UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE MULTIPLEX PCR PARA A DETECÇÃO DE Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae E Escherichia coli EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO, OBTIDAS DE TANQUES DE EXPANSÃO MARCELLA ZAMPOLI TRONCARELLI Botucatu-SP AGOSTO 2011 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE MULTIPLEX PCR PARA A DETECÇÃO DE Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae E Escherichia coli EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO, OBTIDAS DE TANQUES DE EXPANSÃO MARCELLA ZAMPOLI TRONCARELLI Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária Preventiva. Orientador: Prof. Titular Helio Langoni iii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Troncarelli, Marcella Zampoli. Padronização da técnica de multiplex PCR para a detecção de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli em amostras de leite bovino, obtidas de tanques de expansão / Marcella Zampoli Troncarelli. – Botucatu : [s.n.], 2011 Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu Orientador: Helio Langoni Capes: 50502034 1. Bovino de leite. 2. Bactérias. 3. Leite – Contaminação. 4. Reação em cadeia de polimerase. Palavras-chave: Bactérias; Biologia molecular; Bovinos; Diagnóstico; Leite de mistura; Mastite. iv Nome do Autor: Marcella Zampoli Troncarelli Título: PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE MULTIPLEX PCR PARA A DETECÇÃO DE Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae E Escherichia coli EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO, OBTIDAS DE TANQUES DE EXPANSÃO. COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Titular Helio Langoni Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP – Botucatu-SP Profa. Titular Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães Membro Titular Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP – São Paulo-SP Profa. Dra. Deolinda Maria Vieira Filha Carneiro Membro Titular Departamento de Sanidade Animal Instituto Federal Catarinense – Araquari-SC Prof. Dr. Márcio Garcia Ribeiro Membro Titular Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP – Botucatu-SP Prof. Dr. José Paes de Almeida Nogueira Pinto Membro Titular Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP – Botucatu-SP _______________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Veiga dos Santos Membro suplente Departamento de Nutrição e Produção Animal FMVZ – USP – Pirassununga-SP Prof. Dr. Nilson Roberti Benites Membro suplente Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP – São Paulo-SP v Prof. Dr. Paulo Francisco Domingues Membro suplente Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública FMVZ – UNESP – Botucatu-SP Profa. Dra. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Membro suplente Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu-SP Data da Defesa: 05 de agosto de 2011. vi EDICATÓRIA Dedicatória viii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 GRADECIMENTOS Agradecimentos x _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 GRADECIMENTOS A Deus, pela maravilhosa bênção da vida e por Seu infinito Amor. Pelo conforto espiritual, em todos os momentos, especialmente nos mais difíceis. Pela boa saúde. Por me conceder família e amigos tão maravilhosos. Pelo meu lar, pelo meu trabalho, pela oportunidade de estudar. Pelas dádivas alcançadas e ensinamentos constantes. Que eu possa sempre seguir Sua luz e trilhar o caminho do bem, ajudando a todos os que necessitarem de mim. Que o Senhor me ajude que, por meio de minha profissão, eu possa tornar melhor a vida dos animais e dos seres humanos. Amém. Ao meu marido Luiz Alberto Troncarelli (Beto), pelo exemplo de humildade, honestidade, pureza de coração e amor. Pela compreensão e companheirismo. Pelo eterno sorriso. Por me confortar nos momentos difíceis. Por ser este anjo maravilhoso em minha vida... Aos meus amados filhos Pedro, Tiago e Luana, querubins de luz que tornam a minha vida repleta de alegria, encanto e ternura. Que eu possa ser para vocês exemplo de dedicação e retidão, e que vocês sejam muito felizes! Aos meus sogros Odila e Edmundo, pelo infinito amor (de pais) e pela ajuda com as crianças. Vocês contribuíram muito para que tudo isso fosse possível. À minha mãe Zenaide, por toda a ajuda e amor e ao meu pai José Antonio, pela preocupação e palavras de apoio, mesmo de longe; À minha querida irmã Gabriella, pelo carinho, amizade e apoio infinitos; Ao meu irmão Victor Hugo, pelas palavras de incentivo; Aos produtores de leite (proprietários e funcionários) que muito gentilmente autorizaram a realização das colheitas de amostras nas propriedades, entendendo a importância da realização desta pesquisa. Presto especial Agradecimentos xi _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 homenagem a estes trabalhadores, que constituem parte importante da economia do país, e contribuem para que o leite bovino, alimento tão essencial, chegue à mesa do consumidor. O “retiro” leiteiro é um trabalho árduo, que exige dedicação diária, independente das condições climáticas. A todos os animais envolvidos no estudo, por quem tenho extremo respeito e carinho. O contato com bovinos leiteiros sempre me enche de entusiasmo e felicidade! Esta é uma das maravilhas da profissão de Medicina Veterinária, pela qual tenho grande paixão... Ao Prof. Márcio Garcia Ribeiro, Chefe do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ UNESP Botucatu-SP, pela amizade, direcionamento e apoio contínuos. Pelas valiosas contribuições fornecidas ao longo de toda minha formação acadêmica. Pelos apontamentos pertinentes durante o exame geral de qualificação. Por este maravilhoso exemplo de docente jovem que, ao mesmo tempo, contempla tamanha experiência e maturidade profissional. Ao Prof. Paulo Francisco Domingues pela amizade, incentivo e oportunidades de crescimento. Pelas importantes contribuições fornecidas durante o exame geral de qualificação. Ao Prof. Antonio Carlos Paes e à Profa. Jane Megid, pela amizade, confiança e oportunidades de crescimento. À Profa. Simone Baldini Lucheis, pela ajuda nas colheitas de amostras de leite e análises laboratoriais. À Profa. Kátia Bresciani (UNESP Araçatuba-SP), pelo incentivo e por me oferecer contínuas oportunidades de crescimento. Aos amigos Virgínia Bodelão Richini-Pereira, Rodrigo Costa da Silva e Pâmela Marson, pelas valiosas explicações sobre biologia molecular e pela sua boa vontade em ajudar; Agradecimentos xii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 À amiga Deolinda Maria Vieira Filha Carneiro, pela amizade sincera e por ser uma grandiosa fonte de luz. Você é uma pessoa especial que merece muito sucesso! Às amigas Ana Paula Corrêa e Dona Cidinha (esposa do Prof. Helio Langoni), pelo exemplo de superação e inabalável fé em Deus, mesmo frente aos mais severos desafios. Aos amigos pós-graduandos, “irmãos de orientação”, Patrícia Faccioli, Felipe Freitas Guimarães, Diego Nóbrega, Lucilene Camossi, Luciana Baldini, Diego Generoso, Leila Ullmann, Felipe Fornazari e Gustavo Machado, pela amizade, presteza e companheirismo durante todo este trabalho; À amiga e graduanda em Medicina Veterinária, Marcela de Pinho Manzi, pela dedicação, entusiasmo e ajuda nas colheitas de amostras e análises laboratoriais; Aos aprimorandos e estagiários do Laboratório de Diagnóstico de Zoonoses e do Núcleo de Pesquisas em Mastites, do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ, pelo convívio harmonioso e troca de experiências; Aos funcionários Benedito Menozzi, Fernando Paganini, Marcos, Diego e Jéssica pela ajuda nas colheitas de amostras de leite e/ou preparo dos materiais; À UNESP, campus de Botucatu-SP, especialmente à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Instituição onde, com muito orgulho, me graduei, e onde continuo minha formação. A todos os professores, funcionários e colegas da Pós-graduação, especialmente do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ UNESP Botucatu-SP, pelo companheirismo durante esta caminhada; Agradecimentos xiii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Aos alunos de graduação em Medicina Veterinária, com quem tive oportunidade de conviver durante algumas de minhas atividades acadêmicas. Que vocês possam contribuir para o incremento da Profissão, e que sejam felizes em seu campo de atuação. Às funcionárias da limpeza, especialmente à Dona Ana e à Adriana, pela dedicação, carinho e palavras de incentivo; Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da FMVZ UNESP Botucatu-SP, pelas orientações e auxílio no preparo e andamento de documentos relacionados a todo curso de Doutorado; À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa (Processo número 2008/04125-4) e dos recursos de auxílio à pesquisa (Processo 2008/11362-2), acreditando na importância do trabalho; Aos meus colegas de trabalho Marisa, Maria, Odair, Vera, Denise, Sílvia, Marilu, Mirian, Amanda e Rogério pelo companheirismo e incentivo nesta minha nova etapa profissional. À Rosana Minharro, chefe da Divisão de Vigilancia Municipal de Botucatu-SP, pela confiança e incentivo constantes, e pela compreensão, especialmente nesta etapa final do meu curso de Doutorado. A todas as pessoas que estiveram comigo e que me ajudaram de alguma maneira, muito obrigada! Agradecimentos xiv _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 GRADECIMENTOS E OMENAGEM SPECIAL ISTA DE UADROS E ABELAS Lista de quadros e tabelas xvi _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ISTA DE UADROS E ABELAS Tabela 1 - Características avaliadas em 20 propriedades leiteiras localizadas no centro oeste Estado de São Paulo, com base em questionário aplicado ao(s) proprietário(s) e/ou funcionário(s), para classificação quanto às condições higiênico-sanitárias de ordenha. Botucatu-SP, 2011. 60 Quadro 1 - Resultados das reações bioquímicas para identificação de S. agalactiae isolados de espécies animais 62 Tabela 2 - Iniciadores utilizados no estudo para a amplificação do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino, pela técnica de mPCR. Botucatu-SP, 2011. 66 Tabela 3a- Características gerais das propriedades leiteiras avaliadas (1 a 10), no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 73 Tabela 3b - Características gerais das propriedades leiteiras avaliadas (11 a 20), no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 74 Tabela 4a - Resumo das principais características observadas entre as vinte propriedades leiteiras avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 77 Tabela 4b - Resumo das principais características observadas entre as vinte propriedades leiteiras avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 81 Lista de quadros e tabelas M.Z. Troncarelli. - 2011 xvii Tabela 5 - Freqüências (absoluta e relativa) de resultados ao CMT a partir de amostras de leite colhidas dos quartos mamários de vacas em produção das 20 propriedades avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 82 Tabela 6 - Freqüências (absoluta e relativa) de isolados bacterianos, frente ao total de amostras de leite avaliadas, de vacas em produção das 20 propriedades avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 85 Tabela 7 - Freqüências (absoluta e relativa) de isolados bacterianos, frente ao total de isolamentos obtidos a partir de amostras de leite de vacas em produção das 20 propriedades avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 86 Tabela 8 - Micro-organismos isolados a partir de amostras de leite dos tanques de expansão de 20 propriedades avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 87 Tabela 9 - Freqüências (absoluta e relativa) de isolados bacterianos, frente ao total de isolamentos obtidos a partir de amostras de leite de tanque de expansão de 20 propriedades localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 88 Lista de quadros e tabelas M.Z. Troncarelli. - 2011 xviii Tabela 10 - Resultado da Contagem de Células Somáticas (CCS) realizada a partir de amostras de leite dos rebanhos em produção e dos tanques de expansão de 20 propriedades avaliadas, no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 89 Tabela 11 - Distribuição das 20 propriedades leiteiras avaliadas, de acordo com a contagem de células somáticas (CCS) no leite de mistura (tanque de expansão), realizada pela técnica de citometria de fluxo. Botucatu- SP, 2011. 90 Tabela 12 - Número de unidades formadoras de colônias (UFC) de micro-organismos mesófilos e psicrotróficos por mL de amostras de leite, obtidas de tanques de expansão em 20 propriedades leiteiras localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 90 Tabela 13 - Distribuição das 20 propriedades leiteiras avaliadas de acordo com a contagem de mesófilos no leite de mistura (tanque de expansão), pela utilização do Petrifilm®. Botucatu-SP, 2011. 91 Tabela 14 - Distribuição das 20 propriedades leiteiras avaliadas de acordo com a contagem de psicrotróficos no leite de mistura (tanque de expansão), pela utilização do Petrifilm®. Botucatu-SP, 2011. 91 Tabela 15 - Resultados de mPCR para detecção do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em 20 amostras de leite de tanques de expansão de propriedades localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 93 Lista de quadros e tabelas M.Z. Troncarelli. - 2011 xix Tabela 16a - Micro-organismos isolados das amostras de leite dos tanques de expansão (1 a 10) avaliados, e resultados da mPCR para pesquisa de S. aureus, S. agalactiae e E. coli. Botucatu-SP, 2011. 94 Tabela 16b - Micro-organismos isolados das amostras de leite dos tanques de expansão (11 a 20) avaliados, e resultados da mPCR para pesquisa de S. aureus, S. agalactiae e E. coli. Botucatu-SP, 2011. 95 Tabela 17 - Ocorrência de S. aureus, S. agalactiae e E. coli nas amostras de leite dos rebanhos e dos 20 tanques de expansão avaliados, e resultados da multiplex PCR para a detecção do DNA destes três patógenos. Botucatu-SP, 2011. 96 Tabela 18 - Resultados de cultivo microbiológico e de mPCR para S. aureus, S. agalactiae e E. coli nas 20 amostras de leite de tanques de expansão avaliadas. Botucatu-SP, 2011. 97 Tabela 19 - Ocorrência de S. aureus, S. agalactiae e E. coli nas 20 amostras de leite de tanques de expansão avaliadas, pelos métodos de cultivo microbiológico e multiplex PCR (mPCR). Botucatu-SP, 2011. 98 Tabela 20 - Resultados da mPCR frente ao cultivo microbiológico, para a detecção de S. aureus em 20 amostras de leite de tanques de expansão, de propriedades do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 98 Lista de quadros e tabelas M.Z. Troncarelli. - 2011 xx Tabela 21 - Resultados da mPCR frente ao cultivo microbiológico, para a detecção de S. agalactiae em 20 amostras de leite de tanques de expansão, de propriedades localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 99 Tabela 22 - Resultados da mPCR frente ao cultivo microbiológico, para a detecção de E. coli em 20 amostras de leite de tanques de expansão, de propriedades localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 99 Tabela 23 - Resultados da mPCR frente ao cultivo microbiológico, para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em 20 amostras de leite de tanques de expansão, de propriedades localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 100 Tabela 24 - Limiares de detecção dos produtos das PCRs individuais e da mPCR para a pesquisa do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli, utilizando os iniciadores SAU1 e SAU2, SIP3 e SIP4 e Ecoli1 e Ecoli2, a partir do material genético extraído de cepas de referência. Botucatu-SP, 2011. 104 ISTA DE IGURAS Lista de figuras xxii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ISTA DE IGURAS Figura 1 - Municípios do Estado de São Paulo onde foram realizadas as colheitas de amostras de leite bovino (identificados pelo marcador, em vermelho). Em “A”: município de Botucatu-SP, onde foram realizadas colheitas de amostras de leite e análises laboratoriais. Botucatu-SP, 2011. 56 Figura 2 - Colheita de amostra de leite bovino, de tanque de expansão, utilizando concha de aço inox, estéril. Botucatu-SP, 2011. 57 Figura 3 - A: Quarto mamário bovino apresentando mastite clínica necrótico-ulcerativa. B: Prova de Tamis (caneca telada de fundo escuro), realizada para o diagnóstico de mastite clínica. Botucatu-SP, 2011. 58 Figura 4 - A: colheita de amostra de leite bovino para realização da prova de CMT (B). C: anti-sepsia do esfíncter do teto com algodão embebido em álcool iodado. D: colheita de amostra de leite para cultivo microbiológico. E: colheita de amostra de leite (pool dos quatro quartos) para CCS. F: caixa de transporte dos tubos coletores para CCS. Botucatu-SP, 2011. 59 Figura 5 - Ampolas contendo linhagens bacterianas liofilizadas, utilizadas no estudo como referências (controles positivos) nas provas diagnósticas. Botucatu-SP, 2011. 63 Lista de figuras xxiii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Figura 6 - Petrifilm utilizado para contagem bacteriana total (CBT) a partir de amostras de leite bovino, obtidas de tanque de expansão. Botucatu-SP, 2011. 64 Figura 7 - Padrões de peso molecular utilizados nas análises de PCR e mPCR. Botucatu-SP, 2011. 67 Figura 8 - Esquema das diluições seriadas realizadas com amostra de DNA quantificado de E. coli (amostra de referência) para avaliação da sensibilidade analítica da técnica de mPCR. Botucatu-SP, 2011. 69 Figura 9 - A: Sistema de ordenha bovino tipo balde-ao-pé. B: Sistema de ordenha tipo canalizado, com manejo de bezerro ao pé. C: Sistema de ordenha bovino tipo canalizado convencional. Botucatu-SP, 2011. 75 Figura 10 - A: Sistema de ordenha bovino tipo canalizado de alta tecnificação. B: Vacas de excelente genética e alta produção leiteira, em sistema de ordenha tecnificado. Botucatu-SP, 2011. 76 Lista de figuras xxiv _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Figura 11- Propriedades leiteiras com manejo higiênico deficitário. A: presença de cão na sala de ordenha. B: conjunto de ordenha sujo com fezes bovinas. C: bovino em repouso na lama, imediatamente após ordenha. D: intenso grau de sujidade do úbere em animal recém-chegado à sala de ordenha. E e F: utilização de pano para secagem dos tetos. Botucatu-SP, 2011. 78 Figura 12- Procedimento de desinfecção do conjunto de ordenha (sistema balde ao pé) realizado em uma das 20 propriedades avaliadas, no Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 79 Figura 13- Procedimento de desinfecção back-flushing dos conjuntos de ordenha (sistema canalizado), realizado em uma das 20 propriedades avaliadas, no Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. 79 Figura 14- Propriedades leiteiras com manejo e higiene satisfatórios. A: realização de pré-dipping com ácido lático. B: tetos limpos e secos antes da ordenha. C e D: Sala de ordenha limpa. E: Tetos com solução desinfetante (iodo glicerinado) – pós-dipping. F: Animais se alimentando após ordenha. Botucatu-SP, 2011. 80 Figura 15- Amostra de leite bovino submetida ao CMT. Nota-se coagulação (gelificação) classificada como três cruzes, caracterizando mastite subclínica. Botucatu-SP, 2011. 81 Lista de figuras xxv _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Figura 16- Isolados bacterianos obtidos a partir de amostras de leite bovino, colhidas de tanques de expansão. À esquerda, características fenotípicas macroscópicas das colônias. À direita, características fenotípicas microscópicas visualizadas em microscópio óptico com óleo de imersão, coloração de Gram e aumento de 100 vezes. A: colônias de estafilococos beta-hemolíticos isolados em ágar sangue. B: cocos Gram positivos, dispostos em grupamentos (cachos-de-uva). C: colônias de estreptococos beta-hemolíticos isolados em ágar sangue. D: cocos Gram positivos, dispostos em cadeias. E: colônias de enterobactérias, lactose positivas, isoladas em ágar MacConkey. F: bacilos Gram negativos. Botucatu-SP, 2011. 83 Figura 17- Produtos de mPCR obtidos a partir de cepas de referência. 1: S. aureus (1.300pb); 3: E.coli (660pb); 5: E. coli e S. agalactiae (590pb); 7: S. agalactiae (293pb); 2,4, 6 e 8: controles negativos; 9 e 10: S. aureus, E. coli e S. agalactiae; 11: padrão de peso molecular 100pb (Invitrogen). Botucatu-SP, 2011. 92 Figura 18- Produtos de mPCR obtidos a partir do DNA extraído de amostras de leite de tanques de expansão. 1: padrão de peso molecular 100pb (Invitrogen). 2: cepas de referência de S. aureus (1.300pb); E. coli (660pb) e S. agalactiae (590pb e 293pb) – controles positivos. 3: controle negativo. 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 16, 17, 18, 19, 20: amostras negativas. 5,12,14,15: amostras positivas para E.coli. 12: amostra positiva para S. agalactiae. Botucatu-SP, 2011. 92 Lista de figuras xxvi _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Figura 19- Produtos de PCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de S. aureus, utilizando os iniciadores SAU1 e SAU2 e a cepa de referência do micro-organismo (ATCC 25923), nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu-SP, 2011. 100 Figura 20- Produtos de PCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de S. agalactiae, utilizando os iniciadores SAGA1 e SAGA2 e a cepa de referência do micro-organismo (ATCC 13813), nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu-SP, 2011. 101 Figura 21- Produtos de PCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de S. agalactiae, utilizando os iniciadores SIP3 e SIP4 e a cepa de referência do micro- organismo (ATCC 13813), nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu-SP, 2011. 101 Figura 22- Produtos de PCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de E. coli, utilizando os iniciadores Ecoli1 e Ecoli2 e a cepa de referência do micro-organismo (ATCC 11229), nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu-SP, 2011. 102 Lista de figuras xxvii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Figura 23- Produtos de mPCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli utilizando os iniciadores SAU1 e SAU2, SIP3 e SIP4 e Ecoli1 e Ecoli2, e as cepas de referência dos micro- organismos (ATCCs 25923, 13813 e 11229), individualmente, nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu-SP, 2011. 103 Figura 24- Produtos de mPCR obtidos para avaliação do limiar de detecção do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli utilizando os iniciadores SAU1 e SAU2, SIP3 e SIP4 e Ecoli1 e Ecoli2, e as cepas de referência dos micro- organismos (ATCCs 25923, 13813 e 11229), em conjunto, nas concentrações de 10fg; 100fg; 1pg; 10pg; 100pg e 1ng. Controle negativo: água MiliQ. Botucatu- SP, 2011. 104 ISTA DE BREVIATURAS E ÍMBOLOS Lista de abreviaturas e símbolos xxix _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ISTA DE BREVIATURAS E ÍMBOLOS A – adenina ATCC – American Type Culture Collection c – concentração C – citosina CEEA – Câmara de Ética em Experimentação Animal C. bovis – Corynebacterium bovis CCS – Contagem de Células Somáticas CBT – Contagem Bacteriana Total CMT – California Mastitis Test E. coli – Escherichia coli DHVSP – Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública DNA – ácido desoxirribonucléico DNAses – enzimas degradadoras de DNA dNTPs – desoxinucleotídeos-trifosfatos EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético Esp – especificidade et al. – e colaboradores EUA – Estados Unidos da América fg – fantograma g – unidade de medida de força centrífuga relativa FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz FMVZ – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia G – guanina GO – Estado de Goiás HCl – ácido clorídrico H2S – gás sulfídrico IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IAL – Instituto Adolfo Lutz IN – Instrução Normativa INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde KCl – cloreto de potássio Lista de abreviaturas e símbolos xxx _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 L – litro L-TD – L-triptofano desaminase MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MG – Estado de Minas Gerais MgCl2 – cloreto de magnésio mL – mililitro mm - milímetros μL – microlitros μm - micrômetros mmol – milimol mM - milimolar mPCR – Multiplex PCR n – número amostral ng - nanograma nm – nanômetro no. – número NaCl – cloreto de sódio NUPEMAS – Núcleo de Pesquisas em Mastites p – nível descritivo (estatístico) pb – pares de bases PCR – Reação em Cadeia pela Polimerase pg – picograma pH – potencial hidrogeniônico pmol – picomol PM – peso molecular PR – Estado do Paraná P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa RJ – Estado do Rio de Janeiro RNA – ácido ribonucléico RNAses – enzimas degradadoras de RNA rpm – rotações por minuto RS – Estado do Rio Grande do Sul RVP – relação de verossimilhança positiva RVN – relação de verossimilhança negativa Lista de abreviaturas e símbolos xxxi _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 S. agalactiae – Streptococcus agalactiae S. aureus – Staphylococcus aureus SC – Estado de Santa Catarina S. dysgalactiae – Streptococcus dysgalactiae S. epidermidis – Staphylococcus epidermidis S. hyicus – Staphylococcus hyicus S. intermedius – Staphylococcus intermedius S. parauberis – Streptococcus parauberis S. simulans – Staphylococcus simulans S. uberis – Streptococcus uberis Sens – sensibilidade spp. – gênero SP – Estado de São Paulo T – timina TBE – Tampão Tris Borato-EDTA TCC – 2,3,5 cloreto de trifeniltetrazólio TRIS – Tris (hidroximetil)-amino-metano UFC – unidades formadoras de colônias UHT – ultra high temperature UI – unidades internacionais UNESP – Universidade Estadual Paulista UV – ultravioleta v - volume V – volts VPP – valor preditivo positivo VPN – valor preditivo negativo X – sinal de multiplicação (vezes) χ2 – qui-quadrado ’ – minuto % – por cento °C – graus Celsius UMÁRIO Sumário xxxiii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 UMÁRIO Página RESUMO xxxvii ABSTRACT xxxix 1 INTRODUÇÃO 41 2 REVISÃO DA LITERATURA 45 2.1 Principais agentes contagiosos e ambientais envolvidos na mastite bovina 45 2.2 S. aureus 46 2.3 S. agalactiae 47 2.4 E. coli 48 2.5 Métodos de diagnóstico molecular aplicados à detecção dos principais patógenos bacterianos causadores de mastite bovina 49 3 OBJETIVOS 53 3.1 Gerais 53 3.2 Específicos 53 4 MATERIAL E MÉTODOS 55 4.1 Autorização para realização do estudo 55 4.2 Seleção de rebanhos e colheita de amostras de leite 55 4.3 Animais e diagnóstico de mastite 57 4.4 Dados epidemiológicos 60 4.5 Análise microbiológica 61 4.5.1 Cultivo das amostras 61 4.5.2 Isolamento e identificação de S. aureus 61 4.5.3 Isolamento e identificação de S. agalactiae 62 4.5.4 Isolamento e identificação de E. coli 62 Sumário xxxiv _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 4.5.5 Amostras bacterianas padrão 63 4.6 CBT 64 4.7 CCS 65 4.8 mPCR 65 4.8.1 Pesquisa dos materiais genômicos de S. aureus, S. agalactiae e E. coli nas amostras de leite colhidas dos tanques de expansão 65 4.8.1.1 Extração dos ácidos nucléicos 65 4.8.1.2 Desenho dos iniciadores 66 4.8.1.3 Amplificação do material genético pela mPCR 66 4.8.1.4 Visualização dos produtos amplificados 67 4.8.2 Teste de sensibilidade analítica da mPCR 67 4.8.3 Teste de especificidade analítica da mPCR 69 4.8.4 Teste de reprodutibilidade da mPCR 69 4.9 Análise dos resultados 70 5 RESULTADOS 72 5.1 Questionário epidemiológico e características das propriedades 72 5.2 CMT 82 5.3 Isolados bacterianos 83 5.4 CCS 88 5.5 CBT (tanques de expansão) 91 5.6 mPCR 91 5.7 Limiares de detecção 100 5.7.1 PCR individual para S. aureus (iniciadores SAU1 e SAU2) 100 5.7.2 PCR individual para S. agalactiae (iniciadores SAGA1 e SAGA2) 101 5.7.3 PCR individual para S. agalactiae (iniciadores SIP3 e SIP4) 101 5.7.4 PCR individual para E. coli (iniciadores Ecoli1 e Ecoli2) 102 Sumário xxxv _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 5.7.5 mPCR para S. aureus, S. agalactiae e E. coli com DNAs das ATCCs separadas (iniciadores SAU1 e SAU2, Ecoli1 e Ecoli2, e SIP3 e SIP4) 103 5.7.6 mPCR para S. aureus, S. agalactiae e E. coli com DNAs das ATCCs juntas (iniciadores SAU1 e SAU2, Ecoli1 e Ecoli2, e SIP3 e SIP4) 104 5.8 Especificidade da mPCR 105 5.9 Reprodutibilidade da mPCR 106 6 DISCUSSÃO 107 6.1 Avaliação do manejo de ordenha e dos dados obtidos por questionários epidemiológicos 108 6.2 Ocorrência de mastites clínica e subclínica nos rebanhos avaliados, e isolamentos microbianos nas amostras de leite individuais e compostas 111 6.3 CCS e CBT 113 6.4 mPCR 114 6.5 Características epidemiológicas dos rebanhos e relação com resultados de cultivo microbiológico e da mPCR a partir de amostras de leite dos tanques de expansão 118 7 CONCLUSÕES 119 8 BIBLIOGRAFIA 121 ANEXOS 129 TRABALHOS CIENTÍFICOS 133 NORMAS PARA PUBLICAÇÃO 157 ESUMO Resumo xxxvii _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ESUMO TRONCARELLI, M.Z. Padronização da técnica de multiplex PCR para a detecção de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Escherichia coli em amostras de leite bovino, obtidas de tanques de expansão. Botucatu-SP, 2011. 129p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Com o objetivo de normatizar a cadeia produtiva visando à melhoria da qualidade do leite no Brasil, o MAPA delineou a IN n° 51, em vigor desde julho de 2005. Em linha com estes parâmetros, objetivou-se, no presente estudo, padronizar o método de mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão, e avaliar esta técnica como possível recurso diagnóstico a ser empregado em programas de controle de qualidade do leite oferecido para consumo. Foram visitadas 20 propriedades leiteiras do Estado de São Paulo, com sistema de ordenha mecânica e tanque de expansão próprio, nas quais foram colhidas amostras de leite para a realização da mPCR, cultivo microbiológico, CCS e CBT. S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram isolados, em 30%; 10% e 40% das amostras de leite dos tanques de expansão, respectivamente, e detectados pela mPCR em 0; 10% e 35%, respectivamente. A mPCR apresentou acurácia de 78,3%; sensibilidade de 37,5% e especificidade de 93,2% e limiar de detecção de 100 picogramas. A CCS apresentou mediana de 395.000 células/mL, e 55% das amostras avaliadas resultou em valores de CBT satisfatórios para mesófilos. O índice de mastite subclínica nos rebanhos avaliados pelo CMT foi de 28,3%. Conclui-se que a mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foi padronizada com êxito no presente estudo, e pode ser indicada como método complementar aos utilizados na rotina diagnóstica de mastite bovina e qualidade do leite. Palavras-chave: bovinos, mastite, bactérias, leite de mistura, biologia molecular, diagnóstico. BSTRACT Abstract xxxix _______________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 BSTRACT TRONCARELLI, M.Z. Multiplex PCR standardization for Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae and Escherichia coli detection in bovine milk samples obtained from bulk tanks. Botucatu-SP, 2011. 129p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Brazilian Ministry of Agriculture and Supply, objecting the improvement of milk quality in Brazil, published the Normative Instruction n. 51, a technical group of rules for milk business that has been attended since July 2005. In line with these parameters, the aim of the present study was to standardize the mPCR test for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection in bovine milk samples obtained from bulk tanks, in order to evaluate this method as a possible tool to be used in milk quality control programs. Twenty milk farms with milking machine system and individual bulk tank, of different regions of Sao Paulo state were sampled. Bulk milk samples were collected for mPCR, microbiological culture, Somatic Cell Count and Total Bacterial Count. S. aureus, S. agalactiae e E. coli were isolated in 30%; 10% and 40% samples, respectively, and detected by mPCR in 0; 10% and 35% samples, respectively. mPCR presented 78,3% accuracy; 37,5% sensitivity and 93,2% specitivity and detection lower of 100pg for each pathogen. CCCs presented medium of 395.000 cells/mL and 55% of evaluated samples resulted in TBC satisfactory values for mesophilus. Subclinical mastitis index in evaluated cattle, by CMT, was 28,3%. In conclusion, mPCR for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection was successfully standardized in the present study and can be indicated as a complementary diagnosis to the routine methods for bovine mastitis and milk quality’s monitoring. Key words: bovine, mastitis, bacteria, bulk milk, molecular biology, diagnosis. NTRODUÇÃO Introdução 41 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 NTRODUÇÃO O leite bovino é um excelente alimento pelo seu valor nutritivo, conferido principalmente pela presença de proteínas, carboidratos, gorduras, sais minerais, vitaminas e água (FAGUNDES e OLIVEIRA, 2004). É essencial para a nutrição dos humanos de todas as idades, especialmente de recém-nascidos (OLIVEIRA et al., 1999). Estudos realizados pelo Ministério da Saúde e pelo IBGE, considerando a população brasileira no ano de 2007, composta por aproximadamente 183 milhões de habitantes, evidenciaram quehá demanda de produção de mais de 39 bilhões de litros de leite por ano, para que sejam atendidas as recomendações de ingestão diária por faixa etária (EMBRAPA, 2011). No entanto, segundo estimativas da Pesquisa da Pecuária Nacional, realizada pelo IBGE, houve produção de aproximadamente 30 bilhões de litros de leite em 2010, por 23 milhões de bovinos ordenhados, totalizando, em média, produção de 1.326 litros anuais por animal (pouco mais de 3,5 litros por vaca/dia). O reduzido volume de produção de leite, bem como a qualidade do produto enviado aos laticínios e oferecido para o consumo tem sido alvo de constante preocupação no Brasil. Em muitas propriedades, ainda persistem problemas de manejo, condições deficientes de produção, mão-de-obra pouco qualificada, limitações de ordem genética dos rebanhos, nutrição inadequada dos animais e elevada prevalência de mastites (COSTA, 2002). A mastite bovina determina grave impacto no setor leiteiro, causando sérios prejuízos, tanto pelo comprometimento funcional da glândula mamária, como pelo descarte prematuro de fêmeas e/ou morte ocasional de animais (MOTA et al., 2004; RADOSTITS et al., 2007;). Trata-se de processo inflamatório da glândula mamária, de ordem fisiológica, traumática, alérgica, metabólica, psicológica ou infecciosa. A maioria dos casos de mastite bovina apresenta etiologia bacteriana e, em aproximadamente 80%, cinco espécies de micro-organismos (S. aureus, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis e E. coli) são responsáveis pelo estabelecimento da doença (BRITO et al., 1999; BRADLEY, 2002). Além da importância destes micro-organismos como agentes causadores de mastites, também representam risco à saúde pública, Introdução 42 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 já que podem produzir toxinas, algumas termorresistentes, resistindo à pasteurização e ultrapasteurização, favorecendo sua permanência no leite e derivados. Com efeito, a identificação precoce destes patógenos pode contribuir para ações de controle e monitoramento da mastite em rebanhos leiteiros, com conseqüente melhora da qualidade do leite entregue ao laticínio, com vistas a assegurar a saúde pública e maior rendimento industrial. A IN n°51 (BRASIL, 2002), em vigor desde julho de 2005, constitui um conjunto de normas técnicas de produção, identidade, qualidade, coleta e transporte de leite, elaboradas pelo MAPA, de maneira a melhorar a qualidade do leite produzido no país, orientando os diferentes elos da cadeia leiteira. Há demanda por métodos rápidos, com elevada sensibilidade e especificidade, custo acessível e aplicabilidade para o processamento de grande número de amostras de leite (GILLESPIE e OLIVER, 2005), visando à identificação de patógenos e a tomada de ações imediatas para o tratamento e controle de mastite nos rebanhos. A biologia molecular tem contribuído significativamente na identificação de micro-organismos em amostras compostas ou individuais de leite e também em derivados lácteos, mesmo na presença de interferentes, que dificultam a detecção pelos métodos tradicionais de cultivo microbiológico. Ressalta-se a inibição da multiplicação bacteriana decorrente da presença de resíduos de antimicrobianos, o número reduzido de patógenos na amostra e a contaminação com micro-organismos ambientais (PHUEKTES et al., 2003). Entre os métodos de diagnóstico molecular, assume destaque a PCR. Esta técnica requer pouco tempo para processamento e os resultados são caracterizados por elevados índices de sensibilidade e especificidade analítica. Pesquisas recentes utilizando diferentes protocolos de diagnóstico molecular para a detecção simultânea dos DNAs de mais de um agente bacteriano de mastite, denominados multiplex PCR, a partir de amostras de leite individuais ou compostas, têm apresentado excelentes resultados, contribuindo inclusive para estudos epidemiológicos e direcionamento de medidas de controle. Nesse contexto, a proposta do presente estudo foi padronizar a técnica de mPCR como método diagnóstico rápido e sensível para a detecção dos três principais patógenos causadores de mastites (S. aureus, S. agalactiae e E. coli) em amostras de leite coletadas em tanques de expansão, de forma a avaliar esta Introdução 43 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 técnica como possível recurso diagnóstico a ser utilizado em programas de monitoramento da qualidade do leite e controle de mastites. EVISÃO DA ITERATURA Revisão da literatura 45 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 EVISÃO DA LITERATURA 2.1 Principais agentes contagiosos e ambientais envolvidos na mastite bovina Considerando as fontes de infecção e vias de transmissão, os agentes causadores de mastite foram convencionalmente classificados como contagiosos e ambientais. Os contagiosos estão presentes na microbiota da pele dos quartos mamários, dos tetos, nas mucosas e conjuntivas dos animais (denominados de vaca-dependentes), bem como nos equipamentos de ordenha, em panos utilizados na limpeza e secagem dos tetos, e nas próprias mãos do ordenhador (BRADLEY, 2002). As moscas podem participar como vetores mecânicos de agentes contagiosos, especialmente em propriedades com elevada infestação, contribuindo para a transmissão dos micro-organismos às novilhas no período pré-parto (RADOSTITS et al., 2007). A infecção pelos agentes contagiosos ocorre predominantemente durante a ordenha, e os micro-organismos, de forma oportunista, invadem a glândula mamária. Dentre os principais patógenos contagiosos destacam-se S. aureus e S. agalactiae. Estes micro-organismos ocorrem com elevada prevalência e geralmente causam mastite subclínica, de longa duração e com elevada CCS. A mastite subclínica exige diagnóstico específico e está relacionada à redução da produção de leite, muitas vezes não percebida pelos produtores (HORTET e SEEGERS, 1998). O grupo de agentes ambientais está presente na matéria orgânica (solo e fezes), na água, terra, ar e na cama dos animais. A infecção ocorre principalmente no período entre-ordenhas, mas pode ocorrer também durante a ordenha. Fungos, leveduras, algas e enterobactérias são os principais patógenos ambientais, tendo especial importância neste grupo E. coli. Apesar da menor prevalência das mastites causadas por estes agentes, geralmente causam quadros clínicos severos, superagudos, podendo levar os animais a óbito. Há alterações importantes na glândula mamária, que apresenta hiperemia, aumento de volume, hipersensibilidade e alteração de comportamento das fêmeas, como recusa em permitir o aleitamento. Podem ocorrer, ainda, sinais sistêmicos como hipertermia, dispnéia, apatia, atonia Revisão da literatura 46 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ruminal, taquicardia, inapetência, prostração e morte, em decorrência à sepse. Além disso, são observadas alterações no aspecto do leite, que pode conter pus, grumos, flocos, dessora ou presença de sangue (DUNN, 1994). Apesar dos diversos estudos realizados mundialmente, a mastite ainda permanece como doença de elevada prevalência em rebanhos leiteiros (HALASA et al., 2007). Em estudo realizado por Langoni et al. (1998), foram examinadas 7.902 amostras de leite de vacas com mastite subclínica e 850 clínica, em municípios do Estado de São Paulo. Foi verificado que 32,7% das mastites subclínicas eram resultantes da infecção por Staphylococcus sp. e 18,3% estavam relacionadas à infecção por Streptococcus sp. Já as enterobactérias foram responsáveis por 25,6% das mastites clínicas. 2.2 S. aureus S. aureus é o agente etiológico mais freqüente nos quadros de mastite contagiosa em todos os rebanhos leiteiros. É encontrado na pele, mucosas e conjuntivas dos animais e dos humanos, o que torna praticamente impossível a erradicação nos rebanhos. A mastite por S. aureus está associada à elevada CCS, drástica redução da produção de leite e reduzidas taxas de cura microbiológica. Em bovinos, estima-se que a produção de leite esteja reduzida em até 45% por quarto infectado e em até 15% por vaca infectada (BRITO e BRITO, 1998). Segundo Nickerson (1993), aproximadamente 19 a 47% das vacas em um rebanho poderão estar infectadas por este micro-organismo. Caracteriza-se como bactéria Gram positiva, anaeróbia facultativa (fermentadora), positiva à prova da catalase, negativa à oxidase e imóvel, multiplicando-se a temperaturas que variam de 15 a 45°C e em concentrações de NaCl tão altas quanto 15%. É coagulase positiva, assim como a maioria das linhagens dos demais estafilococos patogênicos (S. intermedius e S. hyicus), fermenta o manitol, a maltose e é resistente à polimixina B (300 UI) (QUINN et al., 2005). À microscopia, apresenta-se sob a forma de cocos, cujo diâmetro varia de 0,8 a 1,0 μm, ou agrupados em arranjos semelhantes a “cachos de uva”, embora as células possam estar isoladas. Em meio sólido, as colônias são circulares-convexas, com 2 a 3 mm de diâmetro, de coloração branca ao amarelo-dourado, com halo de hemólise ao redor (QUINN et al., 2005). Podem ser isoladas em meios seletivos como o Revisão da literatura 47 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 ágar Baird Parker, apresentando-se de coloração negra, circundadas por um halo de precipitação (interno) e outro transparente (externo) (CARNEIRO, 2009; FACCIOLI, 2010). S. aureus expressa grande variedade de fatores de virulência, os quais contribuem com a colonização, invasão e persistência deste patógeno no hospedeiro. A maioria das linhagens do micro-organismo produz exotoxinas, ou citolisinas, incluindo hemolisinas, entero-hemolisinas, toxina da síndrome do choque tóxico e toxinas exfoliativas, além de nucleases, proteases, lipases, coagulases, hialuronidase e colagenase (TODAR, 2002). A ação combinada destes fatores de virulência determina efeitos deletérios às células do hospedeiro, e o aparecimento de uma variedade de infecções em humanos e animais, bem como síndromes tóxicas no humano suscetível (FAGUNDES e OLIVEIRA, 2004). As exotoxinas (citolisinas) são importantes fatores de virulência e, especialmente no caso da mastite, produzem agravos ao tecido mamário. São termorresistentes, podendo permanecer viáveis aos tratamentos térmicos comumente aplicados ao leite, como a pasteurização e esterilização (FAGUNDES e OLIVEIRA, 2004), constituindo importante risco à saúde pública. S. aureus apresenta elevada resistência aos antimicrobianos, o que dificulta o tratamento. Além disso, este micro-organismo possui grande capacidade de invasão dos adenômeros mamários e fagócitos, o que permite sua instalação em todo tecido glandular, com formação de tecido fibroso nos focos da infecção, dificultando o acesso dos antimicrobianos convencionais. 2.3 S. agalactiae S. agalactiae é bactéria Gram-positiva, altamente contagiosa, que apresenta habilidade de aderência ao tecido mamário. O microambiente específico do úbere é necessário para a multiplicação bacteriana. Por isso, é considerado agente contagioso obrigatório da glândula mamária. As colônias são pequenas, ao redor de 0,5 a 1 mm de diâmetro, translúcidas e apresentando alfa ou beta hemólise. À microscopia, apresentam-se como cocos isolados, aos pares ou em cadeias. É classificada bioquimicamente por Revisão da literatura 48 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 provas de hidrólise de esculina e do hipurato de sódio, CAMP test, inulina, lactose, manitol, rafinose, salicina, sorbitol, trealose e a multiplicação em NaCl a 6,5% (QUINN et al., 2005). Antes do uso da penicilina no tratamento das mastites, os estreptococos eram reportados como causadores de 90% das mastites bovinas. Estima-se que pode haver até quarenta casos subclínicos para cada caso clínico em um rebanho afetado por essa bactéria (KEEFE, 1997). A bactéria causa geralmente mastites subclínicas que tendem à cronicidade, com elevada CCS (acima de 1.000.000 células/mL), e marcada redução na produção e qualidade do leite (NMC, 1996). S. agalactiae infecta a cisterna e o sistema de ductos da glândula mamária determinando, em alguns casos, substituição do tecido secretor por tecido fibroso. Domingues et al. (1998) observaram que em quartos mamários mastíticos infectados por S. agalactiae, houve redução de 25,2% na produção de leite, em comparação com seus homólogos negativos, o que reafirma sua relevância como agente nas mastites e a importância das ações de controle, levando-se em consideração sua alta contagiosidade. Vacas infectadas com S. agalactiae eliminam elevado número de bactérias no leite, determinando alta contagem bacteriana total (CBT) no leite enviado para a indústria (SOUZA et al., 2008). Quando há diagnóstico precoce, são raros os casos de perda do quarto afetado. A resposta ao tratamento com antimicrobianos é boa e permite até a erradicação de S. agalactiae de rebanhos infectados (KEEFE, 1997). 2.4 E. coli Trata-se de bactéria Gram negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, que inclui os principais agentes causadores de mastite ambiental como Klebsiella spp. e Enterobacter spp. A mastite por E. coli geralmente é clínica, aguda ou hiperaguda, representando risco à vida do animal (DUNN, 1994). No entanto, há relatos de que pode não haver diferenças na manifestação de mastite clínica ou subclínica por enterobactérias (COSTA et al., 1998) e que infecções persistentes por E. coli podem causar somente mastite subclínica (DOPFER et al., 1999). Revisão da literatura 49 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 Pode ser isolada em meios seletivos para enterobactérias, como o ágar MacConkey, após incubação a 37°C durante 18-24 horas, apresentando colônias pequenas, fermentadoras de lactose. E. coli pode ser identificada bioquimicamente utilizando as seguintes provas ou substratos: gás/glicose, citrato, motilidade, indol e lisina (KONEMAN et al., 1997). As infecções por este agente estão relacionadas ao seu comportamento oportunista, veiculado das fezes dos animais, por via ascendente, pelo canal galactóforo (RADOSTITS et al., 2007). Diversas linhagens de E. coli são produtoras de citotoxinas como termolisinas, fator necrosante citotóxico, enterotoxinas e verotoxina (VT) ou “shiga-like” toxina (STX), de grande importância em Saúde Pública, visto que são associadas a casos de diarréia, septicemia, infecção do trato urinário e meningite nos humanos (FORSYTHE, 2002). E. coli habita o trato intestinal de bovinos saudáveis, que podem ser os principais reservatórios do sorotipo O157:H7 (FORSYTHE, 2002). Este sorotipo pode ser isolado de fezes e leite de bovinos assintomáticos (JAYARAO e HENNING, 2001) e causa colite hemorrágica e falência renal, com elevada letalidade, especialmente em crianças (CFSPH, 2009). Vale ressaltar o recente surto de infecção por E. coli enterohemorrágica (EHEC)/Síndrome Hemolítica Urêmica, com 3.092 casos e 31 óbitos notificados em 16 países, sendo 14 situados na Europa, decorrentes, principalmente, do consumo de brotos crus contaminados, como lentilhas, alfafa, feijão azuki, entre outros, produzidos em uma fazenda na Baixa Saxônia, ao sul de Hamburgo, Alemanha (ANVISA, 2011). 2.5 Métodos de diagnóstico molecular aplicados para a detecção dos principais patógenos bacterianos causadores de mastite bovina A biologia molecular tem contribuído, recentemente, em diversos aspectos no diagnóstico da mastite bovina, a partir de amostras de leite individuais ou compostas. Esta técnica permite a identificação de micro- organismos em animais carreadores ou em estágios iniciais da doença, apresentando elevada sensibilidade e especificidade (RIFFON et al., 2001). Os métodos de biologia molecular também têm sido empregados para a pesquisa Revisão da literatura 50 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 de patógenos em leite UHT e em derivados lácteos (GANDRA, 2006; CHOTÁR et al., 2006). Há diversos estudos disponíveis sobre a utilização da técnica de PCR para a identificação e genotipagem dos agentes causadores de mastite, bem como dos genes codificadores de toxinas (MARTINEAU et al., 1998; CREMONESI et al., 2005; FOURNIER et al., 2008). A PCR pode ser realizada utilizando somente um par de iniciadores, para amplificação do DNA de um micro-organismo-alvo (gênero ou espécie), denominada simplex PCR (ou PCR convencional). No entanto, há possibilidade de otimizar a identificação dos principais patógenos da mastite, realizando a amplificação simultânea de dois ou mais DNAs-alvos, com a utilização de mais de um par de iniciadores com ajuste de temperaturas ótimas para as reações, denominada multiplex PCR (mPCR). Além disso, novos métodos utilizando as seqüências das regiões 16S ou 23S rDNA são utilizados com sucesso para a identificação de inúmeras bactérias (FORSMAN et al., 1997). Em estudo realizado por Riffon et al. (2001), foram avaliadas a sensibilidade, especificidade e rapidez da técnica de mPCR para a detecção dos principais patógenos de mastite bovina (E. coli, S. aureus, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. parauberis e S. uberis). Para tanto, os pesquisadores avaliaram amostras de leite inoculadas com cepas padrão de cada micro- organismo, isoladas de casos de mastite, utilizando sete pares de iniciadores espécie-específicos. Verificou-se que o limite de detecção de S. aureus foi de 3,125 × 102 UFC/mL de leite, comprovando a excelente sensibilidade da técnica. A especificidade também foi demonstrada, pois não foram observadas amplificações de DNAs não-alvos, como o de P. aeruginosa, que foi testado frente aos iniciadores espécie-específicos utilizados no estudo. A técnica de mPCR também foi utilizada por Phuektes et al. (2001) para detecção de S. aureus, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. uberis em 117 amostras de leite de vacas com mastite subclínica. A PCR foi significativamente mais sensível que o cultivo microbiológico na detecção de S. aureus e S. uberis, apresentando limiares de detecção, para cada micro- organismo, de 104 UFC/mL e 103 UFC/mL, respectivamente. No entanto, não houve diferenças significativas entre a PCR e o cultivo para a detecção de S. agalactiae e S. dysgalactiae. Os resultados sugerem que a mPCR pode ser Revisão da literatura 51 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 utilizada como método alternativo na rotina diagnóstica para detecção rápida, sensível, específica e simultânea destes agentes em amostras de leite bovino. Phuektes et al. (2003) utilizaram a técnica de mPCR para a identificação de S. aureus, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. uberis em 176 amostras de leite de tanque de expansão, relacionando com resultados de CCS, CBT e contagem de bactérias termodúricas. Com a técnica de mPCR, foi possível a detecção de S. uberis, S. dysgalactiae, S. agalactiae e S. aureus em 78 (44%), 49 (28%), 38 (22%) e 28 (16%) das amostras, respectivamente. Neste estudo, a presença de S. agalactiae estava associada às altas CCS e CBT do tanque. Chotár et al. (2006) investigaram a presença do gene que codifica a proteína imunogênica de superfície de S. agalactiae, S. aureus e E. coli, e verificaram alta sensibilidade e especificidade da técnica, encontrando limite mínimo para detecção de S. agalactiae de 6 UFC/mL e 16 UFC/mL para os outros patógenos. Há ainda possibilidade da utilização da mPCR em tempo real para a detecção simultânea de patógenos, bem como sua quantificação em amostras de leite individuais ou compostas (GILLESPIE e OLIVER, 2005). Entretanto, descrições da metodologia em tempo real revelam sua inabilidade em identificar algumas espécies de patógenos de mastite, devido ao elevado peso molecular (em pares de bases) dos materiais genômicos. Portanto, novos estudos e protocolos são necessários para ajustar a mPCR em tempo real no diagnóstico da mastite em animais. A utilização da técnica de mPCR é uma linha de pesquisa mundialmente atual na área de mastite e qualidade do leite, visando a contribuir como método diagnóstico rápido, altamente sensível e específico na identificação dos principais patógenos envolvidos na gênese das infecções mamárias. No entanto, ainda não existiam estudos realizados no Brasil sobre a detecção simultânea de S. aureus, S. agalactiae e E. coli pela mPCR em amostras de leite de tanque de expansão. Com efeito, o presente estudo pretendeu avaliar a técnica de mPCR como método de diagnóstico para a detecção destes três agentes, face ao impacto dos mesmos sobre a casuística de mastite no Brasil e conseqüente interferência na qualidade do leite. BJETIVOS Objetivos 53 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli. - 2011 BJETIVOS 3.1 Gerais • Padronizar a técnica de mPCR como método diagnóstico para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão, e avaliar esta técnica como possível procedimento para programas de controle de qualidade do leite oferecido para o consumo humano. 3.2 Específicos • Avaliar a freqüência de S. aureus, de S. agalactiae e de E. coli em amostras de leite obtidas dos tanques de expansão das propriedades, mediante o diagnóstico pela mPCR e cultivo microbiano; • Avaliar a CCS e a CBT nas amostras de leite dos tanques de expansão das propriedades; • Comparar a eficiência da mPCR na detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli como método de diagnóstico no leite do tanque, em relação ao cultivo microbiológico, realizado a partir de amostras de leite colhidas dos quartos mamários e do tanque; • Avaliar as características de cada propriedade, bem como sua relação com os resultados obtidos em cada técnica diagnóstica. ATERIAL E ÉTODOS Material e métodos 55 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 ATERIAL E MÉTODOS 4.1 Autorização para a realização do estudo O presente delineamento experimental foi aprovado pela Câmara de Ética em Experimentação Animal da FMVZ-UNESP/Botucatu-SP, no dia 10 de junho de 2008, protocolo n° 133/2008-CEEA (Anexo 1). As colheitas de amostras de leite dos bovinos foram também autorizadas pelos proprietários dos rebanhos envolvidos no estudo. 4.2 Seleção de rebanhos e colheita de amostras de leite Foram avaliadas 20 propriedades leiteiras dos seguintes municípios do centro oeste do Estado de São Paulo: Botucatu (4), Nova Odessa (2), Areiópolis (1), Pardinho (1), São Pedro (2), Lençóis Paulista (1), Porto Feliz (1), Itatinga (3), Lins (1), Agudos (1), Araras (1), Santa Rita do Passa Quatro (1) e Conchas (1) (Figura 1). Todas as propriedades contavam com sistema de ordenha mecânica para extração do leite e tanque de expansão próprio, pré- requisitos para inclusão na pesquisa. As propriedades continham de 19 a 970 vacas em lactação. Material e métodos 56 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 = marcador FIGURA 1. Municípios do Estado de São Paulo onde foram realizadas as colheitas de amostras de leite bovino (identificados pelo marcador, em vermelho). Em “A”: município de Botucatu-SP, onde foram realizadas colheitas de amostras de leite e análises laboratoriais. Botucatu-SP, 2011. As amostras de leite do tanque foram obtidas a partir do total de leite produzido por propriedade no período máximo de 24 horas. De cada tanque de expansão individual foram colhidos 250 mL de leite, utilizando conchas individuais de alumínio, estéreis (Figura 2). As amostras foram tomadas após adequada homogeneização, durante pelo menos cinco minutos, por meio do sistema de homogeneização automática, presente em todos os tanques de expansão avaliados, e acondicionadas em frascos de vidro com tampa rosqueável, estéreis. Foram transportadas sob refrigeração (4-8°C), em caixas isotérmicas contendo gelo reciclável, até o Laboratório do NUPEMAS, da FMVZ-UNESP/Botucatu-SP, onde foram separadas em duas alíquotas. A primeira foi utilizada para a análise microbiana, e a segunda congelada a -80°C para as análises moleculares. Para a CCS, amostras de leite obtidas dos Material e métodos 57 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 tanques de expansão foram acondicionadas em frascos plásticos com tampa, em triplicata. No interior de cada frasco, havia duas pastilhas do conservante bronopol, possibilitando o transporte das amostras em temperatura ambiente, até o laboratório. FIGURA 2. Colheita de amostra de leite bovino, a partir de tanque de expansão, utilizando concha de alumínio, estéril. Botucatu-SP, 2011. 4.3 Animais e diagnóstico de mastite Foram envolvidos no estudo preferencialmente os bovinos em período médio de lactação. Foram colhidas 6.066 amostras de leite de 1.550 animais. O diagnóstico da mastite clínica foi fundamentado nas alterações macroscópicas do leite (presença de pus, dessora, grumos e/ou estrias de sangue), na prova da caneca telada de fundo escuro ou Tamis (Figura 3); na presença de sinais de inflamação na glândula mamária (dor, hiperemia, sensibilidade, recusa em permitir o aleitamento dos bezerros) e/ou sinais sistêmicos (RADOSTITS et al., 2007). A mastite subclínica foi diagnosticada utilizando o CMT (SCHALM et al., 1971). Foram utilizadas para isolamento microbiano as amostras provenientes de tetos a partir do escore 1+ no CMT. As amostras de leite foram colhidas assepticamente após antissepsia dos tetos com solução de iodo glicerinado a 1%, e transportadas sob temperatura de refrigeração (4-8°C) para cultivo microbiano (Figura 4). Material e métodos 58 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 FIGURA 3. A: Quarto mamário bovino apresentando mastite clínica necrótico- ulcerativa. B: Prova de Tamis (caneca telada de fundo escuro), realizada para o diagnóstico de mastite clínica. Botucatu-SP, 2011. A A B Material e métodos 59 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 FIGURA 4. A: colheita de amostra de leite bovino para realização da prova de CMT (B). C: antissepsia do esfíncter do teto com algodão embebido em álcool iodado. D: colheita de amostra de leite para cultivo microbiológico. E: colheita de amostra de leite (pool dos quatro quartos) para CCS. F: caixa de transporte dos tubos coletores para CCS. Botucatu-SP, 2011. C D A B C D E F Material e métodos 60 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.4 Dados epidemiológicos Foram colhidas informações epidemiológicas de cada propriedade, utilizando questionário (Anexo 1), aplicado no dia da colheita das amostras. Foram avaliadas as condições gerais de manejo dos animais e higiene de ordenha, considerando os seguintes itens: produção leiteira (média diária), tipos de equipamentos de ordenha e de armazenamento do leite, manejo de ordenha, hábitos de higiene dos ordenhadores, medidas de diagnóstico e prevenção de mastite, prevalência de mastite clínica e/ou subclínica, protocolo de tratamentos antimicrobianos rotineiramente utilizados nos animais com mastite (FAGUNDES, 2007). Com as informações obtidas nos questionários, as propriedades foram classificadas de acordo com os métodos e condições gerais de ordenha (Tabela 1). TABELA 1. Características avaliadas em 20 propriedades leiteiras localizadas no centro-oeste do Estado de São Paulo, com base em questionário aplicado ao(s) proprietário(s) e/ou funcionário(s), para classificação quanto às condições higiênico-sanitárias de ordenha. Botucatu-SP, 2011. Item Característica 1 Mão-de-obra qualificada 2 Realização de pré-dipping 3 Realização de pós-dipping 4 Realização de teste da caneca telada (Tamis) 5 Realização do CMT 6 Manejo do rebanho pós-ordenha 7 Limpeza diária da sala de ordenha / equipamentos 8 Estrutura física da sala de ordenha 9 Registro dos dados dos animais 10 Acompanhamento médico-veterinário Classificação das propriedades (adaptada de FAGUNDES, 2007): > 8 itens atendidos: A (condições satisfatórias de ordenha) 5-8 itens atendidos: B (condições regulares de ordenha) < 5 itens atendidos: C (condições insatisfatórias de ordenha). Material e métodos 61 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.5 Análise microbiológica 4.5.1 Cultivo das amostras O cultivo microbiológico foi realizado no Laboratório do NUPEMAS, no DHVSP – FMVZ UNESP/Botucatu-SP. Todas as amostras de leite foram semeadas nos meios de ágar acrescido de sangue bovino (5%) e ágar MacConkey, mantidas a 37°C em aerobiose, por 72 horas. As linhagens de micro-organismos de origem bacteriana foram identificadas segundo as características morfo-tintoriais, bioquímicas e de cultivo (QUINN et al., 2005). As linhagens de S. aureus, S. agalactiae e E.coli isoladas foram conservadas em caldo nutriente (infusão cérebro-coração) com glicerol 5%, a -80°C, para estocagem (MURRAY et al., 2007). As amostras de leite obtidas dos tanques de expansão foram diluídas em solução salina a 10-1 e 10-2, para facilitar a visualização das colônias. As amostras puras (100) e suas respectivas diluições foram inoculadas nos meios de ágar sangue e MacConkey, espalhando-se com alça de Drigalski, e posteriormente incubadas a 37°C em aerobiose, por 72 horas. 4.5.2 Isolamento e identificação de S. aureus Dentre as colônias observadas e quantificadas no procedimento supracitado, foram selecionadas aquelas suspeitas de S. aureus. Portanto, colônias com ao redor de 2 a 3 mm de diâmetro, de coloração branca a amarelo dourado, hemolíticas (QUINN et al., 2005), foram repicadas para verificação microscópica, em esfregaços corados pelo método de Gram. Após observação das características morfológicas e de hemólise das colônias, as bactérias foram submetidas à prova enzimática da catalase. Isolados presumivelmente identificados como estafilococos pelas características morfo-tintoriais foram classificados como S. aureus quando resultaram positivos à prova de coagulase em tubo, à fermentação da maltose e manitol e apresentaram resistência à polimixina B (300UI) (KONEMAN et al., 1997). Os demais estafilococos isolados, incluindo os hemolíticos “não-aureus”, foram classificados como Staphylococcus sp. Material e métodos 62 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.5.3 Isolamento e identificação de S. agalactiae Colônias pequenas, ao redor de 0,5 mm de diâmetro, translúcidas e apresentando hemólise (sugestivas de S. agalactiae), foram classificadas fenotipicamente pelas provas da hidrólise da esculina e do hipurato de sódio, CAMP-test e de carboidratos e álcoois, representados pela inulina, lactose, manitol, rafinose, salicina, sorbitol e trealose, e multiplicação em NaCl a 6,5%. A interpretação foi realizada de acordo com Quinn et al. (2005), apresentado no Quadro 1. Os demais estreptococos isolados, incluindo os hemolíticos “não- agalactiae”, foram classificados como Streptococcus sp. QUADRO 1. Resultados das reações bioquímicas para identificação de Streptococcus agalactiae isolados de espécies animais Reação bioquímica Resultado da prova Inulina negativo Lactose positivo Rafinose negativo Salicina (positivo) Sorbitol negativo Trealose positivo Hipurato de sódio positivo Hidrólise de esculina negativo Multiplicação em NaCl a 6,5% negativo ( ) = maioria das estirpes positivas Fonte: modificado de Quinn et al. (2005). 4.5.4 Isolamento e identificação de E. coli E. coli no ágar MacConkey fermentam a lactose com a produção de ácidos, formando colônias rosa-avermelhadas, devido à viragem do indicador em pH baixo. No ágar sangue bovino as colônias de E. coli apresentam-se com coloração acinzentada, com 1,5 a 2,5 mm de diâmetro, com produção ou não de beta-hemólise. As linhagens bacterianas isoladas em ágar MacConkey foram submetidas às provas bioquímicas para enterobactérias utilizando meios de cultura sólidos e semi-sólidos, distribuídos em tubos de ensaio, visando Material e métodos 63 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 determinar os seguintes parâmetros: produção de gás (glicose), H2S, urease, L-TD, motilidade, indol, lisina e citrato de Simmons. Foram classificadas como E. coli aquelas linhagens que se apresentaram positivas nas provas de gás / glicose, indol e lisina, motilidade (variável), e negativas para H2S, urease, L-TD e citrato de Simmons (SILVA et al., 2001; TRABULSI et al., 2005). 4.5.5 Amostras bacterianas padrão Foram utilizadas linhagens bacterianas padrão de S. aureus (ATCC 25923) e E. coli (ATCC 11229), adquiridas da Coleção de Culturas do IAL de São Paulo, e linhagem padrão de S. agalactiae (ATCC 13813), adquirida no INCQS do Rio de Janeiro (Figura 5). Estas linhagens padrão foram utilizadas como controles positivos nos testes e na determinação da sensibilidade analítica das provas. FIGURA 5. Ampolas contendo linhagens bacterianas liofilizadas, utilizadas no estudo como referências (controles positivos) nas provas diagnósticas. Botucatu-SP, 2011. Material e métodos 64 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.6 CBT Para a contagem de micro-organismos aeróbios e anaeróbios facultativos mesófilos e psicrotróficos nas amostras de leite do tanque de expansão, foi utilizado o Petrifilm (3M - EUA), a partir de três diluições, a saber: 10-3, 10-4 e 10-5 para mesófilos (48 horas de incubação a 35°C) e 10-2, 10-3 e 10-4 para psicrotróficos (dez dias de incubação a 7°C). Foram realizadas duplicatas de cada diluição, para cálculo da média de contagem de micro- organismos mesófilos e psicrotróficos. As placas Petrifilm consistem de cartões de papel quadriculado revestido de polietileno e recobertos por nutrientes desidratados em um gel hidrossolúvel a frio (Figura 6). O sistema é protegido por um filme plástico transparente revestido internamente pelo mesmo gel e corante indicador TCC. Ao adicionar a amostra em teste, os nutrientes são imediatamente re- hidratados, ocorre a solidificação do gel, após o que a placa estará pronta para ser incubada (SANT’ANA et al., 2002). O TCC é um corante amplamente utilizado em meios de cultura para a enumeração de bactérias, em amostras contendo impedientes. Os micro- organismos viáveis reduzem o TCC por meio de enzimas, originando um composto de cor vermelha (formazano) que fica acumulado no interior dos grânulos das células coradas (SANT’ANA et al., 2002). FIGURA 6. Petrifilm utilizado para contagem bacteriana total (CBT) a partir de amostras de leite bovino, obtidas de tanques de expansão. Botucatu-SP, 2011. Material e métodos 65 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.7 CCS A contagem eletrônica de células somáticas das amostras de leite foi realizada por citometria de fluxo com equipamento Somacount 300 (BENTLEY, 1995; LANGONI, 2000), no Laboratório do NUPEMAS, DHVSP FMVZ-UNESP/Botucatu-SP. Foram utilizados frascos plásticos próprios, contendo conservante (bronopol). Este conservante apresenta formato de pastilha que, em contato com o leite, forma uma mistura de coloração rosa- clara. As amostras colhidas ficam sob temperatura ambiente, no máximo, até cinco dias da colheita, para a realização das análises. Na técnica de citometria de fluxo, as células coradas são carreadas por um líquido, excitadas por um feixe de laser. Os núcleos corados emitem, por fluorescência, impulsos luminosos que são ampliados por um foto multiplicador, contados e convertidos em concentração de células somáticas (SILVEIRA et al., 2005). Foram considerados indicativos de infecção amostras com contagens iguais ou superiores a 750.000 células/mL (BRASIL, 2002). 4.8 mPCR Todos os procedimentos referentes ao diagnóstico molecular do estudo foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada ao Diagnóstico de Zoonoses, DHVSP- FMVZ/UNESP – Botucatu-SP. 4.8.1 Pesquisa dos materiais genômicos de S. aureus, S. agalactiae e E. coli nas amostras de leite colhidas dos tanques de expansão 4.8.1.1 Extração de ácidos nucléicos As amostras de leite, mantidas congeladas, permaneceram em temperatura ambiente até atingirem aproximadamente 20°C. A extração do DNA, tanto das amostras de leite, quanto das linhagens bacterianas de referência, foi realizada utilizando-se o kit comercial Milk Bacterial DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corporation, Ontario, Canadá), de acordo com as recomendações do fabricante (Anexo 3). Material e métodos 66 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.8.1.2 Desenho dos iniciadores Para identificação molecular de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram utilizados os iniciadores SAU1 e SAU2, SAGA1 e SAGA2, SIP3(F) e SIP4(R), Ecoli1 e Ecoli2, derivados de seqüências previamente publicadas (CHOTÁR et al., 2006). Os iniciadores amplificam regiões espécie-específicas do DNA codificadoras das regiões 16S e 23rRNA, baseado nas seqüências do banco de dados GenBank (Tabela 2). TABELA 2. Iniciadores utilizados no estudo para a amplificação do DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino, pela técnica de mPCR. Botucatu-SP, 2011. Cepas Iniciadores Seqüências dos iniciadores Peso molecular do produto (pb) S. aureus SAU1 5’-GGA CGA CAT TAG ACG AAT CA -3’ 1300 SAU2 5’-CGG GCA CCT ATT TTC TAT CT -3’ S. agalactiae SAGA1 5’-CGT TGG TAG GAG TGG AAA AT – 3’ 590 SAGA2 5’-CTG CTC CGA AGA GAA AGC CT – 3’ SIP3(F) 5’-TGA AAA TGC AGG GCT CCA ACC TCA -3’ 293 SIP4(R) 5’-GAT CTG GCA TTG CAT TCC AAG TAT -3’ E. coli Ecoli1 5’-GCT TGA CAC TGA ACA TTG AG -3’ 660 Ecoli2 5’-GCA CTT ATC TCT TCC GCA TT -3’ pb: pares de bases (CHOTÁR et al., 2006) 4.8.1.3 Amplificação do material genético pela mPCR Para cada reação, foram utilizados 17,5μL de água miliQ; 2,5μL de tampão de reação (10mM Tris HCl pH 8.0, 50mM KCl); 0,75μL de MgCl2 (1,5mM); 0,5μL de dNTP (0,2mM); 2,0μL de cada primer (10ρM); 0,5μL (0,2 unidades) de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen - EUA), e 3μL de DNA genômico (10ng). As condições de termociclagem foram: 96°C por 5’; 30 ciclos de 96°C por 1’, 55°C por 1’e 72°C por 2’; e último ciclo de 72°C por 8’. Os Material e métodos 67 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 controles positivos da reação foram cepas de referência (ATCCs), provenientes da FIOCRUZ. Os controles negativos foram água MiliQ. 4.8.1.4 Visualização dos produtos amplificados A visualização do material amplificado foi avaliada pela corrida eletroforética em gel de agarose a 1,5% adicionado de 1,0μL/mL de SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen -EUA). A corrida eletroforética foi realizada em cuba horizontal contendo TBE 1X (89 nM Tris-HCl, 89 mM ácido bórico e 20 mM EDTA) com voltagem de 65V. O gel foi visualizado em transluminador de luz UV e a imagem capturada pelo sistema de documentação digital. Foram utilizados 8μL do material amplificado e como marcador de peso molecular 4 μL de 100pb ladder (Invitrogen - EUA) (Figura 7). Para todas as amostras foram acrescidos 2 μL do tampão de corrida. A diferença de peso molecular entre produtos da PCR (S. agalactiae: 293 e 590 pb, E. coli: 660 pb, S. aureus: 1300 pb) facilitou a identificação e distinção entre os DNAs dos micro-organismos-alvo à eletroforese. Norgen: PCR Sizer 100 bp DNA Ladder (Cat# 11400 ) Invitrogen: 100 bp DNA Ladder (Cat15628-019) FIGURA 7. Padrões de peso molecular utilizados nas análises de PCR e mPCR. Botucatu-SP, 2011. 4.8.2 Teste de sensibilidade analítica da mPCR Linhagens padrão de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram utilizadas para a determinação do limiar de detecção dos DNAs-alvo, pela técnica de Material e métodos 68 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 mPCR. Para tanto, realizou-se o cultivo das amostras bacterianas de referência em ágar sangue a 10%, com incubação de aproximadamente 36 horas. As colônias foram transferidas com auxílio de alça de platina para tubo de vidro contendo solução salina estéril, até ser obtida turvação correspondente ao valor 1,0 da escala de MacFarland. Foram utilizados inóculos individuais de S. aureus, E. coli e S. agalactiae e um inóculo composto pelos três micro- organismos. Uma alíquota de 1mL de cada solução foi transferida para microtubo livre de DNAses e RNAses, para a realização da extração de DNA. As amostras de DNA extraídas foram quantificadas em espectofotômetro NanoVue (GE Healthcare® - EUA). Para a calibração, foram utilizados 2 μL de água Milli Q estéril (branco) e, para a quantificação, 2 μL do DNA extraído. As concentrações de DNA de E. coli, S. aureus e S. agalactiae foram de 118ng/μL; 15,7ng/μL e 10,5ng/μL, respectivamente. A partir da leitura em ng/μL, foi realizada a diluição com água Milli Q estéril para ajustar a concentração em 1ng/μL. Utilizando o exemplo da concentração de DNA de E. coli, temos: c1 X v1 = c2 X v2 118ng/ μL. V1= 1ng/ μL. 100 μL V1= 0,847 μL produto de DNA quantificado + 99,153 μL de água Milli Q, para obter 1ng/μL. Foram preparados cinco microtubos contendo 90 μL de água Milli Q estéril cada. Da amostra contendo 1 ng/μL, retirou-se 10 μL que foram diluídos em 90 μL de água MiliQ contido no primeiro microtubo. Deste foram procedidas diluições sucessivas, em base 10, nos demais. Desta forma, obteve-se as concentrações de DNA de 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL (Figura 8). Material e métodos 69 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 0,847 μL Solução-mãe 118ng/ μL 1ng/ μL 100pg/ μL 10pg/ μL 1pg/ μL 100fg/μL 10fg/ μL FIGURA 8. Esquema das diluições seriadas realizadas com amostra de DNA quantificado de E. coli (amostra de referência) para avaliação da sensibilidade analítica da técnica de mPCR. Botucatu-SP, 2011. As soluções de DNA de S. aureus, S. agalactiae e E. coli, bem como suas respectivas diluições, foram submetidas à mPCR, individualmente, e em conjunto. Foi considerado como limiar de detecção para cada DNA-alvo a última diluição onde houve visualização de banda (produto de mPCR) à eletroforese. 4.8.3 Teste de especificidade analítica da mPCR Para testar a especificidade dos iniciadores (S. aureus, S. agalactiae e E. coli) frente à presença do material genômico de outras espécies bacterianas comumente encontradas em amostras de leite, foram utilizados os DNAs de linhagens padrão de S. intermedius, S. epidermidis, S. uberis, S. dysgalactiae e P. aeruginosa, adquiridas no INCQS do Rio de Janeiro. 4.8.4 Teste de reprodutibilidade da mPCR A reprodutibilidade dos produtos da mPCR foi testada por meio da análise do DNA de cinco amostras selecionadas ao acaso do total das estudadas, mais os DNAs das linhagens padrão de S. aureus, S. agalactiae e E. coli, utilizados como controles positivos. Foram realizadas reações de amplificação durante cinco dias consecutivos para a avaliação da reprodutibilidade entre testes. Material e métodos 70 ____________________________________________________________________________ M. Z. Troncarelli – 2011 4.9 Análise dos resultados A prevalência de S. aureus, S. agalactiae e E. coli nos rebanhos estudados foi obtida com base nos resultados de cultivo microbiológico e mPCR. O teste ajustado de χ2 de McNemar (Phuektes et al., 2001) foi utilizado para o cálculo da acurácia, sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos da técnica de mPCR frente ao cultivo microbiológico. Probabilidades menores que 0,05 foram consideradas significativas. Os resultados obtidos pelas técnicas de cultivo microbiológico e de mPCR a partir das amostras de leite dos tanques de expansão avaliados, bem como os resultados de cultivo microbiológico das amostras de leite dos quartos mamários dos animais dos rebanhos foram avaliados frente aos dados epidemiológicos das propriedades, para a análise da relação entre as condições gerais de ordenha e os resultados obtidos pelas técnicas diagnósticas. ESULTADOS Resultados 72 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 ESULTADOS 5.1 Questionário epidemiológico e características das propriedades Os resultados dos questionários epidemiológicos aplicados nas vinte propriedades leiteiras avaliadas estão apresentados nas tabelas 3a e 3b. Nas figuras 9 e 10 estão apresentados diferentes sistemas de ordenha, utilizados em algumas das propriedades envolvidas no estudo. Nas tabelas 4a e 4b são apresentados os resumos das características das fazendas, com base nas condições de higiene e manejo de ordenha; média de produção leiteira e de CCS das amostras de leite dos tanques de expansão. Resultados 73 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 TABELA 3a. Características gerais das propriedades leiteiras avaliadas (1 a 10), localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu, 2011. Propriedades leiteiras Características 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Localização (município) Botucatu Nova Odessa Areiópolis Pardinho São Pedro São Pedro Lençóis Paulista Porto Feliz Itatinga Itatinga Produção total de leite (L/dia) 1.300 3.300 1.400 2.000 7.345 3.200 500 2.400 1.700 295 No. de animais em lactação 75 126 94 116 273 160 29 129 90 40 Número de animais avaliados 77 123 87 110 51 56 27 58 86 44 Média diária de produção de leite por animal 17,3 26,1 14,8 17,2 26,9 20 17,2 18,6 18,8 7,3 No. de ordenhas diárias 2 3 2 2 3 3 2 2 2 2 No. de animais com mastite clínica 0 2 10 2 0 1 1 2 2 0 Sistema de ordenha Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Lavagem dos tetos antes da ordenha Sim Sim Não Não Não Sim Sim Não Sim Sim Secagem dos tetos / como Papel toalha Papel toalha Jornal Papel toalha Papel toalha Papel toalha Papel toalha Papel toalha Papel toalha Papel toalha Pré dipping / desinfetante utilizado Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / iodo Sim / cloro Sim / cloro Sim / iodo Sim / iodo Sim / cloro Pós dipping / desinfetante utilizado Sim / iodo Sim / iodo Sim / cloro Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Faz prova Tamis (caneca telada de fundo escuro) Não Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Faz teste CMT Não Sim Não Não Sim Sim Não Sim Não Não Critério para tratamento de mastite clínica Aleatório Antibiograma Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Desinfecção teteiras pós-ordenha / desinfetante Sim / cloro Sim / cloro Não Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Manejo animais pós-ordenha Alimentação Alimentação Alimentação Alimentação Alimentação Alimentação Alimentação Repouso Alimentação Alimentação Realiza terapia/profilaxia vaca seca Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Limpeza diária equipamentos ordenha Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Registra os animais Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Acompanhamento veterinário Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Condição de higiene Ruim Satisfatória Regular Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Regular Satisfatória Ruim Estrutura da sala de ordenha Regular Satisfatória Regular Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Ruim Higienização do tanque Dias alternados Diária Diária Dias alternados Diária Diária Diária Diária Diária Dias alternados CCS do tanque (x 103 células/mL) 230 59 138 544 236 160 815 306 418 1.422 CBT* do tanque (UFC/mL) 2,2 x 105 1,0 x 105 2,3 x 105 4,7 x 104 4,9 x 104 1,6 x 103 < 101 1,4 x 105 4,7 x 104 4,8 x 106 Classificação B A B B A A B B A B *mesófilos Resultados 74 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 TABELA 3b. Características gerais das propriedades leiteiras avaliadas (11 a 20), localizadas no centro oeste do Estado de São Paulo. Botucatu, 2011. Propriedades leiteiras Características 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Localização (município) Lins Agudos Botucatu Botucatu Itatinga Araras Nova Odessa Santa Rita do Passa Quatro Conchas Botucatu Produção total de leite (L/dia) 4.700 19.800 450 120 900 34.000 700 2.200 1.050 80 No. de animais em lactação 260 580 75 19 39 970 65 96 46 28 Número de animais avaliados 54 85 75 19 39 330 61 94 46 28 Média diária produção leite por animal 18 34,1 6 6,3 23 35 10,7 22,9 22,8 2,8 No. de ordenhas diárias 3 3 1 2 2 3 2 2 2 1 No. de animais com mastite clínica 10 6 1 0 6 10 5 6 2 1 Sistema de ordenha Canalizado Canalizado Balde ao pé Balde ao pé Balde ao pé Canalizado Canalizado Canalizado Canalizado Balde ao pé Lavagem dos tetos antes da ordenha Sim Não Não Não Não Sim Sim Não Não Não Secagem dos tetos / como Papel toalha Papel toalha Não Não Jornal Papel toalha Papel toalha Papel toalha Papel toalha Pano Pré dipping / desinfetante utilizado Sim / iodo Sim / cloro Não Não Não Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / ácido lático Não Pós dipping / desinfetante utilizado Sim / iodo Sim / cloro Não Não Não Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Sim / iodo Não Faz prova Tamis (caneca telada de fundo escuro) Sim Sim Não Não Sim Sim Sim Sim Sim Não Faz teste CMT Não Não Não Não Não Sim Não Não Sim Não Critério para tratamento de mastite clínica Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Aleatório Antibiograma Antibiograma Aleatório Aleatório Aleatório Desinfecção teteiras pós-ordenha / desinfetante Sim / cloro Sim Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Sim / cloro Manejo animais pós-ordenha Alimentação Alimentação Repouso Repouso Repouso Alimentação Alimentação Alimentação Alimentação Repouso Realiza terapia/profilaxia vaca seca Sim Sim Não Não Não Sim Sim Sim Sim Não Limpeza diária equipamentos ordenha Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Sim Registra os animais Sim Sim Não Não Não Sim Sim Sim Sim Não Acompanhamento veterinário Sim Sim Não Não Não Sim Sim Sim Sim Não Condição de higiene Regular Satisfatória Regular Regular Ruim Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Regular Estrutura da sala de ordenha Satisfatória Satisfatória Regular Regular Ruim Satisfatória Satisfatória Satisfatória Satisfatória Regular Higienização do tanque Dias alternados Diária Dias alternados Dias alternados Dias alternados Diária Diária Diária Diária Dias alternados CCS do tanque (x 103 células/mL) 735 113 120 550 267 391 528 827 590 400 CBT* do tanque (UFC/mL) 7,3 x 104 7,0 x 105 3,1 x 106 2,2 x 105 6,0 x 104 < 101 < 101 2,8 x 106 2,6 x 104 1,3 x 107 Classificação B A C C C A A A A C *mesófilos Resultados 75 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 FIGURA 9. A: Sistema de ordenha bovino tipo balde-ao-pé. B: Sistema de ordenha tipo canalizado, com manejo de bezerro ao pé. C: Sistema de ordenha bovino tipo canalizado convencional. Botucatu-SP, 2011. C B A Resultados 76 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 FIGURA 10. A: Sistema de ordenha bovino tipo canalizado de alta tecnificação. B: Vacas de excelente genética e elevada produção leiteira, em sistema de ordenha tecnificado. Botucatu-SP, 2011. A B Resultados 77 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 TABELA 4a. Resumo das principais características observadas entre as vinte propriedades leiteiras avaliadas, do Estado de São Paulo. Botucatu-SP, 2011. Característica Ocorrências Condições satisfatórias de ordenha (Grupo A) 9 (45%) Condições regulares de ordenha (Grupo B) 7 (35%) Condições insatisfatórias de ordenha (Grupo C) 4 (20%) Sistema de ordenha 16 (80%) canalizado 4 (20%) balde ao pé Lavagem tetos antes ordenha 9 (45%) sim 11 (55%) não Secagem tetos 2 (10%) não 15 (75%) papel toalha 2 (10%) jornal 1 (5%) pano Pré-dipping 4 (20%) não 11 (55%) cloro 4 (20%) iodo 1 (5%) ácido lático Pós-dipping 4 (20%) não 14 (70%) iodo 2 (10%) cloro Prova de Tamis 16 (80%) sim 4 (20%) não CMT 6 (30%) sim 14 (%70) não Tratamento mastite 17 (85%) sem base em antibiograma 3 (15%) com base em antibiograma Desinfecção teteiras pós-ordenha 19 (95%) sim 1 (5%) não Manejo pós-ordenha 15 (75%) alimentação 5 (25%) repouso Terapia/profilaxia vaca seca 15 (75%) sim 5 (25%) não Acompanhamento veterinário 16 (80%) sim 4 (20%) não Higiene sala ordenha 3 (15%) insatisfatória 6 (30%) regular 11 (55%) satisfatória Estrutura sala ordenha 2 (10%) insatisfatória 5 (25%) regular 13 (65%) satisfatória Higienização tanque expansão 8 (40%) diária 12 (60%) em dias alternados Limpeza diária sala ordenha 20 (100%) sim Registra os dados dos animais 16 (80%) sim 4 (20%) não Resultados 78 ____________________________________________________________________________ M.Z. Troncarelli - 2011 Na Figura 11 são apresentadas condições insatisfatórias de higiene e de manejo em algumas das propriedades envolvidas no estudo. FIGURA 11. Propriedades leiteiras com manejo higiênico deficitário. A: presença de cão na sala de ordenha. B: conjunto de ordenha sujo com fezes bovinas. C: bovino em repouso na lama, imediatamente após ordenha. D: intenso grau de sujidade do úbere em animal recém-chegado à sala de ordenha. E e F: utilização de pano para secagem dos tetos. Botucatu-SP, 2011. A B C D E F Resultados