RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 02/09/2021. PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOMATERIAIS E BIOPROCESSOS MESTRADO PROFISSIONAL “ESTUDOS DA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO CORANTE VERDE OBTIDO A PARTIR DO MICRORGANISMO STREPTOMYCES CARPATICUS” Olímpia Paschoal Martins ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Lucas Primo COORIENTADORA: Profa. Dra. Carmen Lúcia Cardoso ARARAQUARA - SP 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOMATERIAIS E BIOPROCESSOS MESTRADO PROFISSIONAL “ESTUDOS DA ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DO CORANTE VERDE OBTIDO A PARTIR DO MICRORGANISMO STREPTOMYCES CARPATICUS” Olímpia Paschoal Martins Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos (Mestrado Profissional), Área de Biomateriais, Bioprocessos, Bioprodutos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Biomateriais e Bioprocessos. ORIENTADOR: Prof. Dr. Fernando Lucas Primo COORIENTADORA: Profa. Dra. Carmen Lúcia Cardoso ARARAQUARA - SP 2019 Martins, Olímpia Paschoal. M386e Estudos da elucidação estrutural do corante verde obtido a partir do microrganismo Streptomyces carpaticus / Olímpia Paschoal Martins. – Araraquara: [S.n.], 2019. 76 f. : il. Dissertação (Mestrado Profissional) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biomateriais e Bioprocessos. Área de Pesquisa em Biomateriais, Bioprocessos, Bioprodutos. Orientador: Fernando Lucas Primo. Coorientadora: Carmen Lúcia Cardoso. 1. Corantes. 2. Espectrometria. 3. Elucidação estrutural. 4. Biotecnologia. 5. Streptomyces Carpaticus. I. Primo, Fernando Lucas, orient. II. Cardoso, Carmen Lúcia, coorient. III. Título. Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP - Campus de Araraquara CAPES: 33004030170P0 Esta ficha não pode ser modificada Dedicatória Ao Pai Celestial por seu infinito amor e bondade e pelas muitas bênçãos que derramou e continua derramando em minha vida. Ao meu querido marido Ricardo, que teve a paciência e compreensão para aceitar minhas ausências. Ao meu filho querido Thiago, o grande amor da minha vida que suportou minhas mudanças de humor nos momentos de dificuldade. A minha filha amada Letícia, que durante esse período me deu a alegria de gerar dois filhos lindos o Arthur e a Alice, que tornaram meus dias muito mais iluminados. A Daniella Romano de Carvalho, que muito mais que amiga me auxiliou em todas as etapas deste trabalho. Agradecimentos Ao meu orientador Prof. Dr. Fernando Lucas Primo pela oportunidade, confiança e compreensão frente as minhas limitações. A minha coorientadora Profa. Dra. Carmen Lúcia Cardoso, por disponibilizar o laboratório para realização do trabalho e por se colocar à disposição todas as vezes que surgiram dúvidas, compartilhando sua imensa sabedoria. Ao Prof. Dr. Álvaro de Baptista Neto, pelo fornecimento do corante verde. Ao funcionário do Departamento de Química Vinícius Palaretti que se preocupou com o andamento do meu trabalho, me auxiliando nas análises de RMN e colocando-se à disposição para me auxiliar na interpretação dos resultados. A funcionária da FCFRP- USP, Jacqueline Nakau, que se mostrou uma verdadeira amiga ao doar seu tempo e se mostrar sempre solícita para tirar dúvidas e propor ações para melhoria dos meus resultados. Ao aluno de pós graduação do laboratório de toxicologia Raul Miranda, pelo companheirismo e por ter se disposto a me auxiliar em todas as etapas do trabalho. Ao aluno de pós graduação Renato Salviato Cicolani por compartilhar seu conhecimento me auxiliando nessa etapa final de análise de resultados. Ao aluno de pós graduação Douglas Luís da Silva, pelo auxílio na preparação das amostras para análises de IV e realização das mesmas, assim como na interpretação do resultados, mas muito mais que isso, pelo carinho e palavras de incentivo dispendidos durante o tempo de realização desse trabalho. Aos alunos do CNET Leonardo Barcelos, Leonardo Franchi, Daniela Silvestrini, Jayme, Maryanne, Nayara que se alegraram com a minha decisão de dar mais esse passo. A Graciely Gobo, por ter me incentivado a aceitar esse desafio, por dividir comigo as dificuldades que foram surgindo ao longo desse período e por sempre estar disposta a me escutar. A minha querida amiga Patrícia Gotto, que mesmo estando longe fisicamente sempre esteve ao meu lado me apoiando e me fazendo acreditar na minha capacidade e força de levar meus sonhos adiante. A minha amiga Adriana Vilela que sempre me incentivou e confiou na minha capacidade de assumir mais esse desafio. A minha querida amiga Daniela Romano que doou seu tempo e compartilhou suas experiências e sabedoria, que não mediu esforços para me ajudar em todos os momentos. Sem você Dani esse momento não seria possível. Ao meu marido maravilhoso, que vem exercitando ao longo desses nossos anos de união a sua paciência para aceitar e fazer parte dos meus sonhos. A meu filho querido, que com a sua ingenuidade, altruísmo e amor me ensina a cada dia como ser melhor e que podemos nos superar devido a nossa herança Divina. A minha linda filha, que sempre se mostrou orgulhosa frente as minhas realizações. Aos meus lindos netos Arthur e Alice, que chegaram para dar mais luz a minha vida e para fazer meu coração transbordar de amor. Sou imensamente grata a todos que de maneira direta ou indireta me ajudaram a passar por mais essa etapa da minha vida. À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto e o Departamento de Química pela Infraestrutura fornecida. Agradeço a Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus Araraquara e ao Programa de Pós Graduação do Mestrado Profissional, por tornar possível o complemento de minha formação em uma Instituição de Qualidade. Epígrafe “...Desconfie do destino, acredite em você. Gaste mais horas realizando do que sonhando, Fazendo do que planejando, Vivendo do que esperando!”. (Caroline Tavares). RESUMO A exploração da cor nunca esteve tão evidente como nos dias de hoje, e muitas indústrias são direta ou indiretamente dependentes da disponibilidade de corantes artificiais. Com o crescimento da produção, consumo e utilização de produtos contendo corantes sintéticos, aumentaram também os relatos com problemas relacionados à saúde e aos danos causados no meio ambiente devido, principalmente a sua baixa biodegradabilidade, fazendo-se repensar o uso dessas substâncias. Frente ao conhecimento do público, assim como a relação à segurança ambiental e a preocupação com a saúde, os corantes naturais nesse sentido podem ser uma alternativa ao uso dos corantes sintéticos conquistando, a cada ano, uma nova fatia do mercado. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o corante verde de origem biotecnológica, obtido a partir do cultivo do microrganismo Streptomyces carpaticus, através de diversas técnicas espectroscópicas, para que assim possa se propor a aplicação do mesmo em indústrias têxteis, de cosméticos ou alimentícias. Foram realizadas análises para identificação do corante bem como testes para definição dos solventes de trabalho, os quais foram utilizados na preparação das amostras que foram enviadas para as diversas técnicas. Os testes iniciais realizados no corante bruto, tiveram por objetivo definir o solvente ideal para preparação das amostras para análises de Espectroscopia de UV-Vis, Fluorescência, Espectrometria de massas e Ressonância Magnética Nuclear uni e bidimensionais. Após análises por Infravermelho e RMN, foi possível verificar a presença de vários contaminantes, o que direcionou o trabalho para a purificação do corante. Esse trabalho incluiu extração em fase sólida (SPE), técnicas cromatográficas como colunas abertas em sílica gel e Sephadex LH-20. Foram realizadas análises via HPLC acoplado a Espectrometria de Massas. Os resultados experimentais obtidos através da combinação das diversas técnicas permitiram inferir características estruturais à molécula, bem como direcionar os estudos futuros buscando potenciais aplicações industriais. Palavras-chave: corantes; espectrometria; elucidação estrutural; biotecnologia; Streptomyces Carpaticus ABSTRACT The Color exploration has never been more evident than it is today. Many industries are directly or indirectly dependent on the availability of synthetic dyes. With the growth of the production, consumption and the use of products containing synthetic dyes the number of reports about problems related to health and damage caused to the environment, mainly due to their low biodegradability have been increasing. So the use of these substance should be rethought. In the face of public knowledge, as well as environmental safety and health concerns, natural dyes in this sense can be an alternative to the use of synthetic dyes, gaining a new market share each year. The objective of this work was to characterize the green dye of biotechnological origin, obtained from the cultivation of the microorganism Streptomyces carpaticus, through several spectroscopic techniques, so that it can be proposed its application in the textile, cosmetic or food industries. Analyzes were performed to identify the dye as well as tests to define the working solvents, which were used in the preparation of samples that were sent to the various techniques. The initial tests carried out on the raw dye aimed to define the ideal solvent for sample preparation for analysis of UV-Vis Spectroscopy, Fluorescence, Mass Spectrometry and One and Two Dimensional Nuclear Magnetic Resonance. After Infrared and NMR analysis, it was possible to verify the presence of several contaminants, which directed the work to the dye purification. This work included solid phase extraction (SPE), chromatographic techniques such as silica gel open columns and Sephadex LH-20. Mass spectrometry coupled HPLC analyzes were performed. The experimental results obtained through the combination of several techniques allowed to infer structural characteristics to the molecule, as well as to direct future studies looking for potential industrial applications. Keywords: dyes; spectrometry; structural elucidation; biotechnology; Streptomyces Carpaticus LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Grupos cromóforos presentes em corantes orgânicos.............................................22 Figura 2 - Estruturas químicas de corantes sintéticos..............................................................24 Figura 3 - Estruturas químicas de corantes naturais................................................................26 Figura 4 - Estruturas químicas de alguns corantes naturais produzidos por microrganismos.........................................................................................................................29 Figura 5 - Esquema de um espectrofotômetro.........................................................................34 Figura 6 - Esquema geral de um espectrofluorímetro..............................................................36 Figura 7 - Tipos de vibrações moleculares consideradas na espectroscopia de infravermelho............................................................................................................................40 Figura 8 - Espectro eletrônico UV-vis do corante em diferentes solventes orgânicos...................................................................................................................................47 Figura 9 – Espectro de absorção em diferentes valores de pHs...............................................48 Figura 10 - Espectro de emissão de fluorescência normalizado com excitação fixa em 270 nm em diferentes solventes orgânicos, fendas de resolução espectral de 10 nm e 15 nm para excitação e emissão, respectivamente......................................................................................49 Figura 11 - Espectro de fluorescência normalizado com excitação fixa em 440 nm em diferentes solventes orgânicos, fendas de resolução espectral de 10 nm e 15 nm para excitação e emissão, respectivamente......................................................................................................49 Figura 12 - Espectro de infravermelho obtido do corante líquido e liofilizado.......................50 Figura 13 - Espectro de infravermelho obtido do corante purificado......................................50 Figura 14 - Espectro de RMN de análise de 1H do corante verde liofilizado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5MHz.....................................................................................................52 Figura 15 - Espectro de RMN de análise de 1H do corante verde liofilizado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5MHz.....................................................................................................53 Figura 16 - Espectro de RMN de análise de 13C do corante verde liofilizado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5 MHz....................................................................................................54 Figura 17 – Espectro de RMN de análise de 13C do corante verde liofilizado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5 MHz...................................................................................................55 Figura 18 – Sinais de RMN da α-glicose (a) e β-glicose (b)...................................................56 Figura 19 – Espectro de RMN de análise de 1H do corante verde purificado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5 MHz (faixa: 5 – 9 ppm)......................................................................57 Figura 20 - Espectro de RMN de análise de 1H do corante verde purificado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5 MHz (faixa: 2 – 6 ppm)......................................................................58 Figura 21 - Espectro de RMN de análise de 1H do corante verde purificado, dissolvido em MeOH-d4, frequência 5 MHz (faixa: 0 – 3 ppm)......................................................................59 Figura 22 - Comparação dos espectros de massas (ESI+) do corante bruto e metanol /branco (A) e corante bruto e liofilizado (B) .........................................................................................61 Figura 23 - Frações da coluna de Silica gel observadas em: (a) fora da câmara escura, (b) Hexano/Acetato de etila, (c) fração com o composto de interesse...........................................63 Figura 24 - Cromatograma obtido do corante bruto extraido com cartucho SPE e aplicada em coluna de resina Sephadex com monitoramente em 450 nm...................................................64 Figura 25 - Cromatograma LC-UV do corante purificado em C18 com monitoramento em 450 nm.................................................................................................................................64 Figura 26 - Cromatograma LC-MS do corante purificado em C18.........................................65 Figura 27 - Espectro de massas referente ao tempo de 10 minutos da análise LC-MS...........66 Figura 28 - Espectro de massas referente ao tempo de 5 minutos da análise LC-MS.............66 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Corantes sintéticos utilizados no Brasil e na União Européia, de acordo com cada órgão institucional específico...................................................................................................25 Tabela 2 - Principais corantes naturais extraídos de plantas e animais....................................27 Tabela 3 - Tipos de Streptomyces, colorações e outros metabólitos produzidos.....................31 Tabela 4 - Faixas de comprimento de onda de interesse para a espectrofotometria................32 Tabela 5 - Relação entre as cores absorvidas e suas cores observadas com os respectivos comprimentos de onda.............................................................................................................33 Tabela 6 - Regiões espectrais do infravermelho.....................................................................39 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária 13C – Carbono 13 CCD – Cromatografia em Camada Delgada CNNPA – Comissão Nacional de Normas Padrões para Alimentos COSY - COrrelation SpectroscopY DMSO – Dimetil-sulfóxido DSMO-d6 – Dimetil-sulfóxido deuterado EtOH – Etanol ESI – Ionização por ElectroSpray 19F – Flúor 19 FCF – Verde Rápido FDA – Food and Drug Administration 1H - Hidrogênio HMBC - Heteronuclear MultipleBond Coherence HPLC – High Performance Liquid Cromatrography HSQC - Heteronuclear Single Quantum Coherence JECFA - Join FAO/WHO Expert Comminittee on Food Additives LC – Cromatografia Líquida m/z – razão massa/carga mL - mililitro mm - milímetro MeOH – Metanol MS – Mass Spectroscopy nm - nanômetro 31P – Fósforo 31 RMN – Ressonância Magnética Nuclear SPE - Solid Phase Extraction UV-Vis – Ultravioleta-Visível µg – micrograma SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. .17 2. OBJETIVOS ................................................................................................................... .20 2.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 20 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 20 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................... 21 3.1. CORANTES E PIGMENTOS ...................................................................................... .21 3.2. CORANTES SINTÉTICOS ......................................................................................... .23 3.3. CORANTES NATURAIS ............................................................................................ .25 3.4. CORANTES PRODUZIDOS POR MICRORGANISMOS ............................................ .27 3.5. CORANTE PRODUZIDO POR STREPTOMYCES ....................................................... .30 3.6. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS ........................................................................... .31 3.6.1. ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO NO UV-VIS ............................................. .32 3.6.2. ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA .............................. .35 3.6.3. A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA E A ESPECTROMETRIA E MASSAS ......................................................................................... .37 3.6.4. ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR - RMN .................................................................................................................. .38 3.6.5. ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO – IR ........................ .38 4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... .41 4.1. REAGENTES E MATERIAIS ..................................................................................... .41 4.2. EQUIPAMENTOS ....................................................................................................... .41 4.3. MÉTODOS OU PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ............................................... .42 4.3.1. ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VIS .................................................. .42 4.3.2. ESPECTROSCOPIA DE EMISSÃO DE FLUORESCÊNCIA .................................... .42 4.3.3. LIOFILIZAÇÃO ........................................................................................................... .43 4.3.4. ANÁLISE DE RMN ...................................................................................................... .43 4.3.5. ANÁLISE DE INFRAVERMELHO............................................................................. .43 4.3.6. CROMATOGRAFIA EM COLUNA ............................................................................ .44 4.3.7. EXTRAÇÃO DO CORANTE ....................................................................................... .44 4.3.8. CROMATROGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – HPLC ........................ .44 4.3.9. ANÁLISE DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS .................................................... .45 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... .46 5.1. CARACTERÍSTICAS DO CORANTE VERDE DE STREPTOMYCES CARPATICUS ................................................................................................................................................. .46 5.2. ANÁLISE DE INFRAVERMELHO............................................................................ .50 5.3. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) ................................................ .51 5.4. ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS ................................................. .60 5.5. EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA – SPE .................................................................... .62 5.6. FRACIONAMENTO POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA .............................. .62 5.7. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO ................................ 64 6. CONCLUSÕES .............................................................................................................. .68 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 70 INTRODUÇÃO | 17 1. INTRODUÇÃO As cores sempre foram um atrativo para o homem, isso é facilmente percebido quando vemos que os corantes são utilizados desde os tempos mais primórdios. Com o passar do tempo o homem começou a procurar novos corantes e assim surgiram os corantes sintéticos. Considerando que a cor está diretamente relacionada a aceitação de um alimento por exemplo, e que se correlaciona a cor com a qualidade do produto, ela incrementa os apelos de sabor, aroma e textura. Desde a antiguidade vem se utilizando alguns métodos de colorir os alimentos para torná-los mais atraentes (FABRI; TERAMOTO, 2015). Assim, o homem passou a buscar novos corantes, não apenas os naturais, o que levou ao desenvolvimento de novos processos químicos, dando origem ao importante segmento industrial, o de corantes sintéticos. Na primeira metade do século XX, o uso de corantes artificiais para manipular a coloração de alimentos comercializados teve um grande crescimento em virtude de mudanças econômicas, e pela descoberta de métodos de fabricação de corantes sintéticos de forma eficaz e barata. Antes dessa época o emprego por pigmentos naturais prevalecia, porém com aplicação e variação de cores limitadas (BAFANA et al., 2011). As pesquisas de corantes artificiais foram aumentando com o passar dos anos, assim como sua produção, fazendo com que o uso de corantes naturais tivesse uma grande queda (HOLME, 2006; MOHAMMAD et al., 2013). Com o aumento da utilização de corantes sintéticos surgiram relatos sobre a ocorrência de efeitos indesejados, como alergias e toxicidade biológica, de grau moderado e mais graves, como mutagenicidade e potencial carcinogênico, o que levou a sociedade a repensar o uso indiscriminado dessas substâncias (CARVALHO et al., 2014). Além do mais, os problemas ambientais estão cada vez mais evidentes na sociedade contemporânea e as diversas alterações tanto físicas, químicas e biológicas são observados quando avaliamos a qualidade do solo, ar e água. Um dos grandes problemas do século está ligado à qualidade do corpo hídrico que está muito aquém dos padrões estabelecidos como toleráveis. O consumo de água nos processos das atividades industriais têxteis é muito alto e gera um alto volume de efluentes o que contribui para o aumento dos níveis de contaminantes em águas naturais (MENDES, et al., 2015). Dentre os corantes amplamente utilizados nas indústrias têxteis podemos citar os corantes azo sintéticos que do total utilizado tem de 10 a 15% liberados nos corpos d’água por terem um baixo grau de fixação nos tecidos (GANODERMAIERI et al., 2005). Com a liberação dessa carga orgânica há uma alteração do ecossistema, ocasionada pela turbidez da água dificultando a penetração da radiação solar, o INTRODUÇÃO | 18 que gera modificações na atividade fotossintética e na solubilidade dos gases. Essa turbidez ocorre por causa da presença de compostos químicos tóxicos que compõem as moléculas dos corantes, tais como, benzeno, tolueno, etil-benzeno, naftaleno, antraceno e xileno (MENDES, et al., 2015). Esses compostos podem se acumular e causar riscos quando lançados no meio ambiente, devido aos seus efeitos tóxicos podendo permanecer no meio por até 50 anos (MENDES, et al., 2015). Esses fatores juntamente com a sua baixa biodegradabilidade podem trazer significativos problemas ambientais. Com a preocupação crescente da sociedade com relação a saúde e ao prejuízo ambiental têm-se aumentado a procura por corantes naturais e biotecnológicos como alternativa para substituição adequada dos corantes sintéticos (CRUZ FILHO; TEIXEIRA, 2013). Assim, há um grande interesse no desenvolvimento de novos processos para a produção de corantes de origem natural por vias biotecnológicas. Nesse contexto, pesquisas mostram que a indústria de corantes naturais tem apresentado um crescimento de 5-10% em relação aos 3-5% dos obtidos por via sintética, isso associado a um aumento nas vendas de 4,6% de 2004 para 2007, enquanto o índice de aumento de venda de corantes em geral foi de 2,5% no mesmo período (CRUZ FILHO; TEIXEIRA, 2013; MENDONÇA, 2011). O corante natural obtido por processos de cultivos de microrganismos tem chamado a atenção dentre as diferentes fontes de corantes naturais existentes, pois, possibilita o controle e aperfeiçoamento do processo biotecnológico, é independente de condições climáticas e demanda menos espaço físico. Os níveis de rendimentos dos processos fermentativos confirmam a vantagem da obtenção de pigmentos por via microbiana (CRUZ FILHO; TEIXEIRA, 2013). O fato dos pigmentos microbianos estarem associados a uma imagem de produtos naturais de boa qualidade e salutares, também faz com que a aceitação pelo consumidor seja maior, porém se faz necessária a realização das análises toxicológicas e sua comparação com os corantes sintéticos e de outras fontes naturais (CRUZ FILHO e TEIXEIRA, 2013). Neste contexto, o corante verde cedido pelo grupo no Prof. Dr. Álvaro Baptista Neto do Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, campus de Araraquara, obtido como subproduto da produção de Vanilomicina pelo microrganismo Streptomyces Carpaticus, coletado do ambiente marinho, se tornou material de estudo do grupo de pesquisa coordenado pelo Prof. Dr. Fernando Lucas Primo da mesma faculdade, com o intuito de propor a identificação estrutural do corante, assim como suas INTRODUÇÃO | 19 características químicas e físicas para definir uma possível aplicação em indústrias têxteis, de cosméticos ou alimentícias. CONCLUSÕES | 68 6. CONCLUSÕES Nesse trabalho de pesquisa foi possível realizar várias etapas propostas para a determinação da fórmula molecular do corante verde. A amostra foi liofilizada para que fosse possível prepará-la para as análises de RMN e Infravermelho. Pode-se perceber que a amostra é altamente higroscópica, pois absorveu água, mesmo tendo sido fechada de modo adequado. Após a liofilização do corante foi possível solubizar o mesmo parcialmente nos solventes selecionados para o preparo das amostras (MeOH, EtOH, DMSO), isso pode ter sido devido a danos na estrutura da molécula, visto que o processo de liofilização faz uso de condições extremas como abaixamento de temperatura e alto vácuo. Com a realização dos espectros de absorção e emissão de fluorescência no UV-Vis, foi possível perceber um padrão equivalente de espectros da amostra com picos em 270 nm e 454 nm. Após a análise de RMN foi possível verificar a presença de glicose como contaminante o que dificultou a visualização de picos de interesse no espectro e direcionou as atividades do projeto para a investigação de métodos para purificação do corante verde. Através das análises de infravermelho da amostra bruta e da amostra liofilizada foi possível verificar a diminuição significativa do alargamento da banda que se encontra na região 3397 cm-1 característica de estiramento O-H equivalente a molécula de água, mas a análise não foi conclusiva com relação aos grupos existentes, pois não foi possível realizar outras análises para comparação. A tentativa de purificação da amostra, foi feita com aplicação da mesma em coluna de sílica gel e sephadex e em seguida foi colocada no speed vac, rotaevaporada, tendo em vista a preparação da mesma para análises de infravermelho e ressonância magnética nuclear. A amostra foi aplicada em espectrômetro de massas por inserção direta e apresentou um espectro com muitas impurezas, o que tornou os resultados inconclusivos. Foi possível verificar a necessidade da purificação da amostra para otimização do método através de análises futuras. Quando o corante verde foi aplicado no equipamento de HPLC, utilizando a coluna C18 não foi possível fazer uma separação eficiente da amostra, pois a mesma apresentou problemas com o solvente e com a coluna. Em trabalhos futuros a amostra será aplicada em diferentes colunas com a utilização de outros solventes e diferentes proporções na tentativa de otimizar o processo de separação. CONCLUSÕES | 69 Os estudos deixaram evidente que existe uma mistura na qual mais de um produto pode se apresentar como promissor para diversas aplicações, pois pode ser um composto inédito, com isso deve-se pensar na possibilidade da obtenção de uma quantidade maior da amostra para se iniciar com processo de extração seguido da concentração da mesma, podendo então realizar os processos de purificação conforme descritos nesse trabalho. Com isso espera-se obter uma maior eficiência na remoção dos possíveis ativos para aplicação e análise dessa amostra mais concentrada em equipamentos analíticos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS | 70 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABADI, M. D. M.; ASHRAF, N.; CHAMSAZ, M.; SHEMIRANI, F. An overview of liquid phase microextraction approaches combined with UV-Vis spectrophotometry. Talanta, v. 99, p. 1-12, 2012. ABEROUMAND, A. A review article on edibel pigments properties and sources as natural biocolorants in doodstuff and food industry. Word Journal of Dairy & Food Sciences, v. 6, p. 71-78, 2011. ALVES, L. D. S.; ROLIM, L. A.; FONTES, D. A. F.; ROLIM-NETO, P. J.; SOARES, M. F. L. R.; SOBRINHO, J. L. S. Desenvolvimento de método analítico para quantificação do efavirenz por espectrofotometria no UV-Vis. Química Nova, v. 33, p. 1967-1972, 2010. AMRALLAH, A. H.; ABDALLA, N. A.; EL-HATY, E. Y. Spectrophotometric studies on some arylazo barbituric acids and arylazo pyrimidine in organic solvents and in buffer solutions. Journal of the Chinese Chemical Society, v. 54, p.1629-1637, 2007. ANVISA. AGENCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. 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