PRÉ-TRATAMENTO E HIDRÓLISE DA CASCA DE UVA PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES FERMENTESCÍVEIS DÉBORA CRISTINA MORAES NIZ DA SILVA São José do Rio Preto – SP Fevereiro - 2016 PRÉ-TRATAMENTO E HIDRÓLISE DA CASCA DE UVA PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES FERMENTESCÍVEIS DÉBORA CRISTINA MORAES NIZ DA SILVA Orientador: Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi Co-orientadora: Profª Drª Claudia Dorta São José do Rio Preto – SP Fevereiro - 2016 Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos. PRÉ-TRATAMENTO E HIDRÓLISE DA CASCA DE UVA PARA LIBERAÇÃO DE AÇÚCARES FERMENTESCÍVEIS DÉBORA CRISTINA MORAES NIZ DA SILVA BANCA EXAMINADORA Prof Dr Vanildo Luiz Del Bianchi UNESP- São José do Rio Preto Orientador Profª Drª Ellen Silva Lago Vanzela UNESP- São José do Rio Preto Prof Dr Crispin Humberto Garcia-Cruz UNESP- São José do Rio Preto Drª Gisele Ferreira Bueno UFRJ – Rio de Janeiro Prof Dr Elias de Souza Monteiro Filho UNESP - Araraquara São José do Rio Preto, 26 de fevereiro de 2016 Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto, como pré-requisito para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos. Dedico, A minha mãe Mary pelo exemplo de vida, às minhas irmãs Elaine e Paula por todo carinho e apoio, aos meus sobrinhos Camila e Luís Marcelo que eu tanto amo e ao meu esposo Rafael que incondicionalmente apoiou todos os dias dessa jornada. AMO VOCÊS! Agradecimentos Primeiramente agradeço a Deus, que me sustentou até aqui e a Nossa Senhora que sempre me socorreu nos momentos de fraqueza. Agradeço a minha mãe Mary, minhas irmãs Elaine e Paula, meus sobrinhos Camila e Luís Marcelo que são a raiz da minha existência, eu não conseguiria sem vocês. Ao meu esposo Rafael, o amor da minha vida que em momento algum me desamparou, ao contrário, jamais permitiu que eu desistisse e me acompanhou durante todo o percurso, você é parte essencial de tudo isso! Ao Prof Dr Vanildo Luiz Del Bianchi, obrigada por todos os ensinamentos, todo apoio, se eu for um terço do professor que você é, estarei realizada. A Profª Drª Claudia Dorta, pela co-orientação neste trabalho, mais além, pela amizade de todos os dias, você é um exemplo para mim. Aos meus sogros Fátima e Francisco e cunhados Renato, Taciano e Marcelo que torceram por mim. À minha família, tios e primos, todos muito importantes e parte formadora da minha essência. Às minhas amigas e companheiras Samara Murari, Elke Shiguematsu, Leticia Nagai, Marina Moro o caminho teria sido bem mais difícil sem vocês, obrigada por tudo. Às minhas companheiras de trabalho com quem cada dia eu aprendi um pouco Juliana Gianonni, Marie Oshiwa, Alice Tanaka, Silvana Favoni. Às minhas IC, dois presentes que recebi para trabalharem comigo Gabriela Bueno e Sulviene Vendrúsculo, muito obrigada. A minha aluna de iniciação científica Karin Nunes do IBILCE e tantos outros orientados na graduação de Tecnologia em Alimentos da Fatec/Marília, foi um prazer trabalhar com vocês. Aos meus colegas de laboratório por toda a experiência compartilhada no dia a dia, Ariane, Maurício, Mariana, Arturo, Guilherme, Raphael, Jéssica, João. Aos membros da banca professores Ellen, Crispin, Elias e Drª Gisele muito obrigada por todas as considerações e sugestões que contribuíram para melhorar a qualidade deste trabalho. Ao professor Crispin por fornecer o CG para as análises de etanol das amostras. Ao professor Mauricio Boscolo por fornecer o aparelho de ultrassom para as análises. A vinícola Góes de São Roque por fornecer a matéria-prima para este trabalho. A Fundação André Tosello – Coleção Tropical de Culturas que gentilmente cedeu os micro-organismos estudados neste trabalho. Ao programa de Engenharia e Ciência de Alimentos da UNESP/IBILCE pela oportunidade. A CAPES pela bolsa oferecida durante a realização de parte deste trabalho. Muito obrigada! RESUMO O Brasil tem recebido grande destaque no meio econômico por conta da alta produção do setor agroindustrial, como consequência torna-se um dos maiores produtores de resíduos. A reutilização destes compostos é importante para melhorar sua disposição no meio ambiente contribuindo para a redução da poluição ambiental, além disso, é uma forma de agregar valor aos subprodutos. A indústria vinícola tem grande interesse nestas tecnologias de reutilização, já que seus principais resíduos (casca e semente de uva) são de lenta decomposição prejudicando o meio ambiente. A casca da uva pode ser hidrolisada através do emprego de ácidos ou enzimas disponibilizando açúcares fermentescíveis, que podem ser transformados em uma série de bioprodutos. Este trabalho buscou estabelecer o melhor método de pré-tratamento e hidrólise, da casca de uva para disponibilizar os açúcares que podem ser fermentados pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis e Pachysolen tannophilus. Para tanto foi realizado o pré-tratamento químico ácido ou alcalino junto ao pré-tratamento físico em autoclave, micro-ondas ou ultrassom na casca da uva Cabernet Sauvignon. Em etapa posterior, para seleção da melhor condição de pré-tratamento e hidrólise foi aplicado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Também foi analisada a capacidade de consumo de açúcares do mosto hidrolisado de casca de uva pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis e Pachysolen tannophilus. A concentração dos açúcares foi medida através dos métodos de ADNS, xilose e glicose. Levando em consideração que ainda não existem na literatura muitos trabalhos envolvendo a casca de uva, com base nos resultados deste estudo o pré-tratamento alcalino em micro-ondas com 0,72% de NaOH por 13,5 minutos e a hidrólise ácida com 2,6% de H2SO4 por 13,5 minutos em autoclave foram os melhores métodos para a liberação de açúcares fermentescíveis com 10 g L -1 de açúcares redutores, 3,3 g L -1 de glicose e 6,7 g L -1 de xilose. Com relação ao consumo de açúcar pelas leveduras em mosto do hidrolisado de casca de uva as leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae consumiram 100% da glicose disponível em 78% da xilose, com conversão de substrato a célula de Yx/s 0,72 g g -1 para glicose yx/s 0,23 g g -1 para xilose. A associação de leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae mostraram potencial para a fermentação de mostos com glicose e xilose, podendo ser empregadas simultaneamente neste tipo de processo. Palavras-chave: Pré-tratamentos. Hidrólise. Casca de uva. Açúcares fermentescíveis. ABSTRACT Brazil has been highlighted on the economic environment due to the high production of its agroindustrial sector; as a result, it becomes one of the major residue producers. The reutilization of these compounds is relevant to improve the environment disposal, contributing towards for the environmental pollution reduction. Moreover, it is a way of adding value for the by-products.The wine industry has a great interest on reutilization techniques, once its main residues (grape seeds and skin) has a slow decomposition, which damages the environment. The grape skin can be hydrolyzed with acids or enzymes, making available fermentable sugars that can be transformed in a number of byproducts. This work sought to establish the best pre-treatment and hydrolysis method for the grape skin to provide the sugars that can be fermented for the Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis and Pachysolen tannophilus yeasts. For this purpose, it was applied the acid or alkaline chemical pre-treatment along with the physic pre-treatment in autoclave, microwave or ultrasound on the Cabernet Sauvignon grape skin. Afterwards, for the pre-treatment and hydrolysis best condition selection, it was applied the Rotatable Central Composite Design (RCCD). It was also analyzed the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis and Pachysolen tannophilus consumption capacity of the grape skin hydrolysed must sugars. The sugars concentration was measured through the ADNS methods, xylose and glucose. Taking into account the lack of grape skin works on the literature, based on the results of this work the alkaline pre- treatment on microwave with 0,72% of NaOH for 13,5 minutes and the acid hydrolysis with 2,6% of H2SO4 for 13,5 minutes in autoclave were the best methods for the fermentable sugars release with 10 g L -1 of reducing sugars, 3,3 g L -1 of glucose and 6,7 g L -1 of xylose.With regard to sugar consumption by the yeasts in the must of the grape skin hydrolyzate, the yeasts Pichia stipitis CCT 2617 and Saccharomyces cerevisiae consumed 100%w of the glucose available in 78% of the xylose, with conversion of substrate the cell of Yx/s 0,72 g g -1 for glucose yx/s 0,23 g g -1 for xylose. The yeast association between Pichia stipitis CCT 2617 and Saccharomyces cerevisiae showed potencial for the must fermentation with glucose and xylose, which can be simultaneously apllied in this kind of process. Keywords: Pretreteaments. Hydrolysis. Grape skins. Fermentable sugars. SUMÁRIO 1INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1 2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 3 2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 3 2.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 3 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 4 3.1 A uva: Vitis vinífera L. ................................................................................................ 4 3.2 Estruturas lignocelulósicas ......................................................................................... 4 3.2.1 Celulose ............................................................................................................... 5 3.2.2 Hemicelulose....................................................................................................... 6 3.2.3 Lignina ................................................................................................................ 7 3.3 Pré-tratamentos ........................................................................................................... 8 3.3.1 Pré-tratamento químico...........................................................................10 3.3.1.1 Pré-tratamento com ácidos diluídos ................................................................ 10 3.3.1.2 Pré-tratamento alcalino ................................................................................... 11 3.3.2 Pré-tratamento físico ........................................................................................ 11 3.3.2.1 Micro-ondas ..................................................................................................... 12 3.3.2.2 Autoclave .......................................................................................................... 13 3.3.2.3 Ultrassom ......................................................................................................... 13 3.4 Hidrólise ácida ........................................................................................................... 13 3.4.1 Compostos tóxicos derivados da hidrólise ácida ............................................. 15 3.5 Fermentação dos açúcares derivados da hidrólise ................................................. 16 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 18 4.1 Parte 1 – Obtenção de açúcares fermentescíveis da casca de uva Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc e bagaço de cana-de-açúcar após pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida aplicando o planejamento fatorial 2 2 .................................. 18 4.1.1 Coleta do material ............................................................................................. 18 4.1.2 Preparo do material .......................................................................................... 18 4.1.3 Pré-hidrólise alcalina ....................................................................................... 18 4.1.4 Hidrólise ácida .................................................................................................. 19 4.2 Parte 2 – Pré-tratamento ácido ou alcalino em autoclave e hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon ............................................................................ 21 4.2.1 Matéria-prima e reagentes ............................................................................... 22 4.2.2 Pré-tratamento ácido ou alcalino .................................................................... 22 4.1.3 Hidrólise ácida .................................................................................................. 22 4.3 Parte 3 Avaliação dos pré-tratamentos físicos em autoclave, micro-ondas ou ultrassom com pré-tratamentos ácidos ou alcalinos e hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon ........................................... 23 4.3.1 Coleta e preparo do material ............................................................................ 24 4.3.2 Pré-tratamentos ................................................................................................ 24 4.3.2.1 Autoclave ............................................................................................ 24 4.3.2.2 Micro-ondas ..................................................................................................... 24 4.3.2.3 Ultrassom ......................................................................................................... 25 4.3.3 Hidrólise ácida .................................................................................................. 26 4.4 Parte 4 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para pré- tratamento alcalino em micro-ondas. ............................................................................ 26 4.4.1 Coleta e preparo do material ............................................................................ 26 4.4.2 Delineamento experimental ............................................................................. 26 4.4.3 Hidrólise ácida .................................................................................................. 27 4.5 Parte 5 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para hidrólise ácida em autoclave ........................................................................... 27 4.5.1 Coleta e preparo do material ............................................................................ 27 4.5.2 Delineamento experimental ............................................................................. 28 4.6 Parte 6 – Fermentação de mostos sintéticos contendo glicose e xilose.................. 29 4.6.1 Manutenção da Cultura Estoque ..................................................................... 29 4.6.2 Padronização do Inóculo ................................................................................. 29 4.6.3 Fermentação ..................................................................................................... 30 4.7 Parte 7 – Pré-tratamento e hidrólise da casca de uva e fermentação do hidrolisado ..................................................................................... 30 4.7.1 Pré-tratamento e hidrólise da casca de uva .................................................... 30 4.7.2 Remoção dos compostos tóxicos e concentração do mosto ............................. 30 4.7.3 Fermentação do hidrolisado ............................................................................ 31 4.8 Métodos analíticos ..................................................................................................... 31 4.8.1 Concentração de açúcar redutor...................................................................... 31 4.8.2 Concentração de Xilose .................................................................................... 31 4.8.3 Concentração de Glicose .................................................................................. 32 4.8.4 Determinação da relação entre massa celular seca e densidade óptica a 600 nm. ....................................................................................................................... 33 4.8.5 Medida de Crescimento .................................................................................... 33 4.8.6 Determinação dos parâmetros de hidrólise ..................................................... 34 4.8.7 Etanol ................................................................................................................ 34 4.8.7.1 Cálculos relacionados à produção etanólica ................................................... 34 4.9 Análise estatística ...................................................................................................... 35 4.9.1 Forma de análise dos resultados – Parte 1, 2, 3 .............................................. 35 4.9.2 Forma de análise dos resultados- Planejamento DCCR – Parte 1, 4 e 5 ....... 35 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 37 5.1 Parte 1 – Açúcares fermentescíveis obtidos da casca de uva Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc e bagaço de cana após pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida .................................................................................................................. 37 5.2 Parte 2 – Açúcares obtidos de pré-tratamentos ácidos ou alcalinos em autoclave e hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon............................... 49 5.2.1 Pré-tratamento ácido e hidrólise ácida ............................................................ 49 5.2.2 Pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida ....................................................... 53 5.3 Parte 3 Pré-tratamento da casca de uva utilizando como pré-tratamentos físicos autoclave, micro-ondas ou ultrassom ................................................................. 56 5.3.1 Açúcares após pré-tratamento alcalino ou ácido em autoclave associado à hidrólise ácida ........................................................................................ 56 5.3.2 Açúcares após pré-tratamento alcalino ou ácido em micro-ondas associado à hidrólise ácida ........................................................................................ 59 5.3.3 Análise de açúcares após pré-tratamento alcalino ou ácido em ultrassom mais hidrólise ácida .................................................................................. 62 5.4 Parte 4 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para pré- tratamento alcalino em micro-ondas. ............................................................................ 65 5.4.1. Variável resposta Açúcares Redutores (AR) (Parte 4) ................................... 65 5.4.2 Variável resposta glicose (Parte 4)................................................................... 66 5.4.3 Variável resposta xilose (Parte 4) .................................................................... 67 5.5 Parte 5 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para hidrólise ácida em autoclave ........................................................................................... 70 5.5.1 Variável resposta açúcares redutores (AR) (Parte 5) ...................................... 70 5.5.2 Variável resposta glicose (Parte 5)................................................................... 71 5.5.3 Variável resposta xilose (Parte 5) .................................................................... 72 5.6 Parte 6 – Fermentação de mostos sintéticos contendo glicose e xilose.................. 75 5.6.1 Parâmetros cinéticos e fermentativos da levedura Pichia stipitis CCT 2617 ............................................................................................................................ 75 5.6.2 Parâmetros cinéticos e fermentativos do consórcio de leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae ......................................................... 76 5.6.3 Parâmetros cinéticos e fermentativos da levedura Pachysolen tannophilus CCT 1891 .............................................................................................. 78 5.6.4 Parâmetros cinéticos e fermentativos do consórcio de leveduras Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Saccharomyces cerevisiae ............................ 80 5.7 Parte 7 – Parâmetros cinéticos e fermentativos de leveduras em mostos de hidrolisado de casca de uva ............................................................................................ 83 5.7.1 Parâmetros cinéticos e fermentativos da levedura Pichia stipitis CCT 2617 ............................................................................................................................ 83 5.7.2 Parâmetros cinéticos e fermentativos do consórcio de leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae ......................................................... 84 5.7.3 Parâmetros cinéticos e fermentativos da levedura Pachysolen tannophilus CCT 1891 .............................................................................................. 86 5.7.4 Parâmetros cinéticos e fermentativos do consórcio de leveduras Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Saccharomyces cerevisiae ............................ 88 6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 90 7. SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS .............................................................. 90 8. APÊNDICE A ..................................................................................................................... 91 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 95 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição de alguns materiais lignocelulósicos ................................................... 5 Tabela 2 - Métodos de pré-tratamento das biomassas lignocelulósicas .................................... 9 Tabela 3 - Matriz de planejamento fatorial 2² para os testes de pré-hidrólise alcalina ........... 19 Tabela 4- Valores reais e níveis dos fatores aplicados na pré-hidrólise alcalina..................... 19 Tabela 5 - Matriz de planejamento fatorial 2² para os testes de hidrólise ácida ...................... 20 Tabela 6 - Valores reais e níveis dos fatores aplicados na hidrólise ácida .............................. 20 Tabela 7 - Concentração do reagente e tempo de reação nos ensaios utilizando pré- tratamento ácido ou alcalino para hidrólise ácida .................................................................... 22 Tabela 8 - Concentração dos reagentes e tempos de tratamento do experimento 3 ................ 24 Tabela 9 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes (Parte 4) .......................... 26 Tabela 10 - Quadro de ensaios do planejamento composto central rotacional (Parte 4) ......... 27 Tabela 11 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes (Parte 5) ........................ 28 Tabela 12 - Quadro de ensaios do planejamento composto central rotacional (Parte 5) ......... 28 Tabela 13 - Composição do meio de cultivo utilizado para padronização do inóculo das leveduras e meio fermentativo. ................................................................................................. 29 Tabela 14 - Protocolo experimental para análise da concentração de xilose das amostras ..... 32 Tabela 15 - Protocolo experimental para determinação das concentrações de glicose nas amostras .................................................................................................................................... 33 Tabela 16 - Concentração de glicose e xilose da pré-hidrólise alcalina da uva Cabernet Franc e do bagaço de cana-de-açúcar ....................................................................................... 37 Tabela 17 - Concentração de glicose e xilose da pré-hidrólise alcalina da uva Cabernet Sauvignon e do bagaço de cana-de-açúcar ............................................................................... 38 Tabela 18 – Efeitos e interações calculadas para a variável glicose após hidrólise da casca de uva Cabernet Franc .................................................................................................... 39 Tabela 19 - Análise de variância (ANOVA) para a variável glicose após hidrólise da casca de uva Cabernet Franc .................................................................................................... 39 Tabela 20 – Efeitos e interações calculadas para a variável xilose após hidrólise da casca de uva Cabernet Franc .................................................................................................... 40 Tabela 21 – Análise de variância (ANOVA) para a variável xilose após hidrólise da casca de uva Cabernet Franc .................................................................................................... 40 Tabela 22 – Efeitos e interações calculadas para a variável glicose após hidrólise da casca de uva Cabernet Sauvignon ............................................................................................ 41 Tabela 23 – Análise de variância (ANOVA) para a variável glicose após hidrólise da casca de uva Cabernet Sauvignon ............................................................................................ 42 Tabela 24 – Efeitos e interações calculadas para a variável xilose após hidrólise da casca de uva Cabernet Sauvignon ............................................................................................ 43 Tabela 25 – Análise de variância (ANOVA) para a variável xilose após hidrólise da casca de uva Cabernet Sauvignon ............................................................................................ 43 Tabela 26 – Efeitos e interações calculadas para a variável glicose após hidrólise do bagaço de cana .......................................................................................................................... 44 Tabela 27 – Análise de variância (ANOVA) para a variável glicose após hidrólise do bagaço de cana .......................................................................................................................... 44 Tabela 28 – Efeitos e interações calculadas para a variável xilose após hidrólise do bagaço de cana .......................................................................................................................... 45 Tabela 29 – Análise de variância (ANOVA) para a variável xilose após hidrólise do bagaço de cana .......................................................................................................................... 45 Tabela 30 - Concentração de glicose e xilose da hidrólise ácida da uva Cabernet Franc não pré-hidrolisada. .................................................................................................................. 47 Tabela 31 - Concentração de glicose e xilose da hidrólise ácida da uva Cabernet Sauvignon não pré-hidrolisada. ................................................................................................ 48 Tabela 32 - Concentração de açúcares redutores g L -1 obtidos após pré-tratamento ácido e hidrólise ácida. ....................................................................................................................... 49 Tabela 33 - Concentração de açúcares redutores g L -1 obtidos após pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida .......................................................................................................... 53 Tabela 34 – Conversão de substrato a açúcares redutores por pré-tratamentos químicos em autoclave seguido de hidrólise ácida .................................................................................. 57 Tabela 35 – Conversão de substrato a açúcares redutores por pré-tratamentos químicos em micro-ondas seguido de hidrólise ácida .............................................................................. 60 Tabela 36 – Conversão de substrato a açúcares redutores por pré-tratamentos químicos em ultrassom seguido de hidrólise ácida .................................................................................. 63 Tabela 37 - Efeitos e interações calculadas para a variável açúcares redutores (AR) (Parte 4) .................................................................................................................................... 65 Tabela 38 - Análise de variância (ANOVA) para a variável açúcares redutores (AR) (Parte 4) .................................................................................................................................... 65 Tabela 39 - Efeitos e interações calculadas para a variável glicose (Parte 4) ......................... 66 Tabela 40 - Análise de variância (ANOVA) para a variável reposta glicose (Parte 4) ........... 67 Tabela 41 - Efeitos e interações calculadas para a variável xilose (Parte 4) ........................... 68 Tabela 42 - Análise de variância (ANOVA) para a variável resposta xilose (Parte 4) ........... 68 Tabela 43 - Efeitos e interações calculadas para a variável açúcares redutores (AR) (Parte 5) .................................................................................................................................... 70 Tabela 44 - Análise de variância (ANOVA) para a variável reposta açúcares redutores (AR) (Parte 5) ........................................................................................................................... 70 Tabela 45 - Efeitos e interações calculadas para a variável glicose (Parte 5) ......................... 71 Tabela 46 - Análise de variância (ANOVA) para a variável reposta glicose (Parte 5) ........... 72 Tabela 47 - Efeitos e interações calculadas para a variável xilose (Parte 5) ........................... 73 Tabela 48 - Análise de variância (ANOVA) para a variável resposta xilose (Parte 5) ........... 73 Tabela 49 - Parâmetros cinéticos da fermentação do mosto sintético pela levedura Pichia stipitis CCT 2617 durante as 48 horas de fermentação ................................................. 75 Tabela 50 - Parâmetros cinéticos da fermentação do mosto sintético pelo consórcio das leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae durante as 48 horas de fermentação .............................................................................................................................. 77 Tabela 51 - Parâmetros cinéticos da fermentação do mosto sintético pela levedura Pachysolen tannophilus CCT 1891 durante as 48 horas de fermentação................................. 79 Tabela 52 - Parâmetros cinéticos da fermentação do mosto sintético pelo consórcio das leveduras Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Saccharomyces cerevisiae durante as 48 horas de fermentação ................................................................................................................ 81 Tabela 53 - Parâmetros cinéticos da fermentação do hidrolisado por Pichia stipitis CCT 2617 durante 24 horas. ............................................................................................................. 83 Tabela 54 - Parâmetros cinéticos da fermentação do hidrolisado pelo consórcio de leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae durante 24 horas. ............... 85 Tabela 55 - Parâmetros cinéticos da fermentação do hidrolisado pela levedura Pachysolen tannophilus CCT 1891 durante 24 horas. ............................................................. 87 Tabela 56 - Parâmetros cinéticos da fermentação do hidrolisado pelo consórcio de leveduras Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Saccharomyces cerevisiae durante 24 horas. ........................................................................................................................................ 88 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Cadeia linear de glicose formada por vários biopolímeros de celobiose.................. 6 Figura 2 - Componentes da fração hemicelulose ...................................................................... 7 Figura 3 - Estrutura do material lignocelulósico: celulose, hemicelulose e lignina .................. 8 Figura 4 - Três principais precursores monoméricos da lignina: álcool coniferílico, álcool sinapílico e álcool p-cumarílico ....................................................................................... 8 Figura 5 - Efeitos do pré-tratamento na estrutura lignocelulósica .......................................... 10 Figura 6 - Reação de hidrólise ácida da celulose .................................................................... 14 Figura 7 - Fluxograma de execução do experimento Parte 2 .................................................. 21 Figura 8 - Fluxograma de execução do experimento Parte 3 .................................................. 23 Figura 9 - Micro-ondas doméstico utilizado no experimento ................................................. 25 Figura 10 - Equipamento de ultrassom utilizado no experimento ........................................... 25 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 – Concentração da glicose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida da casca de uva Cabernet FrancErro! Indicador não definido. Gráfico 2 – Concentração da xilose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Franc .......................................... 41 Gráfico 3 – Concentração da glicose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon .................................. 42 Gráfico 4 – Concentração da xilose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon .................................. 43 Gráfico 5 - Concentração da glicose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida do bagaço de cana ............................................................... 45 Gráfico 6 - Concentração da xilose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento após a hidrólise ácida do bagaço de cana ............................................................... 46 Gráfico 7 - Concentração de glicose após o pré-tratamento com H3PO4 e hidrólise ácida ..... 50 Gráfico 8 - Concentração de xilose após o pré-tratamento com H3PO4 e hidrólise ácida ....... 51 Gráfico 9 - Concentração de glicose após o pré-tratamento com NaOH e hidrólise ácida ..... 54 Gráfico 10 - Concentração de xilose após o pré-tratamento com NaOH e hidrólise ácida ..... 55 Gráfico 11 - Concentração de açúcares redutores (AR) g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em autoclave ................................................................. 56 Gráfico 12 - Concentração de glicose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em autoclave .................................................................................................. 58 Gráfico 13 - Concentração de xilose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em autoclave .................................................................................................. 59 Gráfico 14 - Concentração de açúcares redutores (AR) g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em micro-ondas ............................................................ 60 Gráfico 15 - Concentração de glicose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em micro-ondas ............................................................................................. 61 Gráfico 16 - Concentração de xilose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em micro-ondas ............................................................................................. 61 Gráfico 17 - Concentração de açúcares redutores (AR) g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em ultrassom ................................................................ 62 Gráfico 18 - Concentração de glicose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em ultrassom .................................................................................................. 63 Gráfico 19 - Concentração de xilose g L -1 após pré-tratamento alcalino NaOH (a) e ácido H3PO4 (b) em ultrassom .................................................................................................. 64 Gráfico 20 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta açúcares redutores (AR) em função da concentração de NaOH e tempo de tratamento .......... 66 Gráfico 21 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta glicose em função da concentração de NaOH e tempo de tratamento ..................................... 67 Gráfico 22 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta xilose em função da concentração de NaOH e tempo de tratamento ....................................... 69 Gráfico 23 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta açúcar redutor em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento ......................... 71 Gráfico 24 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta glicose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento ..................................... 72 Gráfico 25 - Superfície de resposta e gráfico de contorno para avaliação da resposta xilose em função da concentração de H2SO4 e tempo de tratamento ....................................... 74 Gráfico 26 - Parâmetros da fermentação do mosto sintético pela levedura Pichia stipitis CCT 2617 durante as 48 horas de fermentação ........................................................................ 76 Gráfico 27 - Parâmetros da fermentação do mosto sintético pelo consórcio das leveduras Pichia stipitis CCT 2617e Saccharomyces cerevisiae durante as 48 horas de fermentação .............................................................................................................................. 78 Gráfico 28 - Parâmetros da fermentação do mosto sintético pela levedura Pachysolentannophilus CCT 1891durante às 48 horas de fermentação................................... 80 Gráfico 29 - Parâmetros da fermentação do mosto sintético pelo consórcio das leveduras Pachysolen tannophilus e Saccharomyces cerevisiae durante as 48 horas de fermentação .............................................................................................................................. 81 Gráfico 30 - Parâmetros da fermentação do hidrolisado por Pichia stipitis CCT 2617 durante 24 horas ....................................................................................................................... 84 Gráfico 31 - Parâmetros da fermentação do hidrolisado pelo consórcio de leveduras Pichia stipitis CCT 2617 e Saccharomyces cerevisiae durante 24 horas. ................................ 86 Gráfico 32 - Parâmetros da fermentação do hidrolisado pela levedura Pachysolentannophilus CCT 1891 durante 24 horas. .............................................................. 87 Gráfico 33 - Parâmetros da fermentação do hidrolisado pelo consórcio de leveduras Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Saccharomyces cerevisiae durante 24 horas................. 89 1 1 INTRODUÇÃO O Brasil é um dos líderes mundiais na produção agrícola gerando ao final dos processos grande quantidade de resíduos. A procura por novos métodos de reaproveitamento vem aumentando justamente com o propósito de diminuir a poluição ambiental através de síntese de novos produtos (ALZATE; TORO, 2006; HU; WEN, 2008). A indústria vinícola tem grande interesse nestas tecnologias já que um dos seus resíduos mais abundantes é a casca da uva, um material de lenta decomposição no meio ambiente (BAIL et al., 2008; SPIGNO et al., 2008). O seu reaproveitamento pode ser efetuado através da produção de farinha de semente e casca da uva que apresenta propriedades importantes como antioxidantes (ABE et al., 2007) e recuperação de compostos fenólicos (ARVANITOYANNIS et al., 2006; CRUZ et al., 2013), além da possibilidade da produção de bioetanol a partir da celulose e hemicelulose presente nesta biomassa lignocelulósica (SPIGNO et al., 2008; PROZIL et al., 2012). A produção de bioetanol é uma das alternativas que tem o propósito de substituir combustíveis fósseis consequentemente contribuindo para a diminuição do efeito estufa (CHENG et al., 2008; IMAMOGLU, SUKAN, 2014). A biomassa que vem de resíduos agroindustriais é um dos tipos de compostos energéticos mais utilizados na obtenção deste biocombustível. Para a transformação destes resíduos em bioetanol são necessárias duas etapas: a hidrólise dos polissacarídeos contidos nos complexos lignocelulósicos em açúcares mais simples e a posterior fermentação desses açúcares (ROSSELL et al., 2005; KIIPPER, 2009; SU et al., 2012). Os materiais lignocelulósicos a serem hidrolisados são constituídos de celulose, hemicelulose e lignina (MOSIER et al., 2005). A celulose e a hemicelulose são polissacarídeos formados a partir de hexoses e pentoses que podem ser hidrolisados a monossacarídeos (glicose, xilose) e eventualmente fermentados a etanol. A lignina não pode ser convertida em etanol, porém seu emprego no processo como fonte energética é recomendável (HASUNUMA et al., 2013; COTANA et al., 2014). Existem várias tecnologias de hidrólise, incluindo a hidrólise ácida, que compreende a utilização de ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido acético e ácido peracético em conjunto com tratamento térmico (CUZENS; MILLER, 1997; TEIXEIRA et al., 1999; AGUILAR et al., 2002; GÁMEZ et al., 2006). O grande problema deste método é a geração de compostos inibitórios (LASER et al., 2002). 2 Alguns estudos mais recentes apontam que a utilização de pré-tratamentos pode favorecer o processo de hidrólise (MENON; RAO, 2012; PITARELO et al., 2012). Várias são as possibilidades de pré-tratamentos com diferentes rendimentos de glicose e xilose, tais como tratamentos com ácidos (WU; HUANG; SHIH, 2014), álcalis, autoclave (LÓPEZ-LINARES et al., 2013), micro-ondas (HU; WEN, 2008), ultrassom (WERLE et al., 2013; LUNELLI et al., 2014), cujo objetivo é remover a lignina e desestruturar as fibras, facilitando o ataque da hidrólise posterior (SAHA, 2005; SÁNCHEZ; CARDONA, 2008). Após o processo de hidrólise ocorre a fermentação. A transformação da glicose em etanol é um processo completamente estabelecido. Não existe micro-organismo mais apropriado que a levedura Sacharomyces cerevisiae que, através de seu emprego intensivo em fermentação industrial, já passou por um processo de seleção natural apresentando os melhores desempenhos em conversão de glicose a etanol, produtividade e tolerância alcoólica. Desde que os impactos negativos dos inibidores sejam controlados, a fermentação acontece sem maiores problemas (OLIVA-NETO; YOKOYA, 1997; DORTA et al., 2006). Quanto à fermentação das pentoses, poucos micro-organismos possuem a capacidade de fermentar estas a etanol (DELLWEG et al., 1984; GOMEZ, 1985, HERRERA et al., 2003).Três espécies de leveduras foram identificadas como as de maior potencial para a fermentação alcoólica das pentoses: Pichia stipitis, Candida shehatae (DU PREEZ et al.,1986; SÁNCHEZ et al., 2002) e Pachysolen tannophilus (DELLWEG et al., 1984; GOMEZ, 1985; BRAVO et al., 2002). Esta é, portanto, uma alternativa promissora para realizar o reaproveitamento dos resíduos dos processos de vinificação. Desta forma, este trabalho buscou utilizar diferentes metodologias de pré-tratamento e hidrólise para melhoramento da obtenção de açúcares fermentescíveis para posteriormente fazer a transformação em bioetanol. 3 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral  Analisar a influência de pré-tratamentos químicos (ácido e alcalino) e pré- tratamentos físicos (micro-ondas, autoclave e ultrassom) sobre a eficiência da hidrólise ácida da casca da uva Cabernet Sauvignon e estudar a capacidade de consumo dos açúcares existentes na casca da uva hidrolisada por diferentes leveduras. 2.2 Objetivos específicos  Comparar a eficiência de obtenção de açúcares fermentescíveis de casca de uva Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc e bagaço de cana após pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida utilizando o planejamento fatorial 2 2 .  Testar durante o pré-tratamento químico da casca de uva Cabernet Sauvignon o efeito de diferentes concentrações de ácido fosfórico ou hidróxido de sódio, em autoclave, seguida de hidrólise ácida na liberação de açúcares fermentescíveis.  Comparar a ação dos pré-tratamentos físicos: autoclave, micro-ondas e ultrassom seguidos de pré-tratamentos ácidos e alcalinos e hidrólise ácida na casca de uva para obtenção de açúcares fermentescíveis.  Após a seleção do melhor pré-tratamento, melhorar as condições de processo através de Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR).  Melhorar as condições da hidrólise ácida da casca de uva através de Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR).  Verificar a capacidade de utilização dos açúcares obtidos do hidrolisado através de fermentação pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae (comercial Fleishmann),Pichia stipitis CCT2617 e Pachysolen tannophilus CCT 1891. 4 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 A uva: Vitis vinífera L. A videira Vitis vinífera L. (Cabernet Sauvignon ou Franc) é originária de Bordeaux, França, sendo uma das uvas viníferas mais cultivadas no Brasil (GIOVANNINI, 2001; POMMER et al., 2003; DETONI et al., 2007). Tem elevada qualidade para vinificação, sabor herbáceo e destina-se à elaboração de vinho tinto de guarda (requer amadurecimento e envelhecimento) ou para ser consumido jovem (RIZZON; MIELE, 2002). Apresenta os cachos cilíndricos e longos, pesando em média 130 a 170 g, sendo as bagas pequenas, esféricas e pretas (POMMER et al., 2003; DETONI et al., 2007), com teores de açúcar entre 16 e 18 ºBrix (GIOVANNINI, 2001). Embora tenha sido introduzida no Brasil em 1921, foi somente depois de 1980 que houve incremento de seu plantio na Serra Gaúcha e na Fronteira Oeste do Rio Grande do Sul (RIZZON; MIELE, 2002). Segundo o Instituto Brasileiro do Vinho (IBRAVIM), somente as vinícolas do estado do Rio Grande do Sul processaram, no ano de 2014, 66 milhões de kg de uvas viníferas, dentre elas a variedade Cabernet (Vitis vinífera L.). Levando em consideração que o bagaço (casca, engaço e semente) representa de 10 a 15% em peso da matéria-prima inicial e que ainda contém na sua matriz açúcares (ARVANITOYANNIS et al., 2006) que podem ser disponibilizados para a conversão em diversos produtos, esta biomassa desperta um grande interesse para o reaproveitamento (PROZIL et al., 2012a; PROZIL et al., 2012b; MENDES et al., 2013). 3.2 Estruturas lignocelulósicas Os materiais lignocelulósicos possuem um alto teor de carboidrato (cerca de 70%) que podem ser muito utilizados em diversos processos tecnológicos (VÁSQUEZ, 2007). De acordo com Silva (1995) essas moléculas estão dispostas de forma complexo sendo, especificamente, miofibrilas de celulose, envolvida em uma matriz amorfa de polioses e envolta externamente por uma camada de lignina. Essa matriz amorfa age como uma barreira natural de proteção do vegetal ao ataque de micro-organismos e/ou enzimas, e torna esses materiais estruturalmente rígidos e pouco reativos. Segundo Kuhad e Singh 5 (1993), há também, na composição da massa total do bagaço, os extrativos, gomas, amidos, alcalóides, resinas e óleos essenciais. A complexa estrutura vegetal, originada por seus macro e micro constituintes, oferece uma gama de produtos com potencial para agregação de valor à cadeia produtiva. O maior entendimento da estrutura vegetal e dos principais constituintes – celulose, hemicelulose e lignina – se faz necessário para se atingir o objetivo de separação seletiva. A Tabela 1 mostra a constituição lignocelulósica de alguns materiais. Dentre os diversos produtos, a glicose obtida da celulose pode ser usada como matéria-prima para a produção de etanol, enquanto açúcares com 5 carbonos, provenientes da fração de hemiceluloses, podem ser usados para a produção de etanol, xilitol e ácidos orgânicos por exemplo. Por sua vez, a lignina presente nos tecidos vegetais é uma fonte em potencial para a produção em larga escala de diferentes compostos fenólicos (KLASS, 1998; MOSIER et al., 2005). Tabela1 - Composição de alguns materiais lignocelulósicos Materiais Lignocelulósicos Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) Cinzas (%) Forragem de milho 38 - 40 28 7 - 21 3,6 – 7 Fibra de coco 36 - 43 0,15 - 0,25 41 - 45 2,7 - 10,2 Fibra de bagaço 32 - 48 19 - 24 23 - 32 1,5 – 5 Fibra de bananeira 60 - 65 6 - 8 5 - 10 4,7 Palha de trigo 33 - 38 26 - 32 17 - 19 6 – 8 Palha de arroz 28 - 36 23 - 28 12 - 14 14 – 20 Palha de cevada 31 - 45 27 - 38 14 - 19 2 – 7 Bagaço de uva 12 – 15 26 – 29 32 – 35 5 - 7 Fonte: Adaptado de REDDY; YANG, 2005; EGÜÉS et al.; 2013 3.2.1 Celulose A celulose é o principal e o mais abundante componente dentre os materiais lignocelulósicos, que varia de 35 – 50% a sua concentração em diferentes tipos de matérias- primas (KESHWANI, 2009). Sua estrutura é composta por homopolímeros e apresenta estrutura linear formada por unidades de anidroglucopiranose β-D-glucopiranose ligadas por ligações glicosídicas do tipo β (1-4) (PITARELO et al., 2012). Quando se tem duas unidades 6 de glicose unidas por ligações β (1-4) e há repetição do biopolímero de celulose é chamado de celobiose (Figura 1) (VÁSQUEZ, 2007). Em sua estrutura molecular, a celulose apresenta regiões ordenadas que são estabilizadas por ligações de hidrogênio intramolecular e intermolecular sendo regiões cristalinas e amorfas, respectivamente (JARDINE, 2009). A região cristalina possui configuração mais ordenada, pois a sua formação é por cadeias de celulose unidas por ligações de hidrogênio e força de Van der Waals, e a região amorfa, além de menos ordenada e de apresentar maior área superficial, torna-a mais suscetível a hidrólise (SILVA, O. 2010). A molécula de celulose é insolúvel em água, ácidos e álcalis sendo solúvel em solução amoniacal de hidróxido cúprico e somente é totalmente hidrolisada por enzimas celulases (PARISI, 1989). Mendes et al. (2013) apontam que a celulose contida na casca de uva variedade Touriga Nacional é relativamente baixa (20,8%) quando comparada ao engaço da mesma variedade estudado por Prozil et al. (2012). Figura 1 - Cadeia linear de glicose formada por vários biopolímeros de celobiose Fonte: SILVA, O. 2010 3.2.2 Hemicelulose A porção de hemicelulose é a segunda de maior abundância no material lignocelulósico (15% - 45%) e sua estrutura é de cadeias ramificadas, em que se constituem de aldopentoses, como xilose e arabinose, e de aldohexoses, como glicose, manose e galactose (Figura 2). Devido a variadas ligações e ramificações, há a presença de uma alta complexidade de estrutura hemicelulósica e de suas conformações (SILVA, N. 2010). As hemiceluloses encontram-se intercaladas às microfibrilas de celulose proporcionando elasticidade e impedindo que as microfibrilas se toquem. São mais solúveis que a celulose podendo ser isoladas por extração alcalina (STAMBUK et al., 2008). 7 Quanto à sua estrutura molecular, a hemicelulose é mais facilmente hidrolisada por não haver zonas cristalinas em sua estrutura, porém, o processo de fermentação das pentoses não é consideravelmente desenvolvido como o da glicose (NEUREITER et al., 2002). Dentre as aldopentoses presentes, a xilose é a mais importante e de maior quantidade dentre elas. É formada por complexos de carboidratos poliméricos como a xilana (polímero de D-xilose unidas por ligações β-1,40) (SILVA, O. 2010). Com relação à hemicelulose da casca de uva, Mendes et al. (2013) encontraram 21% e Egüés et al. (2013) relatam 26,43% de hemicelulose encontrada na casca de uva. Figura 2 - Componentes da fração hemicelulose Fonte: LEHNINGER, 2014. 3.2.3 Lignina A lignina está presente em 10% a 20% do material lignocelulósico (COSTA, 2011). Encontra-se ligada à parede celular em que se entrelaça a hemicelulose formando uma fibra que envolve a celulose (Figura 3) (VÁSQUEZ, 2007). Ela age como material adesivo, agente de enrijecimento e impede degradação enzimática e/ou microbiana da parede celular (READING et al., 2003). Em sua estrutura tridimensional, há presença de material polifenólico amorfo com três principais precursores monoméricos: os alcoóis coniferílico, sinapílico e p- cumarílico (Figura 4). 8 Por possuir vários tipos de ligações químicas estáveis como C-C, aril-éter e diarílicas, e sendo as mais abundantes: β-0-4 e α-0-4, β-5, β-1, 5-5, β-β e β-0-5, a estrutura da lignina torna-se bastante complexa (PITARELO et al., 2012). No reino vegetal encontra-se a lignina em muitas espécies de plantas, mas sua constituição difere de uma para a outra (JARDINE, 2009). Figura 3 -Estrutura do material lignocelulósico: celulose, hemicelulose e lignina Fonte: COSTA, 2011 Figura 4 - Três principais precursores monoméricos da lignina: álcool coniferílico, álcool sinapílico e álcool p-cumarílico Fonte: SILVA, N.2010 3.3 Pré-tratamentos O pré-tratamento consiste na separação da lignina que está envolvendo a celulose e a hemicelulose, redução da cristalinidade da celulose e aumento da porosidade dos materiais para que haja um maior rendimento em açúcares fermentescíveis (PASQUINI et al., 2005; COSTA, 2011). 9 Existem várias formas de pré-tratamento com diferentes rendimentos de glicose e xilose. Os mais utilizados são os pré-tratamentos ácidos, álcali, explosão a vapor, água quente, fluído supercrítico, amônia líquida (AFEX) e hidróxido de sódio para a desestruturação lignocelulósica na obtenção de combustíveis renováveis (PITARELO et al., 2012). Mas há também outros tipos de pré-tratamentos (Tabela 2), como físicos: moagem, micro-ondas; e biológicos: decomposição microbiana de lignina (RODRIGUES, 2010). Tabela 2 - Métodos de pré-tratamento das biomassas lignocelulósicas Métodos físicos Métodos Químicos Métodos biológicos Métodos Combinados Vapor Ozonólise Pré-tratamento por fungos (de decomposição branca ou parda) Explosão a vapor Radiação Hidrólise ácido diluído (H2SO4, HCl, HNO3, H3PO4) Pré-tratamento por Bioorganosolv Hidrotérmico Moinho de bola Hidrólise ácido concentrado (H2SO4) SO2 e vapor Moinho martelo Ácido acético NO2 e irradiação Barra giratória Hidrólise alcalina (NaOH, Ca(OH)2) Alcalino e moinho de bolas Umidificação Amônia Amônia e vapor (AFEX) Água quente SO2 Explosão e CO2 Pirólise Deslignificação oxidativa Processo organossolv Fonte:Adaptado de SADDLER; RAMOS; BREUIL, 1993; SÁNCHEZ; CARDONA, 2008. Após a utilização de pré-tratamentos são obtidas modificações na estrutura da biomassa (Figura 5), porém as modificações são diferentes de acordo com a matéria-prima utilizada. As tecnologias mudam conforme as biomassas que irão sofrer a ação do pré- tratamento (MARGEOT et al., 2009). 10 Figura 5 - Efeitos do pré-tratamento na estrutura lignocelulósica Fonte: DA SILVA, 2010 3.3.1 Pré-tratamento químico De acordo com Menon; Rao (2012), os pré-tratamentos químicos originalmente foram desenvolvidos e têm sido extensivamente usados na indústria de papel para a deslignificação de materiais celulósicos. Os principais objetivos eram de melhorar a biodegradabilidade de celulose por remoção da lignina e a um grau menor diminuir o grau de polimerização (DP) e da cristalinidade da celulose. O pré-tratamento químico é a técnica mais estudada dentre as categorias pré-tratamento e normalmente incluem: ácido, álcalis, ácidos orgânicos, água quente e líquidos iônicos (SILVERSTAIN et al., 2007). 3.3.1.1 Pré-tratamento com ácidos diluídos São utilizadas baixas concentrações do reagente (0,05 – 5%) e temperatura (160 o C a 220 o C) (SÁNCHEZ; CARDONA, 2008), sendo que o mais utilizado é o ácido sulfúrico (H2SO4) visando diminuir a formação de produtos de degradação, porém outros ácidos também têm sido estudados, tais como ácido clorídrico (HCl) (WANG et al., 2010), o ácido fosfórico (H3PO4) (ZHANG et al., 2007; MARZIALETTI et al., 2008) e ácido nítrico (HNO3) (HIMMEL et al., 1997). Em geral, o pré-tratamento deve promover altos rendimentos do produto em uma subsequente operação de hidrólise enzimática e fermentação, trazendo redução de custos ao processo. Recentemente, foi demonstrado que a pré-hidrólise com ácido diluído pode alcançar elevadas taxas de reações em curto espaço de tempo e melhorar significativamente a hidrólise de celulose (XIANG et al., 2003). No entanto, as condições de operação devem ser 11 adaptadas à composição estrutural das diversas fontes de biomassa, de acordo com o produto a ser obtido (MENON; RAO, 2012). A utilização de ácidos pode causar aspectos negativos como corrosão dos equipamentos. Dessa forma é necessária a utilização de materiais anticorrosivos que são mais caros, mas a vantagem é a não utilização de enzimas hemicelulolíticas na etapa da hidrólise trazendo economia para o processo (DA SILVA, 2010). 3.3.1.2 Pré-tratamento alcalino Os principais reagentes utilizados são: hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, hidróxido de sódio e óxido de cálcio (SADDLER; RAMOS; BREUIL, 1993). A utilização de um composto alcalino provoca a degradação do éster e cadeias laterais glicosídicas resultantes em alteração estrutural da lignina, descristalização parcial da celulose (CHENG et al., 2008; McINTOSH; VANCOV, 2010), e solvatação parcial de hemicelulose (McINTOSH; VANCOV, 2010; SILLS; GOSSETT, 2011). O hidróxido de sódio tem sido extensivamente estudado, com o objetivo de romper a estrutura de lignina, aumentando a acessibilidade para as enzimas de celulose e hemicelulose (MacDONALD et al., 1983; ZHU; WAN; LI, 2010). As condições de pré- tratamento alcalino são geralmente menos severas do que outros pré-tratamentos. Ela pode ser realizada em temperatura ambiente, mas os tempos são mais longos do que quando são utilizadas temperaturas mais elevadas. O processo envolve a imersão da biomassa em soluções alcalinas a uma temperatura-alvo durante certo período de tempo, posteriormente ocorre a neutralização para remover lignina e inibidores (sais, ácidos fenólicos, furfural, e aldeídos) sendo que esta etapa é necessária antes da hidrólise enzimática (MENON; RAO, 2012). Durante o pré-tratamento há perda de parte do reagente que é convertido em sais que se incorporam à biomassa durante a etapa. A eficiência do álcali depende do conteúdo de lignina presente na biomassa (DA SILVA, 2010). 3.3.2 Pré-tratamento físico A utilização de pré-tratamentos físicos aumenta a área de superfície e dos poros da biomassa, diminui a cristalinidade e o grau de polimerização da celulose. Alguns desses pré-tratamentos como a moagem e a irradiação melhoram a hidrólise enzimática e a 12 biodegradabilidade dos materiais lignocelulósicos deixando mais acessíveis para a ação das enzimas (DA SILVA, 2010). Outras maneiras de pré-tratamentos físicos são encontradas e muito utilizadas para o mesmo fim de deslignificação obtendo melhores resultados na hidrólise sendo que a explosão a vapor e a termo-hidrólise também apresentam vantagens e desvantagens em seu uso (SUN e CHENG, 2002; SILVA, O. 2010). O pré-tratamento por irradiação pode ser por raio gama, feixes de elétrons ou micro-ondas que clivam as ligações β-1,4 degradando as fibras de celulose e diminuindo peso molecular podendo chegar até a celobiose. Sua desvantagem de uso é o preço e a dificuldade de sua introdução em escala industrial (RODRIGUES, 2010). 3.3.2.1 Micro-ondas Entre a faixa do espectro eletromagnético e o infravermelho encontra-se a frequência utilizada pelos micro-ondas domésticos e industriais que está dentro da faixa de 900 MHz e 2,45GHz. A frequência de 2,45 GHz não é boa para induzir reações químicas, mas se o material exposto contiver em sua estrutura moléculas polares e íons a radiação causa uma aceleração no processo. Além disso, a utilização das micro-ondas traz como vantagem a redução do investimento inicial, uniformidade e seletividade no processo, além da possibilidade de iniciar e interromper a reação instantaneamente (KESHWANI, 2009; RODRIGUES, 2010). Já a moagem, ao contrário das micro-ondas, exige alta energia para seu funcionamento sendo considerado desfavorável seu uso e consequentemente pouco explorado (SILVA, A. 2010). A sua utilização em material lignocelulósico cria um campo eletromagnético interparticular, gerando calor de forma rápida e direta fazendo com que haja sua ruptura, ao contrário da forma de calor por condução e convecção que é feita a transferência do calor superficial (DE LA ROZ et al., 2005; HU; WEN, 2008). Somente com o pré-tratamento por micro-ondas não há efeito significativo na estrutura lignocelulósica, precisando assim de um componente polar ou iônico como compostos alcalinos (NaOH, Ca(OH)2 e Na2CO3) e ácidos (H2SO4) (PALMAROLA- ADRADOS et al., 2005; ZHU et al., 2005; ZHU et al., 2006; HU; WEN, 2008; KESHWANI, 2009). 13 3.3.2.2 Autoclave A autoclavagem é um tratamento térmico bastante utilizado nas tecnologias de pré-tratamento e hidrólise da biomassa. Consiste em manter o material a ser hidrolisado a uma temperatura elevada e sob pressão, por um período de tempo que deve ser previamente estabelecido. O processo inclui ciclos de compressão e descompressão de forma a facilitar a ruptura das estruturas lignocelulósicas. Os valores usuais de pressão são da ordem de 1 a 3,5 bar e a temperatura atinge 135ºC (BARCZA, 2008). Para a realização deste processo é necessário o uso de reservatórios metálicos que suportem altas pressões e temperaturas. Porém, estes reservatórios podem sofrer corrosão devido às altas temperaturas, à presença de materiais abrasivos e de íon cloreto proveniente dos sistemas de distribuição de água (FERREIRA et al., 2011). Além disso, geralmente este tratamento está associado ao uso de catalisadores químicos como ácidos ou bases que promovem uma melhoria no rendimento em açúcares deste processo. 3.3.2.3 Ultrassom O ultrassom é um método físico queem presença de suspensões aquosas de biomassa ou simplesmente sistemas aquosos, pode produzir pequenos microjatos, que são consequência do fenômeno de cavitação. Portanto, os efeitos mecânicos do ultrassom de potência sobre o material são: a diminuição do tamanho de partícula, dispersão das partículas e facilitador da dissolução do material (ALIYU; HEPHER, 2000, LUNELLI et al., 2014). O ultrassom de potência é empregado na biomassa lignocelulósica a fim de melhorar a extração de hemicelulose, celulose e lignina e, por conseguinte, aumentar o rendimento de hidrólise enzimática (ESFAHANI; AZIN, 2012; WERLE et al., 2013). 3.4 Hidrólise ácida A hidrólise ácida compreende a utilização de ácidos tais como sulfúrico (AGUILAR et al., 2002), clorídrico (CUZENS; MILLER, 1997), acético, peracético (TEIXEIRA et al., 1999), fosfórico (GÁMEZ et al., 2006). Nesse processo há a separação dos compostos lignocelulósicos, onde as frações (celulose e hemicelulose) serão submetidas à fermentação para a produção de etanol (NEUREITER et al., 2002; ROSSELL, 2006). Além 14 disso, podem envolver também condições como altas temperaturas e pressão de trabalho, que facilitam o processo de hidrólise. Faz-se necessário o estudo da matéria-prima a ser utilizada já que as condições diferem em relação aos tipos de materiais usados. A hidrólise ácida de celulose pode ser representada por uma série de reações como é mostrado na Figura 6. Figura 6 - Reação de hidrólise ácida da celulose Fonte: Pietrobon (2008) Pietrobon (2008) diz que durante o processo de hidrólise são gerados dois tipos de açúcares: as pentoses provenientes da hidrólise da fração hemicelulose e as hexoses, geradas na degradação de parte da hemicelulose e celulose. A hidrólise ácida permite atuação seletiva inicial sobre a hemicelulose, heteropolissacarídeo ramificado de cadeia reduzida e amorfo, devido a diferenças estruturais com a celulose, homopolissacarídeo linear de cadeia muito longa e regiões cristalinas. A hemicelulose pode ser seletivamente hidrolisada em condições mais suaves (LEE et al., 1996), sob controle da concentração ácida e da temperatura, aos seus componentes monossacarídeos (RAHMAN et al., 2007), sem afetar a celulose e com reduzido efeito sob a lignina. O tratamento ácido é eficiente em solubilizar e hidrolisar a celulose e hemicelulose da biomassa. Combinações de temperatura, pressão, concentração do ácido e tempo de reação podem resultar em altos níveis de açúcares para fermentação. Rossell et al., (2005) relatam que os ácidos minerais agem rapidamente como catalisadores na hidrólise dos polissacarídeos em açúcares redutores. Normalmente, são empregados os ácidos sulfúrico ou clorídrico e podem prescindir do pré-tratamento. O maior interesse na pesquisa em hidrólise ácida diluída é resultado de que esse processo é economicamente mais favorável para produção de bioetanol, visto que ele é baseado em baixo consumo de ácido o que diminui os custos com matéria-prima e equipamentos devido à menor corrosão durante o processo (CHENG et al., 2008; GURGEL, 2010). Quando o ácido diluído é usado, o processo requer altas temperaturas e pressões para alcançar taxas aceitáveis de hidrólise à glicose em tempos razoavelmente curtos 15 devido à inacessibilidade dos cristais de celulose (GÁMEZ et al., 2006). Devido à natureza sequencial da reação, o rendimento de glicose é limitado. Em contraste ao processo com ácido diluído o processo ácido concentrado pode dar rendimentos maiores de glicose em baixas temperaturas. Por outro lado, o custo do ácido é relativamente alto e esse deve ser recuperado para tornar o processo viável (PESSOA Jr et al., 1997; CHENG et al., 2008). 3.4.1 Compostos tóxicos derivados da hidrólise ácida Durante o pré-tratamento do material lignocelulósico ou nos processos de hidrólise catalisada por ácidos, não se obtém somente os açúcares provenientes da hidrólise. Na dissolução da celulose e hemicelulose, justamente por causa das altas temperaturas e condições ácidas nas quais se desenvolvem estes tratamentos é originada uma série de compostos que pode atuar como inibidores potenciais da fermentação. A natureza e concentração destes compostos dependem do tipo de matéria-prima (conteúdo percentual de celulose, hemicelulose e lignina), do pré-tratamento utilizado, das condições do processo (temperatura e tempo de reação) e do emprego ou não de catalisadores ácidos (ROSSELL, 2006). Os materiais lignocelulósicos apresentam elevado teor de hemiceluloses (30%) constituídas predominantemente de polímeros de pentoses (xilanas e xilo-arabanas). Em virtude da alta reatividade das pentoses (particularmente a xilose), em temperaturas superiores a 140°C, a seletividade e o rendimento sacarídico do processo de hidrólise das hemiceluloses podem ser comprometidos, quando se realizam pré-tratamentos hidrolíticos do bagaço de cana-de-açúcar sob temperaturas superiores a 180°C durante tempos de processo da ordem de 30-60 minutos. A adoção de condições severas de processo tende a incrementar a degradação da xilose em furfural, bem como promover a degradação da glicose em hidróximetilfurfural (HMF), compostos potencialmente inibidores da fermentação etanólica (LASER et al., 2002; CARRION; DORTA, 2009, MILLER et al., 2012). A solubilização e fracionamento da lignina, associada a elevadas severidades de processo, são potencialmente prejudiciais às etapas subseqüentes (fermentação), em virtude da deposição de lignina sobre a superfície da polpa celulósica, bem como da geração de compostos inibidores da fermentação tais como derivados fenólicos e ácidos orgânicos (FELIPE et al., 1997; AGUILAR et al., 2002; PEREIRA et al., 2007). 16 Existem algumas técnicas para a remoção desses compostos tóxicos como o tratamento com hidróxidos alcalino-terrosos (SCHIRMER-MICHEL et al., 2008), adsorção em carvão ativo e carvão vegetal (MUSSATO; ROBERTO, 2001), diluição do hidrolisado, coluna de troca iônica (MARTON et al., 2003, CANILHA; SILVA; SOLENZAL, 2004), evaporação à vácuo (RODRIGUES et al., 2001) entre outras. 3.5 Fermentação dos açúcares derivados da hidrólise Empregando pré-tratamentos e hidrólise ácida na matriz lignocelulósica, é possível obter principalmente dois monômeros. A glicose a partir da celulose e a xilose a partir da hemicelulose. Estes açúcares podem dar origem a vários bioprodutos pela via fermentativa, entre eles o bioetanol. Utilizando a levedura Sacharomyces cerevisiae, a glicose pode ser convertida em etanol desde que haja o controledo processo para evitar os inibidores da fermentação como pH, ácido lático, sulfito e contaminação microbiana (TAKAHASHI, 1998; DORTA et al., 2006). Quanto à fermentação das pentoses, poucos micro-organismos possuem a capacidade de fermentar estas a etanol (DELLWEG et al., 1984; GOMEZ, 1985). Três espécies de leveduras foram identificadas como as de maior potencial para a fermentação alcoólica das pentoses: Pichia stipitis, Candida shehatae (DU PREEZ et al.,1986; AGBOGBO et al., 2006; MUSSATO; ROBERTO; TEIXEIRA, 2011; )e Pachysolen tannophilus (SÁNCHEZ et al. 2004; ZHAO; ZHANG; TAN, 2008) porém o desempenho das mesmas é muito limitado. O metabolismo das pentoses exige a presença de nível mínimo de oxigênio, que deve ser rigorosamente controlado. Estas cepas apresentam baixa tolerância ao etanol e aos ácidos alifáticos (DELLWEG et al., 1984; GOMEZ, 1985; RUDOLF et al., 2008). Para realizar a fermentação alcoólica de um licor contendo pentoses e hexoses, as possibilidades em estudo são: fermentação simultânea ou seqüencial de pentoses e hexoses, ou seja, processo de conversão direta pelo micro-organismo (CDM). Na fermentação simultânea, dois micro-organismos que fermentem respectivamente a glicose e a xilose são cultivados em co-cultura. A maioria dos trabalhos realizados neste campo utilizou duas leveduras: S. cerevisiae e P. stipitis (pentoses) (TANIGUCHI et al., 1997; HICHERT, 2010). As dificuldades encontradas foram: o metabolismo da xilose procede mais lentamente que o da glicose, provocando a inibição alcoólica sobre o micro-organismo que metaboliza as pentoses; repressão catabólica da glicose sobre a utilização da xilose; competição entre S. 17 cerevisiae e a levedura responsável pela fermentação da xilose pelo oxigênio presente no meio; possível incompatibilidade entre as duas cepas (ROSSELL, 2006; RUDOLF et al., 2008). Uma alternativa é a de operar a fermentação em um esquema seqüencial (monocultura), fermentando primeiro a glicose e depois a xilose (ou vice-versa). Os melhores resultados obtidos até agora foram usando uma linhagem mutante de Escherichia coli incapaz de metabolizar glicose, seguida de uma segunda etapa de fermentação da glicose com S. cerevisiae (RUDOLF et al., 2008). No entanto, para este processo pode-se utilizar a S. cerevisiae que fermenta a glicose, em conjunto com a fermentação de xilose que pode ser convertida a etanol pelas leveduras P. stipitis ou P. tannophilus. 18 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Parte 1 – Obtenção de açúcares fermentescíveis da casca de uva Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc e bagaço de cana-de-açúcar após pré-tratamento alcalino e hidrólise ácida aplicando o planejamento fatorial 2 2 4.1.1 Coleta do material As cascas de uvas Cabernet Sauvignon e Cabernet Franc, utilizadas nas análises, foram obtidas da vinícola Góes de São Roque – SP, safra de 2013. O bagaço de cana-de-açúcar, sendo um material vegetal mais estudado pela literatura na obtenção de açúcares fermentescíveis do que a casca de uva, foi utilizado como controle. Este material foi obtido da Usina Guaraní de Olímpia – SP, safra de 2013. 4.1.2 Preparo do material As cascas das duas variedades de uvas e o bagaço de cana-de-açúcar sofreram processo de secagem em estufa (Modelo 315-SE, FANEM) a 100 °C por 24 horas. Posteriormente, as cascas de uvas foram trituradas em liquidificador e as amostras foram reservadas em freezer até o momento de análise. 4.1.3 Pré-hidrólise alcalina Realizou-se a pré-hidrólise alcalina das cascas de uvas Cabernet Sauvignon e Cabernet Franc com o objetivo de verificar se esta etapa melhorava o rendimento da etapa seguinte, a hidrólise ácida, analisando se haveria aumento no rendimento de açúcares redutores fermentáveis – glicose e xilose. Adotou-se o método citado por Aguiar (2010), com algumas adaptações, utilizando-se de solução alcalina hidróxido de sódio (NaOH) na proporção 1:10 (p/v) em autoclave à temperatura de 121 °C. Os testes de pré-hidrólise variaram nas condições de concentração da solução de hidróxido de sódio e o tempo de permanência na autoclave sendo realizados baseados na matriz de planejamento fatorial 2², que é apresentada na Tabela 3. 19 Tabela 3 - Matriz de planejamento fatorial 2² para os testes de pré-hidrólise alcalina Experimento Concentração de NaOH Tempo 1 -1 -1 2 +1 -1 3 -1 +1 4 +1 +1 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Fonte: Dados do autor Na Tabela 4, encontram-se os valores reais das condições em que foram aplicados os testes de pré-hidrólise alcalina e os níveis codificados. Tabela 4 - Valores reais e níveis dos fatores aplicados na pré-hidrólise alcalina Nível -1 Ponto Central 0 Nível +1 Concentração de NaOH (% v/v) 2 4,5 7 Tempo (minutos) 15 30 45 Fonte : Dados do autor O bagaço de cana-de-açúcar foi utilizado como controle do teste, sendo tratado nas mesmas condições que as cascas de uvas e simultaneamente a cada uma delas. 4.1.4 Hidrólise ácida Posteriormente à pré-hidrólise alcalina, as cascas das duas variedades de uvas foram submetidas à hidrólise ácida baseada na metodologia de Aguilar et. al. (2002) com algumas adaptações. Utilizou-se solução de ácido sulfúrico (H2SO4) na proporção 1:10 (p/v) em autoclave à temperatura de 121 °C. Os testes de hidrólise variaram nas condições de concentração da solução de ácido sulfúrico e o tempo de tratamento em autoclave e foram realizados baseados na matriz de planejamento fatorial 2², que é apresentada na Tabela 5. 20 Tabela 5 - Matriz de planejamento fatorial 2² para os testes de hidrólise ácida Experimento Concentração de H2SO4 Tempo 1 -1 -1 2 +1 -1 3 -1 +1 4 +1 +1 5 0 0 6 0 0 7 0 0 Fonte : Dados do autor Na Tabela 6, encontram-se os valores reais das condições em que foram aplicados os testes de hidrólise ácida e os níveis codificados. Tabela 6 -Valores reais e níveis dos fatores aplicados na hidrólise ácida Nível -1 Ponto Central 0 Nível +1 Concentração de H2SO4 (% v/v) 2 4 6 Tempo (minutos) 15 30 45 Fonte : Dados do autor Foi realizada também a hidrólise ácida das cascas das duas variedades de uvas sem que as mesmas fossem pré-hidrolisadas com o objetivo de comparar os rendimentos obtidos nos dois tratamentos (Tratamento 1: hidrólise ácida com as amostras previamente pré- hidrolisadas; Tratamento 2: hidrólise ácida com as amostras não pré-hidrolisadas) e assim, confirmar se a pré-hidrólise aumenta a eficiência da hidrólise ácida. O Tratamento 2 foi realizado da mesma forma que o Tratamento 1 e a matriz do planejamento fatorial pode ser observado na Tabela 4. Além disso, o Tratamento 2 foi realizado simultaneamente ao Tratamento 1 para cada uva, para que ocorressem nas mesmas condições de análise. O bagaço de cana-de-açúcar foi utilizado como controle dos testes, sendo tratado nas mesmas condições que as cascas de uvas e simultaneamente a cada uma delas. 21 4.2 Parte 2 – Pré-tratamento ácido ou alcalino em autoclave e hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon Os experimentos foram conduzidos seguindo o fluxograma da Figura 7 Figura 7 - Fluxograma de execução do experimento Parte 2 Fonte: Dados do autor 22 4.2.1 Matéria-prima e reagentes A casca da uva Cabernet Sauvignon (Vitis vinífera L.) proveniente da safra de 2014 foi gentilmente cedida pela Vinícola Góes de São Roque/SP. Os reagentes utilizados foram: ácido sulfúrico (H2SO4), fosfórico (H3PO4) e hidróxido de sódio (NaOH). 4.2.2 Pré-tratamento ácido ou alcalino Realizou-se uma pré-hidrólise ácida ou alcalina na proporção 1:10 (10 g de casca de uva para 100 mL de solução) com ácido fosfórico ou hidróxido de sódio em autoclave vertical (Modelo AV75 – Phoenix) a 121 °C nos respectivos tempos de reação e concentração do reagente como mostra a Tabela 7 (metodologia adaptada de GÀMEZ et al., 2006 e XU et al., 2010). Tabela 7 - Concentração do reagente e tempo de reação nos ensaios utilizando pré-tratamento ácido ou alcalino para hidrólise ácida Experimentos Concentração do reagente(%) Tempo de reação (min) 2 4,5 7 15 30 45 1 + - - + - - 2 + - - - + - 3 + - - - - + 4 - + - + - - 5 - + - - + - 6 - + - - - + 7 - - + + - - 8 - - + - + - 9 - - + - - + Fonte : Dados do autor 4.1.3 Hidrólise ácida Foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 125 mL, 10 g do pré- hidrolisado com 100 mL de solução de H2SO4 a 2% e levados em autoclave vertical (Modelo AV75 – Phoenix) a 121 °C por 60 minutos (metodologia adaptada de AGUILAR et al.,2002). 23 4.3 Parte 3 Avaliação dos pré-tratamentos físicos em autoclave, micro-ondas ou ultrassom com pré-tratamentos ácidos ou alcalinos e hidrólise ácida da casca de uva Cabernet Sauvignon O experimento foi conduzido seguindo as etapas do fluxograma da Figura 8. Figura 8 - Fluxograma de execução do experimento Parte 3 Fonte: Dados do autor 24 4.3.1 Coleta e preparo do material As cascas de uva provenientes da vinícola Góes, safra de 2014, foram secas em estufa (Modelo 315-SE, FANEM) 60 ºC por 24 horas e depois trituradas. Foram armazenadas em refrigerador até o momento da utilização. 4.3.2 Pré-tratamentos Os pré-tratamentos físicos em autoclave, micro-ondas e ultrassom com ácidos ou álcalis foram realizados seguindo a Tabela 8. Tabela 8 - Concentração dos reagentes e tempos de tratamento do experimento 3 Experimentos Concentração de reagente(%) Tempo de reação (min) 2 4,5 7 5 12,5 20 1 + - - + - - 2 + - - - + - 3 + - - - - + 4 - + - + - - 5 - + - - + - 6 - + - - - + 7 - - + + - - 8 - - + - + - 9 - - + - - + *Experimentos em triplicata Fonte : Dados do autor 4.3.2.1 Autoclave Foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 250 mL, 10 g do pré- hidrolisado com 100 mL de solução de H3PO4 ou NaOH e levados em autoclave vertical (Modelo AV75 – Phoenix) a 121 °C (Tabela 8). 4.3.2.2 Micro-ondas Foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 250 mL, 10 g do pré- hidrolisado com 100 mL de solução de H3PO4 ou NaOH e levados em micro-ondas doméstico (Figura 9) (Modelo Family-Panagrill 31 L, PANASONIC) (Tabela 8). 25 Figura 9 - Micro-ondas doméstico utilizado no experimento Fonte: Dados do autor 4.3.2.3 Ultrassom Foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 250 mL, 10 g do pré- hidrolisado com 100 mL de solução de H3PO4 ou NaOH e levados em sonda ultrassônica operante a 22 kHz e potência de 50 W (Figura 10) (Modelo 50 SonicDismembrator, FISHER SCIENTIFIC) seguindo os experimentos descritos na Tabela 8. Figura 10 - Equipamento de ultrassom utilizado no experimento Fonte: Dados do autor 26 4.3.3 Hidrólise ácida Foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 125 mL, 10 g do pré- hidrolisado com 100 mL de solução de H2SO4 a 2% e levados em autoclave vertical (Modelo AV75 – Phoenix) a 121 °C por 60 minutos (metodologia adaptada de AGUILAR et al.,2002). 4.4 Parte 4 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para pré-tratamento alcalino em micro-ondas. 4.4.1 Coleta e preparo do material As cascas de uva provenientes da vinícola Góes, safra de 2014, foram secas em estufa (Modelo 315-SE, FANEM) 60 ºC por 24 horas e depois trituradas. Foram armazenadas em refrigerador até o momento da utilização. 4.4.2 Delineamento experimental A casca de uva foi submetida a diferentes tratamentos para avaliar os efeitos da concentração de NaOH (X1) e tempo de reação em micro-ondas (X2) na liberação de açúcares,através de um planejamento composto central rotacional (DCCR) 2 2 , contendo 3 pontos centrais e 4 axiais. As Tabelas 9 e 10 mostram o delineamento adotado. Tabela 9 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes (Parte 4) Variáveis Independentes Níveis codificados e reais das variáveis independentes -α -1 0 +1 +α Concentração de NaOH (%) 0,5% 0,72% 1,25% 1,78% 2% Tempo de reação (min) 5 6,5 10 13,5 15 Fonte: Dados do autor O valor de α foi calculado em função do número de variáveis independentes (n=2) através da Equação 1: ∝=(2 n ) 1/4 =1,4 (1) 27 As faixas de variação entre o limite inferior e o superior de cada variável independente foram estabelecidas de acordo com os dados de estudos anteriores e literatura (HU; WEN, 2008; AGUIAR, 2010). Tabela 10 - Quadro de ensaios do planejamento composto central rotacional (Parte 4) Ensaios X1 Concentração NaOH X2 Tempo 1 -1 0,72% -1 6,5 2 +1 1,78% -1 6,5 3 -1 0,72% +1 13,5 4 +1 1,78% +1 13,5 5 0 1,25% -1,41 5 6 0 1,25% +1,41 15 7 -1,41 0,5% 0 10 8 +1,41 2% 0 10 9 0 1,25% 0 10 10 0 1,25% 0 10 11 0 1,25% 0 10 Fonte: Dados do autor 4.4.3 Hidrólise ácida Após o pré-tratamento foram colocados, em frascos Erlenmeyer de 125 mL, 10 g do pré-hidrolisado com 100 mL de solução de H2SO4 a 2% e levados em autoclave vertical (Modelo AV75 – Phoenix) a 121°C por 30 minutos (metodologia adaptada de AGUILAR et al.,2002). 4.5 Parte 5 – Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para hidrólise ácida em autoclave 4.5.1 Coleta e preparo do material A casca de uva foi submetida ao pré-tratamento com NaOH em micro-ondas que apresentou os melhores resultados na etapa anterior, sendo esta condição com 0,72% de NaOH por 13,5 minutos em micro-ondas. Após esta etapa o material foi filtrado e o pH ajustado para 7,0 com H2SO4 0,5% e novamente seco em estufa 60 ºC. Posteriormente a secagem a casca foi submetida a hidrólise de acordo com o planejamento experimental da Tabela 12. 28 4.5.2 Delineamento experimental A casca de uva foi submetida a diferentes tratamentos para avaliar os efeitos da concentração de H2SO4 (X1) e tempo de reação em autoclave (X2) na liberação de açúcares,através de um planejamento composto central rotacional (DCCR) 2 2 , contendo 3 pontos centrais e 4 axiais. As Tabelas 11 e 12 mostram o delineamento adotado. Tabela 11 - Níveis codificados e reais das variáveis independentes (Parte 5) Variáveis Independentes Níveis codificados e reais das variáveis independentes -α -1 0 +1 +α Concentração de H2SO4 (%) 2% 2,6% 4% 5,4% 6% Tempo de reação (min) 5 6,5 10 13,5 15 Fonte: Dados do autor O valor de α foi calculado em função do número de variáveis independentes (n=2)através da Equação 1: ∝=(2 n ) 1/4 =1,41 (1) As faixas de variação entre o limite inferior e o superior de cada variável independente foram estabelecidas de acordo com os dados de estudos anteriores e literatura (AGUILAR et al., 2002) Tabela 12 - Quadro de ensaios do planejamento composto central rotacional (Parte 5) Ensaios X1 Concentração H2SO4 X2 Tempo 1 -1 2,6% -1 6,5 2 +1 5,4% -1 6,5 3 -1 2,6% +1 13,5 4 +1 5,4% +1 13,5 5 0 4% -1,41 5 6 0 4% +1,41 15 7 -1,41 2% 0 10 8 +1,41 6% 0 10 9 0 4% 0 10 10 0 4% 0 10 11 0 4% 0 10 Fonte: Dados do autor 29 4.6 Parte 6 – Fermentação de mostos sintéticos contendo glicose e xilose 4.6.1 Manutenção da Cultura Estoque Neste estudo foram utilizadas três leveduras: Saccharomyces cerevisiae (comercial Fleishmann), e Pachysolen tannophilus CCT 1891 e Pichia stipitis CCT 2617, foram gentilmente cedidas pela Fundação André Tosello, Coleção Tropical de Culturas de Campinas/SP. As leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pachysolen tannophilus CCT 2380 e Pichia stipitis CCT 2617 foram cultivadas em tubo de ensaio com tampão com o meio YEPD (extrato de levedura, peptona, dextrose, ágar) para S.cerevisiae e YEPX (extrato de levedura, peptona, xilose e ágar) para P.tannophilus e P.stipitis, onde o crescimento ocorreu em temperatura de 30 ºC por 24 horas em incubadora BOD, e posteriormente os tubos foram mantidos em refrigerador a 5ºC. 4.6.2 Padronização do inóculo Um volume de 8 mL da cultura estoque (que corresponde a um inóculo com uma absorvância de 0,8, medida a 600 nm) foi transferido em frascos de erlenmeyer, contendo 100 mL do meio de cultivo, composição descrita na Tabela 13. As culturas foram conduzidas em incubadoras, sob agitação de 150 rpm, à temperatura de 30 ºC por aproximadamente 24 horas, para produção do inóculo. Após este período, 10 mL da cultura foram centrifugados a 2 g por 20 minutos. O sedimento de célula foi lavado duas vezes em água peptonada 0,1%, antes de ser adicionado aos meios de cultivo (MURARI et al., 2013 adaptado de SILVEIRA, 2006). Tabela 13 - Composição do meio de cultivo utilizado para padronização do inóculo das leveduras e meio fermentativo. Compostos Concentração % (p:v) Extrato de levedura 0,5% Peptona 0,5% ZnSO4.7H2O 0,03% MgSO4 0,035% Na2HPO4 0,05% K2HPO4 0,05% (NH4)2SO4 0,1% D-xilose ou D-glicose* 2% *Para S.cerevisiae utilizou-se glicose e para P. tannophilus e P. stipitis utilizou-se xilose. Fonte: Dados do autor 30 4.6.3 Fermentação As fermentações foram realizadas em Erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de meio de cultivo (Tabela 13) com pH ajustado para 5,0 com HCl 0,1M. Estes frascos foram vedados com tampão de algodão. Uma vez padronizado o inóculo inicial (10% no meio de cultivo), foram incubados em shaker (Modelo Luca-222, LUCADEMA), sob agitação de 100 rpm, à 30 ºC por 48 horas. Alíquotas foram retiradas de 6 em 6 horas para determinação do crescimento celular e consumo de açúcar. 4.7 Parte 7 – Pré-tratamento e hidrólise da casca de uva e fermentação do hidrolisado 4.7.1 Pré-tratamento e hidrólise da casca de uva A casca de uva foi submetida ao pré-tratamento em micro-ondas com NaOH 0,72% na proporção de 1:10, por 13,5 minutos. Após este procedimento o material foi filtrado e o pH ajustado para 5,0. O líquor obtido após a filtração foi armazenado sob refrigeração (5ºC) e a parte sólida foi levada para secar em estufa 60 ºC por 24h. O material já seco foi submetido a hidrólise ácida com H2SO4 2,6% na proporção 1:10, em autoclave por 13,5 minutos. Após o período de tratamento o material foi filtrado. A casca restante foi descartada e o líquido foi direcionado para a etapa de remoção dos compostos tóxicos. 4.7.2 Remoção dos compostos tóxicos e concentração do mosto O hidrolisado sofreu ajuste de pH com hidróxido de cálcio (3 mg/mL) até o atingir 5,0. Passou-se o hidrolisado numa coluna com carvão ativo (300 mL de hidrolisado para 2,7 g de carvão ativo Synth em pó, com partículas a 0,043 mm; distribuído num volume de 84,5 cm 3 ) através da pressão gerada por bomba a vácuo. Após esta etapa, o hidrolisado foi misturado ao pré-hidrolisado e levado a banho-maria (Modelo Luca 150/10, LUCADEMA) a 99 ºC para concentração dos açúcares. 31 4.7.3 Fermentação do hidrolisado As fermentações foram realizadas em erlenmeyers de 250 mL com 100 mL de hidrolisado com pH ajustado para 5,0 com HCl 0,1M. Estes frascos foram vedados com tampão de algodão. Uma vez padronizado o inóculo inicial (10% no meio de cultivo) foram incubados em shaker (Modelo Luca -222, LUCADEMA), sob agitação de 100 rpm, a 30 ºC por 24 horas. Alíquotas foram retiradas de 3 em 3 horas para determinação do crescimento celular e consumo de açúcar. 4.8 Métodos analíticos 4.8.1 Concentração de açúcar redutor O consumo de xilose e glicose foi medido por ADNS (ácido dinitrossalicílico) (MILLER, 1959), utilizando-se 0,5 mL da amostra diluída e adicionando volume igual de solução de DNS nos tubos de ensaio, fervidos a seguir durante 5 minutos. A amostra foi resfriada e em seguida adicionou-se 4 mL de água destilada. Simultaneamente, foi feito um diagrama de calibração (Figura 5 do Apêndice A) mista de xilose e glicose (P.A. Labsynth). A leitura em espectrofotômetro (Modelo SP-22, BIOESPECTRO) foi feita a 540 nm. Os resultados foram expressos em g L -1 . 4.8.2 Concentração de Xilose A determinação da concentração de xilose foi feita através de uma técnica clínica que mede a concentração desta pentose no plasma sanguíneo ou urina, adaptado para as amostras de pré-hidrolisado da casca de uva. Para ser realizada a análise, o floroglucinol deve ser dissolvido numa solução de ácido acético e ácido clorídrico (9:1, v/v) até a concentração de 36 mMol/L. As pentoses formam, em meio ácido, um complexo colorido com o floroglucinol que se pode determinar através da leitura colorimétrica (EBERTS et al., 1979; JOHNSON et al., 1984). Para que a reação da solução ácida e xilose ocorressem foram pipetados em tubos de ensaio os reagentes de acordo com a Tabela 14. 32 Tabela 14 - Protocolo experimental para análise da concentração de xilose das amostras Tubo de referência Tubo do padrão Tubos das amostras Solução ácida (ác. acético e clorídrico) 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL Água destilada 0,1 mL -- -- Sol. padrão xilose (0,01%) -- 0,1 mL -- Amostras -- -- 0,1 mL Fonte: Adaptado de EBERTS et al., 1979; JOHNSON et al., 1984 Para melhor monitoramento foi feito um diagrama de calibração (Figura 6 do Apêndice A). A leitura foi feita em espectrofotômetro (Modelo SP-22, BIOESPECTRO) à 554 nm. Os resultados foram expressos em g L -1 . 4.8.3 Concentração de Glicose A concentração de glicose foi determinada pelo sistema colorimétrico para determinação de glicose (Doles TM). A metodologia consiste em adicionar glicose em uma solução tampão de fosfatos pH 7,4, contendo Glicose Oxidase, Peroxidase, 4-Aminoantipirina (4-AAP) e p-hidrobenzoato (reagente de cor), quando processam-se as seguintes reações: Glicose + O2 + H2O →GOD→→ Ácido Glucônico+ H2O2 2H2O2+ 4AAP →POD→→ 4-Antipirilquinonimina +4H2O O método é baseado na oxidação enzimática da glicose através da enzima glicose oxidase (GOD), resultando em ácido glucônico e peróxido de hidrogênio, onde este é somado a 4-aminoantipirina e 4 moléculas de água. O produto formado é 4- antipirilquinonimina, pela oxidação de 4-AAP, é de coloração rósea intensa e sua intensidade é diretamente proporcional à concentração de glicose na solução. Os reagentes são misturados e incubados em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos, a cor é medida em espectrofotômetro (Modelo SP-22, BIOESPECTRO) com absorção de 510 nm (Tabela 15). Foi feito um diagrama de calibração (Figura 7 do Apêndice A). Os resultados foram expressos em g L -1 . 33 Tabela 15. Protocolo experimental para determinação das concentrações de glicose nas amostras Tubo de referência Tubo das amostras Tubo do padrão Reagente de cor (kit Glucox) 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Solução padrão de glicose (0,01%) -- -- 20µL Amostras -- 20µL -- Fonte: Adaptado de TRINDER, 1969; BARHAM; TRINDER, 1972; WESTGARD et al., 1981 4.8.4 Determinação da relação entre massa celular seca e densidade óptica a 600 nm. As leveduras estudadas foram ativadas para a produção do inóculo conforme descrito no item 4.6.2. Posterior à padronização do inóculo inicial em uma Densidade Ótica (D.O) 600 nm de 0,8, em erlenmeyers de 250 mL com 50 mL do meio de cultivo base com concentração inicial de açúcares de 20 g L -1 , as culturas foram inoculadas separadamente, e conduzidas para incubação sob agitação de 150 rpm por 24 horas, a uma temperatura de 30 ºC. Após 24 horas, as células ativadas foram separadas por centrifugação a 2 g, por 20 minutos e utilizadas para o preparo de suspensão em 5 mL de água destilada. Foram retiradas alíquotas da suspensão para determinação de massa seca a 105 ºC por 24 horas, conforme metodologia descrita pela AOAC (Association of Analytical Chemistry, Official methods of Analysis). Uma amostra de 1 mL da suspensão foi utilizada para a realização das seguintes diluições 2x10 -2 , 3x10 -2 , 4x10 -2 , 5x10 -2 e 6x10 -2 . A regressão linear entre absorbância e massa seca celular (g L -1 ) permitiu a determinação da massa celular seca correspondente a uma unidade de D.O a 600 nm (Figuras 1, 2, 3 e 4 Apêndice A) (SILVEIRA, 2006). 4.8.5 Medida de Crescimento O crescimento dos micro-organismos foi estimado pela medida da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm. O valor da D.O foi convertida em massa celular, de acordo com a relação obtida no item 4.8.4 34 Equação 2. Produtividade Celular Px = Xf – X0 / tf (2) Onde: Xf = concentração biomassa final (g L -1 ); X0 = concentração biomassa inicial (g L -1 ); tf = tempo total de fermentação (horas), Px = produtividade em biomassa (g L.h -1 ). Equação 3. Conversão substrato a biomassa (g g -1 ) Yx/s = Xf- X0 / St – Sf (3) Onde: Xf= concentração produto final (g L -1 ); X0= concentração produto inicial (g L -1 ); St= concentração substrato total (g L -1 ); Sf = concentração substrato final (g L -1 ); Yx/s = fator de conversão substrato a produto (g g -1 ). 4.8.6 Determinação dos parâmetros de hidrólise A conversão do substrato (casca de uva) em açúcares foi medida pela equação 4. Equação 4.Conversão substrato a açúcares(g g -1 ) YS = CV/M (4) Onde: C = concentração final do produto (g L -1 ); V = volume final da solução líquida (L); M = massa seca da casca de uva utilizada no experimento (g); YS = fator de conversão de substrato a açúcares (g g -1 ). 4.8.7 Etanol O etanol obtido da fermentação do meio sintético foi determinado por cromatografia gasosa, após separação das células por centrifugação, utilizando Cromatógrafo - HP-5890 Série II - detector FID (Flame Ionization Detector), coluna – HP-FFAP (25 m x 0,2 mm x 0,3 μm); temperatura do forno de 70 ºC (mantendo esta temperatura por toda corrida - isotérmica); tempo da corrida de 3,2 min; temperatura do injetor de 250 ºC; temperatura do detector de 250 ºC; injeção de 40 μl de vapor da amostra. As amostras foram deixadas em “dryblock” a uma temperatura de 40 ºC (até atingir o equilíbrio). 4.8.7.1 Cálculos relacionados à produção etanólica Equação 5. Fator de conversão substrato a etanol (g g -1 ) YE/S = Ef – E0 / St – Sf (5) 35 Onde: Ef= concentração produto final (gL -1 ); E0= concentração produto inicial (gL -1 ); St= concentração substrato total (gL -1 ); Sf = concentraçã