12 C–glic OH C–glic H 13 C–glic OCH3 H OH O O R4 R2 OH R1 R3 OH OH Aglicona de flavonois Substância R1 R2 R3 R4 14 OCH3 OH H H 15 OH OH H OH 16 OH OH OH OH 17 OCH3 OH H OH 18 OH OCH3 H OH MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 33 O O R4 R3 R5 R2 OH R1 Glicosídeos de flavonóis Substância R1 R2 R3 R4 R5 19 O–glic OCH3 OH H OH 20 OH OH O–glic OH OH 21 O–glic OCH3 OH OH OH 22 O–glic(1�6)rham OCH3 OH OH OH 23 O–glic(4�1)glic OCH3 OH OH OH 24 O–glic OH OCH3 OH OH 25 OH OH OCH3 OH O–glic 26 O–glic(1�6)glic OH OCH3 OH OH 27 O–glic(1�2)rham OH OCH3 OH OH 28 OH OCH3 O–glic OCH3 OH O O OH OCH3 OCH3 H3CO OH 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 4' 5' 6' 3' 29 Isoflavona O O R4 R3 OH R2 OH R1 Flavonois acilados Substância R1 R2 R3 R4 30 O–glic(6)–p–coum OCH3 OH H 31 O–glic(6)–p–coum OCH3 OH OH 32 O–glic(1�4)glic(2)–caf OH OCH3 OH 33 O–glic(6)–fer OCH3 OH OH Continuação da tabela 1.3. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 34 Fenóis simples COOH OH OH 1 2 3 4 34 O CH3 R2 H3CO OR1 OH O 1 2 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 9a 10 10a 11 ABC Naftopiranonas Substância R1 R2 35 H OCH3 36 –glic OCH3 37 –glic(1�6)allo OCH3 38 –glic H 39 –glic(1�6)glic H 40 H H 41 –glic(1�6)glic OCH3 42 –ara(1�6)glic OCH3 43 –rham(1�6)glic OCH3 Naftopiranonas diméricas O O O O CH3 OCH3 OCH3 OH OH CH3 OCH3 H3CO OHOH 1 4 5 6 8 910 A B C 1' 4'5'6' 8' A'B'C' 47 O O O O CH3H3CO OH OH OCH3 OCH3 CH3 O 1 4 5 10 9 6 A B C 1 45 109 6 ABC 48 Continuação da tabela 1.3. O CH3H3CO OR1 OH O 3 -diidronaftopiranonas Substância R1 44 –glic 45 –glic(1�6)glic 46 –allo(1�6)glic MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 35 O OH OH R1 R2 COOCH3O 1 45 8 9 AB 10 Xantonas Substância R1 R2 49 OH OH 50 OH OCH3 51 OCH3 OCH3 Continuação da tabela 1.3. Legenda: Glic � glicopiranosídeo; Rham � rhamnopiranosídeo; Allo � alopiranosídeo; Ara � arabinopiranosídeo O–Glic � O–glicosídeo; C–Glic � C–glicosídeo; p-Coum � p-Cumaroil; Caf � Cafeoil; Fer � Feruloil; MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 36 2.Objetivos MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 37 Objetivos Realizar o estudo químico dos capítulos de Eriocaulon ligulatum (Vell.) L.B.Smith, Syngonanthus suberosus Giul. e Syngonanthus dealbatus Silv. Determinar o teor de fenóis totais do extrato e das frações dos capítulos de Eriocaulon ligulatum. Avaliar a ação biológica de extratos e/ou frações dos capítulos de Eriocaulon ligulatum, incluindo a atividade tóxica, antimutagênica, antioxidante, antiúlcera e a motilidade intestinal. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 38 3.Estudo Químico MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 39 A separação de produtos naturais geralmente é a etapa mais difícil do trabalho fitoquímico. As avançadas técnicas de determinação estrutural facilitaram, em muito, a determinação das estruturas das moléculas orgânicas. Porém, a determinação das estruturas só é viável quando precedida de processos eficientes de separação e purificação. Em geral, os grupos que atuam em fitoquímica utilizam as técnicas cromatográficas e, dentre essas, a cromatografia de adsorção é a mais usada. Apesar de altamente eficiente, em alguns casos ela apresenta desvantagens, como perda de algumas substâncias, ocasionado pela adsorção irreversível da amostra na fase estacionária. Por esses motivos, foram desenvolvidas técnicas baseadas em partição líquido-líquido (Conway, 1989). A técnica de cromatografia em contracorrente é um método totalmente líquido, que se caracteriza pela ausência de suporte sólido. Sendo por isso muito empregada na separação de compostos polares de amostras complexas. Neste trabalho, utilizamos a cromatografia em contracorrente de alta velocidade (High Speed Countercurrent Chromatography – HSCCC) técnica cada vez mais usada em laboratórios de pesquisa. Explicitaremos a seguir alguns dos pontos mais relevantes da técnica. Cromatografia em contracorrente de alta velocidade – HSCCC (High Speed Countercurrent Chromatography) A cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC) é uma técnica baseada na partição de um soluto entre dois líquidos imiscíveis. A proporção do soluto que passa para cada uma das fases é determinada pela constante de distribuição (KD) de cada uma das substâncias presentes na amostra. A constante de distribuição é uma constante física, característica de cada substância, e é dada pela fórmula: [S] da substância de interesse na fase orgânica [S] da substância de interesse na fase aquosa (KD)S = [S] da substância de interesse na fase orgânica [S] da substância de interesse na fase aquosa (KD)S = Cada substância dissolvida reparte-se em equilíbrio entre as duas fases líquidas não miscíveis de uma forma constante e reprodutível, dependente da temperatura. A KD é o principal parâmetro usado na otimização do sistemas de solventes utilizado nas separações cromatográficas (Hostettmann et al, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Thomas & Robert, 1991). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 40 Figura 3.1. Esquema geral dos itens que constitui um sistema de separação por HSCCC. AA BB Figura 3.2. A) Foto do equipamento de HSCCC. B) Foto da coluna semi-preparativa usada no equipamento de HSCCC. A cromatografia em contracorrente de alta velocidade é um método de separação que emprega somente líquidos durante as separações, com ausência de suporte sólido e, por isso, tem algumas vantagens em comparação com outras técnicas cromatográficas convencionais: - Não ocorre adsorção irreversível da amostra. - Há recuperação total da amostra introduzida na coluna do aparelho. - Redução do risco de degradação das substâncias. - Rapidez e eficiência do método. - Apresenta uma versatilidade na escolha do sistema de solventes usados nas separações. - Economia de solventes e colunas. - Boa resolução em separações semi-preparativa. - Aumento da área de interfase entre as duas fases líquidas usadas nas separações. No equipamento de HSCCC (Fig. 3.1 e 3.2), a bobina (coluna) (Fig. 3.2B) é construída com tubos de PTFE (politetrafluoroetileno) envolto em torno de um suporte central para formar camadas múltiplas (Fig. 3.3) (Ito, 2005; Shinomiya et al, 2002). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 41 Figura 3.3. Esquema de distribuição dos tubos PTFE em torno de um eixo central (Shinomiya et al, 2002). A coluna gira em torno do eixo central da centrífuga e, simultaneamente, ao redor de seu próprio eixo (Fig. 3.4A). O movimento da coluna provoca uma agitação vigorosa das fases do sistema de solvente, provocando um processo de mistura repetitiva, além de proporcionar zonas de mistura e separação das fases (Foucault & Chevolot, 1998; Mandava & Ito, 1988). Esse intercâmbio rápido leva a separações eficazes com pequeno volume de solvente. Um dos parâmetros experimentais importante no HSCCC é o ( , responsável pelo equilíbrio hidrodinâmico dos solventes, definido como a proporção entre o raio da coluna (r) e o raio do giro da coluna no movimento planetário (R), (Fig. 3.4B). A . R B Figura 3.4. A) Esquema do movimento da coluna no aparelho de HSCCC. B) Distribuição dos solventes dentro da coluna do HSCCC (Hostettmann et al, 2003). Atualmente, HSCCC vem sendo uma técnica preparativa amplamente aplicada em laboratórios de universidades e indústrias. No campo dos produtos naturais, HSCCC pode ser usada para fracionar extratos brutos, assim como frações semipuras, em quantidades que variam de MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 42 miligramas a gramas (Hostettmann et al, 2001; Marston et al, 1990). HSCCC é muito utilizada nas separações de substâncias com polaridade elevada, pois evita a adsorção irreversível da amostra na fase estacionária, como acontece freqüentemente com o uso de sílica, que causa perda parcial ou total da amostra. Além dessas aplicações, a técnica é bastante promissora na obtenção de padrões químicos de alta pureza, com rapidez, eficiência e economia de solventes (Leitão, 2005; Zhang et al, 2003). Escolha do sistema de solvente A correta escolha dos sistemas de solventes é crucial para o êxito das separações no HSCCC. As combinações de solventes mais eficazes são aquelas que proporcionam uma constante de distribuição próxima de 1 das substâncias presentes na amostra (Foucault & Chevolot, 1998; Conway, 1989). A escolha tem que obedecer a alguns pré-requisitos para que ocorra uma separação eficiente: - As misturas devem formar sistemas imiscíveis. - O sistema de solventes deve solubilizar a amostra. - As duas fases devem se separar rapidamente após agitação vigorosa (< 30 seg.). - Se possível, formar volume igual de fase superior e inferior. - Proporcionar uma constante de distribuição próxima de 1 das substâncias de interesse. - Não formar emulsão. - Formar mistura pouco viscosa. - Apresentar pequena diferença de densidade entre a fase aquosa e a fase orgânica. As misturas de solventes podem ser binárias, mas estas são pouco usadas, pois devido à grande diferença de polaridade entre os solventes, faria com que os analitos se distribuíssem preferencialmente apenas numa das fases. A adição de um terceiro ou de um quarto solvente, miscível com os outros componentes da mistura, diminui a diferença de polaridade entre as duas fases (Hostettmann et al, 1984). Assim, consegue-se aumentar a seletividade do sistema, permitindo as separações de substâncias com Rf’s próximos. A adição de um solvente auxiliar (Fig. 3.5) provoca, ainda, uma diminuição da tensão interfacial e da viscosidade do sistema (Ito, 2005; Conway, 1989; Mandava & Ito, 1988). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 43 Figura 3.5. Alguns solventes auxiliares usados nas otimizações de sistemas de solventes aplicados em HSCCC. A constante de distribuição (KD) pode ser facilmente determinada analisando a fase superior e inferior de uma mistura de solventes, após a dissolução da amostra, cujas etapas estão resumidas na figura 3.6. F. Orgânica F. Aquosa 1 mg da Amostra Agita F. Orgânica F. Aquosa F. Aquosa F. Orgânica CCD CCD FO FA KD ~ 1 KD ~ 1 KD ~ 1 KD ~ 1 Figura 3.6. Etapas para a determinação da constante de distribuição de uma amostra no sistema de solvente escolhido usando a cromatografia em camada delgada (Conway, 1989). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 44 Aproximadamente 1 mg da amostra é dissolvido no sistema de solvente escolhido previamente preparado em um tubo de ensaio. Após agitação e separação das fases (decantação), as duas fases são analisadas separadamente. Várias técnicas podem ser utilizadas para essa análise, sendo a mais comum e menos onerosa a cromatografia em camada delgada (CCD). A fase inferior e superior são aplicadas em proporções iguais na placa. A eluição da placa é feita em um sistema de solvente que proporcione boa resolução. Após a eluição, ela é analisada com revelador adequado. A constante de distribuição é estimada comparando-se visualmente as proporções das substâncias em cada fase. As substâncias devem estar distribuídas aproximadamente nas mesmas proporções tanto na fase superior quanto na fase inferior (Fig. 3.6) (Ito, 2005; Hostettmann et al, 2003; Foucault & Chevolot, 1998). Exemplos de sistemas de solventes usados nas separações de produtos naturais por cromatografia em contracorrente incluem principalmente misturas de hexano / acetato de etila / n- propanol / n-butanol / metanol / etanol / água (Ito, 2005; Hostettmann. et al, 2003; Foucault & Chevolot, 1998; Oka et al, 1998; Marston & Hostettmann, 1991; Marston et al, 1990; Conway, 1989). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 45 Capítulos das espécies (300 g) 1) Maceração com Hexano 2) Filtração Ex - HexânicoTorta 1) Maceração com diclorometano 2) Filtração Ex - Diclorometânico Torta 1) Retirada do diclorometano 2) Entumecimento da torta com metanol Percolação com MeOH 3 dias Torta Ex - Metanólico Desprezada Concentração Concentração Concentração Coleta do material vegetal e preparo dos extratos Escapos e capítulos de Eriocaulon ligulatum (Vell.) L.B. Smith. (nome vulgar: botão dourado), Syngonanthus suberosus Giul. (nome vulgar: margarida) e Syngonanthus dealbatus Silv. (nome vulgar: roxinha) foram coletados no mês de maio de 1999, em Diamantina, MG pelo prof. Dr. Paulo Takeo Sano, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. As identificações foram feitas pelo mesmo, catalogadas com os números de exsicatas CFCR 7996 (E. ligulatum), CFCR 4463 (S. suberosus) e CFCR 8161 (S. dealbatus), depositadas no herbário do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. O material vegetal foi seco em estufa a 40ºC por 4 dias. Após a secagem, foram triturados em moinho de facas. Os extratos foram preparados por maceração e/ou percolação de acordo com a figura 3.7. e obteve-se os rendimentos descritos na tabela 3.1. Figura 3.7. Obtenção dos extratos das espécies de Eriocaulaceae. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 46 Tabela 3.1. Quantidade obtida de extratos e seus rendimentos das espécies estudadas. Espécies Ex-Hex Rendimento % Ex-DCM Rendimento % Ex-MeOH Rendimento % E. ligulatum (El) 2,8 g 0,9 % 4,3 g 1,4 % 10,6 g 3,5 % S. suberosus (Ss) 3,2 g 1,1 % 3,2 g 1,1 % 5,4 g 1,8 % S. dealbatus (Sd) 3,6 g 1,2 % 3,8 g 1,3 % 4,9 g 1,6 % Estudo químico dos capítulos das espécies Os Ex-MeOH das três espécies foram submetidos à partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente, obtendo frações semipurificadas. Este tipo de metodologia proporciona um adequado clean up dos extratos polares (Calixto & Yunes, 2001). Aproximadamente 4 g de cada Ex-MeOH foram particionados entre 60 mL de água e 20 mL de acetato de etila em um funil de separação por 3 vezes. Em seguida, a fase aquosa foi particionada também com 20 mL de n-butanol (3 vezes) (Fig. 3.8, e Tabela 3.2). As frações obtidas nas partições foram analisadas por CCD, usando como fase móvel Ss 1 e padrões de rutina, 6-metoxiapigenina-7-O- -D-glicopiranosídeo, apigenina, quercetina e paepalantina. Utilizou-se como revelador luz UV (254 e 366 nm), anisaldeído/ H2SO4 e NP/PEG (Wagner et al, 1984). Ex - MeOH das espécies (4 g) 1) Dissolução em água (60 mL) 2) Partição 3) 3 x 20 mL de acetato de etila Fr-Acetato (Fr-EtOAc) Fase aquosa Fr-Butanólico (Fr-BuOH ) 1) 3 x 20 mL de n-butanol Fr-Aquosa (Fr-Aq ) Concentração Concentração Concentração Figura 3.8. Partição dos Ex-MeOH dos capítulos das espécies. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 47 Tabela 3.2. Quantidade obtida de frações e seus rendimentos. Espécies Fr-EtOAc Rendimento % Fr-BuOH Rendimento % E. ligulatum (El) 1,2 g 31,2 % 1,1 g 28,7 % S. suberosus (Ss) 1,3 g 32,0 % 0,9 g 21,7 % S. dealbatus (Sd) 1,1 g 26,7 % 1,3 g 33,2 % Estudo químico das frações obtidas de E. ligulatum A fração acetato de etila apresentou perfil flavonoídico constituído por agliconas e alguns monoglicosídeos, enquanto que a fração butanólica apresentou flavonóides mais polares. A fração aquosa continha uma grande quantidade de açúcares livres. Por isso, iniciamos o trabalho com a fração acetato de etila, por ser menos complexa. Purificação da fração acetato de etila (Fr-EtOAc) por HSCCC em fase normal com eluição isocrática (Fig. 3.9) Foram testadas várias proporções da mistura de hexano:acetato de etila:n-butanol:água, segundo metodologia descrita no item cromatografia em contracorrente de alta velocidade (Pág. 42). Não obtendo resultados satisfatórios, testamos então uma mistura de acetato de etila:n- propanol:água (14:0,8:8 v/v). Esta fase mostrou bons resultados KD próxima de 1. Em seguida, os solventes foram misturados em funil de separação e deixados em repouso por doze horas, para saturação prévia dos mesmos. A fase inferior do sistema foi usada como fase estacionária e a superior como fase móvel. O sentido do bombeamento das fases foi da cauda � cabeça da coluna, com vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. O volume eluido de fase estacionária foi de 55 mL, restando 83 % de fase estacionária dentro da coluna. Após esta etapa, 600 mg da Fr-EtOAc foram solubilizados em 16 mL de mistura de 1:1 das fases superior e inferior do sistema de solventes. A mistura foi filtrada em algodão e injetada no loop do aparelho com auxílio de uma seringa. A vazão foi de 1 mL min-1 e a rotação de 850 rpm. Foram coletadas 130 frações de 3 mL cada. Todas as frações foram analisadas por CCD em placas de sílica usando o sistema de solvente Ss 1 e reveladas com solução de anisaldeído/H2SO4 e NP/PEG. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 48 Fr-EtOAc (600 mg) Solubilizado em 8 mL de fase inferior + 8 mL de fase superior. Injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm -) Sistema de solvente: Acetato de etila: n-Propanol: Água (14:0,8:8). Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior) - Móvel 130 Frações 46-52 68-75 RMN RMN El 2El 1 As frações 46-52 (9 mg) e as frações 68-75 (23 mg) apresentaram manchas com coloração amarelada e Rf’s semelhantes aos do padrão da 6-metoxiapigenina-7-O- -D-glicopiranosídeo. Nas frações 46-52 foi identificada a substância El 1 e nas frações 68-75 a substância El 2. Figura 3.9. Esquema da separação da Fr-EtOAc usando HSCCC. Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) por HSCCC em fase normal com eluição em modo gradiente (Fig. 3.11) A Fr-BuOH quando cromatografada em CCD usando como os sistemas de solventes Ss 1 e Ss 2 apresentou uma mistura complexa de flavonóides e naftopiranonas, todas com Rf’s próximos ao da rutina. A separação destas substâncias torna muito mais complexa quando se usa apenas uma única fase móvel na eluição do HSCCC. Por isso, investigamos a separação usando sistema de eluição em gradiente, com aumento gradativo da polaridade da fase móvel. A constante de distribuição (KD) ótima foi obtida com misturas de acetato de etila:n-butanol:água (140:X:80 v/v), onde X variou 2, 4, 6 e 8 (Fig. 3.10). A fase inferior do sistema de solventes foi usada como fase estacionária e a superior como fase móvel. O sentido do bombeamento das fases foi cauda � cabeça da coluna, com vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. O volume de fase estacionária eluida foi de 40 mL, restando 87 % dentro da coluna. 450 mg da Fr-BuOH foram solubilizados em 16 mL de uma mistura de 1:1 de fase inferior e fase superior do sistema de solvente menos polar, acetato de etila:n-butanol:água (140:2:80 v/v). A mistura foi filtrada em algodão e injetada no loop do aparelho com auxílio de uma MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 49 seringa. A separação ocorreu com uma vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. Coletaram-se 105 frações de 3 mL cada. 2 mL 4 mL 6 mL 8 mL B u t a n o l Frações 0-30 31-60 61-80 81-90 El 3 El 1 e El 2 91-105 Figura 3.10. Variação do n-butanol durante a eluição em modo gradiente. Todas as frações foram analisadas por CCD em placas de sílica usando os sistemas de solventes Ss 1 e Ss 2 e reveladas com solução de anisaldeído/H2SO4. As frações 40-49, 54-60 e 67- 73 apresentaram coloração amarelada, característica de flavonóides, quando reveladas com uma solução de anisaldeído/H2SO4 e com reagente de NP/PEG. Das frações 40-49 (7 mg) e 54-60 (20 mg) foram re-isoladas as substâncias El 1 e El 2, e das frações 67-73 (14 mg) foi isolada a substância El 3. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 50 Fr-BuOH (450 mg) Solubilizado em 8 mL de fase inferior + 8 mL de fase superior. Injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm -) Sistema de solvente: EtOAc:n-BuOH:H2O (140:X:80) Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior) - Móvel Fr. 0-30 RMN El 1 EtOAc:n-BuOH:H2O (140:2:80) EtOAc:n-BuOH:H2O (140:4:80) EtOAc:n-BuOH:H2O (140:6:80) EtOAc:n-BuOH:H2O (140:8:80) Fr. 31-60 Fr. 61-80 Fr. 81-90 Fr. 40-49 Fr. 54-60 RMN El 2 Fr. 67-73 RMN El 3 Variou nas proporções de 2, 4, 6 e 8. Figura 3.11. Esquema da separação da Fr-BuOH usando HSCCC com eluição em gradiente. Fracionamento do Ex-MeOH usando cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 Dois gramas do Ex-MeOH dos capítulos de E. ligulatum foram solubilizados em 6 mL de metanol e centrifugado. O sobrenadante foi filtrado em algodão e aplicado em uma coluna (80 cm de altura x 2 cm de de diâmetro interno) tendo como fase estacionária Sephadex LH-20. 160 frações de aproximadamente 10 mL cada foram coletadas com o auxílio de um coletor automático. As frações foram analisadas por CCD utilizando como fase móvel o sistema Ss 1 e padrões de rutina, 6-metoxiapigenina-7-O- -D-glicopiranosídeo, apigenina, quercetina e paepalantina, e reveladas com anisaldeído/H2SO4 e NP/PEG. Da fração 154-157 (12 mg) foi identifida por RMN a substância El 4. Deste fracionamento obtiveram-se ainda três frações contendo grupos de substâncias diferentes. A primeira fração continha um conjunto de flavonóides glicosilados; a segunda apresentou misturas de flavonóides (glicosídeos e agliconas) e naftopiranonas; a terceira fração apresentou mistura de agliconas de flavonóides (Fig. 3.12). As três frações foram enviadas para ensáios de atividade antiúlceras gástricas e mutagênicidade, uma vez que o Ex-MeOH bruto apresentou promissora atividade nesses dois ensaios (Pág. 110). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 51 Ex-MeOH Capítulos E. ligulatum (2 g) -) Cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 -) Eluição: MeOH 160 Frações CCD Fração de flavonóides glicosílados (749 mg) Fração de flavonóides glicosílados + naftopiranonas + agliconas de flavonóides (982 mg) Fração de agliconas de flavonóides (258 mg) El 4 01-48 49-110 111-153 154-157 Testes biológicos RMN Figura 3.12. Fracionamento do Ex-MeOH dos capítulos de E. ligulatum. Análise do extrato diclorometânico (Ex-DCM) O Ex-DCM foi inicialmente submetido a análises por CCD em placas de sílica gel eluidas com misturas de hexano e acetato de etila (98:02, 95:05 e 80:20 v/v). A revelação das cromatoplacas sob luz UV (254 e 366 nm) evidenciou manchas fluorescentes espalhadas ao longo das placas. Quando as mesmas foram reveladas com anisaldeído/H2SO4 verificaram-se manchas de cores vermelhas e amareladas. Em seguida, fracionou-se o Ex-DCM por meio de cromatografia em coluna aberta (12,5 cm de altura da sílica x 3,0 cm de diâmetro interno) contendo 60 g de sílica gel 60 (0,063-0,200 mm, Merck). O empacotamento foi realizado através do preparo de uma suspensão da sílica em hexano. Agitou-se a suspensão para eliminar possíveis bolhas de ar e transferiu-se para a coluna. Aproximadamente 3 g do Ex-DCM foram pesados e misturados com 1 g da sílica seca empregada na coluna. Em seguida, a mistura foi homogeneizada e vertida no topo da coluna. Os solventes utilizados na eluição cromatográfica constituíram em misturas de hexano:acetato de etila:metanol em gradiente crescente de polaridade (Fig. 3.13). Foram obtidas 96 frações de aproximadamente 15 mL cada. Após evaporação do solvente, todas as frações foram analisadas por CCD, tendo como fase móvel os sistemas Ss 3 e Ss 4 e como reveladores luz UV (254 e 366 nm) e anisaldeído/H2SO4. As frações que apresentaram manchas MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 52 com Rf’s e colorações semelhantes foram reunidas. As frações 35-42 (8 mg) e 51-55 (20 mg), que apresentaram uma única mancha, foram submetidas a RMN. Dessa foi possível identificar por RMN as substâncias El 4 e El 5. 100 00 99 10 98 20 96 4 0 92 8 0 84 16 0 68 32 0 36 64 0 0 100 0 0 99 1 0 98 2 0 96 4 0 92 8 0 84 16 0 68 32 0 36 64 00 100 0 20 40 60 80 100 1 a 2 3 a 4 4 a 5 5 a 8 9 a 11 12 a 20 21 a 29 30 a 49 50 a 52 53 a 56 57 a 61 62 a 69 70 a 76 77 a 79 80 a 85 86 a 92 93 a 96 Fr aç õe s Hex EtOAc MeOH El 5 El 4 Volume dos solventes (mL) Figura 3.13. Gradiente de polaridade crescente usado no fracionamento do Ex-DCM. Estudo químico das frações obtidas de S. suberosus O Ex-MeOH foi submetido a um processo de partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente, seguindo a metodologia apresentada na figura 3.6. As três frações foram cromatografadas em placa de sílica gel utilizando o sistema Ss1 como eluente e reveladas com luz UV (254 e 366 nm), anisaldeído/ H2SO4 e NP/PEG. A fração acetato de etila apresentou perfil cromatográfico com grande quantidade de agliconas de flavonóides. A fração butanólica evidenciou maior quantidade de glicosídeos flavonoídicos. Açúcares em abundância foram detectados na fração aquosa. Foi estabelecido trabalhar com a fração acetato de etila, devido a sua menor complexidade química quando comparada com a fração butanólica. Purificação da fração acetato de etila (Fr-EtOAc) por HSCCC com eluição isocrática (Fig. 3.14) O processo de escolha do sistema de solventes para esta análise foi semelhante ao descrito em E. ligulatum (Pág. 42). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 53 O melhor sistema encontrado para a separação das substâncias presentes na Fr-EtOAc foi hexano:acetato de etila:etanol:água (04:10:04:10 v/v). A fase inferior foi empregada como fase estacionária e a fase superior como fase móvel. O sentido do bombeamento das fases foi cauda � cabeça da coluna com vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. O volume de fase estacionária eluida foi de 37 mL, restando 88 % retido. 450 mg da amostra foram dissolvidos em 16 mL da mistura 1:1 das fases superior e inferior. A mistura resultante foi filtrada em algodão e injetada no loop do equipamento. A separação ocorreu com uma vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. As 94 frações (3 mL cada) foram analisadas por CCD em placas de sílica usando o sistema Ss 1 como eluente e reveladas com solução de anisaldeído/H2SO4. As frações 32-45 (10 mg) e as frações 52-61 (14 mg) apresentaram manchas com coloração amarelada e Rf’s muito próximos aos dos padrões de apigenina e quercetina. As substâncias Ss 1 e Ss 2 foram identificadas por RMN. Fr-EtOAc (450 mg) Solubilizado em 8 mL de fase inferior + 8 mL de fase superior. Injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm -) Sistema de solvente: Hex:EtOAc:EtOH:H2O (4:10:4:10) Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior)- Móvel 94 Frações 32-45 52-61 RMN RMN Ss 2Ss 1 Figura 3.14. Separação da Fr-EtOAc de S. suberosus usando HSCCC. Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) por HSCCC em fase nornal com eluição em modo gradiente (Fig. 3.16) Uma vez que as substâncias presentes na fração mostraram vasta margem de polaridade, optou-se por um gradiente crescente de polaridade da fase móvel. O KD ótimo para as substâncias foi obtido com as seguintes proporções dos solventes, acetato de etila:n-butanol:água (5-X:X:5 v/v), onde X variou 1,0; 1,5 e 1,8 (Fig. 3.15). O sentido do bombeamento das fases foi da cauda � cabeça da coluna com vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. O volume de fase estacionária eluida da coluna foi de 43 mL, restando MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 54 86 % retida. 436 mg da Fr-BuOH foram solubilizados em 16 mL de uma mistura de 1:1 das fases inferior e superior do sistema de solvente menos polar, acetato de etila:n-butanol:água (4:1:5 v/v). A mistura foi filtrada em algodão e injetada no loop do aparelho, com auxílio de uma seringa. A fase móvel foi bombeada a uma vazão de 1 mL min-1 e coluna em 850 rpm durante a análise. 106 frações de 3 mL foram coletadas. Todas as frações foram analisadas por CCD em placas de sílica usando os sistemas Ss 1 e Ss 2 como eluente e reveladas com solução de anisaldeído/H2SO4. As frações 34-39 (12 mg), 47-51 (16 mg) e 89-97 (10 mg) apresentaram coloração amarelada, característica de flavonóides (Wagner et al, 1984) e foram denominadas de Ss 3, Ss 4 e Ss 5 e identificadas por RMN. 4 3,5 3,2 1 1,5 1,8 5 5 5 00-20 21-79 80-106 Fr aç õe s Volume dos solvetes em mL Acetato de Etila n-Butanol Água Ss 3 e Ss 4 Ss 5 Figura 3.15. Variação do n-butanol e do acetato de etila durante a eluição da Fr-BuOH do Ex-MeOH de S. suberosus em modo gradiente utilizando HSCCC. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 55 Fr-BuOH (436 mg) Solubilizado em 8 mL de fase inferior + 8 mL de fase superior. Injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm -) Sistema de solvente: EtOAc:n-BuOH:H2O (5-X:X:5) Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior) - Móvel Fr. 0-20 RMN Ss 3 EtOAc:n-BuOH:H2O (4:1:5) Fr. 21-79 Fr. 80-106 Fr. 34-39 Fr. 47-51 RMN Ss 4 Fr. 89-97 RMN Ss 5 Variou nas proporções de 1, 1,5 e 1,8. EtOAc:n-BuOH:H2O (3,5:1,5:5) EtOAc:n-BuOH:H2O (3,2:1,8:5) Figura 3.16. Separação da Fr-BuOH de S. suberosus usando HSCCC com eluição em gradiente. A fim de verificar a possível similaridade entre a composição química de S. suberosus e S. dealbatus, avaliamos seus perfis cromatográficos usando HPLC-UV-PDA. Perfis dos extratos metanólicos dos capítulos de Syngonathus spp As amostras foram preparadas utilizando 20 mg do extrato MeOH dos capítulos das espécies seguindo a metodologia descrita na pág 148 no item material e métodos. O clean up foi realizado em um cartucho de SPE com fase reversa C18. O objetivo do clean-up foi o de reter os possíveis interferentes lipofílicos presentes na matriz (Lanças, 2004). A fração coletada foi seca em N2. Após vários testes, otimizamos a eluição usando como fase móvel ACN e H2O, ambas acidificadas com TFA 0,05% (Tab. 3.3). MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 56 Tabela 3.3. Gradiente de eluição empregado na separação por HPLC dos metabólitos encontrados no Ex-MeOH de S. suberosus e S. dealbatus. Tempo (min) Água + TFA 0,05% (%) Acetonitrila + TFA 0,05% (%) 0 65 35 20 65 35 25 45 55 45 45 55 50 0 100 O volume injetado em cada análise foi de 20 µL, vazão de 1 mL min–1, coluna RP18 Phenomenex 250 x 4,6 mm ID, 5 �m. Os picos foram monitorados com detecção UV em 254 nm. O resultado está na figura 3.17. Figura 3.17. Cromatograma dos extratos metanólicos dos capítulos das espécies de Syngonanthus. Condições cromatográficas: Coluna RP18 Phenomenex (250 x 4,6 mm d.i.; 5 �m); Gradiente ver tabela 3.3; Volune injetado 20 �L; Vazão 1 mL min–1. S. dealbatus 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 10 20 30 40 50 Minutos 1 1 2 3 4 5 6 7 7 8 8 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 10 20 30 40 50 Minutos10 20 30 40 50 Minutos 1 1 e 2 2 3 3, 4, 5 e 6 4 5 6 7 8 20 30 4010 50 S. suberosus 50 100 150 200 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 350 m AU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 100 200 300 mAU 200 250 300 350 1 1, 2 e 3 2 3 4 5 6 6 e 7 7 8 9 8 e 9 Ampliação 0.00 0.25 0.50 AU Minutos 0.75 1.00 1 2 3 4 4 e 5 5 6 7 8 9 42 43 44 100 200 300 400 500 mAU 45 Minutos S. dealbatus 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 10 20 30 40 50 Minutos 1 1 2 3 4 5 6 7 7 8 8 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 10 20 30 40 50 Minutos10 20 30 40 50 Minutos 1 1 e 2 2 3 3, 4, 5 e 6 4 5 6 7 8 S. dealbatus 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 300 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 m AU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 0 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 nm 10 20 30 40 50 Minutos10 20 30 40 50 Minutos 1 1 2 3 4 5 6 7 7 8 8 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 10 20 30 40 50 Minutos10 20 30 40 50 Minutos 1 1 e 2 2 3 3, 4, 5 e 6 4 5 6 7 8 20 30 4010 50 S. suberosus 50 100 150 200 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 350 m AU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 100 200 300 mAU 200 250 300 350 1 1, 2 e 3 2 3 4 5 6 6 e 7 7 8 9 8 e 9 Ampliação 0.00 0.25 0.50 AU Minutos 0.75 1.00 1 2 3 4 4 e 5 5 6 7 8 9 42 43 44 100 200 300 400 500 mAU 45 Minutos S. suberosus 50 100 150 200 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 350 m AU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 350 m AU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 300 350 m AU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 50 100 150 200 250 mAU 200 250 300 350 100 200 300 mAU 200 250 300 350 100 200 300 mAU 200 250 300 350 100 200 300 mAU 200 250 300 350 1 1, 2 e 3 2 3 4 5 6 6 e 7 7 8 9 8 e 9 AmpliaçãoAmpliação 0.00 0.25 0.50 AU Minutos 0.75 1.00 1 2 3 4 4 e 5 5 6 7 8 9 42 43 44 100 200 300 400 500 mAU 45 Minutos MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 57 Como pode-se verificar, existem grandes diferenças entre os perfis cromatográficos das duas espécies: S. dealbatus possui metabólitos mais polares (1-3), que eluem com tempo de retenção entre 12-15 min, enquanto que S. suberosus apresenta a maior parte dos picos com tempo de retenção entre 17-23 min. Tendo em vista a diferença no perfil cromatográfico das duas espécies (Fig. 3.17), o Ex-MeOH dos capítulos de S. dealbatus foi submetido a partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente (Fig. 3.8. Pág. 46). As duas frações foram cromatografadas em placa de sílica gel utilizando como eluente Ss 1 e revelação com luz UV (254 e 366 nm), anisaldeído/ H2SO4 e NP/PEG. A fração acetato de etila apresentou perfil cromatográfico por CCD muito semelhante à fração acetato de etila já estudada de S. suberosus, com agliconas de flavonas, principalmente derivados de apigenina e luteolina. Devido a semelhança das frações acetato de etila, optou-se pelo estudo da fração butanólica de S. dealbatus sendo esta diferente da fração butanólica da outra espécie. Purificação da fração butanólica (Fr-BuOH) de S. dealbatus por HSCCC (Fig. 3.19) O sistema de solventes ótimo para a separação consistiu em misturas de hexano:acetato de etila:água (1:4:5 v/v sistema A) e (0:5:5 v/v/ sistema B). A fase inferior foi usada como fase estacionária e a superior como fase móvel. O sentido do bombeamento das fases foi da cauda � cabeça da coluna com vazão de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. O volume de fase estacionária eluida da coluna foi de 54 mL, restando 83 % de fase estacionária retida. 850 mg da Fr-BuOH foram solubilizados em 16 mL de uma mistura de 1:1 de fase aquosa e fase orgânica do sistema menos polar hexano:acetato de etila:água (1:4:5 v/v/v). A mistura foi filtrada em algodão e injetada no loop, com auxílio de uma seringa. A vazão foi de 1 mL min-1 e rotação de 850 rpm. Coletaram-se 140 frações de 5 mL cada. Todas as frações foram analisadas por CCD em placas de sílica usando os sistemas Ss 1 e Ss 2 como eluente e reveladas com uma solução de anisaldeído/H2SO4. A separação não resultou em substâncias puras. As frações 72-102 (590 mg) foram reunidas e novamente fracionadas por HSCCC com eluição em modo gradiente. O KD ótimo para esta nova separação foi estabelecido com a mistura de acetato de etila:n- butanol:água (5-X:X:5 v/v), onde X variou 0,9; 1,4 e 1,9 (Fig. 3.18). O preparo do aparelho para a aplicação da amostra seguiu a mesma metodologia descrita anteriormente. O equilíbrio hidrodinâmico foi atingido quando 59 mL de fase estacionária (fase inferior) foi eluida da coluna, restando 81 % da fase estacionária retida. Foram coletadas 103 frações de 3 mL cada. Todas as frações foram analisadas por CCD em placas de sílica usando os sistemas Ss 1 e Ss 2 e reveladas com solução de anisaldeído/H2SO4. As frações 21-26 (8 mg), 46-58 (11 mg) e 79-86 (10 mg) MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 58 apresentaram coloração amarelada, característica de flavonóides, quando reveladas com uma solução de anisaldeído/H2SO4 (Wagner et al, 1984). Essas frações foram denominadas de Sb 1, Sb 2 e Sb 3. As substâncias foram identificadas por RMN. 4,1 0,9 5 3,6 1,4 5 3,1 1,9 5 00-41 42-74 75-103 Fr aç õe s Acetato de Etila n-Butanol Água Sd 1 Sd 2 Sd 3 Figura 3.18. Variação do n-butanol e do acetato de etila durante a eluição em modo gradiente. Volume dos solventes (mL) MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 59 Fr-BuOH (850 mg) Solubilizado em 8 mL de fase infer ior + 8 mL de fase superior. Injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior) - Móvel -) Sistema de solvente: Sistema A - Hex:EtOAc:H2O (1:4:5) (frações 0 a 74) Sistema B - Hex:EtOAc:H2O (0:5:5) (frações 75 a 140) 140 frações (5 mL cada) -) CCD -) Reunião de acordo com os Rf's Fr. 72-102 (590 mg) Dissolução em 16 mL de uma mistura de 1:1 de fase inferior mais a fase superior do sistema de solvente menos polar e injeção no HSCCC -) Vazão de 1 mL min-1 -) Rotação da coluna 850 rpm -) Sistema de solvente: EtOAc:n-BuOH:H2O (5-X:X:5) Fase Aquosa (inferior) - Estacionária Fase Orgânica (superior) - Móvel Variou nas proporções de 0,9; 1,4 e 1,9. Fr. 0-41 EtOAc:n-BuOH:H2O (4,1:0,9:5) EtOAc:n-BuOH:H2O (3,6:1,4:5) EtOAc:n-BuOH:H2O (3,1:1,9:5) Fr. 42-74 Fr. 75-103 Fr. 46-58 RMN Sd 2 103 frações (3 mL cada) Fr. 79-86 RMN Sd 3 Fr. 21-26 RMN Sd 1 Figura 3.19. Esquema do fracionamento da Fr-BuOH de S. dealbatus por HSCCC. MMaarrcceelloo AApp.. ddaa SSiillvvaa –– TTeessee ddee DDoouuttoorraaddoo EEssttuuddoo qquuíímmiiccoo ee bbiioollóóggiiccoo ddee ppllaannttaass ddaa ffaammíílliiaa EErriiooccaauullaacceeaaee 60 4.Elucidação Estrutural e Identificação MM aa rr cc ee ll oo AA pp .. dd aa SS ii ll vv aa –– TT ee ss ee dd ee DD oo uu tt oo rr aa dd oo EE ss tt uu dd oo qq uu íí mm ii cc oo ee bb ii oo ll óó gg ii cc oo dd ee pp ll aa nn tt aa ss dd aa ff aa mm íí ll ii aa EE rr ii oo cc aa uu ll aa cc ee aa ee 61 E l 1 O O H O HO H O H O O O H O O H H 3C O H E l 2 O O O H O O H H 3C O O H O H O H O H O H E l 3 O H O H O H O H O O O O H O H O H O C H 3 O O H O O H H H O H H 3C O E l 4 O O O H O H O H H 3C O E l 5 O O O O C H 3 O C H 3 O H O C H 3 H 3C O O H Ss 1 O O O H O H O C H 3 O H Ss 2 e S d 1 O O O H O H O H O H Ss 3 O O O H O H O H O H O O H O H O H O H O O O H H O H O H C H 3 Ss 4 O O O O H O H O H O H O O H O H H 3C O O H H O O H O H O H C H 3 Ss 5 O H O H O H O H O H O O O H H 3C O O H Sd 2 O H O H O H O H O H O O O H H 3C O O H O H Sd 3 O H O H O H O H O H O O O H O H O H O H T ab el a 4. 1. S ub st ân ci as is ol ad as . Su bs . N om e da m ol éc ul a E l 1 6- m et ox ia pi ge ni na -7 -O - -D -g lic op ira no sí de o E l 2 6- m et ox ia pi ge ni na -7 -O - -D -a lo pi ra no sí de o E l 3 4’ ,6 -d im et ox ik ae m pf er ol -3 -O - -D -6 ’’[ (E )- 3, 4, 5- tri id ro xi ci na m at o] gl ic op ira no sí de o E l 4 6- m et ox ia pi ge ni na E l 5 Er io ca ul in a Ss 1 4’ -m et ox ilu te ol in a Ss 2 Lu te ol in a Ss 3 Q ue rc et in a- 3- O - -D -g lic op ira no sí l ( 1’ ’’ � 6’ ’) rh am no pi ra no sí de o Ss 4 6- m et ox ik ae m pf er ol -3 -O - -D -g al ac to pi ra no sí l ( 1’ ’’ � 2’ ’) rh am no pi ra no sí de o Ss 5 7- m et ox ia pi ge ni na -6 -C - -D -g lic op ira no sí de o Sd 1 Lu te ol in a Sd 2 7- m et ox ilu te ol in a- 6- C - -D -g al ac to pi ra no sí de o Sd 3 Lu te ol in a- 6- C- -D -g al ac to pi ra no sí de o Fi gu ra 4 .1 . M ol éc ul as is ol ad as d as e sp éc ie s d e Er io ca ul ac ea e es tu da da s ne st e tra ba lh o. MM aa rr cc ee ll oo AA pp .. dd aa SS ii ll vv aa –– TT ee ss ee dd ee DD oo uu tt oo rr aa dd oo EE ss tt uu dd oo qq uu íí mm ii cc oo ee bb ii oo ll óó gg ii cc oo dd ee pp ll aa nn tt aa ss dd aa ff aa mm íí ll ii aa EE rr ii oo cc aa uu ll aa cc ee aa ee 62 Id en tif ic aç ão d as su bs tâ nc ia s i so la da s d as e sp éc ie s d e E ri oc au la ce ae A s ta be la s 4. 2 a 4. 4 ap re se nt am o s de sl oc am en to s qu ím ic os d e R M N d e 1 H e 13 C d as s ub st ân ci as j á co nh ec id as , i so la da s da s es pé ci es d e Er io ca ul ac ea e es tu da da s n es te tr ab al ho . T ab el a 4. 2. D es lo ca m en to s q uí m ic os d e R M N d e 1 H e 13 C d os fl av on ói de s i so la do s d e E. li gu la tu m . E l 1 E l 2 E l 4 Po si çã o 1 H 13 C 1 H 13 C 1 H 13 C 2 16 4, 3 16 4, 3 16 3, 7 3 6, 82 (s ) 10 2, 5 6, 81 (s ) 10 2, 4 6, 76 (s ) 10 2, 3 4 18 2, 2 18 2, 2 18 2, 0 5 15 2, 0 15 2, 1 15 2, 3 6 13 2, 5 13 2, 5 13 1, 3 7 15 6, 4 15 6, 7 15 2, 7 8 6, 99 (s ) 94 ,3 6, 95 (s ) 94 ,1 6, 59 (s ) 94 ,1 9 15 2, 4 15 2, 3 15 7, 1 10 10 5, 6 10 5, 6 10 4, 0 1’ 12 0, 9 12 0, 7 12 1, 1 2’ 7, 91 (d ) [ 9, 0] 12 8, 5 7, 93 (d ) [ 9, 0] 12 8, 5 7, 91 (d ) [ 9, 0] 12 8, 4 3’ 6, 91 (d ) [ 9, 0] 11 5, 9 6, 89 (d ) [ 9, 0] 11 6, 0 6, 91 (d ) [ 9, 0] 11 5, 9 4’ 16 1, 4 16 1, 6 16 1, 1 5’ 6, 91 (d ) [ 9, 0] 11 5, 9 6, 89 (d ) [ 9, 0] 11 6, 0 6, 91 (d ) [ 9, 0] 11 5, 9 6’ 7, 91 (d ) [ 9, 0] 12 8, 5 7, 93 (d ) [ 9, 0] 12 8, 5 7, 91 (d ) [ 9, 0] 12 8, 4 A çú ca r G lic os e A lo se -- -- 1” 5, 08 (d ) [ 7, 5] 10 0, 2 5, 27 (d ) [ 7, 5] 98 ,7 -- -- 2” 3, 33 (d d) [ 9, 0; 7 ,5 ] 73 ,1 3, 51 (d d) [7 ,5 ; 3 ,0 ] 70 ,2 -- -- 3” 3, 31 (d d) [9 ,0 ; 9 ,0 ] 76 ,7 3, 94 (d d) [4 ,5 ; 3 ,0 ] 71 ,5 -- -- 4” 3, 19 (d d) [9 ,0 ; 9 ,0 ] 69 ,5 3, 44 (d d) [9 ,0 ; 4 ,5 ] 66 ,9 -- -- 5” 3, 44 (m ) 77 ,2 3, 79 (m ) 74 ,9 -- -- 6” 3, 46 a ( dd ) [ 10 ,0 ; 8 ,0 ] 3, 54 b ( dd ) [ 10 ,0 ; 8 ,0 ] 60 ,6 3, 46 a ( dd ) [ 10 ; 4 ,0 ] 3, 69 b (d d) [1 0; 4 ,0 ] 60 ,8 -- -- 6- O C H 3 3, 75 (s ) 60 ,2 3, 75 (s ) 60 ,2 3, 74 (s ) 59 ,8 D es lo ca m en to s q uí m ic os fo ra m c om pa ra do s c om a li te ra tu ra : A gr aw al , 1 98 9 (D M SO -d 6, 7, 04 T , T M S) e S an to s e t a l, 20 05 (D M SO -d 6, 11 ,7 T , T M S) . ( ) M ul tip lic id ad e; [ ] C on st an te s d e ac op la m en to e m H z; E sp ec tro s o bt id os e m D M SO -d 6, 11 ,7 T . MM aa rr cc ee ll oo AA pp .. dd aa SS ii ll vv aa –– TT ee ss ee dd ee DD oo uu tt