UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química de Araraquara Alan Lima Vieira Novas estratégias de análise espectroquímica elementar de diferentes amostras Araraquara - SP 2020 ALAN LIMA VIEIRA Novas estratégias de análise espectroquímica elementar de diferentes amostras Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientador: Prof. Dr. José Anchieta Gomes Neto Araraquara - SP 2020 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA V657n Vieira, Alan Lima Novas estratégias de análise espectroquímica elementar de diferentes amostras / Alan Lima Vieira. – Araraquara : [s.n.], 2020 141 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: José Anchieta Gomes Neto 1. Espectroscopia de emissão com plasma induzido por laser. 2. Calibração. 3. Espectroscopia de absorção atômica. 4. Espectroscopia de emissão atômica. 5. Preparo de amostras (Química). I. Título. DADOS CURRICULARES 1. IDENTIFICAÇÃO Nome: Alan Lima Vieira Data de nascimento: 12 de julho de 1991 Nacionalidade: Brasileiro Naturalidade: Patos de Minas - MG Filiação: Sebastião Donizete Vieira Geralda de Fátima Vieira Nome em citações bibliográficas: VIEIRA, A. L.; VIEIRA, ALAN LIMA; VIEIRA, ALAN L.; VIEIRA, ALAN. Endereço eletrônico: alan.vieira@hotmail.com 2. Formação acadêmica 2.1. Graduação em Química - Bacharelado Universidade Federal de Viçosa, Campus Rio Paranaíba - UFV-CRP, Rio Paranaíba - MG. Período: 09/2009 - 02/2014. 2.2. Mestrado em Química. Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Araraquara - SP. Período: 03/2014 - 03/2016. 2.3. Doutorado em Química. Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Araraquara - SP. Período: 03/2016 - 06/2020 3. Artigos aceitos e submetidos para publicação 3.1. VIEIRA, A.L.; FERREIRA, E.C.; SANTOS JÚNIOR, D.; SENESI, G.S.; GOMES NETO, J.A. Spark discharge-assisted single-standard calibration in Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: determination of Al and P in agroindustrial samples. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, (Submetido). 3.2. FECHNER, D.C.; SILVA, T.V; NESPECA, M.G.; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A.; SANTOS JÚNIOR, D.; PELLERANO, R. G.; FERREIRA, E.C, Protected geographical identification of honey by laser-induced breakdown spectroscopy. Heliyon, (Submetido). 3.3. PÉREZ-RODRÍGUEZ, M.; DIRCHWOLF, P.M.; SILVA, T.V; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A.; PELLERANO, R. G.; FERREIRA, E.C, Fast spark discharge- laser-induced breakdown spectroscopy method for rice botanic origin determination. Food Chemistry, v. 331, p. 127051, 2020. 3.4. NESPECA, M.G.; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A.; SANTOS JÚNIOR, D.; FERREIRA, E.C. Potential of laser-induced breakdown spectroscopy for detection and quantification of adulterants in honey. Food Chemistry, v. 311, p. 125886, 2020. 3.5. VIEIRA, A.L.; MAURÍLIO, G.N.; PAVINI, W. FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. A user-friendly Excel spreadsheet for dealing with spectroscopic and chromatographic data. Chemometric and Intelligent Laboratory Systems, v. 194, p. 103816, 2019. 3.6. VIEIRA, A.L.; GONÇALVES, D.A.; VIRGILIO, A.; FERREIRA, E.C.; JONES, B.T.; DONATI, G.L.; GOMES NETO, J.A. Multi-Energy Calibration for the determination of non-metals by high-resolution continuum source molecular absorption spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, v. 34, n. 5, p. 972-978, 2019. 3.7. VIEIRA, A.L.; MIRANDA, K.; VIRGILIO, A.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Evaluation of an improved closed-vessel conductively heated digestion system for the analysis of raw meat samples by ICP techniques. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, v. 33, n. 8, p. 1354-1362, 2018. 3.8. VIEIRA, A.L.; SILVA, T.V.; SOUSA, F.S.I.; SENESI, G.S.; DÁRIO SANTOS JR, D.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Determination of phosphorus in fertilizers by electrical discharge assisted laser-induced breakdown spectroscopy. Microchemical Journal, v. 139, p. 322-326, 2018. 3.9. SOARES, F.S.C.; VIEIRA, A.L.; SOARES, M.S.; SANT’ANNA, M.V.; NASCENTES, R.; BOSSU, C.M. Construção de uma bomba peristáltica e de um sistema de detecção utilizando um hardware de código fonte aberto “arduino” para análise em fluxo. Química Nova, v. 41, n. 10, p. 1196-1199, 2018. 3.10. FORTUNATO, F.M.; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A.; DONATI, G.L.; JONES, B.T. Expanding the potentialities of standard dilution analysis: determination of ethanol in gasoline by Raman spectroscopy, Microchemical Journal, v. 133, p. 76-80, 2017. 3.11. MIRANDA, K.; VIEIRA, A.L.; BECHLIN, M.A.; FORTUNATO, F.M.; VIRGILIO, A.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Determination of Ca, Cd, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Mo, Na, Se, and Zn in Foodstuffs by Atomic Spectrometry After Sample Preparation Using a Low-Cost Closed-Vessel Conductively Heated Digestion System. Food Analytical Methods, v. 9, n. 7, p. 1887-1894. 2015. 3.12. MIRANDA, K.; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A. High-throughput sugarcane leaf analysis using a low cost closed-vessel conductively heated digestion system and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. Analytical Methods, v. 6, n. 23, p. 9503-9508. 2014. 4. Principais trabalhos apresentados em congressos 4.1. NESPECA, M.G.; VIEIRA, A.L.; GOMES NETO, J.A.; SANTOS JR, D.; FERREIRA, E.C. Detection of honey adulteration by laser-induced breakdown spectroscopy assisted by spark discharge (SD-LIBS) associated with chemometrics. 15th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2019, Mendoza, Argentina. 4.2. VIEIRA. A.L.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A., SANTOS JR, D.; SENESI, G.S. Spark discharge-assisted single-standard calibration in laser-induced breakdown spectroscopy: determination of Al and P in agroindustrial samples. 15th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2019, Mendoza, Argentina. 4.3. VIEIRA, A.L.; MAURÍLIO, G.N.; PAVINI, W.D.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Uma planilha do Excel amigável ao usuário para tratar dados espectroscópicos e cromatográficos. 6° Congresso Analitica Latin America, 2015, São Paulo - SP. 4.4. VIEIRA, A. L.; VIRGILIO, A.; FERREIRA, E. C.; GOMES NETO, J. A. Dried Blood Spot e determinação de Fe por espectrometria de absorção atômica: um estudo sistemático. 19º ENQA - Encontro Nacional de Química Analítica, 2018, Caldas Novas - GO. 4.5. VIEIRA, A.L.; SILVA, T.V.; SOUSA, F.S.I.; SENESI, G.S.; SANTOS JR, D.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Determination of phosphorus in fertilizers by laser-induced breakdown spectroscopy improved by laser-induced electrical discharge. Pittcon Conference & Expo, 2018, Orlando, Florida, EUA. 4.6. VIEIRA, A.L.; SILVA, T.V.; SANTOS JR, D.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Descarga elétrica induzida por laser como estratégia de melhoria em sensibilidade na determinação de fósforo em fertilizantes por LIBS. 5° Congresso Analitica Latin America, 2017, São Paulo - SP. • Prêmio de melhor trabalho científico apresentado na forma oral e pôster. 4.7. VIEIRA, A.L.; SILVA, T.V.; MORAIS, C.P.; SANTOS JUNIOR, D.; FERREIRA, E.C.; GOMES NETO, J.A. Evaluation of spark discharge as strategy to improve sensitivity in Laser Induced Breakdown Spectroscopy. 14th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2017, Vitória - ES. • Prêmio de melhor trabalho na sessão painel. (SAB/ELSEVIER prize by poster presentation). 4.8. VIEIRA, A. L.; MIRANDA, K.; GOMES NETO, J.A. Avaliação de um sistema de digestão assistida por aquecimento condutivo em frasco fechado para preparar amostras de carne visando à análise elementar. 4º Congresso Analitica Latin America, 2015, São Paulo - SP. 4.9. VIEIRA, A. L., RIBEIRO, L. L., SANTANA, M. V., SOARES, M. S., BABOS, D. V., CASTRO, J. P., RESENDE, M. O. Análise por injeção em fluxo empregando materiais alternativos e de baixo custo. 3º Congresso Analitica Latin America, 2013, São Paulo - SP. 4.10. CASTRO, J. P., RESENDE, M. O., BABOS, D. V., VIEIRA, A. L., SOARES, M. S., SOARES, F. S. C. Remoção de Cr (VI) de soluções aquosas utilizando adsorventes naturais. 3º Congresso Analitica Latin America, 2013, São Paulo - SP. 5. Outras atividades relevantes 5.1. Palestra “Inovações em Química: estratégias de baixo custo em instrumentação analítica”. 6° Semana Acadêmica de Química - SEAQ, Universidade Federal de Viçosa, Campus de Rio Paranaíba - MG, 28 de junho de 2019. 5.2. Pedido Nacional de Invenção: “Patente de Invenção (PI): Aperfeiçoamento em frasco de digestão de amostras por via úmida”, 25 de junho de 2019. Número do processo: BR 10 2019 013186 1. 5.3. Monitor do experimento “Digestão por via úmida assistida por aquecimento condutivo em frasco fechado (CHDS)”. XII workshop sobre preparo de amostras, Instituto de Química da Universidade de São Paulo, São Paulo - SP, 15 a 18 de abril de 2019. DEDICATÓRIA Aos meus pais Sebastião Donizete e Geralda de Fátima, pelo amor, carinho, apoio e estrutura familiar. À minha noiva Stela Alves pelo amor e compreensão. Ao meu irmão Alex Lima pelo companheirismo, incentivo e amizade. Aos meus avós, minha eterna gratidão. É com grande satisfação que lhes dedico este trabalho. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por todas as graças realizadas em minha vida. Aos meus pais Fátima e Sebastião pelos ensinamentos ao longo de minha vida e pelo esforço incondicional para que não me faltasse nada. À minha noiva e eterna companheira Stela, pelo seu amor, carinho, apoio e conselhos dedicados integralmente durante estes anos juntos. Obrigado por nunca medir esforços para tornar a minha vida melhor a cada dia. As minhas avós Isaura (In memorian) e Claudina (In memorian), as quais foram os alicerces durante a minha vida, principalmente durante a minha graduação em química. Ao meu irmão Alex pela amizade e companheirismo ao longo de toda minha vida. Ao Prof. Dr. José Anchieta pela orientação, oportunidade de crescimento profissional e pessoal, pelo exemplo de profissionalismo, além da nossa forte amizade. À profa. Dra. Edilene pela amizade e diversas contribuições dadas para o desenvolvimento deste trabalho. Aos meus amigos do grupo de espectroanalítica e automação (GEA), Maisa, João Victor, Sâmia, Leonardo, Raiane, Evilim, Matheus, João Varoni, os quais me ajudaram bastante diretamente e indiretamente para o desenvolvimento deste trabalho. Aos meus amigos que conheci durante na pós-graduação Felipe, Carol, Marcos, Luciana, Tiago, Juliana, Kelber, Eduana, Ariane, Mário, Carla, Thaila, Maurílio, Mariana, Augusto e Michael. Muito obrigado por todo companheirismo e amizade. Aos meus amigos da República Etanóis, André, Conrado, Daniel, Rodrigo, Rodolfo e Rosembergue, muito obrigado pelo companheirismo e momentos de descontração vivenciados. Ao programa de Pós-Graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” e ao Grupo de Espectroanalítica e Automação pela oportunidade de realização deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelos 44 meses de bolsa cedidos, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos 4 meses de bolsa concedidos. Aos meus amigos Prof. Dr. Alex V., Me. Felipe S. e Dr. Daniel G. que me ajudaram diretamente na execução de parte deste trabalho. Ao Prof. Dr. Fernando Barbosa pela doação dos papeis Whatman 903® utilizados neste trabalho. Obrigado a todos! “Se cheguei até aqui foi porque me apoiei no ombro dos gigantes” Isaac Newton RESUMO Novas estratégias de análise elementar por espectrometria atômica e molecular foram desenvolvidas e propostas visando melhoria em sensibilidade, calibrações mais simples e amostragem de sangue em papel. Um circuito de descarga elétrica (SD) de alta tensão, acoplado a espectrometria de emissão óptica com plasma induzido por laser (LIBS), permitiu aumentar a sensibilidade e determinar P em fertilizantes. O circuito elétrico fornece até 4,5 kV e produz descargas elétricas entre dois eletrodos de W durante o pulso do laser na amostra. A emissão aumenta por conta de mecanismos ainda pouco compreendidos como evolução prolongada da emissão, aumento do volume do plasma e/ou reaquecimento da pluma do plasma. A linha de emissão P(I) em 214,9 nm foi a escolhida para determinar P em fertilizantes empregando calibração externa com padrões sólidos (4,8 - 33,3% m m-1 P2O5) preparados a partir da mistura do material de referência 120c Phosphate Rock com um diluente (CaCO3, CaSO4, KCl e ureia). Curvas de calibração com bons coeficientes de correlação (≥ 0,993) foram obtidas com boa precisão (RSD ≤ 8%). O limite de quantificação (LOQ) foi 5,3 % m m-1. Os resultados obtidos por SD-LIBS foram concordantes ao nível de 95% de confiança (teste t-Student pareado) com aqueles obtidos pelo método comparativo baseado em digestão ácida e espectrometria de absorção atômica em chama de alta resolução com fonte contínua (HR-CS FAAS). O sistema SD-LIBS fez parte de outro estudo sobre um novo método de calibração com padrão único (SSC). O método requer a medida da intensidade de emissão (I) do padrão (Cstd) e da amostra (Camostra) a duas voltagens diferentes, de modo que Camostra = Cstd(Iamostra/Istd). Como prova de conceito, Al e P foram determinados em material foliar e fertilizantes, respectivamente. Para fins comparativos, as mesmas amostras foram analisadas empregando-se outras calibrações baseadas na razão das inclinações (SRC) e em multilinhas (MLC). Ainda, o P foi também determinado por HR-CS FAAS. Os resultados obtidos pelo método proposto foram concordantes com os valores certificados para Al, e com os valores obtidos para P por HR-CS FAAS. A precisão (RSD) das medidas foi  7 % para Al, e entre 4 e 10 % para P. Outra estratégia de calibração denominada calibração multi-energética (MEC) foi avaliada na determinação de Cl, N, P, S por espectrometria de absorção molecular de alta resolução com fonte contínua (HR-CS MAS) via formação de moléculas gasosas diatômicas de CaCl, NO, PO e CS, respectivamente. A determinação de cloreto em leite, e de N, P, e S em fertilizantes e insumos agrícolas pelo método proposto forneceu resultados concordantes (teste t-Student pareado) com os obtidos por calibração externa ao nível de 95 % de confiança. Ainda, as recuperações variaram de 97 a 109 % (Cl), 97 a 103 % (P), 99 a 109 % (S) e 98 a 99 % (N). A precisão (RSD) das medidas foi de aproximadamente 6, 3, 2 e 2 % para Cl, N, P e S respectivamente. O preparo de amostras de sangue para análise direta por HR-CS GFAAS denominada Dried Blood Spot (DBS) foi avaliada como estratégia para determinação direta e simultânea de Fe e Zn. As linhas alternativas escolhidas foram 446,165 nm e 307,572 nm (Fe) e 307,589 nm (Zn). O modificador permanente W prolongou a vida útil das plataformas e a adição de 3 µL de solução 15 % v v-1 H2O2 promoveu a estabilidade térmica e melhorou o perfil do pico de absorção transiente do Zn. As curvas analíticas (0,1 - 3 µg Fe; 0,5 - 50 ng Zn) empregaram discos de papel Whatman 903® impregnados com solução dos analitos. Os resultados de nove das dez amostras de sangue analisadas pelo método proposto foram concordantes com o método comparativo ao nível de 95 % de confiança. A precisão das medidas (RSD) foi ≤ 10 % tanto para Fe como Zn. Os LOQ obtidos para Fe (446,16 nm), Fe (307,572 nm) e Zn (307,589 nm) foram 67, 10,2 e 1,2 mg L-1, respectivamente. Palavras-chave: LIBS, SD-LIBS, SD-SSC LIBS, Calibração multi-energética, DBS. ABSTRACT New strategies for elementary analysis by atomic and molecular spectrometry were developed and proposed to improve sensitivity, simpler calibrations and blood samples on paper. A high voltage spark-discharge (SD) circuit, coupled to laser-induced breakdown spectrometry (LIBS), allowed to increase sensitivity and determine P in fertilizers. The electrical circuit delivers up to 4.5 kV and produces electrical discharges between two W electrodes triggered by laser pulse in the sample. Emission increases due to mechanisms that are still poorly understood, such as prolonged evolution of emission, increased plasma volume and/or reheating plasma plume. The emission line P (I) at 214.9 nm was chosen to determine P in fertilizers using external calibration with solid standards (4.8 - 33.3 % m m-1 P2O5) prepared from the mixture of the reference material 120c Phosphate Rock with a diluent (CaCO3, CaSO4, KCl and urea). Calibration curves with good correlation coefficients (≥ 0.993) were obtained with good precision (RSD ≤ 8 %). The limit of quantification (LOQ) was 5.3 % m/m. The results obtained by SD-LIBS were consistent at a 95 % confidence level (paired Student’s t-test) with those obtained by comparative method based on acid digestion and determination by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry with (HR-CS FAAS). The SD-LIBS system was part of another study on a new calibration method with a single standard (SSC). The method requires the measurement of the emission intensity (I) of the standard (Cstd) and the sample (Csample) at two different voltages, so that Csanple = Cstd (ISample / Istd). As a proof-of-concept, Al and P were determined in leaf material and fertilizers, respectively. For comparative purposes, the same samples were analyzed using other calibrations based on slope ratio (SRC) and multi-line (MLC). In addition, the P was also determined by HR-CS FAAS. The results obtained by the proposed method were in agreement with the values certified for Al, and with the values obtained for P by HR-CS FAAS. The accuracy (RSD) of the measurements was ≤ 7 % for Al, and between 4 and 10 % for P. Another calibration strategy called multi-energy calibration (MEC) was evaluated in the determination of Cl, N, P, S by high-resolution continuum source molecular absorption spectrometry (HR-CS MAS) via formation of gaseous diatomic molecules of CaCl, NO, PO and CS, respectively. The determination of chloride in milk, and of N, P, and S in fertilizers and agricultural inputs by the proposed method provided concordant results (paired Student’s t-test) with those obtained by external calibration at the 95 % confidence level. In addition, recoveries ranged from 97 to 109 % (Cl), 97 to 103 % (P), 99 to 109 % (S) and 98 to 99 % (N). The precision (RSD) of the measurements was approximately 6, 3, 2 and 2% for Cl, N, P and S respectively. The preparation of blood samples for direct analysis by HR-CS GFAAS called Dried Blood Spot (DBS) was evaluated as a strategy for direct and simultaneous determination of Fe and Zn. The alternative lines chosen were 446.165 nm and 307.572 nm (Fe) and 307.589 nm (Zn). The W permanent modifier extended the life of platforms and the addition of 3 µL of H2O2 (15 % v v-1) solution promoted thermal stability and improved the profile of the transient absorption peak of Zn. The analytical curves (0.1 - 3 µg Fe; 0.5 - 50 ng Zn) used Whatman 903® paper discs impregnated with analyte solution. The results of nine of ten blood samples analyzed by the proposed method were in agreement with the comparative method at a 95 % confidence level. Measurement accuracy (RSD) was ≤ 10 % for both Fe and Zn. The LOQ obtained for Fe (446.16 nm), Fe (307.572 nm) and Zn (307.589 nm) were 67, 10.2 and 1.2 mg L-1, respectively. Keywords: LIBS, SD-LIBS, SD-SSC LIBS, Multi-energy calibration, DBS. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Esquema ilustrativo dos principais componentes de um sistema LIBS. ............. 27 Figura 2 - Esquema ilustrativo dos principais eventos decorrentes durante o tempo de vida do plasma produzido por um laser com regime temporal de ns. ................ 28 Figura 3 - Esquema ilustrativo sobre a evolução temporal do plasma e as regiões de predominância das emissões relacionadas ao contínuo, átomos no estado fundamental e moléculas. .................................................................................... 29 Figura 4 - Esquema ilustrativo dos componentes utilizados em um sistema SD-LIBS. ...... 34 Figura 5 - Configurações SD-LIBS utilizadas para a análise de (a) amostras condutoras ou não condutoras e (b) amostras condutoras. .................................. 34 Figura 6 - Esquema ilustrativo dos principais componentes utilizados em um espectrômetro de absorção atômica. .................................................................... 41 Figura 7 - Ilustração esquemática de um espectrômetro de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua (HR-CS AAS) com ênfase nos seus principais componentes. ...................................................................................... 44 Figura 8 - Esquemas ilustrativos (a) entre as diferenças nas possibilidades de absorção de átomos e moléculas e (b) das transições vibracionais e (c) rotacionais características de moléculas diatômicas. .......................................... 46 Figura 9 - Denominação dos termos espectroscópicos utilizados para moléculas diatômicas. ........................................................................................................... 48 Figura 10 - Processo envolvendo DBS, da coleta até o laboratório. ...................................... 49 Figura 11 - Fotografia do sistema LIBS, (a) fonte do laser, (b) laser Nd:YAG de energia máxima de 50 mJ, (c) câmara de ablação e (d) espectrômetros HR2000+. ............................................................................................................ 58 Figura 12 - Circuito gerador de alta tensão: (a) diagrama do circuito eletrônico; fotografias das vistas (b) frontal e (c) interior do equipamento. ......................... 59 Figura 13 - Equipamento SD-LIBS: (a) ilustração da configuração experimental e (b) fotografia dos eletrodos, amostra e porta-amostra. ............................................. 60 Figura 14 - Fotografias da câmara de amostragem na parte superior e dos eletrodos na parte inferior. As fotos em (a), (b) e (c) correspondem ao sistema SD-LIBS desligado, LIBS em operação e SD-LIBS em operação, respectivamente. ........ 62 Figura 15 - Espectros LIBS (▬) e SD-LIBS (▬) obtidos para a amostra 04-14-08 e o espectro SD-LIBS (▬) obtido do branco analítico. Os espectros obtidos por SD-LIBS empregaram 4,5 kV. ...................................................................... 63 Figura 16 - Espectro do material de referência certificado (San Joaquim soil NIST 2709a) (▬) e da amostra 04-14-08 (▬) obtidos por SD-LIBS empregando 4,5 kV. ................................................................................................................. 65 Figura 17 - Intensidade de emissão da linha P (I) 214,9 nm (n = 3) em função da tensão aplicada entre os eletrodos. ...................................................................... 66 Figura 18 - Intensidade da linha de emissão P (I) 214,9 nm (n = 3) em função da distância das pontas dos eletrodos empregando a tensão de 4,5 kV. .................. 67 Figura 19 - Curva de calibração (n = 3) obtida por SD-LIBS (4,5 kV) empregando a linha P (I) 214,9 nm para determinação de P2O5 em fertilizantes. ...................... 69 Figura 20 - Ilustração de curvas de intensidade versus tensão obtidas para (a) padrão único de calibração, (b) amostra e (c) sobreposição das áreas em ambos os gráficos. ............................................................................................................... 78 Figura 21 - Perfis dos picos obtidos com LIBS (▬) e SD-LIBS (4,5 kV) (▬) para (a) P no CRM NIST 120c e (b) Al no CRM NIST 1515. ......................................... 81 Figura 22 - Curvas de tensão versus intensidade (n = 3) para (a) Al (I) 308,2 nm em CRMs de folhas de plantas e (b) P (I) 214,9 nm no CRM NIST 120c e nas amostras. .............................................................................................................. 82 Figura 23 - Influência do número de espectros nas intensidades médias para (○) a linha de emissão Al (I) 308,2 nm no CRM NIST 1515 e para (●) a linha de emissão P (I) 214,9 nm no CRM NIST 120c obtidas por SD-LIBS empregando 4,5 kV. ............................................................................................ 84 Figura 24 - Espectro de absorção molecular obtido por HR-CS GFMAS para a molécula de CaCl (a) e por HR-CS FMAS para as moléculas de NO (b), PO (c) e CS (d) para o branco e as soluções S1 e S2. ......................................... 95 Figura 25 - Influência da massa (a) do Ca e (b) do Pd nos sinais de absorbância para a molécula de CaCl determinada por HR-CS GFMAS. ......................................... 97 Figura 26 - Curvas de pirólise (triângulos) e vaporização (círculos) (a) para amostras de suspensão de leite em pó (NIST-1549, contendo 500 ng Cl) na ausência (▬) e presença (▬) de Pd e (b) perfis dos pico transientes para a molécula de CaCl sob as mesmas condições. ..................................................................... 97 Figura 27 - Curvas de calibração para PO, NO, CS e CaCl obtidas via MEC sem (à esquerda) e após (à direita) a remoção de outliers. ........................................... 101 Figura 28 - Efeito da concentração de Ca na determinação de 1000 mg L-1 de P utilizando MEC e calibração externa (EC). ...................................................... 103 Figura 29 - Fotografias do tubo contendo a amostra de sangue (a) e do DBS produzido com papel Whatman 903® (b). .......................................................................... 108 Figura 30 - Fotografias de 50 µL de sangue depositado no papel (a), DBS após a retirada de 7 discos menores (b) e destaque de um disco sobre régua (c). ........ 111 Figura 31 - Correlação entre volume de sangue depositado e área do DBS (n = 3) calculada pelo software ImageJ. ....................................................................... 113 Figura 32 - Plataforma de grafite contendo discos de DBS antes (a) e depois (b) de um ciclo completo de aquecimento. ........................................................................ 115 Figura 33 - Curvas de pirólise (triângulos) e de atomização (círculos) em meio aquoso (▬) e em amostra (▬). ..................................................................................... 116 Figura 34 - Espectro de absorção resolvido no tempo e comprimento de onda para o Fe na linha 446,165 nm. ......................................................................................... 116 Figura 35 - Curvas de temperatura de pirólise (triângulos) e de atomização (círculos) referentes a 20 ng Zn em padrão aquoso sobre papel (▬) e em amostra de DBS (▬). .......................................................................................................... 117 Figura 36 - Efeito da presença de Pd/Mg (2,5 µg de Pd e 1,25 µg de Mg) e H2O2 (3 µL de solução 15 %, v v-1) em uma amostra de DBS e em um padrão aquoso sobre papel (20 ng Zn). ..................................................................................... 118 Figura 37 - Curvas de temperatura de pirólise (triângulos) e de atomização (círculos) para Fe-307,572 nm e Zn-307,589 nm em meio de uma amostra de DBS (▬) e em solução aquosa contendo 20 ng Zn e 2 µg Fe (▬). Modificador: 3 µL de solução 15% v v-1 H2O2. ...................................................................... 119 Figura 38 - Espectros de absorção atômica resolvidos no tempo e comprimento de onda do Zn e do Fe presentes em uma amostra de DBS empregando H2O2 como modificador químico. .............................................................................. 120 Figura 39 - Massas de Fe e Zn determinadas em diferentes partes (A, B, C e D) de um DBS obtido após adição de 200 µL e 50 µL de sangue. ................................... 121 Figura 40 - Curvas de calibração para (a) Fe-446,165 nm, (b) Fe-307,572 nm e (c) Zn- 307,589 nm obtidas com padrão aquoso depositado sobre papel empregando SS HR-CS GFAAS. ...................................................................... 123 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Métodos de aumento de sensibilidade em LIBS empregando modificações instrumentais ....................................................................................................... 31 Tabela 2 - Determinações elementares empregando DBS. .................................................. 51 Tabela 3 - Massas de CRM NIST 120c e da matriz empregadas na produção dos padrões sólidos utilizados para determinar P por SD-LIBS ................................ 57 Tabela 4 - Parâmetros instrumentais utilizados para a determinação de P2O5 ..................... 61 Tabela 5 - Resultados da determinação (média ± SD, n = 3) de P expressos como % (m m-1) P2O5 nas amostras e no CRM NIST 120c obtidas por SD-LIBS e HR-CS FAAS ...................................................................................................... 70 Tabela 6 - Resultados comparativos (média  desvio padrão) para a determinação (n = 3) de P (expresso como % m m-1 P2O5) em amostras de fertilizantes e de Al (mg kg-1) em CRM de folhas de plantas obtidas por SD-SSC LIBS, SRC e MLC ......................................................................................................... 84 Tabela 7 - Condições operacionais utilizadas nas determinações de Cl por HR-CS GFMAS e N, S e P por HR-CS FMAS ............................................................... 93 Tabela 8 - Resultados (média ± desvio padrão, n = 3) das recuperações obtidas de Cl em leite por HR-CS GFMAS, e de N, P e S e insumos por HR-CS FMAS, utilizando MEC e calibração externa (EC) ......................................................... 98 Tabela 9 - Determinações (n = 3, média ± desvio padrão, % m m-1) por MEC e calibração externa (EC) para a determinação de Cl por HR-CS GF MAS e N, P (expresso como P2O5) e S por HR-CS FMAS ............................................ 99 Tabela 10 - Parâmetros instrumentais da HR-CS FAAS utilizados para determinar Fe e Zn simultâneo .................................................................................................... 110 Tabela 11 - Programa de aquecimento utilizado para o recobrimento da plataforma de grafite com W como modificador permanente .................................................. 111 Tabela 12 - Programas de aquecimento otimizados para a determinação de apenas Fe (446,165 nm) e de Fe (307,572 nm) em conjunto com Zn (307,589 nm) em DBS por SS HR-CS GFAAS ............................................................................ 111 Tabela 13 - Resultados comparativos (média  sd, n = 3) da determinação de Fe e Zn em DBS (mg L-1) pelo método proposto (SS HR-CS GFAAS) e pelo método comparativo (HR-CS FAAS) ............................................................... 123 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AAS Atomic absorption spectrometry, espectrometria de absorção atômica CCD Charge coupled device, dispositivo de carga acoplada CF-LIBS Calibration-free LIBS, LIBS sem calibração ChemCam Chemical camera CRM Certified reference material, material de referência certificado CS Continuum source, Fonte contínua DBS Dried blood spot, Sangue seco em papel DDS Direct solid sampling, Análise direta de sólidos DEMON Double-Echelle Monochromator, monocromador echelle duplo. DP-LIBS LIBS double pulse, LIBS duplo pulso F Farad, unidade de capacitância FAAS Flame atomic absorption spectrometry, espectrometria de absorção atômica em chama FWHM Full width at half maximum, Largura à meia altura GC-CVAFS Gas chromatography coupled to cold-vapour atomic fluorescence spectrometry, Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de fluorescência atômica a vapor frio GFAAS Graphite furnace atomic absorption spectrometry, espectrometria de absorção atômica em forno de grafite HCL Hollow cathode lamp, Lâmpada de cátodo oco HR-CS FAAS High-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry, Espectrometria de absorção atômica em chama com fonte contínua e alta resolução HR-CS GFAAS High-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry, Espectrometria de absorção atômica em chama com fonte contínua e alta resolução HR-CS MAS High-resolution continuum source molecule absorption spectrometry, Espectrometria de absorção molecular com fonte contínua e alta resolução Hz Hertz, unidade de medida da frequência ICP OES Inductively coupled plasma optical emisson spectrometry, Espectrometria de emissão óptica com plasma induzido ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry, Espectrometria de massa acoplada ao plasma induzido IS Internal standardization, Padronização interna kV Kilovolts LA-ICP-MS Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry, Ablação a laser com espectrometria de massa acoplada ao plasma induzido LA-ICP-TOF-MS Laser ablation inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry, Ablação a laser com espectrometria de massas por tempo de voo acoplada ao plasma induzido Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificação de luz por emissão estimulada de radiação LIBS Laser-induced breakdown spectrometry, Espectrometria de emissão óptica em plasma induzido por laser LIFS Laser induced fluorescence spectrometry, Espectrometria de fluorescência induzida por laser LOD Limit of detection, Limite de detecção LOQ Limit of quantification, Limite de quantificação LSBC Least square background correction, Correção de fundo por mínimos quadrados. m m-1 Massa por massa MAS Molecular atomic spectrometry, espectrometria de absorção molecular MEC Multi-energy calibration, Calibração com múltiplas energias MLC Multi-lines calibration, Calibração com múltiplas linhas MMC Matriz-matching calibration, Calibração com compatibilização de matriz MS Mass spectrometry, espectrometria de massas Nd:YAG Neodymium-Doped Yttrium Aluminium Garnet, Íon Nd+3 incorporado no cristal de YAG - granada de ítrio e alumínio, Y3Al5O12 NIST National Institute of Standards and Technology, Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia OP GSA One point gravimetric standard addition r Coeficiente de correlação linear R2 Coeficiente de determinação RELIBS Resonance-enhanced LIBS, LIBS ressonante RSC Slope ratio calibration, Calibração por razão das inclinações RSD Relative standard deviation, desvio padrão relativo S/R Razão sinal ruído SA Standard addition, Adição de padrão SD-LIBS Spark discharge laser-induced breakdown spectrometry, Descarga elétrica acoplada a espectrometria de emissão óptica em plasma induzido por laser SD-SSD LIBS Spark-discharge assisted single standard calibration, Calibração com padrão único assistida por descarga elétrica SIMAAC Simultaneous multielement atomic absorption continuum source spectrometer, Espectrômetro de absorção atômica com fonte contínua multielementar simultâneo STPF Stabilized Temperature Platform Furnace, forno plataforma com temperatura estabilizada TPCT Two-point calibration transfer UV Ultravioleta v v-1 Volume por volume VIS Visível λ Comprimento de onda Ω Ohm, unidade de medida da resistência elétrica SUMÁRIO 1. Introdução .......................................................................................................................... 21 2. Revisão bibliográfica ......................................................................................................... 24 2.1. Espectrometria de emissão óptica com plasma induzido por laser ............................ 24 2.1.1. Histórico ............................................................................................................ 24 2.1.2. Fundamentos ..................................................................................................... 26 2.1.3. Estratégias de aumento de sensibilidade ........................................................... 30 2.1.3.1. LIBS com descarga elétrica ......................................................................... 33 2.1.4. Calibração em LIBS para análise de amostras sólidas ...................................... 37 2.2. Espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua ............ 40 2.2.1. Histórico ............................................................................................................ 40 2.2.2. Instrumentação .................................................................................................. 43 2.2.3. Espectrometria de absorção molecular de alta resolução com fonte contínua.. 45 2.2.4. Análise direta de DBS para determinação elementar ....................................... 48 3. Objetivos ............................................................................................................................. 53 3.1. Objetivos específicos .................................................................................................... 53 4. Descarga elétrica como estratégia de aumento de sensibilidade em LIBS: determinação de fósforo em fertilizantes ......................................................................... 54 4.1. Introdução .................................................................................................................... 55 4.2. Materiais e métodos ..................................................................................................... 56 4.2.1. Reagentes, preparo de amostras e padrões analíticos ....................................... 56 4.2.2. Instrumentação em LIBS .................................................................................. 57 4.2.2.1. Sistema SD-LIBS .......................................................................................... 58 4.2.3. Análise das amostras por SD-LIBS .................................................................. 60 4.2.4. Método comparativo para a determinação de fósforo em fertilizante .............. 61 4.2.4.1. Digestões ácidas assistida por radiação micro-ondas ................................ 61 4.2.4.2. Determinação de P por HR-CS FAAS ......................................................... 61 4.3. Resultados e discussão ................................................................................................. 61 4.3.1. Escolha da linha de emissão de fósforo ............................................................ 63 4.3.2. Otimização do sistema SD-LIBS ...................................................................... 65 4.3.2.1. Estudo sobre a tensão aplicada ................................................................... 65 4.3.2.2. Otimização do posicionamento dos eletrodos .............................................. 66 4.3.3. Determinação de P por SD-LIBS ...................................................................... 68 4.4. Conclusões parciais ..................................................................................................... 70 5. Calibração com padrão único assistida por descarga elétrica em LIBS: determinação de Al e P em amostras agroindustriais .................................................... 72 5.1. Introdução .................................................................................................................... 73 5.2. Materiais e métodos ..................................................................................................... 75 5.2.1. Instrumentação .................................................................................................. 75 5.2.2. Reagentes e amostras ........................................................................................ 75 5.2.3. Preparo de amostra e procedimentos analíticos ................................................ 76 5.2.4. Fundamentação da metodologia SD-SSC LIBS ............................................... 77 5.2.5. Estratégias comparativas de calibração com único padrão ............................... 79 5.3. Resultados e discussão ................................................................................................. 80 5.3.1. Escolha das linhas analíticas para determinação de Al e P ............................... 80 5.3.2. Influência da tensão na intensidade de emissão ................................................ 82 5.3.3. Influência do número de espectros por replicata .............................................. 83 5.3.4. Determinação de Al e P com métodos de calibração com padrão único .......... 83 5.4. Conclusões parciais ..................................................................................................... 87 6. Calibração multi-energética para a determinação de não-metais por espectrometria de absorção molecular com fonte contínua e alta resolução ............... 88 6.1. Introdução .................................................................................................................... 89 6.2. Materiais e métodos ..................................................................................................... 90 6.2.1. Instrumentação .................................................................................................. 90 6.2.2. Reagentes .......................................................................................................... 91 6.2.3. Amostras e procedimentos analíticos................................................................ 91 6.3. Resultados e discussão ................................................................................................. 94 6.3.1. Otimização das condições experimentais ......................................................... 95 6.3.2. MEC: desempenho analítico ............................................................................. 98 6.4. Conclusões parciais ................................................................................................... 103 7. Determinação direta e simultânea de Fe e Zn em sangue por HR-CS GFAAS empregando DBS ............................................................................................................. 105 7.1. Introdução .................................................................................................................. 106 7.2. Materiais e métodos ................................................................................................... 108 7.2.1. Reagentes, soluções e amostras ...................................................................... 108 7.2.2. Instrumentação ................................................................................................ 109 7.2.3. Procedimento de determinação de Fe e Zn em DBS ...................................... 110 7.2.3.1. Determinação de Fe e Zn pelo método comparativo ................................. 112 7.3. Resultados e discussão ............................................................................................... 112 7.3.1. Procedimento de amostragem e escolha da linha analítica ............................. 112 7.3.1.1. Cálculo do volume de sangue nos discos removidos para análise ............ 113 7.3.1.2. Escolha das linhas analíticas para determinações de Fe e Zn .................. 114 7.3.2. Programa de aquecimento nas determinações de Fe e Zn .............................. 114 7.3.3. Distribuição de Fe e Zn no DBS ..................................................................... 120 7.3.4. Determinação de Fe e Zn em DBS por HR-CS GFAAS ................................ 122 7.4. Conclusões parciais ................................................................................................... 124 8. Conclusões ........................................................................................................................ 125 Referências ............................................................................................................................ 127 21 1. Introdução A química analítica tem por missão propor os meios para a determinação de uma ou mais espécies químicas em diferentes materiais. De um modo geral, ela desempenha o papel de aprimorar os métodos analíticos estabelecidos, aplicá-los para novos tipos de amostras e desenvolver novos métodos mais robustos e eficientes (1). O químico analítico desempenha um papel que consiste em uma tarefa interminável, não podendo haver vitória final, embora haja muitos sucessos e triunfos ao longo do caminho (2). Por conseguinte, a química analítica é demandada por necessidade crescente de procedimentos analíticos quantitativos que sejam rápidos, exatos, precisos, com pouco ou nenhum consumo de reagentes, com mínimo ou nenhum preparo de amostra, e que não sejam dispendiosos. A espectrometria de emissão óptica com plasma induzido por laser, conhecida como Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS), é uma técnica espectroquímica que se destaca por promover análise multielementar direta ou com mínimo preparo da amostra, possuir instrumentação versátil para análise de amostras sólidas, líquidas ou gasosas, de forma rápida, minimamente destrutiva e com mínima geração de resíduos, permitir aplicações em ambientes laboratoriais, remotos e insalubres (3–5). Portanto, LIBS desempenha um papel importante na área da química analítica, contribuindo com diversas aplicações em que outras técnicas espectroanalíticas consolidadas não são capazes de atingir. Em contrapartida, LIBS contém uma limitação relacionada a baixa sensibilidade, quando comparada a outras técnicas espectroanalíticas (6–8). Além do mais, a análise quantitativa de amostras sólidas, apesar de vantajosa em vários aspectos, tem como limitação a calibração com padrões sólidos, por conta da disponibilidade restrita de material de referência ou padrões sólidos para diferentes matrizes e vários analitos em diferentes concentrações. Assim como LIBS, a espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua, conhecida como High-Resolution Continuum Source Atomic Absorption Spectrometry (HR-CS AAS) é uma técnica com importante presença em química analítica. Entre as suas principais características estão (i) alta resolução obtida pelo arranjo óptico e detector CCD, (ii) fonte contínua de alta intensidade de emissão que possibilita determinações entre 190 nm a 900 nm, (iii) corretor de fundo espectral através do algoritmo de mínimos quadrados, LSBC, (iv) monitoramento dos sinais de absorção em três dimensões, absorbância x comprimento de onda x tempo; (v) amostragem direta de sólidos combinada com atomização eletrotérmica em forno de grafite (HR-CS GFAAS) (9,10). Diferentemente dos equipamentos de absorção atômica convencionais, a HR-CS AAS tornou-se possível a 22 separação e visualização das diversas linhas rotacionais de moléculas diatômicas tipicamente separadas por apenas 10 a 25 pm (9,11). Neste momento, as linhas de absorção rotacionais passaram a ser utilizadas para fins analíticos e não tratadas como interferências espectrais. Embora várias linhas de absorção molecular estejam disponíveis para fins quantitativos, a maioria dos trabalhos publicados utiliza calibração externa convencional, ou seja, fixa-se um comprimento de onda e mede-se a absorbância de uma série de soluções contendo diferentes concentrações do analito. A calibração externa, como mencionada, é simples, de fácil interpretação e amplamente utilizada. Por outro lado, está sujeita a interferências causadas por efeitos de matriz (i.e., diferenças nas propriedades físicas e químicas entre os padrões de calibração e a amostra) e interferências espectrais (12). Nesse contexto, estudos relativos a novos métodos de calibração apresentam-se como promissores. A análise direta de amostras sólidas, conhecida como Direct Solid Sampling (DSS), associada a HR-CS GFAAS constitui outra vantagem relevante que merece destaque porque requer o mínimo preparo da amostra, podendo até dispensar o preparo convencional da amostra, evitando etapas morosas, reagentes tóxicos e possibilidade de contaminação (13). Esta estratégia tem sido utilizada para análise de sangue seco impregnado em papel filtro especial (DBS), principalmente para a determinação de Pb (14,15). A estratégia DBS é muito promissora para análise de sangue, visto que a amostragem é minimamente invasiva, a qual utiliza apenas alguns microlitros de sangue depositados em papel, que por sua vez permite a coleta em locais remotos sem a necessidade de refrigeração, simplificando o transporte até o local de análise (16). Por conseguinte, a utilização de DBS em HR-CS GFAAS é promissora para determinação de não apenas de elementos tóxicos, mas também no âmbito de elementos essenciais. Esta Tese de Doutorado descreve o desenvolvimento de quatro estratégias analíticas empregando LIBS e HR-CS AAS que estão divididas e apresentadas em capítulos singulares. Uma síntese de cada estratégia estudada está apresentada a seguir. Um circuito de descarga elétrica, conhecido como Spark-Discharge (SD) de alta tensão foi projetado para ser acoplado ao sistema LIBS como estratégia de aumento de sensibilidade na determinação de fósforo em fertilizantes. Neste trabalho é abordado (i) o desenvolvimento de um circuito elétrico para produção de alta tensão, o qual foi conectado a dois eletrodos de tungstênio, (ii) o estudo sobre as melhores linhas de emissão para a determinação de P, (iii) a otimização da tensão aplicada, e (iv) a otimização da posição dos eletrodos. As amostras foram moídas, secas e compactadas na forma de pastilhas para posterior determinação com o sistema SD-LIBS desenvolvido. O LIBS convencional não 23 forneceu intensidade de emissão suficiente para as determinações de P. Os resultados obtidos demonstram que a estratégia SD-LIBS é simples, de baixo custo e robusta para aumento de sensibilidade em LIBS, bem como para a determinação de P e fertilizantes comerciais. O sistema SD-LIBS foi utilizado no desenvolvimento de um novo método de calibração com padrão único, conhecida como Single Standard Calibration (SSC). Considerando que o aumento da tensão aplicada entre os eletrodos aumenta a intensidade de emissão, o método se fundamenta na medida da intensidade de emissão (I) do padrão (Cstd) e da amostra (Camostra) a duas voltagens diferentes, de modo que Camostra = Cstd(Iamostra/Istd). O método desenvolvido foi aplicado como prova de conceito para as determinações de Al em amostras de folhas e P em amostras de fertilizantes. Neste trabalho faz-se um estudo comparativo entre o método proposto e outras estratégias de calibração com padrão único recentemente propostas na literatura, como a calibração baseada na razão das inclinações, conhecida como Slope Ratio Calibration (SRC) e a calibração multilinhas, conhecida como Multi Lines Calibration (MLC). Os resultados obtidos com o método proposto realçam que a estratégia SD-SSC LIBS tem potencial analítico duplo por contornar as limitações relativas a sensibilidade e calibração com padrões sólidos. Outra abordagem da calibração multilinhas denominada calibração multi-energética, conhecida por Multi-Energy Calibration (MEC), foi estudada para a determinação de não metais por espectrometria de absorção molecular de alta resolução com fonte contínua, conhecida como High-Resolution Continuum Source Molecular Absorption Spectrometry (HR-CS MAS). O capítulo em questão aborda uma nova estratégia de calibração aplicada a determinação não metais utilizando diversas linhas de absorção rotacionais de moléculas diatômicas, as quais são registradas simultaneamente na estreita janela espectral do espectrômetro. Os elementos Cl, N, P e S foram determinados via CaCl, NO, PO e CS, respectivamente. A estratégia MEC utiliza várias linhas de absorção do analito para a calibração, analisando apenas duas soluções, uma contendo uma mistura de amostra e padrão, e outra solução contendo amostra e branco. Neste trabalho foi abordada a possibilidade de MEC corrigir interferências espectrais e não espectrais. Os resultados corroboram que a estratégia MEC é promissora para a determinação de não metais por HR-CS MAS. A coleta e armazenamento de amostras de sangue em papel cartão, conhecida como Dried Blood Spot (DBS) foi avaliada como estratégia para a determinação direta e simultânea de Fe e Zn em sangue empregando DSS HR-CS GFAAS. O procedimento de amostragem DBS é simples e minimamente invasivo no que se refere a coleta do sangue. As amostras em DBS foram introduzidas via amostrador de sólidos do equipamento HR-CS GFAAS. A 24 detecção e determinação conjunta, simultânea dos elementos Fe e Zn nas linhas de absorção 307,572 nm e 307,589 nm, respectivamente, por HR-CS GFAAS é tratada pela primeira vez na literatura. Um estudo sistemático a respeito da influência do volume depositado de sangue, dos efeitos de migração diferencial (área do DBS escolhida) foi feito e seus resultados sugerem boa correlação entre volume de sangue e área do DBS, o que facilita expressar a concentração dos analitos em mg por litro. 2. Revisão bibliográfica Considerando os quatro trabalhos que motivaram o desenvolvimento desta Tese de Doutorado, nesta revisão bibliográfica são abordados contextos históricos e fundamentais para as técnicas LIBS e HR-CS AAS. Com relação a primeira, a revisão ainda engloba estratégias de aumento de sensibilidade e de calibração. A respeito da HR-CS AAS, a revisão bibliográfica abrange uma contextualização sobre absorção molecular por espécies diatômicas, bem como uma revisão sobre DBS em determinações elementares. 2.1. Espectrometria de emissão óptica com plasma induzido por laser 2.1.1. Histórico A técnica LIBS utiliza um pulso de laser focalizado sobre a superfície da amostra para promover a vaporização, atomização e excitação dos elementos constituintes. Os fundamentos da LIBS remontam nos estudos da emissão estimulada proposta por Einstein em 1917. Entretanto, devido à falta de recursos tecnológicos da época, o primeiro dispositivo de amplificação da luz por emissão estimulada de radiação, conhecido como Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (Laser), foi produzido apenas em 1960 por Theodore Maiman (17). Posteriormente, em 1962 no X Colóquio Internacional de Espectroscopia em Maryland, Brech e Cross (18) apresentaram um trabalho com o uso de um plasma produzido por um laser de rubi como fonte espectral. Neste trabalho, uma descarga elétrica produzida entre dois eletrodos de cobre conectados a um capacitor carregado foi utilizada como fonte auxiliar de excitação para registrar o espectro do ferro de uma lâmina de barbear (19). Este 25 fato é considerado como o “nascimento” da técnica LIBS (20). Apesar de Brech e Cross não terem publicado o trabalho em um periódico científico, o resumo apresentado em Maryland está disponível no periódico Applied Spectroscopy (21). Nos anos subsequentes, vários avanços significativos foram alcançados. Em 1963, Debras-Guédon e Liodec (22) relataram o primeiro uso de laser para análise espectroscópica de superfície. No mesmo ano, Rosan, Healy e McNary (23) utilizaram um laser de rubi e dois eletrodos de grafite para fazer a análise simultânea de Be, Ca, Cu, Fe, Mn e Zn em tecidos biológicos de camundongos. Em 1964, Maker et al., (24) fizeram a primeira observação óptica de um gás utilizando laser. Um ano mais tarde, Runge et al., (25) propuseram a primeira aplicação de um laser de rubi pulsado, sem o uso de outra fonte de excitação, para a análise Cr e Ni em liga de ferro. Curvas de calibração linear para Cr e Ni foram obtidas com precisão de 3,8 e 5,3 %, respectivamente. De 1964 a 1967, os equipamentos LIBS mais notáveis comercializados foram Jarrell- Ash (Estados Unidos da América), VEB Carl Zeiss (Alemanha) e JEOL (Japão). Estes equipamentos empregavam um laser para vaporização da amostra e dois eletrodos para excitação dos elementos vaporizados (4,19). Contudo, o alto custo desses equipamentos, a dificuldade de competir em precisão com espectroscopia de centelha e a ascensão de outras técnicas espectroanalíticas (e.g., GFAAS e espectrometria de emissão óptica com plasma induzido (ICP OES)), levaram a um declínio no entusiasmo da LIBS até o final da década de 70 (26). De certa forma, até o início da década de 80, LIBS foi tratada mais como uma curiosidade científica, e a literatura se dedicava mais a estudos teóricos sobre plasmas e lasers do que aplicações analíticas (3). Em 1971, Ready (27) publicou a primeira monografia abrangente com o foco em estudos experimentais e teóricos da LIBS. Entre 1960 e 1980, na Rússia houve muitos estudos teóricos importantes sobre plasma e laser, o que levou o pesquisador Raizer a fazer uma compilação destes principais estudos em seu livro Laser-Induced Discharge Phenomena, publicado em inglês em 1977 (4,28). A partir de 1980, as aplicações empregando a técnica LIBS passaram a caminhar alinhadas com o desenvolvimento instrumental (26). Em 1989 Radziemski e Cremers (29) editaram o livro Laser Induced Plasmas and Applications, no qual condensaram os aspectos físicos, químicos e as aplicações relevantes até o final da década de 80. No início da década de 90, os avanços tecnológicos relativos a lasers mais compactos, robustos e de menor custo, assim como detectores mais sensíveis, com maior resolução espectral e temporal (20,30), proporcionaram aplicações envolvendo a interrogação 26 da amostra de forma remota, in situ, com mínimo ou nenhum preparo, com rapidez e simplicidade, permitindo aplicações antes inconcebíveis por outras técnicas espectroanalíticas. No início da década de 2000, Lazic et al., (31) propuseram a aplicação da LIBS para análise de amostras submersas em água do mar, sendo empregado um LIBS de duplo pulso para exploração arqueológica in situ. Esses autores demonstraram a possibilidade de diferenciar amostras de mármore e de rocha calcária, bem como a análise quantitativa de Cu, Pb, Sn, e Zn em ligas metálicas. Em seguida, Guirado et al., (32) desenvolveram um equipamento LIBS portátil para reconhecimento e identificação de materiais arqueológicos submersos até 30 metros de profundidade em água do mar. Os resultados deste trabalho demonstraram a capacidade da LIBS para análise in situ de amostras de bronze com alto grau de oxidação no mar mediterrâneo. Em 2004, a LIBS foi proposta para o desenvolvimento da ChemCam para ser incorporada ao Rover Curiosity (33), o qual foi enviado a Marte em 2012 para analisar rochas no solo da cratera de Gale em Marte (5,33,34). Vários espectros de emissão foram enviados a Terra, evidenciando a versatilidade e potencialidade da LIBS para exploração espacial. Talvez esta seja a aplicação mais popular para a LIBS até o momento. Neste ponto, considerando o sucesso da LIBS em diversas aplicações geológicas, arqueológicas, exploração espacial, entre outras, fica evidente que esta técnica espectroanalítica constitui uma ferramenta analítica importante, principalmente em relação a análise de amostras sólidas, evitando etapas morosas de preparo antes da análise propriamente dita. Portanto, LIBS é uma das técnicas mais promissoras em química analítica qualitativa e quantitativa. 2.1.2. Fundamentos A LIBS se baseia na espectrometria de emissão óptica, a qual faz a observação da radiação emitida por espécies excitadas em um plasma com temperaturas da ordem de 10000 a 20000 K (3,30,35). Os componentes primordiais desta técnica são: laser, controlador do laser, lentes de focalização do laser, lentes coletoras da radiação emitida pelas espécies excitadas no plasma, cabo de fibra óptica para condução da radiação emitida, espectrômetro para separação dos comprimentos de onda, detector e computador para registro dos espectros de emissão. Um esquema ilustrativo de um sistema LIBS está apresentado na Figura 1. Cabe 27 informar que, cada sistema LIBS contém suas peculiaridades, a depender da aplicação desejada. Com relação a instrumentação apresentada, o laser é a parte mais importante, visto ser fundamental para promover a ruptura dielétrica das ligações químicas da amostra e formação do respectivo plasma. Neste sentido, há pulsos de laser com alta irradiância, da ordem de GW cm-2, e regime temporal entre nano, pico ou femtossegundos (3,30,36). Embora haja diversos tipos de lasers para uso em LIBS, tais como os lasers de excímeros (i.e. ArF, KrF e XeCl), microchip, N2, CO2, Ti:Safira e Nd:YAG (íon Nd+3 incorporado no cristal de YAG - granada de ítrio e alumínio, Y3Al5O12). Em parte, Nd:YAG é o mais comum para aplicações em LIBS, por apresentar características atrativas, tais como: (i) ser compacto, (ii) dispor de alta densidade de energia (>1 J), (iii) possuir baixas flutuações na energia do pulso, (iv) simplicidade operacional, e (v) o comprimento de onda fundamental em 1064 nm que pode ser facilmente alterado por dobradores harmônicos para 532 nm, 355 nm, 266 nm (4). Embora haja evidências de vários benefícios de se utilizar pulsos de laser da ordem de femtossegundos (37), até o momento o laser de Nd:YAG com regime temporal da ordem de 4 a 15 nanosegundos (ns) é o mais utilizado na literatura (36). Figura 1 - Esquema ilustrativo dos principais componentes de um sistema LIBS. Fonte: Autor De um modo geral, os processos envolvendo a formação do plasma por um pulso de laser de regime temporal da ordem de ns podem ser descritos nas seguintes etapas: 28 (i) Absorção do pulso de laser pela superfície da amostra, provocando um aumento súbito de temperatura (ca. 10000 K em apenas ~10-13 s), promovendo a vaporização de uma pequena quantidade de amostra e ejeção de elétrons livres (38). (ii) Os elétrons livres adquirem energia cinética pela interação com a radiação eletromagnética do pulso do laser (Bremsstrahlung inverso), os quais colidem com os elétrons das ligações químicas da amostra, causando ionização, liberando mais elétrons livres, gerando uma reação em cascata (avalanche de elétrons). (iii) Expansão rápida do plasma, produzindo ondas de choque e forte emissão de radiação de ampla faixa espectral (“luz branca do plasma”), processo relacionado com a emissão de fótons pela mudança da trajetória dos elétrons do plasma (Bremsstrahlung) (38,39). (iv) Resfriamento até a extinção o plasma (restando a cratera produzida pelo laser). Para fins didáticos, os processos envolvidos desde a formação até a extinção do plasma estão ilustrados na Figura 2. Figura 2 - Esquema ilustrativo dos principais eventos decorrentes durante o tempo de vida do plasma produzido por um laser com regime temporal de ns. Fonte: Autor Na evolução do plasma ilustrada acima, o espectro de emissão das espécies se altera em função do processo predominante em cada instante, e, portanto, o tempo após a incidência do laser é um parâmetro fundamental para o registro do espectro de emissão. Neste sentido, um esquema ilustrativo sobre a intensidade de emissão e a região de predominância das emissões de íons, átomos no estado fundamental e moléculas no plasma está apresentado na Figura 3. Após o pulso do laser, há forte emissão de uma “luz branca” proveniente da emissão do contínuo. Neste ponto ocorre a emissão de íons que pouco se distingue da emissão do contínuo, fornecendo pouca informação analítica. Com o decorrer do tempo a intensidade do 29 contínuo diminui, salientando as linhas de emissão de íons, átomos no estado fundamental e moléculas que são formadas por recombinação ou fragmentação parcial. Na Figura 3 é possível observar os parâmetros fundamentais para coleta dos espectros, sendo estes, (i) o tempo de atraso (início da incidência do laser até o momento do início da observação do plasma) e (ii) o tempo de integração (tempo de coleta da radiação do plasma pelo espectrômetro). Figura 3 - Esquema ilustrativo sobre a evolução temporal do plasma e as regiões de predominância das emissões relacionadas ao contínuo, átomos no estado fundamental e moléculas. Fonte: Adaptado de Miziolek, Palleschi e Schechter (3) Com relação ao registro dos espectros de emissão, o sistema óptico é composto por um monocromador e um detector (30,36). Geralmente, os espectros LIBS são registrados entre 200 a 1000 nm, com resolução entre 0,003 a 0,1 nm e tempo de integração da ordem de microssegundos (µs). Desta forma, os espectrômetros Czerny-Turner, Paschen-Runge e rede Echelle, bem como os detectores de tubos fotomultiplicadores, matriz de fotodiodos, matriz de fotodiodos intensificado, dispositivo de carga acoplado (CCD) e CCD intensificado (ICCD) são os mais utilizados em equipamentos LIBS (30,36,39). De modo geral, os fundamentos teóricos aliados com a instrumentação atual proporcionam características atrativas aos métodos de análise por LIBS, a saber: 30 (i) Análise multielementar direta ou com mínimo preparo da amostra, evitando etapas morosas, como a digestão ácida, a qual utiliza reagentes tóxicos, consome tempo e está propensa a contaminação. (ii) Possui instrumentação versátil para aplicações em ambientes laboratoriais, remotos e insalubres. (iii) Permite análise da amostra nos três estados (sólido, líquido e gasoso) da matéria. (iv) Análise rápida e pontual, minimamente destrutiva e com mínima ou nenhuma geração de resíduos. Com base nestas características, é notório que LIBS desempenha um papel importante para análises químicas, contribuindo com diversas aplicações em que outras técnicas espectroanalíticas consolidadas não são capazes de atingir. Além do mais, essa técnica está em ascensão, atrelada ao desenvolvimento tecnológico, o que torna uma técnica ainda mais promissora. 2.1.3. Estratégias de aumento de sensibilidade Embora LIBS apresente vários pontos positivos, uma limitação frequentemente relatada na literatura refere-se ao fato de a sensibilidade e os limites de detecção (LOD) serem insuficientes quando comparados a outras técnicas espectroanalíticas já consolidadas (6–8). As principais razões para este fenômeno estão relacionadas com a flutuação da energia do laser, superfície irregular da amostra, efeitos de matriz, e a instabilidade e a influência da atmosfera que envolve o plasma (6). Uma das formas geralmente empregadas para melhorar as figuras de mérito em análises qualitativas e quantitativas está relacionada com o aprimoramento instrumental da LIBS. Em relação às estratégias que utilizam modificações instrumentais para aumento de sensibilidade, as principais são o LIBS duplo-pulso (DP-LIBS), a espectrometria de fluorescência induzida por laser LIBS (LIBS-LIFS), LIBS ressonante (RELIB), confinamento espacial, confinamento magnético e SD-LIBS. De forma sucinta, as principais informações de cada uma destas estratégias estão listadas na Tabela 1. 31 Tabela 1 - Métodos de aumento de sensibilidade em LIBS empregando modificações instrumentais Estratégia Método Instrumentação necessária Pontos relevantes Referência DP-LIBS - Dois pulsos de laser são sincronizados, o primeiro faz ablação e formação do plasma e o segundo reaquecer o plasma inicialmente formado - Um laser adicional, ou um sofisticado arranjo óptico para dividir o feixe em dois e atrasar um feixe em relação ao outro - Geometrias dos feixes: geralmente ortogonal e colinear - Aumento do custo - Complexidade instrumental (7) LIBS-LIFS - Sobre o plasma é disparado um segundo pulso com comprimento de onda ajustado para estimular uma transição eletrônica específica do elemento de interesse - Um laser adicional com comprimento de onda específico ao elemento de interesse - Análise monoelementar - Aumento do custo - Complexidade instrumental (6,8) RELIBS - Sobre o plasma é disparado um segundo pulso com comprimento de onda ajustado para estimular uma transição eletrônica específica do elemento majoritário da matriz - Um laser adicional com comprimento de onda específico ao elemento da matriz - Aumento do custo - Complexidade instrumental (40) Confinamento espacial LIBS - O plasma é confinado a um pequeno espaço, limitado por cavidades cilíndrica ou hemisférica - Cavidade cilíndrica ou hemisférica - Baixo custo - Simplicidade instrumental (41) Confinamento magnético LIBS - O plasma é gerado entre um campo magnético (~0,5 a 1,1 T) produzido por ímãs de Nd em ar atmosférico ou em câmara de vácuo - Ímãs de neodímio (NdFeB) para produção do campo magnético - Baixo custo - Simplicidade instrumental (42) SD-LIBS - Uma descarga elétrica produzida durante o pulso do laser reaquece o plasma, aumentando a temperatura e densidade eletrônica do plasma. - Geralmente emprega-se voltagens > 2 kV - Circuito de alta tensão com 1 eletrodo para amostras condutoras, e com 2 eletrodos para amostras condutoras ou não - Baixo custo - Facilidade de acoplamento em qualquer sistema LIBS (6,43) 32 A DP-LIBS baseia-se no reaquecimento do plasma por um segundo pulso do laser. O segundo pulso geralmente é disparado por outro laser, espaçados temporalmente por alguns microssegundos. Em outros casos, um arranjo óptico pode ser utilizado para divisão do pulso do laser em dois e espaçamento temporal entre eles. No qual o primeiro pulso a atingir a amostra provoca a ablação do material e o segundo reaquece o plasma anteriormente gerado. Há diversas configurações para o posicionamento dos feixes, contudo, geralmente as configurações em perpendicular e colinear são as mais utilizadas. Com esta estratégia os LOD geralmente são melhorados em até uma ordem de magnitude (8). Lee et al., (44) utilizaram DP-LIBS para a determinação de B e Li em soluções aquosas, e conseguiram LOD de 0,8 mg L-1 e 0,8 µg L-1, respectivamente. Em relação ao B, uma melhora de duas ordens de magnitude no LOD foi obtida com base em outros trabalhos da literatura. Yaroshchyk et al., (45) compararam LIBS e DP-LIBS na determinação de 15 elementos em óleo de motor, sendo obtido geralmente uma melhora de duas vezes no LOD relativo ao DP-LIBS. Neste caso, os autores relatam que para esta aplicação é preferível utilizar apenas a LIBS, visto que a ligeira melhora no LOD não justifica o significativo aumento na complexidade da instrumentação requerida para a DP-LIBS. Portanto, a DP-LIBS necessita de uma instrumentação mais elaborada, acarretando inevitavelmente em aumento da complexidade e dos custos da LIBS em questão. A LIBS-LIFS e a RELIBS utilizam dois pulsos de laser sucessivos, sendo o primeiro, utilizado para gerar o plasma da amostra, e o segundo, utilizado com o comprimento de onda específico para estimular uma transição eletrônica do elemento de interesse (i.e., no caso da LIBS-LIFS) ou, para um elemento majoritário da matriz (i.e., no caso da RELIBS). Com relação a LIBS-LIFS o sinal de fluorescência do analito é utilizado para estudos analíticos, e no caso da RELIBS, os átomos excitados com o segundo pulso transferem essa energia através de colisões com outros elementos no plasma, proporcionando um aumento no sinal de emissão. Laville et al., (8) determinaram Pb em ligas de latão utilizando LIBS-LIFS com acúmulo de 100 pulsos de laser. O LOD obtido foi de 0,2 mg kg-1 de Pb, correspondendo a um aumento de duas ordens de magnitude quando comparado com LIBS. Goueguel et al., (40) avaliaram o incremento de sinal obtido para Mg e Si em amostras de ligas de alumínio utilizando a RELIBS. O segundo pulso foi ajustado em 396,15 nm para excitar os átomos de Al. Com RELIBS o LOD para Mg e Si foi 5,7 e 2,5 vezes inferiores em relação aqueles obtidos com LIBS, respectivamente. Cabe destacar que, da 33 mesma forma que DP-LIBS, o uso de um laser adicional tem como consequência o aumento do custo e da complexidade instrumental. A LIBS com confinamento espacial ou magnético são abordagens simples e econômicas para aumento da sensibilidade em LIBS. O confinamento espacial do plasma geralmente utiliza câmara cilíndrica ou hemisférica para confinamento do plasma. Wang et al., (46) desenvolveram uma estrutura de politetrafluoretileno de forma a produzir uma cavidade cilíndrica, com altura de 1,5 mm e diâmetro de 3 mm, para confinamento do plasma gerado em amostras de carvão. Um aumento significativo na intensidade de emissão das linhas de C, bem como o aumento na repetibilidade entre os espectros foi observado. Popov et al., (47) usaram uma câmara cilíndrica de 4 mm de diâmetro equipada com parede de latão polido. Os LOD para micronutrientes, As e Hg em solos obtidos com esta estratégia foram de duas a cinco vezes menores que aqueles obtidos com LIBS convencional. O confinamento magnético do plasma utiliza imãs para produção de um forte campo magnético na região de formação do plasma, que tem influência na densidade eletrônica e no volume do plasma, resultando em melhores condições de excitação das espécies emissoras. Liu et al., (42) fizeram o estudo sobre a influência do campo magnético em diversas condições de pressão sobre a intensidade de emissão de Al e Li em liga metálica, os resultados demonstraram que a intensidade de emissão aumenta em função do aumento do campo magnético, possibilitando o incremento de sinal da ordem de 1,5 a 3 vezes para Al e Li. A SD-LIBS utiliza um ou dois eletrodos conectados a um circuito elétrico de alta tensão com capacitores carregados. Apesar de possuir complexidade instrumental superior ao confinamento magnético e espacial, ainda é mais simples que a DP-LIBS, LIBS-LIFS e RELIBS. Além do mais, a SD-LIBS possibilita obtenção de incrementos de sinais expressivos em relação ao LIBS (6). Com relação ao custo benefício, a SD-LIBS se destaca das demais e por ter sido escolhida para este trabalho, será abordada mais profundamente a seguir. 2.1.3.1. LIBS com descarga elétrica A SD-LIBS pode ser implementada utilizando eletrodos geralmente feitos de tungstênio ou cobre, conectados a um banco de capacitores alimentados por uma fonte de alta tensão, como pode ser observado no esquema da Figura 4. Nesta figura, os dois eletrodos são utilizados para aplicar a diferença de potencial sobre a amostra. No momento em que o pulso do laser sobre amostras condutoras ou não, há produção de espécies carregadas entre os 34 eletrodos, induzindo a descarga elétrica. No caso de amostras condutoras, pode ser utilizado apenas um eletrodo, ao qual se aplica potencial positivo; o negativo é aplicado na amostra (Figura 5). Figura 4 - Esquema ilustrativo dos componentes utilizados em um sistema SD-LIBS. Fonte: Autor Figura 5 - Configurações SD-LIBS utilizadas para a análise de (a) amostras condutoras ou não condutoras e (b) amostras condutoras. Fonte: Autor Brech e Cross (18) foram os primeiros a introduzir uma descarga elétrica no plasma para aumento de sensibilidade, uma vez que os lasers disponíveis na época continham baixa energia. Com o avanço da tecnologia e a produção de lasers dispondo de feixes mais 35 energéticos, a reexcitação (ou reaquecimento) do plasma por uma descarga elétrica entrou em desuso até 2005, ano em que Nassef e Elsayed-Ali (43) propuseram um circuito de alta tensão para produzir uma descarga elétrica e reaquecer o plasma. O sistema SD foi desenvolvido utilizando dois eletrodos de tungstênio, um capacitor de 0,250 µF, um resistor de 500 kΩ e uma fonte de alta tensão (de até 10 kV). O SD-LIBS foi utilizado para monitoramento de linhas de Al e Cu em liga de alumínio, obtendo valores de razão sinal/ruído (S/R) de até seis vezes maiores em relação ao LIBS convencional. O êxito dos resultados apresentados por Nassef e Elsayed-Ali (43) despertou novamente o interesse pela reexcitação do plasma como estratégia de aumento de sensibilidade, e vários trabalhos foram apresentados na literatura. Zhou et al., (48) propuseram um novo circuito elétrico utilizando dois eletrodos de liga de tungstênio e tório (98% e 2%, respectivamente), um pequeno capacitor de 6 nF, um diodo e um indutor. Este sistema foi utilizado para o estudo da emissão de Si em uma amostra de cristal de silício, e observado um aumento de 52 vezes para uma linha de Si, além de menores RSD. Cabe destacar aqui que este circuito desenvolvido foi utilizado em diversos estudos (49–55) Kexue et al., (49) avaliaram o aumento da intensidade de emissão de As e Pb em amostras de solo. Em comparação com o LIBS, a reexcitação do plasma pela descarga elétrica proporcionou o acréscimo de 38,5 vezes no sinal do Pb, no caso do As, a comparação não foi possível devido a não ocorrência da linha deste elemento com LIBS convencional. Li et al., (54) avaliaram o aumento de emissão para os elementos Al, As, Ba, Ca, Co, Fe, Mg, Pb, Si, Sr, Ti e V em amostras de solo. Em relação ao LIBS, a intensidade de emissão foi aumentada em até 223 vezes, dependendo da linha de emissão e do elemento analisado. Além do mais, a razão S/R foi melhorada significativamente, principalmente para os elementos em menor concentração. Zhou et al., (50) avaliaram a influência da tensão e da capacitância na intensidade de emissão. Neste caso, o aumento destas variáveis proporcionou o aumento do tempo de vida do plasma e da quantidade de espécies excitadas em transições eletrônicas de maior energia. Li et al., (52) fizeram a análise quantitativa de Mg, Pb e Sn em solo, obtendo os LOD de 34, 1,5 e 0,16 μg g-1, respectivamente. Zhou et al., (51) compararam a temperatura e a densidade eletrônica do plasma de uma amostra de cristal de silício obtidas com o reaquecimento do plasma e a LIBS convencional. Quando o reaquecimento do plasma é utilizado, a temperatura do plasma 36 aumenta, provocando o aumento das linhas de emissão, por outro lado, a densidade eletrônica para ambos os métodos foi aproximadamente a mesma. Eschlböck-Fuchs et al., (56) propuseram um circuito elétrico de baixa tensão e alta corrente para reaquecimento do plasma, utilizando dois eletrodos de cobre, um banco de capacitor com 9,4 mF e a uma fonte com tensão máxima de 63 V. Alumínio, Ca, Fe, Mg e Mn foram monitoraram em amostras de escória de metalurgia para avaliação da proposta. Neste caso, o reaquecimento do plasma obteve aumento significativo na intensidade de emissão, bem como maior tempo de permanência e volume do plasma. Além do mais, apenas com o uso da proposta de reaquecimento do plasma foi possível observar linhas de emissão de F e S, elementos com alta energia de excitação. Sobral e Robledo-Martinez (57) utilizaram um eletrodo de aço inoxidável, um cabo de 50 m de comprimento, servindo como capacitor (5 nF), e uma fonte de alta tensão para análise de liga de alumínio. Um aumento de sinal de uma ordem de magnitude foi observado devido ao aumento no tempo de vida do plasma. Bol’shakov et al., (58) desenvolveram um circuito elétrico conectado a dois eletrodos de cobre para reaquecimento do plasma, e constataram que espécies moleculares, como OH, AlO e CaF, tem um aumento significativo na intensidade de emissão causadas pelo reaquecimento do plasma. He et al., (2018) (59) utilizaram um eletrodo de tungstênio conectado a um circuito elétrico com tensão máxima de 4 kV e 50 mA para determinação de Cu, Cr, Mg e Mn em ligas de alumínio. Os LOD obtidos para estes elementos foram de 9,0, 7,8, 11,1 e 20,1 mg kg-1, respectivamente, sendo estes de 4 a 10 vezes melhores que aqueles obtidos com a LIBS convencional. Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisa utilizou um circuito elétrico com alta taxa de repetição (1 kHz) para determinação de Al e Pb em ligas de cobre (60). Os LOD obtidos com o plasma reaquecido foram de 1,9 e 15,5 mg kg-1 para Al e Pb, respectivamente. Estes valores correspondem em 6 e 11 vezes maiores que aqueles obtidos com a LIBS nas mesmas condições. Grünberger et al., (61) utilizaram um eletrodo de tungstênio, um circuito elétrico com tensão máxima de 2,5 kV, composto por um capacitor de 25 nF e um resistor de 1 MΩ. Devido ao aumento de sinal proporcionado pela descarga elétrica no plasma, um laser de menor energia pode ser utilizado, causando menos danos a superfície da amostra. Esta estratégia foi utilizada para fazer imageamento químico de uma impressão digital sobre a superfície de uma liga de alumínio e de um cartão USAF (utilizado para teste de resolução óptica) sobre a superfície de cobre, bem como o imageamento hiperespectral de camadas de 37 tinta e óxido de silício sobre alumínio. As imagens obtidas com o reaquecimento do plasma tiveram maior razão S/R, contribuindo para uma imagem química com maior definição em relação as imagens obtidas com a LIBS. 2.1.4. Calibração em LIBS para análise de amostras sólidas A análise quantitativa representa um grande desafio em LIBS, em parte devido a intensidade de emissão do analito no plasma depender de diversos fatores; além da concentração do analito na amostra, tem as propriedades do plasma, da fonte de excitação (energia, fluência e comprimento de onda) e do ambiente entorno do plasma (3). Portanto, para obter resultados precisos é crucial entender e controlar os processos de ablação, bem como conhecer as propriedades físicas e químicas da amostra. Tais diferenças entre os padrões de calibração e as amostras podem resultar em ablação não estequiométrica e variações na temperatura e densidade eletrônica do plasma, i.e., efeito de matriz, resultando em erros na determinação da concentração dos analitos. Curvas de calibração externa preparadas com um conjunto de materiais de referência certificados (CRMs) ou com amostras com concentração do analito previamente determinadas por outra técnica de referência, ambos com matrizes similares as das amostras em análise, têm sido eventualmente utilizados para análises quantitativas em LIBS. Santos et al., (62) desenvolveram um método quantitativo por LIBS para determinação de Cd em amostras de solo. Seis CRMs de amostras de solo, contendo diferentes concentrações de Cd foram utilizados como padrões de calibração. As figuras de mérito obtidas neste trabalho indicam que este método pode ser utilizado para a discriminação de solos contaminados com Cd. Arantes de Carvalho et al., (63) determinaram Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, P e Zn em comprimidos de polivitamínicos utilizando como padrões de calibração misturas de amostras com concentrações previamente determinadas por ICP OES. As concentrações determinadas por LIBS obtiveram RSD entre 2 a 16 %, sendo estas concentrações concordantes com àquelas determinadas por ICP OES. Na existência de efeitos de matriz, outras estratégias têm sido empregadas em LIBS, como por exemplo, a calibração com compatibilização de matriz (MMC) e padronização interna (IS), utilizadas por Morais et al., (64) para determinação de Ca em amostras de biocarvão. Neste caso, apenas a estratégia MMC não foi suficiente para minimizar os efeitos 38 de matriz, sendo necessário o uso do Na como padrão interno. Por sua vez, as duas estratégias (MMC e IS) proporcionaram concentrações de Ca concordantes com aquelas determinadas por HR-CS FAAS após digestão das amostras. É importante destacar que a escolha do padrão interno deve levar em consideração a taxa de volatilização, energias de ionização e massa atômica, de modo que o padrão interno tenha (i) a mesma energia de excitação que o analito, (ii) não ser afetado com autoabsorção, e (iii) ter intensidades de emissão próximas a do analito (65). Zivkovic et al., (66) determinaram Ba e Mn em amostras de hortelã pimenta utilizando a estratégia de calibração com adição de padrão (SA) juntamente com o elemento Sr como padrão interno. Porções de aproximadamente 10 g da mesma amostra foram colocadas em cinco frascos contendo 20 mL de soluções multielementares com concentrações crescentes de Ba (0,00, 4,95, 9,90, 19,80 e 39,60 µg g-1) e de Mn (0,00, 24,75, 49,50, 99,01 e 198,02 µg g-1). Após a homogeneização, as amostras foram secas a 60 °C por 12 h e em sequência compactadas na forma de pastilhas, resultando na curva de calibração. O método SA com IS gerou resultados com exatidões de 99,7 % e 102,3 % para Ba e Mn, respectivamente, com relação as concentrações de destes elementos determinadas por ICP OES. Cabe destacar que apesar do êxito obtido com este método, curva de calibração foi necessária para cada amostra, aumentando significativamente o tempo da análise. Calibration-free (CF-LIBS) foi desenvolvida para a determinação multielementar sem uso de calibração, a qual considera a matriz como parte do problema analítico, analisando-a juntamente com o analito (67). Com esta estratégia, as determinações elementares são realizadas através de algoritmos que se baseiam nas intensidades das linhas de emissão e na temperatura e densidade eletrônica do plasma (i.e., calculados experimentalmente), assumindo que o plasma encontra-se em equilíbrio termodinâmico local (67,68). A CF-LIBS fornece em alguns casos resultados quantitativos satisfatórios, em outros, observa-se carência de precisão (67). Cavalcanti et al., (69) desenvolveram a calibração monoponto (one-point calibration) para CF-LIBS. O método se fundamenta no emprego de um padrão com matriz semelhante a da amostra. Tanto a amostra quanto o padrão são analisados nas mesmas condições, de modo a determinar com maior precisão os parâmetros do plasma. Apesar da obtenção de resultados mais precisos, a concentração da amostra é determinada através de cálculos complexos pela equação de Saha-Boltzmann. Gaudiuso et al., (70) utilizaram a calibração livre inversa, conhecida como calibration-free inverse (CFI) para análises arqueológicas. A CFI-LIBS baseia-se na 39 suposição de que, diferentes amostras com matrizes semelhantes analisadas nas mesmas condições terão a mesma temperatura de excitação do plasma. Os resultados obtidos com este método foram concordantes com a espectrometria de massas acoplada ao plasma induzido com ablação a laser (LA-ICP-MS) para determinação de diversos elementos. Cabe destacar que a complexidade da matriz dificulta a aplicação do método CF-LIBS e CFI-LIBS, sendo estes métodos mais facilmente aplicados para análise de amostras homogêneas, e.g., ligas metálicas. Recentemente, Babos et al., (71) aplicaram o MEC para a determinação de Ca, Cu, Fe, Mn e Zn em suplementos alimentares para bovino. O método utilizou apenas dois padrões sólidos: o primeiro contendo amostra + padrão, o segundo amostra + diluente, ambos em iguais proporção m:m de modo a manter constante a matriz da amostra em ambos. As pastilhas dos dois padrões sólidos preparados para análise das amostras e de CRMs foram analisadas por LIBS, e as respectivas concentrações calculadas. Os resultados obtidos foram concordantes com aqueles determinados por ICP OES e com os valores dos materiais de referência. Os autores destacaram que o método foi eficiente para minimizar os efeitos de matriz e apresentou frequência analítica equivalente a 15 amostras por hora. Hao et al., (72) propuseram um novo método chamado de one point and multi-line calibration (OP-MLC LIBS). Este se baseia na utilização de várias linhas do analito monitoradas tanto na amostra e como no padrão (com matrizes semelhantes). A concentração da amostra é calculada através da multiplicação entre a concentração do padrão e a inclinação obtida pela equação linear entre as intensidades em várias linhas de emissão registradas no padrão (eixo x) e na amostra (eixo y). Com este método foi determinado Cr, Mn, Ni e Ti em seis amostras de aço utilizando o Fe como padrão interno. O RSD variou de 9 a 36 %, mas valores de 79 % foram observados para Cr. De modo geral, as concentrações determinadas por OP-MLC LIBS e as concentrações certificadas foram próximas. Por outro lado, cabe aqui destacar que, a obtenção de êxito desta estratégia depende da escolha do padrão com matriz compatibilizada e da disponibilidade de linhas de emissão do analito. Yuan et al., (73) propuseram a single-sample calibration LIBS, a qual se baseia na simplificação da fórmula de Lomakin-Scherbe, permitindo o uso de apenas um padrão para calibração. A determinação de Cu, Cr, Fe, Ni, Nb, Mo e Zn foi feita em ligas metálicas, sendo os resultados comparados com a estratégia de calibração externa em LIBS. Os melhores resultados foram obtidos quando a single-sample calibration LIBS foi utilizada. Novamente, a escolha do padrão é fundamental para que efeitos de matriz não sejam significativos. 40 Babos et al., (74) aplicaram o método de one point gravimetric standard addition (OP GSA), a qual emprega a estratégia de MMC com SA. A intensidade de emissão do analito é mensurada em dois padrões para calibração, sendo o primeiro, constituído por amostra + padrão e o segundo, por amostra + diluente, mantendo constante a matriz da amostra em ambos os padrões. A concentração é obtida de forma similar ao método de SA, através do intercepto e da inclinação da curva de calibração obtida com os dois padrões preparados. As concentrações de Ca e P em amostras de suplemento bovino foram determinadas com as estratégias OP GSA, MEC e MMC com IS e os resultados comparados. As estratégias MEC e OP GSA obtiveram os melhores valores de exatidão, além de não apresentarem diferenças estatísticas entre os valores de referência e os valores determinados com ICP OES. É importante destacar que em ambas as estratégias MEC e OP GSA, a qualidade dos resultados depende da disponibilidade de diluentes e do padrão com concentração adequada. Nunes et al., (75) propuseram a calibração por razão das inclinações (SRC) que é baseada na utilização de apenas um padrão sólido de calibração. Explorando o efeito do acúmulo de pulsos do laser na intensidade de emissão do analito, é utiliza para a calibração a inclinação obtida pelo gráfico do número de pulsos acumulados versus a intensidade de emissão do analito, para amostra e padrão. A concentração do analito é determinada através da concentração do padrão multiplicada pela razão entre a inclinação da amostra dividida pela inclinação do padrão. A concentração de B, Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, P e Zn em amostras de folhas de plantas foram determinadas pelo método proposto, sendo estes valores concordantes com aqueles determinados por ICP OES e com os valores certificados dos CRMs. Os autores destacam ainda que estes resultados foram mais precisos que aqueles determinados por calibração externa. 2.2. Espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua 2.2.1. Histórico O físico Gustav Kirchhoff em 1859 observou que os elementos químicos absorvem radiação eletromagnética que eles próprios emitem. Posteriormente, os trabalhos de Kirchhoff e Robert Bunsen deram início a espectroscopia analítica moderna (76). 41 Nesse momento em diante, maior empenho foi dado para as técnicas espectroscópicas de emissão, em parte, devido a simplicidade da instrumentação requerida para registro do sinal de emissão em um anteparo escuro. Em contra partida, os instrumentos de absorção atômica utilizavam uma lâmpada de fonte contínua (CS), devido ser a única fonte de radiação confiável disponível na época, bem como espectrômetro de baixa resolução, dificultando o registro da diminuição de intensidade (absorção dos analitos) em um fundo luminoso (10). Alan Walsh em 1952 chegou à conclusão de que o uso da fonte contínua só seria viável caso o espectrômetro tivesse resolução de aproximadamente de 2 pm. Como estratégia para dar continuidade a AAS, Walsh utilizou a lâmpada de cátodo oco (HCL), produzida com o elemento de interesse, permitindo a emissão de radiação com pequena largura espectral (alguns pm), específico para cada elemento, sendo altamente seletiva e dispensando o uso de monocromadores de alta resolução (9,10). A concepção de absorção atômica surgiu em 1955, quando Walsh publicou o artigo “The application of atomic absorption spectra to chemical analysis” (77), marcando o nascimento oficial de um novo método de análise instrumental, a AAS (78). Neste equipamento, os átomos do analito no estado gasoso em uma chama de acetileno/ar absorviam a radiação emitida por uma HCL. A radiação transmitida após a chama atravessava um prisma para separar os comprimentos de onda até chegar ao detector de tubo fotomultiplicador. Este detector possibilitou a obtenção de um sinal eletrônico ao invés da impressão fotográfica utilizada anteriormente. Por utilizar uma chama para atomização dos analitos, o nome de espectrometria de absorção atômica em chama (FAAS) foi estabelecido. Neste ponto, o equipamento projetado por Walsh estabeleceu os principais componentes de um espectrômetro de AAS, os quais podem ser observados no esquema ilustrado na Figura 6. Figura 6 - Esquema ilustrativo dos principais componentes utilizados em um espectrômetro de absorção atômica. Fonte: Autor 42 Após um período sendo tratada como uma curiosidade científica, a AAS passou a ser mundialmente aceita como uma técnica instrumental de análise apenas em 1963, quando a Perkin-Elmer fabricou o primeiro espectrômetro de absorção atômica de chama (modelo 303). Nos próximos anos, outras empresas também iniciaram a produção de espectrômetros de absorção atômica, e em 1966 excedeu o número de 2000 unidades destes equipamentos comercializados por ano (78). Com a grande expansão comercial, vários trabalhos exploratórios da AAS foram desenvolvidos, sendo observado em muitos destes que a AAS apresentava menos interferências do que os métodos de emissão atômica da época, além de maior sensibilidade e seletividade (79). Em 1961 foi obtido um grande marco em relação a análise de sólidos, quando L’vov propôs o atomizador em forno de grafite aquecido eletricamente e purgado com argônio, dando início a espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS) (80). O GFAAS ganhou maior atenção quando Slavin, baseado nos estudos de L’vov, propôs em 1981 o conceito forno plataforma com temperatura estabilizada, conhecido como Stabilized Temperature Platform Furnace (STPF) (81,82). De modo geral, essas condições contemplam o uso de; (i) modificador químico, (ii) grafite pirolítico, (iii) medida de sinais transientes em área de pico, (iv) corretor de fundo, (v) velocidade de aquecimento na etapa de atomização ≥ 2000 °C s-1, (vi) etapa de atomização com interrupção do gás de purga e (vii) eletrônica compatível com medida de sinais transientes. Esses requisitos conferem condições para gerar uma nuvem densa de átomos (i.e., aumento na sensibilidade), remoção de interferentes (i.e., através do programa de aquecimento) e temperatura controlada (i.e., ambiente isotérmico). A partir deste momento, as alterações frente aos instrumentos AAS passaram a ter caráter instrumental. Um passo significativo foi dado quando Keliher e Wohlers (1974) propuseram o uso de um espectrômetro de alta resolução com rede Echelle e uma lâmpada de Xe de 150 W como CS. Estes autores demonstraram resultados promissores, contudo, devido à baixa potência da lâmpada de Xe, fornecia baixa intensidade de emissão em comprimentos de onda inferiores a 320 nm, região em que a maioria dos elementos apresentam linhas de absorção mais sensíveis (9,83). Harnly et al., (84) desenvolveram o SIMAAC (simultaneous multielement atomic absorption continuum source spectrometer), o primeiro instrumento de absorção atômica multielementar e simultâneo, o qual utiliza uma lâmpada de Xe de 300 W como CS de radiação. Outra vantagem deste sistema está no fato de ser compatível com a análise em 43 chama e em forno de grafite. Contudo, a instabilidade do arco elétrico da lâmpada de Xe proporcionava maiores limites de detecção (85). A instrumentação mais elaborada que permitiu a ascensão CS na AAS foi descrita em 1996, pelo grupo do Becker-Ross, os primeiros a projetar e construir um espectrômetro de alta resolução, bem como os demais componentes, para uso exclusivo para AAS (86,87). Este equipamento trouxe o conceito instrumental em relação a fonte de radiação, o espectrômetro e o detector para a HR-CS AAS. Recentemente, um equipamento com capacidade multielementar simultânea foi proposto por Labusov et al., (88), o qual é capaz de fornecer um espectro de absorção atômica nas faixas de 190 a 350 nm e 350 a 780 nm, com resoluções de 10 e 30 nm respectivamente. Este equipamento pode ser uma tendência para os novos equipamentos de HR-CS AAS, no entanto, até o momento trata-se de um protótipo. 2.2.2. Instrumentação Como mencionado, o grupo de Becker-Ross resolveu grande parte dos problemas instrumentais relacionados a HR-CS AAS, obtendo um novo conceito instrumental ilustrado na Figura 7. A lâmpada de arco curto de xenônio de 300 W opera com pressões > 17 bar e produz um plasma de diâmetro < 0,2 mm entre os eletrodos de tungstênio, atingindo temperaturas de aproximadamente 10000 K (9). Esta lâmpada em hot spot é capaz de emitir com alta intensidade entre 190 e 900 nm, obtendo radiância de 2 a 3 ordens de magnitude maior que as obtidas com lâmpadas de HCL (dependendo do elemento). O feixe de radiação emitido pela lâmpada possui uma instabilidade intrínseca a flutuação do plasma n