UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI
EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO
CÉREBRO, VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis
mellifera AFRICANIZADA.
Rio Claro
2011
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências do Campus de Rio
Claro, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas (Biologia
Celular e Molecular).
CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI
EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO CÉREBRO,
VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis mellifera AFRICANIZADA.
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências do Campus de Rio Claro,
Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas (Biologia Celular e
Molecular)
Orientador: Prof. Dr. OSMAR MALASPINA
Co-orientadora: Profª. Drª. THAISA C. ROAT
Rio Claro - SP
2011
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
Rossi, Caroline de Almeida
Efeitos de doses subletais do imidaclopride no cérebro,
ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada
/ Caroline de Almeida Rossi. - Rio Claro : [s.n.], 2011
101 f. : il., figs., tabs.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Osmar Malaspina
Co-Orientador: Thaisa Cristina Roat
1. Abelha. 2. Toxicidade do imidacloprie em abelhas. 3.
Inseticida. 4. Citotoxicidade. I. Título.
595.799
R831e
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP
iii
Dedicado aos meus pais, Lodovico e Fátima,
e ao meu irmão Diego, por me apoiarem sempre.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais), Departamento de Biologia e UNESP por me
fornecer suporte e condições para a realização de minhas pesquisas.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo e suporte financeiro à pesquisa realizada.
Ao Prof. Dr. Osmar Malaspina, pela orientação e incentivo aos meus estudos, pela atenção e
paciência diante às minhas dúvidas e pelas experiências adquiridas ao longo desses anos.
Ao Tiago Favaro de Souza, por toda ajuda e correções realizadas.
À Thaisa Cristina Roat, pela co-orientação e principalmente pela amizade. Muito obrigada
pelas correções dos trabalhos, pela ajuda nos experimentos e preparação dos materiais
biológicos. Seu apoio foi fundamental para a realização desse trabalho.
À Elaine e à Roberta, pela ajuda, pelos esclarecimentos e pelo fornecimento de alguns
materiais utilizados na metodologia.
A todos os colegas do laboratório de bioensaio e histologia. Em especial, agradeço a Daiana e
a Cintya pela amizade, apoio e incentivo.
Ao técnico Antônio Sérgio Pascon, pela atenção e disponibilidade em ajudar, coletando as
abelhas até mesmo durante as férias.
Ao Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca e Dr. Mário Sérgio Palma, por permitirem o uso de
equipamentos de seus laboratórios.
À Necis, à Vanessa, à Ita, à Marcela e à Olívia pela atenção e pelos empréstimos de material.
Ao técnico Gerson Mello Souza, pelo auxílio em laboratório, pela amizade e por tornar a
rotina no laboratório muito mais animada e divertida.
Ao “The nine” (Mila, Dani, Dé, Lara, Quel, Nat, Ina e Marcelo) pelo apoio e incentivo em
todas as horas.
À Juliana Vasconcelos Mello, Karina Fernandes Baccile e Larissa Adorno Pivatto, provas de
que a amizade resiste à distância.
Ao José Diego e à Miriam, meus cunhados, pela amizade.
Ao Pedro, amigo e namorado, que sempre me confortou nos momentos de insegurança e
desespero. Muito abrigado por acreditar em mim e por me apoiar.
v
A toda minha família, principalmente ao meu irmão, Diego, e aos meus pais, Lodovico e
Fátima, pela confiança, pelo amor e pelo incentivo. Por que me ensinaram que o sucesso é
conseqüência de muito trabalho e perseverança.
A todos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho e me
ajudaram a ter sucesso nessa etapa.
vi
“O sucesso nasce do querer, da determinação
e persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
José de Alencar
vii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................. 10
2. OBJETIVOS GERAIS...................................................................................... 19
3. ARTIGO 1.......................................................................................................... 20
A comparação do efeito de doses subletais do inseticida imidaclopride no lobo
óptico, corpo pedunculado e lobo antenal de Apis mellifera africanizada.
4. ARTIGO 2.......................................................................................................... 48
Alterações morfológicas e histoquímicas nas células digestivas do ventrículo
de abelhas Apis mellifera africanizada expostas a doses subletais do inseticida
imidaclopride.
5. ARTIGO 3.......................................................................................................... 72
Avaliação dos efeitos das doses subletais do inseticida imidaclopride no túbulo
de malpighi de Apis mellifera africanizada.
6. DISCUSSÃO GERAL....................................................................................... 93
7. CONCLUSÃO GERAL.................................................................................... 95
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................ 96
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 97
viii
RESUMO
Uma preocupação atual consiste no uso indiscriminado de muitas substâncias sintéticas no
controle de pragas na agricultura. Estudos atuais indicam que algumas dessas substâncias
podem estar envolvidas em casos de intoxicação de insetos, como as abelhas, que são
fundamentais em muitas culturas, devido à atividade de polinização realizada por elas. No
Brasil, um dos inseticidas mais usados nas culturas de café, citrus, algodão e cana-de-açúcar é
o imidaclopride, que apresenta ação neurotóxica para os insetos. Seus metabólitos circulam
por todo o organismo e entram em contato com diversos órgãos. A exposição a doses
subletais deste inseticida pode provocar mudanças na fisiologia e no comportamento das
abelhas, sendo que tais alterações podem ser mais intensas ou não, dependendo do período de
exposição. Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da
exposição crônica a doses subletais (DL50/100, DL50/50 e DL50/10) do inseticida
imidaclopride, no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada.
Para isso os órgãos estudados das abelhas expostas e dos controles foram submetidos a
análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica, após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de
exposição. No cérebro das abelhas expostas foi possível observar alterações morfológicas,
histoquímicas e imunocitoquímicas nos lobos ópticos de todos os grupos expostos, enquanto
que nos corpos pedunculados observou-se tais alterações apenas no grupo exposto à DL50/10.
Já nos lobos antenais as alterações não foram observadas. No ventrículo das abelhas de todos
os grupos expostos ao inseticida, a análise morfológica permitiu observar de uma maneira
geral um aumento na quantidade de células eliminadas no lúmen, na quantidade de secreção
apócrina eliminada no lúmen e na quantidade de halos pericromatínicos nas células digestivas.
As análises histoquímicas permitiram confirmar a presença de núcleos picnóticos, mostrar a
presença de fragmentos e indicar áreas degeneradas nas células digestivas. A técnica
imunocitoquímica não evidenciou a presença de núcleos positivos à reação de Tunel. No
túbulo de Malpighi de todos os grupos expostos foi possível observar na análise morfológica,
de uma maneira geral, um aumento na quantidade de células com núcleo picnótico, na
eliminação de parte da célula para o lúmen e da homogeneização da coloração do citoplasma.
Além disso, foi possível observar a presença de vacuolização citoplasmática, de células
eliminadas no lúmen e acúmulo de material amorfo no lúmen. As técnicas histoquímicas
permitiram confirmar ocorrência de núcleos picnóticos e observar uma intensificação na
coloração do núcleo e uma coloração mais uniforme do citoplasma. A técnica de
imunocitoquímica empregada mostrou núcleos positivos ao Tunel nos órgãos das abelhas
expostas ao imidaclopride. Logo, é possível concluir a partir dos resultados obtidos, que o
imidaclopride é citotóxico para o cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi, de abelhas
expostas a doses subletais deste inseticida. O lobo óptico mostrou ser mais sensível ao
inseticida, uma vez que as alterações ocorreram em todas as doses testadas.
Palavras-chave: citotoxicidade, abelhas, inseticida.
ix
ABSTRACT
The indiscriminate use of synthetic chemicals to control pests in agriculture is not a new
concern. Recent studies indicate that some of these substances are involved in cases of
poisoning bees, which are fundamental in many cultures due to the activity of pollination. In
Brazil, an insecticide widely used on crops of coffee, citrus, cotton and sugar cane, is
imidacloprid, which is neurotoxic to insects. However, its metabolites circulate throughout the
body and come into contacting with another organs. Exposure to sublethal doses of this
insecticides causes changes in physiology and behavior of bees, and these changes can be
more intense depending on exposure period. Therefore, this study aimed to evaluate the
effects of chronic exposure to sublethal doses (DL50/100, DL50/50 and DL50/10) of
imidacloprid in the brain, midgut and the Malpighian tubules of africanized bees (Apis
mellifera). For this, the organs of treated and untreated bees were subjected to morphological,
histochemical and immunocytochemical techniques, dissecting the bees after 1, 3, 5, 7 and 10
days. In the brains of exposed bees it was possible to observe morphological, histochemical
and immunocytochemical alterations on optic lobes of all bees, whereas in the mushroom
bodies, alterations was observed only in the group exposed to DL50/10. The antennal lobe
presented no alterations after the treatment in all doses. In the midgut of all exposed groups of
bees, morphological analysis showed in general an increase in the number of digestive cells
and apocrine secretion eliminated in the lumen and in the number of peripherical chromatin
halos were also increased. The histochemical techiniques confirmed the presence of pyknotic
nuclei, showing the presence of nuclear fragments and degenerated areas in cytoplasm of
digestive cells. The immunocytochemical technique showed no presence of positive nuclei for
Tunel reaction in digestsive cells. In Malpighian tubules of exposed bees was observed in
general, through morphological analysis, an increase in the number of cells with a picnotic
nucleus, eliminating part of the cell into the lumen and the homogenization of staining of the
cytoplasm. Moreover, it was observed the presence of vacuolization of cells and amorphous
material accumulated in the lumen. Histochemical techniques allow confirming the
occurrence of pyknotic nuclei, observed through the increase staining of the nucleus besides
the uniform staining of the cytoplasm. The immunocytochemical technique showed positive
nuclei in honeybees exposed to imidacloprid. Based on results obtained it is possible to
conclude that imidacloprid is cytotoxic to the brain, midgut and the Malpighian tubule of bees
exposed to sublethal doses of insecticide. The optic lobe was the most sensitive to the
insecticide, once the alterations occurred for all concentrations.
Key words: citotoxicity, bee, insecticide.
Introdução geral _______________________________________________________________________ 10
1. INTRODUÇÃO GERAL
Apis mellifera, abelha pertencente à família Apidae, foi introduzida no Brasil em 1839,
e hoje é um poli-híbrido resultante do cruzamento das subespécies A. mellifera scutellata
(oriunda da África), A. mellifera mellifera (vinda do norte da Europa), A. mellifera ligustica
(originária da Itália e norte da Ioguslávia) e A. mellifera iberica (provinda da Europa
Ocidental) (RUTTNER, 1988). A. mellifera encontra-se no grupo das abelhas eussociais, no
qual há divisão de trabalho por castas de acordo com as tarefas desempenhadas na colônia.
Dessa forma, enquanto a rainha e o zangão têm função reprodutiva, as operárias têm a tarefa
de realizar toda a manutenção da colônia, desde construção, limpeza e defesa até a
alimentação da rainha e da cria. Estas atividades são desempenhadas de acordo com a faixa
etária das operárias (CRUZ-LANDIM; MELLO, 1981). As operárias recém-emergidas, por
exemplo, inicialmente fazem a limpeza de si mesmas e posteriormente limpam células que
contiveram cria. As operárias nutridoras alimentam a cria e as operárias forrageiras saem para
o campo à procura de pólen e néctar (FREE, 1980).
As forrageiras são excelentes insetos polinizadores e, portanto, contribuem para a
manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem. Sugere-
se que um terço da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por
abelhas (WILLIANS,1995; KLEIN et al., 2007).
Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas
terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999). As abelhas são
importantes como polinizadores e devido ao desmatamento de seus hábitats naturais, elas tem
aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. Entretanto, o aumento dessa
atividade, está levando a uma redução no número de espécies desses insetos, devido ao
contato com inseticidas normalmente utilizados no controle de insetos-praga (MALASPINA;
SILVA-ZACARIN, 2006).
Fletcher e Barnett (2003) realizaram um plano de investigação no Reino Unido, para
casos de envenenamento de abelhas por inseticidas utilizados na agricultura. Assim que
detectavam um incidente, amostras de abelhas mortas eram submetidas aos diagnósticos de
doenças e análises químicas, a fim de identificar-se qualquer tipo de resíduo. Os acidentes por
envenenamento foram causados, em 46% dos casos, por uso de inseticidas proibidos ou não-
especificados.
Introdução geral _______________________________________________________________________ 11
Porrini et al. (2003) monitoraram colônias de abelhas em áreas próximas a Bologna,
Itália. Uma vez por semana o número de abelhas mortas era registrado. Caso esse número
fosse superior a 250 abelhas/semana/lugar, eram realizadas as análises em laboratórios. O
monitoramento e as análises feitas permitiram caracterizar áreas, indicar a época de maior
risco de envenenamento, identificar os inseticidas mais utilizados, como melationa e
dimetoato, e também, identificar moléculas de uso não permitido, como parationa e
metidationa. Nessa mesma área e com a mesma metodologia de monitoramento e coleta dos
autores anteriores, Ghini et al. (2004) detectaram também a presença de 35 inseticidas em
culturas, principalmente de cereais, batatas e beterraba.
No ano de 2002, foi observada uma elevada mortalidade de colônias de abelhas, em
apiários localizados no leste da Romênia. Foram realizadas análises bacteriológicas,
parasitológicas e testes de toxicidade para detectar níveis de inseticidas em amostras de
abelhas e no pasto apícola das áreas afetadas. As análises (bacteriológicas e parasitológicas)
apresentaram-se negativas. Nos testes de toxicidade, identificou-se o inseticida deltametrina
como responsável pela mortalidade das abelhas (NICA et al., 2004).
Na França, Chauzat et al. (2006) também realizaram um monitoramento de colônias de
abelhas. Durante três anos as colônias foram visitadas quatro vezes por ano. Em cada visita
amostras de pólen foram coletadas e submetidas a análises específicas de cromatografia
líquida e espectrometria de massa. Foram identificados 19 compostos, sendo o imidaclopride
o mais freqüente nas amostras. Os resíduos mais concentrados foram coumafos e tau-
fluvalinate.
Em alguns casos os efeitos do inseticida nas abelhas não são imediatamente notados.
De fato, pequenas doses da molécula não causam a morte das abelhas, porém podem induzir
mudanças no comportamento, além da diminuição na atividade de forrageamento ou
desorientação, afetando temporariamente toda a colônia (GUEZ; ZHANG; SRINIVASAN,
2005; vanENGELSDORP; MEIXNER, 2010). Essas doses que provocam tais efeitos são
conhecidas como doses subletais, ou seja, doses abaixo da dose letal média (DL50).
Entre os pesticidas mais utilizados na atualidade, os neonicotinóides – inseticidas
neurotóxicos – possuem considerável representatividade, devido a sua grande eficiência no
combate aos insetos praga, substituindo os compostos organofosforados e metilcarbamatos,
que tiveram seu uso diminuído devido à toxicidade e à diminuição de sua eficiência
(TOMIZAWA; CASIDA, 2003).
Atualmente, os neonicotinóides têm sete representantes, sendo o imidaclopride o
primeiro a ser comercializado em 1991, pela Bayer CropScience. Esse grupo também pode ser
Introdução geral _______________________________________________________________________ 12
dividido em dois outros: (i) um formado por aqueles que possuem o radical Nnitroguanidina
(imidaclopride, tiametoxam, clothianidin e dinotefuram); (ii) e outro com Nciano- amidina
(acetamipride e tiaclopride).
No Brasil, o inseticida imidaclopride é usado como defensivo agrícola, no controle de
pragas aéreas e do solo, nas culturas de cana-de-açúcar, citros, algodão e café, e é conhecido
comercialmente como Gaucho, Confidor, Premier, Provado, Evidence, Connect, Cropstar,
Winner, Kohinor e Warrant (BRASIL, 2008). No entanto, o uso desse produto já está proibido
na França desde 1999, por representar a intoxicação para abelhas e outros animais (GODOY,
2004).
Estudos realizados com abelhas européias (A. mellifera) verificaram para o inseticida
imidaclopride a DL50 oral de 3,7 ηg/abelha (SCHMUCK et al., 2001). Suchail, Guez, e
Belzunces (2000) verificaram a DL50 oral e tópica do imidaclopride para A. mellifera
mellifera e A. mellifera caucasica. Para ambas as subespécies, encontrou-se uma DL50 oral de
24 h e 48 h no valor de 5 ηg/abelha. Para a DL50 tópica, os valores foram de 24 ηg/abelha para
A. mellifera mellifera e 14 ηg/abelha A. mellifera caucasica.
Decourtye et al. (2004b) compararam os efeitos de doses subletais dos inseticidas
imidaclopride e deltametrina em abelhas A. mellifera ligustica. Uma solução de açúcar
contendo 24 �g Kg –1 de imidaclopride ou 500 �g Kg –1 de deltametrina foi oferecida às
abelhas. A contaminação do xarope por imidaclopride e deltametrina induziu um menor
forrageamento e menor atividade de entrada na colônia por parte das operárias.
Bortolotti et al. (2003) verificaram os efeitos das doses subletais do imidaclopride no
forrageamento e no retorno à colônia para abelhas A. mellifera. As abelhas eram treinadas
para forragear em um campo artificial, e era oferecido xarope como alimento. Foram testadas
três concentrações da substância: 100 ppb, 500 ppb e 1000 ppb, sendo que as duas últimas
apresentaram efeito repelente para as abelhas. Os resultados mostraram que as abelhas do
controle voltavam à colônia, retornando ao alimentador em até 5 horas. Aquelas tratadas com
a solução de 100 ppb também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador
após 24 horas. Já as abelhas tratadas com 500 ppb e 1000 ppb, desapareceram por 24 horas,
sem voltar a colônia ou ao alimentador.
Medrzycki et al. (2003) também avaliaram o efeito das doses subletais do
imidaclopride, nas concentrações de 100 ppb e 500 ppb, no comportamento de abelhas A.
mellifera. Para ambos os tratamentos, foram observadas diminuição da mobilidade e da
comunicação, o que pode ter comprometido o comportamento social desses animais. Outro
estudo avaliou os efeitos do imidaclopride nas concentrações 0,5μg/L e 5μg/L. Os resultados
Introdução geral _______________________________________________________________________ 13
mostraram que houve toxicidade do imidaclopride em relação à atividade das abelhas adultas,
à freqüência de condução de pólen durante o forrageamento e ao número de células
operculadas (FAUCON et al., 2005).
Rossi (2008) estabeleceu a DL50 oral do imidaclopride e verificou os efeitos de doses
subletais associados às possíveis alterações morfológicas no cérebro de A. mellifera
africanizada. A DL50 oral aguda estabelecida para o imidaclopride foi de 80,9 ηg/abelha. Para
verificar os efeitos das doses subletais, os grupos de abelhas foram tratados com xarope nas
concentrações 25, 50 e 80,9 ηg/abelha por um período de 24 horas. No entanto, comparando-
se os cérebros de abelhas tratadas e não tratadas com o inseticida, não foram verificadas
alterações morfológicas.
Suchail, Debrauwer e Belzunces (2003) verificaram o metabolismo do imidaclopride
em A. mellifera. As abelhas foram tratadas com soluções de 20 e 50 μg Kg –1 de abelha. O
imidaclopride apresentou uma meia-vida de 4,5 a 5 horas e foi rapidamente metabolizado em
5-hidroxiimidaclopride e olefin. Os dois metabólitos apresentaram uma concentração máxima
após 4 horas da ingestão, exceto para o 5- hidroxiimidaclopride no tratamento de 20 μg Kg –1.
Essa concentração máxima coincidiu com o aparecimento da mortalidade induzida pelo
imidaclopride.
Bendahou, Fleche e Bounias (1999), verificaram efeitos biológicos e bioquímicos da
exposição crônica à uma dieta contendo baixas doses de cipermetrina em colônias de A.
mellifera. O inseticida foi adicionado ao xarope na concentração de 12,5 µg/L e oferecido às
colônias por 5 meses. Durante o período em que o estudo foi realizado, verificaram muitas
perturbações dos grupos tratados comparados ao grupo controle, como a taxa de mortalidade
na colônia, a área de cria e o comportamento das abelhas.
Outro estudo avaliando o efeito da exposição ao inseticida imidaclopride, em dieta
crônica para A. mellifera, foi realizado por Schmuck (2004), com o inseticida imidaclopride.
O alimento foi oferecido às abelhas nas concentrações de 0,1, 1 e 10 µg de inseticida / L de
xarope, durante 10 dias. Não se verificou mortalidade mais elevada nos grupos tratados com o
inseticida comparado ao controle.
Uma metodologia interessante para se avaliar o efeito de inseticidas sobre os processos
de aprendizagem e memória é a observação da resposta de extensão da probóscide (REP).
Esse método visa reproduzir a interação entre abelha e a planta. Quando a abelha forrageia e
chega ao botão floral, ela instintivamente estende sua probóscide, como reflexo dos receptores
gustativos na antena, tarso ou outras partes que são estimuladas pelo néctar. Esse reflexo
induz a abelha a coletar o néctar e memorizar o odor floral ali presente (DECOURTYE et al.,
Introdução geral _______________________________________________________________________ 14
2005). Utilizando-se esse método, Decourtye et al. (2004a) verificaram uma deficiência no
aprendizado olfatório das abelhas, após trinta minutos do tratamento oral com imidaclopride.
Este resultado, que mostra deficiência de aprendizado, pode ser explicado levando-se em
consideração o modo de ação do imidaclopride. Este inseticida atua inibindo a ação de
receptores nicotínicos acetilcolina dos insetos, agindo mais especificamente nas subunidades
α do receptor nicotínico (BUCKINGHAM et al., 1997). Esses receptores são encontrados em
muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas nos processos de
aprendizagem e memória, como os cálices do corpo pedunculado (BICKER, 1999).
O sistema nervoso central das abelhas é um sistema de condução e processamento de
informações que assegura uma coordenação rápida da função dos efetores, produzindo ou
modificando respostas aos estímulos percebidos pelos órgãos sensoriais. Os elementos
característicos são os neurônios, que percebem e transmitem estímulos informacionais; e as
glias, que são células de sustentação. O sistema nervoso central é constituído pelo cordão
nervoso ventral e pelo cérebro.
O cérebro é o principal centro de associação, recebendo estímulos dos órgãos
sensoriais da cabeça e da parte posterior do corpo. Apresenta regiões que contém corpos
celulares de neurônios, chamadas de somata, e regiões de prolongamento, chamada neurópila.
Ele é constituído pela fusão de três gânglios: protocérebro, deutocérebro e tritocérebro.
O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis,
corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas
dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o
comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante
de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo
pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com
corpos celulares chamados de células de Kenyon (FARRIS, 2005; FAHRBACH, 2006). Os
lobos ópticos contêm os elementos nervosos dos olhos compostos e projetam-se lateralmente
ao protocérebro.
O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém axônios motores e
sensoriais que chegam às antenas (CRUZ-LANDIN, 2009).
O tritocérebro é reduzido e dele partem os conectivos que ligam o cérebro ao gânglio
subesofageano (DALY; DOYEN; PURCELL III, 1998; CRUZ-LANDIM, 2009).
Abdalla (1997) estudou a área ocupada pelos corpos pedunculados em algumas
espécies de abelhas. Os cérebros foram preparados com métodos histológicos e através da
preparação de lâminas mediram-se as estruturas cerebrais, calculando-se a área total e a
Introdução geral _______________________________________________________________________ 15
porcentagem da área ocupada pelos corpos pedunculados e glomérulos. A. mellifera
apresentou maior desenvolvimento dos corpos pedunculados e dos glomérulos, evidenciando
a relação dessas áreas com o alto desenvolvimento social dessa espécie.
Roat e Cruz-Landim (2005) estudaram as diferenças morfológicas do cérebro de
operárias, rainhas e zangões de A. mellifera, associadas com as diferenças comportamentais
de cada casta e sexo. Os cérebros foram dissecados e preparados de acordo com rotina
histológica. Nos zangões, o protocérebro é mais desenvolvido, devido ao maior
desenvolvimento dos lobos ópticos, uma vez que eles não participam da organização social,
mas precisam de uma visão exata para o acasalamento e sua própria sobrevivência. Nas
operárias, entretanto, as partes mais desenvolvidas são os corpos pedunculados, onde se
verifica um cálice mais profundo com grande número de pontos convergentes para o
pedúnculo, indicando a presença de mais sinapses. Essa maior quantidade de sinapses é
necessária para que as operárias possam desenvolver todas as suas funções na colônia, como
defesa, forrageamento e cuidado e alimentação das abelhas jovens.
O inseticida imidaclopride age no sistema nervoso dos insetos e pode interferir no
processo de aprendizagem das abelhas. No entanto, há poucos estudos relacionados à
citoxicidade de órgãos não-alvo, como intestino e túbulos de Malpighi, responsáveis pela
digestão e absorção, e excreção, respectivamente. A avaliação da morfologia dos mesmos
pode revelar alterações ultra-estruturais induzidas por agentes tóxicos (BRAECKMAN;
RAES, 1999; BRAECKMAN et al., 1999; SOROUR, 2001).
Além de verificar o efeito do imidaclopride no sistema nervoso da abelha, é
importante analisar a toxicidade deste inseticida para tecidos não alvos, que são atingidos
durante a rota de metabolização e excreção deste composto.
Um dos órgãos chave para análise da toxicidade é o intestino, já que é responsável
pela digestão e absorção do alimento. Além disso, é uma das primeiras fontes de contato na
administração oral do inseticida
O canal alimentar das abelhas é dividido em três regiões: estomodeo ou intestino
anterior; mesêntero ou intestino médio, também chamado de ventrículo; proctodeo ou
intestino posterior.
O ventrículo é a região do tubo digestório onde ocorre a maior parte da digestão dos
alimentos e da absorção dos produtos da digestão. É um tubo cilíndrico, grosso e longo, que
se dobra em forma de arco no interior da cavidade abdominal. A sua parede é constituída pelo
epitélio e por fibras musculares viscerais.
Introdução geral _______________________________________________________________________ 16
No epitélio são encontrados quatro tipos celulares, sendo que dois são de células
prismáticas, situadas na membrana basal e emergem no lúmen com o ápice coberto por
microvilosidades, e outros dois são de células basais, sem que seu pólo apical alcance o
lúmen. Entre as células prismáticas estão aquelas que sintetizam a membrana peritrófica, e as
que secretam enzimas digestivas e absorvem os produtos da digestão, sendo essas últimas
chamadas de células digestivas. Já entre as células basais estão as células regenerativas e as
endócrinas. As células regenerativas são células indiferenciadas, agrupadas em ninhos, que
substituem as células digestivas eliminadas no lúmen por desgaste (BOWEN, I.; BOWEN, S.;
JONES, 1998; CAVALCANTE; CRUZ-LANDIM, 1999; CRUZ-LANDIM, 2009).
Quando as células digestivas estão maduras, é possível observar três zonas distintas:
basal, com muitas invaginações da membrana plasmática; mediana, com núcleo, retículo
endoplasmático granular e Golgi; e apical, com grânulos de secreção, além de mitocôndrias e
microvilosidades. Os grânulos pequenos e elétrons-densos localizados logo abaixo da
membrana plasmática, provavelmente correspondem à secreção, enquanto outros com
organização em camadas concêntricas representam material de excreção, e outros ainda são
vacúolos auto ou heterofágicos (CRUZ-LANDIM, 2009).
Outro órgão chave para análise da toxicidade é o túbulo de Malpighi, responsável pela
excreção de substâncias do organismo. Dessa forma, esse órgão entra em contato com o
imidaclopride e seus metabólitos presentes na hemolinfa.
O sistema excretório é o responsável primário pela manutenção da homeostase. Nos
insetos, é composto, na maioria das vezes, por um número variável de túbulos de Malpighi, os
quais têm seu ponto de desembocadura no intestino, onde terminam em fundo cego (HABIB,
2003; CRUZ-LANDIM, 2009).
Os túbulos produzem um filtrado a partir da hemolinfa, chamado de urina primária,
que se apresenta inicialmente como um fluido iso-osmótico, que serve como carreador dos
produtos de excreção, como compostos tóxicos e excesso de íons. A medida que passa pelo
interior do túbulo, vai sendo modificado, através da reabsorção de água e outras substâncias
indispensáveis ao organismo, até se transformar na urina que será eliminada.
Os túbulos são constituídos por uma camada células epiteliais que repousam sobre
uma lâmina basal. A forma das células e conteúdo do lúmen mudam ao longo do
comprimento do túbulo, que apresenta a extremidade apical mais fina, e a basal mais alargada
(CRUZ-LANDIM, 2009).
Nos órgãos de animais submetidos a tratamentos com substâncias tóxicas, que
conduzem a um alto nível de estresse nas células, pode ocorrer a indução do processo de
Introdução geral _______________________________________________________________________ 17
morte celular. Essa indução pode ocorrer a partir da ativação das vias sinalizadoras
intracelulares, por diversos agentes exógenos e/ou endógenos, que culminam na ativação do
programa de morte celular (MEYER; SILVA, 1999).
Os processos de morte celular podem ser classificados em três tipos de acordo com
suas características morfológicas: apoptose, autofagia e necrose (KERR; WYLLIE; CURRIE,
1972). Nesse primeiro tipo de classificação, as duas primeiras são consideradas “Morte
Celular Programada”, enquanto que a necrose seria uma morte celular patológica e não
programada geneticamente. Contudo, estudos recentes mostram que há uma regulação
fisiológica em células necróticas e que a necrose não ocorre somente em situações
patológicas, mas é também um componente de alguns processos fisiológicos
(PROSKURYAKOV; KONOPLYANNIKOV; GABAI, 2003).
Os três tipos de morte celular podem ser classificados com base nas características
morfológicas distintas que as diferem uma das outras. Na apoptose, o núcleo e o citoplasma se
condensam, a célula morre e fragmenta-se em corpos apoptóticos delimitados por membrana,
os quais são fagocitados e digeridos por macrófagos ou células vizinhas, portanto não há
vazamento do conteúdo celular. A autofagia tem como principal característica o acúmulo de
vacúolos autofágicos no citoplasma. Já na necrose as células incham, a membrana plasmática
é rompida e ocorre extravasamento do conteúdo citoplasmático (BOWEN, I.; BOWEN, S.;
JONES, 1998).
Em tecidos de insetos, a classificação do tipo de morte celular gera controvérsias, pois
exibe tanto características de apoptose como de autofagia. Silva-Zacarin (2007) demonstrou
que a apoptose e a morte celular autofágica contribuem para a degeneração da porção
secretora das glândulas salivares de Apis mellifera no final do estágio larval.
A morte celular programada em insetos está relacionada com a reorganização tecidual
que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de algum órgão na fase adulta
(GREGORC; POGACNIK; BOWEN, 2004).
No Brasil, o consumo anual de inseticidas tem sido superior a 300 mil toneladas de
produtos comerciais, ou seja, expresso em quantidade de ingrediente-ativo, é consumido
anualmente no país cerca de 130 mil toneladas, representando um aumento no consumo de
inseticidas de 700% nos últimos quarenta anos, enquanto a área agrícola aumentou 78% nesse
período (SPADOTTO et al., 2004). Embora em países desenvolvidos os estudos para
estabelecer os efeitos dos inseticidas no comportamento das abelhas estejam cada vez mais
freqüentes, no Brasil os efeitos das doses subletais tem sido pouco estudados. Além disso, não
há estudos referentes ao efeito da exposição a uma dieta crônica de imidaclopride em A.
Introdução geral _______________________________________________________________________ 18
mellifera africanizada, principalmente no que tange o efeito deste composto em sua rota de
metabolização no organismo, bem como seus efeitos sobre o órgão alvo de sua ação. Dessa
forma, faz-se necessário o estudo do ventrículo, dos túbulos de Malpighi e do cérebro, onde
ocorrem, respectivamente, a absorção e possível metabolização do composto químico
ingerido, excreção e provável ação do mesmo.
Objetivos Gerais _______________________________________________________________________ 19
2. OBJETIVOS GERAIS
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das doses subletais do
inseticida imidaclopride no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi em operárias de Apis
mellifera africanizada.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 20
3. ARTIGO 1
COMPARAÇÃO DO EFEITO DE DOSES SUBLETAIS DO INSETICIDA
IMIDACLOPRIDE NO LOBO ÓPTICO, CORPO PEDUNCULADO E LOBO
ANTENAL DE Apis mellifera AFRICANIZADA.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 21
Resumo
Atualmente diversas substâncias sintéticas são utilizadas nas áreas de cultivo para o combate
de insetos-praga. No entanto, o uso indiscriminado desses produtos pode afetar insetos não-
alvo, como as abelhas que são essenciais nessas áreas devido à polinização. Além disso, como
esses insetos estão expostos continuamente a esses compostos, devido ao forrageamento,
foram relatados muitos casos de intoxicação em diversos países. Como conseqüência, pode-se
verificar mudanças fisiológicas e comportamentais induzidas pela exposição a doses subletais,
ou ainda a morte desses insetos. Tais alterações podem estar ou não relacionadas ao tempo de
exposição a esses compostos. No Brasil, um dos inseticidas mais utilizados nas culturas de
cana-de-açúcar, café e citrus é o imidaclopride, embora já tenha sido proibido em outros
países devido à intoxicação das abelhas e outros seres vivos. Esse princípio ativo tem ação no
sistema nervoso do inseto. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da
exposição crônica a doses subletais do inseticida imidaclopride, no cérebro de Apis mellifera
africanizada. Para isso o órgão estudado das abelhas expostas e do controle foram submetidos
à análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica. A partir dos resultados obtidos na
comparação do cérebro das abelhas dos grupos controles e expostos, foi possível observar
algumas alterações celulares. Nos corpos pedunculados do grupo exposto à DL50/10 por 3 dias
ou mais, e nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os períodos de
exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à DL50/100 e
DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição, foi possível observar com a coloração H.E. a
presença de células compactadas Com a reação de Feulgen, observou-se a presença de
algumas células com núcleos picnóticos, enquanto que com a técnica de Xilidine Ponceau foi
possível observar células com núcleos fortemente corados. Todas essas características
indicam a ocorrência de morte celular. Além disso, nos corpos pedunculados das abelhas
expostas à DL50/10 por 10 dias, também se observou a presença de células com aspecto
inchado. A partir da técnica imunocitoquímica empregada, foi possível confirmar a ocorrência
de morte celular, além de verificar tais mortes também no corpo pedunculado das abelhas
expostas a DL50/10 por 1 dia e nos lobos ópticos de todos os grupos e períodos de exposição.
Já nos lobos antenais, não foi observada qualquer alteração morfológica, histoquímica ou
imunocitoquímica. Dessa maneira, foi possível concluir que doses subletais do imidaclopride
tem ação citotóxica no cérebro das abelhas expostas e que o lobo óptico foi a estrutura mais
sensível ao inseticida.
Palavras-chave: citotoxicidade, lobo óptico, corpo pedunculado, abelha, inseticida.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 22
1. Introdução
Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas
terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999), e contribuem para a
manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem
(WILLIANS, 1995).
Globalmente, o valor da polinização por insetos tem sido estimada em 212 bilhões de
dólares, o que representa cerca de 9,5% do valor total da produção agronômica (GALLAI et
al., 2009). Entre os principais polinizadores estão as abelhas, que são tidas como as mais
eficientes em muitas culturas (NRC, 2006) e as mais importantes para a maioria das
monoculturas mundiais (MCGREGOR, 1976; DELAPLANE; MAYER, 2000). Sugere-se que
35% da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por esses insetos
(KLEIN et al., 2007; WILLIANS, 1995).
Embora o crescimento do número de colônias seja evidente, em algumas localidades
como Europa e Estados Unidos da América a perda de colônias está sendo um grande
problema aos apicultores. Tal fato é conhecido como Distúrbio do Colapso das Colônias e
ainda não tem causas definidas, embora se especule que possa haver a interação de alguns
fatores que afetam a saúde da colônia. Entre eles temos as doenças bacterianas e infestações
por ácaro. Além das doenças, um fator preocupante é o envenenamento das abelhas por
substâncias químicas presentes no ambiente. Isso porque, devido ao desmatamento de seus
hábitats naturais, elas têm aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. A
agricultura moderna depende cada vez mais do uso de substâncias químicas para controlar
ervas daninhas, fungos e artrópodes pragas nas áreas de cultivo. No entanto, como
conseqüência da atividade de forrageamento as abelhas ficam mais expostas a esses químicos
lançados no ambiente, o que está pode estar levando a uma redução no número de espécies
desses insetos (CROFT, 1990; THOMPSON, 2003; MALASPINA; SILVA-ZACARIN,
2006; DESNEUX; DECOURTYE; DELPUECH, 2007).
O consumo anual de inseticidas tem sido superior a 300 mil toneladas de produtos
comerciais. Expresso em quantidade de ingrediente-ativo, é consumido anualmente cerca de
130 mil toneladas, representando um aumento no consumo de inseticidas de 700% nos
últimos quarenta anos, enquanto a área agrícola aumentou 78% nesse período (SPADOTTO et
al., 2004). Entre os inseticidas mais utilizados nas culturas brasileiras estão os da classe dos
neonicotinóides, devido a sua grande eficiência no combate aos insetos. O imidaclopride é
aplicado principalmente nas culturas de cana-de-açúcar, café, citrus e algodão (BRASIL,
2011), embora haja relatos de sua toxicidade para abelhas e outros animais (GODOY, 2004).
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 23
Este inseticida atua inibindo a ação de receptores nicotínicos de acetilcolina dos
insetos, agindo mais especificamente nas subunidades α do receptor (BUCKINGHAM et al.,
1997). Esses receptores são encontrados em muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo
as áreas envolvidas nos processos de aprendizagem e memória (BICKER, 1999).
O sistema nervoso das abelhas inclui o cérebro e o cordão nervoso ventral. O cérebro
de uma abelha adulta apresenta três massas ganglionares: protocérebro, deutocérebro e
tritocérebro.
O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis,
corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas
dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o
comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante
de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo
pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com
corpos celulares chamados de células de Kenyon. O cálice é dividido em anéis de neurópila
em torno dos corpos celulares: a borda, que corresponde ao lábio; o colar, que corresponde às
paredes; e a base, que corresponde ao fundo do cálice, do qual parte o pedúnculo. As células
de Kenyon estão diferenciadas em compactas internas, não compactas e compactas externas,
de acordo com a quantidade de citoplasma em relação ao núcleo (FARRIS, 2005;
FAHRBACH, 2006). Os lobos ópticos são extensões do protocérebro em direção aos olhos
compostos. Cada lobo é constituído por três massas de neurópilas denominadas lobo, medula
e lâmina. Entre duas massas de neurópila, os axônios se cruzam produzindo regiões de
quiasma. Entre o lobo e a medula está o localizado o quiasma interno e entre a medula e a
lâminas está o quiasma externo.
O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém as arborizações
terminais dos axônios dos neurônios sensoriais das antenas e os corpos celulares dos nervos
motores dos apêndices. Cada lobo está relacionado a uma das antenas e dele parte um nervo
antenal, que contém axônios motores e sensoriais que chegam às antenas. Os lobos são
basicamente constituídos por neurópila, organizada sob a forma de uma região central menos
compacta e vários glomérulos periféricos de neurópila compacta (CRUZ-LANDIN, 2009).
O tritocérebro é composto por um par de lobos, ligados por uma comissura transversal,
localizados ventralmente aos lobos antenais. Dessa região, partem os conectivos que ligam o
cérebro ao gânglio subesofageano (DALY; DOYEN; PURCELL III, 1998; CRUZ-LANDIM,
2009).
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 24
Diversos substâncias xenobióticas podem promover a indução da morte celular pela
ativação das vias sinalizadoras intracelulares, de forma direta ou indireta. O trabalho
desenvolvido por Braeckman et al. (1999) é um exemplo dessa ativação de morte celular em
resposta a tais compostos. Esses autores detectaram alterações ultra-estruturais em cultura de
células de insetos expostas à doses subletais de cádmio, que podem estar relacionadas à
alterações na maquinaria de síntese protéica, de proteínas envolvidas na ativação do programa
de morte celular em resposta ao agente químico testado.
Várias técnicas têm sido utilizadas para estudar a morte celular. Aspectos
morfológicos deste processo podem ser visualizados por microscopia de luz, já que as
manifestações de morte celular incluem mudanças no aspecto do núcleo e na morfologia
celular como: redução do volume nuclear e condensação da cromatina (picnose), mudança no
volume celular, perda de regiões especializadas da membrana plasmática, tais como
microvilosidades e complexos juncionais provocando mudanças de forma, com tendência para
a esfericidade (ALBERTS et al., 2010).
Assim, técnicas morfológicas associadas a técnicas histoquímicas para detecção de
proteínas e que permitam análise da compactação da cromatina podem ser ferramentas
valiosas para verificação de alterações estruturais, que podem levar à morte celular,
provocada por agentes xenobióticos.
Além disso, como a característica que tem sido considerada mais marcante nas
modificações do material nuclear durante a morte celular é a fragmentação do DNA, que
ocorre em conseqüência da ativação de endonucleases (WYLLIE, 1981), a presença de
células em processo de morte pode ser confirmada pela utilização de técnicas que a detectem.
As endonucleases cortam a cadeia dupla de DNA em regiões inter-nucleossômicas, dando
origem a nucleotídeos com número de pares de base múltiplos de 180 que podem ser
detectadas por técnicas imunocitoquímicas, como a técnica de TUNEL, que marca as novas
extremidades 3’-OH geradas pela fragmentação.
Muitos estudos têm sido feitos para avaliar a toxicidade do imidaclopride em abelhas.
No estudo realizado por Schmuck et al. (2004), foi avaliada a toxicidade crônica deste
inseticida. No entanto, não foi possível observar aumento da mortalidade quando comparados
os grupos expostos por menor e maior período. Isso pode ter ocorrido, pois pequenas doses de
inseticida, conhecidas como doses subletais, podem não causar a morte das abelhas, mas
podem induzir mudanças no comportamento, além da diminuição na atividade de
forrageamento ou desorientação, afetando temporariamente toda a colônia. Tais mudanças
puderam ser observadas em alguns trabalhos que avaliaram a toxicidade aguda do
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 25
imidaclopride (BORTOLOTTI et al., 2003; MEDRZYCKI et al., 2003; DECOURTYE et al.,
2004b). Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de doses
subletais do imidaclopride no cérebro de operárias de Apis mellifera africanizada.
2. Materiais e Métodos
2.1. Teste de toxicidade crônica
2.1.1. Coleta das abelhas
Abelhas adultas recém-emergidas da espécie A. mellifera africanizada foram coletadas
diretamente dos favos, no apiário do Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. Foram
verificadas as condições de saúde da colônia e o estado fisiológico, de acordo com as
diretrizes para testes químicos em abelhas da OECD (Organização para Cooperação e o
Desenvolvimento Econômico, 1998).
2.1.2. Bioensaios de intoxicação de abelhas
As abelhas foram acondicionadas em potes plásticos (10 abelhas por caixa),
previamente forrados com papel-filtro. Os experimentos foram conduzidos à estufa B.O.D.,
com temperatura a 32oC � 1°C e umidade relativa de 70%. Todos os grupos, experimentais e
controles, receberam os mesmos suprimentos de água, que consistiu em algodão embebido em
água, e de alimento (10 �L/abelha). Foram realizados dois grupos controle: controle sem
solvente, alimentado apenas com xarope (1 água: 1 açúcar invertido), e controle do solvente,
alimentado com xarope contendo 1% acetona (solvente utilizado para dissolver o inseticida).
Para a contaminação do alimento oferecido aos grupos experimentais, foi preparada uma
solução mãe, para o qual o inseticida foi dissolvido em acetona e misturado ao xarope. A
partir da solução mãe, foram realizadas 3 diluições em xarope, obtendo-se as concentrações
0,809 (DL50/100), 1,618 (DL50/50) e 8,09 (DL50/10) ηg/abelha do inseticida. As doses
subletais utilizadas foram calculadas a partir do estudo realizado por Rossi (2008) que
estabeleceu a DL50 do imidaclopride como sendo 80,9 ηg/abelha. Os períodos de exposição ao
inseticida foram de 1, 3, 5, 7 e 10 dias.
2.2. Coleta das abelhas após os períodos de intoxicação
Para cada grupo do bioensaio, foram coletadas 6 abelhas. A coleta dos espécimes para
os estudos de alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas no cérebro foi
baseada no período de exposição das abelhas ao imidaclopride, sendo ele após o início do
fornecimento do alimento contaminado. Juntamente a estas coletas, foram realizadas coletas
de abelhas dos grupos controle sem solvente e do grupo controle do solvente.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 26
2.3. Processamento do material
Para cada grupo do bioensaio, foram dissecadas 6 abelhas após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de
tratamento. A dissecção foi realizada em solução salina para insetos tamponada (NaCl 7,5g/L,
Na2HPO4 2,38g/L e KH2PO4 2,72g/L) e os cérebros fixados em paraformaldeído 4% em
tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,4. Posteriormente, o material foi desidratado nos
seguintes banhos de álcool: 15, 30, 50, 70, 85, 90, 95 e 100% (duração de 2 horas cada)
(SILVA-ZACARIN et al., 2010 – informação pessoal).
2.3.1. Inclusão em resina: análises morfológicas e histoquímicas
Após a desidratação, o material foi transferido para a resina de embebição, e
posteriormente, foi incluído em moldes plásticos contendo historesina Leica. Os blocos foram
mantidos em estufa a 37°C e depois de polimerizados, foram colocados em suportes de
madeira para a secção (5 μm de espessura) em micrótomo. As secções foram recolhidas em
lâminas de vidro, previamente limpas, e submetidas às técnicas de análises morfológica e
histoquímicas.
2.3.2. Inclusão em paraplast: análise imunocitoquímica
Após a desidratação, material foi submetido a um banho de álcool e xilol (1:1) por 10
minutos e dois banhos de xilol, de 5 minutos cada. Em seguida, o material foi submetido a 3
banhos de paraplast, de 2 horas cada, em estufa à 57°C, para posteriormente ser incluído em
paraplast em blocos de papel. Os blocos foram mantidos sob refrigeração e seccionados em
micrótomo (7 μm de espessura). As secções foram recolhidas em lâminas de vidro
previamente limpas e tratadas com polilisina. Logo antes do uso das lâminas, foi realizada a
remoção do paraplast, utilizando 3 banhos de xilol (2 de 20 minutos e 1 de 10 minutos), 1
banho de xilol +álcool (2:1), 1 banho de xilol + álcool (1:1), 1 banho de xilol + álcool (1:2) e
3 banhos de álcool, de 5 minutos cada.
2.4. Análise Morfológica
Técnica de coloração pela H. E. (JUNQUEIRA, L. C.; JUNQUEIRA, L. M., 1983).
As lâminas foram coradas com hematoxilina por 10 minutos, lavadas em água por 4
minutos, e coradas com eosina por 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente
para a retirada do excesso do corante. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do
Canadá e fotografadas.
2.5. Análises Histoquímicas
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 27
2.5.1. Reação de Feulgen para análise do nível de compactação cromatínica (FEULGEN,
ROSSENBECK, 1924).
As lâminas foram colocadas em HCL 4N por 45 minutos. Em seguida, foram deixadas
em água destilada por 5 minutos. Foram submetidas então, ao reativo de Schiff por 1 hora no
escuro. As lâminas foram lavadas em água sulfurosa por 2 minutos e lavadas em água
corrente por 20 minutos. Foi feita a contra-coloração com fast Green 1% por 30 segundos.
Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e fotografadas.
2.5.2. Xilidine Ponceau para detecção de proteínas totais (JUNQUEIRA, L. C.;
JUNQUEIRA, L. M., 1983).
As lâminas foram coradas por 30 minutos em Xilidine Ponceau e em seguida,
submetidas a tampão acetato de sódio (pH = 2,5 a 3,5) por 1 minuto. Depois, foram lavadas
em água destilada. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e
fotografadas.
2.6. Análise imunocitoquímica para detecção de fragmentação do DNA por
endonucleases
Os cortes obtidos através da inclusão em paraplast (item 2.3.2) foram submetidos por
30 minutos a peróxido de hidrogênio 30% em metanol, para bloquear a peroxidase endógena.
O processo foi realizado segundo o protocolo descrito pelo fabricante (Roche Molecular
Biochemicals), para detecção imunocitoquímica de quebras no DNA, utilizando o Kit
ISCDDK (im situ Cell Death Detectetion Kit). Os cortes foram recobertos com solução de
proteinase K (20μg/mL em Tris-HCl, pH 7,5), por 15 minutos, à 37ºC em câmara úmida.
Após esta permeabilização, as lâminas, contendo as secções histológicas, foram lavadas em
água destilada e PBS (10 mM, pH = 7,4). Em seguida, 50μL da solução de Tunel recém
preparada, foram colocados sobre as secções histológicas. As secções foram incubadas por 60
minutos em câmara úmida, à 37ºC. Foram feitos controles negativos e positivos para a reação
Tunel. Após a incubação, as lâminas analisadas e fotografadas em microscópio de
fluorescência Olympus BX-51, utilizando comprimento de onda de 450-500nm.
3. Resultados
Levando-se em consideração que o imidaclopride atua inibindo a ação de receptores
nicotínicos de acetilcolina dos insetos, que são encontrados em muitas regiões do cérebro das
abelhas, foram feitas análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímicas dos corpos
pedunculados, lobos ópticos e lobos antenais de abelhas expostas ou não a este inseticida.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 28
Além da análise morfológica realizada por meio da técnica coloração por H.E., foi
possível verificar a ocorrência do aumento ou não da síntese protéica no cérebro, decorrente
da exposição das abelhas ao inseticida, com a técnica de Xilidine Ponceau que cora proteínas
totais nas células. O aumento de síntese protéica pode estar relacionado à ativação das vias
sinalizadoras intracelulares que desencadeiam a morte celular, como as caspases. Já a reação
de Feulgen permitiu analisar a ocorrência de compactação da cromatina que é um processo
característico de morte celular. Estas técnicas, morfológica e histoquímicas, aliadas a análise
imunocitoquímica com a reação de Tunel, permitiram a verificação dos efeitos citotóxicos do
imidaclopride, que podem desencadear o processo de morte celular.
Os grupos controle sem solvente e controle do solvente apresentaram as estruturas
cerebrais sem alterações morfológicas. Assim, nos copos pedunculados, as células de Kenyon
apresentaram-se íntegras, com coloração normal (Figuras 1A, 1B), assim como nos lobos
ópticos (Figura 4A) e nos lobos antenais (Figura 6A). Na reação de Feulgen, os neurônios
presentes nos corpos pedunculados (Figuras 2A, 2B), nos lobos ópticos (Figura 4C) e nos
lobos antenais (Figura 6C) apresentaram núcleos levemente corados, evidenciando uma
cromatina descondensada e uniformemente distribuída. Na detecção de proteínas pela técnica
de Xilidine Ponceau, as células das estruturas cerebrais analisadas apresentaram uma
distribuição homogênea no citoplasma. Os núcleos são positivos à Xilidine Ponceau devido à
marcação das proteínas nucleares (histonas) e nucleolares (Figuras 2E, 2F, 4E, 6E).
Os resultados obtidos pelas técnicas empregadas nos corpos pedunculados para os
grupos expostos ao imidaclopride estão sumarizados na tabela 1. Nenhuma alteração
estrutural, morfológica ou histoquímica foi observada nos grupos de abelhas expostas à
DL50/100 e DL50/50. No entanto, no grupo exposto á DL50/10, foi possível observar através
técnica de H.E., a presença de células condensadas, que apresentaram coloração mais intensa
(Figuras 1C e detalhe em 1D), sugerindo que algumas células de Kenyon podem estar em
processo de morte, no interior do cálice dos corpos pedunculado de abelhas expostas por 3
dias ou mais ao inseticida. Neste mesmo grupo de exposição ao inseticida e com estas
mesmas idades, a reação de Feulgen mostrou a presença de algumas células com núcleos mais
fortemente corados, indicando condensação cromatínica, também ocupando a região central
do cálice dos corpos pedunculados (Figuras 2C e detalhe em 2D). Com a técnica de Xilidine
Ponceau foi possível observar células com núcleos fortemente corados, o que pode indicar um
aumento na atividade de secreção de proteínas neste compartimento celular ou ser resultado
da compactação da célula (Figuras 2G e detalhe em 2H).
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 29
A ocorrência de morte celular, indicada pela presença de núcleos picnóticos e aumento
da síntese protéica, visualizadas pelas análises morfológicas e histoquímicas foi confirmada
pela técnica de imunocitoquímica empregada. A partir dessa técnica, além de núcleos
positivos à reação de Tunel a partir do 3º dia de exposição à DL50/10, também foi possível
verificar a ocorrência de morte celular nos corpos pedunculados do cérebro das abelhas
expostas ao inseticida por 1 dia (Figura 3B).
No corpo pedunculado de abelhas expostas imidaclopride na dose de DL50/10 por 10
dias (Figuras 1E e 1F), verificou-se, além da presença de células condensadas, alterações no
aspecto de algumas células de Kenyon dos subtipos compactas interna e não compactas. Essas
células apresentaram-se maiores e menos coradas, o que confere um aspecto de inchaço à
célula.
A tabela 2 mostra os resultados obtidos pelas técnicas empregadas para os lobos
ópticos. Pode-se observar que nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os
períodos de exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à
DL50/100 e DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição (Figura 4B), a técnica morfológica
utilizada mostrou a presença de células condensadas que foram caracterizadas por estarem
fortemente coradas e com diminuição do volume celular. Nestas mesmas doses e períodos de
exposição, através da reação de Feulgen, foi possível observar células com núcleo fortemente
corados, apresentando compactação cromatínica (Figura 4D) e células positivas ao Xilidine
Ponceau, coradas com maior intensidade que as dos grupos controles, o que pode ser um
indício de aumento na síntese de proteínas ou devido a compactação celular. (Figura 4E). No
entanto, através da técnica imunocitoquímica empregada foi possível observar núcleos
positivos à reação de Tunel, e, portanto em processo de morte celular, não apenas nestas
idades e doses, mas em todos os grupos e em todos os períodos de exposição analisados
(Figuras 5B e 5C).
Já nos lobos antenais (Tabela 3), não foi possível observar nenhuma alteração
morfológica, histoquímica ou estrutural nos grupos expostos às doses subletais empregadas
(Figuras 6B, 6D e 6F), quando comparado aos controles (Figuras 6A, 6C e 6E). Também não
foi possível observar a presença de núcleos positivos à reação de Tunel nesta estrutura (Figura
7).
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 30
Tabela 1. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos corpos pedunculados A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células
Condensadas1
Núcleos com
Compactação
da Cromatina2
Aumento na
intensidade da
coloração3
Núcleos
positivos à
reação de
Tunel
Células com
aspecto inchado
no corpo
pedunculado
Tipo de
Exposição Dias
Controle
sem
solvente
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
Controle
do
solvente
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/100
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/50
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/10
1 - - - + -
3 + + + + -
5 + + + + -
7 + + + + -
10 + + + + +
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1 visualizadas através da coloração com H.E.
2 visualizados através da reação de Feulgen
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 31
Tabela 2. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos lobos ópticos A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células
Condensadas1
Núcleos com
Compactação da
Cromatina2
Aumento na
intensidade da
coloração3
Núcleos
positivos à
reação de Tunel
Tipo de
Exposição Dias
Controle
sem
solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
Controle
do solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/100
1 - - - +
3 - - - +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
DL50/50
1 - - - +
3 - - - +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
DL50/10
1 + + + +
3 + + + +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1 visualizadas através da coloração com H.E.
2 visualizados através da reação de Feulgen
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 32
Tabela 3. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos lobos antenais A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células
Condensadas1
Núcleos com
Compactação da
Cromatina2
Aumento na
intensidade da
coloração3
Núcleos
positivos à
reação de Tunel
Tipo de
Exposição Dias
Controle
sem
solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
Controle
do solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/100
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/50
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/10
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1 visualizadas através da coloração com H.E.
2 visualizados através da reação de Feulgen
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 33
Figura 1. Fotomicrografias do corpo pedunculado, corados com H.E, de Apis mellifera submetidas ou não ao
imidaclopride. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do grupo controle sem alterações
morfológicas; C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta DL50/10 por 7 dias,
mostrando a presença de algumas células fortemente coradas (seta). E e F – visão geral e detalhe do corpo
pedunculado de abelhas expostas à DL50/10 por 10 dias. Notar células no interior do cálice com aspecto inchado
(cabeça de seta). Ba = base; Bo = borda; Ce = compactas externas; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc =
não compactas.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 34
Figura 2. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Feulgen e à técnica de Xilidine
Ponceau, de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do
grupo controle, submetido à reação de Feulgen, mostrando núcleos levemente corados com cromatina
descondensada. C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 10 dias,
submetido à reação de Feulgen. Notar a presença de núcleos fortemente corados (seta). E e F – visão geral e
detalhe do corpo pedunculado do grupo controle, submetido à técnica de Xilidine Ponceau, com células . G e H
– visão geral e detalhada do corpo pedunculado submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à
DL50/50 por 3 e 7 dias, respectivamente. Observar aumento na intensidade da coloração de algumas células
(cabeça de seta). Ba = base; Bo = borda; Ce = compactas externas; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc =
não compactas.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 35
Figura 3. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou
não a doses subletais de imidaclopride A – corpo pedunculado de abelhas do grupo controle, com ausência de
núcleos positivos. B – corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 1 dia. Notar a presença de núcleos
positivos à reação de Tunel (seta). Ba = base; Bo = borda; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc = não
compactas.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 36
Figura 4. Fotomicrografias do lobo óptico de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida e A – lobo óptico,
corado com H.E., do grupo controle sem alteração morfológica. B – lobo óptico, corado com H.E., de abelha
exposta à DL50/50 por 7 dias apresentando células fortemente coradas (seta). C – lobo óptico submetido à reação
de Feulgen do grupo controle sem alteração histoquímica. D – lobo óptico submetido à reação de Feulgen de
abelha exposta à DL50/100 por 10 dias. Notar a presença de núcleos corados intensamente (cabeça de seta). E –
lobo óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau do grupo controle sem alteração histoquímica. F – lobo
óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à DL50/10 por 7 dias onde. É possível
observar células intensamente coradas (contorno de seta). La = lâmina; Lo = lobo; Me = medula; Qe = quiasma
externo; Qi = quiasma interno.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 37
Figura 5. Fotomicrografias do lobo óptico submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou não ao
inseticida. A – lobo óptico do grupo controle com ausência de núcleos positivos. B e C – lobo óptico de abelhas
expostas à DL50/10 por 7 dias e DL50/10 por 3 dias, respectivamente. Notar a presença de núcleos positivos à
reação de Tunel (seta). La = lâmina; Lo = lobo; Me = medula; Qe = quiasma externo; Qi = quiasma interno.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 38
Figura 6. Fotomicrografias do lobo antenal de Apis mellifera corados com H.E. e submetidos a reação de
Feulgen e com Xilidine Ponceau. A, C e E – lobos antenais de abelhas do grupo controle, coradas com H.E.,
submetidas à reação de Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e
histoquímica. B, D e F – lobos antenais de abelhas do grupo exposto coradas com H.E., submetidas à reação de
Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e histoquímica. G = glomérulo; N
= neurópila; Ne = neurônios.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 39
Figura 7. Fotomicrografias do lobo antenal de Apis mellifera submetidas à reação de Tunel. A – lobo antenal de
abelha do grupo controle sem alteração evidenciada pela técnica de imunocitoquímica. B – lobo antenal de
abelha do grupo exposto sem alteração evidenciada pela técnica de imunocitoquímica. G = glomérulo; N =
neurópila; Ne = neurônios.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 40
4. Discussão e Conclusão
A partir dos resultados obtidos pode-se verificar que ocorreram alterações
morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas nos corpos pedunculados e nos lobos
ópticos, das abelhas expostas ao imidaclopride quando comparadas as do grupo controle.
Nos lobos ópticos das abelhas dos grupos DL50/100 e DL50/50, expostas por 1 e 3 dias,
e nos corpos pedunculados do grupo DL50/10, expostas por 10 dias ao inseticida foi possível
observar uma diferença nos resultados obtidos por meio das técnicas morfológicas e
histoquímicas, comparadas a técnica de detecção de morte celular. Nessas estruturas não
foram observadas, por meio das técnicas morfológicas e histoquímicas, a presença de células
condensadas, células com núcleos picnóticos e com aumento de síntese protéica, que, como
discutido acima, caracterizam células em processo de morte celular. Já a reação de Tunel,
mostrou reações positivas em alguns núcleos nos corpos pedunculados e lobos ópticos de
abelhas expostas à estas doses e por estes períodos. Tais diferenças podem ter ocorrido devido
ao estágio do processo de morte que a célula se encontra. Quando os núcleos são marcados
apenas pela reação Tunel pode ser que estes estejam em estágio inicial da morte celular,
enquanto que a condensação celular e cromatínica, evidenciado pelas técnicas morfológica e
histoquímicas podem ocorrer no estágio final do processo de morte, ou então, ser
característica de células apoptóticas e autofágicas, em que o DNA não sofre fragmentação por
endonucleases.
Além disso, comparando os grupos expostos entre si, foi possível observar que o lobo
óptico foi a estrutura mais sensível ao inseticida, já que as alterações foram observadas em
todas as doses e períodos testados, enquanto que nos corpos pedunculados as alterações foram
exclusivas do grupo DL50/10. Já, em relação aos lobos antenais, não foi verificado qualquer
tipo de alteração morfológica comparando-se os grupos expostos e controles.
A alteração morfológica mais marcante observada foi em relação à coloração mais
intensa que algumas células apresentaram com a técnica de H.E., evidenciando a presença de
células condensadas. Através da reação de Feulgen foi possível observar que estas estruturas
cerebrais também apresentaram células com núcleos com condensação cromatínica.
A condensação da célula pode indicar morte celular por apoptose (BOWEN, I.;
BOWEN, S.; JONES, 1998). A presença de células com núcleos com compactação
cromatínica pode resultar em baixa atividade transcricional, sugerindo tratar-se de células
sofrendo o processo de morte celular (WYLLIE, 1981; HÄCKER, 2000; SILVA-ZACARIN;
TABOGA; SILVA DE MORAES, 2008).
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 41
Na morte celular por apoptose, a homeostasia é mantida pelo controle da quantidade
de proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas. Estímulos, como dano ao DNA, levam ao
aumento na expressão das proteínas pró-apoptóticas e esse desequilíbrio induz a apoptose
(PETROS; OLEJNICZAK; FESIK, 2004). No presente estudo a técnica para de detecção de
proteínas totais mostrou células positivas ao Xilidine Ponceau, mais intensamente coradas que
as dos controles, nos corpos pedunculados e lobos ópticos de abelhas expostas ao
imidaclopride, o que pode ser um indício do aumento de síntese protéica que pode ser
decorrente do desencadeamento da maquinaria de sinalização de morte celular, ou ainda pode
ser resultado da condensação celular.
Dessa forma, embora a morte celular programada em insetos esteja relacionada com a
reorganização tecidual que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de
algum órgão na fase adulta (GREGORC et al., 2004), esse tipo de morte celular também pode
ser observado nos órgãos de animais submetidos à exposição com substâncias tóxicas, que
conduzem a um alto nível de estresse nas células, como observado no presente estudo.
Alguns trabalhos mostraram as alterações ultra-estruturais ocasionadas pela exposição
de células de inseto de origem embrionária em cultura a doses subletais ao mercúrio orgânico
e inorgânico (BRAECKMAN; RAES, 1999) e, também, ao cádmio (BRAECKMAN et al.,
1999). Os resultados dessas pesquisas revelam alterações ultra-estruturais que não são
características de necrose, mas da ativação da morte celular apoptótica. De acordo com estes
autores a manutenção da maquinaria de síntese protéica está relacionada com a síntese de
proteínas de estresse (HSPs), em resposta aos agentes químicos testados nestas células. Silva-
Zacarin, Gregorc e Silva de Moraes (2006) também detectaram a ativação das HSPs em
glândulas salivares de larvas de abelhas tratadas com acaricidas em apiários comerciais.
Deglise et al. (2003) e Armengaud et al. (2000), trabalhando com este mesmo
inseticida, utilizaram a atividade da enzima citocromo oxidase para avaliar os efeitos de curta
duração de ligantes colinérgicos no metabolismo de diferentes estruturas cerebrais, focando
suas investigações nas regiões dos lobos antenais e corpos pedunculados. Esses autores
verificaram que o imidaclopride ativou o metabolismo celular nos corpos pedunculados e em
menor intensidade nos lobos antenais.
O sistema visual de um inseto adulto consiste em retina (o olho propriamente dito),
contendo células fotorreceptoras, e os lóbulos ópticos que compreendem três gânglios: a
lâmina, a medula e a lóbula. A retina forma um arranjo de células altamente ordenado de
unidades omatidiais repetidas (READY; HANSON; BENZER, 1976). Cada unidade retinal
(com oito a nove células fotossensorais), dentro do omatídeo, projeta feixes axonais em
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 42
direção aos lóbulos ópticos formando sinapses na lâmina e, eventualmente, na medula.
Neurônios da lâmina por sua vez projetam axônios para dentro da medula e esta projeta para a
lóbula (HORRIDGE, 1965). Assim, mortes celulares nos lobos ópticos podem causar
diminuição de neurônios e, conseqüentemente diminuição do número de sinapses entre esta
estrutura e os olhos compostos. Portanto, o imidaclopride administrado em doses subletais
provoca alterações estruturais nos lobos ópticos que podem levar ao surgimento de problemas
na acuidade visual dos indivíduos, prejudicando diversas atividades desenvolvidas pelas
operárias, como a atividade de forrageamento.
Os resultados obtidos por Bortolotti et al. (2003), durante a avaliação dos efeitos das
doses subletais do imidaclopride no forrageamento e retorno à colônia por A. mellifera,
podem ser explicados devido as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas
observadas nos lobos ópticos. As abelhas do controle voltavam à colônia, retornando ao
alimentador em até 5 horas. Aquelas alimentadas com xarope contendo 100 ppb do inseticida
também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador após 24 horas. Já as
abelhas expostas aos alimentadores com 500 e 1000 ppb, não retornaram à colônia ou ao
alimentador. É possível que nesses indivíduos também tenha ocorrido a morte celular
evidenciada pela reação de Tunel, o que pode ter comprometido a acuidade visual deles.
Outra estrutura cerebral que mereceu atenção foram os corpos pedunculados por
estarem relacionados à aprendizagem e memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998;
CRUZ-LANDIN, 2009). Assim, no cérebro das abelhas expostas do grupo DL50/10,
verificou-se a presença de núcleos picnóticos nos corpos pedunculados das abelhas
submetidas a 3, 5, 7 e 10 dias de tratamento. No corpo pedunculado da abelha exposta por
maior período, foi possível observar além de núcleos picnóticos, um aspecto de inchaço dos
corpos celulares. Dessa maneira, é possível afirmar que o dano causado no cérebro foi mais
intenso nas abelhas expostas à maior concentração de inseticida e ao maior período de
tratamento.
Como os corpos pedunculados estão associados aos processos de memória e
aprendizagem, os danos nessas estruturas podem provocar desorientação e prejudicar a
atividade de forrageamento das abelhas, o que pode comprometer temporariamente toda a
colônia.
Estudos realizados por Decourtye et al. (2004 a,b) comprovaram, a partir do método
de REP, que as abelhas submetidas a uma dieta contendo dose subletal de imidaclopride
apresentaram uma diminuição no desempenho do aprendizado olfatório.
Artigo 1 _______________________________________________________________________ 43
Rossi (2008) avaliou os efeitos agudos da dose letal média do imidaclopride na
morfologia do cérebro de A. mellifera africanizada. Nesse estudo, não foram verificadas
nenhuma alteração morfológica. Assim, podemos verificar que é provável que a exposição a
doses subletais por um período maior de tempo, como testado no presente estudo, contribuiu
para as alterações morfológicas observadas. Isso pode ser explicado, possivelmente, pela ação
e exposição prolongada ao inseticida e seus metabólitos. Além disso, os resultados indicam
que os as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas observadas nos corpos
pedunculados e lobos ópticos das abelhas expostas ao inseticida, pode afetar as atividades
realizadas pelas abelhas, como o forrageamento, e afetar temporariamente toda a colônia.
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Artigo 2 _______________________________________________________________________ 48
4. ARTIGO 2
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E HISTOQUÍMICAS NAS CÉLULAS
DIGESTIVAS DO VENTRÍCULO DE ABELHAS Apis mellifera AFRICANIZADA
EXPOSTAS A DOSES SUBLETAIS DO INSETICIDA IMIDACLOPRIDE.
Artigo 2 _______________________________________________________________________ 49
Resumo
As abelhas apresentam papel essencial para a agricultura, uma vez que, são importantes como
polinizadores. Para o controle de insetos-praga nesse ambiente estão sendo usadas diversas
substâncias sintéticas. Entretanto, a exposição das abelhas a esses compostos, devido a sua
atividade de forrageamento, tem como consequência a intoxicação destes insetos, observada
pelas altas taxas de mortalidade ou ainda, pelas mudanças fisiológicas e comportamentais
induzidas pela exposição a doses subletais. No Brasil, um dos inseticidas mais utilizados nas
culturas de cana-de-açúcar, café e citrus é o imidaclopride. Esse princípio ativo tem ação no
sistema nervoso do inseto. No entanto, há poucos estudos referentes à ação em órgãos não-
alvo que entram em contato com o inseticida ou seus metabólitos, como o ventrículo, órgão
responsável pela digestão e absorção de alimentos. Assim, o presente estudo teve como
objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica a doses subletais do inseticida imidaclopride,
no ventrículo de Apis mellifera africanizada. Para isso, o órgão estudado das abelhas expostas
e do controle foram submetidos a análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica.
Comparando-se a morfologia do ventrículo das abelhas dos grupos controles e expostos, foi
possível observar, de uma maneira geral, um aumento na quantidade de células eliminadas no
lúmen, principalmente após 1 dia de exposição; na quantidade de secreção apócrina eliminada
no lúmen, mais intensa geralmente após 10 dias de exposição; e na quantidade de halos
pericromatínicos nas células digestivas. A reação de Feulgen permitiu confirmar ocorrência
de núcleos picnóticos no epitélio e mostrar a presença de fragmentos nucleares nas células
digestivas dos ventrículos de todos os períodos e grupos expostos. Já a reação com Xilidine
Ponceau, permitiu observar regiões negativas a este, que pode indicar áreas degeneradas da
célula e confirmar a presença de halos pericromatínicos evidenciadas pela coloração com
H.E.. A técnica de imunocitoquímica empregada não mostrou núcleos positivos ao Tunel.
Dessa maneira, foi possível concluir que doses subletais do imidaclopride tem ação citotóxica
no ventrículo das abelhas expostas.
Palavras-chave: citotoxicidade, abelha, inseticida.
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1. Introdução
As abelhas são responsáveis pela polinização de mais espécies de plantas do que
qualquer outro grupo de animais, contribuindo na manutenção da biodiversidade das espécies
vegetais (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001). Dessa maneira, são muito importantes para
a produtividade na agricultura moderna, sendo que 52 das 115 maiores produções de alimento
no mundo dependem da polinização por abelhas para produção de frutas e sementes. Algumas
dessas produções teriam até 90% de redução da produção caso não houvesse as abelhas, além
de redução do tamanho, qualidade e quantidade dos frutos (KLEIN et al., 2007).
Tal eficiência pode ser atribuída a diversos fatores como: a grande força de trabalho
das colônias devido ao elevado número de indivíduos (10.000-40.000), crescimento da
colônia usando como estímulo a alimentação artificial com xarope, visita a uma ampla
variedade de flores, largo alcance de vôo (4,5 Km) e comunicação eficiente entre as
forrageiras para indicar a fonte de alimento (SEELEY, 1985). Assim, o uso de colônias
manejadas tem se tornado extremamente importante para garantir a polinização de algumas
culturas. O aumento na demanda de unidades de polinização causou um aumento no preço de
aluguel da colônia de 54 dólares em 2004 para 136 em 2006 (SUMNER; BORISS, 2006). O
número total de colônias de abelhas manejadas no mundo foi estimada em 72,6 milhões em
2007 (FAO, 2009).
Uma grande preocupação atual dos apicultores americanos e europeus é a perda de
colônias, conhecida como Distúrbio do Colapso das Colônias. Embora as causas desse
fenômeno não estejam bem definidas, uma hipótese relevante é a intoxicação das abelhas por
inseticidas, substâncias cada vez mais usadas na agricultura para o controle de insetos-praga
(WESTIN, 2007).
Desde 1975, o Brasil está entre os seis maiores mercados de agrotóxicos do mundo.
Em 2008, o país assumiu a liderança desse consumo e as vendas de agrotóxicos somaram US$
7,125 bilhões (ANDEF, 2009). Embora esteja proibido em alguns países devido à intoxicação
de insetos e outros animais (GODOY, 2004; CORTEZ, 2008a, 2008b), um dos inseticidas
mais utilizados no Brasil, nas culturas de cana-de-açúcar, café, citrus e algodão, é o
imidaclopride (BRASIL, 2011).
O imidaclopride atua inibindo a ação de receptores nicotínicos de acetilcolina dos
insetos, encontrados em muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas
nos processos de aprendizagem e memória (BICKER, 1999). No entanto, em uma exposição
oral, o inseticida entra em contato com outros órgãos, antes de chegar ao órgão alvo. Entre
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esses órgãos, estão ventrículo, cuja função é digestão e absorção do alimento. Dessa maneira,
este é um órgão chave no estudo dos efeitos do imidaclopride em órgãos não-alvo.
O canal alimentar das abelhas é dividido em três regiões: intestino anterior; intestino
médio, também chamado de ventrículo; e intestino posterior.
O ventrículo é composto por um epitélio constituído especialmente, por células
prismáticas. Esse epitélio apresenta três tipos celulares: células digestivas, endócrinas e
regenerativas. As células digestivas apresentam núcleos elípticos ou esféricos acompanhando
a forma mais alta ou mais baixa das células e apresentam cromatina, geralmente
descondensada. As principais funções dessas células são a produção de enzimas digestivas e a
absorção dos produtos de digestão. É possível observar nestas células, a formação e liberação
de projeções citoplasmáticas, que podem ser consideradas um modo de eliminação de
secreção ou em alguns casos, de material de excreção. As células digestivas são ricas em
microvilosidades que aumentam a superfície de contato com o lúmen, facilitando a absorção
(CRUZ-LANDIN, 2009).
Devido à intensa atividade secretora e absortiva, e às vezes, excretora, as células
digestivas sofrem desgastes, que podem ser intensificados quando são expostas em situações
patológicas e/ou toxicológicas. Essas células desgastadas são eliminadas no lúmen, e
substituídas por células derivadas da diferenciação das células regenerativas (BOWEN, I.;
BOWEN, S.; JONES, 1998; CAVALCANTE; CRUZ-LANDIM, 1999).
Ao longo da porção apical do epitélio, junto às microvilosidades, é possível observar
uma camada denominada membrana peritrófica que apresenta como principais funções:
proteger o epitélio contra a ação mecânica do alimento; controlar o fluxo de substâncias entre
os compartimentos internos e externos da membrana; barreira física contra parasitas e
bactérias; impedir a ligação inespecífica do alimento a hidrolases ou a proteínas
transportadoras da membrana plasmática das células epiteliais; e evitar excreção das células
digestivas, permitindo uma recirculação endo-ectoperitrófica destas (CRUZ-LANDIN, 2009).
Pequenas doses de inseticida, conhecidas como doses subletais, podem não causar a
morte das abelhas, mas podem induzir mudanças no comportamento e na fisiologia desses
insetos, o que pode afetar temporariamente toda a colônia. Além disso, poucos estudos têm
sido realizados no sentido de avaliar alterações em órgãos não-alvo do inseticida (CRUZ et
al., 2010; SILVA-ZACARIN; MALASPINA, 2006). Dessa maneira, o objetivo do presente
estudo foi avaliar os efeitos da exposição crônica às doses subletais do imidaclopride sobre o
ventrículo de operárias de Apis mellifera africanizada.
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2. Materiais e Métodos
2.1. Teste de toxicidade crônica
2.1.1. Coleta das abelhas
Abelhas adultas recém-emergidas da espécie A. mellifera africanizada foram coletadas
diretamente dos favos, no apiário do Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. Foram
verificadas as condições de saúde da colônia e o estado fisiológico, de acordo com as
diretrizes para testes químicos em abelhas da OECD (Organização para Cooperação e o
Desenvolvimento Econômico, 1998).
2.1.2. Bioensaios de intoxicação de abelhas
As abelhas foram acondicionadas em potes plásticos (10 abelhas por caixa),
previamente forrados com papel-filtro. Os experimentos foram conduzidos à estufa B.O.D.,
com temperatura a 32oC � 1°C e umidade relativa de 70%. Todos os grupos, experimentais e
controles, receberam os mesmos suprimentos de água, que consistiu em algodão embebido em
água, e de alimento (10 �L/abelha). Foram realizados dois grupos controle: controle sem
solvente, alimentado apenas com xarope (1 água: 1 açúcar invertido), e controle do solvente,
alimentado com xarope contendo 1% acetona (solvente utilizado para dissolver o inseticida).
Para a contaminação do alimento oferecido aos grupos experimentais, foi preparada uma
solução mãe, para o qual o inseticida foi dissolvido em acetona e misturado ao xarope. A
partir da solução mãe, foram realizadas 3 diluições em xarope, obtendo-se as concentrações
0,809 (DL50/100), 1,618 (DL50/50) e 8,09 (DL50/10) ηg/abelha do inseticida. As doses
subletais utilizadas foram calculadas a partir do estudo realizado por Rossi (2008) que
estabeleceu a DL50 do imidaclopride como sendo 80,9 ηg/abelha. Os períodos de exposição ao
inseticida foram de 1, 3, 5, 7 e 10 dias .
2.2. Coleta das abelhas após os períodos de intoxicação
Para cada grupo do bioensaio, foram coletadas 6 abelhas. A coleta dos espécimes para
os estudos de alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas no ventrículo foi
baseada no período de exposição das abelhas ao imidaclopride, sendo ele após o início do
fornecimento do alimento contaminado. Juntamente a estas coletas, foram realizadas coletas
de abelhas dos grupos controle sem solvente e do grupo controle do solvente.
2.3. Processamento do material
A dissecção das abelhas foi realizada em solução salina para insetos tamponada (NaCl
7,5g/L, Na2HPO4 2,38g/L e KH2PO4 2,72g/L) e os ventrículos retirados foram fixados em
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paraformaldeído 4% em tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,4. Posteriormente, o material
foi desidratado nos seguintes banhos de álcool: 15, 30, 50, 70, 85, 90, 95 e 100% (duração de
2 horas cada) (SILVA-ZACARIN et al., 2010 – informação pessoal).
2.3.1. Inclusão em resina para as análises morfológicas e histoquímicas
Após a desidratação, o material foi transferido para a resina de embebição, e
posteriormente, foi incluído em moldes plásticos contendo historesina. Os blocos foram
mantidos em estufa a 37°C e depois de polimerizados, foram colocados em suportes de
madeira para a secção (7 μm) em micrótomo. As secções foram recolhidas em lâminas de
vidro, previamente limpas, e coradas.
2.3.2. Inclusão em parafina para a análise imunocitoquímica
Após a desidratação, material foi submetido a um banho de álcool e xilol (1:1) por 10
minutos e dois banhos de xilol, de 5 minutos cada. Em seguida, o ma