Campus de Botucatu PG-BGA ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DO HORMÔNIO CONCENTRADOR DE MELANINA (MCH) NA ÁREA HIPOTALÂMICA LATERAL DO RATO AO LONGO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL E ENVELHECIMENTO CARLA DE MORAES MACHADO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior BOTUCATU – SP 2015 Campus de Botucatu PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DO HORMÔNIO CONCENTRADOR DE MELANINA (MCH) NA ÁREA HIPOTALÂMICA LATERAL DO RATO AO LONGO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL E ENVELHECIMENTO CARLA DE MORAES MACHADO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Prof. Titular Jackson Cioni Bittencourt BOTUCATU – SP 2015 CARLA DE MORAES MACHADO ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DO HORMÔNIO CONCENTRADOR DE MELANINA (MCH) NA ÁREA HIPOTALÂMICA LATERAL DO RATO AO LONGO DO DESENVOLVIMENTO PÓS-NATAL E ENVELHECIMENTO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Orientador: Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Comissão examinadora: _____________________________________________ Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Instituto de Biociências – UNESP/Botucatu _____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Fernando Takase Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – UFSCAR _____________________________________________ Profª. Drª. Luciana Pinato Faculdade de Filosofia e Ciências – UNESP/Marília Botucatu, 26 de fevereiro de 2015. DEDICATÓRIA Aos meus pais, Carlos e Sineide, e a minha irmã, Gabriela. A Robert Hans de Moraes Santos (In Memoriam). AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Carlos e Sineide, e à minha irmã, Gabriela, por todo o apoio em mais uma etapa cumprida de um sonho que, a priori, era só meu, mas se tornou parte do de vocês. À minha segunda família, Shirley, Thiago e Marina, por fazerem parte de todos os momentos importantes e me apoiarem em todos eles. Ao Professor Doutor José de Anchieta de Castro e Horta Júnior, por ter acreditado no meu potencial para desenvolver um projeto de pesquisa envolvendo Neurociências, pelo aprendizado durante toda a preparação dessa dissertação, que contribuiu de forma brilhante para o meu crescimento profissional. Ao Professor Titular Jackson Cioni Bittencourt, pela receptividade, disponibilidade e todo suporte em seu laboratório, pela confiança depositada no trabalho, contribuindo diretamente para o seu enriquecimento. À Professora Doutora Raquel Fantin Domeniconi, por sua generosidade e incentivo desde o início dessa nova etapa, e por continuar contribuindo de forma significativa para a minha formação. Às Professoras Doutoras Patrícia Fernanda Felipe Pinheiro e Mirela Barros Dias, pelas ricas sugestões para esse trabalho durante o Exame de Qualificação. Aos Professores Doutores Luciana Pinato e Luiz Claudio Takase, pelas contribuições para a discussão e o aprimoramento dessa dissertação. Aos meus irmãos de Botucatu, Juliana (Balsa), Cristiane (Dofa), Ana Carolina (Passa), André (Qualy) e Amanda (Para), por todos os momentos que enfrentamos juntos, fortalecendo ainda mais os laços de amizade que formamos e por sempre acreditarem em mim. À Marina, pelo companheirismo dentro e fora do laboratório e pelo sinergismo. Aos colegas do Laboratório de Neuromorfologia, Nicole, André e Rian, pelos bons momentos compartilhados durante todo o trabalho. Aos novos colegas do Laboratório de Neuroanatomia Química (ICB/USP), Renata, Daniella, Giovanne, Jéssica, Érica, e à Professora Doutora Luciane Valéria Sita pela recepção sempre cordial e toda atenção oferecida. À funcionária Joelcimar Martins da Silva (Jô) por todo aprendizado durante os experimentos e pelos bons momentos compartilhados em sua execução. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, pelo atendimento solícito na condução dessa dissertação. Aos alunos, funcionários e docentes do Departamento de Anatomia do Instituto de Biociências de Botucatu, pela convivência harmoniosa no ambiente de trabalho e fora dele. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro concedido na forma de bolsa (2013/08618-3) e auxílio Jovem Pesquisador (2008/02771-6) para a execução do presente trabalho. “Em algum lugar, alguma coisa incrível está esperando para ser conhecida” Carl Sagan Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................6 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................................. 7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES .................................................................................................................... 8 RESUMO ............................................. .................................................................................................. 9 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 10 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 11 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................................... 16 OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 16 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................................................................................................... 16 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................... 17 Animais ........................................................................................................................................... 17 Preparo do material biológico ......................................................................................................... 18 Protocolo de imuno-histoquímica para o MCH ............................................................................... 20 Estudo Citoarquitetônico pelo método de Nissl .............................................................................. 21 Hibridização in situ ......................................................................................................................... 21 Forma de análise dos resultados ................................................................................................... 22 Estudo estereológico dos neurônios MCH-ir da área hipotalâmica lateral ..................................... 23 Mapeamento e reconstrução tridimensional dos neurônios MCH-ir ............................................... 25 Densitometria óptica ....................................................................................................................... 25 Apresentação das ilustrações científicas ....................................................................................... 27 RESULTADOS .................................................................................................................................... 27 Estudo citoarquitetônico do hipotálamo e da LHA .......................................................................... 27 Imuno-histoquímica para MCH ....................................................................................................... 27 Estudo estereológico dos neurônios MCH-ir da área hipotalâmica lateral ..................................... 32 Reconstrução tridimensional da área hipotalâmica lateral ............................................................. 34 Hibridização in situ ......................................................................................................................... 44 Densitometria óptica ....................................................................................................................... 48 DISCUSSÃO ........................................................................................................................................ 51 Imuno-histoquímica e hibridizaçãoo in situ ..................................................................................... 51 Estimativa do número de neurônios MCH-ir na LHA e a expressão de MCH quantificada por densitometria óptica ....................................................................................................................... 52 Reconstrução tridimensional .......................................................................................................... 55 CONCLUSÃO ...................................................................................................................................... 56 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 57 APÊNDICES – Protocolos ................................................................................................................... 61 APÊNDICE A – Protocolo de acasalamento programado de ratos ................................................ 62 APÊNDICE B – Protocolo padrão de imuno-histoquímica – MCH ................................................. 66 APÊNDICE C – Protocolo de hibridização in situ para ppMCH ..................................................... 68 APÊNDICE D – Protocolo de estereologia – contagem de células utilizando a ferramenta optical fractionator” do sistema de estereologia “Stereo Investigator” (MBF Bioscience) ......................... 72 APÊNDICE E – Protocolo para análise densitométrica para RNAm após hibridização in situ ...... 74 APÊNDICE F – Instruções para manipulação de pdf 3D interativo criado a partir do modelo de reconstrução tridimensional ............................................................................................................ 76 APÊNDICE G – Análise estatística dos resultados ........................................................................ 78 Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................7 LISTA DE ABREVIATURAS 3V – terceiro ventrículo ACTH – hormônio adrenocorticotrópico AgRP – peptídeo relacionado à proteína agouti AHA – parte anterior da área hipotalâmica anterior AHC – parte central da área hipotalâmica anterior Arc – núcleo arqueado cDNA – ácido desoxirribonucleico complementar CART – transcrito regulado pela anfetamina e cocaína cp - pedúnculo cerebral CRF – fator liberador de corticotropina DAB – 3,3’ diaminobenzidina tetrahidrocloreto DMC – núcleo dorsomedial compacto DMD – núcleo dorsomedial dorsal DMV – núcleo dorsomedial ventral DOI – densidade óptica integrada f – fórnix Hcrt/OX – hipocretina/orexina Hcrt/OX-ir – células imunorreativas à hipocretina/orexina ic – cápsula interna LA – núcleo látero-anterior do hipotálamo LHA – área hipotalâmica lateral LM – núcleo mamilar lateral LPO – área pré-óptica lateral M – molar MCH – hormônio concentrador de melanina MCH-ir – células imunorreativas ao hormônio concentrador de melanina MCLH – núcleo magnocelular lateral do hipotálamo MGOP – peptídeo resultante de leitura alternativa do gene MCH MPA – área pré-óptica medial MPOM – região medial do núcleo pré-óptico medial ML – região lateral do núcleo mamilar medial MM – região medial do núcleo mamilar medial MRe3V – recesso mamilar do 3V mt – trato mamilotalâmico NEI – neuropeptídeo ácido glutâmico isoleucina NEI-ir – células imunorreativas ao neuropeptídeo ácido glutâmico isoleucina NGE – neuropeptídeo glicina, ácido glutâmico NPY – neuropeptídeo Y opt – trato óptico PaMP – região medial do núcleo paraventricular parvocelular PaLM – região lateral do núcleo paraventricular magnocelular Pef – núcleo perifornicial POMC – peptídeo da pró-opiomelanocortina ppMCH – pré-pró-hormônio concentrador de melanina RNAm – ácido ribonucleico mensageiro RNAt – ácido ribonucleico transportador Rch – núcleo retroquiasmático rpm – rotações por minuto SNC – sistema nervoso central SO – núcleo supra-óptico SuMM – núcleo supramamilar medial STMPM – núcleo STM póstero-medial VMHC – núcleo ventromedial central VMHDM – núcleo ventromedial dorsomedial VMHVL – núcleo ventromedial ventrolateral ZIrm – zona incerta rostromedial Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Esquema da divisão do hipotálamo em três zonas longitudinais e quatro regiões transversais. ........... 11  Figura 2: Esquema da estrutura primária do MCH e origem genética do pré-pró-hormônio concentrador de melanina (pp-MCH) . .............................................................................................................................................. 13  Figura 3: Esquema adapatado de Nahon (1989) que mostra a localização dos neurônios imunorreativos ao MCH e suas projeções axonais para as diversas áreas do neuro-eixo. ......................................................................... 14  Figura 4: Fotomicrografia de lavado vaginal com presença de espermatozoides, corados com eosina, hematoxilina e Orange G (Apêndice A), caracterizando o dia 0 de gestação. ....................................................... 19  Figura 5: Fotografia do períneo em rato fêmea (A) e macho (B) da linhagem Sprague-Dawley de 10 dias de idade. ..................................................................................................................................................................... 19  Figura 6: Imagem da janela de observação tecidual do programa Stereo Investigator, obtida em tempo real através de câmera digital acoplada ao microscópio óptico.. .................................................................................. 24  Figura 7: Esquema de uma janela de contagem do programa Stereo Investigator. ............................................. 24  Figura 8: Representação do filtro de densidade óptica neutra utilizado para captura de imagens de referência para calibração de densidade óptica no programa ImageJ. .................................................................................. 26  Figura 9: Citoarquitetura do hipotálamo e distribuição dos neurônios MCH-ir nas regiões mamilar (A), tuberal (B), anterior (C) e pré-óptica (D) do hipotálamo do rato. .............................................................................................. 28  Figura 10: Fotomicrografias da região mamilar da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias.. .................................................................................. 29  Figura 11: Fotomicrografias da região tuberal da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. ......................................................................................... 30  Figura 12: Fotomicrografias da região anterior da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. ................................................................................... 31  Figura 13: Média do número de neurônios MCH-ir na LHA total estimados por método estereológico, para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. .................................................................................................... 32  Figura 14: Média da área LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. ............................ 33  Figura 15: Média do volume da LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. .................... 33  Figura 16: Média de densidade neuronal (neurônios/mm³) da LHA para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. ................................................................................................................................................................ 33  Figura 17: Reconstrução tridimensional do hipotálamo para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir: grupos de 14, 28 e 50 dias. ............................................................................................................................................... 35  Figura 18: Reconstrução tridimensional do hipotálamo para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir: grupos de 90, 210, 540 e 750 dias. ................................................................................................................................... 36  Figura 19: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 14 dias. ......................................... 37  Figura 20: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 28 dias.. ........................................ 38  Figura 21: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 50 dias. ......................................... 39  Figura 22: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 90 dias. ......................................... 40  Figura 23: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 210 dias. ............. 41  Figura 24: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 540 dias.. ............ 42  Figura 25: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 750 dias. ............. 43  Figura 26: Distância média (µm) entre as células MCH-ir da LHA total e das regiões adjacentes a ela para os grupos de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. ...................................................................................................... 44  Figura 27: Hibridização in situ para RNAm do ppMCH nas regiões da área hipotalâmica lateral: mamilar (A), tuberal (B), anterior (C). ......................................................................................................................................... 44  Figura 28: Hibridização in situ para o ppMCH na região mamilar da LHA. ........................................................... 45  Figura 29: Hibridização in situ para o ppMCH na região tuberal da LHA.. ............................................................ 46  Figura 30: Hibridização in situ para o ppMCH na região anterior da LHA. ............................................................ 47  Figura 31: Média da densidade óptica integrada (DOI) na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). ....................................................................................................................................... 48  Figura 32: Média da densidade óptica média dos grãos de prata precipitados na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). ............................................................................................. 49  Figura 33: Média da área marcada na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). ................................................................................................................................................................... 50  Figura 34: Média da densidade óptica integrada (DOI) nas regiões mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e mediana da DOI na LHA anterior (LHAa) para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). ................ 50  Figura 35: Média da densidade óptica média nas regiões mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e mediana para a LHA anterior (LHAa) para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). .................................... 51  Figura 36: Médiana da área marcada nas regiões mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e anterior (LHAa) para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). ........................................................................... 51  Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................9 RESUMO Alterações na Expressão do Hormônio Concentrador de Melanina (MCH) na Área Hipotalâmica Lateral do Rato ao longo do Desenvolvimento Pós-natal e Envelhecimento O hormônio concentrador de melanina (MCH) do rato é um nonadecapeptídeo presente em neurônios localizados, principalmente, na área hipotalâmica lateral (LHA) que se projetam para diversas regiões do neuro-eixo. O MCH está envolvido em diversas funções, tais como: reprodução, certos aspectos do comportamento motivado, atividade locomotora, percepção sensorial, controle de temperatura, memória, aprendizagem, ansiedade, ciclo sono-vigília e comportamento alimentar. Nesse, o MCH atua como neuropeptídeo orexígeno. Durante o envelhecimento, ocorre a diminuição no consumo de energia associada à idade. Nesse trabalho, analisamos em diferentes faixas etárias, as variações da expressão do MCH na área hipotalâmica lateral, empregando métodos esterológicos (para estimar o número de neurônios MCH-ir, área, volume e densidade neuronal), reconstrução tridimensional (para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir) e densitometria óptica de tecido hibridizado para reconhecimento do RNAm do ppMCH (para mensuração da área hibridizada, densidade óptica média e densidade óptica integrada [DOI]) na LHA e em suas regiões. Foram utilizados 35 ratos Sprague-Dawley machos, divididos em 7 grupos experimentais de diferentes idades: 14 (lactente), 28 (pré-púbere), 50 (púbere), 90 (adulto jovem), 210 (adulto maduro), 540 (adulto senescente) e 750 (adulto senil) dias pós-natais. Os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca, seus encéfalos coletados e processados para análise da expressão do MCH na área hipotalâmica lateral, segundo protocolos de imuno-histoquímica e hibridização in situ. A LHA apresentou um aumento significativo no número de neurônios apenas entre os grupos de 14 e 28 dias e sua área e volume foram significativamente menores apenas no grupo de 14 dias em relação a todos os grupos, com exceção do grupo de 750 dias. No entanto, com relação a densidade neuronal não foram observadas diferenças significantes entre os grupos. O padrão de distribuição dos neurônios MCH-ir não mostrou diferenças qualitativas na LHA e em regiões adjacentes entre os grupos. Os neurônios MCH-ir no hipotálamo apresentaram-se em igual proporção dentro e fora da LHA como um todo, porém, analisando sua distribuição nas regiões mamilar, tuberal e anterior, notou-se a maior concentração dos neurônios MCH-ir na região tuberal, na qual a maior quantidade está dentro da LHA, seguida das regiões anterior e mamilar onde a maior quantidade de neurônios MCH-ir está fora da LHA. A mensuração da DOI indicou um aumento da expressão do MCH entre o período pré-púbere e adulto jovem e posterior diminuição da expressão com o envelhecimento, com diferenças significativas entre o adulto jovem e adultos senescente e senil, dados também corroborados pela mensuração da densidade óptica média e área de tecido hibridizado. Esse mesmo padrão de expressão do MCH foi verificado em todas as regiões da LHA. Dessa forma, concluímos que não há alteração no número de neurônios MCH-ir da LHA após a lactação, embora haja uma diminuição significativa na expressão do RNAm do ppMCH com o processo de envelhecimento. Palavras-chaves: Hibridização in situ, envelhecimento, desenvolvimento pós-natal, área hipotalâmica lateral, imuno-histoquímica, hormônio concentrador de melanina, densitometria óptica, estereologia, reconstrução tridimensional Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................10 ABSTRACT Melanin-Concentrating Hormone (MCH) Expression in the Lateral Hypothalamic Area of the Rat During the Postnatal Development and Aging The Melanin-Concentrating Hormone (MCH) is a nonadecapeptide located mainly in neurons in the lateral hypothalamic area (LHA), which innervate several regions of neuraxis. MCH is involved in many functions as reproduction, aspects of motived behaviors, motor activity, sensorial information, temperature control, memory, learning, anxiety, sleep-wake cycle and feeding behavior in which the MCH plays an orexigenic role. The energy consumption in aging is reduced as well as, the expression of MCH presents alterations associated with age. Therefore, we analyzed the variations in the expression of MCH at different ages in the lateral hypothalamic area, using stereology (to estimate the number of MCH-ir neurons, area, volume and neuronal density), 3D reconstruction (to study the distribution of MCH-ir neurons) and optical density after in situ hybridization protocol for ppMCH RNAm (to measure the hibridizated area, the mean optical density and the integrated optical density [IOD]) in the LHA and its three regions. In this study, 35 animals were divided in 7 experimental groups of 14 (neonate), 28 (prepubescent), 50 (pubescent), 90 (young adult), 210 (middle aged adult), 540 (senescent adult) and 750 (elderly adult) postnatal days. All the animals were perfused via the ascending aorta, the brains were collected and processed by immunohistochemistry and in situ hybridization protocols to analyze the expression of MCH in the lateral hypothalamic area. LHA neurons number increased only between groups of 14 and 28 days, and its area and volume significantly smaller in 14-days group when in respect to all other groups but the 750-days one. However, there weren’t differences in neuronal density among groups. MCH-ir neurons distribution in LHA and contiguous regions was similar among all groups as well. Hypothalamic MCH-ir neurons has shown uniform rates in and out of LHA, but after analyzing its distribution in mamillary, tuberal and anterior regions, it has been observed a higher concentration of MCH-ir neurons in tuberal region, where there are more neurons inside LHA, when compared to anterior and mamillary regions which have a greater number of them out of it. The IOD measurement revealed an increased MCH expression between prepubescent and young adult groups followed by its decreasing during aging, especially among young adult and senescent and elderly adult animals. These data are also corroborated by mean optical density measurement and labeled area. This MCH expression pattern was observed in all LHA regions. Therefore, we conclude that the number of MCH-ir neurons in LHA doesn’t modify after suckling, even though the RNAm expression of ppMCH decreases during aging. Keywords: in situ hybridization, aging, postnatal development, lateral hypothalamic area, immunohistochemistry, melanin-concentrating hormone, optical density, stereology, 3D reconstruction Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................11 INTRODUÇÃO O hipotálamo é um centro integrativo essencial para a sobrevivência. Sua diversidade de funções regulatórias se reflete em sua estrutura, neuroquímica e conexões, visto que quase todas as importantes regiões do sistema nervoso central (SNC) se comunicam com esse centro (SQUIRE, 2008). Ele ocupa a região ventral e medial do diencéfalo, próximo às paredes do terceiro ventrículo, ventralmente à zona incerta, medialmente à cápsula interna e ao subtálamo, rostralmente à substância periaquedutal e à área tegmental ventral do mesencéfalo (SIMERLY e GEORGE, 2004). O hipotálamo pode ser dividido em 12 compartimentos a partir de dois critérios: o primeiro, estabelecido por LE GROS CLARK (1938), que o divide em quatro regiões rostro-caudais (pré-óptica, anterior, tuberal e mamilar) e o segundo, postulado por CROSBY e WOODBURNE (1940), que identifica três zonas longitudinais (periventricular, medial e lateral - Figura 1). A zona periventricular contém a maior parte dos neurônios neuroendócrinos, a zona medial consiste em grupos celulares bem definidos que recebem, principalmente, aferências de diferentes regiões do sistema límbico e a zona lateral é composta de neurônios dispersos entre as fibras do feixe prosencefálico medial (SAWCHENKO, 1998). Em especial, a zona lateral pode ser subdividida em duas áreas: a área pré- óptica lateral e a área hipotalâmica lateral (SWANSON, 1987; SIMERLY e GEORGE, 2004). Figura 1: Esquema da divisão do hipotálamo em três zonas longitudinais e quatro regiões transversais, com a identificação dos seus núcleos e áreas (SIMERLY e GEORGE, 2004). Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................12 A área hipotalâmica lateral (LHA) pode ser dividida em três regiões (anterior, tuberal e mamilar), com padrões de conexões diferentes e complexos associados ao feixe prosencefálico medial que a atravessa (SAPER et al., 1979; BERTHOUD, 2002). Além disso, a LHA está relacionada ao processamento de informações sensitivas, modulação de respostas motoras somáticas e, especialmente, com a expressão de comportamentos motivados associados à ingestão alimentar (BERNARDIS e BELLINGER, 1996), ingestão hídrica, reprodução, modulação autônoma, ciclo sono- vigília (SZYMUSIAK et al., 1989; KRILOWICZ et al., 1994), controle neuroendócrino (BERNARDIS e BELLINGER, 1993; LARSEN et al., 1994), termorregulação (SATINOFF e SHAN, 1971; ZHANG et al., 1997) e ativação cortical (SAPER, 1985; SAPER et al., 1986) A diversidade de funções está apoiada por uma grande variedade de neurotransmissores e neuromoduladores. Estudos anteriores demonstraram a presença de diversos neuropeptídeos na LHA, dentre eles a hipocretina/orexina (Hcrt/Ox), que apresenta importante papel na manutenção da vigília e no controle da ingestão alimentar (BROBERGER et al., 1998; BROBERGER, 2005), o neuropeptídeo ácido glutâmico isoleucina (NEI), associado ao comportamento de grooming e locomoção (NAHON et al., 1989), o transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART) relacionado com manutenção do peso corporal, ingestão alimentar, estresse e recompensa (KOYLU et al., 1997; KUHAR et al., 2002; ZHANG et al.) e o hormônio concentrador de melanina (MCH), um oligopeptídeo de expressão predominantemente hipotalâmica, associado à regulação de respostas comportamentais que garantem a homeostase do indivíduo, sua sobrevivência e, portanto, a manutenção da espécie (BITTENCOURT et al., 1992; NAHON e ABBA, 2006; BITTENCOURT, 2011). A distribuição de fibras e terminais imunorreativos ao MCH, associada à distribuição de seu receptor (MCH-1R), sugere sua capacidade de influenciar a organização de comportamentos motivados, através da influência no alerta, comportamento exploratório, regulação autonômica, alimentação, aprendizado e memória (BITTENCOURT et al., 1992; HERVIEU et al., 2000; SAITO et al., 2001). O MCH pode ser encontrado em vários órgãos, como pulmão, tireóide, baço, trato gastrintestinal e, em destaque, no cérebro, que é responsável pela expressão de 98% do peptídeo (NAHON et al., 1993). O isolamento do MCH do rato foi realizado por Nahon et al. (1989) e Vaughan et al. (1989). Segundo esses trabalhos, o MCH do rato possui estrutura cíclica, composta por 19 aminoácidos, diferenciando do MCH do salmão, descrito previamente por Kawauchi et al. (1983), em dois aminoácidos da porção amino-terminal e quatro substituições. O MCH do rato ocupa a porção carboxi-terminal de um polipeptídeo precursor (pré-pró-hormônio concentrador de melanina – ppMCH; Figura 2) composto por 165 aminoácidos, o qual também codifica outro neuropeptídeo de conformação não-cíclica (neuropeptídeo ácido glutâmico isoleucina; NEI), e um outro potencial peptídeo (neuropeptídeo glicina ácido glutâmico; NGE) (NAHON et al., 1989). Posteriormente, foi descoberto um quarto peptídeo da família do MCH, o MGOP (MCH gene overprinted polypeptide), um transcrito alternativo do gene do MCH (TOUMANIANTZ et al., 1996; TOUMANIANTZ et al., 2000; ALLAEYS et al., 2004). Alteraç Figur melan conse entre MCH. nervo padrã radio expre respe hipota previa grupa núcle dorso apres regiã os nú densa prose grupa escla A B ções na express ra 2: Esquem nina (pp-MCH ervados entre as duas ciste Adaptado de O estudo oso central f ão de distrib ativamente m essão do RN No SNC d ectivamente) alâmica late amente com amentos com eo periventric omedial e sentaram exp o não descri Há projeç úcleos motor a por essa encefálico m amentos ext arecidas quai são do MCH na ma da estrutur H) . Em A, s as espécies e eínas. Em B, e Nahon e Abb o da distribuiç foi realizado buição do R marcada. A NAm do ppMC do rato, a dis ) é essenc eral (LHA) e m anticorpos m menor qua cular anterio ventromedia pressão do R ta da formaç ções MCH-ir/ res de nervo as fibras. A medial, que a tra-diencefál is são essas a LHA durante d ra primária do sequência dos estão circunda posição dos í ba (1989; 2006 ção dos neu por Bittenc RNAm do pp co-localizaç CH. stribuição da ialmente die e zona incer contra MCH antidade de or e uma reg al do hipotá RNAm do pp ção reticular /NEI-ir para os cranianos A maior pa atravessa a L icos também vias. desenvolvimento o MCH e ori s aminoácido ados pelos re íntrons e éxon 6) e Vaughan urônios imun court et al. ( pMCH de ra ão celular e as células im encefálica ( rta rostrome H de salmão células na gião no hipo álamo. Out pMCH e de s pontina para quase todo s do tronco e arte das fib LHA (BITTE m emitem p o pós-natal e en gem genética os do MCH d etângulos e as ns relacionan et al.(1989). orreativos ao 1992). Ness ato através ntre MCH e munorreativas (Figura 3), edial (ZIrm) o. Entretanto parte dorsom otálamo med ros grupam seus peptíde amediana (B o neuro-eixo encefálico p ras MCH-ir/ NCOURT et projeções M nvelhecimento.. a do pré-pró-h de rato e de s chaves indic dos com as s o MCH e ao se trabalho, de hibridiza NEI foi de s ao MCH e a ocupando de maneira o, também fo medial do nú dial, entre a mentos extra os, como o t ITTENCOUR o (Figura 3), arecem não /NEI-ir são t al., 1992). CH-ir/NEI-ir, ........................ hormônio con salmão. Os cam as pontes sequências do o NEI do rato também foi ação in situ 96%, confirm ao NEI (MCH principalme similar àqu oram observ úcleo tubero as margens a-diencefálic tubérculo olfa RT et al., 199 entretanto, o receber um veiculadas Entretanto, , mas ainda ..................13 ncentrador de aminoácidos s dissulfídicas o NGE, NEI e o no sistema estudado o com sonda mada com a H-ir e NEI-ir, nte a área uela descrita vados outros omamilar, no dos núcleos os também atório e uma 92). o cerebelo e ma inervação pelo feixe a ZIrm e os a não estão e s s e a o a a , a a s o s m a e o e s o Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................14 Figura 3: Esquema adapatado de Nahon (1989) que mostra a localização dos neurônios imunorreativos ao MCH e suas projeções axonais para as diversas áreas do neuro-eixo. O MCH é um dos primeiros neuropeptídeos expressos no encéfalo. Neurônios MCH-ir se diferenciam entre os 10° e 16º dias do período embrionário do rato, com um pico em sua formação no 13º dia, no qual é possível detectar o RNAm e o próprio peptídeo (BRISCHOUX et al., 2001). O surgimento dos neurônios MCH-ir obedecem a um gradiente látero-medial, de forma que os neurônios posicionados lateralmente se diferenciam primeiro do que os situados medialmente (RISOLD et al., 2009). Em neonatos, neurônios MCH-ir estão organizados em agrupamentos menores e localizados mais medialmente do que observado no período embrionário. No 16º dia pós- natal, os corpos celulares MCH-ir já apresentam dimensões e distribuição semelhantes aos padrões encontrados em animais adultos (BRISCHOUX et al., 2001). Os terminais axônicos MCH-ir se dirigem primeiramente ao tronco encefálico e ampliam sua distribuição progressivamente até o 21º dia (STEININGER et al., 2004). Estudos funcionais têm indicado a participação do MCH nos padrões reprodutivos e no comportamento materno (KNOLLEMA et al., 1992; PARKES e VALE, 1993), na integração sensório- motora (MILLER et al., 1993; ELIAS et al., 2008), na influência sobre a secreção de ACTH por meio da modulação do CRF (BAKER, 1994), na homeostase de água e eletrólitos (PARKES e VALE, 1993; PRESSE e NAHON, 1993), no controle da respiração (LI et al.), e no comportamento alimentar (PRESSE et al., 1996; QU et al., 1996; SAPER et al., 2002; SZEKELY e SZELENYI, 2005). Entre todos os participantes do controle do balanço energético, atribuiu-se ao MCH um papel de destaque no controle tônico do comportamento alimentar, exercendo um papel orexígeno (QU et al., 1996; ROSSI et al., 1997), fato confirmado pela inativação gênica do MCH (SHIMADA et al., 1998), que resulta num modelo de camundongos magros e hipofágicos, no qual o fenótipo se estabeleceu progressivamente após o nascimento. A elucidação do verdadeiro papel do MCH no comportamento alimentar também depende do estudo de sua relação com outros peptídeos. Trabalhos prévios investigaram o papel desses peptídeos e de seus receptores no que se refere à gênese da obesidade e suas possíveis utilizações farmacológicas (FAN et al., 1997; BROBERGER et al., 1998; ELIAS et al., 1998; HAKANSSON et al., 1998; SAWCHENKO, 1998; ELIAS et al., 1999; VRANG et al., 1999). Nesse contexto, a leptina Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................15 produzida pelo tecido adiposo branco está envolvida na sinalização ao sistema nervoso central sobre o status energético do indivíduo, através da mediação de neurônios imunorreativos ao neuropeptídeo Y (NPY), ao peptídeo relacionado à proteína agouti (AgRP), aos peptídeos da pro-opiomelanocortina (POMC) e ao transcrito regulado pela anfetamina e cocaína (CART) do núcleo arqueado. Esses grupos neuronais, por sua vez, projetam-se para células contendo MCH ou Hcrt/Ox da LHA que modulam os comportamentos necessários para a manutenção do equilíbrio energético, dentre os quais inclui-se o comportamento de busca por água e alimentos. Assim, o MCH mostra-se como via final da ação da leptina sobre o neuro-eixo, informando-o das necessidades energéticas do indivíduo (ELIAS et al., 1998; ELIAS et al., 1999). Com o processo de envelhecimento, mesmo em indivíduos saudáveis, ocorre perda de gordura e peso corporais, possivelmente relacionados a um balanço energético negativo (relação entre ingestão energética e gasto energético), pois grupos etários mais velhos apresentam substancial redução em sua capacidade de manter um balanço energético constante (ROBERTS, 2000; AKIMOTO e MIYASAKA, 2010). A análise da expressão gênica de peptídeos relacionados ao comportamento alimentar tem sido cada vez mais frequente nos estudos relacionados ao envelhecimento (PETERVARI et al., 2011; FADEL et al., 2013). Assim, o envelhecimento parece estar relacionado com a diminuição de expressão de genes hipotalâmicos de neuropeptídeos, como o POMC, o CART e o MCH, o que sugere uma diminuição no consumo energético com o envelhecimento (KAPPELER et al., 2003). Outro aspecto diretamente influenciado pelo processo de envelhecimento e o MCH é o sono, mais especificamente, a sua duração. Indivíduos jovens apresentam maior tempo de sono, tanto no período de sono de ondas lentas quanto no tempo de sono REM, comparados com idades mais avançadas. Durante o período de sono REM, neurônios MCH-ir estão fortemente ativados e micro- injeções intraventriculares de MCH na fase ativa de ratos provocam aumento do tempo de sono REM em 200%, sugerindo, assim, papel importante do MCH na modulação e manutenção do sono (VERRET et al., 2003; PEYRON et al., 2009; TORTEROLO et al., 2011). Em camundongos, Konadhode et al. (2013) observaram aumento de sono REM e de sono não-REM após estimulação de neurônios MCH-ir através de optogenética. Recentemente, as alterações no padrão de expressão do MCH associadas ao envelhecimento também têm sido relacionadas à doença de Parkinson, patologia que acomete mais frequentemente pessoas idosas. A progressão dessa enfermidade e seu estadiamento clínico estão associados à diminuição de neurônios imunorreativos a hipocretina/orexina (Hcrt/Ox) e ao MCH na área hipotalâmica lateral (THANNICKAL et al., 2007). A perda seletiva dos neurônios Hcrt/Ox-ir pode ser causa da narcolepsia, ocorrência comum na doença de Parkinson, que também pode provocar insônia noturna, distúrbios de sono REM, alucinações e depressão. Outra doença neurodegenerativa frequente em indivíduos idosos é a doença de Alzheimer. Schmidt et al. (2013) identificaram aumento nos níveis de MCH no líquido cérebro-espinal de pacientes com doença de Alzheimer. Esse aumento poderia ser causado pela liberação desse neuropeptídeo gerada pela apoptose ou necrose de células MCH-ir no hipotálamo lateral. Dessa forma, é possível identificar diversas alterações em processos fisiológicos e patológicos associados ao envelhecimento que podem ser relacionadas a alterações na expressão de MCH. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................16 JUSTIFICATIVA A expressão do MCH está relacionada a processos fisiológicos que garantem a homeostase e apresentam mudanças associadas com a idade. Dentre esses processos, já foi descrita previamente a associação entre o envelhecimento e a diminuição no consumo de energia; e a diminuição do tempo de sono, tanto no período de sono de ondas lentas quanto no período de sono REM. Além disso, recentemente, foi descrita uma significativa perda de neurônios Hcrt/Ox-ir e MCH-ir na área hipotalâmica lateral em pacientes com doença de Parkinson e aumento nos níveis de MCH no líquido cérebro-espinal de pacientes com doença de Alzheimer, patologias com maior incidência em indivíduos idosos (THANNICKAL et al., 2007; SCHMIDT et al., 2013). Portanto, é interessante estudar com detalhe a distribuição e a quantidade de MCH nos neurônios da área hipotalâmica lateral durante o desenvolvimento pós-natal e processo de envelhecimento. OBJETIVOS Os objetivos desse trabalho visaram a estudar, durante o desenvolvimento pós-natal e processo de envelhecimento, as variações da expressão do MCH na área hipotalâmica lateral de ratos, e assim, aumentar o conhecimento atual sobre a expressão do MCH, a quantidade e distribuição de neurônios MCH-ir em função da idade DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Para estudar as variações da expressão do MCH na LHA durante o desenvolvimento pós- natal e processo de envelhecimento, foram constituídos 7 grupos experimentais, com 5 animais cada, em idades pós-natais (14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias) representativas de diferentes faixas etárias em ratos (QUINN, 2005; ANDREOLLO et al., 2012). Todos os animais foram eutanasiados por perfusão transcardíaca, fixados e seus encéfalos coletados. Cada encéfalo teve a região do hipotálamo seccionada em 5 séries de cortes obtidos em micrótomo de congelamento. Em todos os casos experimentais, uma série de cortes foi destinada à realização de protocolo de imuno-histoquímica para o MCH e outra série destinada à realização de hibridização in situ para o RNAm do ppMCH. Para referência citoarquitetônica, todas as séries foram contra-coradas com tionina. As demais séries foram armazenadas para possível repetição dos protocolos, caso fosse necessário. Para a contagem dos neurônios MCH-ir na LHA, foi realizada a estimativa do número de neurônios por meio de estereologia, utilizando o programa de computador Stereo Investigator (MicroBrightField, MBF Bioscience, versão 10). O estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir foi realizado através do mapeamento e da elaboração de um modelo de reconstrução tridimensional do hipotálamo com a área hipotalâmica lateral e suas principais referências citoarquitetônicas, utilizando o programa de computador Neurolucida (MicroBrightField, MBF Bioscience, versão 10). A fim de comparar a quantidade de RNAm para o ppMCH na LHA entre os grupos etários, foi Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................17 realizada análise semi-quantitativa, por meio da densidade óptica média e integrada, dos grãos de prata depositados sobre os neurônios após a realização do protocolo de hibridização in situ com sonda marcada com radioisótopo 35S. Os dados quantitativos obtidos na análise estereológica e densitométrica foram analisados quanto sua significância estatística (p<0,05). MATERIAIS E MÉTODOS Animais Todos os experimentos propostos nesse projeto necessitaram da utilização de animais de experimentação, não existindo método alternativo. Tratamos de tomar o maior cuidado possível no planejamento, preparação e execução dos experimentos para incrementar ao máximo as possibilidades de êxito, o que supõe uma redução do número de animais utilizados. Esse preceito foi seguido na elaboração dos protocolos experimentais, aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP (Protocolo CEUA/IBB Nº. 488). Utilizaram-se ratos albinos machos (Rattus norvergicus), da linhagem Sprague-Dawley como modelo experimental, criados no Biotério Central do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Essa espécie é representativa dos mamíferos roedores e já foi utilizada para o mapeamento do MCH no sistema nervoso central (BITTENCOURT et al., 1992) e estudos ontogenéticos desse neuropeptídeo com as técnicas de imuno-histoquímica e hibridização in situ (BRISCHOUX et al., 2001; STEININGER et al., 2004). Os animais foram alojados em gaiolas (33x17x18cm) com livre acesso à água e ração, em biotério com temperatura controlada (21 a 24oC) e ciclo claro/escuro de 12/12 horas (luzes acesas às 7h). Os animais foram divididos em sete grupos experimentais com cinco animais cada (n =5), que foram eutanasiados por perfusão transcardíaca em idades representativas do desenvolvimento pós- natal e processo de envelhecimento: lactente (14 dias), pré-púbere (28 dias), púbere (50 dias), adulto jovem (90 dias), adulto maduro (210 dias), adulto senescente (540) e adulto senil (750 dias) (QUINN, 2005; ANDREOLLO et al., 2012). Para a obtenção dos animais de 14 e 28 dias, foi realizado o acasalamento de ratos da linhagem Sprague-Dawley (Apêndice A). Inicialmente, os casais de animais permaneceram no biotério do Departamento de Anatomia do Instituto de Biociências de Botucatu, até atingirem idade reprodutiva. Após esse período, uma fêmea foi introduzida na caixa de um macho para acasalamento durante a noite. Na manhã seguinte, a fêmea foi retirada para coleta de lavado vaginal e preparo de lâmina corada com eosina, hematoxilina e Orange G, com objetivo de verificar a presença de espermatozoides. Esse procedimento foi realizado durante 6 dias consecutivos, ultrapassando a duração do ciclo estral de ratos da linhagem Sprague-Dawley, a fim de que o acasalamento obtivesse êxito. A presença de espermatozoides no lavado vaginal foi considerada o dia 0 de gestação (Figura 4) e, após a confirmação da prenhez, cada fêmea foi transferida para uma caixa individual. A gestação das fêmeas foi acompanhada diariamente até seu último dia (21º ou 22º dia). O dia em que foi detectada a presença da prole, foi considerado dia 0 pós-natal. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................18 Nos dias pós-natais 14 e 28, datas correspondentes aos grupos experimentais, foi realizado um processo de sexagem dos animais através da observação da distância anogenital (Figura 5), a fim de selecionar para o estudo, exclusivamente, animais machos. Os machos selecionados foram pesados e imediatamente conduzidos ao procedimento de perfusão transcardíaca e preparo de material biológico, evitando que houvesse restrição alimentar aos animais lactentes (14 dias) ou estresse pela separação materna. Preparo do material biológico A intervenção para a eutanásia dos animais foi realizada sob anestesia profunda. Antes de se iniciar qualquer procedimento ou imobilização do animal, sempre foi comprovada a ausência do reflexo de retirada do membro como sinal de anestesia eficaz. Como anestésico, utilizamos uma dose letal de solução de hidrato de cloral (400mg/kg) por via intraperitoneal. Os animais de todos os grupos foram perfundidos com solução salina 0,9% (30ml/minuto), seguida de solução fixadora de formaldeído a 4%, recém-preparado a partir paraformaldeído, em tampão fosfato 0,1M pH7,4, durante 30 minutos. O fluxo de passagem das soluções foi reduzido e adaptado para os grupos de 14 dias (10ml/min) e 28 dias (18 ml/min), para que a fixação dos tecidos fosse eficaz da mesma forma que nos animais de faixa etária mais avançada. Após a perfusão, os animais ficaram em repouso por cerca de 30 minutos para aprimorar a fixação do tecido. Foi realizada craniotomia dorsal e os encéfalos foram retirados da caixa craniana, divididos em dois blocos por uma secção coronal ao nível dos colículos superiores com o auxílio de uma matriz para encéfalos (Insight Ltda.) e pós-fixados na mesma solução fixadora durante uma noite a 4°C. Posteriormente, os blocos foram transferidos para solução de tampão fosfato 0,1M com 30% de sacarose para crioproteção até o momento da microtomia. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................19 Figura 4: Fotomicrografia de lavado vaginal com presença de espermatozoides, corados com eosina, hematoxilina e Orange G (Apêndice A), caracterizando o dia 0 de gestação. Os blocos foram congelados e cortados no plano coronal em secções de 30μm de espessura com um micrótomo de deslizamento (Leica SM2010R) equipado com platina congeladora (BFS- 30MP, Physiotemp Inc.). Os cortes foram recolhidos, sequencialmente, em uma série de 5 frascos preenchidos com solução anti-congelante (30% de etilenoglicol e 20% de glicerol em 1XPBS 0,1M), de maneira que o intervalo entre os cortes consecutivos em cada frasco foi de 150m. As séries de cortes foram armazenadas a -20°C. Figura 5: Fotografia do períneo em rato fêmea (A) e macho (B) da linhagem Sprague-Dawley de 10 dias de idade. A seta indica a distância anogenital que é utilizada como critério para sexagem. 50 µm Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................20 Desde a perfusão até o armazenamento das séries de cortes, todo o cuidado foi tomado para evitar a contaminação dos tecidos por RNAses para a posterior realização do protocolo de hibridização in situ. As soluções foram preparadas com água purificada tratada com dietilpirocarbonato a 0,1% (DEPC) e autoclavadas. O material utilizado para todas as etapas descritas, que antecedem o protocolo de hibridização in situ, foi higienizado e autoclavado ou descontaminado com solução Rnase AWAY® (Invitrogen, #10328-011) para que qualquer contaminação prévia fosse evitada. Todas as substâncias tóxicas foram manipuladas em uma capela extratora de gases, na qual foram preparados os fixadores, perfundidos os animais, realizadas as reações imuno-histoquímicas com DAB e manipuladas substâncias para desidratação e montagem das lâminas para microscopia óptica. Protocolo de imuno-histoquímica para o MCH Esse protocolo foi utilizado para identificar de forma permanente as células MCH-ir na área hipotalâmica lateral, para posterior contagem por estereologia. O protocolo de imuno-histoquímica para o MCH foi padronizado após o teste de três diferentes protocolos para a técnica, seguido de testes de diluição para diferentes concentrações de anticorpo primário anti-MCH, utilizando o protocolo de maior êxito. Para as provas de diluição, foram utilizadas secções histológicas de animais de 90 dias, idade representativa de um animal adulto jovem. As concentrações do anticorpo primário testadas foram: 1:1000, 1:3000, 1:6000, 1:10000, 1:30000 e 1:70000. O mesmo protocolo, com melhor relação entre o sinal (imunorreatividade) e a marcação inespecífica (marcação de fundo), foi utilizado em todos os grupos experimentais (Apêndice B). Após a determinação do protocolo, a concentração ideal para o anticorpo primário anti-MCH foi selecionada por testes de diluição, ficando definida a concentração de 1:6000 como a que promovia a melhor relação entre sinal e fundo. Inicialmente, os cortes histológicos foram lavados em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 , passando à inibição da peroxidase endógena em solução de peróxido de hidrogênio 3% em tampão fosfato 0,1M pH 7,4. Posteriormente, os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 e TBS-Tx 0,05M pH 7,6 (Trisma Base, NaCl 0,85% e Triton-x 0,25%) e incubados em solução para bloqueio da marcação inespecífica contendo soro normal de cabra (Vector Laboratories) a 2% em TBS-Tx. Finalizando a primeira etapa do protocolo, os cortes foram incubados em solução de anticorpo primário anti-MCH do rato, produzido em coelho, na concentração de 1:6000 e TBS-Tx por 48h, em temperatura de 4ºC e sob constante agitação. O anticorpo primário foi gentilmente cedido pelo Dr. Wylie W. Vale e Dr. Joan Vaughan (Salk Institute,La Jolla, CA, USA), do mesmo lote (PBL #234) previamente testado quanto à especificidade por meio de testes de adsorção do anticorpo com concentrações microMolares crescentes do peptídeo sintético e co-localização com a marcação obtida com hibridização in situ (BITTENCOURT et al., 1992). Após 48 horas de incubação, os cortes foram lavados em TBS-Tx 0,05M pH 7,6 e incubados em anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de coelho (Vector Laboratories), produzido em cabra, na concentração de 1:200 (BA-1000 Vector) por 2 horas em temperatura ambiente, lavados em TBS-Tx e incubados em complexo avidina-biotina peroxidase (Vectastain Elite ABC Kit, PK-6100), diluído em TBS-Tx a 1:200, por 2 horas em temperatura ambiente. Esse método baseia-se na grande afinidade Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................21 que a molécula de avidina tem pela molécula de biotina, com constante de dissociação na ordem de 10-15 (HSU et al., 1981). Em seguida, os cortes foram lavados em TBS-Tx e em tampão Tris-HCl 0,05M pH 8,0 para retirada do complexo ABC. Finalmente, a peroxidase unida ao complexo ABC foi evidenciada pela reação de peróxido de hidrogênio, utilizando como cromógeno o 3,3’ diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB), reforçado com níquel amônio sulfato (DAB-Ni), que gera um produto de reação estável na cor negra (HSU e SOBAN, 1982). Após o processo de imuno-histoquímica, os cortes foram transferidos para uma solução de gelatina 0,4%, em tampão Tris-HCl 0,05M, e montados em lâminas de vidro sequencialmente, de caudal para rostral. As séries foram contra-coradas com tionina pelo método de Nissl, para referência citoarquitetônica e as lâminas foram cobertas com lamínulas, utilizando Permont® (Fisher Scientific) como meio de montagem. Estudo Citoarquitetônico pelo método de Nissl A coloração de Nissl tem por objetivo evidenciar estruturas basófilas do tecido nervoso, especialmente o retículo endoplasmático rugoso, presente em grande quantidade nos corpos celulares de neurônios. Dessa forma, esse protocolo é utilizado com frequência para referência citoarquitetônica (KADAR et al., 2009). Primeiramente, os cortes foram montados em lâminas de vidro, a partir de uma solução de gelatina 0,4% em tampão Tris-HCl 0,05M, sequencialmente de caudal para rostral. Após a imersão em formol 10% por 30 minutos, o protocolo para a coloração de Nissl consistiu em realizar a desidratação dos cortes por meio de banhos de álcool etílico de concentração crescente (de 95% a 100%), dissolução dos lipídeos com dois banhos de xilol, reidratação dos cortes por meio de banhos de álcool etílico de concentração decrescente (de 100% a 50%), coloração com solução de tionina a 0,25% (Fisher #T-409) com 1,2% de ácido acético glacial e 0,144% de NaOH seguida de mergulhos em água deionizada. Em seguida, foi realizada uma nova desidratação com álcoois etílicos (50% a 100%), imersão em três banhos de xilol e cobertura das lâminas com lamínula, utilizando Permont® como meio de montagem (PAXINOS e WATSON, 2005). Hibridização in situ Utilizamos a técnica de hibridização in situ para mapeamento e quantificação do RNAm do ppMCH na área hipotalâmica lateral, seguindo o protocolo estabelecido no Laboratório de Neuroanatomia Química, Departamento de Anatomia/ICB-USP (RONDINI et al., 2007; SITA et al., 2007; ELIAS et al., 2008; RONDINI et al., 2010), onde foram realizados esses experimentos sob co- orientação do Prof. Titular Jackson Cioni Bittencourt (Apêndice C). A hibridização in situ possibilita realizar medidas semi-quantitativas de alterações na expressão gênica de regiões específicas do sistema nervoso central, em diversas condições fisiológicas e comportamentais. As sondas foram produzidas por transcrição in vitro utilizando o cDNA do ppMCH (gentilmente cedido pelo Dr. Paul Sawchenko), 35S-UTP, ∆NTP, RNasin, RNA polimerase específica de acordo com o mapa do plasmídeo e tampão de transcrição, incubados à 37°C por 1 hora. Os NTPs não incorporados foram removidos em micro colunas de resina (Probe Quant G-50), por meio Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................22 de centrifugação a 3500rpm por 2 minutos, na temperatura de 4ºC. Posteriormente, duas amostras, contendo 1µl da sonda em cada, foram preparadas para realizar a contagem de incorporação do radioisótopo 35S em aparelho de cintilação. Essa etapa é fundamental para determinar a quantidade de sonda a ser adicionada na solução de ribossonda durante a hibridização e permite que as secções de todos os grupos experimentais sejam hibridizadas com sondas de igual teor de 35S. Foram utilizadas as ribossondas marcadas em tampão de hibridização contendo 0,01% DNA de esperma de salmão, 0,01% RNAt de levedura, 0,05% RNA total de levedura, 10mM DTT, 10% sulfato dextrana, 0,3M NaCl, 1Mm EDTA, pH 8,0 e 1x solução de Denhardt (Sigma), SDS 10%, Na- tiossulfato 10%, em 50% formamida. Os cortes histológicos de encéfalo foram montados em lâminas RNase-free, com carga eletrostática (Fisher Superfrost Plus®), sequencialmente, da região caudal para rostral da LHA, utilizando 1XPBS RNase-free com 4 gotas de formalina para neutralização de possíveis contaminações por RNases. Então, o material foi imerso em solução fixadora de formaldeído a 4% em 1XPBS, para preservação da morfologia do tecido nervoso, e em seguida, pré-tratados em solução de Proteinase K (0,5µg/ml), a fim de realizar digestão proteica e facilitar a penetração da sonda. Posteriormente, o material foi acetilado em 0,1M trietanolamina (TEA-HCl) pH 8,0 e anidrido acético em temperatura ambiente, desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico e deslipidificados em xilol. As lâminas foram colocadas em uma placa preparada com papel de filtro umedecido com 4XSSC para evitar o ressecamento do material e da solução de hibridização. A ribossonda, em tampão de hibridização, foi aplicada sobre as lâminas (100µl/lâmina) que foram cobertas com lamínulas flexíveis estéreis e levadas para a estufa de hibridização a 57°C por aproximadamente 18 horas . Posteriormente, as lamínulas foram removidas espontaneamente em 2XSSC e o excesso de ribossonda no tecido foi lavado com solução de RNAse A (20μg/mL, preparada com tampão contendo 5M NaCl, 1M de Tris-HCl pH8.0, 0,5M EDTA pH 8,0) em temperatura ambiente. Os cortes foram submetidos a banhos de estringência crescente (50°C em 2xSSC + 1mM de DTT, 55°C em 0,2xSSC + 1mM de DTT e 60°C em 0,2xSSC + 1mM de DTT) e desidratados em álcool etílico a 70% + 20XSSC. Após a secagem, as lâminas foram transferidas para cassetes e colocadas em contato com filme auto-radiográfico (Kodak – Biomax MR), permanecendo por 2 dias. Transcorrido o tempo de exposição, os filmes auto-radiográficos foram revelados em solução reveladora Kodak®, lavados em água e imersos em solução fixadora Kodak®, sendo possível verificar se o processo de hibridização obteve êxito. Em seguida, as lâminas foram imersas em emulsão fotográfica (NBT - II Kodak) e estocadas em freezer -30°C. Passados 12 dias, as lâminas foram reveladas com revelador e fixador Kodak®, processadas segundo método de coloração de Nissl para obtenção de referência citoarquitetônica, desidratadas e cobertas com lamínula utilizando-se DPX como meio de montagem. Forma de análise dos resultados Os resultados foram observados em microscópio óptico utilizando as técnicas de microscopia de campo claro. A quantidade de neurônios que apresentaram imunorreatividade ao anticorpo anti- Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................23 MCH, sua distribuição, assim como a área e o volume da LHA foram analisados por meio de estereologia e reconstrução tridimensional. Para a contagem e mapeamento dos neurônios MCH-ir na área hipotalâmica lateral, foi realizada estereologia em 5 animais de todos os grupos etários e a reconstrução tridimensional de um animal representativo de cada grupo etário. A quantidade relativa de RNAm para o ppMCH entre os grupos experimentais (n=5), evidenciada pelo protocolo de hibridização in situ, foi estimada por densitometria óptica. Estudo estereológico dos neurônios MCH-ir da área hipotalâmica lateral O número de neurônios MCH-ir da LHA foi estimado utilizando princípios estereológicos de amostragem sistemática e aleatória (GUNDERSEN e JENSEN, 1987; GUNDERSEN et al., 1988; WEST e GUNDERSEN, 1990; WEST et al., 1991; KULESZA et al., 2002). A técnica de estereologia é um método que determina parâmetros quantitativos tridimensionais de estruturas anatômicas a partir de secções bidimensionais. Para sua execução, foi utilizado o programa Stereo Investigator (MBF Bioscience, MicroBrightfield, Inc., Colchester, VT, USA) e empregado o protocolo de fracionador óptico, que se baseia nos princípios de dissector e fracionador óptico (GUNDERSEN et al., 1988). Para essa análise, foi selecionada uma série de cortes (1 em cada 5 cortes seriados = intervalo de secção) destinados ao protocolo de imuno-histoquímica do MCH em cada caso experimental. As estimativas foram realizadas bilateralmente (Apêndice D). Em cada secção, sobre as imagens transmitidas ao programa por uma câmera de vídeo acoplada ao microscópio óptico, os limites da LHA esquerda e direita foram delineados a partir do centro do fórnix (Figura 6), seguindo ventrolateralmente em direção a superfície ventral do hipotálamo até a capsula interna, que foi contornada até a altura do núcleo subtalâmico para então dirigir-se horizontalmente em direção medial, para encontrar com a linha reta que une o trato mamilotalâmico ao fórnix (PANKSEPP, 1979; KESSLER et al., 2011). Os neurônios MCH-ir foram selecionados a partir de uma janela de contagem quadrada (70 µm de lado = fração de área, Figura 7), constituída por duas linhas de inclusão (verdes) e três linhas de exclusão (vermelhas). A espessura média de cada secção foi determinada a partir de vários pontos de observação com objetiva de imersão a óleo e aumento de 100x (NA=1,45), selecionando o topo e base do tecido. Para os cálculos estereológicos, foram determinadas como zonas de segurança no eixo Z (fração de dissecção) no mínimo 2µm superiores e inferiores de cada secção, assim o dissector foi fixado no centro do tecido com altura de 5µm, evitando qualquer viés gerado pela compressão do tecido após os protocolos de imuno-histoquímica e coloração de Nissl. Somente foram contados os neurônios que estavam em foco, entre as zonas de segurança, e que não tocassem as linhas de exclusão da janela de contagem (Figura 7). A precisão das estimativas da contagem neuronal, em cada série de cortes (caso experimental), foi avaliada usando como parâmetro o coeficiente de erro de Gundersen (m=1) (GUNDERSEN e JENSEN, 1987; SLOMIANKA e WEST, 2005). A amostragem foi considerada apropriada com coeficiente de erro menor que 0,10 (WEST e GUNDERSEN, 1990; LIM et al., 2014). A área e o volume da LHA foram estimados pelo método de planimetria a partir da delimitação da área de interesse e aplicação do método de Cavalieri. A área total da LHA é o resultado da soma das áreas da LHA em cada corte em que ela se apresenta. Os resultados, descritos em média e desvio- Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................24 padrão, foram comparados e analisados estatisticamente quanto à sua significância através de ANOVA (p<0,05), com pós-teste de Tukey. Figura 6: Imagem da janela de observação tecidual do programa Stereo Investigator, obtida em tempo real através de câmera digital acoplada ao microscópio óptico. A LHA foi delimitada utilizando referências citoarquitetônicas: cápsula interna (ic), fórnice (f) e trato mamilotalâmico (mt). Figura 7: Esquema de uma janela de contagem do programa Stereo Investigator. Linhas de inclusão (verdes) e linhas de exclusão (vermelhas). Os círculos tracejados em azul representam corpos celulares de neurônios que seriam contados durante a análise estereológica e os círculos tracejados em amarelo representam corpos de neurônios que seriam excluídos durante a contagem. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................25 Mapeamento e reconstrução tridimensional dos neurônios MCH-ir Os neurônios MCH-ir do hipotálamo de um caso de cada grupo experimental foram representados em figuras esquemáticas, em duas dimensões, e em modelos tridimensionais, com ênfase nos neurônios MCH-ir dentro e fora da LHA, para estabelecer uma relação entre os diferentes grupamentos MCH-ir do hipotálamo durante o processo de envelhecimento. A reconstrução tridimensional foi realizada com auxílio do sistema Neurolucida (versão 10, MBF Bioscience, MicroBrightfield, Inc.) com a finalidade de facilitar a compreensão da distribuição dos neurônios MCH-ir, pois, dessa forma, é possível obter uma visualização integrada nos 3 planos do espaço. O sistema é composto por um programa de computador conectado a um microscópio óptico motorizado, equipado com câmera de vídeo. Para esse protocolo, utilizamos, em cada caso experimental, uma série de cortes submetida à imuno-histoquímica para MCH e contra-corada pelo método de Nissl. As etapas para realização dos modelos 3D incluíram a calibração do programa inserindo informações sobre o intervalo de avaliação e número de secções utilizadas na reconstrução, definição dos contornos que limitam as estruturas de referência citoarquitetônica, identificação dos neurônios MCH-ir pertencentes à LHA e a outras regiões adjacentes em cada secção, e alinhamento individual de cada nova secção com respeito a sua antecessora imediata. Em cada secção foram delineados: o contorno externo do encéfalo na região do hipotálamo de ambos antímeros; a marca de lateralidade realizada pela passagem de uma agulha gengival 31G no bloco de tecido antes da microtomia; o sistema ventricular representado pelo aqueduto cerebral e III ventrículo, com seus recessos; os tratos ópticos e núcleos importantes do hipotálamo medial (núcleos ventromedial, dorsomedial e paraventricular do hipotálamo de ambos lados); e as referências citoarquiteônicas que limitam a área hipotalâmica lateral como o fórnice, o trato mamilotalâmico e a cápsula interna. Além desses contornos, também foi delineado o limite da LHA segundo os mesmos critérios utilizados nas análises de densitometria óptica e estereologia. Imagens dos contornos, marcadores e do modelo tridimensional foram capturadas para confecção de pranchas e o modelo também foi representado em forma de PDF interativo 3D (vide instruções no Apêndice F). A partir dos modelos tridimensionais reconstruídos, foram obtidos de cada animal dados quantitativos a respeito da quantidade e da distância entre os neurônios MCH-ir dentro da LHA (MCH- LHA) e dos neurônios MCH-ir que estão em grupamentos adjacentes (MCH-OUT), demonstrando o nível de compactação dessas células na região de interesse e fora dela. Densitometria óptica As séries de cortes submetidas ao protocolo de hibridização in situ foram analisadas através da quantificação relativa do RNAm para o ppMCH por meio das medidas de densidade óptica média e integrada dos grãos de prata da emulsão fotográfica, precipitados pela radioatividade da sonda marcada com radioisótopo 35S. Além dessas duas medidas semi-quantitativas, foi também analisada a área marcada por esses grãos, visto que a unidade de densidade óptica integrada (DOI) é o produto entre a densidade óptica média e área marcada. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................26 Primeiramente, o microscópio óptico (Axioplan2, Carl Zeiss), equipado com câmera digital (axioCam HRc, Zeiss), foi ajustado para obter a condição ótima de iluminação com a objetiva de aumento de 10X (NA=0,25), utilizada para captura de todas as imagens. Nesse momento, centralizou-se o feixe de luz no CCD da câmera digital e fixou-se a intensidade de iluminação observando-se o histograma de brilho RGB da imagem, a fim de distribuí-lo ao longo do espectro dinâmico da câmera digital. Todos os parâmetros de iluminação do campo, abertura dos diafragmas, jogos de filtros e tempo de exposição da câmera foram controlados manualmente para evitar que houvesse variação desses parâmetros em uma mesma sessão de captura de imagens. Em cada sessão de captura, inicialmente foram adquiridas 11 imagens de referência para calibração de densidade óptica, representativas de densidades entre 0,04 e 1,0 (Figura 8), a partir de um filtro escalonado de densidade óptica neutra (Edmund Industrial Optics, #32-599). A seguir, foram capturadas imagens de todos os campos de observação da LHA, nos dois antímeros, em todas as secções de uma série de cortes (Apêndice E). Figura 8: Representação do filtro de densidade óptica neutra utilizado para captura de imagens de referência para calibração de densidade óptica no programa ImageJ. Em A, filtro de densidade óptica. Em B, imagem representativa do escalonamento de densidades ópticas do filtro. Os valores indicam a densidade óptica de cada faixa do filtro. Utilizando o programa PhotoShop® CS2 (version 9.0; Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA, USA), as imagens da LHA capturadas ao microscópio foram unidas, como um mosaico, para a confecção de imagens panorâmicas de toda a LHA bilateralmente. Em cada lado, a LHA foi delimitada utilizando os mesmos critérios citoarquitetônicos descritos anteriormente (Figura 6), recortada e colada em nova figura com fundo branco contendo somente as LHA de ambos lados. Nessa etapa, eventualmente, foram removidos pequenos artefatos sobre o tecido que pudessem ser confundidos com o sinal da hidridização. O programa ImageJ (version 1.47, ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012) foi utilizado para realizar a quantificação comparativa da densidade óptica das secções do tecido entre os diversos grupos experimentais, o que reflete a quantidade do RNAm do ppMCH. Para análise de cada conjunto de imagens capturadas em uma mesma sessão, inicialmente foi realizada a calibração da densidade óptica utilizando as imagens de referência com escala crescente de níveis de cinza. Os resultados, descritos em média e desvio-padrão, foram comparados e analisados estatisticamente quanto à sua significância através de ANOVA (p<0,05), com pós-teste de Tukey, após comprovada a normalidade e homocedasticidade A B 0,04 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................27 dos dados. E os resultados ,descritos em mediana e máximo, foram comparados através do teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn para dados não paramétricos (p<0,05). Apresentação das ilustrações científicas Toda a iconografia científica foi digitalizada. As imagens foram trabalhadas com o programa PhotoShop® CS2 (version 9.0; Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA, USA), ajustando o brilho, contraste e balanço de cores de acordo com o preconizado (SAPER, 1999; SCHENK et al., 1999) para preparação de imagens digitais para publicação científica e organizadas em figuras com o programa CorelDRAW® graphics suite X3 (Corel Corporation, Ottawa, Canada). As barras de calibração das fotomicrografias foram confeccionadas fotografando uma lâmina com escala micrométrica calibrada (Leica, Leitz Wetzlar), cuja menor divisão é de 100µm, com os mesmos equipamentos e aumentos do material histológico em questão. A nomenclatura e as abreviaturas utilizadas na descrição dos resultados foram baseadas no atlas estereotáxico do encéfalo do rato (PAXINOS e WATSON, 2005). RESULTADOS Estudo citoarquitetônico do hipotálamo e da LHA Finalizada a padronização da imuno-histoquímica para o MCH como descrito na seção de Materiais e Métodos, os cortes histológicos foram submetidos ao método de coloração de Nissl, para estudo citoarquitetônico do hipotálamo, identificando suas 04 regiões no sentido rostro-caudal (pré- óptica, anterior, tuberal e mamilar) e delimitação de seus principais núcleos (Figura 9). Além disso, foi realizado estudo citoarquitetônico da LHA identificando seus limites e sua divisão em 03 regiões no sentido ântero-posterior: anterior, tuberal e mamilar. As referências citoarquitetônicas observadas que permitiram essa divisão da LHA foram os núcleos bem evidentes do hipotálamo tuberal: núcleo dorsomedial, núcleo ventromedial e núcleo arqueado. Posteriormente a esses núcleos, na parte mamilar do hipotálamo, foi evidente o complexo mamilar. Anteriormente àqueles núcleos, no hipotálamo anterior, é evidente o núcleo paraventricular. Nesse estudo, também observamos a organização e distribuição dos neurônios MCH-ir na LHA (Figura 9). Imuno-histoquímica para MCH Com o objetivo de estudar o número e a distribuição dos MCH-ir na área hipotalâmica lateral, foi realizado o protocolo de imuno-histoquímica para o neuropeptídeo em todos os animais (n=5) de todos os grupos experimentais (14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias). Todos os grupos experimentais apresentaram imunorreatividade para o MCH nas três regiões da área hipotalâmica lateral (Figuras 10, 11 e 12). Assim, essas observações ratificam a necessidade de se realizar a contagem dos neurônios MCH-ir nos diferentes grupos e analisar quantitativamente as possíveis variações nas diferentes faixas etárias, assim como verificar alterações no seu padrão de distribuição por meio de mapeamento e reconstrução tridimensional. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................28 Figura 9: Citoarquitetura do hipotálamo e distribuição dos neurônios MCH-ir nas regiões mamilar (A), tuberal (B), anterior (C) e pré-óptica (D) do hipotálamo do rato. As linhas tracejadas indicam os limites citoarquitetônicos de estruturas representativas de cada região (núcleos e feixes de fibras nervosas). Os somas dos neurônios MCH-ir estão marcados com DAB-níquel, em negro. Em E, F e G, fotomicrografias da LHA delimitada pela linha vermelha nas regiões mamilar, tuberal e anterior respectivamente. Em H, detalhe em maior aumento da área delimitada pelo retângulo em F. A barra de calibração em A é válida para as imagens de B a G. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................29 Figura 10: Fotomicrografias da região mamilar da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todos as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................30 Figura 11: Fotomicrografias da região tuberal da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todas as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................31 Figura 12: Fotomicrografias da região anterior da LHA após imuno-histoquímica para MCH em animais de 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todas as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................32 Estudo estereológico dos neurônios MCH-ir da área hipotalâmica lateral Todos os grupos experimentais foram analisados para a estimativa do número de neurônios MCH-ir na LHA bilateralmente, com 5 animais em cada grupo (exceto o grupo de 750 dias, n=4). Em cada animal, foi empregado o protocolo delineado para a análise estereológica. Em todas as estimativas o coeficiente de erro de Gundersen (m=1) esteve entre 0,04 e 0,08. Considerando todos os grupos em conjunto, a LHA possui em média 30.490,51 (±7.208,53) neurônios. O grupo de 14 dias (24.635±5.307) apresentou a menor estimativa de número de neurônios MCH-ir na LHA em média e o grupo de 28 dias (37.934±5.573) apresentou a maior estimativa, com diferença estatisticamente significativa entre estes grupos. Os demais grupos experimentais não apresentaram diferença significativa quanto ao número total de neurônios MCH-ir na LHA (Figura 13 e Apêndice G1), embora o número de neurônios apresente pequena variação entre os grupos de 50 (29.730±6.093), 90 (33.947±5.217), 210 (28.697±5.856), 540 dias (33.612±4.419) e 750 dias (27.891±6.888). Figura 13: Média do número de neurônios MCH-ir na LHA total estimados por método estereológico, para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. As barras de erro indicam o desvio-padrão (*= p<0,05). Também foram comparados através da estereologia, os valores da área e do volume da LHA total para todos os grupos. Considerando todos os grupos em conjunto, a LHA possui a área de 27.089.245,71µm2 (±5.414.154,46) e o volume de 4.063.387.142,86µm3 (±812.122.131,58). O grupo de 14 dias apresentou a menor média de área e volume da LHA entre todos os grupos, com diferenças estatisticamente significativas com os grupos de 28, 50, 90, 210 e 540 dias. No entanto, com o grupo de 750 dias não houve diferença significativa (Figuras 14 e 15 e Apêndices G2 e G3). A estimativa do número de neurônios e do volume da LHA permitiu calcular a densidade neuronal da LHA. Considerando todos os grupos em conjunto, a LHA possui em média 7.607,51 (±1.735,66) neurônios/mm3. Embora a média de densidade neuronal varie entre 9.025,28 neurônios/mm3 para o grupo de 28 dias e 6.300,67 neurônios/mm3 para o grupo de 210 dias, não houve diferença estatisticamente significantiva entre os grupos experimentais (Figura 16 e Apêndice G4). Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................33 Figura 14: Média da área LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. As barras de erro indicam o desvio-padrão (*= p<0,05, **=p<0,01). Figura 15: Média do volume da LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. As barras de erro indicam o desvio-padrão (*= p<0,05, **=p<0,01). Figura 16:Média de densidade neuronal (neurônios/mm³) da LHA para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. As barras de erro indicam o desvio-padrão . Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................34 Reconstrução tridimensional da área hipotalâmica lateral Para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir foi realizada a reconstrução tridimensional da LHA (Figuras 17 e 18) e o mapeamento (Figuras 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25) em todos os grupos experimentais. Para a comparação entre os grupos, foram reconstruídas partes equivalentes do hipotálamo em todos os casos, a partir de secções de um animal de cada grupo, de forma que o início e o fim de cada modelo 3D estivessem em níveis interaurais semelhantes, de acordo com a observação da citoarquitetura da região de interesse. O padrão de distribuição dos neurônios MCH-ir não mostrou diferenças qualitativas na LHA e em regiões adjacentes entre os grupos. Os neurônios MCH-ir no hipotálamo encontraram-se em igual proporção dentro e fora da LHA como um todo (Tabela 1). A distância média entre as células MCH-ir na LHA foi de 37,87µm (±2,94) (grupo 14: 38,1µm; grupo 28: 33,1 µm; grupo 50: 36,7µm; grupo 90: 36,5µm; grupo 210: 39,9 µm; grupo 540: 42,5 µm; grupo 750: 38,3µm), sendo menor do que a distância média entre as células MCH-ir fora da LHA que foi de 49,54µm (±3,88) (grupo 14: 47,5µm; grupo 28: 46,6; grupo 50: 49,4µm; grupo 90: 48,7µm; grupo 210:55,4µm; grupo 540:54,2 µm; grupo 750: 45,0µm) indicando maior compactação das células MCH-érgicas dentro da LHA com pouca variação entre os grupos analisados (Figura 26). Dentro da LHA, a distribuição neuronal é heterogênea, com grande quantidade de neurônios MCH-ir localizados nas regiões perifornicial, magnocelular e dorsal da LHA, deixando a região central da LHA com menor quantidade de neurônios. O aparecimento dos neurônios MCH-ir ao longo da extensão rostro-caudal da LHA iniciou-se nas secções mais rostrais do hipotálamo mamilar e seguiu até os cortes mais caudais do núcleo paraventricular do hipotálamo. Observou-se a presença de neurônios MCH-ir em todas as regiões da LHA (MCH-LHA) e regiões adjacentes (MCH-OUT) com padrão de distribuição semelhante entre todos os grupos. A região tuberal sempre apresentou o maior número de neurônios MCH-ir, localizados dentro da LHA (Tabela 1), seguida das regiões anterior e mamilar onde a maior quantidade de neurônios MCH-ir está fora da LHA. Distribuição percentual do número de neurônios MCH-ir Grupos MCH – LHA MCH – OUT Total LHAm LHAt LHAa Total LHAm LHAt LHAa 14 dias 51,05 0,67 38,28 12,11 48,95 1,16 29,93 17,86 28 dias 48,34 3,07 40,01 5,26 51,66 10,89 21,22 19,54 50 dias 49,79 4,19 45,34 0,27 50,21 7,04 36,05 7,12 90 dias 52,78 3,33 44,56 4,89 47,22 9,49 24,41 13,32 210 dias 53,99 1,60 51,16 1,23 46,01 6,02 31,94 8,05 540 dias 52,17 6,48 43,65 2,04 47,83 8,45 24,76 14,62 750 dias 45,25 0,95 43,08 1,22 54,75 2,31 37,38 15,06 Tabela1: Distribuição percentual do número de neurônios MCH-ir identificados na reconstrução tridimensional da LHA total e nas regiões mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e anterior (LHAa) para os grupos de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. Foram identificadas as células MCH-ir pertencentes à LHA (MCH-LHA) e as que estão em regiões adjacentes (MCH-OUT). Todos os grupos apresentaram maior número de células dentro da LHA na região tuberal e maior número de células fora da LHA nas regiões mamilar e anterior. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................35 Figura 17: Reconstrução tridimensional do hipotálamo para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir: grupos de 14, 28 e 50 dias. Em A, visão panorâmica com referências citoarquitetônicas e as células MCH-ir representadas pelas esferas amarelas (fora da LHA) e vermelhas (dentro da LHA). Em B e C, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 14 dias. Em D e E, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 28 dias. Em F e G, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 50 dias. 1, cápsula interna; 2, trato óptico; 3, III ventrículo; 4, LHA; 5, trato mamilotalâmico; 6, superfície do encéfalo; 7, fórnix. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................36 Figura 18: Reconstrução tridimensional do hipotálamo para estudo da distribuição dos neurônios MCH-ir: grupos de 90, 210, 540 e 750 dias. As células MCH-ir estão representadas pelas esferas amarelas (fora da LHA) e vermelhas (dentro da LHA). Em A e B, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 90 dias. Em C e D, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 210 dias. Em E e F, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 540 dias. Em G e H, detalhe frontal e lateral da LHA no grupo de 750 dias. 1, cápsula interna; 2, trato óptico; 3, III ventrículo; 4, LHA; 5, trato mamilotalâmico; 6, superfície do encéfalo; 7, fórnix. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................37 Figura 19: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 14 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (G). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH- ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................38 Figura 20: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 28 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (I). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH- ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................39 Figura 21: : Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 50 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (I). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH- ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................40 Figura 22: Esquemas de mapeamento dos neurônios MCH-ir em animal de 90 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (J). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH- ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................41 Figura 23: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 210 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (I). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH-ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................42 Figura 24: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 540 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (I). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH-ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................43 Figura 25: Esquemas de mapeamento dos neurônios imunorreativos ao MCH em animal de 750 dias. Os esquemas representam secções coronais do hipotálamo orientados de caudal (A) para rostral (J). O intervalo entre as secções é de 300µm. A barra de calibração e as setas de orientação em A são válidas para todos os esquemas. Para as abreviaturas, consultar lista de abreviaturas. Símbolos: = neurônios MCH-ir da LHA;= neurônios MCH-ir de regiões adjacentes. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................44 Figura 26: Distância média (µm) entre as células MCH-ir da LHA total e das regiões adjacentes a ela para os grupos de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias. Os neurônios MCH-ir da LHA apresentaram menor distância média, demonstrando maior compactação quando comparados aos neurônios MCH-ir fora da LHA. Hibridização in situ O protocolo de hibridização in situ para o RNAm do ppMCH foi testado em um animal adulto de 90 dias e sua eficácia pôde ser comprovada (Figura 27). Foi realizado protocolo de hibridização in situ para ppMCH em uma série de cortes de cada animal dos grupos experimentais. Em todos os grupos etários, foi observada a deposição de grãos de prata reduzida nas mesmas regiões da área hipotalâmica lateral onde se obtém a identificação de somas MCH-ir (Figuras 28, 29 e 30). Figura 27: Hibridização in situ para RNAm do ppMCH nas regiões da área hipotalâmica lateral: mamilar (A), tuberal (B), anterior (C). Em D, detalhe em maior aumento da área delimitada pelo retângulo em B, destacando a marcação pelos grãos de prata nos neurônios da região tuberal. A barra de calibração em A é válida para as imagens B e C. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................45 Figura 28: Hibridização in situ para o ppMCH na região mamilar da LHA. Fotomicrografias representativas dos grupos etários 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todas as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................46 Figura 29: Hibridização in situ para o ppMCH na região tuberal da LHA. Fotomicrografias representativas dos grupos etários 14 (A), 28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todas as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................47 Figura 30: Hibridização in situ para o ppMCH na região anterior da LHA. Fotomicrografias representativas dos grupos etários 14 (A),28 (B), 50 (C), 90 (D), 210 (E), 540 (F) e 750 (G) dias. A barra de calibração em A é válida para todas as imagens. Para as abreviaturas, consultar a lista de abreviaturas. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................48 Densitometria óptica Após a realização do protocolo de hibridização in situ para o ppMCH, foi executada a análise da quantidade relativa de RNAm para o ppMCH na LHA dos animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5). Foram mensuradas a densidade óptica integrada, a área marcada e sua densidade óptica média. A densidade óptica integrada é o produto entre a densidade óptica média dos grãos de prata precipitados e a área marcada por eles. A densidade óptica média permite analisar o valor relativo à densidade dos grãos de prata precipitados no tecido que é proporcional à quantidade de RNAm para o ppMCH, e a área marcada é proporcional a quantidade de tecido hibridizado que expressa o RNAm. Figura 31: Média da densidade óptica integrada (DOI) na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). As barras de erro indicam o desvio-padrão (*= p<0,05, ** = p<0,01, ***= p<0,001. Os animais de 28, 540 e 750 dias apresentaram valores de DOI significativamente menores na LHA como um todo (Figura 31 e Apêndice G5) quando comparado com os grupos de 90 dias. Além disso, o grupo de 750 dias também apresentou diminuição significativa de DOI quando comparado com os animais de 14 e 50 dias de idade. Quanto à densidade óptica média, o grupo de 28 dias apresentou valores significantivamente menores do que os grupos de 14, 50, 90 e 210 dias, indicando aumento quantidade relativa de RNAm para o ppMCH na LHA total nos grupos púbere e adultos (Figura 32 e Apêndice G6) em relação ao grupo pré-púbere. Já os grupos de 540 e 750 dias apresentaram diminuição significativa de densidade óptica média comparados aos grupos de 50 e 90 dias (Figura 32), resultando assim, em uma diminuição da quantidade relativa de RNAm para ppMCH na LHA com o envelhecimento. Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................49 Figura 32: Média da densidade óptica média dos grãos de prata precipitados na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). As barras de erro indicam o desvio-padrão (** = p<0,01, ***= p<0,001) Com relação a área de tecido hibridizado na LHA total, os animais de 750 dias apresentaram diminuição significativa quando comparados aos animais de 14, 50 e 90 dias (Figura 33 e Apêndice G7). Além disso, embora sem significância estatística, os valores de média de área seguem uma relação de grandeza entre os grupos semelhante a descrita para a densidade óptica média, sendo mais acentuada a diminuição aos 750 dias (Figura 33). Analisando a LHA dividida em suas regiões, mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e anterior (LHAa), observou-se que os maiores valores de DOI encontram-se na LHAt, onde o comportamento da DOI foi semelhante ao que ocorreu para a LHA como um todo. Nessa região, os animais de 750 e 540 dias apresentaram diminuição de densidade óptica integrada na quando comparados aos animais de 50 e 90 dias (Figura 34 e Apêndices G8, G9 e G10) . Além disso, o grupo de 750 dias também apresenta diminuição de DOI quando comparado com os animais de 14 dias de idade e o grupo de 28 dias apresentou valores de DOI significativamente menores quando comparado com o grupo de 90 dias. Na região LHAa, o grupo de 750 dias apresentou diminuição de DOI comparado aos grupos de 50 e 90 dias. Na LHAm, não houve diferenças estatísticamente significantes na DOI entre os grupos (Figura 34 e Apêndice G8 e G10). Alterações na expressão do MCH na LHA durante desenvolvimento pós-natal e envelhecimento............................................50 Figura 33: Média da área marcada na LHA total para os animais de 14, 28, 50, 90, 210, 540 e 750 dias (n=5 por grupo). As barras de erro indicam o desvio-padrão. Figura 34: Média da densidade óptica integrada (DOI) nas regiões mamilar (LHAm), tuberal (LHAt) e e mediana da DOI na LHA anterior (LHAa) para os animais de 14, 28, 50, 90, 21