UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO 

 

 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI 

EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO 
CÉREBRO, VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis 

mellifera AFRICANIZADA. 
 

 

Rio Claro 
2011 

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

Dissertação apresentada ao Instituto 
de Biociências do Campus de Rio 
Claro, Universidade Estadual 
Paulista, como parte dos requisitos 
para obtenção do título de Mestre 
em Ciências Biológicas (Biologia 
Celular e Molecular). 



 

 

CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI 

 

 

EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO CÉREBRO, 
VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis mellifera AFRICANIZADA.  

 
 
 
 
 
 
 
 
 

Dissertação apresentada ao Instituto de 
Biociências do Campus de Rio Claro, 
Universidade Estadual Paulista, como parte dos 
requisitos para obtenção do título de Mestre em 
Ciências Biológicas (Biologia Celular e 
Molecular) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof. Dr. OSMAR MALASPINA 
Co-orientadora: Profª. Drª. THAISA C. ROAT 
 
 

 
 
 
 
 

 
Rio Claro - SP 

2011 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO 



Rossi, Caroline de Almeida
      Efeitos de doses subletais do imidaclopride no cérebro,
ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada
/ Caroline de Almeida Rossi. - Rio Claro : [s.n.], 2011
      101 f. : il., figs., tabs.

      Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Instituto de Biociências de Rio Claro
      Orientador: Osmar Malaspina
      Co-Orientador: Thaisa Cristina Roat

      1. Abelha. 2. Toxicidade do imidacloprie em abelhas. 3.
Inseticida. 4. Citotoxicidade.  I. Título.

595.799
R831e

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP





 iii

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedicado aos meus pais, Lodovico e Fátima,  

e ao meu irmão Diego, por me apoiarem sempre.  

 

 



 iv

AGRADECIMENTOS 

 

Ao CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais), Departamento de Biologia e UNESP por me 

fornecer suporte e condições para a realização de minhas pesquisas. 

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo e suporte financeiro à pesquisa realizada. 

Ao Prof. Dr. Osmar Malaspina, pela orientação e incentivo aos meus estudos, pela atenção e 

paciência diante às minhas dúvidas e pelas experiências adquiridas ao longo desses anos. 

Ao Tiago Favaro de Souza, por toda ajuda e correções realizadas. 

À Thaisa Cristina Roat, pela co-orientação e principalmente pela amizade. Muito obrigada 

pelas correções dos trabalhos, pela ajuda nos experimentos e preparação dos materiais 

biológicos. Seu apoio foi fundamental para a realização desse trabalho. 

À Elaine e à Roberta, pela ajuda, pelos esclarecimentos e pelo fornecimento de alguns 

materiais utilizados na metodologia. 

A todos os colegas do laboratório de bioensaio e histologia. Em especial, agradeço a Daiana e 

a Cintya pela amizade, apoio e incentivo. 

Ao técnico Antônio Sérgio Pascon, pela atenção e disponibilidade em ajudar, coletando as 

abelhas até mesmo durante as férias. 

Ao Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca e Dr. Mário Sérgio Palma, por permitirem o uso de 

equipamentos de seus laboratórios. 

À Necis, à Vanessa, à Ita, à Marcela e à Olívia pela atenção e pelos empréstimos de material.  

Ao técnico Gerson Mello Souza, pelo auxílio em laboratório, pela amizade e por tornar a 

rotina no laboratório muito mais animada e divertida.  

Ao “The nine” (Mila, Dani, Dé, Lara, Quel, Nat, Ina e Marcelo) pelo apoio e incentivo em 

todas as horas.  

À Juliana Vasconcelos Mello, Karina Fernandes Baccile e Larissa Adorno Pivatto, provas de 

que a amizade resiste à distância.  

Ao José Diego e à Miriam, meus cunhados, pela amizade. 

Ao Pedro, amigo e namorado, que sempre me confortou nos momentos de insegurança e 

desespero. Muito abrigado por acreditar em mim e por me apoiar. 



 v 

A toda minha família, principalmente ao meu irmão, Diego, e aos meus pais, Lodovico e 

Fátima, pela confiança, pelo amor e pelo incentivo. Por que me ensinaram que o sucesso é 

conseqüência de muito trabalho e perseverança.  

A todos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho e me 

ajudaram a ter sucesso nessa etapa.  



 vi

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“O sucesso nasce do querer, da determinação 

e persistência em se chegar a um objetivo.   

Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence  

obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” 

 

José de Alencar 



vii 

 

 

 

SUMÁRIO 

                                                                                                                                   Página 

1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................. 10 

2. OBJETIVOS GERAIS...................................................................................... 19 

3. ARTIGO 1.......................................................................................................... 20 

       A comparação do efeito de doses subletais do inseticida imidaclopride no lobo 

óptico, corpo pedunculado e lobo antenal de Apis mellifera africanizada.  

4. ARTIGO 2.......................................................................................................... 48 

        Alterações morfológicas e histoquímicas nas células digestivas do ventrículo 

de abelhas Apis mellifera africanizada expostas a doses subletais do inseticida 

imidaclopride. 
 

5. ARTIGO 3.......................................................................................................... 72 

       Avaliação dos efeitos das doses subletais do inseticida imidaclopride no túbulo 

de malpighi de Apis mellifera africanizada.  

6. DISCUSSÃO GERAL....................................................................................... 93 

7. CONCLUSÃO GERAL.................................................................................... 95 

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................ 96 

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 97 

  



viii 
 
RESUMO 
 
Uma preocupação atual consiste no uso indiscriminado de muitas substâncias sintéticas no 
controle de pragas na agricultura. Estudos atuais indicam que algumas dessas substâncias 
podem estar envolvidas em casos de intoxicação de insetos, como as abelhas, que são 
fundamentais em muitas culturas, devido à atividade de polinização realizada por elas. No 
Brasil, um dos inseticidas mais usados nas culturas de café, citrus, algodão e cana-de-açúcar é 
o imidaclopride, que apresenta ação neurotóxica para os insetos. Seus metabólitos circulam 
por todo o organismo e entram em contato com diversos órgãos. A exposição a doses 
subletais deste inseticida pode provocar mudanças na fisiologia e no comportamento das 
abelhas, sendo que tais alterações podem ser mais intensas ou não, dependendo do período de 
exposição. Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da 
exposição crônica a doses subletais (DL50/100, DL50/50 e DL50/10) do inseticida 
imidaclopride, no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada. 
Para isso os órgãos estudados das abelhas expostas e dos controles foram submetidos a 
análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica, após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de 
exposição. No cérebro das abelhas expostas foi possível observar alterações morfológicas, 
histoquímicas e imunocitoquímicas nos lobos ópticos de todos os grupos expostos, enquanto 
que nos corpos pedunculados observou-se tais alterações apenas no grupo exposto à DL50/10. 
Já nos lobos antenais as alterações não foram observadas. No ventrículo das abelhas de todos 
os grupos expostos ao inseticida, a análise morfológica permitiu observar de uma maneira 
geral um aumento na quantidade de células eliminadas no lúmen, na quantidade de secreção 
apócrina eliminada no lúmen e na quantidade de halos pericromatínicos nas células digestivas. 
As análises histoquímicas permitiram confirmar a presença de núcleos picnóticos, mostrar a 
presença de fragmentos e indicar áreas degeneradas nas células digestivas. A técnica 
imunocitoquímica não evidenciou a presença de núcleos positivos à reação de Tunel. No 
túbulo de Malpighi de todos os grupos expostos foi possível observar na análise morfológica, 
de uma maneira geral, um aumento na quantidade de células com núcleo picnótico, na 
eliminação de parte da célula para o lúmen e da homogeneização da coloração do citoplasma. 
Além disso, foi possível observar a presença de vacuolização citoplasmática, de células 
eliminadas no lúmen e acúmulo de material amorfo no lúmen. As técnicas histoquímicas 
permitiram confirmar ocorrência de núcleos picnóticos e observar uma intensificação na 
coloração do núcleo e uma coloração mais uniforme do citoplasma. A técnica de 
imunocitoquímica empregada mostrou núcleos positivos ao Tunel nos órgãos das abelhas 
expostas ao imidaclopride. Logo, é possível concluir a partir dos resultados obtidos, que o 
imidaclopride é citotóxico para o cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi, de abelhas 
expostas a doses subletais deste inseticida. O lobo óptico mostrou ser mais sensível ao 
inseticida, uma vez que as alterações ocorreram em todas as doses testadas.   
 
Palavras-chave: citotoxicidade, abelhas, inseticida. 



ix 
 
ABSTRACT 
 
The indiscriminate use of synthetic chemicals to control pests in agriculture is not a new 
concern. Recent studies indicate that some of these substances are involved in cases of 
poisoning bees, which are fundamental in many cultures due to the activity of pollination. In 
Brazil, an insecticide widely used on crops of coffee, citrus, cotton and sugar cane, is 
imidacloprid, which is neurotoxic to insects. However, its metabolites circulate throughout the 
body and come into contacting with another organs. Exposure to sublethal doses of this 
insecticides causes changes in physiology and behavior of bees, and these changes can be 
more intense depending on exposure period. Therefore, this study aimed to evaluate the 
effects of chronic exposure to sublethal doses (DL50/100, DL50/50 and DL50/10) of 
imidacloprid in the brain, midgut and the Malpighian tubules of africanized bees (Apis 
mellifera). For this, the organs of treated and untreated bees were subjected to morphological, 
histochemical and immunocytochemical techniques, dissecting the bees after 1, 3, 5, 7 and 10 
days. In the brains of exposed bees it was possible to observe morphological, histochemical 
and immunocytochemical alterations on optic lobes of all bees, whereas in the mushroom 
bodies, alterations was observed only in the group exposed to DL50/10. The antennal lobe 
presented no alterations after the treatment in all doses. In the midgut of all exposed groups of 
bees, morphological analysis showed in general an increase in the number of digestive cells 
and apocrine secretion eliminated in the lumen and in the number of peripherical chromatin 
halos were also increased. The histochemical techiniques confirmed the presence of pyknotic 
nuclei, showing the presence of nuclear fragments and degenerated areas in cytoplasm of 
digestive cells. The immunocytochemical technique showed no presence of positive nuclei for 
Tunel reaction in digestsive cells. In Malpighian tubules of exposed bees was observed in 
general, through morphological analysis, an increase in the number of cells with a picnotic 
nucleus, eliminating part of the cell into the lumen and the homogenization of staining of the 
cytoplasm. Moreover, it was observed the presence of vacuolization of cells and amorphous 
material accumulated in the lumen. Histochemical techniques allow confirming the 
occurrence of pyknotic nuclei, observed through the increase staining of the nucleus besides 
the uniform staining of the cytoplasm. The immunocytochemical technique showed positive 
nuclei in honeybees exposed to imidacloprid. Based on results obtained it is possible to 
conclude that imidacloprid is cytotoxic to the brain, midgut and the Malpighian tubule of bees 
exposed to sublethal doses of insecticide. The optic lobe was the most sensitive to the 
insecticide, once the alterations occurred for all concentrations. 
 
Key words:  citotoxicity, bee, insecticide. 
 



Introdução geral _______________________________________________________________________     10 

1. INTRODUÇÃO GERAL 

Apis mellifera, abelha pertencente à família Apidae, foi introduzida no Brasil em 1839, 

e hoje é um poli-híbrido resultante do cruzamento das subespécies A. mellifera scutellata 

(oriunda da África), A. mellifera mellifera (vinda do norte da Europa), A. mellifera ligustica 

(originária da Itália e norte da Ioguslávia) e A. mellifera iberica (provinda da Europa 

Ocidental) (RUTTNER, 1988). A. mellifera encontra-se no grupo das abelhas eussociais, no 

qual há divisão de trabalho por castas de acordo com as tarefas desempenhadas na colônia. 

Dessa forma, enquanto a rainha e o zangão têm função reprodutiva, as operárias têm a tarefa 

de realizar toda a manutenção da colônia, desde construção, limpeza e defesa até a 

alimentação da rainha e da cria. Estas atividades são desempenhadas de acordo com a faixa 

etária das operárias (CRUZ-LANDIM; MELLO, 1981). As operárias recém-emergidas, por 

exemplo, inicialmente fazem a limpeza de si mesmas e posteriormente limpam células que 

contiveram cria. As operárias nutridoras alimentam a cria e as operárias forrageiras saem para 

o campo à procura de pólen e néctar (FREE, 1980). 

As forrageiras são excelentes insetos polinizadores e, portanto, contribuem para a 

manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem. Sugere-

se que um terço da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por 

abelhas (WILLIANS,1995; KLEIN et al., 2007).  

Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas 

terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999). As abelhas são 

importantes como polinizadores e devido ao desmatamento de seus hábitats naturais, elas tem 

aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. Entretanto, o aumento dessa 

atividade, está levando a uma redução no número de espécies desses insetos, devido ao 

contato com inseticidas normalmente utilizados no controle de insetos-praga (MALASPINA; 

SILVA-ZACARIN, 2006).  

Fletcher e Barnett (2003) realizaram um plano de investigação no Reino Unido, para 

casos de envenenamento de abelhas por inseticidas utilizados na agricultura. Assim que 

detectavam um incidente, amostras de abelhas mortas eram submetidas aos diagnósticos de 

doenças e análises químicas, a fim de identificar-se qualquer tipo de resíduo. Os acidentes por 

envenenamento foram causados, em 46% dos casos, por uso de inseticidas proibidos ou não-

especificados. 



Introdução geral _______________________________________________________________________     11 

Porrini et al. (2003) monitoraram colônias de abelhas em áreas próximas a Bologna, 

Itália. Uma vez por semana o número de abelhas mortas era registrado. Caso esse número 

fosse superior a 250 abelhas/semana/lugar, eram realizadas as análises em laboratórios. O 

monitoramento e as análises feitas permitiram caracterizar áreas, indicar a época de maior 

risco de envenenamento, identificar os inseticidas mais utilizados, como melationa e 

dimetoato, e também, identificar moléculas de uso não permitido, como parationa e 

metidationa.  Nessa mesma área e com a mesma metodologia de monitoramento e coleta dos 

autores anteriores, Ghini et al. (2004) detectaram também a presença de 35 inseticidas em 

culturas, principalmente de cereais, batatas e beterraba. 

No ano de 2002, foi observada uma elevada mortalidade de colônias de abelhas, em 

apiários localizados no leste da Romênia. Foram realizadas análises bacteriológicas, 

parasitológicas e testes de toxicidade para detectar níveis de inseticidas em amostras de 

abelhas e no pasto apícola das áreas afetadas. As análises (bacteriológicas e parasitológicas) 

apresentaram-se negativas. Nos testes de toxicidade, identificou-se o inseticida deltametrina 

como responsável pela mortalidade das abelhas (NICA et al., 2004). 

Na França, Chauzat et al. (2006) também realizaram um monitoramento de colônias de 

abelhas. Durante três anos as colônias foram visitadas quatro vezes por ano. Em cada visita 

amostras de pólen foram coletadas e submetidas a análises específicas de cromatografia 

líquida e espectrometria de massa. Foram identificados 19 compostos, sendo o imidaclopride 

o mais freqüente nas amostras. Os resíduos mais concentrados foram coumafos e tau-

fluvalinate. 

Em alguns casos os efeitos do inseticida nas abelhas não são imediatamente notados. 

De fato, pequenas doses da molécula não causam a morte das abelhas, porém podem induzir 

mudanças no comportamento, além da diminuição na atividade de forrageamento ou 

desorientação, afetando temporariamente toda a colônia (GUEZ; ZHANG; SRINIVASAN, 

2005; vanENGELSDORP; MEIXNER, 2010). Essas doses que provocam tais efeitos são 

conhecidas como doses subletais, ou seja, doses abaixo da dose letal média (DL50).  

Entre os pesticidas mais utilizados na atualidade, os neonicotinóides – inseticidas 

neurotóxicos – possuem considerável representatividade, devido a sua grande eficiência no 

combate aos insetos praga, substituindo os compostos organofosforados e metilcarbamatos, 

que tiveram seu uso diminuído devido à toxicidade e à diminuição de sua eficiência 

(TOMIZAWA; CASIDA, 2003).  

Atualmente, os neonicotinóides têm sete representantes, sendo o imidaclopride o 

primeiro a ser comercializado em 1991, pela Bayer CropScience. Esse grupo também pode ser 



Introdução geral _______________________________________________________________________     12 

dividido em dois outros: (i) um formado por aqueles que possuem o radical Nnitroguanidina 

(imidaclopride, tiametoxam, clothianidin e dinotefuram); (ii) e outro com Nciano- amidina 

(acetamipride e tiaclopride). 

No Brasil, o inseticida imidaclopride é usado como defensivo agrícola, no controle de 

pragas aéreas e do solo, nas culturas de cana-de-açúcar, citros, algodão e café, e é conhecido 

comercialmente como Gaucho, Confidor, Premier, Provado, Evidence, Connect, Cropstar, 

Winner, Kohinor e Warrant (BRASIL, 2008). No entanto, o uso desse produto já está proibido 

na França desde 1999, por representar a intoxicação para abelhas e outros animais (GODOY, 

2004). 

Estudos realizados com abelhas européias (A. mellifera) verificaram para o inseticida 

imidaclopride a DL50 oral de 3,7 ηg/abelha (SCHMUCK et al., 2001). Suchail, Guez, e 

Belzunces (2000) verificaram a DL50 oral e tópica do imidaclopride para A. mellifera 

mellifera e A. mellifera caucasica. Para ambas as subespécies, encontrou-se uma DL50 oral de 

24 h e 48 h no valor de 5 ηg/abelha. Para a DL50 tópica, os valores foram de 24 ηg/abelha para 

A. mellifera mellifera e 14 ηg/abelha A. mellifera caucasica. 

Decourtye et al. (2004b) compararam os efeitos de doses subletais dos inseticidas 

imidaclopride e deltametrina em abelhas A. mellifera ligustica. Uma solução de açúcar 

contendo 24 �g Kg –1 de imidaclopride ou 500 �g Kg –1 de deltametrina foi oferecida às 

abelhas. A contaminação do xarope por imidaclopride e deltametrina induziu um menor 

forrageamento e menor atividade de entrada na colônia por parte das operárias.  

Bortolotti et al. (2003) verificaram os efeitos das doses subletais do imidaclopride no 

forrageamento e no retorno à colônia para abelhas A. mellifera. As abelhas eram treinadas 

para forragear em um campo artificial, e era oferecido xarope como alimento. Foram testadas 

três concentrações da substância: 100 ppb, 500 ppb e 1000 ppb, sendo que as duas últimas 

apresentaram efeito repelente para as abelhas. Os resultados mostraram que as abelhas do 

controle voltavam à colônia, retornando ao alimentador em até 5 horas. Aquelas tratadas com 

a solução de 100 ppb também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador 

após 24 horas. Já as abelhas tratadas com 500 ppb e 1000 ppb, desapareceram por 24 horas, 

sem voltar a colônia ou ao alimentador.  

Medrzycki et al. (2003) também avaliaram o efeito das doses subletais do 

imidaclopride, nas concentrações de 100 ppb e 500 ppb, no comportamento de abelhas A. 

mellifera. Para ambos os tratamentos, foram observadas diminuição da mobilidade e da 

comunicação, o que pode ter comprometido o comportamento social desses animais. Outro 

estudo avaliou os efeitos do imidaclopride nas concentrações 0,5μg/L e 5μg/L. Os resultados 



Introdução geral _______________________________________________________________________     13 

mostraram que houve toxicidade do imidaclopride em relação à atividade das abelhas adultas, 

à freqüência de condução de pólen durante o forrageamento e ao número de células 

operculadas (FAUCON et al., 2005). 

Rossi (2008) estabeleceu a DL50 oral do imidaclopride e verificou os efeitos de doses 

subletais associados às possíveis alterações morfológicas no cérebro de A. mellifera 

africanizada. A DL50 oral aguda estabelecida para o imidaclopride foi de 80,9 ηg/abelha. Para 

verificar os efeitos das doses subletais, os grupos de abelhas foram tratados com xarope nas 

concentrações 25, 50 e 80,9 ηg/abelha por um período de 24 horas. No entanto, comparando-

se os cérebros de abelhas tratadas e não tratadas com o inseticida, não foram verificadas 

alterações morfológicas. 

Suchail, Debrauwer e Belzunces (2003) verificaram o metabolismo do imidaclopride 

em A. mellifera. As abelhas foram tratadas com soluções de 20 e 50 μg Kg –1 de abelha. O 

imidaclopride apresentou uma meia-vida de 4,5 a 5 horas e foi rapidamente metabolizado em 

5-hidroxiimidaclopride e olefin. Os dois metabólitos apresentaram uma concentração máxima 

após 4 horas da ingestão, exceto para o 5- hidroxiimidaclopride no tratamento de 20 μg Kg –1. 

Essa concentração máxima coincidiu com o aparecimento da mortalidade induzida pelo 

imidaclopride.  

Bendahou, Fleche e Bounias (1999), verificaram efeitos biológicos e bioquímicos da 

exposição crônica à uma dieta contendo baixas doses de cipermetrina em colônias de A. 

mellifera. O inseticida foi adicionado ao xarope na concentração de 12,5 µg/L e oferecido às 

colônias por 5 meses. Durante o período em que o estudo foi realizado, verificaram muitas 

perturbações dos grupos tratados comparados ao grupo controle, como a taxa de mortalidade 

na colônia, a área de cria e o comportamento das abelhas. 

Outro estudo avaliando o efeito da exposição ao inseticida imidaclopride, em dieta 

crônica para A. mellifera, foi realizado por Schmuck (2004), com o inseticida imidaclopride. 

O alimento foi oferecido às abelhas nas concentrações de 0,1, 1 e 10 µg de inseticida / L de 

xarope, durante 10 dias. Não se verificou mortalidade mais elevada nos grupos tratados com o 

inseticida comparado ao controle.  

Uma metodologia interessante para se avaliar o efeito de inseticidas sobre os processos 

de aprendizagem e memória é a observação da resposta de extensão da probóscide (REP).  

Esse método visa reproduzir a interação entre abelha e a planta. Quando a abelha forrageia e 

chega ao botão floral, ela instintivamente estende sua probóscide, como reflexo dos receptores 

gustativos na antena, tarso ou outras partes que são estimuladas pelo néctar. Esse reflexo 

induz a abelha a coletar o néctar e memorizar o odor floral ali presente (DECOURTYE et al., 



Introdução geral _______________________________________________________________________     14 

2005). Utilizando-se esse método, Decourtye et al. (2004a) verificaram uma deficiência no 

aprendizado olfatório das abelhas, após trinta minutos do tratamento oral com imidaclopride. 

Este resultado, que mostra deficiência de aprendizado, pode ser explicado levando-se em 

consideração o modo de ação do imidaclopride. Este inseticida atua inibindo a ação de 

receptores nicotínicos acetilcolina dos insetos, agindo mais especificamente nas subunidades 

α do receptor nicotínico (BUCKINGHAM et al., 1997). Esses receptores são encontrados em 

muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas nos processos de 

aprendizagem e memória, como os cálices do corpo pedunculado (BICKER, 1999).  

O sistema nervoso central das abelhas é um sistema de condução e processamento de 

informações que assegura uma coordenação rápida da função dos efetores, produzindo ou 

modificando respostas aos estímulos percebidos pelos órgãos sensoriais. Os elementos 

característicos são os neurônios, que percebem e transmitem estímulos informacionais; e as 

glias, que são células de sustentação. O sistema nervoso central é constituído pelo cordão 

nervoso ventral e pelo cérebro. 

O cérebro é o principal centro de associação, recebendo estímulos dos órgãos 

sensoriais da cabeça e da parte posterior do corpo. Apresenta regiões que contém corpos 

celulares de neurônios, chamadas de somata, e regiões de prolongamento, chamada neurópila. 

Ele é constituído pela fusão de três gânglios: protocérebro, deutocérebro e tritocérebro.   

 O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis, 

corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas 

dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o 

comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante 

de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo 

pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com 

corpos celulares chamados de células de Kenyon (FARRIS, 2005; FAHRBACH, 2006). Os 

lobos ópticos contêm os elementos nervosos dos olhos compostos e projetam-se lateralmente 

ao protocérebro.  

 O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém axônios motores e 

sensoriais que chegam às antenas (CRUZ-LANDIN, 2009). 

O tritocérebro é reduzido e dele partem os conectivos que ligam o cérebro ao gânglio 

subesofageano (DALY; DOYEN; PURCELL III, 1998; CRUZ-LANDIM, 2009). 

Abdalla (1997) estudou a área ocupada pelos corpos pedunculados em algumas 

espécies de abelhas. Os cérebros foram preparados com métodos histológicos e através da 

preparação de lâminas mediram-se as estruturas cerebrais, calculando-se a área total e a 



Introdução geral _______________________________________________________________________     15 

porcentagem da área ocupada pelos corpos pedunculados e glomérulos. A. mellifera 

apresentou maior desenvolvimento dos corpos pedunculados e dos glomérulos, evidenciando 

a relação dessas áreas com o alto desenvolvimento social dessa espécie. 

Roat e Cruz-Landim (2005) estudaram as diferenças morfológicas do cérebro de 

operárias, rainhas e zangões de A. mellifera, associadas com as diferenças comportamentais 

de cada casta e sexo.  Os cérebros foram dissecados e preparados de acordo com rotina 

histológica. Nos zangões, o protocérebro é mais desenvolvido, devido ao maior 

desenvolvimento dos lobos ópticos, uma vez que eles não participam da organização social, 

mas precisam de uma visão exata para o acasalamento e sua própria sobrevivência. Nas 

operárias, entretanto, as partes mais desenvolvidas são os corpos pedunculados, onde se 

verifica um cálice mais profundo com grande número de pontos convergentes para o 

pedúnculo, indicando a presença de mais sinapses. Essa maior quantidade de sinapses é 

necessária para que as operárias possam desenvolver todas as suas funções na colônia, como 

defesa, forrageamento e cuidado e alimentação das abelhas jovens.  

O inseticida imidaclopride age no sistema nervoso dos insetos e pode interferir no 

processo de aprendizagem das abelhas. No entanto, há poucos estudos relacionados à 

citoxicidade de órgãos não-alvo, como intestino e túbulos de Malpighi, responsáveis pela 

digestão e absorção, e excreção, respectivamente. A avaliação da morfologia dos mesmos 

pode revelar alterações ultra-estruturais induzidas por agentes tóxicos (BRAECKMAN; 

RAES, 1999; BRAECKMAN et al., 1999; SOROUR, 2001). 

Além de verificar o efeito do imidaclopride no sistema nervoso da abelha, é 

importante analisar a toxicidade deste inseticida para tecidos não alvos, que são atingidos 

durante a rota de metabolização e excreção deste composto.  

Um dos órgãos chave para análise da toxicidade é o intestino, já que é responsável 

pela digestão e absorção do alimento. Além disso, é uma das primeiras fontes de contato na 

administração oral do inseticida 

O canal alimentar das abelhas é dividido em três regiões: estomodeo ou intestino 

anterior; mesêntero ou intestino médio, também chamado de ventrículo; proctodeo ou 

intestino posterior.  

O ventrículo é a região do tubo digestório onde ocorre a maior parte da digestão dos 

alimentos e da absorção dos produtos da digestão.  É um tubo cilíndrico, grosso e longo, que 

se dobra em forma de arco no interior da cavidade abdominal. A sua parede é constituída pelo 

epitélio e por fibras musculares viscerais. 



Introdução geral _______________________________________________________________________     16 

No epitélio são encontrados quatro tipos celulares, sendo que dois são de células 

prismáticas, situadas na membrana basal e emergem no lúmen com o ápice coberto por 

microvilosidades, e outros dois são de células basais, sem que seu pólo apical alcance o 

lúmen. Entre as células prismáticas estão aquelas que sintetizam a membrana peritrófica, e as 

que secretam enzimas digestivas e absorvem os produtos da digestão, sendo essas últimas 

chamadas de células digestivas. Já entre as células basais estão as células regenerativas e as 

endócrinas. As células regenerativas são células indiferenciadas, agrupadas em ninhos, que 

substituem as células digestivas eliminadas no lúmen por desgaste (BOWEN, I.; BOWEN, S.; 

JONES, 1998; CAVALCANTE; CRUZ-LANDIM, 1999; CRUZ-LANDIM, 2009). 

Quando as células digestivas estão maduras, é possível observar três zonas distintas: 

basal, com muitas invaginações da membrana plasmática; mediana, com núcleo, retículo 

endoplasmático granular e Golgi; e apical, com grânulos de secreção, além de mitocôndrias e 

microvilosidades. Os grânulos pequenos e elétrons-densos localizados logo abaixo da 

membrana plasmática, provavelmente correspondem à secreção, enquanto outros com 

organização em camadas concêntricas representam material de excreção, e outros ainda são 

vacúolos auto ou heterofágicos (CRUZ-LANDIM, 2009). 

Outro órgão chave para análise da toxicidade é o túbulo de Malpighi, responsável pela 

excreção de substâncias do organismo. Dessa forma, esse órgão entra em contato com o 

imidaclopride e seus metabólitos presentes na hemolinfa. 

O sistema excretório é o responsável primário pela manutenção da homeostase. Nos 

insetos, é composto, na maioria das vezes, por um número variável de túbulos de Malpighi, os 

quais têm seu ponto de desembocadura no intestino, onde terminam em fundo cego (HABIB, 

2003; CRUZ-LANDIM, 2009).  

Os túbulos produzem um filtrado a partir da hemolinfa, chamado de urina primária, 

que se apresenta inicialmente como um fluido iso-osmótico, que serve como carreador dos 

produtos de excreção, como compostos tóxicos e excesso de íons. A medida que passa pelo 

interior do túbulo, vai sendo modificado, através da reabsorção de água e outras substâncias 

indispensáveis ao organismo, até se transformar na urina que será eliminada. 

Os túbulos são constituídos por uma camada células epiteliais que repousam sobre 

uma lâmina basal. A forma das células e conteúdo do lúmen mudam ao longo do 

comprimento do túbulo, que apresenta a extremidade apical mais fina, e a basal mais alargada 

(CRUZ-LANDIM, 2009). 

 Nos órgãos de animais submetidos a tratamentos com substâncias tóxicas, que 

conduzem a um alto nível de estresse nas células, pode ocorrer a indução do processo de 



Introdução geral _______________________________________________________________________     17 

morte celular. Essa indução pode ocorrer a partir da ativação das vias sinalizadoras 

intracelulares, por diversos agentes exógenos e/ou endógenos, que culminam na ativação do 

programa de morte celular (MEYER; SILVA, 1999).  

Os processos de morte celular podem ser classificados em três tipos de acordo com 

suas características morfológicas: apoptose, autofagia e necrose (KERR; WYLLIE; CURRIE, 

1972). Nesse primeiro tipo de classificação, as duas primeiras são consideradas “Morte 

Celular Programada”, enquanto que a necrose seria uma morte celular patológica e não 

programada geneticamente. Contudo, estudos recentes mostram que há uma regulação 

fisiológica em células necróticas e que a necrose não ocorre somente em situações 

patológicas, mas é também um componente de alguns processos fisiológicos 

(PROSKURYAKOV; KONOPLYANNIKOV; GABAI, 2003). 

Os três tipos de morte celular podem ser classificados com base nas características 

morfológicas distintas que as diferem uma das outras. Na apoptose, o núcleo e o citoplasma se 

condensam, a célula morre e fragmenta-se em corpos apoptóticos delimitados por membrana, 

os quais são fagocitados e digeridos por macrófagos ou células vizinhas, portanto não há 

vazamento do conteúdo celular. A autofagia tem como principal característica o acúmulo de 

vacúolos autofágicos no citoplasma. Já na necrose as células incham, a membrana plasmática 

é rompida e ocorre extravasamento do conteúdo citoplasmático (BOWEN, I.; BOWEN, S.; 

JONES, 1998). 

Em tecidos de insetos, a classificação do tipo de morte celular gera controvérsias, pois 

exibe tanto características de apoptose como de autofagia. Silva-Zacarin (2007) demonstrou 

que a apoptose e a morte celular autofágica contribuem para a degeneração da porção 

secretora das glândulas salivares de Apis mellifera no final do estágio larval.  

A morte celular programada em insetos está relacionada com a reorganização tecidual 

que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de algum órgão na fase adulta 

(GREGORC; POGACNIK; BOWEN, 2004). 

No Brasil, o consumo anual de inseticidas tem sido superior a 300 mil toneladas de 

produtos comerciais, ou seja, expresso em quantidade de ingrediente-ativo, é consumido 

anualmente no país cerca de 130 mil toneladas, representando um aumento no consumo de 

inseticidas de 700% nos últimos quarenta anos, enquanto a área agrícola aumentou 78% nesse 

período (SPADOTTO et al., 2004). Embora em países desenvolvidos os estudos para 

estabelecer os efeitos dos inseticidas no comportamento das abelhas estejam cada vez mais 

freqüentes, no Brasil os efeitos das doses subletais tem sido pouco estudados. Além disso, não 

há estudos referentes ao efeito da exposição a uma dieta crônica de imidaclopride em A. 



Introdução geral _______________________________________________________________________     18 

mellifera africanizada, principalmente no que tange o efeito deste composto em sua rota de 

metabolização no organismo, bem como seus efeitos sobre o órgão alvo de sua ação. Dessa 

forma, faz-se necessário o estudo do ventrículo, dos túbulos de Malpighi e do cérebro, onde 

ocorrem, respectivamente, a absorção e possível metabolização do composto químico 

ingerido, excreção e provável ação do mesmo. 

 



Objetivos Gerais _______________________________________________________________________      19 
 

 

2. OBJETIVOS GERAIS 

 O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das doses subletais do 

inseticida imidaclopride no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi em operárias de Apis 

mellifera africanizada. 

 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      20 

3. ARTIGO 1 

 

COMPARAÇÃO DO EFEITO DE DOSES SUBLETAIS DO INSETICIDA 

IMIDACLOPRIDE NO LOBO ÓPTICO, CORPO PEDUNCULADO E LOBO 

ANTENAL DE Apis mellifera AFRICANIZADA. 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      21 

Resumo 
 
Atualmente diversas substâncias sintéticas são utilizadas nas áreas de cultivo para o combate 
de insetos-praga. No entanto, o uso indiscriminado desses produtos pode afetar insetos não-
alvo, como as abelhas que são essenciais nessas áreas devido à polinização. Além disso, como 
esses insetos estão expostos continuamente a esses compostos, devido ao forrageamento, 
foram relatados muitos casos de intoxicação em diversos países. Como conseqüência, pode-se 
verificar mudanças fisiológicas e comportamentais induzidas pela exposição a doses subletais, 
ou ainda a morte desses insetos. Tais alterações podem estar ou não relacionadas ao tempo de 
exposição a esses compostos. No Brasil, um dos inseticidas mais utilizados nas culturas de 
cana-de-açúcar, café e citrus é o imidaclopride, embora já tenha sido proibido em outros 
países devido à intoxicação das abelhas e outros seres vivos. Esse princípio ativo tem ação no 
sistema nervoso do inseto. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da 
exposição crônica a doses subletais do inseticida imidaclopride, no cérebro de Apis mellifera 
africanizada. Para isso o órgão estudado das abelhas expostas e do controle foram submetidos 
à análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica. A partir dos resultados obtidos na 
comparação do cérebro das abelhas dos grupos controles e expostos, foi possível observar 
algumas alterações celulares. Nos corpos pedunculados do grupo exposto à DL50/10 por 3 dias 
ou mais, e nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os períodos de 
exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à DL50/100 e 
DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição, foi possível observar com a coloração H.E. a 
presença de células compactadas Com a reação de Feulgen, observou-se a presença de 
algumas células com núcleos picnóticos, enquanto que com a técnica de Xilidine Ponceau foi 
possível observar células com núcleos fortemente corados. Todas essas características 
indicam a ocorrência de morte celular. Além disso, nos corpos pedunculados das abelhas 
expostas à DL50/10 por 10 dias, também se observou a presença de células com aspecto 
inchado. A partir da técnica imunocitoquímica empregada, foi possível confirmar a ocorrência 
de morte celular, além de verificar tais mortes também no corpo pedunculado das abelhas 
expostas a DL50/10 por 1 dia e nos lobos ópticos de todos os grupos e períodos de exposição. 
Já nos lobos antenais, não foi observada qualquer alteração morfológica, histoquímica ou 
imunocitoquímica. Dessa maneira, foi possível concluir que doses subletais do imidaclopride 
tem ação citotóxica no cérebro das abelhas expostas e que o lobo óptico foi a estrutura mais 
sensível ao inseticida. 
 
Palavras-chave: citotoxicidade, lobo óptico, corpo pedunculado, abelha, inseticida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      22 

1. Introdução 

Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas 

terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999), e contribuem para a 

manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem 

(WILLIANS, 1995).  

Globalmente, o valor da polinização por insetos tem sido estimada em 212 bilhões de 

dólares, o que representa cerca de 9,5% do valor total da produção agronômica (GALLAI et 

al., 2009). Entre os principais polinizadores estão as abelhas, que são tidas como as mais 

eficientes em muitas culturas (NRC, 2006) e as mais importantes para a maioria das 

monoculturas mundiais (MCGREGOR, 1976; DELAPLANE; MAYER, 2000). Sugere-se que 

35% da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por esses insetos 

(KLEIN et al., 2007; WILLIANS, 1995). 

Embora o crescimento do número de colônias seja evidente, em algumas localidades 

como Europa e Estados Unidos da América a perda de colônias está sendo um grande 

problema aos apicultores. Tal fato é conhecido como Distúrbio do Colapso das Colônias e 

ainda não tem causas definidas, embora se especule que possa haver a interação de alguns 

fatores que afetam a saúde da colônia. Entre eles temos as doenças bacterianas e infestações 

por ácaro. Além das doenças, um fator preocupante é o envenenamento das abelhas por 

substâncias químicas presentes no ambiente. Isso porque, devido ao desmatamento de seus 

hábitats naturais, elas têm aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. A 

agricultura moderna depende cada vez mais do uso de substâncias químicas para controlar 

ervas daninhas, fungos e artrópodes pragas nas áreas de cultivo. No entanto, como 

conseqüência da atividade de forrageamento as abelhas ficam mais expostas a esses químicos 

lançados no ambiente, o que está pode estar levando a uma redução no número de espécies 

desses insetos (CROFT, 1990; THOMPSON, 2003; MALASPINA; SILVA-ZACARIN, 

2006; DESNEUX; DECOURTYE; DELPUECH, 2007). 

O consumo anual de inseticidas tem sido superior a 300 mil toneladas de produtos 

comerciais. Expresso em quantidade de ingrediente-ativo, é consumido anualmente cerca de 

130 mil toneladas, representando um aumento no consumo de inseticidas de 700% nos 

últimos quarenta anos, enquanto a área agrícola aumentou 78% nesse período (SPADOTTO et 

al., 2004). Entre os inseticidas mais utilizados nas culturas brasileiras estão os da classe dos 

neonicotinóides, devido a sua grande eficiência no combate aos insetos. O imidaclopride é 

aplicado principalmente nas culturas de cana-de-açúcar, café, citrus e algodão (BRASIL, 

2011), embora haja relatos de sua toxicidade para abelhas e outros animais (GODOY, 2004). 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      23 

Este inseticida atua inibindo a ação de receptores nicotínicos de acetilcolina dos 

insetos, agindo mais especificamente nas subunidades α do receptor (BUCKINGHAM et al., 

1997). Esses receptores são encontrados em muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo 

as áreas envolvidas nos processos de aprendizagem e memória (BICKER, 1999). 

O sistema nervoso das abelhas inclui o cérebro e o cordão nervoso ventral. O cérebro 

de uma abelha adulta apresenta três massas ganglionares: protocérebro, deutocérebro e 

tritocérebro.  

 O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis, 

corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas 

dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o 

comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante 

de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo 

pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com 

corpos celulares chamados de células de Kenyon. O cálice é dividido em anéis de neurópila 

em torno dos corpos celulares: a borda, que corresponde ao lábio; o colar, que corresponde às 

paredes; e a base, que corresponde ao fundo do cálice, do qual parte o pedúnculo. As células 

de Kenyon estão diferenciadas em compactas internas, não compactas e compactas externas, 

de acordo com a quantidade de citoplasma em relação ao núcleo (FARRIS, 2005; 

FAHRBACH, 2006). Os lobos ópticos são extensões do protocérebro em direção aos olhos 

compostos. Cada lobo é constituído por três massas de neurópilas denominadas lobo, medula 

e lâmina. Entre duas massas de neurópila, os axônios se cruzam produzindo regiões de 

quiasma. Entre o lobo e a medula está o localizado o quiasma interno e entre a medula e a 

lâminas está o quiasma externo.  

 O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém as arborizações 

terminais dos axônios dos neurônios sensoriais das antenas e os corpos celulares dos nervos 

motores dos apêndices. Cada lobo está relacionado a uma das antenas e dele parte um nervo 

antenal, que contém axônios motores e sensoriais que chegam às antenas. Os lobos são 

basicamente constituídos por neurópila, organizada sob a forma de uma região central menos 

compacta e vários glomérulos periféricos de neurópila compacta (CRUZ-LANDIN, 2009). 

O tritocérebro é composto por um par de lobos, ligados por uma comissura transversal, 

localizados ventralmente aos lobos antenais. Dessa região, partem os conectivos que ligam o 

cérebro ao gânglio subesofageano (DALY; DOYEN; PURCELL III, 1998; CRUZ-LANDIM, 

2009). 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      24 

Diversos substâncias xenobióticas podem promover a indução da morte celular pela 

ativação das vias sinalizadoras intracelulares, de forma direta ou indireta. O trabalho 

desenvolvido por Braeckman et al. (1999) é um exemplo dessa ativação de morte celular em 

resposta a tais compostos. Esses autores detectaram alterações ultra-estruturais em cultura de 

células de insetos expostas à doses subletais de cádmio, que podem estar relacionadas à  

alterações na maquinaria de síntese protéica, de proteínas envolvidas na ativação do programa 

de morte celular em resposta ao agente químico testado.  

 Várias técnicas têm sido utilizadas para estudar a morte celular. Aspectos 

morfológicos deste processo podem ser visualizados por microscopia de luz, já que as 

manifestações de morte celular incluem mudanças no aspecto do núcleo e na morfologia 

celular como: redução do volume nuclear e condensação da cromatina (picnose), mudança no 

volume celular, perda de regiões especializadas da membrana plasmática, tais como 

microvilosidades e complexos juncionais provocando mudanças de forma, com tendência para 

a esfericidade (ALBERTS et al., 2010). 

 Assim, técnicas morfológicas associadas a técnicas histoquímicas para detecção de 

proteínas e que permitam análise da compactação da cromatina podem ser ferramentas 

valiosas para verificação de alterações estruturais, que podem levar à morte celular, 

provocada por agentes xenobióticos.  

 Além disso, como a característica que tem sido considerada mais marcante nas 

modificações do material nuclear durante a morte celular é a fragmentação do DNA, que 

ocorre em conseqüência da ativação de endonucleases (WYLLIE, 1981), a presença de 

células em processo de morte pode ser confirmada pela utilização de técnicas que a detectem. 

As endonucleases cortam a cadeia dupla de DNA em regiões inter-nucleossômicas, dando 

origem a nucleotídeos com número de pares de base múltiplos de 180 que podem ser 

detectadas por técnicas imunocitoquímicas, como a técnica de TUNEL, que marca as novas 

extremidades 3’-OH geradas pela fragmentação. 

Muitos estudos têm sido feitos para avaliar a toxicidade do imidaclopride em abelhas. 

No estudo realizado por Schmuck et al. (2004), foi avaliada a toxicidade crônica deste 

inseticida. No entanto, não foi possível observar aumento da mortalidade quando comparados 

os grupos expostos por menor e maior período. Isso pode ter ocorrido, pois pequenas doses de 

inseticida, conhecidas como doses subletais, podem não causar a morte das abelhas, mas 

podem induzir mudanças no comportamento, além da diminuição na atividade de 

forrageamento ou desorientação, afetando temporariamente toda a colônia. Tais mudanças 

puderam ser observadas em alguns trabalhos que avaliaram a toxicidade aguda do 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      25 

imidaclopride (BORTOLOTTI et al., 2003; MEDRZYCKI et al., 2003; DECOURTYE et al., 

2004b). Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de doses 

subletais do imidaclopride no cérebro de operárias de Apis mellifera africanizada. 

 

2. Materiais e Métodos 

2.1. Teste de toxicidade crônica 

2.1.1. Coleta das abelhas 

Abelhas adultas recém-emergidas da espécie A. mellifera africanizada foram coletadas 

diretamente dos favos, no apiário do Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. Foram 

verificadas as condições de saúde da colônia e o estado fisiológico, de acordo com as 

diretrizes para testes químicos em abelhas da OECD (Organização para Cooperação e o 

Desenvolvimento Econômico, 1998). 

2.1.2. Bioensaios de intoxicação de abelhas 

As abelhas foram acondicionadas em potes plásticos (10 abelhas por caixa), 

previamente forrados com papel-filtro. Os experimentos foram conduzidos à estufa B.O.D., 

com temperatura a 32oC � 1°C e umidade relativa de 70%. Todos os grupos, experimentais e 

controles, receberam os mesmos suprimentos de água, que consistiu em algodão embebido em 

água, e de alimento (10 �L/abelha). Foram realizados dois grupos controle: controle sem 

solvente, alimentado apenas com xarope (1 água: 1 açúcar invertido), e controle do solvente, 

alimentado com xarope contendo 1% acetona (solvente utilizado para dissolver o inseticida). 

Para a contaminação do alimento oferecido aos grupos experimentais, foi preparada uma 

solução mãe, para o qual o inseticida foi dissolvido em acetona e misturado ao xarope. A 

partir da solução mãe, foram realizadas 3 diluições em xarope, obtendo-se as concentrações 

0,809 (DL50/100), 1,618 (DL50/50) e 8,09 (DL50/10) ηg/abelha do inseticida. As doses 

subletais utilizadas foram calculadas a partir do estudo realizado por Rossi (2008) que 

estabeleceu a DL50 do imidaclopride como sendo 80,9 ηg/abelha. Os períodos de exposição ao 

inseticida foram de 1, 3, 5, 7 e 10 dias.  

 

2.2. Coleta das abelhas após os períodos de intoxicação 

Para cada grupo do bioensaio, foram coletadas 6 abelhas. A coleta dos espécimes para 

os estudos de alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas no cérebro foi 

baseada no período de exposição das abelhas ao imidaclopride, sendo ele após o início do 

fornecimento do alimento contaminado. Juntamente a estas coletas, foram realizadas coletas 

de abelhas dos grupos controle sem solvente e do grupo controle do solvente. 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      26 

 

2.3. Processamento do material  

Para cada grupo do bioensaio, foram dissecadas 6 abelhas após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de 

tratamento. A dissecção foi realizada em solução salina para insetos tamponada (NaCl 7,5g/L, 

Na2HPO4 2,38g/L e KH2PO4 2,72g/L) e os cérebros fixados em paraformaldeído 4% em 

tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,4. Posteriormente, o material foi desidratado nos 

seguintes banhos de álcool: 15, 30, 50, 70, 85, 90, 95 e 100% (duração de 2 horas cada) 

(SILVA-ZACARIN et al., 2010 – informação pessoal).  

2.3.1. Inclusão em resina: análises morfológicas e histoquímicas 

Após a desidratação, o material foi transferido para a resina de embebição, e 

posteriormente, foi incluído em moldes plásticos contendo historesina Leica. Os blocos foram 

mantidos em estufa a 37°C e depois de polimerizados, foram colocados em suportes de 

madeira para a secção (5 μm de espessura) em micrótomo. As secções foram recolhidas em 

lâminas de vidro, previamente limpas, e submetidas às técnicas de análises morfológica e 

histoquímicas.  

2.3.2. Inclusão em paraplast: análise imunocitoquímica 

Após a desidratação, material foi submetido a um banho de álcool e xilol (1:1) por 10 

minutos e dois banhos de xilol, de 5 minutos cada. Em seguida, o material foi submetido a 3 

banhos de paraplast, de 2 horas cada, em estufa à 57°C, para posteriormente ser incluído em 

paraplast em blocos de papel. Os blocos foram mantidos sob refrigeração e seccionados em 

micrótomo (7 μm de espessura). As secções foram recolhidas em lâminas de vidro 

previamente limpas e tratadas com polilisina. Logo antes do uso das lâminas, foi realizada a 

remoção do paraplast, utilizando 3 banhos de xilol (2 de 20 minutos e 1 de 10 minutos), 1 

banho de xilol +álcool (2:1), 1 banho de xilol + álcool (1:1), 1 banho de xilol + álcool (1:2) e 

3 banhos de álcool, de 5 minutos cada. 

 

2.4. Análise Morfológica 

Técnica de coloração pela H. E. (JUNQUEIRA, L. C.; JUNQUEIRA, L. M., 1983).  

As lâminas foram coradas com hematoxilina por 10 minutos, lavadas em água por 4 

minutos, e coradas com eosina por 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente 

para a retirada do excesso do corante. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do 

Canadá e fotografadas.  

2.5. Análises Histoquímicas 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      27 

2.5.1. Reação de Feulgen para análise do nível de compactação cromatínica (FEULGEN, 

ROSSENBECK, 1924). 

As lâminas foram colocadas em HCL 4N por 45 minutos. Em seguida, foram deixadas 

em água destilada por 5 minutos. Foram submetidas então, ao reativo de Schiff por 1 hora no 

escuro. As lâminas foram lavadas em água sulfurosa por 2 minutos e lavadas em água 

corrente por 20 minutos. Foi feita a contra-coloração com fast Green 1% por 30 segundos. 

Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e fotografadas. 

2.5.2. Xilidine Ponceau para detecção de proteínas totais (JUNQUEIRA, L. C.; 

JUNQUEIRA, L. M., 1983). 

As lâminas foram coradas por 30 minutos em Xilidine Ponceau e em seguida, 

submetidas a tampão acetato de sódio (pH = 2,5 a 3,5) por 1 minuto. Depois, foram lavadas 

em água destilada. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e 

fotografadas. 

 

2.6. Análise imunocitoquímica para detecção de fragmentação do DNA por 

endonucleases 

 Os cortes obtidos através da inclusão em paraplast (item 2.3.2) foram submetidos por 

30 minutos a peróxido de hidrogênio 30% em metanol, para bloquear a peroxidase endógena. 

O processo foi realizado segundo o protocolo descrito pelo fabricante (Roche Molecular 

Biochemicals), para detecção imunocitoquímica de quebras no DNA, utilizando o Kit 

ISCDDK (im situ Cell Death Detectetion Kit). Os cortes foram recobertos com solução de 

proteinase K (20μg/mL em Tris-HCl, pH 7,5), por 15 minutos, à 37ºC em câmara úmida. 

Após esta permeabilização, as lâminas, contendo as secções histológicas, foram lavadas em 

água destilada e PBS (10 mM, pH = 7,4). Em seguida, 50μL da solução de Tunel recém 

preparada, foram colocados sobre as secções histológicas. As secções foram incubadas por 60 

minutos em câmara úmida, à 37ºC. Foram feitos controles negativos e positivos para a reação 

Tunel. Após a incubação, as lâminas analisadas e fotografadas em microscópio de 

fluorescência Olympus BX-51, utilizando comprimento de onda de 450-500nm. 

 

3. Resultados 

Levando-se em consideração que o imidaclopride atua inibindo a ação de receptores 

nicotínicos de acetilcolina dos insetos, que são encontrados em muitas regiões do cérebro das 

abelhas, foram feitas análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímicas dos corpos 

pedunculados, lobos ópticos e lobos antenais de abelhas expostas ou não a este inseticida. 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      28 

Além da análise morfológica realizada por meio da técnica coloração por H.E., foi 

possível verificar a ocorrência do aumento ou não da síntese protéica no cérebro, decorrente 

da exposição das abelhas ao inseticida, com a técnica de Xilidine Ponceau que cora proteínas 

totais nas células. O aumento de síntese protéica pode estar relacionado à ativação das vias 

sinalizadoras intracelulares que desencadeiam a morte celular, como as caspases. Já a reação 

de Feulgen permitiu analisar a ocorrência de compactação da cromatina que é um processo 

característico de morte celular. Estas técnicas, morfológica e histoquímicas, aliadas a análise 

imunocitoquímica com a reação de Tunel, permitiram a verificação dos efeitos citotóxicos do 

imidaclopride, que podem desencadear o processo de morte celular. 

Os grupos controle sem solvente e controle do solvente apresentaram as estruturas 

cerebrais sem alterações morfológicas. Assim, nos copos pedunculados, as células de Kenyon 

apresentaram-se íntegras, com coloração normal (Figuras 1A, 1B), assim como nos lobos 

ópticos (Figura 4A) e nos lobos antenais (Figura 6A). Na reação de Feulgen, os neurônios 

presentes nos corpos pedunculados (Figuras 2A, 2B), nos lobos ópticos (Figura 4C) e nos 

lobos antenais (Figura 6C) apresentaram núcleos levemente corados, evidenciando uma 

cromatina descondensada e uniformemente distribuída. Na detecção de proteínas pela técnica 

de Xilidine Ponceau, as células das estruturas cerebrais analisadas apresentaram uma 

distribuição homogênea no citoplasma. Os núcleos são positivos à Xilidine Ponceau devido à 

marcação das proteínas nucleares (histonas) e nucleolares (Figuras 2E, 2F, 4E, 6E). 

Os resultados obtidos pelas técnicas empregadas nos corpos pedunculados para os 

grupos expostos ao imidaclopride estão sumarizados na tabela 1. Nenhuma alteração 

estrutural, morfológica ou histoquímica foi observada nos grupos de abelhas expostas à 

DL50/100 e DL50/50. No entanto, no grupo exposto á DL50/10, foi possível observar através 

técnica de H.E., a presença de células condensadas, que apresentaram coloração mais intensa 

(Figuras 1C e detalhe em 1D), sugerindo que algumas células de Kenyon podem estar em 

processo de morte, no interior do cálice dos corpos pedunculado de abelhas expostas por 3 

dias ou mais ao inseticida. Neste mesmo grupo de exposição ao inseticida e com estas 

mesmas idades, a reação de Feulgen mostrou a presença de algumas células com núcleos mais 

fortemente corados, indicando condensação cromatínica, também ocupando a região central 

do cálice dos corpos pedunculados (Figuras 2C e detalhe em 2D). Com a técnica de Xilidine 

Ponceau foi possível observar células com núcleos fortemente corados, o que pode indicar um 

aumento na atividade de secreção de proteínas neste compartimento celular ou ser resultado 

da compactação da célula (Figuras 2G e detalhe em 2H).  



Artigo 1 _______________________________________________________________________      29 

A ocorrência de morte celular, indicada pela presença de núcleos picnóticos e aumento 

da síntese protéica, visualizadas pelas análises morfológicas e histoquímicas foi confirmada 

pela técnica de imunocitoquímica empregada. A partir dessa técnica, além de núcleos 

positivos à reação de Tunel a partir do 3º dia de exposição à DL50/10, também foi possível 

verificar a ocorrência de morte celular nos corpos pedunculados do cérebro das abelhas 

expostas ao inseticida por 1 dia (Figura 3B).  

No corpo pedunculado de abelhas expostas imidaclopride na dose de DL50/10 por 10 

dias (Figuras 1E e 1F), verificou-se, além da presença de células condensadas, alterações no 

aspecto de algumas células de Kenyon dos subtipos compactas interna e não compactas. Essas 

células apresentaram-se maiores e menos coradas, o que confere um aspecto de inchaço à 

célula. 

A tabela 2 mostra os resultados obtidos pelas técnicas empregadas para os lobos 

ópticos. Pode-se observar que nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os 

períodos de exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à 

DL50/100 e DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição (Figura 4B), a técnica morfológica 

utilizada mostrou a presença de células condensadas que foram caracterizadas por estarem 

fortemente coradas e com diminuição do volume celular. Nestas mesmas doses e períodos de 

exposição, através da reação de Feulgen, foi possível observar células com núcleo fortemente 

corados, apresentando compactação cromatínica (Figura 4D) e células  positivas ao Xilidine 

Ponceau, coradas com maior intensidade que as dos grupos controles, o que pode ser um 

indício de aumento na síntese de proteínas ou devido a compactação celular. (Figura 4E). No 

entanto, através da técnica imunocitoquímica empregada foi possível observar núcleos 

positivos à reação de Tunel, e, portanto em processo de morte celular, não apenas nestas 

idades e doses, mas em todos os grupos e em todos os períodos de exposição analisados 

(Figuras 5B e 5C).  

Já nos lobos antenais (Tabela 3), não foi possível observar nenhuma alteração 

morfológica, histoquímica ou estrutural nos grupos expostos às doses subletais empregadas 

(Figuras 6B, 6D e 6F), quando comparado aos controles (Figuras 6A, 6C e 6E). Também não 

foi possível observar a presença de núcleos positivos à reação de Tunel nesta estrutura (Figura 

7). 

 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      30 

Tabela 1. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada 

nos corpos pedunculados A. mellifera expostas ou não com imidaclopride. 

 

 

 
 
 
 

Células 
Condensadas1 

Núcleos com 
Compactação 

da Cromatina2 

Aumento na 
intensidade da 

coloração3 

Núcleos 
positivos à 
reação de 

Tunel 

Células com 
aspecto inchado 

no corpo 
pedunculado 

Tipo de 
Exposição Dias      

Controle 
sem 

solvente 

1 - - - - - 
3 - - - - - 
5 - - - - - 
7 - - - - - 
10 - - - - - 

Controle 
do 

solvente 

1 - - - - - 
3 - - - - - 
5 - - - - - 
7 - - - - - 
10 - - - - - 

 
 

DL50/100 

1 - - - - - 
3 - - - - - 
5 - - - - - 
7 - - - - - 
10 - - - - - 

 
 

DL50/50 

1 - - - - - 
3 - - - - - 
5 - - - - - 
7 - - - - - 
10 - - - - - 

 
 

DL50/10 

1 - - - + - 
3 + + + + - 
5 + + + + - 
7 + + + + - 
10 + + + + + 

( - ) Ausência; ( + ) Presença 
 
1 visualizadas através da coloração com H.E. 
2 visualizados através da reação de Feulgen 
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      31 

Tabela 2. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada 

nos lobos ópticos A. mellifera expostas ou não com imidaclopride. 

 

 

 
 
 
 

Células 
Condensadas1 

Núcleos com 
Compactação da 

Cromatina2 

Aumento na 
intensidade da 

coloração3 

Núcleos 
positivos à 

reação de Tunel 

Tipo de 
Exposição Dias     

Controle 
sem 

solvente 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 

Controle 
do solvente 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 
 
 

DL50/100 

1 - - - + 
3 - - - + 
5 + + + + 
7 + + + + 

10 + + + + 
 
 

DL50/50 

1 - - - + 
3 - - - + 
5 + + + + 
7 + + + + 

10 + + + + 
 
 

DL50/10 

1 + + + + 
3 + + + + 
5 + + + + 
7 + + + + 

10 + + + + 
( - ) Ausência; ( + ) Presença 

 
1 visualizadas através da coloração com H.E. 
2 visualizados através da reação de Feulgen 
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau 
 
 
 
 
 
  
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      32 

Tabela 3. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada 

nos lobos antenais A. mellifera expostas ou não com imidaclopride. 

 

 

 
 
 
 

Células 
Condensadas1 

Núcleos com 
Compactação da 

Cromatina2 

Aumento na 
intensidade da 

coloração3 

Núcleos 
positivos à 

reação de Tunel 

Tipo de 
Exposição Dias     

Controle 
sem 

solvente 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 

Controle 
do solvente 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 
 
 

DL50/100 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 
 
 

DL50/50 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 
 
 

DL50/10 

1 - - - - 
3 - - - - 
5 - - - - 
7 - - - - 

10 - - - - 
( - ) Ausência; ( + ) Presença 

 
1 visualizadas através da coloração com H.E. 
2 visualizados através da reação de Feulgen 
3 visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      33 

Figura 1. Fotomicrografias do corpo pedunculado, corados com H.E, de Apis mellifera submetidas ou não ao 
imidaclopride. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do grupo controle sem alterações 
morfológicas; C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta DL50/10 por 7 dias,  
mostrando a presença de algumas células fortemente coradas (seta). E e F – visão geral e detalhe do corpo 
pedunculado de abelhas expostas à DL50/10 por 10 dias. Notar células no interior do cálice com aspecto inchado 
(cabeça de seta).  Ba = base; Bo = borda; Ce = compactas externas; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc = 
não compactas. 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      34 

                                                                                                                                              

Figura 2. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Feulgen e à técnica de Xilidine 
Ponceau, de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do 
grupo controle, submetido à reação de Feulgen, mostrando núcleos levemente corados com cromatina 
descondensada. C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 10 dias, 
submetido à reação de Feulgen. Notar a presença de núcleos fortemente corados (seta). E e F – visão geral e 
detalhe do corpo pedunculado do grupo controle, submetido à técnica de Xilidine Ponceau, com células . G e H 
– visão geral e detalhada do corpo pedunculado submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à 
DL50/50 por 3 e 7 dias, respectivamente. Observar aumento na intensidade da coloração de algumas células 
(cabeça de seta). Ba = base; Bo = borda; Ce = compactas externas; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc = 
não compactas. 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      35 

Figura 3. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou 
não a doses subletais de imidaclopride A – corpo pedunculado de abelhas do grupo controle, com ausência de 
núcleos positivos. B – corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 1 dia. Notar a presença de núcleos 
positivos à reação de Tunel (seta). Ba = base; Bo = borda; Ci = compactas internas; Co = colar; Nc = não 
compactas.  

 

 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      36 

Figura 4. Fotomicrografias do lobo óptico de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida e A – lobo óptico, 
corado com H.E., do grupo controle sem alteração morfológica. B – lobo óptico, corado com H.E., de abelha 
exposta à DL50/50 por 7 dias apresentando células fortemente coradas (seta). C – lobo óptico submetido  à reação 
de Feulgen do grupo controle sem alteração histoquímica. D – lobo óptico submetido à reação de Feulgen de 
abelha exposta à DL50/100 por 10 dias. Notar a presença de núcleos corados intensamente (cabeça de seta). E – 
lobo óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau do grupo controle sem alteração histoquímica. F – lobo 
óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à DL50/10 por 7 dias onde. É possível 
observar células intensamente coradas (contorno de seta). La = lâmina; Lo = lobo; Me = medula; Qe = quiasma 
externo; Qi = quiasma interno. 
 
 
 
 
 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      37 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Figura 5. Fotomicrografias do lobo óptico submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou não ao 
inseticida. A – lobo óptico do grupo controle com ausência de núcleos positivos. B e C – lobo óptico de abelhas 
expostas à DL50/10 por 7 dias e  DL50/10 por 3 dias, respectivamente. Notar a presença de núcleos positivos à 
reação de Tunel (seta). La = lâmina; Lo = lobo; Me = medula; Qe = quiasma externo; Qi = quiasma interno. 
 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      38 

Figura 6. Fotomicrografias do lobo antenal de Apis mellifera corados com H.E. e submetidos a reação de 
Feulgen e com Xilidine Ponceau. A, C e E – lobos antenais de abelhas do grupo controle, coradas com H.E., 
submetidas à reação de Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e 
histoquímica. B, D e F – lobos antenais de abelhas do grupo exposto coradas com H.E., submetidas à reação de 
Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e histoquímica. G = glomérulo; N 
= neurópila; Ne = neurônios.  
 
 
 
                                                                                                                                                                           



Artigo 1 _______________________________________________________________________      39 

Figura 7. Fotomicrografias do lobo antenal de Apis mellifera submetidas à reação de Tunel. A – lobo antenal de 
abelha do grupo controle sem alteração evidenciada pela técnica de imunocitoquímica. B – lobo antenal de 
abelha do grupo exposto sem alteração evidenciada pela técnica de imunocitoquímica. G = glomérulo; N = 
neurópila; Ne = neurônios.  



Artigo 1 _______________________________________________________________________      40 

4. Discussão e Conclusão 

A partir dos resultados obtidos pode-se verificar que ocorreram alterações 

morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas nos corpos pedunculados e nos lobos 

ópticos, das abelhas expostas ao imidaclopride quando comparadas as do grupo controle.  

Nos lobos ópticos das abelhas dos grupos DL50/100 e DL50/50, expostas por 1 e 3 dias, 

e nos corpos pedunculados do grupo DL50/10, expostas por 10 dias ao inseticida foi possível 

observar uma diferença nos resultados obtidos por meio das técnicas morfológicas e 

histoquímicas, comparadas a técnica de detecção de morte celular. Nessas estruturas não 

foram observadas, por meio das técnicas morfológicas e histoquímicas, a presença de células 

condensadas, células com núcleos picnóticos e com aumento de síntese protéica, que, como 

discutido acima, caracterizam células em processo de morte celular. Já a reação de Tunel, 

mostrou reações positivas em alguns núcleos nos corpos pedunculados e lobos ópticos de 

abelhas expostas à estas doses e por estes períodos. Tais diferenças podem ter ocorrido devido 

ao estágio do processo de morte que a célula se encontra. Quando os núcleos são marcados 

apenas pela reação Tunel pode ser que estes estejam em estágio inicial da morte celular, 

enquanto que a condensação celular e cromatínica, evidenciado pelas técnicas morfológica e 

histoquímicas podem ocorrer no estágio final do processo de morte, ou então, ser 

característica de células apoptóticas e autofágicas, em que o DNA não sofre fragmentação por 

endonucleases. 

Além disso, comparando os grupos expostos entre si, foi possível observar que o lobo 

óptico foi a estrutura mais sensível ao inseticida, já que as alterações foram observadas em 

todas as doses e períodos testados, enquanto que nos corpos pedunculados as alterações foram 

exclusivas do grupo DL50/10. Já, em relação aos lobos antenais, não foi verificado qualquer 

tipo de alteração morfológica comparando-se os grupos expostos e controles.  

A alteração morfológica mais marcante observada foi em relação à coloração mais 

intensa que algumas células apresentaram com a técnica de H.E., evidenciando a presença de 

células condensadas. Através da reação de Feulgen foi possível observar que estas estruturas 

cerebrais também apresentaram células com núcleos com condensação cromatínica. 

A condensação da célula pode indicar morte celular por apoptose (BOWEN, I.; 

BOWEN, S.; JONES, 1998). A presença de células com núcleos com compactação 

cromatínica pode resultar em baixa atividade transcricional, sugerindo tratar-se de células 

sofrendo o processo de morte celular (WYLLIE, 1981; HÄCKER, 2000; SILVA-ZACARIN; 

TABOGA; SILVA DE MORAES, 2008).  



Artigo 1 _______________________________________________________________________      41 

Na morte celular por apoptose, a homeostasia é mantida pelo controle da quantidade 

de proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas. Estímulos, como dano ao DNA, levam ao 

aumento na expressão das proteínas pró-apoptóticas e esse desequilíbrio induz a apoptose 

(PETROS; OLEJNICZAK; FESIK, 2004). No presente estudo a técnica para de detecção de 

proteínas totais mostrou células positivas ao Xilidine Ponceau, mais intensamente coradas que 

as dos controles, nos corpos pedunculados e lobos ópticos de abelhas expostas ao 

imidaclopride, o que pode ser um indício do aumento de síntese protéica que pode ser 

decorrente do desencadeamento da maquinaria de sinalização de morte celular, ou ainda pode 

ser resultado da condensação celular. 

Dessa forma, embora a morte celular programada em insetos esteja relacionada com a 

reorganização tecidual que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de 

algum órgão na fase adulta (GREGORC et al., 2004), esse tipo de morte celular também pode 

ser observado nos órgãos de animais submetidos à exposição com substâncias tóxicas, que 

conduzem a um alto nível de estresse nas células, como observado no presente estudo. 

Alguns trabalhos mostraram as alterações ultra-estruturais ocasionadas pela exposição 

de células de inseto de origem embrionária em cultura a doses subletais ao mercúrio orgânico 

e inorgânico (BRAECKMAN; RAES, 1999) e, também, ao cádmio (BRAECKMAN et al., 

1999). Os resultados dessas pesquisas revelam alterações ultra-estruturais que não são 

características de necrose, mas da ativação da morte celular apoptótica. De acordo com estes 

autores a manutenção da maquinaria de síntese protéica está relacionada com a síntese de 

proteínas de estresse (HSPs), em resposta aos agentes químicos testados nestas células. Silva-

Zacarin, Gregorc e Silva de Moraes (2006) também detectaram a ativação das HSPs em 

glândulas salivares de larvas de abelhas tratadas com acaricidas em apiários comerciais. 

Deglise et al. (2003) e Armengaud et al. (2000), trabalhando com este mesmo 

inseticida, utilizaram a atividade da enzima citocromo oxidase para avaliar os efeitos de curta 

duração de ligantes colinérgicos no metabolismo de diferentes estruturas cerebrais, focando 

suas investigações nas regiões dos lobos antenais e corpos pedunculados. Esses autores 

verificaram que o imidaclopride ativou o metabolismo celular nos corpos pedunculados e em 

menor intensidade nos lobos antenais. 

O sistema visual de um inseto adulto consiste em retina (o olho propriamente dito), 

contendo células fotorreceptoras, e os lóbulos ópticos que compreendem três gânglios: a 

lâmina, a medula e a lóbula. A retina forma um arranjo de células altamente ordenado de 

unidades omatidiais repetidas (READY; HANSON; BENZER, 1976). Cada unidade retinal 

(com oito a nove células fotossensorais), dentro do omatídeo, projeta feixes axonais em 



Artigo 1 _______________________________________________________________________      42 

direção aos lóbulos ópticos formando sinapses na lâmina e, eventualmente, na medula. 

Neurônios da lâmina por sua vez projetam axônios para dentro da medula e esta projeta para a 

lóbula (HORRIDGE, 1965). Assim, mortes celulares nos lobos ópticos podem causar 

diminuição de neurônios e, conseqüentemente diminuição do número de sinapses entre esta 

estrutura e os olhos compostos. Portanto, o imidaclopride administrado em doses subletais 

provoca alterações estruturais nos lobos ópticos que podem levar ao surgimento de problemas 

na acuidade visual dos indivíduos, prejudicando diversas atividades desenvolvidas pelas 

operárias, como a atividade de forrageamento.  

Os resultados obtidos por Bortolotti et al. (2003), durante a avaliação dos efeitos das 

doses subletais do imidaclopride no forrageamento e retorno à colônia por A. mellifera, 

podem ser explicados devido as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas 

observadas nos lobos ópticos. As abelhas do controle voltavam à colônia, retornando ao 

alimentador em até 5 horas. Aquelas alimentadas com xarope contendo 100 ppb do inseticida 

também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador após 24 horas. Já as 

abelhas expostas aos alimentadores com 500 e 1000 ppb, não retornaram à colônia ou ao 

alimentador. É possível que nesses indivíduos também tenha ocorrido a morte celular 

evidenciada pela reação de Tunel, o que pode ter comprometido a acuidade visual deles. 

 Outra estrutura cerebral que mereceu atenção foram os corpos pedunculados por 

estarem relacionados à aprendizagem e memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; 

CRUZ-LANDIN, 2009). Assim, no cérebro das abelhas expostas do grupo DL50/10, 

verificou-se a presença de núcleos picnóticos nos corpos pedunculados das abelhas 

submetidas a 3, 5, 7 e 10 dias de tratamento. No corpo pedunculado da abelha exposta por 

maior período, foi possível observar além de núcleos picnóticos, um aspecto de inchaço dos 

corpos celulares. Dessa maneira, é possível afirmar que o dano causado no cérebro foi mais 

intenso nas abelhas expostas à maior concentração de inseticida e ao maior período de 

tratamento. 

Como os corpos pedunculados estão associados aos processos de memória e 

aprendizagem, os danos nessas estruturas podem provocar desorientação e prejudicar a 

atividade de forrageamento das abelhas, o que pode comprometer temporariamente toda a 

colônia. 

Estudos realizados por Decourtye et al. (2004 a,b) comprovaram, a partir do método 

de REP, que as abelhas submetidas a uma dieta contendo dose subletal de imidaclopride 

apresentaram uma diminuição no desempenho do aprendizado olfatório.  



Artigo 1 _______________________________________________________________________      43 

Rossi (2008) avaliou os efeitos agudos da dose letal média do imidaclopride na 

morfologia do cérebro de A. mellifera africanizada. Nesse estudo, não foram verificadas 

nenhuma alteração morfológica. Assim, podemos verificar que é provável que a exposição a 

doses subletais por um período maior de tempo, como testado no presente estudo, contribuiu 

para as alterações morfológicas observadas. Isso pode ser explicado, possivelmente, pela ação 

e exposição prolongada ao inseticida e seus metabólitos. Além disso, os resultados indicam 

que os as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas observadas nos corpos 

pedunculados e lobos ópticos das abelhas expostas ao inseticida, pode afetar as atividades 

realizadas pelas abelhas, como o forrageamento, e afetar temporariamente toda a colônia. 

 
5. Referências Bibliográficas 
 
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.; 
RENARD, G.; CHIES, J. M. Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre: Artes 
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Amsterdam, v. 859, n. 2, p. 390– 393, 2000. 

BICKER, G.  Histtochemistry of classical neurotransmitters in antennal lobes and mushroom 
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Artigo 2 _______________________________________________________________________      48 
 

4. ARTIGO 2 

 

ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E HISTOQUÍMICAS NAS CÉLULAS 

DIGESTIVAS DO VENTRÍCULO DE ABELHAS Apis mellifera AFRICANIZADA 

EXPOSTAS A DOSES SUBLETAIS DO INSETICIDA IMIDACLOPRIDE. 

 

 

 

 
 
 
 

  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Artigo 2 _______________________________________________________________________      49 
 
Resumo  
 
As abelhas apresentam papel essencial para a agricultura, uma vez que, são importantes como 
polinizadores. Para o controle de insetos-praga nesse ambiente estão sendo usadas diversas 
substâncias sintéticas. Entretanto, a exposição das abelhas a esses compostos, devido a sua 
atividade de forrageamento, tem como consequência a intoxicação destes insetos, observada 
pelas altas taxas de mortalidade ou ainda, pelas mudanças fisiológicas e comportamentais 
induzidas pela exposição a doses subletais. No Brasil, um dos inseticidas mais utilizados nas 
culturas de cana-de-açúcar, café e citrus é o imidaclopride. Esse princípio ativo tem ação no 
sistema nervoso do inseto. No entanto, há poucos estudos referentes à ação em órgãos não-
alvo que entram em contato com o inseticida ou seus metabólitos, como o ventrículo, órgão 
responsável pela digestão e absorção de alimentos. Assim, o presente estudo teve como 
objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica a doses subletais do inseticida imidaclopride, 
no ventrículo de Apis mellifera africanizada. Para isso, o órgão estudado das abelhas expostas 
e do controle foram submetidos a análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica. 
Comparando-se a morfologia do ventrículo das abelhas dos grupos controles e expostos, foi 
possível observar, de uma maneira geral, um aumento na quantidade de células eliminadas no 
lúmen, principalmente após 1 dia de exposição; na quantidade de secreção apócrina eliminada 
no lúmen, mais intensa geralmente após 10 dias de exposição; e na quantidade de halos 
pericromatínicos nas células digestivas. A reação de Feulgen permitiu confirmar ocorrência 
de núcleos picnóticos no epitélio e mostrar a presença de fragmentos nucleares nas células 
digestivas dos ventrículos de todos os períodos e grupos expostos. Já a reação com Xilidine 
Ponceau, permitiu observar regiões negativas a este, que pode indicar áreas degeneradas da 
célula e confirmar a presença de halos pericromatínicos evidenciadas pela coloração com 
H.E.. A técnica de imunocitoquímica empregada não mostrou núcleos positivos ao Tunel. 
Dessa maneira, foi possível concluir que doses subletais do imidaclopride tem ação citotóxica 
no ventrículo das abelhas expostas. 
 
Palavras-chave: citotoxicidade, abelha, inseticida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 



Artigo 2 _______________________________________________________________________      50 
 
1. Introdução 

 As abelhas são responsáveis pela polinização de mais espécies de plantas do que 

qualquer outro grupo de animais, contribuindo na manutenção da biodiversidade das espécies 

vegetais (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001). Dessa maneira, são muito importantes para 

a produtividade na agricultura moderna, sendo que 52 das 115 maiores produções de alimento 

no mundo dependem da polinização por abelhas para produção de frutas e sementes. Algumas 

dessas produções teriam até 90% de redução da produção caso não houvesse as abelhas, além 

de redução do tamanho, qualidade e quantidade dos frutos (KLEIN et al., 2007). 

Tal eficiência pode ser atribuída a diversos fatores como: a grande força de trabalho 

das colônias devido ao elevado número de indivíduos (10.000-40.000), crescimento da 

colônia usando como estímulo a alimentação artificial com xarope, visita a uma ampla 

variedade de flores, largo alcance de vôo (4,5 Km) e comunicação eficiente entre as 

forrageiras para indicar a fonte de alimento (SEELEY, 1985). Assim, o uso de colônias 

manejadas tem se tornado extremamente importante para garantir a polinização de algumas 

culturas. O aumento na demanda de unidades de polinização causou um aumento no preço de 

aluguel da colônia de 54 dólares em 2004 para 136 em 2006 (SUMNER; BORISS, 2006). O 

número total de colônias de abelhas manejadas no mundo foi estimada em 72,6 milhões em 

2007 (FAO, 2009). 

 Uma grande preocupação atual dos apicultores americanos e europeus é a perda de 

colônias, conhecida como Distúrbio do Colapso das Colônias. Embora as causas desse 

fenômeno não estejam bem definidas, uma hipótese relevante é a intoxicação das abelhas por 

inseticidas, substâncias cada vez mais usadas na agricultura para o controle de insetos-praga 

(WESTIN, 2007). 

 Desde 1975, o Brasil está entre os seis maiores mercados de agrotóxicos do mundo. 

Em 2008, o país assumiu a liderança desse consumo e as vendas de agrotóxicos somaram US$ 

7,125 bilhões (ANDEF, 2009). Embora esteja proibido em alguns países devido à intoxicação 

de insetos e outros animais (GODOY, 2004; CORTEZ, 2008a, 2008b), um dos inseticidas 

mais utilizados no Brasil, nas culturas de cana-de-açúcar, café, citrus e algodão, é o 

imidaclopride (BRASIL, 2011). 

O imidaclopride atua inibindo a ação de receptores nicotínicos de acetilcolina dos 

insetos, encontrados em muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas 

nos processos de aprendizagem e memória (BICKER, 1999). No entanto, em uma exposição 

oral, o inseticida entra em contato com outros órgãos, antes de chegar ao órgão alvo. Entre 



Artigo 2 _______________________________________________________________________      51 
 
esses órgãos, estão ventrículo, cuja função é digestão e absorção do alimento. Dessa maneira, 

este é um órgão chave no estudo dos efeitos do imidaclopride em órgãos não-alvo. 

O canal alimentar das abelhas é dividido em três regiões: intestino anterior; intestino 

médio, também chamado de ventrículo; e intestino posterior.  

O ventrículo é composto por um epitélio constituído especialmente, por células 

prismáticas. Esse epitélio apresenta três tipos celulares: células digestivas, endócrinas e 

regenerativas. As células digestivas apresentam núcleos elípticos ou esféricos acompanhando 

a forma mais alta ou mais baixa das células e apresentam cromatina, geralmente 

descondensada. As principais funções dessas células são a produção de enzimas digestivas e a 

absorção dos produtos de digestão. É possível observar nestas células, a formação e liberação 

de projeções citoplasmáticas, que podem ser consideradas um modo de eliminação de 

secreção ou em alguns casos, de material de excreção. As células digestivas são ricas em 

microvilosidades que aumentam a superfície de contato com o lúmen, facilitando a absorção 

(CRUZ-LANDIN, 2009).  

Devido à intensa atividade secretora e absortiva, e às vezes, excretora, as células 

digestivas sofrem desgastes, que podem ser intensificados quando são expostas em situações 

patológicas e/ou toxicológicas. Essas células desgastadas são eliminadas no lúmen, e 

substituídas por células derivadas da diferenciação das células regenerativas (BOWEN, I.; 

BOWEN, S.; JONES, 1998; CAVALCANTE; CRUZ-LANDIM, 1999).  

Ao longo da porção apical do epitélio, junto às microvilosidades, é possível observar 

uma camada denominada membrana peritrófica que apresenta como principais funções: 

proteger o epitélio contra a ação mecânica do alimento; controlar o fluxo de substâncias entre 

os compartimentos internos e externos da membrana; barreira física contra parasitas e 

bactérias; impedir a ligação inespecífica do alimento a hidrolases ou a proteínas 

transportadoras da membrana plasmática das células epiteliais; e evitar excreção das células 

digestivas, permitindo uma recirculação endo-ectoperitrófica destas (CRUZ-LANDIN, 2009).   

Pequenas doses de inseticida, conhecidas como doses subletais, podem não causar a 

morte das abelhas, mas podem induzir mudanças no comportamento e na fisiologia desses 

insetos, o que pode afetar temporariamente toda a colônia. Além disso, poucos estudos têm 

sido realizados no sentido de avaliar alterações em órgãos não-alvo do inseticida (CRUZ et 

al., 2010; SILVA-ZACARIN; MALASPINA, 2006). Dessa maneira, o objetivo do presente 

estudo foi avaliar os efeitos da exposição crônica às doses subletais do imidaclopride sobre o 

ventrículo de operárias de Apis mellifera africanizada. 

 



Artigo 2 _______________________________________________________________________      52 
 
2. Materiais e Métodos 

2.1. Teste de toxicidade crônica 

2.1.1. Coleta das abelhas 

Abelhas adultas recém-emergidas da espécie A. mellifera africanizada foram coletadas 

diretamente dos favos, no apiário do Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. Foram 

verificadas as condições de saúde da colônia e o estado fisiológico, de acordo com as 

diretrizes para testes químicos em abelhas da OECD (Organização para Cooperação e o 

Desenvolvimento Econômico, 1998). 

2.1.2. Bioensaios de intoxicação de abelhas 

As abelhas foram acondicionadas em potes plásticos (10 abelhas por caixa), 

previamente forrados com papel-filtro. Os experimentos foram conduzidos à estufa B.O.D., 

com temperatura a 32oC � 1°C e umidade relativa de 70%. Todos os grupos, experimentais e 

controles, receberam os mesmos suprimentos de água, que consistiu em algodão embebido em 

água, e de alimento (10 �L/abelha). Foram realizados dois grupos controle: controle sem 

solvente, alimentado apenas com xarope (1 água: 1 açúcar invertido), e controle do solvente, 

alimentado com xarope contendo 1% acetona (solvente utilizado para dissolver o inseticida). 

Para a contaminação do alimento oferecido aos grupos experimentais, foi preparada uma 

solução mãe, para o qual o inseticida foi dissolvido em acetona e misturado ao xarope. A 

partir da solução mãe, foram realizadas 3 diluições em xarope, obtendo-se as concentrações 

0,809 (DL50/100), 1,618 (DL50/50) e 8,09 (DL50/10) ηg/abelha do inseticida. As doses 

subletais utilizadas foram calculadas a partir do estudo realizado por Rossi (2008) que 

estabeleceu a DL50 do imidaclopride como sendo 80,9 ηg/abelha. Os períodos de exposição ao 

inseticida foram de 1, 3, 5, 7 e 10 dias .  

 

2.2. Coleta das abelhas após os períodos de intoxicação 

Para cada grupo do bioensaio, foram coletadas 6 abelhas. A coleta dos espécimes para 

os estudos de alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas no ventrículo foi 

baseada no período de exposição das abelhas ao imidaclopride, sendo ele após o início do 

fornecimento do alimento contaminado. Juntamente a estas coletas, foram realizadas coletas 

de abelhas dos grupos controle sem solvente e do grupo controle do solvente. 

 

2.3. Processamento do material  

A dissecção das abelhas foi realizada em solução salina para insetos tamponada (NaCl 

7,5g/L, Na2HPO4 2,38g/L e KH2PO4 2,72g/L) e os ventrículos retirados foram fixados em 



Artigo 2 _______________________________________________________________________      53 
 
paraformaldeído 4% em tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,4. Posteriormente, o material 

foi desidratado nos seguintes banhos de álcool: 15, 30, 50, 70, 85, 90, 95 e 100% (duração de 

2 horas cada) (SILVA-ZACARIN et al., 2010 – informação pessoal).  

2.3.1. Inclusão em resina para as análises morfológicas e histoquímicas 

Após a desidratação, o material foi transferido para a resina de embebição, e 

posteriormente, foi incluído em moldes plásticos contendo historesina. Os blocos foram 

mantidos em estufa a 37°C e depois de polimerizados, foram colocados em suportes de 

madeira para a secção (7 μm) em micrótomo. As secções foram recolhidas em lâminas de 

vidro, previamente limpas, e coradas.  

2.3.2. Inclusão em parafina para a análise imunocitoquímica 

Após a desidratação, material foi submetido a um banho de álcool e xilol (1:1) por 10 

minutos e dois banhos de xilol, de 5 minutos cada. Em seguida, o ma